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JP7522656B2 - 常染色体優性網膜色素変性の処置のための材料および方法 - Google Patents

常染色体優性網膜色素変性の処置のための材料および方法 Download PDF

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JP7522656B2
JP7522656B2 JP2020545012A JP2020545012A JP7522656B2 JP 7522656 B2 JP7522656 B2 JP 7522656B2 JP 2020545012 A JP2020545012 A JP 2020545012A JP 2020545012 A JP2020545012 A JP 2020545012A JP 7522656 B2 JP7522656 B2 JP 7522656B2
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Description

分野
本出願は、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において、常染色体優性網膜色素変性（ＲＰ）を有する患者を処置するための材料および方法を提供する。
関連出願
本出願は、２０１７年１１月２１日に出願された米国仮出願第６２／５８９，１１１号、２０１８年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／６４９，１３３号、２０１８年７月２日に出願された米国仮出願第６２／６９３，０８０号、および２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，３１９号の利益を主張し、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照による配列表の組込み
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み（ファイル名：１７０６２１ＰＣＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ、１０，１２７，３４３バイトのＡＳＣＩＩテキストファイル、２０１８年１１月１５日に作成）、これは、参照によりその全体が組み込まれ、本開示の一部をなす。
網膜色素変性（ＲＰ）は、眼の後方に並ぶ光感受性組織である網膜の細胞の破壊および喪失を伴う、珍しい遺伝子障害である。一般的な症状としては、夜間の見えにくさおよび周辺視野の喪失が挙げられる。
ＲＰと関連する視力喪失を有する人が日常活動を行い、自立を維持するためのいくつかのサービスおよびデバイスが利用可能である。しかしながら、これらのサービスおよびデバイスを用いても、ＲＰを有する個体にとって生活は困難であり得る。
ＲＰに対処しようと試みている世界中の研究者および医療従事者による努力にもかかわらず、ＲＰの安全かつ有効な処置を開発する極めて重要な必要性が依然として残っている。
本開示は、常染色体優性ＲＰを改善する新規なアプローチを提示する。この新規なアプローチは、ＲＨＯ遺伝子における変異、例えば、Ｐ２３Ｈ変異を標的とし、またこの新規なアプローチは、１回程度の少ない処置により、タンパク質レベルでＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子の発現を低減または排除することができる。結果として得られる治療法により、常染色体優性ＲＰの作用を改善することができるか、またはそれを完全に排除することができる。
ヒト細胞においてＲＨＯ遺伝子を編集するための方法が、本明細書に提示される。本方法は、ヒト細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子またはＲＨＯ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらし、それによって、編集されたヒト細胞を作り出すステップであって、ＳＳＢまたはＤＳＢは、ＲＨＯ遺伝子内もしくはその近傍に、またはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つまたは複数の変異の恒久的な欠失、挿入、修正、またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらす、ステップを含む。
ヒト細胞においてＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍に、Ｐ２３Ｈ変異の恒久的な欠失、挿入、修正、またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって、編集されたヒト細胞を作り出すステップを含む。
常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者の細胞においてＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するステップを含む。
常染色体優性ＲＰを有する患者に由来する細胞において、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。１つまたは複数のｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
常染色体優性網膜色素変性を有する患者を処置するための治療であって、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための少なくとも１つまたは複数のｇＲＮＡを含む、治療もまた、本明細書に提示される。１つまたは複数のｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入するステップと、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入するステップと、必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型を導入するステップとを含む方法によって形成される、常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するための治療もまた、本明細書に提示される。１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏで常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのキットもまた、本明細書に提示される。キットは、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、および必要に応じて１つまたは複数のドナー鋳型を含む。１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
配列番号５２８７の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５２８８の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５２８９の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５２９０の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５２９１の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３１９の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３２０の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３２１の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３２２の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３５８の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５２９０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５２９１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３１９、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３２０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３２１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３２２、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
配列番号５３５８、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２８７を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２８８を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２８９を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９０を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９１を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３１９を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２０を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２１を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２２を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３５８を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３１９、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２２、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３５８、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２８７を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２８８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２８９を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２９０を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２９１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３１９を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２０を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２２を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３５８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを、患者へと投与するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５２９１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５３１９、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５３２０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５３２１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５３２２、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが、配列番号５３５８、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系もまた、本明細書に提示される。自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、第１のセグメント、第２のセグメント、および１つまたは複数の第３のセグメントを含む。第１のセグメントは、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。第２のセグメントは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２９０を含む。１つまたは複数の第３のセグメントは、自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ＳＩＮ部位に実質的に相補的である。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ゲノム標的配列に実質的に相補的である。
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系もまた、本明細書に提示される。自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、第１のセグメント、第２のセグメント、および１つまたは複数の第３のセグメントを含む。第１のセグメントは、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。第２のセグメントは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２９１を含む。１つまたは複数の第３のセグメントは、自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ＳＩＮ部位に実質的に相補的である。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ゲノム標的配列に実質的に相補的である。
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系もまた、本明細書に提示される。自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、第１のセグメント、第２のセグメント、および１つまたは複数の第３のセグメントを含む。第１のセグメントは、ＳａＣａｓ９またはその任意のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。第２のセグメントは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。１つまたは複数の第３のセグメントは、自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ＳＩＮ部位に実質的に相補的である。ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ゲノム標的配列に実質的に相補的である。ＳＩＮ部位は、配列番号５３１３～５３１４からなる群から選択される配列を含む。
本明細書に記載される本発明は、この発明の概要に要約される例に限定されないことを理解されたい。様々な他の態様が、本明細書に記載され、例証される。
本明細書において開示し、説明するＲＰの処置のための材料および方法の様々な態様は、付属の図を参照して、より良く理解することができる。
図１Ａ～Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。
図１Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。
図２Ａ～Ｃは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての標的ＤＮＡ配列、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖（reverse strand）を示す。図２Ａは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての標的ＤＮＡ配列を示す。
図２Ｂは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
図２Ｃは、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについてのｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
図２Ｄ～Ｆは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての、標的ＤＮＡ配列、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｄは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての標的ＤＮＡ配列を示す。
図２Ｅは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
図２Ｆは、４個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについての、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
図２Ｇ～Ｉは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての、標的ＤＮＡ配列、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｇは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての標的ＤＮＡ配列を示す。
図２Ｈは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
図２Ｉは、１個のｓｇＲＮＡ配列についての、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
図３は、野生型ロドプシン遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡのオンターゲット編集効率および変異体Ｐ２３Ｈロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡのオフターゲット編集効率を示す。
図４は、変異体Ｐ２３Ｈロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡのオンターゲット編集効率およびオフターゲット編集効率を示す。
図５Ａ～Ｄは、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）ならびにｐＳＩＡ０１０およびｐＳＩＡ０１１のＡＡＶ配列の構造的配置を示す。図５Ａは、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）の構造的配置を示す。
図５Ｂは、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）の構造的配置を示す。
図５Ｃは、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）の構造的配置を示す。
図５Ｄは、ｐＳＩＡ０１０およびｐＳＩＡ０１１のＡＡＶ配列の構造的配置を示す。ｐＳＩＡ０１０は、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである。ｐＳＩＡ０１１は、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである。
図６Ａ～Ｎは、Ｐ２３Ｈ ２０マー（mer）ｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１０、またはＰ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１１、および（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）、のいずれかで共トランスフェクトされている２つの異なるＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞株についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ａは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｂは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｃは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｄは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。
図６Ｅは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｆは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｇは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｈは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。
図６Ｉは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｊは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｋは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、いかなるＤＮＡでもトランスフェクトされないＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｌは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１０および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｍは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、（１）ｐＳＩＡ０１１および（２）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１α）で共トランスフェクトされているＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。図６Ｎは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、いかなるＤＮＡでもトランスフェクトされないＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す。
図７Ａ～Ｂは、Ｐ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１０、またはＰ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列を含むプラスミドである、ｐＳＩＡ０１１、および（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）、のいずれかで共トランスフェクトされている２つの異なるＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞株についてのウエスタンブロットデータを示す。図７Ａは、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＳａＣａｓ９、アクチンおよびＧＦＰ発現を示すウエスタンブロットである。これらのＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞は、ｐＳＩＡ０１０またはｐＳＩＡ０１１のいずれかでトランスフェクトされている。ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞はまた、（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）、または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）のいずれかでトランスフェクトされている。
図７Ｂは、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＳａＣａｓ９、アクチンおよびＧＦＰ発現を示すウエスタンブロットである。これらのＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞は、ｐＳＩＡ０１０またはｐＳＩＡ０１１のいずれかでトランスフェクトされている。ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞はまた、（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）、または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）のいずれかでトランスフェクトされている。
図８は、青色蛍光タンパク質へと融合されたＣａｓ９標的部位（Ｐ２３Ｈ変異を含む野生型ＲＨＯ遺伝子またはＲＨＯ遺伝子のいずれか）を含むドナープラスミドを示す。
図９Ａ～Ｂは、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介してゲノムＤＮＡへと導入されたＰ２３Ｈ変異およびヒトロドプシン遺伝子のコドン２３の一塩基変異（single nucleotide mutation）を示す。図９ＡはＨＤＲを介してゲノムＤＮＡへと導入されたＰ２３Ｈ変異を示す。
図９Ｂは、ヒトロドプシン遺伝子のコドン２３での一塩基変異を示す。
図１０は、野生型ロドプシン遺伝子をターゲティングする合成ｓｇＲＮＡのオンターゲット／オフターゲット編集効率およびＰ２３Ｈ変異体ロドプシン遺伝子をターゲティングする合成ｓｇＲＮＡのオンターゲット／オフターゲット編集効率を記載する。
図１１は、Ｐ２３Ｈ変異体ロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのオンターゲット／オフターゲット編集効率を記載する。
図１２は、Ｐ２３Ｈ変異体ロドプシン遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのオンターゲット／オフターゲット編集効率を記載する。
図１３は、非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１０が網膜下注射を介してＰ２３Ｈ－ｈＲＨＯ－ＲＦＰマウスおよび対照ｈＲＨＯ－ＧＦＰマウスへと送達されたｉｎ ｖｉｖｏ実験を示す。
配列表の簡単な説明
配列番号１～６１２は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ配列である。
配列番号６１３～４６９６は、マイクロＲＮＡ配列である。
配列番号４６９７～５２６５は、ＡＡＶ血清型配列である。
配列番号５２６６は、ＲＨＯヌクレオチド配列である。
配列番号５２６７～５２６９は、ＳｐＣａｓ９が複合体化される、ｓｇＲＮＡ骨格配列の例を示す。
配列番号５２７０は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の例である。
配列番号５２７１は、その構造で分類される、公知のホーミングエンドヌクレアーゼファミリーを示す。
配列番号５２７２～５２８１は、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を表す配列である。
配列番号５２８２～５２８４は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子またはＲＨＯ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための１８～２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５２８５～５２８６は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子またはＲＨＯ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための１９～２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５２８７～５２８９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍をターゲティングするための１８～２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５２９０～５２９１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍をターゲティングするための１９～２０ｂｐのスペーサー配列である。
配列番号５２９２～５３０１は、１０個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する、標的ＤＮＡ配列の逆鎖を表す配列である。
配列番号５３０２は、配列番号５２８７および５２６７を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３０３は、配列番号５２８８および５２６７を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３０４は、配列番号５２８９および５２６７を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３０５～５３０７は、配列を含まない。
配列番号５３０８は、配列番号５２９０および５３２７を含むｓｇＲＮＡをコードする、ＡＡＶ配列を含むプラスミド配列である、ｐＳＩＡ０１０である。
配列番号５３０９は、配列番号５２９１および５３２７を含むｓｇＲＮＡをコードする、ＡＡＶ配列を含むプラスミド配列である、ｐＳＩＡ０１１である。
配列番号５３１０は、図５Ａに示される、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１（ｓＥＦ１αプロモーター）を含むプラスミド配列である。
配列番号５３１１は、図５Ｂに示される、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２（ｓＥＦ１αプロモーター）を含むプラスミド配列である。
配列番号５３１２は、図５Ｃに示される、非ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（ｓＥＦ１αプロモーター）を含むプラスミド配列である。
配列番号５３１３は、図５Ａに示されるＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１においてＳａＣａｓ９ ＯＲＦの上流に位置し、図５Ｂに示されるＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２においてＳａＣａｓ９ ＯＲＦの上流に位置する、可能なＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）である。
配列番号５３１４は、図５Ａに示されるＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン１または図５Ｂに示されるＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９バージョン２において、ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ内に位置する、天然に存在するイントロンまたはキメラ挿入（chimeric inserted）イントロン内に位置する、可能なＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）である。
配列番号５３１５～５３１８は、４つのｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を表す配列である。
配列番号５３１９～５３２２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異にわたるゲノム配列をターゲティングするための２１～２４ｂｐのプロトスペーサー配列である。
配列番号５３２３～５３２６は、４つのｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する、標的ＤＮＡ配列の逆鎖を表す配列である。
配列番号５３２７～５３３８は、ＳａＣａｓ９が複合体化される、ｓｇＲＮＡ骨格配列の例を示す。
配列番号５３３９は、ｐＳＩＡ０１０におけるＡＡＶ配列である。
配列番号５３４０は、ｐＳＩＡ０１１におけるＡＡＶ配列である。
配列番号５３４１は、ＳＩＮ－ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９バージョン１（ＧＲＫ１）におけるＡＡＶ配列である。
配列番号５３４２は、ＳＩＮ－ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９バージョン２（ＧＲＫ１）におけるＡＡＶ配列である。
配列番号５３４３は、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞株を生成するために、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子内またはその近傍をターゲティングするためのＲＮＡプロトスペーサー配列である。
配列番号５３４４は、ＲＨＯ遺伝子内またはその近傍に位置する標的ＤＮＡ配列であり、これを標的として、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞株を生成した。
配列番号５３４５は、ｓｇＲＮＡが結合する、ＲＨＯ遺伝子内またはその近傍に位置する標的ＤＮＡ配列の逆鎖である。
配列番号５３４６は、相同組換え修復の鋳型として使用される、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞株を生成する。
配列番号５３４７が、ＲＨＯ遺伝子のコドン２３の周囲を増幅させるために使用されるフォワードプライマーである。
