JP7613130B2

JP7613130B2 - リガーゼ変異体

Info

Publication number: JP7613130B2
Application number: JP2021010565A
Authority: JP
Inventors: 美和小西; 祥平梶本; 佑介萩原; 康博三原; 祥吾中野; 智晴本山; 創平伊藤
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2020-03-25
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2025-01-15
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: JP2021153573A

Description

本発明は、リガーゼ変異体などに関する。

Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２は、ＡＴＰの存在下でリボヌクレオチドの連結能を有するＲＮＡリガーゼ（ＥＣ６．５．１．３）の一種であり、エシェリヒアへの感染能を有するＴ４バクテリオファージに由来する酵素である（ＮＰ＿０４９７９０）。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２は、ホスホジエステル結合を形成することにより、核酸の５’末端のリン酸基（ドナー）を３’末端のヒドロキシル基（アクセプター）に連結する能力を有する。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２は、突出末端を有する二本鎖ＲＮＡの連結、および二本鎖ＲＮＡ中のニックの連結等の反応に使用されている。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２はまた、ＲＮＡのみならず、ＤＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ以外の修飾核酸も基質として利用できることが知られている。また、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２には、幾つかの変異体が知られている。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２の先行技術については、下記を参照することができる。

国際公開第２００８／０９４５９９号

［ｏｎｌｉｎｅ］，ＩＮＴＥＲＮＥＴ，ＮＣＢＩＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａｂａｓｅ，２０１８年８月１３日，ＮＰ＿０４９７９０，検索日：２０２０年２月２７日，ＵＲＬ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿０４９７９０Ｃｈａｕｌｅａｕ，Ｍ．，＆Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２０１３）．ＫｉｎｅｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｉｃｋｓｅａｌｉｎｇｂｙＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２ａｎｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆ３′－ＯＨｂａｓｅｍｉｓｐａｉｒｓａｎｄｄａｍａｇｅｄｂａｓｅｌｅｓｉｏｎｓ．ＲＮＡ，１９（１２）：１８４０－１８４７．Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｊ．，Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．，Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｄ．（２００６）．ＲＮＡｌｉｇａｓｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｒｅｖｅａｌｔｈｅｂａｓｉｓｆｏｒＲＮＡｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｓｔｈａｔｄｒｉｖｅｌｉｇａｔｉｏｎｆｏｒｗａｒｄ．Ｃｅｌｌ，６；１２７（１）：７１－８４．Ｈｏ，Ｃ．Ｋ．，＆Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００２）．ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２（ｇｐ２４．１）ｅｘｅｍｐｌｉｆｉｅｓａｆａｍｉｌｙｏｆＲＮＡｌｉｇａｓｅｓｆｏｕｎｄｉｎａｌｌｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｄｏｍａｉｎｓ．ＰＮＡＳ，１；９９（２０）：１２７０９－１４．Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｊ．，Ｈｏ，Ｃ．Ｋ．，Ｌｉｍａ，Ｃ．Ｄ．，Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００４）．ＲＮＡｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄｍｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３；２７９（３０）：３１３３７－４７．Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｊ．＆Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００４）．ＨｏｗａｎＲＮＡｌｉｇａｓｅｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｓＲＮＡｖｅｒｓｕｓＤＮＡｄａｍａｇｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，２２；１６（２）：２１１－２１．Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ，Ｊ．＆Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００５）．ＤｕａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｗｈｅｒｅｂｙａｂｒｏｋｅｎＲＮＡｅｎｄａｓｓｉｓｔｓｔｈｅｃａｔａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｒｅｐａｉｒｂｙＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４；２８０（２５）：２３４８４－９．Ｙｉｎ，Ｓ．，Ｈｏ，Ｃ．Ｋ．，Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００３）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１６；２７８（２０）：１７６０１－８．Ｙｉｎ，Ｓ．，ＫｉｏｎｇＨｏ，Ｃ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（２００４）．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＫＶＰ４０ａｎｄＴ４ＲＮＡｌｉｇａｓｅ２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５；３１９（１）：１４１－５１．

本発明の目的は、優れた性質を有するリガーゼ変異体を提供することである。

本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に対してそれぞれ９３％、８７％および９５％のアミノ酸配列同一性を示し（後述の表１を参照）、かつ当該Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２に比し優れた性質を有する３種のリガーゼ変異体Ｍｕｔ１～３（配列番号１～３）を開発することに成功し、もって本発明を完成するに至った。上記先行技術は、このような３種のリガーゼ変異体を教示も示唆もしていない。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記（１）、（２）または（３）のリガーゼ変異体：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
〔２〕核酸が、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである、〔１〕のリガーゼ変異体。
〔３〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体の存在下で核酸材料を連結して核酸生成物を生成することを含み、
核酸材料が、一本鎖核酸材料、二本鎖核酸材料、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる、核酸生成物の製造方法。
〔４〕核酸材料がＲＮＡである、〔３〕の方法。
〔５〕核酸材料が４本以上の一本鎖ＲＮＡである、〔３〕または〔４〕の方法。
〔６〕核酸生成物が１２～２７塩基長の相補部分を含む、〔３〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕核酸材料がＤＮＡおよび／または修飾核酸を含む、〔３〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕核酸材料の濃度が１μＭ以上である、〔３〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕核酸生成物がｓｉＲＮＡである、〔３〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕〔１０〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１２〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換微生物。
〔１３〕〔１〕または〔２〕のリガーゼ変異体を、〔１２〕の形質転換微生物を用いて生成することを含む、リガーゼ変異体の製造方法。

本発明によれば、核酸材料から核酸生成物（例、ｓｉＲＮＡやヘテロ二本鎖核酸等の修飾核酸）を効率的に製造することができる。

図１は、本発明のリガーゼ変異体（Ｍｕｔ１～３）のアミノ酸配列（配列番号１～３）を示す図である。図２は、４断片の一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーション反応により生成する二本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。修飾ヌクレオチド残基の表記は、表２のものと同じである。図３は、（Ａ）４断片の一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーション反応により生成する二本鎖オリゴヌクレオチド、および（Ｂ）当該二本鎖オリゴヌクレオチドの生成のタイムコースを示す図である。修飾ヌクレオチド残基の表記は、表４のものと同じである。図４は、（Ａ）３断片の一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーション反応により生成する二本鎖オリゴヌクレオチド、および（Ｂ）当該二本鎖オリゴヌクレオチドの量（反応時間１５分）を示す図である。ライゲーションポイントから－２位、－１位、＋１位、＋２位のヌクレオチド残基の２’位がフッ素原子（Ｆ）、Ｏ－メチル（Ｏｍｅ）、Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）に修飾された、または水素原子（ＤＮＡ）に置換されたオリゴヌクレオチドを基質として用いた。

