JPH04159298A - Ｈｃｖペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス遺伝子の構造領域にコード
されるタンパク質の抗原部位の一部に一致するペプチド
に関し、本発明のペプチドはＣ型肝炎ウィルスに対する
抗体の検出、ならびにＣ型肝炎ウィルス遺伝子の構造領
域にコード化される蛋白質のポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体を得る目的で哺乳動物に投与される免疫
原等に利用される。

［従来の技術］ われわれの住んでいる地球上にはさまざまなウィルスが
存在している０人類は、輸血という手段を用いてお互い
に生命を維持することがある。現在まで、この輸血によ
って肝炎が発症した例は数多い。Ｂ型肝炎ウィルス（以
下ＨＢＶと略す）もその原因となっていた。しかし、Ｈ
ＢＶの存在の有無を検出する検査試薬が開発され、輸血
前にＨＢＶの存在を確認することができるようになり、
輸血によるＦＩＢＶ感染者はなくなった。

ところがＡ型肝炎ウィルス（以下１（ＡＶと略す）やＨ
ＢＶが原因と考えられない肝炎の発生源を確認する事が
できなかった。ところが、Ｃｈｏｏ、Ｑ−Ｌ。

らの文献（：５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：３５９−３６２
．１９８９）およびＫｕｏ＊　Ｇ、らの文献（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　２４４：３６２−３６４．１９８９）によって
、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの存在が明らかにされた。こ
れを彼らはＣ型肝炎ウィルス（以下ＨＣＶと略す）と呼
んだ。

ＨＣＶはヒトとチンパンジーにのみ感染することが以前
から明らかになっていた。非Ａ非Ｂ型肝炎患者に投与さ
れた血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤と同じ血液凝固第ＶＩ
Ｉｒ因子製剤をチンパンジーに投与し、非Ａ非Ｂ型肝炎
を発症させた。さらにその肝臓からの抽出物を別のチン
パンジーに投与し、同様に非Ａ非Ｂ型肝炎を発症させ、
このチンパンジーの血漿を抽出した。そして、その血漿
をさらに別のチンパンジーに投与し、非Ａ非Ｂ型肝炎の
発症を確認した。この発症が確認された血漿をフラビノ
ウイルスと想定したウィルス粒子の濃縮操作（Ｂｒａｄ
ｌｅｙ、　ＤＪ、ｅｔ　ａｌ、　：Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ
ｅｒｏｌｏｇｙ　８８　：　７７３−７７９．１９８９
参照）を行い、ＲＮＡを抽出した。　ＲＮＡからｃＤＮ
Ａを合成し、λｇｔｌｌライブラリーを作製した。これ
を回復期のチンパンジー血清や非Ａ非Ｂ型慢性肝炎患者
血清を用いてスクリーニングを行い、反応するクローン
の選択を行った。その結果、５−１１というクローンの
みがＨＣＶに由来するｃＤＮＡ断片だった０以上の操作
は、特公表平２−５００８８０号公報（国際公開番号１
１０８９１０４６６９）に記載されており、遺伝子配列
も明かなものとなった。この中で彼らはＨＣＶ抗体の検
出は、５−１−１を含むヒトスーパーオキシドデイスム
ダーゼ遺伝子の一部との融合タンパクとして酵母で発現
させた組換タンパクＣ−１００−３（以下Ｃ−１００−
３と略す）を用いている。　５−１−１　は［ＩＣＶの
非構造タンパク質であり、コアやエンベロープを構成す
るタンパク質ではない、それゆえ、ｃ−１００−３ｓ１
域に対する抗体は感染から３ケ月から６ケ月以上しない
と検出されない、また、発症しても抗体が検出されなく
なる場合もある。　Ｃ−１００−３を用いた分析では非
Ａ非Ｂ型肝炎を発症した患者の７０％程度しか抗体を検
出できていない、そもそも、ウィルスの非構造タンパク
質は増殖を行うためなどの目的で構成されるものである
。したがって、ウィルス自身を構成するコアやエンベロ
ープに対する抗体を検出することは非常に重要である。