配列番号５３４８は、ＲＨＯ遺伝子のコドン２３の周囲を増幅させるために使用されるリバースプライマーである。
配列番号５３４９は、配列番号５２８５および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５０は、配列番号５２８６および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５１は、配列番号５２９０および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５２は、配列番号５２９１および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５３は、配列番号５３１９および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５４は、配列番号５３２０および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５５は、配列番号５３２１および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５６は、配列番号５３２２および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３５７は、１つのｓｇＲＮＡ配列の標的ＤＮＡ配列を表す配列である。
配列番号５３５８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を含むゲノム配列をターゲティングするための１８ｂｐのＲＮＡプロトスペーサー配列である。
配列番号５３５９は、１つのｓｇＲＮＡ配列について、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を表す配列である。
配列番号５３６０は、配列番号５３５８および５３３２を含む、全長ｓｇＲＮＡである。
配列番号５３６１は、配列番号５３５８を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
配列番号５３６２は、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
配列番号５３６３は、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
配列番号５３６４は、配列番号５３２２を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
配列番号５３６５は、配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
配列番号５３６６は、配列番号５３２０を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
配列番号５３６７は、配列番号５３１９を含むｓｇＲＮＡをコードするプラスミド配列である。
詳細な説明
治療アプローチ
本明細書に提示される方法は、細胞の、ｅｘ ｖｉｖｏ方法か、ｉｎ ｖｉｖｏ方法かに関係なく、以下のうちの１つまたは組合せを含み得る：１）非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に起因して生じる挿入もしくは欠失により、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子にフレームシフト変異を導入することによって、タンパク質レベルで、Ｐ２３Ｈ変異体対立遺伝子の発現を低減もしくは排除すること、２）ＨＤＲによってＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を修正すること、または３）ＲＨＯ遺伝子のローカスもしくはセーフハーバーローカスにＲＨＯ ｃＤＮＡをノックインすること。
ＮＨＥＪフレームシフト戦略は、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ）により、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内もしくはその近傍に１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導すること、または２つもしくはそれよりも多いＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび２つもしくはそれよりも多いｓｇＲＮＡにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内もしくはその近傍に２つもしくはそれよりも多い一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導することを含み得る。このアプローチは、Ｐ２３Ｈ変異体対立遺伝子にフレームシフトを引き起こすことによって、Ｐ２３Ｈ変異体対立遺伝子の転写／合成を防止することができる。この方法は、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異に特異的なｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを用いる。
ＨＤＲ修正戦略は、相同組換え修復に対する細胞内ＤＳＢ応答を導くために外部から導入したドナーＤＮＡ鋳型の存在下において、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよび１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡ）により、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内もしくはその近傍に１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導すること、または１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）および２つもしくはそれよりも多いｇＲＮＡにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内もしくはその近傍に２つもしくはそれよりも多い一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導することを含み得る。ドナーＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、短い二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、長い一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。本方法は、遺伝子を２回切断することによって欠失を作製するｇＲＮＡの対を提供し得、これは、一方のｇＲＮＡがＰ２３Ｈ変異の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡが、Ｐ２３Ｈ変異の３’末端で切断し、それによって、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を置き換えるポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列の挿入が促進される。切断は、それぞれがＤＳＢを作製する１対のＤＮＡエンドヌクレアーゼ（Ｐ２３Ｈ変異のそれぞれの末端に１つのＤＳＢ）、または一緒になってＤＳＢを作製する複数のニッカーゼ（Ｐ２３Ｈ変異のそれぞれの末端に１つのＤＳＢ）によって、達成することができる。この方法は、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異に特異的なｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡ分子を用いる。
ノックイン戦略は、ＲＨＯ遺伝子の第１のもしくは他のエクソンおよび／もしくはイントロンの上流もしくはそこをターゲティングする１つのｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）または１対のｇＲＮＡを使用して、ＲＨＯ遺伝子のローカス、またはセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１）に、ＲＨＯ ｃＤＮＡをノックインすることを含む。ドナーＤＮＡは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得る。
上記の戦略（フレームシフト、修正、およびノックイン戦略）の利点は、原則、短期的および長期的の両方の有益な臨床効果および実験室効果を含め、類似である。ノックインアプローチは、フレームシフトおよび修正のアプローチを上回る少なくとも１つの利点、すなわち、一部の患者のみを処置するのに対して、全ての患者を処置する能力を提供する。
そのような方法は、ＲＨＯ遺伝子のゲノムローカス内のＰ２３Ｈ変異を安定に修正するために、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼを使用する。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを、本開示の方法において使用することができ、それぞれのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、疾患特異的な場合もあり、疾患特異的でない場合もある、それ自体と関連するＰＡＭを有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５２８７～５２８９に特定されている。Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を標的とするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５２９０～５２９１に特定されている。
本開示に記載される例は、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍に、一本鎖切断または二本鎖切断を誘導して、わずか単回の処置で（潜在的治療法を患者の生涯にわたり送達するのではなく）、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異にフレームシフトを導入するかまたはそれを修正することができる。
網膜色素変性（ＲＰ）
網膜色素変性（ＲＰ）は、網膜変性を引き起こす遺伝疾患の群を指す。ＲＰと関連している６０個を上回る遺伝子が同定されており、それらは、常染色体劣性（５０～６０％）、常染色体優性（３０～４０％）、またはＸ連鎖型（５～１５％）である。いくつかの場合には、ＲＰは、ＲＨＯ遺伝子における変異によって引き起こされる。ＲＨＯにおけるＰ２３Ｈ変異は、米国ではおよそ２５００人の患者に相当する、全ての進行性網膜色素変性のうちの１０％を占め、１年につきおよそ３０人の新しい患者がいる。この変異は、光受容器の変性と関連するフォールディングされていない変異したロドプシンの蓄積をもたらす。この障害は、光受容器（桿体および錐体）または網膜の網膜色素上皮の異常、ならびに進行的な視力喪失をもたらす周辺部網膜における色素沈着を特徴とする。典型的なＲＰは、主として桿体、続いて錐体の変性を伴う、桿体－錐体ジストロフィーである。この疾患の発生率は、１：３０００～１：７０００の個体、または１００，０００人につき１４～３３人である。米国および欧州における発生率は、約１：３５００～１：４０００であり、発症年齢は、通常、１０～３０歳である。ＲＰは、いずれの民族特異性も示さないが、所与の遺伝子内の病原性バリアントの範囲は、集団間で異なり得る。
ＲＰは、数十年にわたって進展する長期持続性の疾患である。この疾患に罹患した個体は、まず、夜盲を経験し、続いて、日中における周辺部視野の進行的な喪失を経験し、最終的に、失明する。臨床発現としては、夜盲、視力、眼底の外観、後嚢下白内障、硝子体における塵様粒子（dust-like particle）、網膜深部の白色斑点、視神経乳頭のヒアリン体、滲出性血管症、および区画性ＲＰ（sector RP）が挙げられる。「区画性ＲＰ」という用語は、それぞれの眼底の４分の１または２分の１における変化を記載するために使用されている。最も一般的には、下側および鼻側の４分の１区分が、対称に関与する。そのような区画性変化（sectoral change）は、常染色体優性ＲＰにおいて、例えば、ＲＨＯにおける一般的なＰ２３Ｈ病原性バリアントを有する人々、およびＸ連鎖型ＲＰについてはヘテロ接合性の女性において、観察されている。網膜は、検眼鏡検査、網膜電図検査、光干渉断層撮影、フルオレセイン血管造影によって評価され、視覚の機能的評価は、視力、視野、および色覚によって行われる。
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異によって引き起こされるＲＰは、常染色体優性遺伝を有する単一遺伝子障害である。患者が、１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子しか有さない場合、フレームシフトを、細胞ごとに１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子へと導入して、１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子の転写／合成を防止することができる。フレームシフトを、細胞ごとに１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子へと導入して、１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子の転写／合成を防止することによる、常染色体優性ＲＰの作用を改善するための新規なアプローチが開発されている。
また、患者が、１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子しか有さない場合、その１つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子を修正して、ＲＨＯ機能を回復させることができる。患者が、２つのＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子を有する場合、両方のＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子をＨＤＲにより修正して、ＲＨＯ機能を回復させることができる。
遺伝子編集を使用して、フレームシフトをＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子に導入することまたはＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子を修正することは、その精度および低い有害作用のため、レンチウイルス送達および組込みを通じたＲＨＯ発現カセットの導入などの既存または潜在的な治療を上回る重要な改善を提供する。
ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子
ＲＨＯは、ロドプシン２；オプシン－２；ＯＰＮ２；常染色体優性網膜色素変性４；オプシン２、桿体色素；桿体色素；オプシン２；ＣＳＮＢＡＤ１；またはＲＰ４とも称され得る。
ＲＨＯは、細胞遺伝学的位置３ｑ２２．１を有し、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースで見られるゲノム座標は、フォワード鎖の第３染色体の１２９，５２８，６４０位～１２９，５３５，１６９位にある。ＲＨＯのヌクレオチド配列は、配列番号５２６６として示される。ＲＨＯは、８２６個のＳＮＰ、４個のイントロン、および５個のエクソンを有する。Ｅｎｓｅｍｂｌからのエクソンの識別子、ならびにイントロンおよびエクソンの開始／終止部位を、表１に示す。
Figure 0007522656000001
ＲＨＯは、８２６個のＳＮＰを有し、ＲＨＯ遺伝子のＳＮＰのＮＣＢＩ ｒｓ番号および／またはＵｎｉＰｒｏｔ ＶＡＲ番号は、ＶＡＲ＿００４７６５、ＶＡＲ＿００４７６６、ＶＡＲ＿００４７６７、ＶＡＲ＿００４７６８、ＶＡＲ＿００４７６９、ＶＡＲ＿００４７７０、ＶＡＲ＿００４７７１、ＶＡＲ＿００４７７２、ｒｓ１０４８９３７７０、ＶＡＲ＿００４７７４、ｒｓ１４９０７９９５２、ＶＡＲ＿００４７７６、ＶＡＲ＿００４７７７、ｒｓ２８９３３３９５、ｒｓ２８９３３３９４、ＶＡＲ＿００４７８１、ＶＡＲ＿００４７８２、ＶＡＲ＿００４７８３、ＶＡＲ＿００４７８４、ｒｓ１４４３１７２０６、ＶＡＲ＿００４７８６、ＶＡＲ＿００４７８７、ＶＡＲ＿００４７８８、ＶＡＲ＿００４７８９、ＶＡＲ＿００４７９０、ＶＡＲ＿００４７９１、ＶＡＲ＿００４７９２、ＶＡＲ＿００４７９３、ＶＡＲ＿００４７９４、ＶＡＲ＿００４７９５、ＶＡＲ＿００４７９６、ＶＡＲ＿００４７９７、ＶＡＲ＿００４７９８、ＶＡＲ＿００４７９９、ＶＡＲ＿００４８００、ＶＡＲ＿００４８０１、ＶＡＲ＿００４８０２、ＶＡＲ＿００４８０３、ＶＡＲ＿００４８０４、ＶＡＲ＿００４８０５、ＶＡＲ＿００４８０６、ＶＡＲ＿００４８０７、ＶＡＲ＿００４８０８、ＶＡＲ＿００４８０９、ＶＡＲ＿００４８１０、ＶＡＲ＿００４８１１、ＶＡＲ＿００４８１２、ＶＡＲ＿００４８１３、ＶＡＲ＿００４８１４、ＶＡＲ＿００４８１５、ＶＡＲ＿００４８１６、ｒｓ５６７２８８６６９、ｒｓ２８９３３９９３、ＶＡＲ＿００４８１９、ＶＡＲ＿００４８２０、ＶＡＲ＿００４８２１、ＶＡＲ＿００４８２２、ＶＡＲ＿００４８２５、ＶＡＲ＿００４８２６、ＶＡＲ＿００４８２７、ｒｓ２９００１６５３、ＶＡＲ＿００４８２９、ＶＡＲ＿００４８３０、ＶＡＲ＿００４８３１、ＶＡＲ＿００４８３２、ＶＡＲ＿００４８３３、ＶＡＲ＿００４８３４、ＶＡＲ＿００４８３５、ｒｓ２９００１５６６、ｒｓ２９００１６３７、ＶＡＲ＿０６８３５９、ＶＡＲ＿０６８３６０、ｒｓ２４１０、ｒｓ７９８４、ｒｓ２０７１０９２、ｒｓ２０７１０９３、ｒｓ２２６９７３６、ｒｓ２６２５９５３、ｒｓ２６２５９５５、ｒｓ２８５５５５７、ｒｓ２８５５５５８、ｒｓ３７５５８３７、ｒｓ６８０３４８４、ｒｓ１１３５９２０８、ｒｓ５５９１５５３６、ｒｓ５５９４１５９９、ｒｓ３５００５８２４、ｒｓ３５６４９１０４、ｒｓ３４２０４５８２、ｒｓ６０７４４５４８、ｒｓ５８５０８８６２、ｒｓ３５８２２８８３、ｒｓ６１１７０４５５、ｒｓ７２９８７９３２、ｒｓ６２２６７５６３、ｒｓ７４４３５８３３、ｒｓ７５４５６７５２、ｒｓ７３８６３１０３、ｒｓ７４５７８８８１、ｒｓ７３２０４２４５、ｒｓ７３２０４２４７、ｒｓ７７１５４５２３、ｒｓ７７５３０１７８、ｒｓ７８１６３００８、ｒｓ７５７８３５６９、ｒｓ７６２８８５６５、ｒｓ１１３３１０９９３、ｒｓ１１３３１２３４１、ｒｓ１１１８２３７８０、ｒｓ１３９０２８１５０、ｒｓ１１５３４５３５７、ｒｓ１４２２８５８１８、ｒｓ１４２３２２２０２、ｒｓ１１３７５１８３８、ｒｓ１３９３７４４２３、ｒｓ１１３９６４８９７、ｒｓ１４０８５１４９５、ｒｓ１１７８０３０８６、ｒｓ１４４２２２８２１、ｒｓ１４４２７０４４１、ｒｓ１０４８９３７６８、ｒｓ１０４８９３７６９、ｒｓ１０４８９３７７１、ｒｓ１０４８９３７７２、ｒｓ１０４８９３７７４、ｒｓ１０４８９３７７５、ｒｓ１０４８９３７７６、ｒｓ１０４８９３７７７、ｒｓ１０４８９３７７８、ｒｓ１０４８９３７７９、ｒｓ１０４８９３７８０、ｒｓ１０４８９３７８２、ｒｓ１０４８９３７８３、ｒｓ１０４８９３７８６、ｒｓ１０４８９３７８７、ｒｓ１０４８９３７８８、ｒｓ１０４８９３７９３、ｒｓ１０４８９３７９４、ｒｓ１０４８９３７９６、ｒｓ１０４８９３７９７、ｒｓ１３９５０２１４９、ｒｓ１４５９２１８６２、ｒｓ１１８１７３８８７、ｒｓ１４４３３９４７８、ｒｓ１２１９１８５９０、ｒｓ１０４８９３７９５、ｒｓ１０４８９３７９２、ｒｓ１０４８９３７９１、ｒｓ１０４８９３７９０、ｒｓ１４２７７１８６２、ｒｓ１３９７３１２６４、ｒｓ１４１１８５４８０、ｒｓ１０４８９３７８９、ｒｓ１０４８９３７８１、ｒｓ１０４８９３７７３、ｒｓ１４３００３９３４、ｒｓ１４６３１１６８４、ｒｓ１１２９６３１０１、ｒｓ１４６３２７７０４、ｒｓ１４４２１１１１７、ｒｓ１３９４３５５７１、ｒｓ１１２４４５１７０、ｒｓ１４４８５２７７１、ｒｓ８０２６３７１３、ｒｓ１１３８２３９２６、ｒｓ１４５００４３０６、ｒｓ１１６３５１７４２、ｒｓ１１２３０２７９７、ｒｓ１１１８７１１４０、ｒｓ１４９０８４５３７、ｒｓ１３８８３１５９０、ｒｓ１４５２４８７２９、ｒｓ１４１８４４３９７、ｒｓ７８８７２２５５、ｒｓ７９３１１８９０、ｒｓ７６２５７８２２、ｒｓ１４１９５１１１８、ｒｓ１４３７３５１８２、ｒｓ１４１９５６３５６、ｒｓ７９７６５７５１、ｒｓ１８１９１４９７３、ｒｓ１４７００５８０７、ｒｓ６０６４５９２４、ｒｓ５６３４０６１５、ｒｓ１４５５４９２７０、ｒｓ１４３９７７８２５、ｒｓ１４９６１５７４２、ｒｓ６０１２０５８１、ｒｓ１８７４３０２９６、ｒｓ５６１２０４１５、ｒｓ１９０８８９１４２、ｒｓ５５８５１５２５、ｒｓ３４４７６７８０、ｒｓ１２６３３８１４、ｒｓ６８０３４６８、ｒｓ２８５５５５６、ｒｓ２８５５５５３、ｒｓ２８５５５５２、ｒｓ３７３３１４９、ｒｓ１８１０４７６６８、ｒｓ３７３３１４８、ｒｓ１４８６２７７６４、ｒｓ２６２５９６９、ｒｓ２６２５９６４、ｒｓ２６２５９５４、ｒｓ１８８１２８８５８、ｒｓ１３９５６６６０２、ｒｓ１４８７４８７８１、ｒｓ１８１３８７５８２、ｒｓ１９９５５３５４０、ｒｓ１９９５７３５３２、ｒｓ１３７８８３６８６、ｒｓ１１２６４０７１０、ｒｓ１４２７６９１１３、ｒｓ１８５０１１０７３、ｒｓ１８３２３０８３０、ｒｓ１１２８５５１８８、ｒｓ１３８１１５０１９、ｒｓ１３８１４２０２３、ｒｓ３６９４０８４０５、ｒｓ３７１４６１４２２、ｒｓ３６９４４５７２５、ｒｓ１４６３８９２８０、ｒｓ３７５５９３３１２、ｒｓ２０００５４４４３、ｒｓ１４６３９１４６３、ｒｓ１４１４６８３３５、ｒｓ２００１６５５３０、ｒｓ２００２０７０７０、ｒｓ３６７６３１５７５、ｒｓ３６７６３３２７９、ｒｓ１４３１９３４８９、ｒｓ１４４９３９８６３、ｒｓ１４５０２４３６９、ｒｓ１８９０１８０３０、ｒｓ１９２４１２６６１、ｒｓ１４３５５９９１４、ｒｓ１４５３１０２０５、ｒｓ２００９４６６３８、ｒｓ２００９４７１２２、ｒｓ３６７９０９２４６、ｒｓ３７６０５７１２０、ｒｓ３７３９４９２４８、ｒｓ３６９８５１２０８、ｒｓ１４７６４０４３５、ｒｓ１４６９３６６８１、ｒｓ３７６１１１６１８、ｒｓ３６９８９３１６８、ｒｓ１４６９８７１１０、ｒｓ１４７７６１８６６、ｒｓ１５１０６３５４３、ｒｓ１８４１２４２５５、ｒｓ５３２１３７０８４、ｒｓ３６８１５７８３９、ｒｓ５２８４８２１２５、ｒｓ３７２１２８１１２、ｒｓ３７６２７１１５８、ｒｓ３８６６６５７７５、ｒｓ１９２６０４１９９、ｒｓ３７４３３４５１２、ｒｓ１８６０９１７９４、ｒｓ１４８１１０８８８、ｒｓ３７０２７１６６０、ｒｓ１４９７２２６６８、ｒｓ１４８１６５０４４、ｒｓ１９２７１０４５２、ｒｓ２０１４１１６７９、ｒｓ１９１００９６０２、ｒｓ３６８５２２９７４、ｒｓ１４８２２２９９１、ｒｓ３７６６２６２６０、ｒｓ３７０４４１８４２、ｒｓ３７４５５０９２９、ｒｓ３７２５７０６１１、ｒｓ１８２７３５８３４、ｒｓ３７６７２７６９７、ｒｓ３７６７７６８９０、ｒｓ１５０１２９５１９、ｒｓ１８７９２３１６６、ｒｓ３７６８０２１６０、ｒｓ３９８１２２５２５、ｒｓ１５０２５０９４６、ｒｓ１８８０５２８２０、ｒｓ５２７２３６１０２、ｒｓ５２７２３６１０３、ｒｓ３７４７８８７８４、ｒｓ３６８８１９１７３、ｒｓ５３１０１４６１１、ｒｓ３７０７４６４３４、ｒｓ３７２８１２５２３、ｒｓ３７６９９５４７７、ｒｓ３７４９０２４６２、ｒｓ３６８９１０４７０、ｒｓ１８９７８６９１１、ｒｓ１８６７１９５４４、ｒｓ３６８９９５０５３、ｒｓ１８４８５０３７３、ｒｓ１８４９６６９７３、ｒｓ５２９２９５７３９、ｒｓ３７７１５７５５４、ｒｓ５３１２１０６６３、ｒｓ３６９１０２４０７、ｒｓ１９９５８３４６８、ｒｓ１４８８０１５２２、ｒｓ５２９３３８７７２、ｒｓ１９９７０１３３８、ｒｓ３７３１１８１１４、ｒｓ３６９１９８４２０、ｒｓ３６９２３３３０４、ｒｓ５２９４２２４１９、ｒｓ５２９４３８８８５、ｒｓ１９１８１９６６７、ｒｓ５３１３４６７３８、ｒｓ１８３３１８４６６、ｒｓ３７５３０６７９９、ｒｓ３７１２６４３７８、ｒｓ５３１４０９０８１、ｒｓ２０２２１５１７９、ｒｓ３７５３９１３１９、ｒｓ５３７５８１７４９、ｒｓ３７３３６９５１７、ｒｓ５２７５３８３６２、ｒｓ３７３４５０８９９、ｒｓ５２９６７４０７１、ｒｓ５４１１６３９４９、ｒｓ２０００７６１２８、ｒｓ５４１２０４７０２、ｒｓ５４４７６６６１９、ｒｓ２０００９５６４８、ｒｓ５３３３５８６３２、ｒｓ２００２４８１９８、ｒｓ２００８２６４９８、ｒｓ３６７７９７６７７、ｒｓ５４８９３２２７６、ｒｓ５３４５８８０６２、ｒｓ２００８９４２７７、ｒｓ３７１８５３２２０、ｒｓ１９２４６１６００、ｒｓ２０１００８７３５、ｒｓ３７３９７４２９８、ｒｓ５５３１０８０２２、ｒｓ５４１８２５２３９、ｒｓ３６８０３７５９４、ｒｓ３７２０１０８４９、ｒｓ５５６７６９０４９、ｒｓ５３４８１０４３０、ｒｓ３７７６８７３２９、ｒｓ３７６１８４２９９、ｒｓ５２８６０５５１９、ｒｓ３６８３５２２０２、ｒｓ５６１０５２１２９、ｒｓ５２８６６２８１３、ｒｓ５５３３９２８８４、ｒｓ３７２３４９７１４、ｒｓ５３８５８１４１０、ｒｓ２０１３４０９１４、ｒｓ５４９４７０１２８、ｒｓ５６５２０１８５８、ｒｓ５３８７４４９９５、ｒｓ５４９５９０１６０、ｒｓ３７０３７０５７４、ｒｓ５３８８２００１５、ｒｓ５３５２３０６９７、ｒｓ３７０４０１９４８、ｒｓ５４５９５００１６、ｒｓ５５７３０１４７７、ｒｓ３６８５３４４１４、ｒｓ３７６７０８００９、ｒｓ５６９４５００９９、ｒｓ３７４６８５９５８、ｒｓ５４２３６７０１２、ｒｓ５６５５９７９６５、ｒｓ３７０６０１６０６、ｒｓ５４６１２７３５５、ｒｓ５２７２３６１００、ｒｓ５２７２３６１０１、ｒｓ５５４０３９３０３、ｒｓ５３５６３５３０２、ｒｓ５３１０７７６３３、ｒｓ５３９２４９９９５、ｒｓ５２９１５６４１３、ｒｓ３７７１２０７９４、ｒｓ３７５０４４０７９、ｒｓ３７１１９２８０３、ｒｓ５６９９５２８７５、ｒｓ３７１２８８６１８、ｒｓ５５４３１５８１１、ｒｓ５６６１７３７４１、ｒｓ５５２３６２４５６、ｒｓ５３２９４９４１２、ｒｓ５３２９６７０８５、
ｒｓ２０１９８９３０８、ｒｓ５４１０５３１５６、ｒｓ５４８７０８２３７、ｒｓ５４３１２４６３５、ｒｓ５５８０３７８７４、ｒｓ５５４３０３７０９、ｒｓ５６６１８６１１８、ｒｓ５４６８５２５１３、ｒｓ５６２４３９３３８、ｒｓ５５２４５５６６０、ｒｓ５５４７５３４２６、ｒｓ５６２５２４４７５、ｒｓ５４３４６６１６０、ｒｓ５７０５６５７７４、ｒｓ５５８６２４３４７、ｒｓ５５４８２８４５２、ｒｓ５３３３７０８８３、ｒｓ５３１６９１２７６、ｒｓ５４５１９３６８２、ｒｓ５５６６５５４２２、ｒｓ５３４６９５６１４、ｒｓ５７０７１４４２７、ｒｓ５３４７０７１５１、ｒｓ５６０８３５７１５、ｒｓ５５８８３８３１１、ｒｓ５４５４４００５９、ｒｓ５６０８９４０９３、ｒｓ５３４８１９６７５、ｒｓ５３４８２０９６８、ｒｓ５６４９６７７００、ｒｓ５６２９９９０７７、ｒｓ５６４９７９８９８、ｒｓ５６９１６１２０９、ｒｓ５３６８４４４１５、ｒｓ５３８５６０１２３、ｒｓ５６９１９４６３１、ｒｓ５７１２５６６７３、ｒｓ５５３６５４９６９、ｒｓ５４４１５５２０８、ｒｓ５６７３５０７３５、ｒｓ５３８８２５２９３、ｒｓ５４４１７０９９０、ｒｓ５３７０６５２７３、ｒｓ５５３７７５０８３、ｒｓ５６９４４５２７８、ｒｓ５４６０６５８７３、ｒｓ５４７９８１４９３、ｒｓ５３８９９９０６５、ｒｓ５４２４５４０９１、ｒｓ５７１６３６７５７、ｒｓ５３９１７２７６２、ｒｓ５４８０８９９７９、ｒｓ５４８０９１０７１、ｒｓ５３５６５３８１２、ｒｓ５４８１１３５１３、ｒｓ５４８１５７５２７、ｒｓ５４４４２３０４８、ｒｓ５４４４３１８０７、ｒｓ５４１０２４４１４、ｒｓ５７１９１６１５０、ｒｓ５５９７４７２２９、ｒｓ５６５９００１８８、ｒｓ７４７６４３９５５、ｒｓ５６９７６１８３０、ｒｓ５６４０１８４４１、ｒｓ５５２２３７３６８、ｒｓ５６８１６９６４３、ｒｓ５４８５８１４４９、ｒｓ５５６５１４９５１、ｒｓ５４２７４８３９４、ｒｓ５６８２０２０２４、ｒｓ５３９３７０９６０、ｒｓ５４２９６６８４１、ｒｓ７５５９２１７２４、ｒｓ７４７８５５４０１、ｒｓ５６４２６２２８０、ｒｓ５６０３２４７８６、ｒｓ７５１８９４０３２、ｒｓ５４３２０４５６０、ｒｓ５７２４０６９９０、ｒｓ７６０５１５７６４、ｒｓ５６４３８８４２９、ｒｓ５７００７５３７５、ｒｓ７５６１６２６３０、ｒｓ５６８６３２４０２、ｒｓ５６６３０１９５６、ｒｓ５６２３７４３９８、ｒｓ７５２０７６３７２、ｒｓ５５８５０３５５５、ｒｓ５６６３１９７１７、ｒｓ５７０２６６７６０、ｒｓ５６８５７１５８０、ｒｓ５６０６００８９０、ｒｓ５６０３７０７５９、ｒｓ５４３５２１７９８、ｒｓ７６４６３３０７６、ｒｓ７６０７９２８４３、ｒｓ７５６４５４２０３、ｒｓ５５１０２８３４６、ｒｓ７５６５０９７３７、ｒｓ７７３８９０９７７、ｒｓ５５１０４３５７５、ｒｓ５４３５４２９９２、ｒｓ５５８６９３４９５、ｒｓ５５８７６８３８５、ｒｓ７５６６５８６５９、ｒｓ５３６４６７８９３、ｒｓ５７０７９５３２３、ｒｓ５６２８５３２０１、ｒｓ７６９５４４４３０、ｒｓ５５８８７７７５４、ｒｓ７６４９２７４５２、ｒｓ７６４９５６９０５、ｒｓ５３６５８２１７０、ｒｓ５６２９８５５３３、ｒｓ５７４１６３８２６、ｒｓ５４７３７４３５１、ｒｓ５７４２０２０２３、ｒｓ５６６９９７２４７、ｒｓ５４０３８６３０５、ｒｓ７６９７６９３６０、ｒｓ５５１６７９８５３、ｒｓ５３６９７７４９７、ｒｓ５５１７５９６０９、ｒｓ５４０６３２１４３、ｒｓ５５５７９０６２１、ｒｓ５５１８２８５９０、ｒｓ５５９４２１７７７、ｒｓ７６５２６５９９６、ｒｓ７７４４２５５５７、ｒｓ７７９１６９６３１、ｒｓ７５２８０５８０５、ｒｓ７６９９５４２８１、ｒｓ５６３６３６５６７、ｒｓ７６５３５０５９３、ｒｓ７７４４９６９９１、ｒｓ５５６０１９３２０、ｒｓ７４８９８９１２２、ｒｓ７６１５００４５３、ｒｓ５５６０４９６６６、ｒｓ５４８４６０５８９、ｒｓ５７７２３５８０５、ｒｓ５７３１６３７４６、ｒｓ７５７２１９４５８、ｒｓ７７９３８２３８１、ｒｓ５６０１０１４９１、ｒｓ５７２２５２９３８、ｒｓ７５６２８５７０４、ｒｓ７５６３０６３７７、ｒｓ７４８２６９７５２、ｒｓ５６０５００１００、ｒｓ７６５５８６２３４、ｒｓ７６０６６７６５７、ｒｓ７４８２１１６６２、ｒｓ７５３０３６９８２、ｒｓ７６１６８２１９８、ｒｓ５７３７１５０３５、ｒｓ７７４８１６４１３、ｒｓ７７９５６０６８９、ｒｓ７５７３９５８３０、ｒｓ７４５６１６３７２、ｒｓ７６１７８１２９５、ｒｓ７７９６０９９３０、ｒｓ７６１７８４８２７、ｒｓ７４９２８００２１、ｒｓ５７４６７７９５２、ｒｓ７６４６０７７６０、ｒｓ７６５５６４３３３、ｒｓ７７９６６５０９６、ｒｓ７６５７８１２１８、ｒｓ７４９１３７７８６、ｒｓ７４９３５６８８３、ｒｓ７７４９６７６６６、ｒｓ７６５８５５０３０、ｒｓ７５２２４８８６７、ｒｓ７６０８９４２０５、ｒｓ７４８４２９０９０、ｒｓ７４５７５９２６４、ｒｓ７６５９３１０９２、ｒｓ７６１９９０７３３、ｒｓ７７５０９５２３３、ｒｓ７６９４６４３６２、ｒｓ７４５８５１４０８、ｒｓ７６２０５９４６８、ｒｓ７６６０２７０２１、ｒｓ７５３３５３２７６、ｒｓ７５７６９０２６１、ｒｓ７７０７０１４００、ｒｓ７４８４８３５７５、ｒｓ７５６６６３１７５、ｒｓ７７５１９１４７４、ｒｓ７６１０１３２５８、ｒｓ７６１０２２５０７、ｒｓ７６２１４６５５４、ｒｓ７５２４５５１２７、ｒｓ７６２１５０７６０、ｒｓ７５２４９６８０４、ｒｓ７６１１０１２６３、ｒｓ７４６０２９８８２、ｒｓ７４８６８９８３２、ｒｓ７４９６６３４４６、ｒｓ７６６２２５９４６、ｒｓ７５３４９６２３３、ｒｓ７４８７２３５９８、ｒｓ７６２２９０２２３、ｒｓ７６６２７５４７１、ｒｓ７８０１８８５２７、ｒｓ７５６８９８１５５、ｒｓ７７０９４１５６１、ｒｓ５７５１６１１５７、ｒｓ７６５１３９７９１、ｒｓ７６６３２６９０２、ｒｓ７６６３４４３４５、ｒｓ７５３５８５８４８、ｒｓ７７１００７１４６、ｒｓ７７９０２９１９９、ｒｓ７５２６９５０９８、ｒｓ７７４３３６４９３、ｒｓ７７５５２８６００、ｒｓ７４６２１００４３、ｒｓ７４６２２３５３０、ｒｓ７７５５５７６８０、ｒｓ７６６４２２６７９、ｒｓ７６２４５１４５７、ｒｓ７７５５７９１２７、ｒｓ７６５１９３１５４、ｒｓ７４６２４７８０６、ｒｓ７８０４０８３６７、ｒｓ７５６９８６１９１、ｒｓ７６１３３８２７８、ｒｓ７５２８３０４６６、ｒｓ７４９９２９３８８、ｒｓ７８０４９４６５７、ｒｓ７５７１０６２９９、ｒｓ７７９２９６５２５、ｒｓ７７１３２２６１５、ｒｓ７４９０１６９５５、ｒｓ７６５４３８３１３、ｒｓ７７５９４５１２０、ｒｓ７６１５６２０８９、ｒｓ７６５５１９０３５、ｒｓ７４６５６３４２３、ｒｓ７７６０１４７７０、ｒｓ７７０１５１２４９、ｒｓ７５４０６４３１４、ｒｓ７５８４７５５００、ｒｓ７７４６９８９０７、ｒｓ７５８４８４９１６、ｒｓ７５８４９１８５１、ｒｓ７７９４６５２２１、ｒｓ７５０１７１２４７、ｒｓ７５８５４３６１９、ｒｓ７７６１２４７１１、ｒｓ７６６９３２０９５、ｒｓ７４９１５５４３２、ｒｓ７５０２１９７６４、ｒｓ７５０２２０９７５、ｒｓ７７４８０９８９３、ｒｓ７４６７７３５９２、ｒｓ７７１６３７２２４、ｒｓ７７１６８２９７２、ｒｓ７５４３４９３４３、ｒｓ７６７１５２９７９、ｒｓ７４５６４３６５０、ｒｓ７７６４１１０６４、ｒｓ７５８８４４０４９、ｒｓ７５８８４８５１６、ｒｓ７５０４７３５１７、ｒｓ７８１２３７１６２、ｒｓ７５７４４９３０２、ｒｓ７５０５１９６９１、ｒｓ７７６５０４３５１、ｒｓ７５８９０１６９４、ｒｓ７６３２２３２２１、ｒｓ７８１３２５８６９、ｒｓ７４７００２１８８、ｒｓ７７６５８６７１１、ｒｓ７５４５８４２１７、ｒｓ７７０４３２６３５、ｒｓ７７４８６５４９４、ｒｓ５７６１４０６４０、ｒｓ７５９０２１５０３、ｒｓ７８１２６６９８２、ｒｓ７８１４３７６８８、ｒｓ７５４６４８６４０、ｒｓ７８１４６０５５８、ｒｓ７８１３７５８９７、ｒｓ７７２０８６４７９、ｒｓ７６６９４３４００、ｒｓ７６３４０２０４９、ｒｓ７６３４２２５７４、ｒｓ７７９７４７８９０、ｒｓ７５４２０６５２６、ｒｓ７６３４４７１８７、ｒｓ７５０４３０７７７、ｒｓ７５７５２４３５７、ｒｓ７７５００５３８４、ｒｓ７４５８４９１７４、ｒｓ７４７１５９７５０、ｒｓ７７６８１２４６６、ｒｓ７６７５７３３５１、ｒｓ７５４８０９７１５、ｒｓ７７２２２２８３８、ｒｓ７６３５３８１２５、ｒｓ７７０７０３９２７、ｒｓ７４５９２０３８７、ｒｓ７４９５６７０８４、ｒｓ７５７７４０９１３、ｒｓ７６６１１２０７４、ｒｓ７８００６０５９７、ｒｓ７６６１６１３２２、ｒｓ７６６１９６７３７、ｒｓ７５０９０５２５１、ｒｓ７７５３８２６４０、ｒｓ７７２３１６８４２、ｒｓ５７６４４４３４４、ｒｓ７４６１２１９３１、ｒｓ７５９３１６８２０、ｒｓ７５９３２２７７８、ｒｓ７４９７５３５５５、ｒｓ５７５１９６４５６、ｒｓ７４６１８６３５２、ｒｓ７５３６０９３１０、ｒｓ７５９４０６６９２、ｒｓ７５９４０６７８９、ｒｓ７５９４２５６２２、ｒｓ７４７３６９５９９、ｒｓ７５１０８４３６８、ｒｓ７５５０８５８３６、ｒｓ７５３６６５７２７、ｒｓ７７１１２３９５８、ｒｓ７７２５３３９３２、ｒｓ７４７４１８９８３、ｒｓ７５１１５３０７５、ｒｓ７４６３３２３５５、ｒｓ７６７９７９６１０、ｒｓ７５１１６７０６２、ｒｓ７６３８８７８６０、ｒｓ７７１１８８１４８、ｒｓ７４６４６８２０１、ｒｓ７６２７１１３５６、ｒｓ７８０６８２８１２、ｒｓ７９６０９８４６４、ｒｓ７５９６３７８１８、ｒｓ７５１２８００６０、ｒｓ７８０７０７４９７、ｒｓ７６６７８７６３５、ｒｓ７５１３１２９０６、ｒｓ７８０７４３３７０、ｒｓ７８０７８５０７７、ｒｓ７６６８５２５８９、ｒｓ７７６１０１９１３、ｒｓ７６８２５１１３８、ｒｓ７６７３６３１４５、ｒｓ７７７５５９０４２、ｒｓ７７６６５４８３６、ｒｓ７６４２０８４５６、ｒｓ７６８２９８４３１、ｒｓ７８１４６５９２７、ｒｓ５７６９７４８８０、ｒｓ５７６２１６２６７、ｒｓ７７２１３７３６０、ｒｓ７５９８１８４７５、ｒｓ７７７６２５２０６、ｒｓ７８１５３９７９３、ｒｓ７５９１２２７６０、ｒｓ７５０７６３６４６、ｒｓ７５１５６１８１５、ｒｓ７５９９４５００７、ｒｓ７７３０２２４９０、ｒｓ７６４３８６３１１、ｒｓ７６８３００４６３、ｒｓ７５５６５４２９６、ｒｓ７６３４５５１５２、ｒｓ７７３１２７４６０、ｒｓ７８１５５０７５７、ｒｓ７５９２０９１０３、ｒｓ７７３１７７９０２、ｒｓ７６８６１６０８２、ｒｓ７７７９４３８０３、ｒｓ７４７２０３４１０、ｒｓ７７３２９１８３３、ｒｓ７７３２９５１４５、ｒｓ７７３３４７３６４、ｒｓ７６７６４６４２８、ｒｓ７７８１７０５２９、ｒｓ７７８１７３９７８、ｒｓ７６８８７７２４３、ｒｓ７７６８９０３８１、ｒｓ７６９００９６１３、ｒｓ７４７２１５７８９、ｒｓ７６３５６６４５６、ｒｓ７７３８０８４０６、ｒｓ７６７６５４４２６、ｒｓ７８１６８１７１０、ｒｓ７７８６２６０６５、ｒｓ７８１７１３４６１、ｒｓ７６３６４４５３９、ｒｓ７５４９６３７９４、ｒｓ７５０９７４０８６、ｒｓ７５９３５４８１２、ｒｓ７６３７２８６２１、ｒｓ７６３７９４９９４、ｒｓ７７２５２８４９０、ｒｓ７５５１７１６９０、ｒｓ７５５１９０５３８、ｒｓ７７７２７４０７３、ｒｓ７７７２８３３９６、ｒｓ７６８０３０５４７、ｒｓ５７６８０２１２５、ｒｓ７５１３１１６２０、ｒｓ７９６２４７９５９、ｒｓ７５５３５０９５５、ｒｓ７６８１９５５０２、ｒｓ７６８２１０５６２、ｒｓ７４７５８２１３３、ｒｓ５７６９８０７９４、ｒｓ７５１４７５７７１、ｒｓ７４７６２０１２１、ｒｓ７７７６３７１７９、ｒｓ７５５５４０１７０、ｒｓ７６４２７７４４４、ｒｓ７７３０７７０６２、ｒｓ７５５６７４５４９、ｒｓ７７７８４９７３５、ｒｓ７７７８５１８６７、ｒｓ７６４５９０５