１．リガーゼ変異体
本発明は、下記（１）、（２）または（３）のリガーゼ変異体を提供する：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。

配列番号１のアミノ酸配列は、公知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）のアミノ酸配列に対して９３％の同一性を示す。（１）のリガーゼ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列で特定されていることから、公知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２に対して十分に差別化されている。（１）のリガーゼ変異体における配列番号１のアミノ酸配列に対する同一性％の程度は、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上であってもよい。

配列番号２のアミノ酸配列は、公知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）のアミノ酸配列に対して８７％の同一性を示す。（２）のリガーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列で特定されていることから、公知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２に対して十分に差別化されている。（１）のリガーゼ変異体における配列番号２のアミノ酸配列に対する同一性％の程度は、好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、さらにより好ましくは９３％以上、最も好ましくは９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。

配列番号３のアミノ酸配列は、公知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）のアミノ酸配列に対して９５％の同一性を示す。（３）のリガーゼ変異体は、配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列で特定されていることから、公知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２に対して十分に差別化されている。（３）のリガーゼ変異体における配列番号３のアミノ酸配列に対する同一性％の程度は、好ましくは９７．５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９８．５％以上、最も好ましくは９９％以上または９９．５％以上であってもよい。

アミノ酸配列の同一性％の算出は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸＶｅｒ１３．１．１を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、ＭｕｓｃｌｅａｌｉｇｎｍｅｎｔもしくはＣｌｕｓｔａｌＷａｌｉｇｎｍｅｎｔもしくはＭｕｌｔｉｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔを行った後にＧａｐｓａｒｅｔａｋｅｉｎｔｏａｃｃｏｕｎｔの設定で計算させた際の数値を用いて行うことができる。配列番号１（全長３３２個のアミノ酸残基）、配列番号２（全長３３０個のアミノ酸残基）、および（全長３３２個のアミノ酸残基）において上記のような同一性％を達成できるアミノ酸残基の修飾（例、置換、欠失、付加、もしくは挿入、またはそれらの組合せ）の個数は、９０％以上については１～３３個であり、９１％以上については１～２９個であり、９２％以上については１～２６個であり、９３％以上については１～２３個であり、９４％以上については１～１９個であり、９５％以上については１～１６個であり、９６％以上については１～１３個であり、９７％以上については１～９個であり、９８％以上については１～６個であり、９９％以上については１～３個であってもよい。

本発明のリガーゼ変異体は、核酸の連結活性を有する。核酸としては、例えば、一本鎖核酸、および二本鎖核酸が挙げられる。核酸としてはまた、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ以外の修飾核酸、ならびにこれらの混合型の核酸が挙げられる。好ましくは、核酸は、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであってもよい。核酸の詳細は、後述する核酸生成物の製造方法における核酸材料と同様である。

本発明のリガーゼ変異体が有する核酸の連結活性は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）のものに比し優れている限り特に限定されないが、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２に比べて好ましくは１．２倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらにより好ましくは１．８倍以上、特に好ましくは２．０倍以上の核酸の連結活性を有していてもよい。このような核酸の連結活性は、実施例に記載されるような所定の反応により測定することができる。例えば、このような反応は、下記ａ）～ｃ）の手順により行われてもよい（例、実施例２を参照）：
ａ）終濃度で１０μＭ核酸材料（例、一本鎖ＲＮＡ）、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰを含む反応液２０μＬを調製する；
ｂ）この反応液に精製リガーゼ変異体含有溶液５０μＬを終濃度０．３６μｇ／ｍＬとなるよう添加して反応を開始する；
ｃ）２５℃１時間反応させる。

本発明のリガーゼ変異体はまた、優れた温度安定性を有することができる。例えば、本発明のアミノ酸配列を含むリガーゼ変異体は、熱処理およびそれに引き続き活性の測定が行われた場合、熱処理無しの条件下で測定された活性を基準として３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の残存活性を有することが好ましい。このような条件は、２５℃での２３時間の保温、または３７℃での４時間の保温（例、５４ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．２ｍＭＭｇＣｌ_２、１．１ｍＭジチオスレイトール、０．４３ｍＭＡＴＰ、および酵素０．７８μｇ／ｍＬを含む溶液中での保温）、およびそれに引き続き活性の測定を行う条件であってもよい。活性の測定は、上記段落中のａ）～ｃ）の条件下で行われてもよい。あるいは、活性の測定は、２５℃もしくは３７℃で１５分間の反応において活性を測定する条件であってもよい。このような条件下で使用される反応液組成は、例えば、１０μＭオリゴヌクレオチド、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰ、および酵素０．７２μｇ／ｍＬであってもよい。酵素の温度安定性と液状安定性および／または長期保存安定性は一般に相関し得るので、優れた温度安定性を有する本発明のリガーゼ変異体は、液状安定性および／または長期保存安定性に優れるということができる。したがって、本発明のリガーゼ変異体は、試薬として有用である。

本発明のリガーゼ変異体は、所望の同一性％および連結活性が維持される範囲内において１以上のアミノ酸残基の変異を有していてもよい。変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。例えば、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列（例、配列番号１～３）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明のリガーゼ変異体のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。このような位置における変異後のアミノ酸残基は、変異前のアミノ酸残基と異なる所望の天然α－アミノ酸残基である。このような所望の天然α－アミノ酸残基は、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ－リジン（Ｋ）、またはグリシン（Ｇ）の残基である。例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列では、配列番号１のアミノ酸配列に１～１６個のアミノ酸残基の変異が導入されてもよい。配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列では、配列番号２のアミノ酸配列に１～３３個のアミノ酸残基の変異が導入されてもよい。配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列では、配列番号３のアミノ酸配列に１～９個のアミノ酸残基の変異が導入されてもよい。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の置換、欠失、付加および挿入からなる群より選ばれる。

アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。

本発明のリガーゼ変異体はまた、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例、タグ部分）を含んでいても。本発明のリガーゼ変異体に含まれ得る他のペプチド成分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらをリガーゼ変異体とつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。

２．本発明のリガーゼ変異体の製造に関連し得る発明
本発明のリガーゼ変異体は、本発明のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換微生物を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。本発明はまた、このようなポリヌクレオチドおよび形質転換微生物、ならびに形質転換体の作製に利用できる発現ベクターを提供する。

本発明のポリヌクレオチドは、本発明のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましい。

本発明の形質転換微生物は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、またはゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｃｔｉｖａｔｏｒ－ＬｉｋｅＥｆｆｅｃｔｏｒＮｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むこと、および宿主細胞が固有に備える発現単位を改変することが可能である。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。