１９９０年６月に日本肝臓学会が行われ、ＲＣＶの構造
領域の遺伝子配列について自治医科大学の開本らによっ
て明らかになった。

１９９０年７月には日本癌学会において開本らと同様に
ＨＣＶの構造領域の遺伝子配列が明らかになった。コア
領域は遺伝子の変異がほとんどなく、エンベロープ領域
は両者の遺伝子配列で若干の相違があった。

：発明が解決しようとする！ｌＩ題コ 従来のＣ−１００−３組換えタンパク質によるＨＣＶ抗
体の分析では、ＨＣＶの非構造領域の抗原位を使用して
おり　ＦＩＣＶに感染した患者の７０％しか検出するこ
とができず、さらには非特異的な反応が生じる怖れがあ
る。

本発明は、ＨＣＶ感染患者の血清中に存在する抗ＨＣＶ
抗体の検出に用いることができるＨＣｖの構造領域抗原
部位に相当するペプチドを提供することを目的とする。

または、本発明は、構造領域のペプチドと非構造領域の
ペプチドの混合物を提供することを目的とする。

［課題を解決する手段および作用］ 発明者は、Ｎａｔｕｒｅ　３０２：ＰＰ４９０−４９５
．１９８３でＧｅｏｆｆｒｅｙ　ＲＳが示した合成ペプ
チドが抗原性を持つことが明らかにされていること・に
もとすき、従来例で明らかになったＨＣＶの遺伝子配列
からそのアミノ酸配列を求め、これをもとにして、発明
者は、ホップとウッズの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵＳＡ、Ｖｏ１．７８．Ｎｏ、６
．ｐｐ３８２４−３８２８．１９８１）を用いて、各ア
ミノ酸の親水性値に基づき抗原性を強く持つ部分を予測
した。その結果に基いて、アミノ末端からカルボキシ末
端の方向を左から右へ記した下記式のアミノ酸配列で表
現される　ａ＋ｏｋｋ−ｃｌ、ｗｏｋｋ−ｃ２，５ｏｋ
ｋ−ｃ３．ｍｏｋｋ−ｃ４．ｍｏｋｋ−３３のペプチド
を合成した。下記式中、記号は次のように定義する。

略号　　名称　　　　略号　　名称 ＾ａｐミルアスパラギンｌ　　ＶａｔバリンＡｓｎアス
パラギン　　ＭｅｔメチオニンＴｈｒ　　）レオニン　
　　Ｉｌｅイソロイシンシンｒセリン　　　　　Ｌｅｕ
　ロイシンＧｌｕグルタミン＠　　　Ｔｙｒチロシンシ
ンｎグルタミン　　　ＰｂｅフェニルアラニンＰｒｏ　
プロリン　　　　Ｔｒｐ　　）リプトファンＧｌｙグリ
シン　　　　Ｌｙｓ　リジンＡｌａアラニン　　　　Ｈ
ｉｓ　ヒスチジンＣｙｓ　システィン　　　Ａｒｇアル
ギニン５ｏｋｋ−Ｃ１：　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｇｉｎ　　Ａｒｃ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙ
ｓＡｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　
　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｎＡｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｌ
ｙｓ ｓｏｋｋ−Ｃ２：　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　
Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　ＶａｌＡｒ
ｇ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｓｅｒ　　ＧｌｕＡｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ　
　Ｐｒｏ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　ＡｒｇＧ
ｌｎ　　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｖ
ａｌ　　Ａｒｇ　　ＡｒｇＰｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ
　　Ａｒｇｍｏｋｋ−Ｃ３：　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　
Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｒｐ　　
ＧｌｙＰｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ａｒ
ｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　ＳｅｒＡｒｇ　　Ａｓｎ　
　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙｓｏｋｋ−Ｃ４：　　Ｇｌｙ　　Ｃ
ｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｌａ　　５ｅｒＣｙｓ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｌｅａ
　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　ＡｓｐＧｌｎ　　
Ｇｌｙ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　（ｌｅｍｏ
ｋｋ−３３：　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　ｌｅａ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａｌｉｅ　
　ｌｉｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　
　Ｖａｌ　　ＬｅｕＴｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ｐ
ｈｅ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ｍｅｔ　　ＧｌｕＧｌｕ
　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ　　旧ｓ　　Ｌｅｕ　
　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒｌｌｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｉｎ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｍｅｔ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ本発明
のペプチドは上式のアミノ酸配列で特定されるペプチド
で構成されているが、その題僚物および上記各式で特定
されるアミノ酸配列のうち少なくとも６個のアミノ酸か
らなる配列に一致するペプチドも本発明の範囲である。