１５、ｒｓ７６８７８７２７４、ｒｓ７７８３５６０２７、ｒｓ７７８５３３８８６、ｒｓ７７８５３６０１８、ｒｓ７７８５８７３４０、ｒｓ７７８８０４０２１、ｒｓ７６９２３６２２４およびｒｓ７７８７９４１６５である。
ＲＨＯ遺伝子は、ロドプシンと称されるタンパク質を作製するための指示を提供する。このタンパク質は、正常な視覚に必要であり、特に、弱光条件下において必要である。ロドプシンは、桿体と称される特化した光受容細胞に見出される。眼の後方における光感受性組織（網膜）の一部として、桿体は、弱光下での視覚を提供する。網膜における他の光受容細胞は、錐体と称され、明るい光下における視覚を担う。ロドプシンタンパク質は、ビタミンＡの一形態である、１１－シスレチナールと称される分子に結合する。この分子が光に曝露されると、ロドプシンを活性化し、電気シグナルを作り出す一連の化学反応を開始する。これらのシグナルが脳に伝達され、そこで、視覚として解釈される。
挿入、欠失、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、および他の変異であり得る、網膜色素変性（ＲＰ）と関連する様々な変異が存在し、ＲＨＯ遺伝子を不活性化する共通の作用を有する。変異のうちのいずれか１つまたは複数を修復して、ＲＨＯタンパク質活性を回復させることができる。例えば、病理学的バリアントであるＰ２３Ｈは、回復または修正することができる（表２を参照されたい）。
Figure 0007522656000002
エクソン欠失
別のゲノム操作戦略は、エクソン欠失を伴う。特定のエクソンの標的化欠失は、単一の治療カクテルで大きな患者サブセットを処置するための有望な戦略であり得る。欠失は、単一エクソンの欠失または複数エクソンの欠失のいずれであってもよい。複数エクソンの欠失は、より多くの患者に届き得るが、欠失が大きくなると、欠失の効率は、サイズの増加とともに大幅に減少する。したがって、欠失範囲は、４０～１０，０００塩基対（ｂｐ）のサイズであり得る。例えば、欠失は、４０～１００、１００～３００、３００～５００、５００～１，０００、１，０００～２，０００、２，０００～３，０００、３，０００～５，０００、または５，０００～１０，０００塩基対のサイズの範囲に及び得る。
前述のように、ＲＨＯ遺伝子は、５つのエクソンを含む。５つのエクソンのうちのいずれか１つまたは複数は、変異を含み得る。５つの変異したエクソンのうちのいずれか１つもしくは複数、または異常なイントロンスプライスアクセプターもしくはドナー部位を欠失させて、ＲＨＯ機能を回復させるかまたは部分的に回復させることができる。一部の実施形態では、本方法は、変異したエクソン１、２、３、４、５のうちのいずれか１つもしくは複数、またはこれらの任意の組合せを欠失させるために使用することができる、ｇＲＮＡ対を提供する。
ｐｒｅ－ｍＲＮＡが、欠失の後に適正にプロセシングされるのを確実にするために、周囲のスプライシングシグナルを、欠失させてもよい。スプライシングドナーおよびアクセプターは、一般に、隣接するイントロンの１００塩基対以内にある。したがって、一部の例では、本方法は、目的とされるそれぞれのエクソン／イントロン接合部に関して、およそ±１００～３１００ｂｐで切断する全てのｇＲＮＡを提供し得る。
ゲノム編集戦略のいずれについても、遺伝子編集は、配列決定またはＰＣＲ分析によって確認することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏベースの療法
常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するための方法が、本明細書に提示される。一部の態様では、本方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。本明細書に記載される材料および方法を使用して、ＲＰ患者における細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ方法は、光受容細胞または網膜前駆細胞などの患者の細胞において、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集することを含み得る。
ある特定の細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける処置および療法のための有望な標的を提示するが、送達の有効性を増加させることにより、そのような細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでの直接送達が可能となり得る。ターゲティングおよび編集は、関連細胞を対象とすることが理想的であろう。他の細胞における切断はまた、ある特定の細胞およびまたは成長段階においてのみ活性であるプロモーターの使用によって、防止することができる。追加のプロモーターは、誘導性であり、したがって、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合には、一時的に制御され得る。送達されたＲＮＡおよびタンパク質が、細胞内に留まる時間の量もまた、半減期を変化させるために付加される処置またはドメインを使用して、調整することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの処置により、いくつかの処置ステップが排除されるが、送達率が低いため、より高い編集率が必要となり得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの処置は、ｅｘ ｖｉｖｏでの処置および生着による問題および損失を排除することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療の利点は、治療的生産および投与の容易さであり得る。同じ治療アプローチおよび治療は、１人を上回る患者、例えば、同じかまたは類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する何人かの患者を処置するために使用される潜在性を有する。対照的に、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法は、典型的に、患者自身の細胞を使用する必要があり、この細胞は、同じ患者から単離、操作され、その患者に戻される。
ｅｘ ｖｉｖｏベースの療法
常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するための方法が、本明細書に提示される。そのような方法の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、患者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、作り出すことができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらのｉＰＳＣ細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。例えば、本方法は、ｉＰＳＣのＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍で編集するステップを含み得る。次いで、ゲノム編集したｉＰＳＣを、他の細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることができる。最後に、分化した細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことができる。
そのような方法の別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞は、患者から単離することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらの光受容細胞または網膜前駆細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。例えば、本方法は、光受容細胞または網膜前駆細胞のＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍で編集するステップを含み得る。最後に、ゲノム編集した光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことができる。
そのような方法の別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞ベースの療法である。例えば、間葉幹細胞を、患者から単離してもよく、これは、患者の骨髄または末梢血から単離することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらの間葉幹細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。例えば、本方法は、間葉幹細胞のＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内またはその近傍で編集するステップを含み得る。次いで、ゲノム編集した間葉幹細胞を、任意の種類の細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることができる。最後に、分化した細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことができる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法アプローチの１つの利点は、投与の前に、治療法（the therapeutic）についての包括的な解析を行う能力である。ヌクレアーゼベースの治療法は、あるレベルのオフターゲット作用を有し得る。遺伝子修正をｅｘ ｖｉｖｏにおいて実施することにより、埋め込み（implantation）の前に、修正した細胞集団を特徴付けることが可能である。本開示は、修正した細胞の全ゲノムを配列決定して、オフターゲット作用が存在する場合に、それが、確実に、患者に対する最小限の危険性と関連するゲノム位置に存在し得るようにすることを含む。さらに、クローン集団を含め、特定の細胞集団を、埋め込みの前に単離することができる。
ｅｘ ｖｉｖｏにおける細胞療法の別の利点は、他の初代細胞供給源と比較した、ｉＰＳＣ内の遺伝子修正に関する。ｉＰＳＣは、多産であり、細胞ベースの療法に要求される多数の細胞を得ることを容易とする。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を実施するために理想的な細胞型である。これにより、生存率を低下させる危険を冒さずに、正確なゲノム修正のためのスクリーニングが可能である。これに対し、他の初代細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞は、数回の継代にわたってのみ生存可能であり、クローン的に拡大することは困難である。このため、常染色体優性ＲＰの処置のためのｉＰＳＣの操作は、はるかに容易であり得、所望される遺伝子修正を行うのに必要とされる時間の量を短縮することができる。
ゲノム編集
ゲノム編集とは、ゲノムのヌクレオチド配列を、例えば、精密なまたは所定の方式で、修飾するプロセスを指す。本明細書に記載されるゲノム編集法の例は、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡを、ゲノム内の正確な標的位置で切断し、それによって、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を、ゲノム内の特定の位置において作り出す方法を含む。そのような切断は、ＨＤＲおよびＮＨＥＪなど、天然の内因性細胞プロセスにより修復することが可能であり、通常、そのように修復される。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替的な経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合させるが、場合によって、ヌクレオチド配列の喪失または付加であって、遺伝子発現を破壊する場合もあり、増強する場合もある、喪失または付加を伴う。ＨＤＲは、相同配列またはドナー配列を、規定されたＤＮＡ配列を切断点に挿入するための鋳型として利用する。相同配列は、姉妹染色分体など、内因性ゲノム内に存在し得る。代替的に、ドナーは、ヌクレアーゼにより切断されるローカスとの相同性が大きな領域を有するが、切断された標的ローカスへと組み込まれ得る欠失を含むさらなる配列または配列変化も含み得る、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外因性核酸であり得る。第３の修復機構は、「代替的ＮＨＥＪ（ＡＮＨＥＪ）」とも称される、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であって、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じ得るという点で、遺伝的結果がＮＨＥＪと同様である、ＭＭＥＪであり得る。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位を挟む少数の塩基対の相同配列を利用して、より好ましいＤＮＡ末端結合による修復結果を駆動することができ、近年の報告により、このプロセスの分子機構がさらに解明されている。一部の事例では、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロホモロジーについての解析に基づき、可能性がある修復結果を予測することが可能であり得る。
これらのゲノム編集機構の各々を使用して、所望のゲノムの変更を創出することができる。ゲノム編集工程内のステップは、意図される突然変異部位の近傍にまで近接した、標的ローカス内で、１つのＤＮＡ切断、または２つのＤＮＡ切断であって、二本鎖切断または２つの一本鎖切断としての２つのＤＮＡ切断を創出することでありうる。これは、本明細書で記載および例示される通り、部位特異的ポリペプチドの使用を介して達成することができる。
部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼにより、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡに導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路［例えば、相同性依存的修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）もしくは（ＡＮＨＥＪ）もしくは（ＭＭＥＪ）］を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をもたらし得、遺伝子発現の破壊または変更をもたらし得る。欠失範囲は、４０～１０，０００塩基対（ｂｐ）のサイズであり得る。例えば、欠失は、４０～１００、１００～３００、３００～５００、５００～１，０００、１，０００～２，０００、２，０００～３，０００、３，０００～５，０００、または５，０００～１０，０００塩基対のサイズの範囲に及び得る。ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同なドナー鋳型は、野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含み得る。野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、その断片もしくは組合せ、またはＲＨＯ遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体であり得る。ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドであり得る。ドナー鋳型は、最大５ＫＢであり得る。ドナー鋳型は、最大４ＫＢであり得る。ドナー鋳型は、最大３ＫＢであり得る。ドナー鋳型は、最大２ＫＢであり得る。ドナー鋳型は、最大１ＫＢであり得る。ドナー鋳型は、ＡＡＶによって送達され得る。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列に相同的であり得る配列を含み得る。例えば、ドナー鋳型は、３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有し得る。ドナー鋳型また、病理学的バリアントＰ２３Ｈに対する相同性アームを有し得る。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用され得る。しかしながら、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型とともに、さらなる核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（単一もしくは複数の塩基変化もしくは欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じ得るという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位を挟む少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合によるＤＮＡ修復結果を駆動することができる。一部の事例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーについての解析に基づき、可能性がある修復結果を予測することが可能であり得る。
したがって、一部の場合には、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列もしくはポリヌクレオチドドナー鋳型）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列であり得る。
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、変異、欠失、変更、組込み、遺伝子の修正、遺伝子の置き換え、遺伝子のタグ付け、導入遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子の破壊、転座、および／または遺伝子の変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを欠失させ、非天然核酸を、ゲノムＤＮＡへと組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノムローカスは、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノム内で見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲローカスは、原核生物を、ウイルスおよびファージなど、外来の侵入者に対して防御する一助となる、ある種の免疫系として機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲローカスの機能の３つの段階：新たな配列の、ＣＲＩＳＰＲローカスへの組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来の侵入者核酸のサイレンシングが存在する。５種類のＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、およびＶ型）が同定されている。
ＣＲＩＳＰＲローカスは、「リピート」と称する、いくつかの短い反復配列を含む。発現すると、リピートは、二次構造（例えば、ヘアピン）を形成する場合もあり、かつ／または非構造化一本鎖配列を構成する場合もある。リピートは通例、クラスターで生じ、種間で顕著に異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と称する固有の介在配列で規則的に隔てられる結果として、リピート－スペーサー－リピートローカスアーキテクチャーをもたらす。スペーサーは、既知の外来インベーダー配列と同一であるか、またはこれと高度な相同性を有する。スペーサー－リピート単位は、スペーサー－リピート単位の成熟形態へとプロセシングされる、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。ｃｒＲＮＡは、標的核酸のターゲティングに関与する、「シード」またはスペーサー配列（原核生物における天然に存在する形態では、スペーサー配列は、外来のインベーダー核酸をターゲティングする）を含む。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
ＣＲＩＳＰＲローカスはまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物におけるｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同な二次および／または三次構造を含む。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡの生合成は、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮアーゼＩＩＩにより修飾され、次いで、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイ内のｃｒＲＮＡリピートとハイブリダイズすることができる。内因性ＲＮアーゼＩＩＩを動員して、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを切断することができる。切断されたｃｒＲＮＡを、エクソリボヌクレアーゼによるトリミング（例えば、５’トリミング）にかけて、成熟ｃｒＲＮＡ形態をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡを、さらに、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせたままにすることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズしうる標的核酸へとガイドしうる。ｃｒＲＮＡの、標的核酸とのハイブリダイゼーションは、Ｃａｓ９を、ターゲティングされた核酸切断のために活性化させうる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系内の標的核酸を、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する。天然では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の、標的核酸への結合を容易とするのに不可欠である。ＩＩ型系（また、ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも称する）は、ＩＩ－Ａ型（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ－Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）へとさらに細分することができる。Jinekら、Science、３３７巻（６０９６号）：８１６～８２１頁（２０１２年）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、ＲＮＡによりプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多数の例および適用を提示する。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型系との、いくつかの重要な差違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型系とは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く、単一のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらにトランス活性化させる要件なしに、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、各成熟ｃｒＲＮＡが、１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、２３～２５ヌクレオチドのスペーサー配列を後続させる、４２～４４ヌクレオチドの長さの短い成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。これに対し、ＩＩ型系における成熟ｃｒＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートを後続させうる。また、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭを先行させる標的ＤＮＡを効率的に切断するように、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用するが、これは、ＩＩ型系についての標的ＤＮＡが、ＧリッチＰＡＭを後続させるのと対照的である。したがって、Ｖ型系が、ＰＡＭから遠い点で切断するのに対し、ＩＩ型系は、ＰＡＭと隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型系とは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５’突出を伴う、ずれた位置でのＤＮＡの二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。ＩＩ型系は、平滑末端型二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型系と同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠き、これは、ＩＩ型系と対照的である。
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドとしては、Fonfara et al., Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014)の図１におけるＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範にわたり書き直されている。Fonfara（上記）の図５は、様々な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列を提示している。
部位特異的ポリペプチド
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するため、および／または部位特異的変異誘発を誘導するために、ゲノム編集において使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ヌクレアーゼは、細胞または患者へと、１つもしくは複数のポリペプチドとして、またはポリペプチドをコードする１つもしくは複数のｍＲＮＡとしてのいずれかで、投与され得る。配列番号１～６１２に列挙されているかまたは本明細書に開示されている酵素またはオルソログのうちのいずれかを、本明細書の方法において利用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することが可能であり、ガイドＲＮＡは、そのポリペプチドが対象とする標的ＤＮＡ内の部位を指定する。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼであり得る。
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含みうる。２つまたはこれを超える核酸切断ドメインは、リンカーを介して、併せて連結することができる。例えば、リンカーは、可撓性リンカーを含みうる。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、またはこれを超えるアミノ酸の長さを含みうる。
天然に存在する野生型のＣａｓ９酵素は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣドメインという２つのヌクレアーゼドメインを含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」とは、天然に存在するＣａｓ９および組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で想定されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つのアンチパラレルのβ鎖およびα螺旋を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、ｃｒＲＮＡによりターゲティングされる鎖の相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲＮアーゼＨ様フォールドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に対する作用を含む核酸ベースの機能の多様なセットに関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、複数のα螺旋により取り囲まれた、５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
部位特異的ポリペプチドにより、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡ内に導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路［例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪもしくはＡＮＨＥＪもしくはＭＭＥＪ］を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をし得、遺伝子発現の破壊または変更をもたらし得る。ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列と相同である配列を含み得る。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用され得る。しかしながら、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型とともに、さらなる核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（単一もしくは複数の塩基変化もしくは欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じ得るという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位を挟む少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合によるＤＮＡ修復結果を駆動することができる。一部の事例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーについての解析に基づき、可能性がある修復結果を予測することが可能であり得る。
したがって、場合によって、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、「ドナーポリヌクレオチド」（またはドナーもしくはドナー配列）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列でありうる。
部位特異的ポリペプチドは、例示的な、野生型の部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９；ＵＳ２０１４／００６８７９７における配列番号８；またはSapranauskasら、Nucleic Acids Res、３９巻（２１号）：９２７５～９２８２頁（２０１１年）］、および多様な他の部位特異的ポリペプチドに対する、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、多くて７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、多くて７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、多くて７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。
部位特異的ポリペプチドは、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する突然変異を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有しうる。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有さない修飾形態である場合、本明細書では、「酵素的に不活性」と称する。