発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。

発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用されている発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。

本発明のリガーゼ変異体を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換微生物としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換微生物、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換微生物が挙げられる。

本発明の形質転換微生物は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃～３７℃であってもよく、ｐＨは６．５～７．５であってもよく、培養時間は１ｈ～１００ｈであってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行っても良い。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１～１０％を、好ましくは３％～８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することも出来る。

形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒアコリＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換微生物を選別する方法は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。

本発明のポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。また、ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等を用いてもよい。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。

また、本発明のポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。

本発明のポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。

また、形質転換微生物を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３－２（クローンテック製）〕。

得られた本発明の発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、本発明のリガーゼ変異体を得ることができる。

培地としては、Ｍ９－カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ_４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。

本発明のリガーゼ変異体を回収するには、以下の方法などがある。本発明のリガーゼ変異体は、本発明の形質転換微生物を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明のリガーゼ変異体を得ることができる。

３．核酸生成物の製造方法
本発明はまた、本発明のリガーゼ変異体の存在下で核酸材料を連結して核酸生成物を生成することを含む、核酸生成物の製造方法を提供する。核酸材料としては、一本鎖核酸材料、二本鎖核酸材料、およびそれらの混合物からなる群より選ばれるものを使用することができる。

（核酸）
核酸材料および核酸生成物における核酸は、天然核酸および修飾核酸に分類することができる。天然核酸とは、細胞に含まれるポリヌクレオチドを構成するヌクレオチド残基（アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）、デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシチジン（ｄＣ）、チミジン（ｄＴ）。以下、「天然ヌクレオチド残基」と呼ぶ。）から構成される核酸を（ＲＮＡおよびＤＮＡ）いう。修飾核酸とは、天然核酸以外の核酸をいい、天然ヌクレオチド残基以外のヌクレオチド残基（以下、「修飾残基」と呼ぶ。）を含む核酸である。修飾残基としては、例えば、修飾ヌクレオチド残基、アミノ酸残基、リンカーが挙げられる。修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、後述する修飾を含むヌクレオチド残基が挙げられる。アミノ酸には、アミノ酸の誘導体が含まれる。アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、およびこれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸の誘導体とは、アミノ酸中の任意の原子または基が、別の原子または基で置換されたアミノ酸をいい、例えば、アミノ基中の水素原子、カルボキシル基中の水素原子、酸素原子、水酸基、側鎖中の任意の原子もしくは基、または骨格炭素原子（例、α－、β－、γ－、δ－炭素原子）に結合した水素原子が、別の原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子）または基（例、後述する化学修飾における置換後の置換基）で置換されたアミノ酸が挙げられる。

修飾ヌクレオチド残基における修飾には、ヌクレオチド残基の糖部分（リボースまたはデオキシリボース）の原子または基の置換、ヌクレオチド残基の糖部分自体（糖骨格）の置換、およびヌクレオチド残基の核酸塩基部分の修飾（例、核酸塩基部分の置換基の置換）が含まれる。

ヌクレオチド残基の糖部分の原子または基の置換としては、例えば、１’－Ｈ、２’－ＯＨ（リボースのみ）、２’－Ｈ、３’－ＯＨ、３’－ＮＨ_２、３’－Ｈ、３’－リン酸基、４’－Ｈ、５’－リン酸基、またはこれらの組合せの置換が挙げられる。ここで、リン酸基には、－Ｏ－Ｐ(Ｏ）（ＯＨ)_２だけでなく、酸素原子が硫黄原子またはΝＨに置き換わった基（例えば、－Ｏ－Ρ（Ｓ）（ＯＨ）_２、－ＮＨ－Ρ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－ＮＨ－Ρ（Ｓ）（ＯＨ）_２）も含まれる。また、リン酸基中の水酸基（－ＯＨ)がＯＲ^＊(式中、Ｒ^＊は、リン酸基の保護基などの有機基を示す）に置き換わった基（例えば、保護されたリン酸基）も、リン酸基に含まれる。このような置換としては、例えば、１’、２’、３’、もしくは４’－化学修飾（１’、２’、３’、または４’部位における他の置換基への置換）、５’－または３’－リン酸基修飾（５’－または３’－リン酸基の他の置換基への置換）、架橋修飾（１’、２’、３’、または４’部位の２つ同士を架橋する置換）、およびキャリア付加修飾（１’、２’、３’、４’、または５’部位におけるキャリアへの置換）が挙げられる。

化学修飾は、例えば、オリゴヌクレオチドの分解耐性を向上させるために導入されてもよい。化学修飾における置換後の置換基としては、例えば、Ｃ_１～６アルキルオキシＣ_１～６アルキレン（例、メトキシエチル：ＭＯＥ）、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル（例、－Ｏ－Ｍｅ）、－Ｏ－Ｃ_６～１４アリール（例、－Ｏ－フェニル）、－Ｃ－アリール（例、－Ｃ－フェニル）、ハロゲン原子（例、フッ素原子）、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルＮ－アミドＣ_１～６アルキレン（例、－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド、－Ｏ－ＮＭＡ）、－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル－（Ｃ_１～６アルキル－）アミノ－Ｃ_１～６アルキレン（例、－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル、－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、および－Ｏ－アミノＣ_１～６アルキル（例、－Ｏ－アミノプロピル、－Ｏ－ＡＰ）が挙げられる。化学修飾は、２’－化学修飾（２’部位の置換）、３’－化学修飾（３’部位の置換）が好ましく、中でも、２’－化学修飾（２’部位の置換）がより好ましい。２’－化学修飾における置換後の置換基としては、例えば、２’－Ｃ_１～６アルキルオキシＣ_１～６アルキレン（例、２’－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル（例、２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－Ｃ_６～１４アリール（例、２’－Ｏ－フェニル）、２’－Ｃ－アリール（例、２’－Ｃ－フェニル）、２’－ハロゲン原子（例、２’－Ｆ）、２’－Ｏ－Ｃ_１～６アルキルＮ－アミドＣ_１～６アルキレン（例、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド、２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－Ｏ－Ｃ_１～６アルキル－（Ｃ_１～６アルキル－）アミノ－Ｃ_１～６アルキレン（例、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル、２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、および２’－Ｏ－アミノＣ_１～６アルキル（例、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－Ｏ－ＡＰ）が挙げられる。３’－化学修飾における置換後の置換基としては、例えば、３’－Ｏ－Ｐ(Ｏ）（ＯＨ)_２、３’－Ｏ－Ρ（Ｓ）（ＯＨ）_２、３’－ＮＨ－Ρ（Ｏ）（ＯＨ）_２、３’－ＮＨ－Ρ（Ｓ）（ＯＨ）_２）、および、リン酸基中の水酸基（－ＯＨ)がＯＲ^＊(式中、Ｒ^＊は、後述するリン酸基の保護基などの有機基を示す）に置き換わった基が挙げられる。