これは、抗原決定基の最小のサイズが６個のアミノ酸か
らなる配列であることに由来する（Ｉｍｍｕ−ｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　１２．ｐｐ４２３−４３８．１９７５
）、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｖｏｌ、７８．１）ｌ）３
８２４−３８２８．１９８１）　。

したがって、上式のアミノ酸配列式の一部であっても、
６個以上の連続したアミノ酸からなる配列からなり、上
式のペプチドと交差反応性（ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉ
ｖｅ）を有するペプチドは本発明に含まれる。

上式のアミノ酸配列で特定されるペプチドの類以物は、
上式中の１または複数のアミノ酸が別のアミノ酸に置換
されたもの、削除されたもの、および上式中のアミノ酸
配列中のアミノ酸に１または複数のアミノ酸が付加され
たものであって、上式のペプチドと交差反応性を有する
ペプチドである。交差反応性を有するかどうかは、アミ
ノ酸配列の３次元構造に起因するＨＣＶに対する抗体に
対する免疫反応性をテストすることで確認することがで
きる。

本発明のペプチドは支持体に固相化してＨＣＶ抗原に対
する抗体の分析を行うことができる。

支持体としてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、分子
量５万から１０万程度のポリペプチド、マイクロプレー
トのウェル、直径０．１μ−から６閣程度のポリスチレ
ンボールなどがあげられる。

［実施例］ ユニ上王立１Ｉ ＨＣＶの非構造領域の抗原部位は第１図に示したアミノ
酸配列を基に、また、ＨＣＶの構造領域の抗原部位は第
２図に示したアミノ酸配列を基に、ホップとウッズの方
法を用いて、各アミノ酸の親水性値に基づき抗原性を強
く持つ部分を予測した。

各アミノ酸に固有の親水性値を与えて、第１図、第２図
のアミノ酸配列中の連続する６個のアミノ酸の親水性値
を合計し、その６個のアミノ酸からなるペプチドの抗原
性を示す親水性値とする。この操作を第１図、第２図に
示すＨＣｖの一次構造のアミノ酸すべてについて行った
。

抗原部位を予測する他の手法として、ＪａｃｋＫのＭｏ
１．Ｂｉｏｌ　１５７：１０５．１９８２に示されてい
るＨｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ＶａｌｕｅやＡｌａｎ　Ｍｓ
の５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．：４２９、１９８５に示さ
れているＡｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　Ｖａｌｕｅなどを
用いてもよい。

この結果、抗原性が高いと思われるｍｏｋｋ−ｃｌ、ｍ
ｏｋｋ−ｃ２．ｍｏｋｋ−ｃ３．ｍｏｋｋ−ｃ４．ｍｏ
ｋｋ−３３を選択した。

これらのペプチドと、組換えタンパク質Ｃ−１００−３
のアミノ酸位置は以下のとおりである。

５ｏｋｋ−ｃｌ　：　１１３−１３１　　（構造領域）
ｅｉｏｋｋ−ｃ２　：　１４７−１８２　　（構造領域
）ｍｏｋｋ−ｃ３　：　２０９−２２８　　（構造領域
）ｓｏｋｋ−ｃ４　ｓ　５５９−５８０　　（構造領域
）ｍｏｋｋ−３３：１２３６−１２７５　（非構造領域
）Ｃ−１００−３：１１１９−１４８０　（非構造領域
）上記ペプチドは、左端がＮ末端であり、右端がＣ末端
である。