部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、それが、標的核酸上のＳＳＢを誘導し得る（例えば、二本鎖標的核酸の糖－リン酸骨格のうちの１つだけを切断することにより）ような、変異を含み得る。変異は、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数における核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらし得る。変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらし得る。変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらし得る。例えば、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６を変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つまたは複数を不活化する。変異させるべき残基は、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６（例えば、配列および／または構造アライメントにより決定される）に対応し得る。変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａが挙げられる。アラニン置換以外の変異が、好適であり得る。
Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｈ８４０Ａ突然変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５４Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５６Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ突然変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドを、「ニッカーゼ」と称する。
ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集の特異性を増大させることができる。野生型のＣａｓ９は、標的配列（内因性のゲノムローカスなど）内の、指定された約２０ヌクレオチドの配列とハイブリダイズするようにデザインされた、単一のガイドＲＮＡによりガイドされることが典型的である。しかし、ガイドＲＮＡと標的ローカスとのいくつかのミスマッチが許容される可能性があり、標的部位内で要求される相同性の長さを、例えば、たった１３ｎｔの相同性まで効果的に低減し、これにより、標的ゲノム内の他の場所で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による、結合および二本鎖核酸切断（オフ標的切断としてもまた公知である）の潜在的可能性の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は各々、１つの鎖だけを切断するため、二本鎖切断を創出するためには、１対のニッカーゼが、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合し、これにより、二本鎖切断の同等物である、１対のニックを創出することが必要である。これは、２つの別個のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼにつき１つずつ）が、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合しなければならないことを要求する。この要件は本質的に、二本鎖切断が生じるために必要とされる、最小の相同性の長さを二倍にし、これにより、２つのガイドＲＮＡ部位（存在する場合）が、二本鎖切断の形成を可能とするのに十分な程度に、互いと近接する可能性が低い場合に、二本鎖切断イベントが、ゲノム内の別の場所で生じる可能性を低減する。当技術分野で記載される通り、ニッカーゼはまた、ＨＤＲを、ＮＨＥＪと対比して促進するのにも使用することができる。ＨＤＲを使用して、所望の変化を効果的に媒介する特異的ドナー配列の使用を介して、選択された変化を、ゲノム内の標的部位へと導入することができる。
想定される突然変異は、置換、付加、および欠失、またはこれらの任意の組合せを含みうる。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、アラニンへと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）へと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）へと転換する。突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、アミノ酸模倣体（例えば、リン酸化模倣体）へと転換する。突然変異は、保存的突然変異でありうる。例えば、突然変異は、突然変異させるアミノ酸を、サイズ、形状、電荷、極性、コンフォメーションが相似するアミノ酸、および／または突然変異させるアミノ酸のロタマー（例えば、システイン／セリン突然変異、リシン／アスパラギン突然変異、ヒスチジン／フェニルアラニン突然変異）へと転換する。突然変異は、リーディングフレームのシフトおよび／または早期終止コドンの創出を引き起こしうる。突然変異は、遺伝子の調節的領域、または１もしくは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすローカスへの変化を引き起こしうる。
部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性の部位特異的ポリペプチド）は、核酸をターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡをターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡをターゲティングしうる。
部位特異的ポリペプチドは、１または複数の非天然配列（例えば、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質である）を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、核酸結合性ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメインに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９に由来するヌクレアーゼドメインに対する、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および部位特異的ポリペプチドを、非天然配列へと連結する、非天然配列（例えば、核局在化シグナル）またはリンカーに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方における突然変異であって、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する突然変異を含む。
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは、アスパラギン酸１０の突然変異を含み、かつ／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つは、ヒスチジン８４０の突然変異を含むことが可能であり、突然変異は、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する。
１または複数の部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を併せて生じさせる２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特異的ローカスにおいて、２つの二本鎖切断を併せて生じさせるかまたは引き起こす４つのニッカーゼを含みうる。代替的に、１つの部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を生じさせうるかまたは引き起こしうる。
他の細菌株に由来するＣａｓ９オルソログの非限定的な例としては、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７；Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ５５０１；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ ２３２７０；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＬＡＡ１；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ４４６；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ ＤＳＭ １８０；Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ ＫＣ４；Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ－３２８；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｓｔｒ．Ｐａｒａｃａ；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＰＣＣ ８００５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ ＤＳＭ １２４４２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＬＳ１０；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿１＿４７；Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ ＤＳＭ ６７２５；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ ＭＰ１０４Ｃ；Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ＿１０８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈａｇｅ ｃ－ｓｔ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ ｓｔｒ．Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂａ４ ｓｔｒ．６５７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＱＣＤ－６３ｑ４２；Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ ＷＨ ８５０１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＣＣＹ０１１０；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２；Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ ２５５－１５；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８；Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ ＤＳＭ ４４９６３；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＰＢ２００３／０４４－Ｔ３－４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ １１７４１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＥＬＢ１７；Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ Ｚ－７３０３；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｈａｇｅ Ｍａ－ＬＭＭ０１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ－８４３；Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＡＴＣＣ ２３１３４；Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ Ｎｃ４；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＤＳＭ ４３１１１；Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ ＣＣＹ９４１４；Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ＰＣＣ ６５０６；Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ＿ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ＿ＳＩ；Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ ＳＪ９５；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＪ２；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ ＴＡＣ１２５；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ４０７３６；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ４３０２１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５；およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＴＣＦ５２Ｂにおいて同定されるＣａｓタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない（Chylinskiら、RNA Biol.、２０１３年、１０巻（５号）：７２６～７３７頁）。
Ｃａｓ９オルソログに加えて、他のＣａｓ９バリアント、例えば、不活性ｄＣａｓ９および異なる機能を有するエフェクタードメインの融合タンパク質は、遺伝子モジュレーションのプラットフォームとしての機能を果たし得る。前述の酵素のうちのいずれも、本開示において有用であり得る。
本開示において利用され得るエンドヌクレアーゼのさらなる例を、配列番号１～６１２に提示する。これらのタンパク質は、使用前に修飾されてもよく、または核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡにおいて、またはベクター構築物、例えば、本明細書において教示されるプラスミドもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にコードされてもよい。さらに、これらは、コドン最適化されていてもよい。
ゲノムターゲティング核酸
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特異的標的配列へと誘導できるゲノムターゲティング核酸を提示する。ゲノムターゲティング核酸は、ＲＮＡであり得る。本明細書では、ゲノムターゲティングＲＮＡを、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称する。ガイドＲＮＡは、少なくとも目的の標的核酸配列とハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含み得る。ＩＩ型系では、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、互いとハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。いずれの系でも、ガイドＲＮＡと、部位特異的ポリペプチドとが、複合体を形成するように、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し得る。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、複合体に、標的特異性をもたらし得る。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導できる。
例示的なガイドＲＮＡは、配列表の配列番号５２８２～５２９１におけるスペーサー配列を含み、これらは、それらの標的配列のゲノム位置（図２Ａにおける配列番号５２７２～５２８１を参照されたい）および関連するＣａｓ９切断部位とともに示されており、ここで、ゲノム位置は、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ヒトゲノムアセンブリに基づく。
それぞれのガイドＲＮＡは、そのゲノムの標的配列と相補的なスペーサー配列を含むようにデザインすることができる。例えば、配列表の配列番号５２８２～５２９１におけるスペーサー配列のそれぞれは、単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡとともに）へ入れることができる。Jinek et al., Science, 337, 816-821 (2012)およびDeltcheva et al., Nature, 471, 602-607 (2011)を参照されたい。
ゲノムターゲティング核酸は、二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ゲノムターゲティング核酸は、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。二重分子ガイドＲＮＡまたは単一分子ガイドＲＮＡは、修飾されていてもよい。
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含みうる。第１の鎖は、５’～３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。
ＩＩ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’～３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡの、さらなる機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含みうる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成しうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１または複数のヘアピンを含みうる。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７～３０ヌクレオチドで長さが可変のスペーサー配列を含み得る（表３）。他の例では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７～２４ヌクレオチドで長さが可変のスペーサー配列を含み得る。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１９ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１８ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチドを上回るスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２１ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２２ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２３ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２４ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２５ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２６ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２７ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２８ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２９ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、３０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。
ｓｇＲＮＡは、表３の配列番号５２６８、５３２８、５３３１、５３３４、または５３３７など、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まなくてもよい。ｓｇＲＮＡは、表３の配列番号５２６７、５２６９、５３２７、５３２９、５３３０、５３３２、５３３３、５３３５、５３３６、または５３３８など、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、１つまたは複数のウラシルを含んでもよい。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、１つのウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、２つのウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、３つのウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、４つのウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、５つのウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、６つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、７つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、８つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
ｓｇＲＮＡは、修飾されていなくてもよく、または修飾されていてもよい。例えば、修飾ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
Figure 0007522656000003
Figure 0007522656000004
Ｖ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’～３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含みうる。
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、化学的手段によりたやすく合成することができる。化学合成手順が、持続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増大するにつれて、難しくなる傾向がある。より長いＲＮＡを作出するために使用される１つの手法は、併せてライゲーションされる、２つまたはこれを超える分子を作製することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく作出される。多様な種類のＲＮＡ修飾、例えば、当技術分野で記載される、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強する修飾は、ＲＮＡの化学合成および／または酵素による作出中に導入することもでき、これらの後で導入することもできる。
スペーサー伸長配列
ゲノムターゲティング核酸についての一部の例では、スペーサー伸長配列は、活性を修飾することも可能であり、安定性をもたらすことも可能であり、かつ／またはゲノムターゲティング核酸を修飾するための位置をもたらすこともできる。スペーサー伸長配列は、オンまたはオフ標的活性または特異性を修飾しうる。一部の例では、スペーサー伸長配列を提供することができる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドを超える長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの間の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの間の長さでありうる。
スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含みうる。この部分は、核酸ターゲティング核酸の安定性を低下させる場合もあり、増大させる場合もある。この部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）でありうる。この部分は、真核細胞内で機能しうる。この部分は、原核細胞内で機能しうる。この部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。適切な部分の非限定的な例は、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体のアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列とハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に、標的核酸と相互作用しうる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動しうる。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、スペーサー配列は、系内で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸とハイブリダイズするようにデザインすることができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチする場合もあり、ミスマッチを有する場合もある。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ内で認識する、特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸内で、配列５’－ＮＲＧ－３’［配列中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０を上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、多くとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基を含み得る。例えば、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ－３’（配列番号５２７０）を含む配列では、標的核酸は、複数のＮに対応する配列（配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線を付したＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭである）を含み得る。
標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有しうる。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔでありうる。一部の例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含みうる。一部の例では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、１８ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、２２ヌクレオチドを含み得る。
一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、多くて約３０％、多くて約４０％、多くて約５０％、多くて約６０％、多くて約６５％、多くて約７０％、多くて約７５％、多くて約８０％、多くて約８５％、多くて約９０％、多くて約９５％、多くて約９７％、多くて約９８％、多くて約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列のうちの、最も５’側の６つの連続ヌクレオチドにわたり、１００％である。スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、約２０連続ヌクレオチドにわたり、少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列および標的核酸の長さは、１～６ヌクレオチド異なる場合があるが、これは、１つまたは複数のバルジと考えることができる。
スペーサー配列は、コンピュータプログラムを使用して、デザインすることもでき、選び出すこともできる。コンピュータプログラムは、予測溶融温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるかまたは類似するが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として、１または複数のスポットで変動する配列）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用しうる。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、基準ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列であり得る。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成し得る。一体となって、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合し得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズし得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、多くて約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含み得る。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔである。一部の例では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ９ヌクレオチドの長さであり得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さであり得る。
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含みうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズしうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的でありうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔ長でありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約９ヌクレオチドの長さでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１２ヌクレオチドでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Jinekら、前出において記載されている、ｔｒａｃｒＲＮＡのｎｔ２３～４８からなりうる。
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型、ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、二重螺旋を含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。
二重鎖は、ミスマッチを含みうる（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含みうる。
バルジ（ｂｕｌｇｅ）
一部の場合には、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖内には、「バルジ」が存在し得る。バルジとは、二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域である。バルジは、二重鎖の、部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与し得る。バルジは、二重鎖の一方の側に、非対合の５’－ＸＸＸＹ－３’［配列中、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対を形成し得るヌクレオチドを含む］を含むことが可能であり、二重鎖の他の側に、非対合ヌクレオチド領域を含み得る。二重鎖の２つの側における非対合ヌクレオチドの数は、異なり得る。
一例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に、非対合プリン（例えば、アデニン）を含みうる。一部の例では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’－ＡＡＧＹ－３’［配列中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対合を形成しうる、ヌクレオチドを含む］を含みうる。
二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、第２の側のバルジ（例えば、二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