５’－または３’－リン酸基修飾は、例えば、オリゴヌクレオチドの分解耐性を向上させるために導入されてもよい。５’－または３’－リン酸基修飾としては、例えば、リン酸基（－Ｏ－Ｐ(Ｏ）（ＯＨ)_２）から、リン酸基において酸素原子が硫黄原子またはΝＨに置き換わった基への置換が挙げられる。このような基としては、例えば、－Ｏ－Ρ（Ｓ）（ＯＨ）_２（チオリン酸基：ホスホロチオエート修飾）、－ＮＨ－Ρ（Ｏ）（ＯＨ）_２、－ＮＨ－Ρ（Ｓ）（ＯＨ）_２が挙げられる。また、５’－または３’－リン酸基修飾には、リン酸基中の水酸基（－ＯＨ）がＯＲ^＊(式中、Ｒ^＊は、リン酸基の保護基などの有機基、を示す）に置き換わった基（例えば、保護されたリン酸基）も含まれる。リン酸基の保護基としては、例えば、トリチル（Ｔｒ）基、ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル（ＭＭＴｒ）基、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴｒ）基、シアノエチル基（ＣＮ－Ｃ_２Ｈ_４－）が挙げられる。

架橋修飾は、例えば、ヌクレオチド残基の立体構造安定性を向上させるために導入されてもよい。架橋修飾としては、例えば、２’４’－架橋修飾（２’－ＯＨと４’－Ｈを架橋する置換）、３’５’－架橋修飾（３’－Ｈと５’－Ｈを架橋する置換）等が挙げられる。２’４’－架橋修飾としては、例えば、２’－ＯＨと４’－Ｈの２’－Ｏ－Ｃ_１～６アルキレン－４’への置換（例、２’－Ｏ－メチレン－４’（ロック核酸：ＬＮＡ）、２’－Ｏ－エチレン－４’（エチレン架橋核酸：ＥＮＡ）、２’－Ｏ－メチル置換メチレン－４’への置換（コンストレインドエチル架橋化核酸：ＢＮＡの一種（ｃＥｔ－ＢＮＡ））、２’－ＯＨと４’－Ｈの２’－Ｏ－Ｃ_１～６アルキレン－Ｏ－Ｃ_１～６アルキレン－４’への置換（例、２’－Ｏ－メチレン－Ｏ－メチレン－４’（架橋化核酸：ＢＮＡの一種（ＢＮＡ^ＣＯＣ））、２’－ＯＨと４’－Ｈの２’－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－Ｃ_１～６アルキレン－４’への置換（例、２’－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－メチレン－４’（架橋化核酸：ＢＮＡの一種（ＢＮＡ^ＮＣ）、ここで、Ｒはメチル、水素原子またはベンジルを示す）、２’－ＮＨ_２と４’－Ｈの２’－Ｎ（Ｒ）－Ｃ（Ｏ）－４’への置換（例、２’－Ｎ（メチル）－Ｃ（Ｏ）－４’（アミド架橋核酸：ＡｍＮＡ））、２’－ＮＨ_２と４’－Ｈの２’－ＮＨ－Ｃ_１～６アルキレン－４’への置換（例、２’－ＮＨ－メチレン－４’）、２’－Ｈと４’－Ｈの２’－Ｃ_１～６アルキレン－４’への置換（例、２’－メチル置換エチレン－４’）が挙げられる。また、３’５’－架橋修飾としては、例えば、３’－Ｈと５’－Ｈの３’ －Ｃ_１～６アルキレン－５’への置換（例、３’－エチレン－５’（ビシクロ核酸：Ｂｃ核酸）、Ｂｃ核酸の一種：ｔｃ核酸等））が挙げられる。

キャリア付加修飾におけるキャリアは、目的の修飾オリゴヌクレオチドに安定性、標的指向性、薬効等の性能を向上または付与するためのキャリアであってもよい。このようなキャリアは、使用目的に応じて、公知のキャリアから適宜選択することができる。キャリアとしては、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ペプチド、リン酸、コレステロール、トコフェロール、脂肪鎖、葉酸が挙げられる。キャリア付加修飾における付加部位は、目的の修飾オリゴヌクレオチドの末端に相当する３’または５’部位が好ましい。

ヌクレオチド残基の糖部分自体の置換を含むヌクレオチド残基としては、例えば、５員環の糖から６員環の擬似糖への置換を含む修飾ヌクレオチド残基が挙げられる。このような修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）が挙げられる。また、ヌクレオチド残基の糖部分自体の置換を含む修飾ヌクレオチド残基としてはさらに、生体内の酵素（例、ＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼ）により分解を受けずかつ免疫応答を誘導しないモルフォリノ環構造を持つヌクレオチド類似人工化合物であるモルフォリノ核酸（ＰＭＯ）残基も挙げられる。

ヌクレオチド残基の核酸塩基部分の修飾としては、例えば、ヌクレオチド残基の核酸塩基部分がアルキル置換したもの（例、シトシル基の５位にメチル基が置換したもの）が挙げられる。

（核酸材料）
核酸材料は、単一であっても複数であってもよい。例えば、単一の核酸材料として、突出末端を有する二本鎖核酸が用いられる場合、本発明の方法は、当該二本鎖核酸の環化に用いることができる。複数の核酸材料が用いられる場合、本発明の方法は、突出末端を有する複数の二本鎖核酸の連結、突出末端を有する単一または複数の二本鎖核酸と単一または複数の一本鎖核酸との連結、複数の一本鎖核酸の連結等の連結に用いることができる。複数の核酸材料が用いられる場合の核酸材料の本数としては、２本以上であれば特に限定されず、例えば、２～１０本、２～８本、３～７本、４～６本等の比較的少数の本数であってもよいが、１０本を超える本数であってもよい。

核酸材料の長さは、特に限定されない。例えば、１０００塩基長を超える長い核酸材料を用いることができる。あるいは、短い核酸生成物の製造が所望される場合、短い核酸材料を用いることができる。短い核酸材料は、例えば５塩基長以上、好ましくは６塩基長以上、より好ましくは７塩基長以上、さらにより好ましくは８塩基長以上、特に好ましくは９塩基長以上であってもよい。短い核酸材料はまた、１９塩基長以下、好ましくは１８塩基長以下、より好ましくは１７塩基長以下、さらにより好ましくは１６塩基長以下、特に好ましくは１５塩基長以下であってもよい。