ＨＣＶの構造領域の親水性値を示すグラフを参考までに
第３図に示した０図中、構造領域のｍｏｋｋ−ｃｌ〜５
ｏｋｋ−ｃ４のペプチドを上方に表示した。

前記ペプチド−ｏｋｋ−ｃｌ、　５ｏｋｋ−ｃ２＋　ｍ
ｏｋｋ−ｃ：Ｌｓｏｋｋ−ｃ４．５ｏｋｋ−３３を以下
に示す方法で合成した。ペプチドの合成は、＾ｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３０Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ
　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用い、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸
の対称性無水物で合成を行った。つぎに、アニソール・
ジメチルサルファイド・パラチオクレゾール内に溶かし
た合成ペプチドを０−５℃のフッ化水素酸の存在下で、
１時間反応させて脱保護を行った。この方法は、Ｓ、５
ａｋａｋｉｂａｒａのＢａ１１．　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ
、Ｊｐｎ、　４０　：２１６４、１９６７に示されてい
る方法である。この粗結晶を２Ｎ酢酸に溶解して抽出し
、凍結乾燥した。これを５１３１！１００カプセルパッ
クＣｌ８ＳＧ１２０直径４６■長さ２５０−を用い、純
水中に０．１％Ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅｔｉｃ　ａｃｉ
ｄ（ＴＦＡ）と５％ＣＬＣＮが含まれる溶解と、純水中
に０．１　％ＴＦＡ　と５０％ＣＨ３ＣＮが含まれる溶
液を流量１２ｍ１／ｓｉｎでグラデイエンドをかけるこ
とによって精製した。−例としてこのときのｍｏｋｋ−
Ｃ２のクロマトグラフを第４図（＾）に示す。ピーク１
７が本発明の合成ペプチドである。これを分取し、精製
したものを分析したクロマトグラフを第４図（Ｂ）に示
した。第４図（Ｂ）で精製に使用したカラム及び精製条
件は上記と同じである。

ＥＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＥの作製 ｍｏｋｋ−ｃＬ　ｓ＋ｏｋｋ−ｃ２．ｍｏｋｋ−ｃ３．
ｍｏｋｋ−ｃ４．−ｏｋｋ−３３の５種のＩＩＣＶペプ
チドを以下の手順で９６穴マイクロプレ一ト底面に固定
化した。

０．１５Ｍ　ＮａＣ１０，ＯＩＭＮａｔＨＰＯ４−Ｎａ
ＨｘＰＯａ緩衝液（ＰＢＳ）　ＰＨ７，０１７）液中４
　ｎ／　ｄＯ）　ＨＣＶヘプチドをＮＵＮＣ社９６ウエ
ルＥＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＥ　６８６６７　に１ウエルあ
たり　１００ＩＩｊずつ分注し、３７℃で６０分反応さ
せた。前記の溶液を除去後、０．０１Ｍ　ＰＨ５ＰＨ７
，０で３回洗浄した。洗浄液を除去後、０．１　％ゼラ
チン０．０１Ｍ　ＰＢＳ　Ｐ）１７．０を１ウエルあた
り３０Ｏｔｔｌずつ分注し、３７℃で６０分反応させた
。さらに前記の溶液を除去後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
００．０１Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ７，０で３回洗浄した。

そして２５℃で６時間乾燥後４°Ｃで検体分析時まで保
存した。

ｍｏｋｋ−ｃｌ　と５ｏｋｋ−３３を混合したペプチド
＋ｗｏｋｋ−ｃｌ＋ｓ＋ｏｋｋ−３３は次の方法で作成
した。

０．１５Ｍ　Ｎａｃｌ　０．０１Ｍ　ＮａｚＨＰＯａ−
ＮａＬＰＯａ、ＰＨ７，０緩衝液（以下ＰＢＳ　と称す
）に、２Ｒｇ／Ｗ１１のペプチドｍｏｋｋ−ｃｌと、２
尾／−のペプチドｍｏｋｋ−３３を加えて混合したペプ
チドの混合物（混合比１：１）をＮＵＮＣ社９６　ウェ
ルｔ！ＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＥ　６８６６７に１ウエルあ
たり　１００１１ｊずつ分注し、３７℃で６０分反応さ
せた。前記の溶液を除去後、０．０ＩＭＰＢＳ　ＰＨ７
，０で３回洗浄した。洗浄液を除去後、０．１％ゼラチ
ン０．０１６ＰＲＳ　Ｐ１１７．Ｏを１ウエルあたり３
００ｐ７ずつ分注し、３７℃で６０分反応させた。さら
に前記の溶液を除去後、０．５％Ｔｗｅｅｎ２００．Ｏ
ＬＭ　ＰＢＳ　Ｐ）１７．０で３回洗浄した。