バルジは、少なくとも１つの揺らぎ対合を含みうる。一部の例では、バルジは、最大で１つの揺らぎ対合を含みうる。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含みうる。一部の例では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含みうる。
ヘアピン
多様な例では、１または複数のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡに対して３’側に位置しうる。
ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。
ヘアピンは、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。ヘアピンは、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続シトシンヌクレオチド）を含みうる。
ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、ヘアピン内で一体にハイブリダイズしたヌクレオチド）を含みうる。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内の、ＧＧジヌクレオチドへとハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含みうる。
ヘアピンのうちの１または複数は、部位特異的ポリペプチドの、ガイドＲＮＡと相互作用する領域と相互作用しうる。
ある例では、２つまたはこれを超えるヘアピンが存在し、他の例では、３つまたはこれを超えるヘアピンが存在する。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有しうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチドの長さを有しうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なり（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つを超える二重鎖領域（例えば、ヘアピン領域、ハイブリダイズ領域）を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。ステムループ構造は、機能的部分を含みうる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含みうる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐドメインを含みうる。一部の例では、Ｐドメインは、ヘアピン内の二本鎖領域を含みうる。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一分子ガイドの文脈にある場合であれ、二重分子ガイドの文脈にある場合であれ、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０～約５０００またはこれを超えるヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含みうる。機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含みうる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの全長を有しうる。機能的部分は、真核細胞内で機能しうる。機能的部分は、原核細胞内で機能しうる。機能的部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長の機能的部分の非限定的な例は、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体によるアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合性部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合性部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を含みうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１または複数のアフィニティータグを含みうる。
単一分子ガイドリンカー配列
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。Jinekら、前出では、例えば、単純な４ヌクレオチドの「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６～８２１頁（２０１２年））。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有しうる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４～４０ヌクレオチドの間でありうる。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。
リンカーは、様々な配列のうちのいずれも含みうるが、一部の例では、リンカーは、ガイドＲＮＡの他の部分と相同的である広範な領域であって、ガイドの他の機能的な領域に干渉する可能性のある分子内結合を引き起こしうる領域を有する配列を含まない。Jinekら、前出では、単純な４ヌクレオチドの配列である、－ＧＡＡＡ－が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６～８２１頁（２０１２年））が、より長い配列を含む、多数の他の配列も同様に、使用することができる。
リンカー配列は、機能的部分を含みうる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、タンパク質結合性部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む、１または複数の特色を含みうる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。一部の例では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
ゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９など、核酸にガイドされるヌクレアーゼ）と相互作用し、これにより、複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを、標的核酸へと導く。
リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）
部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸は、それぞれ、細胞または患者へと、別個に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。部位特異的ポリペプチドは、１つまたは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。ＲＮＰにおける部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端に位置する１つのＮＬＳおよびＣ末端に位置する第２のＮＬＳの２つのＮＬＳが、隣接し得る。ＮＬＳは、当技術分野において公知の任意のＮＬＳ、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳであり得る。ＲＮＰにおける、ゲノムターゲティング核酸の部位特異的ポリペプチドに対する重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰにおける、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対する重量比は、１：１であり得る。
標的配列の選択
５’境界部および／または３’境界部の位置の、特定の基準ローカスと比べたシフトを使用して、本明細書にさらに記載および例示される、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼ系に部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易とするかまたは増強することができる。
このような標的配列選択の第１の非限定的な例では、多くのエンドヌクレアーゼ系は、切断のための潜在的な標的部位の初期の選択を導き得る規則または基準、例えば、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合のＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの要件を有する。
標的配列の選択または最適化についての別の非限定的な例では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せについてのオフターゲット活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で、ＤＳＢが生じる頻度）を、オンターゲット活性の頻度と比べて評価することができる。一部の場合には、所望されるローカスにおいて適正に編集されている細胞は、他の細胞と比べて、選択的利点を有し得る。選択的利点についての、例示的であるが非限定的な例としては、複製速度の増強、存続性、ある特定の条件に対する耐性、患者への導入後のｉｎ ｖｉｖｏにおける、生着成功率または存続率の増強などの属性、およびこのような細胞の維持または数もしくは生存率の増加と関連する他の属性の獲得が挙げられる。他の場合には、所望されるローカスにおいて適正に編集されている細胞を、適正に編集されている細胞を同定するか、分取するか、または他の形で選択するのに使用される、１つまたは複数のスクリーニング法によって、正に選択することができる。選択的利点および指向選択法（directed selection method）のいずれも、修正と関連する表現型を利用し得る。一部の場合には、意図された細胞集団を選択または精製するのに使用される新たな表現型を作り出す第２の修飾を作り出すために、細胞を、２回またはこれを超える回数にわたり編集することができる。このような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能マーカーのための第２のｇＲＮＡを付加することによって、作り出す可能性がある。一部の場合には、ｃＤＮＡを含有し、また、選択可能マーカーも含有するＤＮＡ断片を使用して、細胞を、所望されるローカスにおいて適正に編集することができる。
特定の場合に、いずれかの選択的利点が適用可能であるか、またはいずれかの指向選択を適用するかにかかわらず、適用の有効性を増強し、かつ／または所望される標的以外の部位における、所望されない変更の潜在性を低減するために、標的配列の選択はまた、オフターゲット頻度の考慮によっても導くことができる。本明細書および当技術分野で、さらに記載および例示される通り、オフターゲット活性の発生は、標的部位と多様なオフターゲット部位との間の類似性および相違性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む、いくつかの因子の影響を受け得る。オフターゲット活性の予測の一助となる、バイオインフォマティクスツールが利用可能であり、多くの場合、このようなツールはまた、オフターゲット活性の可能性が最も高い部位を同定し、次いで、これを、実験状況下で評価して、オフターゲットの、オンターゲット活性に対する相対頻度について査定することができ、これにより、より高度な相対オンターゲット活性を有する配列の選択を可能とするのにも使用することができる。本明細書では、このような技法の実例を提示するが、当技術分野では、他の例が公知である。
標的配列選択の別の態様は、相同組換えイベントに関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす、相同組換えイベントのための焦点として機能し得る。このような組換えイベントは、染色体および他のＤＮＡ配列の、通常の複製過程中に生じ、また、通常の細胞複製サイクル中に定期的に生じるが、多様なイベント（ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他の誘導因子など）の発生により増強される場合もあり、ある特定の作用物質（agent）（多様な化学的誘導因子など）の存在により増強される場合もある、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成される他の時点においても生じる。多くのこのような誘導因子は、ＤＳＢを、ゲノム内で、無差別的に生じさせ、ＤＳＢは、通常の細胞内で、定期的に誘導および修復され得る。修復中に、元の配列は、完全な忠実度で再構築され得るが、しかしながら、一部の場合には、小規模の挿入または欠失（「インデル」と称する）が、ＤＳＢ部位に導入される。
ＤＳＢはまた、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置において、特異的に誘導することもでき、これを使用して、選択された染色体位置において、指向されたまたは優先的な遺伝子修飾イベントを引き起こすことができる。相同な配列が、ＤＮＡ修復（ならびに複製）の状況で組換えに供される傾向を、いくつかの状況において利用することができ、これは、相同組換え修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を介して供給される目的の配列を所望される染色体位置へと挿入する、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集系の１つの適用のための基礎である。
１０塩基対またはそれ未満という少数の塩基対を含み得る、「マイクロホモロジー」の小領域であり得る、特定の配列の間の相同性の領域もまた、所望の欠失をもたらすのに使用することができる。例えば、単一のＤＳＢを、近傍の配列とのマイクロホモロジーを呈する部位に導入することができる。このようなＤＳＢの修復の通常の過程中、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび相伴う細胞の修復プロセスにより組換えが容易となる結果としての介在配列の欠失である。
しかしながら、一部の状況では、相同性の領域内で、標的配列を選択することはまた、遺伝子融合（欠失が、コーディング領域内にある場合）を含む、はるかに大きい欠失ももたらし得、これは、特定の状況を考慮すると、所望される場合もあり、所望されない場合もある。
本明細書に提示される例は、ＲＨＯタンパク質活性の回復をもたらす置き換えを誘導するようにデザインされたＤＳＢを作り出すための、多様な標的領域の選択、ならびにオンターゲットイベントと比べてオフターゲットイベントを最小化するようにデザインされたそのような領域内の特異的標的配列の選択をさらに例示する。
相同組換え修復（ＨＤＲ）／ドナーヌクレオチド
相同組換え修復とは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は、相同組換えである。ＨＤＲには、一本鎖アニーリングおよび代替的ＨＤＲを含む、さらなる経路が存在する。ゲノム操作ツールは、研究者が、ゲノムに対して、部位特異的修飾を作り出すように、細胞の相同組換え経路を操作することを可能とする。細胞は、トランスに提供される合成のドナー分子を使用して、二本鎖切断を修復し得ることが見出されている。したがって、特異的変異の近傍に二本鎖切断を導入し、好適なドナーを提供することにより、標的とされる変化が、ゲノムにおいて作製され得る。特異的切断により、ＨＤＲ率は、相同なドナー単独を受ける細胞１０６個中における１の率よりも１，０００倍を超えて増加する。特定のヌクレオチドにおける相同組換え修復（ＨＤＲ）率は、切断部位までの距離の関数であるので、重複するかまたは最近傍の標的部位を選び出すことが重要である。ｉｎ ｓｉｔｕで修正することにより、ゲノムの残りは乱れないままとなるため、遺伝子編集は、遺伝子付加を上回る利点を提供する。
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは、顕著に変動するが、小さいまたは大きいフランキング相同性アームを伴う配列であって、ゲノムＤＮＡとのアニーリングを可能とする意図される配列を含有し得る。導入される遺伝子変化を挟む相同性領域は、３０ｂｐまたはこれより小さい場合もあり、マルチキロベースという大きなカセットの場合もあり、これらは、プロモーター、ｃＤＮＡなどを含有し得る。一本鎖オリゴヌクレオチドドナーおよび二本鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれも使用されている。これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満から多くのｋｂを超える（over many kb）サイズの範囲であるが、より長いｓｓＤＮＡもまた、生成および使用し得る。ＰＣＲ単位複製配列、プラスミド、およびミニサークルを含む、二本鎖ドナーを使用することができる。一般に、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型の送達の極めて有効な手段であり得ることが見出されているが、個々のドナーに対するパッケージング限界が＜５ｋｂである。ドナーの能動的転写が、ＨＤＲを３倍に増加させたことから、プロモーターを含むことが、転換を増加させ得ることが指し示される。逆に、ドナーのＣｐＧのメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを減少させた。
変異を修正するためのドナーヌクレオチドは、多くの場合、小さい（３００ｂｐ未満）。ＨＤＲ効率は、ドナー分子のサイズに対して逆に関連性し得るため、これは、有利である。また、ドナー鋳型が、サイズが制限されるＡＡＶ分子に適合し得ることも予測され、これは、ドナー鋳型送達の効果的な手段であることが示されている。
Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、一方のヌクレアーゼドメインまたは他方のヌクレアーゼドメインを不活化させる結果として、１つのＤＮＡ鎖だけの切断をもたらす、ニッカーゼバリアントが存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから誘導することができ、または標的領域を挟むニッカーゼ対を使用して誘導することもできる。ドナーは、一本鎖の場合もあり、ニック処理されている場合もあり、ｄｓＤＮＡの場合もある。
ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼとともに供給することもでき、または様々な異なる方法、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、もしくはウイルスを介する形質導入により、独立して供給することもできる。ＨＤＲのためのドナーのアベイラビリティーを増加させる、一連のテザリングの選択肢が提起されている。例としては、ドナーの、ヌクレアーゼへの結合、近傍に結合するＤＮＡ結合性タンパク質への結合、またはＤＮＡ末端における結合もしくは修復に関与するタンパク質への結合が挙げられる。
修復経路の選択は、細胞周期に影響を及ぼす培養条件など、いくつかの培養条件により導くこともでき、ＤＮＡ修復および関連タンパク質のターゲティングにより導くこともできる。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶなど、鍵となるＮＨＥＪ分子を抑制することができる。
ドナーが存在しない場合、接合部において塩基対合をほとんどまたは全く伴わずにＤＮＡ末端を接合させる、いくつかの非相同性修復経路を使用して、ＤＮＡ切断に由来する末端または異なる切断に由来する末端を接合させることができる。カノニカルのＮＨＥＪに加えて、ＡＮＨＥＪなど、同様の修復機構が存在する。２つの切断が存在する場合、介在するセグメントを、欠失させることもでき、反転させることもできる。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部において、挿入、欠失、または変異をもたらし得る。ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼによる切断の後において、１５ｋｂの誘導的遺伝子発現カセットを、ヒト細胞株内の規定されたローカスへと挿入するのに使用された。大きい誘導的遺伝子発現カセットの挿入の方法が、説明されている［Maresca, M., Lin, V.G., Guo, N. & Yang, Y., Genome Res 23, 539-546 (2013)、Suzuki et al. Nature, 540, 144-149 (2016)］。
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲの両方を使用する、部位特異的遺伝子挿入が、実施されている。組合せアプローチは、恐らくイントロン／エクソン境界部を含む、ある特定の状況において、適用可能であり得る。ＮＨＥＪは、イントロンにおけるライゲーションに有効であることを実証し得るが、エラーのないＨＤＲが、コーディング領域においてはより適している可能性がある。
ＲＨＯ遺伝子内の例示的な改変としては、上記に参照された変異内またはその近傍（近位）、例えば、特異的変異から３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満上流または下流の領域内における置き換えが挙げられる。ＲＨＯ遺伝子における変異の比較的広範な変化を考慮すると、上記の置き換えの多数の変化形（限定することなく、より大きい並びにより小さい欠失）が、ＲＨＯタンパク質活性の回復をもたらすと予測されるであろうことが理解される。
そのようなバリアントは、問題の特異的変異よりも５’および／もしくは３’の方向に大きいか、またはいずれかの方向に小さい、置き換えを含み得る。したがって、特異的置き換えに関連する「近傍」または「近位」であるとは、所望される置き換え境界部（本明細書においてエンドポイントとも称される）と関連するＳＳＢまたはＤＳＢローカスが、基準ローカス、例えば、変異部位から約３ｋｂ未満である領域内にあり得ることを意図する。ＳＳＢまたはＤＳＢローカスは、より近位であってもよく、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内であってもよい。小さい置き換えの事例では、所望されるエンドポイントは、基準ローカスにあってもよく、またはそれに「隣接して」いてもよく、これは、エンドポイントが、基準ローカスから１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ未満～５ｂｐであり得ることを意図する。
大きい置き換えも小さい置き換えも、ＲＨＯタンパク質活性が回復される限り、同じ利点を提供し得る。したがって、本明細書に記載され、例示される置き換えの様々な変化形が、網膜色素変性（ＲＰ）を改善するのに有効であり得ることが予測される。
ＳＳＢまたはＤＳＢに関連する「近傍」または「近位」という用語は、ＳＳＢまたはＤＳＢが、Ｐ２３Ｈ変異から２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、０．２５ｋｂ以内、０．２ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内であることを指す。
核酸の修飾（化学的および構造的修飾）
一部の場合には、細胞へと導入されたポリヌクレオチドは、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を増強するか、送達を変更するか、宿主細胞内の自然免疫応答を低減するか、または本明細書でさらに記載され、当技術分野でも公知の他の増強のために、個別に、または組合せで使用され得る、１つまたは複数の修飾を含み得る。
ある特定の例では、修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用することができるが、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドもしくは二重分子ガイド）、および／または細胞へと導入されるＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下に記載および例示されるように、修飾することができる。このような修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用して、任意の１つまたは複数のゲノムローカスを編集することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系を、このような使用の非限定的例示を目的として使用して、単一分子ガイドの場合もあり、二重分子ガイドの場合もある、ガイドＲＮＡと、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を増強するために、ガイドＲＮＡの修飾を使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、ゲノム編集複合体と、ゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または反応速度を増強するのに使用することができ、例えば、オンターゲット活性を増強するのに使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、特異性、例えば、オンターゲット部位におけるゲノム編集の、他の（オフターゲット）部位における効果と比較した相対速度を増強するのに使用することができる。
修飾はまた、または代替的に、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその耐性を増加させ、これにより、細胞内でのその半減期の延長をもたらすことによって、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの半減期を延長する修飾は、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞へと、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを導入する態様において、特に有用であり得るが、これは、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入される、ガイドＲＮＡ半減期の延長が、ガイドＲＮＡと、コードされるＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞内に共存する時間を延長するのに使用することができるためである。
修飾はまた、または代替的に、細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるのに使用することができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈では、十分に特徴付けられており、下記および当技術分野で記載されるこのような応答は、ＲＮＡの半減期の短縮および／またはサイトカインもしくは免疫応答と関連する他の因子の誘発と関連する傾向がある。
限定なしに述べると、ＲＮＡの安定性を増強する（細胞内に存在するＲＮアーゼによる分解に対するその耐性を増大させることなどにより）修飾、結果として得られる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、および／または細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾を含む、１種または複数種の修飾もまた、細胞へと導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡへと施すことができる。
前出および他のものなどの修飾の組合せも同様に、使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、１種または複数種の修飾を、ガイドＲＮＡ（上記で例示したガイドＲＮＡを含む）へと施すこともでき、かつ／または１種または複数種の修飾を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記で例示したＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡを含む）へと施すこともできる。
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用されるガイドＲＮＡ、または他の低分子ＲＮＡは、化学的手段によりたやすく合成することができ、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、いくつかの修飾をたやすく組み込むことを可能とする。化学合成手順が、断続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増加するにつれて、難しくなる傾向がある。より長い化学修飾ＲＮＡを生成するために使用され得る１つの手法は、一緒にライゲーションされる、２つまたはこれを上回る分子を作製することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく生成される。酵素により産生されたＲＮＡにおける使用のために利用可能な修飾の種類は少ないが、下記および当技術分野でさらに記載されるように、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強するのに使用され得る修飾がまだ存在し、通例、新たな種類の修飾が開発されている。
多様な種類の修飾、とりわけ、化学合成される低分子ＲＮＡとともに頻繁に使用される修飾についての例示を目的として述べると、修飾は、糖の２’位において修飾された、１つまたは複数のヌクレオチド、一部の態様では、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、または２’－フルオロで修飾されたヌクレオチドを含み得る。一部の例では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース、無塩基残基、またはＲＮＡの３’末端における逆向き塩基における、２’－フルオロ、２’－アミノ、または２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。このような修飾は、規定の方式で、オリゴヌクレオチドへと組み込むことができ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’－デオキシオリゴヌクレオチドよりＴｍが大きい（すなわち、標的への結合アフィニティーが大きい）ことが示されている。
いくつかのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に対して、天然のオリゴヌクレオチドより耐性とすることが示されており、これらの修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたりインタクトのまま存続する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによる糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環による糖間連結を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を伴うオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２、ＣＨ、～Ｎ（ＣＨ３）～Ｏ～ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知である）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２骨格、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、およびＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格［式中、天然のホスホジエステル骨格を、Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨとして表す］；アミド骨格［De Mesmaekerら、Ace. Chem. Res.、２８巻：３６６～３７４頁（１９９５年）を参照されたい］；モルホリノ骨格構造（SummertonおよびWeller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、ポリアミド骨格で置きかえ、ヌクレオチドを、ポリアミド骨格のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させる；Nielsenら、Science、１９９１年、２５４巻、１４９７頁を参照されたい）を伴うオリゴヌクレオチドである。リン含有連結は、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートであって、通常の３’－５’連結を有するこれら、２’－５’連結されたこれらの類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が、５’－３’に対する３’－５’、または５’－２’に対する２’－５’で連結される逆極性を有するリン含有連結を含むがこれらに限定されない（米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を参照されたい）。
モルホリノベースのオリゴマー性化合物については、BraaschおよびDavid Corey、Biochemistry、４１巻（１４号）：４５０３～４５１０頁（２００２年）；Genesis、３０巻、３号（２００１年）；Heasman、Dev. Biol.、２４３巻：２０９～２１４頁（２００２年）；Naseviciusら、Nat. Genet.、２６巻：２１６～２２０頁（２０００年）；Lacerraら、Proc. Natl. Acad. Sci.、９７巻：９５９１～９５９６頁（２０００年）；および１９９１年７月２３日に公布された、米国特許第５，０３４，５０６号において記載されている。
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体については、Wangら、J. Am. Chem. Soc.、１２２巻：８５９５～８６０２頁（２０００年）において記載されている。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとの混合によるヌクレオシド間連結、または１もしくは複数の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環によるヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分の混合を有する他の骨格（米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を参照されたい）を含む。