連結では、突出末端が利用されてもよい。連結で利用される突出末端としては、例えば、突出末端を有する二本鎖核酸（核酸材料）における突出末端、および核酸材料間（例、二本鎖核酸と一本鎖核酸との間、または一本鎖核酸間）のアリーリングで形成される突出末端が挙げられる。突出末端の長さは特に限定されないが、短い核酸生成物の製造が所望される場合、突出末端は、例えば１～１０塩基長であり、好ましくは１～８塩基長であり、より好ましくは１～６塩基長であり、さらにより好ましくは２～６塩基長、３～６塩基長または４～６塩基長であってもよい。したがって、核酸材料として、このような突出末端を有する二本鎖核酸、または複数の核酸材料の組合せ（例、二本鎖核酸と一本鎖核酸との組合せ、複数の一本鎖核酸の組合せ）が選択されてもよい。

核酸材料は、遊離の形態であっても、固相に固定されていてもよい。また、核酸生成物と機能性部分との複合体化が所望される場合、核酸材料は、その対応部分において機能性部分と複合体化されていてもよい。

核酸材料は、化学合成法（例、固相合成法、液相合成）または酵素的合成法により製造することができる。このような合成法としては、例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号、国際公開第２００５／０７０８５９号に記載の方法が挙げられる。

好ましくは、核酸材料は、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであってもよい。より好ましくは、このような核酸材料は、上述したような突出末端を有する二本鎖ＲＮＡ、または上述したような突出末端をアニーリングで形成するような複数のＲＮＡ材料の組合せ（例、二本鎖ＲＮＡと一本鎖ＲＮＡとの組合せ、複数の一本鎖ＲＮＡの組合せ）であってもよい。

（核酸生成物）
核酸生成物は、塩基が対合している相補部分を含む。このような核酸生成物としては、例えば、二本鎖核酸、二本鎖様構造部分を含む一本鎖核酸（例、ヘアピン型核酸、ダンベル型核酸等のループ型核酸）が挙げられる。二本鎖核酸は、各鎖が上述した核酸である二本鎖核酸であってもよく、例えば、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡからなるヘテロ二本鎖核酸、ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＤＮＡ混成核酸からなる二本鎖核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡ－ＤＮＡ混成核酸からなる二本鎖核酸、およびＲＮＡ－ＤＮＡ混成核酸同士からなる二本鎖核酸が挙げられる。二本鎖核酸としては、例えば、ｓｉＲＮＡやヘテロ二本鎖核酸が挙げられる。

特定の実施形態では、核酸生成物は、上述した修飾残基を相補部分に含んでいてもよい。このような核酸生成物としては、例えば、修飾型ヌクレオチド残基を含む二本鎖核酸またはループ型核酸（例、相補部分に修飾型ヌクレオチド残基を含む二本鎖核酸またはループ型核酸）、ループ部分に修飾型ヌクレオチド残基またはヌクレオチド残基以外の残基（例、アミノ酸残基やリンカー等）を含むループ型核酸が挙げられる（例、国際公開第２０１２／００５３６８号）。このような核酸生成物において、一部のヌクレオチド残基が修飾型ヌクレオチド残基であってもよく、全てのヌクレオチド残基が修飾型ヌクレオチド残基であってもよいが、修飾ヌクレオチド残基がモルフォリノ核酸（ＰＭＯ）残基の場合には、目的の修飾核酸において、一部のヌクレオチド残基がモルフォリノ核酸（ＰＭＯ）残基であるのが好ましい。また、このような核酸生成物には、その配列の両端に修飾型ヌクレオチド残基を有し、その配列の中央部にＲＮａｓｅの認識を受けるギャップ領域を有する核酸であるギャップマーが含まれ、さらに、その配列中に修飾型ヌクレオチド残基が混在している核酸であるミックスマー、その配列中の全てのヌクレオチド残基が修飾型ヌクレオチド残基である核酸である全修飾型核酸等のＲＮａｓｅ活性を誘導しない核酸も含まれる。

核酸生成物は、塩基が対合している相補部分のみからなる核酸であってもよいが、相補部分に加えて、塩基が対合していない非相補部分を含む核酸であってもよい。相補部分および／または非相補部分の長さは特に限定されないが、相補部分および／または非相補部分は短いものであってもよい。例えば、短い相補部分は、１１～２７塩基長、１２～２７塩基長、１５～２７塩基長、または１８～２７塩基長であってもよい。例えば、短い非相補部分は、１～１６塩基長、１～１０塩基長、１～５塩基長、または１、２もしくは３塩基長であってもよい。核酸生成物は、相補部分に加えて非相補部分を有する場合、相補部分は、連続形態であってもよいが、非相補部分により分断された非連続形態であってもよい。核酸生成物の長さは特に限定されないが、核酸生成物は短いものであってもよい。短い核酸生成物は、例えば、２０～８０塩基長、または２４～７４塩基長であってもよい。

好ましくは、核酸生成物は、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであってもよい。より好ましくは、このような核酸生成物は、上述したような修飾残基を相補部分に含んでいてもよい。

（連結のための反応条件）
反応系としては、水溶液を用いることができる。水溶液としては、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、炭酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液が挙げられる。ｐＨは、例えば約５～９であってもよい。例えば、目的の核酸生成物の効率的な大量生産が特に所望される場合、ｐＨは、７．５～９．０（例えば、８．０～８．５）であってもよい。

連結反応における各核酸材料の濃度は、核酸材料が溶解し、かつ目的の核酸生成物を生成するために十分な濃度であればよい。各核酸材料の濃度は、例えば１μＭ以上、１０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、３００μＭ以上、５００μＭ以上または１０００μＭ以上であってもよい。各核酸材料の濃度はまた、例えば１Ｍ、１００ｍＭ、または１０ｍＭ以下であってもよい。目的の核酸生成物の効率的な大量生産が特に所望される場合、上記濃度のうち１００μＭ以上の濃度で各核酸材料を用いることが好ましい。

連結反応において複数の核酸材料が用いられる場合、全核酸材料のモル数は、未反応の核酸材料量の低減により製造効率を向上させる観点から、ほぼ等量であることが好ましい。全核酸材料のモル数がほぼ等量であるためには、複数の核酸材料より選ばれる任意の２個の核酸材料の全モル比が、例えば０．５～２、好ましくは１／１．８～１．８、より好ましくは１／１．５～１．５、さらにより好ましくは１／１．２～１．２、特に好ましくは１／１．１～１．１の範囲内であってもよい。