そして２５°Ｃで６時間乾燥後４℃で検体分析時まで保
存した。

ａ＋ｏｋｋ−ｃｌ　と−ｏｋｋ−３３を混合比２：１で
混合した混合物は、上述した作成方法のうち、ＰＢＳ溶
液中で２　、６　ＩＮ／−のペプチドｍｏｋｋ−ｃｌ　
とＡ倍量の（たとえば１．３尾／−）ペプチド−ｏｋｋ
−３３を加えて混合する操作以外は同様の操作により作
成した。

検体の分析 上で作成した各種ペプチド固定化プレートを用いて、Ｉ
ＩＣＶ患者で、慢性肝炎、肝硬変、肝癌の症状を示す者
の血清２０検体（第５図、第６図中、サンプル阻１〜２
０で示した。）およびＨＣＶ患者の血清１９検体（第７
．８図中、サンプル隘１〜１９で示した。）、Ｂ型肝炎
患者の血清２０検体（第７．８図中、サンプル随２０〜
３９で示した。）、健康診断で肝機能に異常のあった人
の血清３６検体（第７．８図中、サンプルＮｏ、４０〜
７５で示した。）を検査した。

従来のＣ−１００−３＆ｌｌ換えタンパク質を固定化し
たプレートはオーツ社より販売されているＨＣＶ　Ａｂ
分析キットを用いた。

検体の分析は以下の操作で行った。各検体を０．０１％
ＢＳＡ　Ｏ，０５％Ｔｗｅｅｎ２００．ＯＩＭ　ＰＢＳ
　ＰＨ７，０で５０希釈して各ウェル１００ｘＺ分注し
て３７°Ｃで６０分反応させた０反応後、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２００．０１！’Ｉ　ＰＢＳ　ＰＨ７，０で５
回洗浄後、洗浄液を除去して０．ＩＩ＠ペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を３７℃６０分反応させた０反
応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２００．ＯＩＭ　ＰＢＳ　
　ＰＨ７，０で５回洗浄後、洗浄液を除去して０．０２
３％過酸化水素水、０．００５％０−フ二重レンジアミ
ン（ＯＰＤ）０．１Ｍクエン酸−Ｎａｇ　ＨＰＯ＊　Ｉ
Ｉ衝液を１００１ＩＺ分注して３７℃、３０分反応させ
た０反応後、５Ｎ硫酸を５０１１添加して反応を停止さ
せ、４９１０−のプレートリーダーで吸光度を測定した
。

分析の結果 ｍｏｋｋ−ｃｌ、ｍｏｋｋ−ｃ２．ｍｏｋｋ−ｃ３．＋
ｍｏｋｋ−ｃ４の各ペプチドおよび従来のＣ−１００−
３組換えタンパク譬固定化プレートを用いたＨＣＶ　１
者血清の分析結果を第５図に示す、第６図は第５図の測
定値から陽性（＋）、陰性（−）を判定した結果である
。

第５図、第６図の数値は、Ｅｌ＾リーダーのＯＤ値であ
る。　Ｃ１１Ｔ　ＯＦＦ値とは、本ＥＬｒＳＡで健常人
集団の血清を分析した場合に陰性と判断する基準値であ
る。ＣＵＴ　ＯＦＦ値よりも分析値が高い場合に陽性と
判定し、ＣＵＴ　ＯＦＦ値以下の分析値を示した場合に
陰性と判定する。カットオフ値は、健常人集団２０検体
の血清を用いて設定した。検体番号１から５および１７
は、従来のＣ−１００−３抗原では検出できなかったＨ
ＣＶ！Ａ者検体である。検体番号１７を除く７から２０
はＣ−１００−３抗原での分析と診断とが一致した検体
である。そして、検体番号１から２０をＲＮＡ　ＰＣＲ
を用いてＨＣＶのＲＮＡの存在の有無を検査した。その
結果、検体番号５を除くすべての検体からＩＩＣＶのＲ
ＮＡが検出された。