１つまたは複数の置換糖部分、例えば、２’位における以下：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ ＯＣＨ３、ＯＣＨ３ Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ ＣＨ３（式中、ｎは、１～約１０である）；Ｃ１～Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール、またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基のうちの１つも含まれ得る。一部の態様では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）としてもまた公知の、２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含む（Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486）。他の修飾は、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。同様の修飾を、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても施すことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチルなどの糖模倣体も有し得る。
一部の例では、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格を、新規の基で置きかえることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。１つのこのようなオリゴマー性化合物であるオリゴヌクレオチド模倣体であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称する。ＰＮＡ化合物中では、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置きかえることができる。ヌクレオ塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製について教示する、代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsenら、Science、２５４巻：１４９７～１５００頁（１９９１年）において見出すことができる。
ガイドＲＮＡはまた、加えてまたは代替的に、ヌクレオ塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、天然の核酸内で、低頻度で、または一過性に見出されるに過ぎないヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に、５－メチルシトシン（また、５－メチル－２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、５－Ｍｅ－Ｃと称されることが多い）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成のヌクレオ塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾイルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニン（2-(aminoalklyamino)adenine）または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、および２，６－ジアミノプリンを含む（Kornberg, A.、DNA Replication、W. H. Freeman & Co.、San Francisco、７５～７７頁（１９８０年）；Gebeyehuら、Nucl. Acids Res.、１５巻：４５１３頁（１９９７年））。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンもまた、組み入れることができる。５－Ｍｅ－Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６～１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、１９９３年、２７６～２７８頁）、塩基置換の態様である。
修飾ヌクレオ塩基は、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、および２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルアデニンおよび８－ヒドロキシルグアニンならびに他の８－置換アデニンおよび８－置換グアニン、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、特に、５－ブロモウラシルおよび５－ブロモシトシン、５－トリフルオロメチルウラシルおよび５－トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５－置換ウラシルおよび５－置換シトシン、７－メチルグアニン（quanine）および７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなど、他の合成および天然ヌクレオ塩基を含みうる。
さらに、ヌクレオ塩基は、；米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているヌクレオ塩基；「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、８５８～８５９頁、Kroschwitz, J.I.編、John Wiley & Sons、１９９０年において開示されているヌクレオ塩基；Englischら、「Angewandle Chemie, International Edition」、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示されているヌクレオ塩基；およびSanghvi, Y. S.、１５章、「Antisense Research and Applications」、２８９～３０２頁、Crooke, S.T.およびLebleu, B.編著、CRC Press、１９９３年により開示されているヌクレオ塩基を含みうる。これらのヌクレオ塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー性化合物の結合アフィニティーを増大させるために、特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む、Ｎ－２、Ｎ－６、および０－６置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６～１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S.、Crooke, S. T.およびLebleu, B.編、「Antisense Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、１９９３年、２７６～２７８頁）、なおより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、塩基置換の態様である。修飾ヌクレオ塩基については、米国特許第３，６８７，８０８号のほか、同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；および米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号において記載されている。
したがって、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼの両方へと組み込まれた、非天然の糖、リン酸、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチド内の全ての位置が、一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つを超える修飾は、単一のオリゴヌクレオチドに組み込むこともでき、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むこともできる。
ガイドＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、活性、細胞の分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞による取込みを増強する、１または複数の部分またはコンジュゲートへと化学的に連結することができる。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Letsingerら、Proc. Natl. Acad.、Sci. USA、８６巻：６５５３～６５５６頁（１９８９年）］；コール酸［Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、４巻：１０５３～１０６０頁（１９９４年）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール［Manoharanら、Ann. N. Y. Acad. Sci.、６６０巻：３０６～３０９頁（１９９２年）；およびManoharanら、Bioorg. Med. Chem. Let.、３巻：２７６５～２７７０頁（１９９３年）］；チオコレステロール［Oberhauserら、Nucl. Acids Res.、２０巻：５３３～５３８頁（１９９２年）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Kabanovら、FEBS Lett.、２５９巻：３２７～３３０頁（１９９０年）；およびSvinarchukら、Biochimie、７５巻：４９～５４頁（１９９３年）］；リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート［Manoharanら、Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１～３６５４頁（１９９５年）；およびSheaら、Nucl. Acids Res.、１８巻：３７７７～３７８３頁（１９９０年）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Mancharanら、Nucleosides & Nucleotides、１４巻：９６９～９７３頁（１９９５年）］；アダマンタン酢酸［Manoharanら、Tetrahedron Lett.、３６巻：３６５１～３６５４頁（１９９５年）］；パルミチル部分［（Mishraら、Biochim. Biophys. Acta、１２６４巻：２２９～２３７頁（１９９５年）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－ｔオキシコレステロール（hexylamino-carbonyl-t oxycholesterol）部分［Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、２７７巻：９２３～９３７頁（１９９６年）］を含むがこれらに限定されない。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
糖および他の部分を使用して、タンパク質と、カチオン性のポリソームおよびリポソームなど、ヌクレオチドを含む複合体とを、特定の部位へとターゲティングすることができる。例えば、肝細胞指向移入は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を媒介しうる（例えば、Huら、Protein Pept Lett.、２１巻（１０号）：１０２５～３０頁（２０１４年）を参照されたい）。当技術分野で公知であり、定期的に開発されている他の系は、本場合において使用される生体分子および／またはその複合体を、目的の、特定の標的細胞へとターゲティングするのに使用することができる。
これらのターゲティング部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基へと共有結合的に結合させたコンジュゲート基を含み得る。本開示のコンジュゲート基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本開示の文脈における、薬力学特性を増強する基は、取込みを改善する基、分解に対する耐性を増強する基、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本開示の文脈における、薬物動態特性を増強する基は、本開示の化合物の、取込み、分布、代謝、または排出を改善する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号（ＷＯ１９９３００７８８３として公開）、および米国特許第６，２８７，８６０号において開示されている。コンジュゲート部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル－５－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分を含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
化学合成にあまり適さず、酵素的合成により作製することが典型的な、長型のポリヌクレオチドもまた、多様な手段により修飾することができる。このような修飾は、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、特定の配列または他の部分の、分子の５’または３’末端における組込み、および他の修飾を含みうる。例示を目的として述べると、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂの長さであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写により合成することができる。ｍＲＮＡへの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を増大させる（細胞による分解に対するその耐性を増大させることなどによる）ように適用することもでき、ＲＮＡの、自然免疫応答を誘発する傾向であって、外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡなど、長いＲＮＡの導入後において、細胞内で観察されることが多い傾向を低減するように適用することもできる。
当技術分野では、ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基（シュードＵＴＰ、２－チオ－ＵＴＰ、５－メチルシチジン－５’－三リン酸（５－メチル－ＣＴＰ）またはＮ６－メチル－ＡＴＰなど）の使用、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理など、多数のこのような修飾について記載されている。当技術分野では、これらの修飾および他の修飾が公知であり、ＲＮＡの新たな修飾が、定期的に開発されている。
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、および多くの他の供給元を含む、修飾ＲＮＡの多数の市販品の供給元が存在する。ＴｒｉＬｉｎｋにより記載されている通り、例えば、５－メチル－ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼの安定性の増大、翻訳の増大、または生得的免疫受容体の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写されたＲＮＡとの相互作用の低減など、望ましい特徴を付与することができる。下記で言及される、KormannらおよびWarrenらによる刊行物において例示されている通り、５－メチルシチジン－５’－三リン酸（５－メチル－ＣＴＰ）、Ｎ６－メチル－ＡＴＰ、ならびにシュードＵＴＰおよび２－チオ－ＵＴＰはまた、培養物中およびｉｎ ｖｉｖｏにおける生得的免疫刺激を低減する一方で、翻訳を増強することも示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達される化学修飾ｍＲＮＡを使用して、治療効果の改善を達成しうることが示されている（例えば、Kormannら、Nature Biotechnology、２９巻、１５４～１５７頁（２０１１年）を参照されたい）。このような修飾を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増大させ、かつ／またはその免疫原性を低減することができる。シュードＵ、Ｎ６－メチル－Ａ、２－チオ－Ｕ、および５－メチル－Ｃなどの化学修飾を使用して、ウリジンおよびシチジン残基のうちの４分の１だけを、それぞれ、２－チオ－Ｕおよび５－メチル－Ｃで置換する結果として、マウスにおける、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により媒介されるｍＲＮＡの認識の顕著な低下がもたらされることが見出された。生得的免疫系の活性化を低減することにより、これらの修飾を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に増大させることができる（例えば、Kormannら、前出を参照されたい）。
また、生得的抗ウイルス応答を迂回するようにデザインされた修飾を組み込む、合成のメッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化ヒト細胞を、多能性へと再プログラム化できることも示されている。例えば、Warrenら、Cell Stem Cell、７巻（５号）：６１８～３０頁（２０１０年）を参照されたい。一次再プログラム化タンパク質として作用する、このような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラム化する、効率的な手段でありうる。このような細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称し、５－メチル－ＣＴＰ、シュードＵＴＰ、およびＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）を組み込む、酵素的に合成されたＲＮＡであれば、細胞の抗ウイルス応答を効果的に逃避するのに使用されうることが見出された（例えば、Warrenら、前出を参照されたい）。
当技術分野で記載されるポリヌクレオチドの他の修飾は、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の付加、５’もしくは３’非翻訳領域ＵＴＲの修飾、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理（そして、新たな手法が定期的に開発されている）を含む。
本明細書における使用のための修飾ＲＮＡを生成するのに適用可能な、いくつかの組成物および技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾との関連で開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介する、遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果が、一般に、一過性であり、これは、反復投与を要求し得るため、ｉｎ ｖｉｖｏでは、特定の課題を提示する。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、ウイルス感染の副産物であることが多い、ｄｓＲＮＡを検出および中和するように進化した免疫応答を有する。したがって、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介し得る、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）など、哺乳動物の酵素、および潜在的にレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、ならびにこのような分子に応答してサイトカインの誘導を惹起し得るＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８など）が存在する（例えば、Angart et al., Pharmaceuticals (Basel) 6(4): 440-468 (2013)、Kanasty et al., Molecular Therapy 20(3): 513-524 (2012)、Burnett et al., Biotechnol J. 6(9):1130-46 (2011)、Judge and MacLachlan, Hum Gene Ther 19(2):111-24 (2008)による総説を参照されたい）。
ＲＮＡの安定性を増強し、自然免疫応答を低減し、かつ／またはポリヌクレオチドの、ヒト細胞への導入であって、本明細書で記載される導入との関連で有用でありうる他の利益を達成するように、多種多様な修飾が、開発および適用されている（例えば、Whitehead KAら、Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering、２巻：７７～９６頁（２０１１年）；GaglioneおよびMessere、Mini Rev Med Chem、１０巻（７号）：５７８～９５頁（２０１０年）；Chernolovskayaら、Curr Opin Mol Ther.、１２巻（２号）：１５８～６７頁（２０１０年）；Deleaveyら、Curr Protoc Nucleic Acid Chem、１６章：１６．３部（２００９年）；Behlke、Oligonucleotides、１８巻（４号）：３０５～１９頁（２００８年）；Fuciniら、Nucleic Acid Ther、２２巻（３号）：２０５～２１０頁（２０１２年）；Bremsenら、Front Genet、３巻：１５４頁（２０１２年）による総説を参照されたい）。
上記で言及した通り、それらの多くが、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するようにデザインされた修飾に特化した、修飾ＲＮＡのいくつかの市販品の供給元が存在する。文献で報告されている多様な知見に基づき、様々な手法が提供されている。例えば、Dharmaconは、Kole、Nature Reviews Drug Discovery、１１巻：１２５～１４０頁（２０１２年）により報告されている通り、非架橋酸素の、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）による置きかえが、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するのに使用されていることについて言及している。リボースの２’位の修飾は、ヌクレオチド間のリン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を増大させ、これはまた、免疫活性化からの保護をもたらすことも示されていることが報告されている。Soutschekら、Nature、４３２巻：１７３～１７８頁（２００４年）により報告されている通り、中程度のＰＳ骨格の修飾の、小型の、十分に忍容される２’－置換（２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロ）との組合せは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける適用のための、高度に安定的なｓｉＲＮＡと関連しており、Volkov、Oligonucleotides、１９巻：１９１～２０２頁（２００９年）により報告されている通り、２’－Ｏ－メチル修飾は、安定性の改善において有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることとの関連で、特異的配列を、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロで修飾することは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減する一方で、一般に、サイレンシング活性を保存することが報告されている（例えば、Judgeら、Mol. Ther.、１３巻：４９４～５０５頁（２００６年）；およびCekaiteら、J. Mol. Biol.、３６５巻：９０～１０８頁（２００７年）を参照されたい）。２－チオウラシル、シュードウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、およびＮ６－メチルアデノシンなどのさらなる修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８により媒介される免疫作用を最小化することが示されている（例えば、Kariko, K.ら、Immunity、２３巻：１６５～１７５頁（２００５年）を参照されたい）。
また、当技術分野で公知であり、市販されている、いくつかのコンジュゲートであって、例えば、コレステロール、トコフェロール、および葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーを含み、それらの送達および／または細胞による取込みを増強し得るコンジュゲートを、本明細書における使用のために、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドへと適用することができる（例えば、Winkler, Ther. Deliv. 4:791-809 (2013)による総説を参照されたい）。
コドンの最適化
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で標準的な方法に従い、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内の発現のために、コドンを最適化することができる。例えば、意図された標的核酸が、ヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化したヒトポリヌクレオチドを、Ｃａｓ９ポリペプチドを産生するための使用に想定する。
系の構成要素をコードする核酸
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提示する。
本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードする核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含みうる。
「ベクター」という用語は、それを連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、さらなる核酸セグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなる核酸セグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、および哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。
一部の例では、ベクターは、それらが作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能でありうる。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」、またはより簡単に、「発現ベクター」と称するが、これらは、同等の機能を果たす。
「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする形で、調節配列へと連結されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。当技術分野では、このような調節配列が周知であり、例えば、Goeddel、Gene Expression Technology、Methods in Enzymology、１８５巻、Academic Press、San Diego、CA（１９９０年）において記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節配列と、ある特定の宿主細胞内だけのヌクレオチド配列の発現を導く調節配列（例えば、組織特異的調節配列）とを含む。当業者は、発現ベクターのデザインが、標的細胞の選び出し、所望の発現レベルなどの因子に依存しうることを察知するであろう。
想定される発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づくウイルスベクター、ならびに他の組換えベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核標的細胞のために想定される他のベクターとしては、ｐＸＴ１ベクター、ｐＳＧ５ベクター、ｐＳＶＫ３ベクター、ｐＢＰＶベクター、ｐＭＳＧベクター、およびベクターｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。真核標的細胞のために想定される追加のベクターとしては、ｐＣＴｘ－１ベクター、ｐＣＴｘ－２ベクター、およびｐＣＴｘ－３ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合性である限りにおいて、他のベクターを使用することができる。
一部の例では、ベクターは、１または複数の転写および／または翻訳制御エレメントを含みうる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクター内で使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構もしくは他のエレメントの構成要素を不活化させる、自己不活化ベクターでありうる。
適切な真核プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来するＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）へと融合させたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１ローカスプロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネインＩに由来するプロモーターを含む。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの関連で使用されるガイドＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現するためには、例えば、Ｕ６およびＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの多様なプロモーターが有利でありうる。当技術分野では、このようなプロモーターの使用を増強することについての記載、およびこのためのパラメータが公知であり、さらなる情報および手法が、定期的に記載されている（例えば、Ma, H.ら、Molecular Therapy - Nucleic Acids、３巻、ｅ１６１頁（２０１４年）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい）。
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合性部位および転写ターミネーターも含有しうる。発現ベクターはまた、発現を増幅するのに適切な配列も含みうる。発現ベクターはまた、非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列であって、部位特異的ポリペプチドへと融合させ、したがって、融合タンパク質をもたらすヌクレオチド配列も含みうる。
プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーターなど）でありうる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）でありうる。場合によって、プロモーターは、空間限定型および／または時間限定型プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）でありうる。
本開示のゲノムターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のための送達媒体内またはその表面上にパッケージングすることができる。想定される送達媒体は、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲル、およびミセルを含むがこれらに限定されない。当該分野において記載されている通り、様々なターゲティング部分を使用して、このような媒体の、所望される細胞型または場所との優先的な相互作用を増強することができる。
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の、細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型トランスフェクション、リポソーム媒介型トランスフェクション、遺伝子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達などにより行うことができる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
遺伝子調節的領域の別のクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節において鍵となる役割を果たすノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、全ての哺乳動物タンパク質コード遺伝子のうちの３０％の発現を調節し得る。さらなる低分子ノンコーディングＲＮＡを加えた、二本鎖ＲＮＡによる、特異的かつ強力な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）が発見された（Canver, M.C. et al., Nature (2015)）。遺伝子サイレンシングに重要なノンコーディングＲＮＡの最大のクラスは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡはまず、個別の転写単位、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物であり得る、長いＲＮＡ転写物として転写される。長い転写物は、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、塩基対合の不完全なヘアピン構造を含む。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを伴う、核内のタンパク質複合体である、Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒにより、１つまたは複数の短い前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）へと切断され得る。