連結反応における本発明のリガーゼ変異体の濃度は、目的の核酸生成物を生成するために十分な濃度であればよい。リガーゼ変異体の濃度は、例えば０．０１Ｕ／μＬ以上、好ましくは０．０２Ｕ／μＬ以上、より好ましくは０．０３Ｕ／μＬ以上、さらにより好ましくは０．０４Ｕ／μＬ以上であってもよい。リガーゼ変異体の濃度はまた、例えば１Ｕ／μＬ以下、好ましくは０．５Ｕ／μＬ以下、より好ましくは０．２Ｕ／μＬ以下、さらにより好ましくは０．１Ｕ／μＬ以下であってもよい。ここで、１ユニット（Ｕ）は、実施例２に記載の反応で１時間に１μｍｏｌの核酸生成物を生成するために必要な酵素量として定義される。

反応系は、補因子を含んでいてもよい。補因子としては、例えば、ＡＴＰ、二価金属塩（例、塩化マグネシウム等のマグネシウム塩）が挙げられる。反応系は、リガーゼの安定化剤を含んでいてもよい。リガーゼの安定化剤としては、例えば、酸化防止剤（例、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール等の還元剤）が挙げられる。反応系は、酵素の安定保持および反応速度向上等の目的のため、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤（例、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００等のＴｒｉｔｏｎシリーズの界面活性剤）、およびイオン性界面活性剤が挙げられる。イオン性界面活性剤としては、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤）が挙げられる。また、反応系は、反応速度向上等の目的のため、ポリエチレングリコールを含んでいてもよい。

反応系は、低濃度の一価カチオン塩を含むか、または一価カチオン塩を実質的に含んでいなくてもよい。反応系が一価カチオン塩を含む場合、反応系中の一価カチオン塩濃度は、例えば１０ｍＭ以下、好ましくは１ｍＭ以下、より好ましくは０．１ｍＭ以下、さらにより好ましくは０．０１ｍＭ以下であってもよい。特に好ましくは、反応系は、一価カチオン塩を実質的に含んでいなくてよい。一価カチオン塩としては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、アンモニウムイオン等の一価カチオンと、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のアニオンとの塩が挙げられる。

反応温度は、本発明のリガーゼ変異体の活性化のために十分な温度であればよい。このような温度は、例えば２～５０℃、好ましくは１６～５０℃、より好ましくは２５～５０℃であってもよい。

反応時間は、目的の核酸生成物を生成するために十分な時間であればよい。このような時間は、例えば１～７２時間であってもよい。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕ＲＮＡリガーゼの設計および調製
１）ＲＮＡリガーゼの設計
機能既知のＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０．１）を鋳型とし、Ｂｌａｓｔｐから類似配列を４２５個取得した。なおＢｌａｓｔｐの解析条件として、Ｍａｘｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓを１００００，Ｅｘｐｅｃｔｅｄｔｈｒｅｓｈｏｌｄの値を１．０Ｅ^－６に設定した。取得した類似配列を解析し、重複した配列及び配列長が明らかに鋳型と異なるものを除去することで、１７２配列まで選抜した。これを配列ライブラリーとした。その後文献１（Ｎａｋａｎｏ，Ｓ．，Ｍｏｔｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｙ．，Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｏ，Ｎ．，Ｔｏｋｉｗａ，Ｈ．，Ｓｈｉｎｏｄａ，Ｓ．，Ａｓａｎｏ，Ｙ．，ａｎｄＩｔｏ，Ｓ．（２０１８）ＢｅｎｃｈｍａｒｋＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮａｔｉｖｅａｎｄＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＮＡＤ^＋－ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＥｎｚｙｍｅｓＧｅｎｅｒａｔｅｄｂｙａＳｅｑｕｅｎｃｅ－ＢａｓｅｄＤｅｓｉｇｎＭｅｔｈｏｄｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃＤａｔａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５７，３７２２－３７３２．）及び２（Ｎａｋａｎｏ，Ｓ．，Ｎｉｗａ，Ｍ．，Ａｓａｎｏ，Ｙ．，ａｎｄＩｔｏ，Ｓ．（２０１９）ＦｏｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＴｒａｃｋｏｆａＨｉｇｈｌｙＳｐｅｃｉｆｉｃｌ－ＡｒｇｉｎｉｎｅＯｘｉｄａｓｅｂｙＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｎｃｅｓｔｒａｌａｎｄＮａｔｉｖｅＥｎｚｙｍｅｓ，ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ８５，ｅ００４５９－００４１９．）で用いた手法を適用することで、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２のモチーフ様配列（３２位がＡｌａ，１１６位がＰｈｅ，１７０位がＳｅｒ，２７４位がＩｌｅ）を同定した。配列ライブラリーにおいて、これらモチーフ様配列を有する配列のみ選抜し、最終的に２１配列のデータを得た。２１配列を用いて人工設計を行い、Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、およびＭｕｔ３と名づけた配列番号１～３のアミノ酸配列で示される人工ＲＮＡリガーゼ配列を設計した（図１）。

２）人工ＲＮＡリガーゼの発現菌株の構築
設計したＲＮＡリガーゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのコドンに最適化し、ｐＥＴ－１６ｂ（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩサイトに連結した発現プラスミドをユーロフィンジェノミクス社で合成した。Ｍｕｔ１、Ｍｕｔ２、およびＭｕｔ３に対応するＯＲＦとして配列番号４～６の塩基配列を有する各人工設計ＲＮＡリガーゼ発現プラスミドをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ含有のＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩培養して得られたコロニーを分離して各ＲＮＡリガーゼの発現菌株を取得した。この発現株では、Ｎ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付与された各ＲＮＡリガーゼが発現される。

３）人工ＲＮＡリガーゼの発現
各ＲＮＡリガーゼの発現菌株をアンピシリン１００ｍｇ／Ｌ含有のＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。生育した菌体をエーゼでかきとり、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地１５０ｍＬを添加した５００ｍｌ容の坂口フラスコに植菌した。３７℃でＯＤ_６００が０．５となるまで３時間１２０ｒｐｍで振とう培養を行った後、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、さらに３７℃、１２０ｒｐｍで３時間培養を継続した。培養終了後、得られた培養液１５０ｍｌより菌体を８０００ｒｐｍで３０分の遠心分離により回収した。

４）ＲＮＡリガーゼの精製
回収した菌体を２５０ｍＭＮａＣｌ，１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ，１５ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅを含む５０ｍＭｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１５ｍＬに懸濁した。さらにＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を終濃度５０μｇ／ｍＬ、１０％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を終濃度０．１％になるように添加し、氷上で３０分間静置した。３０分後、超音波破砕機（インソネータ２０１Ｍ）（クボタ）にて菌体を破砕し、１０，０００×ｇで１０分の遠心分離により菌体残渣を除き、上清を可溶性画分とした。