ｍｏｋｋ−ｃ４　は、■検体しか陽性と判定できなかっ
たが、５ｏｋｋ−ｃｌ、ｍｏｋｋ−ｃ２．ｍｏｋｋ−ｃ
３は、Ｃ−１００−３と比較しても検体の判定率がよく
特にｍｏｋｋ−０１は検体番号５を除くすべての検体を
陽性として検出することができた。

ｍｏｋｋ−ｃｌ、５ｏｋｋ−ｃ３３の各ペプチドを固定
したプレート、ｍｏｋｋ−ｃｌ＋５ｏｋｋ−ｃ３３　（
混合比２：１）。

ｗｏｋｋ−ｃｌ＋５ｏｋｋ−ｃ３３　（混合比ｌ：１）
の各ペプチド混合物を固定したプレートおよび従来のＣ
−１００−３組換えタンパク質を固定したプレートを用
いた分析結果を第７図（Ａ）　、　（Ｂ）に示す。

第８図（＾）、（Ｂ）　は第７図の判定結果である。

第７図、第８図で、検体番号ｌから１９はＨＣＶ肝炎と
診断された検体、検体番号２０から３９はＨＢＶ肝炎と
診断された検体、検体番号４０から７５は肝機能に異常
がある検体である。

鐙ｏｋｋ−３３はＣ−１００−３と同様の判定結果であ
った。　ｍｏｋｋ−ｃｌ　と−ｏｋｋ−３３とをｌ：１
　で混合した場合に最も良い検出率を示した。

従来のＨＣＶ抗体検査に使用されているＣ−１００−３
１７）ＨＣＶ　ＥＬＩＳＡ　テは７５検体中１７検体が
陽性であった。５ｏｋｋ−ｃｌでは２３検体が陽性であ
った。■ｏｋｋ−３３では１８検体が陽性であった。

ｍｏｋｋ−ｃｌ　と−ｏｋｋ−３３の混合比ｌ：ｌ　の
ＥＬＩＳＡ　では検体番号７０のように明確な吸光度を
示さなかった検体についてもその判定が明確になった。

また、Ｃ−１００−３で検出できる抗体もすべて−ｏｋ
ｋ−３３で検出できることから、非構′ａ領域に対する
抗体を持っている患者、あるいは構造領域に対する抗体
を持っている患者の組み合わせについて抗体をスクリー
ニングすることができる。したがって、＊ｏｋｋ−ｃｌ
　　と網ｏｋｋ−３３の抗原部位を用いてスクリーニン
グを行えば、Ｃ−１００−３抗原を用いた場合に比べ著
しく高率で輸血後肝炎を防止することができる。