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、２ヌクレオチドの３’突出を有する約７０ヌクレオチドの長さの短いステムループであり、エクスポートされて１９～２５ヌクレオチドの成熟ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖になる。塩基対合安定性の低い方のｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされ得る。パッセンジャーガイド鎖（＊でマークされる）は、機能的であり得るが、通常、分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを、標的ｍＲＮＡ内の部分的に相補的な配列モチーフであって、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に主に見出される相補的な配列モチーフへ係留し、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Bartel, D.P. Cell 136, 215-233 (2009)、Saj, A. & Lai, E.C. Curr Opin Genet Dev 21, 504-510 (2011)）。
ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、および増殖の制御、ならびに哺乳動物および他の多細胞の生物の事実上全ての生物学的経路において重要でありうる。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期の制御、アポトーシス、および幹細胞分化、造血、低酸素状態、筋発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルスの複製、および免疫応答にも関与しうる。
単一のｍｉＲＮＡが、数百の異なるｍＲＮＡ転写物を標的とし得る一方で、個々の転写物は、多くの異なるｍｉＲＮＡにより標的とされ得る。最新版のｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるｍｉＲＮＡが、注釈されている。一部のｍｉＲＮＡは、複数のローカスによりコードされる場合があり、それらの一部は、タンデムに共転写されたクラスターから発現され得る。この特色は、複数の経路およびフィードバック制御を伴う、複雑な調節ネットワークを可能とする。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバックおよび調節回路の不可欠な部分である可能性があり、タンパク質の産生を制限内に保つことにより、遺伝子発現を調節する一助となり得る（Herranz, H. & Cohen, S.M. Genes Dev 24, 1339-1344 (2010); Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)）。
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現と関連する多数のヒト疾患においても重要であり得る。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調する。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究では、ｍｉＲＮＡを、免疫応答の調節と関連付けている（Stern-Ginossar, N. et al., Science 317, 376-381 (2007)）。
ｍｉＲＮＡはまた、がんとも強力な関連を有し、異なる種類のがんにおいて役割を果たし得る。ｍｉＲＮＡは、いくつかの腫瘍において、下方調節されることが見出されている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期の制御およびＤＮＡの損傷への応答など、鍵となるがん関連経路の調節において重要な場合があり、したがって、診断において使用することができ、臨床において標的とすることができる。ｍｉＲＮＡは、全てのｍｉＲＮＡを枯渇させる実験が、腫瘍血管新生を抑制するように、血管新生の平衡を精密に調節し得る（Chen, S. et al., Genes Dev 28, 1054-1067 (2014)）。
タンパク質コーディング遺伝子について示されている通り、ｍｉＲＮＡ遺伝子はまた、がんと共に生じる後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）変化下にも置かれうる。多くのｍｉＲＮＡローカスは、ＤＮＡのメチル化によるそれらの調節の機会を増大させるＣｐＧアイランドと関連しうる（Weber, B.、Stresemann, C.、Brueckner, B.、およびLyko, F.、Cell Cycle、６巻、１００１～１００５頁（２００７年））。研究の大半は、クロマチンリモデリング薬による処理を使用して、ｍｉＲＮＡの後成的サイレンシングを明らかにしている。
ＲＮＡサイレンシングにおけるそれらの役割に加えて、ｍｉＲＮＡはまた、翻訳も活性化させ得る（Posadas, D.M. & Carthew, R.W. Curr Opin Genet Dev 27, 1-6 (2014)）。これらの部位のノックアウトが、標的とした遺伝子の発現の低下をもたらし得るのに対し、これらの部位の導入は、発現を増加させ得る。
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性に重要であり得る、シード配列（２～８塩基のｍｉＲＮＡ）を変異させることにより、最も効果的にノックアウトすることができる。この領域内の切断、続いてＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合を遮断することにより、ｍｉＲＮＡの機能を効果的に消失させ得る。ｍｉＲＮＡはまた、回文配列に隣接する特殊なループ領域の特異的ターゲティングによっても阻害することができる。触媒的に不活性なＣａｓ９もまた、ｓｈＲＮＡの発現を阻害するために使用することができる（Zhao, Y. et al., Sci Rep 4, 3943 (2014)）。ｍｉＲＮＡのターゲティングに加えて、結合部位もまた、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防止するために標的とし、変異させることができる。
本開示によると、ｍｉＲＮＡまたはそれらの結合部位のうちのいずれかを、本発明の組成物に組み込んでもよい。
組成物は、配列番号６１３～４６９６に列挙されるｍｉＲＮＡのうちのいずれかの配列、配列番号６１３～４６９６に列挙されるｍｉＲＮＡの逆相補体、または配列番号６１３～４６９６に列挙されるｍｉＲＮＡのうちのいずれかのｍｉＲＮＡアンチシード領域を含む領域などであるがこれらに限定されない領域を有し得る。
本発明の組成物は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、またはｍｉＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、米国公開第２００５／０２６１２１８号および米国公開第２００５／００５９００５号に教示されるものなど、任意の公知のｍｉＲＮＡに対応し得る。非限定的な例として、公知のｍｉＲＮＡ、それらの配列、およびヒトゲノムにおけるそれらの結合部位の配列は、配列番号６１３～４６９６に列挙されている。
ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２位～８位の領域にある配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完璧なワトソン・クリック相補性を有する。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８または２～７位を含み得る。一部の例では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ １位に対向するアデニン（Ａ）が隣接している。一部の例では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ １位に対向するアデニン（Ａ）が隣接している。例えば、Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 Jul 6;27(1):91-105を参照されたい。ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。
ｍｉＲＮＡの同定、ｍｉＲＮＡ標的領域、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割が、報告されている（Bonauer et al., Curr Drug Targets 2010 11:943-949、Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403。
例えば、組成物が、肝臓へと送達されるのを意図したものではないにもかかわらず、送達されてしまった場合、肝臓において豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１２２は、ｍｉＲ－１２２の１つまたは複数の標的部位が、その標的配列をコードするポリヌクレオチド内に操作されていれば、送達された配列の発現を阻害することができる。異なるｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入は、生存性、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させるように操作することができ、したがって、さらに妥当性（tenability）を重ねることができる。
本明細書において使用されるとき、「ｍｉＲＮＡ部位」という用語は、ｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ認識部位、またはｍｉＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来的なワトソン・クリックハイブリダイゼーション則に従い得るか、またはｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ部位もしくはそれに隣接する標的配列との任意の安定な会合を反映し得ることを理解されたい。
対照的に、本開示の組成物の目的で、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特異的組織におけるタンパク質発現を増加させるために、それらが天然に存在する配列の外部で（すなわち、そこから取り出して）操作されてもよい。例えば、ｍｉＲ－１２２結合部位は、肝臓におけるタンパク質発現を改善するために、取り出され得る。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも称される）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて、差次的に発現されることが知られている。免疫細胞に特異的なｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫性、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療および組織／器官移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞に特異的なｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、およびアポトーシスの多数の側面を調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２およびｍｉＲ－１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に、骨髄樹状細胞において豊富である。ｍｉＲ－１４２結合部位を、本開示のポリペプチドの３’－ＵＴＲへと導入することによって、ｍｉＲ－１４２により媒介されるｍＲＮＡの分解を通じて抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制し、プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって、遺伝子送達後の抗原により媒介される免疫応答を予防することができる（例えば、Annoni A et al., blood, 2009, 114, 5152-5161を参照されたい）。
１つの例は、免疫細胞、特に、抗原提示細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチド内に操作して、ｍｉＲＮＡにより媒介されるＲＮＡの分解を通じてＡＰＣにおけるポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原に媒介される免疫応答を緩和することができ、同時に、ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞に特異的なｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞においては維持される。
様々ながん細胞／組織および他の疾患におけるｍｉＲＮＡの差次的発現をプロファイリングするために、多くのｍｉＲＮＡ発現に関する研究が行われており、当技術分野において説明されている。一部のｍｉＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、その他のものは、過少発現される。例えば、ｍｉＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）、がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）、膵臓がんおよび疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）、喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）、前立腺がん（ＵＳ２０１３／００５３２６４）、肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）、肺がん細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）、結腸直腸がん細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）、がん陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）、上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）、慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）、甲状腺がん（ＷＯ２０１３／０６６６７８）、卵巣がん細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）、乳がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）において、差次的に発現される。
ヒト細胞
本明細書に記載および例示されるように、網膜色素変性（ＲＰ）またはＲＨＯと関連する任意の障害の改善に関して、遺伝子編集の主要な標的は、ヒト細胞である。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、体細胞であり得、体細胞は、記載される技法を使用して修飾された後に、分化した細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を生じ得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、光受容細胞または網膜前駆細胞であり得る。
自家細胞において遺伝子編集を実施することを必要とする患者に由来し、したがって、既に患者と完全にマッチしている自家細胞において遺伝子編集を実施することにより、患者へと安全に再導入することが可能であり、患者の疾患と関連する１つまたは複数の臨床状態の改善において有効であり得る細胞集団を効果的にもたらす細胞を生成することが可能である。
前駆細胞（本明細書において幹細胞とも称される）は、増殖およびより多くの前駆細胞をもたらすことのいずれもが可能であり、分化細胞または分化可能な娘細胞をもたらし得る、多数の母細胞を発生させる能力を有する。娘細胞自体が、増殖し、その後、１つまたは複数の成熟細胞型へと分化する一方で、また、親の発生的潜在能を伴う１つまたは複数の細胞も保持する後代をもたらすように、誘導することができる。次いで、「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、より特化したまたは分化した表現型へと分化する能力または潜在能を有し、ある特定の状況下では、実質的に分化せずに、増殖する能力を保持する、細胞を指す。一態様では、前駆細胞または幹細胞という用語は、それらの子孫細胞（後代）が、分化により、例えば、胚細胞および組織の、進行する多様化においてそうであるように、完全に個別の性格を獲得することにより、しばしば、異なる方向に特化する汎用母細胞を指す。細胞の分化とは、典型的に、多くの細胞分裂を介して生じる、複雑なプロセスである。分化細胞は、複能性細胞に由来することが可能であり、複能性細胞はそれ自体、複能性細胞に由来するなどである。これらの複能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられるが、各々がもたらし得る細胞型の範囲は、かなり変動し得る。一部の分化細胞はまた、発生的潜在能が大きな細胞をもたらす能力も有する。このような能力は、天然の場合もあり、多様な因子による処理の際に、人工的に誘導される場合もある。多くの生物学的事例では、幹細胞はまた、１つを超える別個の細胞型の後代をもたらし得るため、「複能性」でもあり得るが、これは、「幹細胞性」であるために必要ではない。
自己再生は、幹細胞の別の重要な側面でありうる。理論的に、自己再生は、２つの主要な機構のうちのいずれかにより生じうる。幹細胞は、一方の娘細胞が、幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞が、何らかの別個の他の特異的機能および表現型を発現して、非対称的に分裂する場合がある。代替的に、集団内の幹細胞の一部が、２つの幹細胞へと、対称的に分裂することが可能であり、これにより、全体としての集団内に一部の幹細胞を維持するのに対し、集団内の他の細胞は、分化した後代だけをもたらす。一般に、「始原細胞」は、より始原性である（すなわち、発生経路または進行に沿って、完全な分化細胞より早期の段階にある）、細胞の表現型を有する。始原細胞はまた、顕著な、または極めて高度な、増殖潜在能も有する。始原細胞は、細胞が発生および分化する、発生の経路および環境に応じて、複数の別個の分化細胞型をもたらす場合もあり、単一の分化細胞型をもたらす場合もある。
細胞の個体発生の文脈では、「分化した」または「～を分化させること」という形容詞は、相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較する細胞より、発生経路をさらに下に進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系統制限前駆体細胞（lineage-restricted precursor cell）（筋細胞の前駆細胞など）へと分化することが可能であり、これは、経路をさらに下った、他の種類の前駆体細胞（筋細胞の前駆体細胞など）へと分化することが可能であり、次いで、筋細胞など、最終段階の分化細胞へと分化し、ある特定の組織型において、特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持する場合もあり、保持しない場合もある。
誘導多能性幹細胞
本明細書で記載される、遺伝子操作されたヒト細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でありうる。ｉＰＳＣを使用する利点は、細胞を、始原細胞が投与される同じ対象から導出しうることである。すなわち、体細胞は、対象から得、誘導多能性幹細胞へと再プログラム化し、次いで、対象へと投与するように、始原細胞へと再分化させることができる（例えば、自家細胞）。始原細胞は、自家供給源から本質的に導出されるため、別の対象または対象群に由来する細胞の使用と比較して、生着拒絶またはアレルギー応答の危険性を低減することができる。加えて、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞に対する必要も無化する。したがって、一態様では、開示される方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
分化は、生理学的文脈では、一般に、不可逆的であるが、体細胞を、ｉＰＳＣへと再プログラム化するためのいくつかの方法が最近開発されている。当業者には、例示的な方法が公知であり、本明細書の下記で略述する。
「～を再プログラム化すること」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更するまたは逆行させ工程を指す。言い換えると、再プログラム化することとは、細胞の分化を、より未分化なまたはより始原的な細胞型へと戻すように駆動する工程を指す。多くの初代細胞を培養することは、完全な分化特徴の、何らかの喪失をもたらしうることに留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を単に培養するだけで、これらの細胞が、非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞となるわけではない。分化細胞から多能性への移行は、培養物中で分化的性格の部分的な喪失をもたらす刺激を越えた、再プログラム化刺激を要求する。再プログラム化細胞はまた、培養物中では一般に、回数の限定された分裂能だけを有する初代親細胞と比べて、増殖可能性の喪失を伴わない、拡大継代能の特徴も有する。
再プログラム化されるべき細胞は、再プログラム化する前に、部分分化している場合もあり、最終分化している場合もある。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、多能性状態または複能性状態への完全な逆行を包含しうる。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全なまたは部分的な逆行を包含しうる。再プログラム化は、細胞による特定の遺伝子であって、その発現が、再プログラム化にさらに寄与する遺伝子の発現をもたらしうる。本明細書で記載されるある特定の例では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラム化は、分化細胞に、未分化状態を取らせうる（例えば、分化細胞を、未分化細胞としうる）。結果として得られる細胞を、「再プログラム化細胞」または「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と称する。
再プログラム化は、細胞の分化の間に生じる遺伝パターンであって、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、後成的変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝性パターンの少なくとも一部の変更、例えば、逆行を伴いうる。再プログラム化は、既に多能性である細胞の、既存の未分化状態を単に維持すること、または既に複能性細胞（例えば、筋原性幹細胞）である細胞の、既存の完全未満の分化状態を維持することとは別個である。再プログラム化はまた、既に多能性または複能性である細胞の自己再生または増殖の促進とも別個であるが、一部の例では、本明細書で記載される組成物および方法はまた、このような目的でも有用でありうる。
当技術分野では、体細胞から多能性幹細胞を作出するのに使用しうる多くの方法が公知である。体細胞を、多能性表現型へと再プログラム化する、任意のこのような方法が、本明細書で記載される方法における使用に適切であろう。
転写因子の規定された組合せを使用して、多能性細胞を作出するための再プログラム化法については記載されている。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃの直接的な形質導入により、マウス体細胞を、発生の潜在能を拡大した、ＥＳ細胞様細胞へと転換することができる（例えば、TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻（４号）：６６３～７６頁（２００６年）を参照されたい）。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路およびエピジェネティックランドスケープの大半を修復するので、ＥＳ細胞に似ている。加えて、マウスｉＰＳＣは、多能性についての全ての標準的アッセイ：具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、三胚葉の細胞型への分化、奇形腫の形成、キメラへの寄与、生殖細胞系列伝達［例えば、MaheraliおよびHochedlinger、Cell Stem Cell、３巻（６号）：５９５～６０５頁（２００８年）を参照されたい］、および四倍体補完法を満たす。
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入方法を使用して得ることができ、転写因子のトリオである、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧが、多能性を支配する転写因子のコアセットとして確立されている。例えば、Budniatzky and Gepstein, Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014)、Barrett et al., Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121 (2014)、Focosi et al., Blood Cancer Journal 4: e211 (2014)を参照されたい。ｉＰＳＣの作製は、従来通りにウイルスベクターを使用して、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を、成体の体細胞へと導入することにより達成することができる。
ｉＰＳＣは、最終分化した体細胞から生成または得ることができるほか、成体幹細胞または体細胞性幹細胞から生成または得ることもできる。すなわち、非多能性前駆細胞を、再プログラム化することにより、多能性または複能性とすることができる。このような事例では、最終分化細胞を再プログラム化するのに要求されるほど多くの再プログラム化因子を含むことが必要ではない場合がある。さらに、再プログラム化は、再プログラム化因子の非ウイルス的導入により誘導することができ、例えば、タンパク質自体を導入することにより、または再プログラム化因子をコードする核酸を導入することにより、または翻訳の際に再プログラム化因子をもたらすメッセンジャーＲＮＡを導入することにより誘導することができる（例えば、Warren et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010)を参照されたい。再プログラム化は、例えば、Ｏｃｔ－４（Ｏｃｔ－３／４またはＰｏｕｆ５１としてもまた公知）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ－Ｍｙｃ、１－Ｍｙｃ、ｎ－Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、およびＬＩＮ２８を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組合せを導入することにより達成することができる。本明細書に記載される方法および組成物を使用する再プログラム化は、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、およびＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１つまたは複数を、体細胞へと導入することをさらに含み得る。本明細書に記載される方法および組成物は、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ－ＭＹＣ、およびＫｌｆ４のそれぞれのうちの１つまたは複数を、再プログラム化のために導入することをさらに含み得る。上記で言及した通り、再プログラム化のために使用される正確な方法は、本明細書に記載される方法および組成物にとって、必ずしも不可欠なわけではない。しかしながら、再プログラム化細胞から分化させた細胞を、例えば、ヒト治療において使用しようとする場合、一態様では、再プログラム化は、ゲノムを変更する方法によりなされるわけではない。したがって、このような例では、再プログラム化は、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを使用せずに達成することができる。
出発細胞集団から導出される再プログラム化の効率（すなわち、再プログラム化細胞の数）は、Shiら、Cell-Stem Cell、２巻：５２５～５２８頁（２００８年）；Huangfuら、Nature Biotechnology、２６巻（７号）：７９５～７９７頁（２００８年）；およびMarsonら、Cell-Stem Cell、３巻：１３２～１３５頁（２００８年）により示される通り、多様な薬剤、例えば、低分子の添加により増強することができる。したがって、誘導多能性幹細胞作製の効率または速度を増強する薬剤または薬剤の組合せを、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの作製において使用することができる。再プログラム化効率を増強する薬剤の一部の非限定的な例は、とりわけ、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ－０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’－アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）を含む。
再プログラム化増強剤の他の非限定的な例は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ－２１０、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ（例えば、（－）－Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、ＨＣトキシン、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４－（１，３－ジオキソ－１Ｈ，３Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－２－イル）－Ｎ－ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニル酪酸ナトリウムおよびバルプロ酸（ＶＰＡ）および他の短鎖脂肪酸）、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ－９）、Ｔｒａｐｏｘｉｎ Ｂ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としてもまた公知である）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ－９９４（例えば、Ｎ－アセチルジナリン）およびＭＳ－２７－２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ－ＬＡＱ－８２４、ＣＢＨＡ（ｍ－カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、Ｔｕｂａｃｉｎ、Ａ－１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３－Ｃｌ－ＵＣＨＡ（例えば、６－（３－クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２－アミノ－８－オキソ－９，１０－エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、およびＣＨＡＰ５０を含む。他の再プログラム化増強剤は、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒不活性形態）、ｓｉＲＮＡによるＨＤＡＣ阻害剤、およびＨＤＡＣに特異的に結合する抗体を含む。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、およびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
本明細書に記載される方法による使用のための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンを、幹細胞マーカーの発現について調べることができる。体細胞に由来する細胞内のこのような発現により、細胞を、人工多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、およびＮａｔｌを含む非限定的な群から選択することができる。１つの場合には、例えば、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は、多能性であると同定される。このようなマーカーの発現を検出するための方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、およびウエスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析など、コードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を含み得る。検出は、ＲＴ－ＰＣＲを含み得るだけでなく、タンパク質マーカーの検出も含み得る。細胞内マーカーは、ＲＴ－ＰＣＲ、または免疫細胞化学などのタンパク質検出法を介して、最も良好に同定され得、一方で細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によって容易に同定される。
単離された細胞の多能性幹細胞性は、ｉＰＳＣが、三胚葉の各々の細胞へと分化する能力について査定する試験により確認することができる。一例として述べると、ヌードマウスにおける奇形腫形成を使用して、単離されたクローンの多能性について査定することができる。細胞を、ヌードマウスへと導入し、細胞から生じる腫瘍に対して、組織学および／または免疫組織化学を実施することができる。三胚葉全てに由来する細胞を含む腫瘍の増殖は、例えば、細胞が多能性幹細胞であることをさらに指し示す。