得られた可溶性画分を、ＡＫＴＡＰｕｒｅ（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）を用いて、前記緩衝液で平衡化したＨｉｓＴＡＬＯＮＳｕｐｅｒｆｌｏｗＣａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍＬ）（タカラバイオ）に添加して吸着させた。非吸着タンパク質を２５０ｍＭＮａＣｌ，１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ，１５ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅを含むＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）緩衝液３０ｍｌを用いて洗浄した後、２５０ｍＭＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２００ｍＭＩｍｉｄａｚｏｌｅを含む５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で溶出した。

２８０ｎｍの吸収でタンパク質の溶出を検出し、Ｈｉｓタグ融合タンパクとして発現したＲＮＡリガーゼが含まれる画分を集めた。４ｍｌの溶出画分を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－１５１０ｋＤａ（メルクミリポア）を用いて濃縮し、５０ｍＭＫＣｌ，３５ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，０．１ｍＭＥＤＴＡ，０．１ｍＭＤＴＴ，５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌを含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液にバッファーを置換し、５０μＬの溶液とした。精製酵素は本バッファー溶液として－２０℃で保管した。配列１から３で示されるアミノ酸配列からなる各人工ＲＮＡリガーゼをそれぞれＭｕｔ１、Ｍｕｔ２およびＭｕｔ３と名付けた。１５０ｍｌの培養液より各人工ＲＮＡリガーゼＭｕｔ１、Ｍｕｔ２およびＭｕｔ３をそれぞれ、４．２ｍｇ、１．１ｍｇ、および０．６５ｍｇ得た。

〔実施例２〕各人工ＲＮＡリガーゼによる４断片のライゲーション反応
１）ＲＮＡライゲーション反応条件
調製した３種の人工ＲＮＡリガーゼのリガーゼ活性を以下の条件で測定した。基質として表２の４断片のオリゴヌクレオチドを用い、図２で示すように４断片のオリゴヌクレオチドを連結して、相補する２断片のヌクレオチドを生成する反応を行った。対照として市販のＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いた。便宜上、ＭＯＤ１－Ｓ－１２ＵおよびＭＯＤ１－Ｓ－１２Ｄの連結反応で生成するオリゴヌクレオチドをセンス鎖、ＭＯＤ１－Ａ－１３ＵおよびＭＯＤ１－Ａ－１３Ｄより生成するオリゴヌクレオチドをアンチセンス鎖と表記した。

終濃度で１０μＭの各オリゴヌクレオチド、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰからなる反応液２０μＬを氷上で調製し、２００μＬ容のマイクロチューブにいれ、各精製酵素溶液５０μＬを終濃度０．３６μｇ／ｍＬとなるよう添加して反応を開始した。サーマルサイクラーで２５℃に保温し、反応開始１時間で、８０℃に上げ、５分間加熱することにより反応を停止した。ライゲーション産物の濃度を下記の条件でＨＰＬＣにより定量した。

２）ＨＰＬＣによる分析
ライゲーション産物のオリゴヌクレオチドをＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ（登録商標）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＢＥＨＣ１８Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ、１．７ μｍ２．１×５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣにより定量した。ＨＰＬＣはカラム温度６０℃、検出波長２６０ｎｍ、インジェクション量１０μＬ、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎの条件で、移動相として１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール、８ｍＭトリエチルアミン、０．００４％リン酸を含む溶離液Ａおよび１０％メタノールを含む溶離液Ｂを用い、表３に示すリニアグラジエントにより分析した。ライゲーション別に合成した産物と同じ配列のオリゴヌクレオチドを別途合成し、これを標品としてライゲーション産物の濃度を定量した。

３）結果
結果を表４に示す。ＭＯＤ１－Ｓ－１２ＵおよびＭＯＤ１－Ｓ－１２Ｄの連結反応で生成するオリゴヌクレオチドを便宜上、センス鎖と表記した。対照のＴ４ＲＮＡリガーゼ２を用いる反応では、１時間の反応によってセンス鎖のライゲーション産物が０．４７μＭ生成した。人工ＲＮＡリガーゼではいずれも反応速度が上昇し、Ｍｕｔ１の反応では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２の場合と比較して、１．９８μＭのライゲーション産物が生成し、約４．２倍に大きく向上した。また、Ｍｕｔ２およびＭｕｔ３でも、活性向上が観察され、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２と比較して、１時間の反応によるライゲーション産物量が約２．２倍に向上した。本反応で１時間に１μｍｏｌのライゲーション産物を生成するために必要な酵素量を１ｕｎｉｔとして定義すると、最も活性の高かったＭｕｔ１では５．５０ｕｎｉｔ／ｍｇと算出された。

〔実施例３〕基質高濃度条件での人工ＲＮＡリガーゼによる４断片のライゲーション反応
基質濃度を上げて、最も活性の向上したＭｕｔ１ＲＮＡリガーゼによるライゲーション反応を行った。基質として表５の４断片のオリゴヌクレオチドを用いた。対照としてＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いて反応した。図３（Ａ）に示すように、ＭＯＤ５－Ｓ－１１ＵおよびＭＯＤ５－Ｓ－１１Ｄの連結反応で生成するオリゴヌクレオチドをセンス鎖、ＭＯＤ５－Ａ－１２ＵおよびＭＯＤ５－Ａ－１２Ｄより生成するオリゴヌクレオチドをアンチセンス鎖と表記した。
終濃度で５００μＭの各オリゴヌクレオチド、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、１．４ｍＭＡＴＰ、および各酵素７．２μｇ／ｍＬを含む１０μＬの反応液を２００μＬ容のマイクロチューブに加えサーマルサイクラーで２５℃に保温した。反応開始後、０．５、１、２、４、６および２４時間で１μｌの反応液をサンプリングし、１０ｍＭＥＤＴＡ溶液４９μＬを添加して反応を停止した。ライゲーション産物の濃度を実施例２に記載の条件にてＨＰＬＣにより分析した。
ライゲーション産物の生成のタイムコースを図３（Ｂ）に示す。対照のＴ４ＲＮＡリガーゼ２では、アンチセンス側のライゲーション産物の生成速度が遅く、反応２４時間後のアンチセンス鎖およびセンス鎖のライゲーション産物量は、それぞれ３２０μＭおよび１２０μＭであり、基質として添加した４断片のオリゴヌクレオチドの一部が未反応のまま残存した。
一方、ライゲーション活性の向上したＭｕｔ１では、センス側およびアンチセンス側のオリゴヌクレオチドのライゲーション速度が大きく改善した。反応２４時間でのアンチセンス鎖およびセンス鎖のライゲーション産物量は、それぞれ４７０μＭおよび４５０μＭであり、基質として添加した４断片のオリゴヌクレオチドはほぼ完全に消費された。