［発明の効果］ 本発明によるＣ型肝炎ウィルスの抗原部位に相当するペ
プチドを用いることによって、ＨＣＶ抗体陽性者を見つ
けだすことができる。

ＨＣＶ抗体陽性者の検体をスクリーニングすることで輸
血による肝炎の発症を防止することができ、人類にとっ
て有用な診断薬となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＣＶ非構造１域におけるアミノ酸配列であ
り、 第２図は、ｎｃｖ構造領域におけるアミノ酸配列であり
、 第３図は、ＨＣｖの抗原部位を予測するための親水性値
を示したグラフであり、 第４図（＾）は、化学合成したーｏｋｋ−ｃ２の精製後
のクロマトグラムであり、 第５図は、検体の各１！ＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＥによる分
析結果であり、 第６図は、検体の各ＥＬＩＳＡ　ＰＬＡＴＨによる判定
結果であり、 第７図は、検体の各ＥＬＩＳＡ　ＰＬＡＴｆ！による分
析結果であり、 第８図は、検体の各ＨＬＩＳＡ　ＰＬＡＹＨによる判定
結果である。 Ｅ５：ｉ５　３１５　　＝＜’Ｅ、ｈ　　足：：５ａ　
　Ｚ、＝Ｅ５吋苔５Ｓ　占創弓　縛結９５賭母　足三ム
ミ！Ｕ賭　９占ご謂　；５ｔご　♂こ；β　＝二２を言
＝Ｃ困　占ヨ！２　ム］吾　４口づ　占５ξ２ｊ占５よ
　遅ｕ−５杏西ζ　ζξδ３９調３さ５＜　Ｓ　ａ　’
　５　Ｃ５’２　５　ａ　ｋ　５　　ｊ　ａ　Ｍ　Ｅ　
　ａ　訳猪気ト＝　１はミ　ヨξにξ　よＭ　８　Ｅ　
　ムかぁ電ご芸＝　ｆと々々　　と５シ霜　ｙごご５　
１％ｆシロ３５ｔ　餐お参　δ１足母　３ａ己ミ　３４
ｉ屯；：２ｇ　電電；と　　；二とと　突＝ぶマ　；３
；ｙ　　メーー；３々霜　Ｇ；二；　　＝電と四　５々
亡３　とＧ＞ご壊はξ　苔９３３１５１書　よｊａｉ　
万！３３舅：２Ｚｋ５　葺＜ａＥ５　　會５　母：３　
’Ｆ３　Ｎ　Ｅ　ｋ　８Ａ＊　ａ：　；　５　：１″ｕ
”ｌ−巳　＝々ご：！　ごと３ぷ　−Ｊ’！２５−Ｊと
虫膚　ｙ霜々ｙ””　’：：ＦＡ　　ａｗ”５ｔＦ−５
Ａ：２Ｍ　　に５５母：Ｅ−Ｍ５；　　ａ：：−−ｉ〜
−−・・　己＝電：３３己ぷご　ξ：ａｋ　　吾ａ、：
　ＥａＳ５＝；畳ａ　二よ驚よ　芸二之之　：旨；：　
上；二；　三；ｙ！：、　％　、　　δ：　ｗ”　ｊ　
　暑！！　：　ａ　　：　ｋ　ａ　；＝　　ｅζζｂ　
ご５電電〜−一〜　ｆｓ５ａ　　云ζａ二　！さ吾ｊ　
左目３Ｃよａ占δｅ＝　ｚ　ｇ　ｚ　　Ｉ　Ｃ；　３　
　、ｏ、５　、；−Ｈ；　、；４５５　　、：１４　；
　　５　ｚ　ｐ　ｚ＋”ＩＦψ″　上々ご芸　＝５３カ
　ママ＝電　ｉ　ｆｉ盲；　＝５二′−：　Ｓ　宮　　
ミ５　Ａξ　暑ム１　ｊ　ｋ　ＩＥ’言　３１母石　５
！二″！−冗ご詔　Ｚ　ｅよ３　ａ睨ト　鱒ｔｅ　暑茨
占＝　Ｌ［り去Ｓｌｉ超　テピきピ　）１ピ之　２”−
Ｅｊ！　　Ｗツ上二　２ｂ−＜＜＜＜　　←＜く←　シ
ー口←　−＜口く　−ψ；−″′の−５々ｆ　５　ｆ＞
＝＋１　　＋Ｊ　；ｌ／ｌ宙　；＝３電　電３−＝冒；
呂　）５；之　；記コ）　；フ響己　巴ツ：二　よニー
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番号 時間Ｃ分） 時間（分） 判定結果 第６図 ｑコ 一一一一／ 区 ０り 手続補正書（方式） 平成３年３月８日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｃ型肝炎ウィルスに対する抗体に反応性を有し、
   下記（ａ）から（ｉ）で特定されるアミノ酸配列の一部
   または全体に一致する少なくとも６個のアミノ酸を含む
   ペプチドのグループから選択されることを特徴とするペ
   プチド、 （ａ）【遺伝子配列があります】 （ｂ）【遺伝子配列があります】 （ｃ）【遺伝子配列があります】 （ｄ）【遺伝子配列があります】 （ｅ）蛋白質の３次構造に起因するＣ型肝炎ウィルスの
   抗体に対する免疫反応性が維持される範囲内で上記（ａ
   ）から（ｄ）の１または複数のアミノ酸を置換、削除、
   または付加されたペプチド。 （ｆ）【遺伝子配列があります】 と 【遺伝子配列があります】 とを混合したもの。 （ｇ）【遺伝子配列があります】 と 【遺伝子配列があります】 とを１：１で混合したもの。 （ｈ）【遺伝子配列があります】 と上記（ｂ）から（ｅ）のペプチドを混合したもの。 （ｉ）特許請求の範囲（ａ）から（ｅ）のペプチドを２
   個以上混合したもの。