〔実施例４〕人工ＲＮＡリガーゼの基質特異性
図４（Ａ）に示すように３断片のオリゴヌクレオチドを基質として、２断片のオリゴヌクレオチドを連結する反応で、人工ＲＮＡリガーゼの基質特異性の変化を調べた。連結されるオリゴヌクレオチドのライゲーションポイント近傍を修飾型ＲＮＡに置換したオリゴヌクレオチド、具体的には表６に示すようにライゲーションポイントから－２位、－１位、＋１位、＋２位の２’位がフッ素原子（Ｆ）やＯ－メチル、Ｏ－メトキシエチルに修飾された、または水素原子（ＤＮＡ）に置換されたオリゴヌクレオチドを基質として用いた。最も活性の向上したＭｕｔ１ＲＮＡリガーゼおよび、対照としてＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いた。終濃度で１０μＭのオリゴヌクレオチド５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰ、および各酵素１．７８μｇ／ｍＬを含む２０μＬの反応液を２００μＬ容のマイクロチューブに加え２５℃に保温した。反応開始後、１５分で３μｌの反応液をサンプリングし、１０ｍＭＥＤＴＡ溶液２７μＬを添加して反応を停止した。反応液に含まれるライゲーション産物の濃度を実施例２に記載の条件にてＨＰＬＣにより分析し、修飾核酸が含まれていないライゲーション産物を標品として、生成物を定量した。

１５分の反応で生成したライゲーション産物の量を図４（Ｂ）に示した。対照のＴ４ＲＮＡリガーゼ２では、全て天然型ＲＮＡからなるフラグメントを基質とした場合と比較して、－２位が２’－Ｆ、２’－ＭＯＥ、ＤＮＡまたは、－１位が２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－ＭＯＥ、ＤＮＡに置換したオリゴヌクレオチドを基質とした場合、ライゲーション産物量が５～５０％まで大きく減少した。一方、ライゲーション活性の向上したＭｕｔ１では、－２位が２’－ＦおよびＤＮＡに置換したオリゴヌクレオチドを基質とした場合でも、ライゲーション産物量は、全て天然型ＲＮＡからなるフラグメントを基質とした場合と同程度であった。また、Ｍｕｔ１では、どのオリゴヌクレオチドを基質としても、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２の２倍以上のライゲーション産物量を示した。

〔実施例５〕人工ＲＮＡリガーゼの温度安定性
人工設計ＲＮＡリガーゼの温度安定性の評価を行った。最も活性の向上したＭｕｔ１ＲＮＡリガーゼおよび、対照としてＴ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を用いた。基質として表７の４断片のオリゴヌクレオチドを用いた。表７に示すように、ＲＮＡ１－Ａ－１３ＵおよびＲＮＡ１－Ａ－１３Ｄより生成するオリゴ核酸をアンチセンス鎖と表記した。５４ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２．２ｍＭＭｇＣｌ_２、１．１ｍＭジチオスレイトール、０．４３ｍＭＡＴＰ、および各酵素０．７８μｇ／ｍＬを含む９．２μＬの溶液を２００μＬ容のマイクロチューブで２５℃に保温した。保温開始から２３時間後、５００μＭの基質を各０．２μＬ添加し、ライゲーション反応を開始した。反応液組成は１０μＭオリゴヌクレオチド、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、０．４ｍＭＡＴＰ、および各酵素０．７２μｇ／ｍＬである。反応開始後、１５分で３μＬをサンプリングし、１０ｍＭＥＤＴＡを２７μＬ添加することで反応を停止した。実施例２に記載の条件にてＨＰＬＣにより、アンチセンス鎖の生成物量を定量した。

１５分の反応で生成したライゲーション産物量および残存活性を表８に示した。対照のＴ４ＲＮＡリガーゼ２では、２５℃で２３時間保温した場合、未処理と比較して、ライゲーション産物量が１９％まで大きく低下した。一方、ライゲーション活性の向上したＭｕｔ１では、２５℃で２３時間保温した場合でも、ライゲーション産物量は未処理の８９％であり、安定性が向上していた。

同様に３７℃で４時間保温後の活性も測定した。表９に示すように、対照のＴ４ＲＮＡリガーゼ２では、３７℃で４時間保温した場合、ライゲーション産物量を確認できず大きく活性が低下していた。一方、ライゲーション活性の向上したＭｕｔ１では、３７℃で４時間保温した場合でも、ライゲーション産物量は未処理の８３％であり、安定性が向上していた。

Claims

下記（１）、（２）または（３）のリガーゼ変異体：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に比し１．５倍以上である核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に比し１．５倍以上である核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に比し１．５倍以上である核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
リガーゼ変異体が以下である、請求項１記載のリガーゼ変異体：
（１）配列番号１のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に比し１．５倍以上である核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；
（２）配列番号２のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に比し１．５倍以上である核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体；または
（３）配列番号３のアミノ酸配列に対して９７％以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２（ＮＰ＿０４９７９０）に比し１．５倍以上である核酸の連結活性を有するリガーゼ変異体。
核酸が、ＤＮＡおよび／または修飾核酸を含んでいてもよい一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡである、請求項１または２記載のリガーゼ変異体。
請求項１～３のいずれか一項記載のリガーゼ変異体の存在下で核酸材料を連結して核酸生成物を生成することを含み、
核酸材料が、一本鎖核酸材料、二本鎖核酸材料、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる、核酸生成物の製造方法。
核酸材料がＲＮＡである、請求項４記載の方法。
核酸材料が４本以上の一本鎖ＲＮＡである、請求項４または５記載の方法。
核酸生成物が１２～２７塩基長の相補部分を含む、請求項４～６のいずれか一項記載の方法。
核酸材料がＤＮＡおよび／または修飾核酸を含む、請求項４～７のいずれか一項記載の方法。
核酸材料の濃度が１μＭ以上である、請求項４～８のいずれか一項記載の方法。
核酸生成物がｓｉＲＮＡである、請求項４～９のいずれか一項記載の方法。
請求項１～３のいずれか一項記載のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
請求項１１記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項１～３のいずれか一項記載のリガーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む形質転換微生物。
請求項１～３のいずれか一項記載のリガーゼ変異体を、請求項１３記載の形質転換微生物を用いて生成することを含む、リガーゼ変異体の製造方法。