網膜前駆細胞および光受容細胞
一部の例では、本明細書に記載される遺伝子操作されたヒト細胞は、光受容細胞または網膜前駆細胞（ＲＰＣ）である。ＲＰＣは、網膜の６つ全てのニューロンならびにミューラーグリアをもたらし得る、複能性前駆細胞である。ミューラーグリアは、網膜膠細胞の一種であり、網膜の主要な膠細胞構成要素である。それらの機能は、網膜のニューロンを補助すること、ならびに網膜の恒常性および完全性を維持することである。成体ヒト網膜から単離されたミューラーグリアは、桿体光受容器に分化することが示されている。パッチクランプ記録によるそのようなミューラーグリアに由来する光受容器の機能的特徴付けにより、それらの電気的特性が、成体桿体に匹敵することが明らかとなった（Giannelli et al., 2011, Stem Cells, (2):344-56）。ＲＰＣは、網膜形成の間に、徐々に、系統制限前駆体細胞へと特化し、その後、最終分化したニューロンまたはミューラーグリア（Mueuller glia）へと成熟する。胎児由来のヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）は、最大で６回目の継代まで、網膜前駆細胞状態の指標である分子特徴を呈する。それらは、継代１回目から６回目まで、ＫＩ６７、ＳＯＸ２、およびビメンチン陽性細胞の割合の漸減を示し、一方で、ネスチンおよびＰＡＸ６の発現の持続は、継代６回目まで見られる。継代１回目のｈＲＰＣのマイクロアレイ分析は、初期網膜発生遺伝子：ＶＩＭ（ビメンチン）、ＫＩ６７、ＮＥＳ（ネスチン）、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、ＨＥＳ５、ＧＮＬ３、ＯＴＸ２、ＤＡＣＨ１、ＳＩＸ６、およびＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）の発現を示す。ｈＲＰＣは、本質的に機能性であり、興奮性神経伝達物質に応答する（Schmitt et al., 2009, Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 2009;50(12):5901-8）。網膜の最も外側の領域は、補助的な網膜色素上皮（ＲＰＥ）層を含み、これは、栄養を輸送し、脱落した光受容器部分を再利用することによって、光受容器の健康状態を維持する。ＲＰＥは、脈絡膜と網膜との間の界面にある細胞外マトリックス構造体であるブルッフ膜に結合している。眼の内部へ向かって内側に移動し、ＲＰＥの反対側には、ニューロンの３つの層がある：光を感知する桿体および錐体光受容器、ニューロンをつなぐ中間層（アマクリン、双極細胞および水平細胞）、ならびに最も内側の神経節細胞の層、これは、光受容器層を起源とするシグナルを、視神経を通じて脳へと伝達する。一部の態様では、本明細書に記載される遺伝子操作されたヒト細胞は、光受容細胞であり、これは、網膜において見られる特化した種類のニューロンである。光受容器は、光を、生物学的プロセスを刺激することができるシグナルに変換し、視覚を担う。桿体および錐体は、視覚系への情報に寄与する、２つの古典的な光受容細胞である。
網膜前駆細胞および光受容細胞の単離
前駆細胞を含め、網膜細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って、単離することができる。例えば、ヒト網膜細胞は、新しい外科手術標本から単離される。網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、組織を、ＩＶ型コラゲナーゼで消化させることによって、脈絡膜から分離させ、網膜色素上皮パッチを、培養する。外植片から１００～５００個の細胞の増殖後に、初代培養物を、継代させ（Ishida M. et al., Current Eye Research 1998; 17(4):392-402）、ＲＰＥマーカーの発現について特徴付ける。桿体は、パパインを使用して、生検網膜の破壊によって単離される。激しい破壊を回避し、細胞収率を改善するために、予防措置を講じる。単離した細胞を選別して、純粋な桿体細胞の集団を得、免疫染色によって、さらに特徴付ける（Feodorova et al., MethodsX 2015; 2:39-46）。
錐体を単離するために、神経網膜を同定し、切り出し、１０％ゼラチン上に置く。内部網膜層を、レーザーを使用して単離する。単離した錐体単層を、１８時間培養し、光学顕微鏡法および透過電子顕微鏡法によって、未処理の網膜と比較して、任意の構造的損傷を調べる。細胞を、錐体特異的マーカーの発現について特徴付ける（Salchow et al., Current Eye Research 2001;22）。
網膜前駆細胞を単離するために、生検網膜を、二重メス（dual scalpel）で細かく刻み、インキュベーターにおいて３７℃で酵素消化させる。消化した細胞の上清を、遠心分離し、細胞を、無細胞網膜前駆細胞条件培地に再懸濁する。細胞を、新しい培地を含有する、フィブロネクチンをコーティングした組織培養フラスコへと移し、培養する（Klassen et al., Jornal of Neuroscience Research 2004; 77:334-343）。
患者特異的なｉＰＳＣの創出
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の１つのステップは、患者特異的な１つのｉＰＳ細胞、患者特異的な複数のｉＰＳ細胞、または患者特異的なｉＰＳ細胞株を創出することを含み得る。TakahashiおよびYamanaka、２００６年；Takahashi、Tanabeら、２００７年において記載されている通り、当技術分野では、患者特異的なｉＰＳ細胞を創出するための多くの方法が確立されている。例えば、創出するステップは、ａ）体細胞、例えば、皮膚細胞または線維芽細胞を、患者から単離すること、およびｂ）多能性幹細胞となるように細胞を誘導するために、多能性関連遺伝子のセットを、体細胞へと導入することを含み得る。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－ＭＹＣ、ｎ－ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択される遺伝子のうちの１つまたは複数であり得る。
患者の骨髄の生検または吸引の実施
生検または吸引物は、身体から採取される組織または体液の試料である。多数の異なる種類の生検または吸引物が存在する。それらのほぼ全てが、鋭利なツールを使用して、少量の組織を摘出することを含む。生検が、皮膚または他の感受性領域に行われる場合、麻痺させる薬を、最初に適用してもよい。生検または吸引は、当技術分野において公知の方法のうちのいずれかに従って実施され得る。例えば、骨髄吸引の場合、大きな針を使用して、骨盤の骨に進入させ、骨髄を採取する。
間葉幹細胞の単離
間葉幹細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って、患者の骨髄または末梢血などから単離することができる。例えば、骨髄吸引物を、ヘパリンを有するシリンジに採取してもよい。細胞を、洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）密度勾配において遠心分離してもよい。細胞、例えば、血液細胞、肝臓細胞、間質細胞、マクロファージ、マスト細胞、および胸腺細胞を、密度勾配遠心分離培地、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を使用して、分離してもよい。細胞を、次いで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）において培養してもよい（Pittinger MF, Mackay AM, Beck SC et al., Science 1999; 284:143-147）。
ゲノム編集したｉＰＳＣの、他の細胞型への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、ゲノム編集したｉＰＳＣを、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。例えば、ｉＰＳＣを使用して、当技術分野において説明されているように、網膜オルガノイド（retinal organioid）および光受容器を生成することができる（Phillips et al., Stem Cells, June 2014, 32(6): pgs. 1480-1492、Zhong et al. Nat. Commun., 2014, 5: pg 4047、Tucker et al., PLoS One, April 2011, 6(4): e18992）。例えば、ｈｉＰＳＣを、Ｗｎｔ、Ｎｏｄａｌ、およびＮｏｔｃｈ経路阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｋ１、ＬｅｆｔｙＡ、およびＤＡＰＴ）、ならびに他の成長因子を含む、様々な処理を使用して、網膜前駆細胞へと分化させる。網膜前駆細胞を、光受容細胞へとさらに分化させるが、処理には、共培養系、ＲＸ＋もしくはＭｉｔｆ＋においてナイーブ網膜細胞に曝露し、続いて、レチノイン酸およびタウリンで処理すること、またはＮｏｇｇｉｎ、Ｄｋｋ１、ＤＡＰＴ、およびインスリン様成長因子を含む、いくつかの外因性因子に曝露することが含まれる（Yang et al., Stem Cells International 2016）。
ゲノム編集した間葉幹細胞の、光受容細胞または網膜前駆細胞への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、ゲノム編集した間葉幹細胞を、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。
細胞の、患者への埋め込み
本開示のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことを含み得る。この埋め込むステップは、当技術分野で公知の任意の埋め込み方法を使用して、達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の血液に直接注射してもよく、またはそうでなければ、患者に投与してもよい。
本発明のｅｘ ｖｉｖｏ方法の別のステップは、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことを含む。この埋め込むステップは、当技術分野で公知の任意の埋め込み方法を使用して、達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の眼に直接注射してもよく、またはそうでなければ、患者に投与してもよい。
遺伝子改変細胞
「遺伝子改変細胞」という用語は、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系を使用して）導入された少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書における一部のｅｘ ｖｉｖｏでの例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された前駆細胞であり得る。本明細書における一部のｉｎ ｖｉｖｏでの例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された光受容細胞または網膜前駆細胞であり得る。外因性ゲノムターゲティング核酸および／またはゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子改変細胞が、本明細書において想定される。
「対照で処置された集団」という用語は、ゲノム編集の構成要素の付加を除き、同一な培地、ウイルスによる誘導、核酸配列、温度、コンフルエンシー、フラスコサイズ、ｐＨなどで処置された細胞の集団について記載する。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、ＲＨＯタンパク質のウエスタンブロット分析、またはＲＨＯ ｍＲＮＡを定量するためのリアルタイムＰＣＲを使用して、ＲＨＯ遺伝子の回復またはタンパク質の発現もしくは活性を測定することができる。
「単離細胞」という用語は、それが元来見出される生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、規定された条件下、または他の細胞の存在下で培養することができる。任意選択で、細胞は、後に、第２の生物へと導入することもでき、それが単離された生物（またはそれを子孫とする細胞）へと再導入することもできる。
細胞の単離集団に関する「単離集団」という用語は、混合細胞集団または異質細胞集団から、取り出され、分離された細胞集団を指す。場合によって、単離集団は、細胞がそこから単離されるかまたは濃縮された異質集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団でありうる。場合によって、単離集団は、ヒト始原細胞の単離集団、例えば、ヒト始原細胞と、ヒト始原細胞がそこから導出された細胞とを含む異質細胞集団と比較して、実質的に純粋なヒト始原細胞の集団でありうる。
特定の細胞集団に関する、「実質的に増強された」という用語は、特定の種類の細胞の発生が、例えば、網膜色素変性（ＲＰ）を改善するための、このような細胞の所望のレベルに応じて、既存のまたは基準レベルと比べて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはこれを超える倍数だけ増加する細胞集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に照らして、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはこれを超える細胞集団を指す。
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、前駆細胞集団に関して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書の用語により規定される前駆細胞ではない細胞を、約２０％未満、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満含有する細胞集団を指す。
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルス性または非ウイルス性の送達媒体によって送達することができる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチドは、当技術分野で公知のウイルス性または非ウイルス性送達媒体によって、例えば、電気穿孔もしくは脂質ナノ粒子によって、送達することができる。さらに代替的な態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１つまたは複数のポリペプチドとして単独で送達するか、または１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、もしくはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つもしくは複数のｃｒＲＮＡとあらかじめ複合体化させた、１つまたは複数のポリペプチドとして送達することができる。
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボヌクレオタンパク質、正に帯電させたペプチド、低分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ－融合タンパク質複合体を含むがこれらに限定されない、非ウイルス性送達媒体により送達することができる。一部の例示的な非ウイルス性送達媒体については、Peer and Lieberman, Gene Therapy, 18: 1127-1133 (2011)（これは、他のポリヌクレオチドの送達にもまた有用な、ｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達媒体に焦点を当てている）において記載されている。
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）により、細胞または患者へと送達することができる。
ＬＮＰは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍの直径を有する任意の粒子を指す。代替的に、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、または２５～６０ｎｍのサイズの範囲であり得る。
ＬＮＰは、カチオン性脂質から作製することもでき、アニオン性脂質から作製することもでき、中性脂質から作製することもできる。融合性リン脂質であるＤＯＰＥまたは膜成分であるコレステロールなどの中性脂質を、トランスフェクション活性およびナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー脂質」として、ＬＮＰ中に組み入れることができる。カチオン性脂質の限界は、低い安定性および急速なクリアランスに起因する低い効能ならびに炎症性または抗炎症性応答の発生を含む。
ＬＮＰはまた、疎水性脂質から構成される場合もあり、親水性脂質から構成される場合もあり、疎水性脂質および親水性脂質の両方から構成される場合もある。
当技術分野で公知の、任意の脂質または脂質の組合せを使用して、ＬＮＰを作製することができる。ＬＮＰを作製するのに使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧで修飾された脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。
脂質を、任意の数のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。加えて、ポリヌクレオチド（複数可）を、脂質（複数可）と、広範にわたるモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。
既に明示した通り、部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸は、それぞれ、細胞または患者へと、別個に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡとの特異的相互作用を形成することが可能である。この特性は、多くの生物学的プロセスで利用されているが、核酸に富む細胞内環境における、無差別的な相互作用の危険性とも隣り合わせである。この問題に対する１つの解決法は、ＲＮＡを、エンドヌクレアーゼと、あらかじめ複合体化させる、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡの、分解からの保護である。
ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。当技術分野では、多数の修飾が公知であり、使用することができる。
エンドヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとは、一般に、１：１のモル比で組み合わせることができる。代替的に、エンドヌクレアーゼと、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとは、一般に、１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかし、広範にわたるモル比を使用して、ＲＮＰを作製することができる。
ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、送達のために使用することができる。当技術分野では、パッケージされるＡＡＶゲノムであって、送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むＡＡＶゲノムを、細胞へともたらす、ｒＡＡＶ粒子を作製する技法が標準的である。ｒＡＡＶの作製は典型的に、以下の構成要素：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個の（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内には存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一の細胞（本明細書では、パッケージング細胞として表す）内に存在することを要求する。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る、任意のＡＡＶ血清型に由来し得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型であって、本明細書中に記載されるＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されないＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの作製については、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ ０１／８３６９２号に開示されている。
本明細書に開示されるＡＡＶ配列は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を標的とするｓｇＲＮＡを含み得る。例えば、ｐＳＩＡ０１０は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を標的とするｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列（配列番号５３３９）を含む。ｓｇＲＮＡは、配列番号５２９０（ｓｇＲＮＡプロトスペーサー配列）および配列番号５３２７（ｓｇＲＮＡ骨格配列）を含む。ｐＳＩＡ０１１は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を標的とするｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列（配列番号５３４０）を含む。ｓｇＲＮＡは、配列番号５２９１（ｓｇＲＮＡプロトスペーサー配列）および配列番号５３２７（ｓｇＲＮＡ骨格配列）を含む。
ＡＡＶ血清型
本開示の組成物をコードするポリヌクレオチド、例えば、本開示のエンドヌクレアーゼ、ドナー配列、またはＲＮＡガイド分子をパッケージングするＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含み得るか、またはそれに由来し得る。本開示によると、ＡＡＶ粒子は、以下のＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、日本ＡＡＶ １０、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、および／またはＡＡＶ ＳＭ １０－８を含むがこれらに限定されない、血清型のうちのいずれかおよびそれらのバリアントから選択される血清型を利用し得るか、またはそれに基づき得る。
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、N Pulicherla et al. (Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)によって説明されるように、ＡＡＶ９配列における変異、例えば、限定されないが、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４であり得るか、またはそれを有し得る。
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、米国特許第６１５６３０３号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＡＡＶ３Ｂ（ＵＳ ６１５６３０３の配列番号１および１０）、ＡＡＶ６（ＵＳ ６１５６３０３の配列番号２、７、および１１）、ＡＡＶ２（ＵＳ ６１５６３０３の配列番号３および８）、ＡＡＶ３Ａ（ＵＳ ６１５６３０３の配列番号４および９）、またはこれらの誘導体であり得るか、またはそれを有し得る。
一部の例では、血清型は、Grimm et al. (Journal of Virology 82(12): 5887-5911 (2008))によって説明されるように、ＡＡＶＤＪまたはそのバリアント、例えば、ＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ－ＤＪ８）であり得る。ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つまたはそれよりも多くの変異を含み得る。非限定的な例として、米国特許第７，５８８，７７２号において配列番号１として記載されるＡＡＶ－ＤＪ配列は、２つの変異：（１）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）へと変化する、Ｒ５８７Ｑ、および（２）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）へと変化する、Ｒ５９０Ｔを含み得る。別の非限定的な例としては、３つの変異：（１）アミノ酸４０６におけるリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）が、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）へと変化する、Ｋ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）へと変化する、Ｒ５８７Ｑ、および（３）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）へと変化する、Ｒ５９０Ｔを含み得る。
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、国際公開第ＷＯ２０１５１２１５０１号に記載される配列、例えば、限定されないが、真型ＡＡＶ（true type AAV）（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号８）、「日本ＡＡＶ１０（Japanese AAV10）」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号９）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
本開示によると、ＡＡＶキャプシド血清型選択または使用は、様々な種に由来し得る。１つの例では、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であり得る。ＡＡＡＶ血清型は、米国特許第９２３８８００号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＡＡＡＶ（ＵＳ ９，２３８，８００の配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、および１４）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
１つの例では、ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であり得る。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第９，１９３，７６９号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ ９１９３７６９の配列番号１および６）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第ＵＳ７４２７３９６号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号５および６）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
１つの例では、ＡＡＶは、ヤギＡＡＶであり得る。ヤギＡＡＶ血清型は、米国特許第ＵＳ７４２７３９６号に記載される配列、例えば、限定されないが、ヤギＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号３）、またはそのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
他の例では、ＡＡＶは、２つまたはそれよりも多くの親血清型に由来するハイブリッドＡＡＶとして操作してもよい。１つの例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９に由来する配列を含む、ＡＡＶ２Ｇ９であってもよい。ＡＡＶ２Ｇ９ ＡＡＶ血清型は、米国特許公開第ＵＳ２０１６００１７００５号に記載される配列であり得るか、またはそれを有し得る。
１つの例では、ＡＡＶは、Pulicherla et al. (Molecular Therapy 19(6):1070-1078 (2011)によって説明されるように、アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１番号付け）における変異を有する、ＡＡＶ９キャプシドライブラリーによって生成された血清型であってもよい。血清型ならびに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸の置換は、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８ＡおよびＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３ＤおよびＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０ＣおよびＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ，；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）およびＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であり得るが、これらに限定されない。
１つの例では、ＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、血清型であってもよい。非限定的な例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ８であり得る。
１つの例では、ＡＡＶは、バリアント、例えば、Deverman. 2016. Nature Biotechnology. 34(2): 204-209に記載されるＰＨＰ．ＡまたはＰＨＰ．Ｂであってもよい。
１つの例では、ＡＡＶは、配列番号４６９７～５２６５および表４に見出されるもののうちのいずれかから選択される血清型であってもよい。
１つの例では、ＡＡＶは、配列番号４６９７～５２６５および表４に記載される配列、断片、またはバリアントによってコードされ得る。
パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子の作製に必要な構成要素の全てを安定に発現する細胞株を作り出すステップを含む。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、プラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Laughlin et al., 1983, Gene, 23:65-73）、または直接の平滑末端ライゲーション（Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666）などの手技によって、細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株に、ヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルスを感染させることができる。この方法の利点は、細胞が、選択可能であり、大規模なｒＡＡＶの作製に好適であることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを利用して、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、パッケージング細胞に導入する。
ｒＡＡＶ作製の一般原理については、例えば、Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; and Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129)において総説されている。様々なアプローチが、Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988);およびLebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)に記載されている。Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ ９５／１３３９２、ＷＯ ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ ９９／１１７６４、Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615、Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、ならびに米国特許第６，２５８，５９５号。
ＡＡＶベクターの血清型は、標的細胞型とマッチさせることができる。例えば、以下の例示的な細胞型には、とりわけ、表示のＡＡＶ血清型を形質導入することができる。
Figure 0007522656000005
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の場合には、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＲＨＯ遺伝子の１つまたは２つのローカスをターゲティングするｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡは、それぞれ、別個に脂質ナノ粒子へと製剤化され得るか、または全てが１つの脂質ナノ粒子へと共製剤化される。
一部の場合には、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化され得るが、一方でｓｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターで送達され得る。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達する選択肢が、利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現されてもよく、またはＲＮＡとして送達されてもよい。ＲＮＡは、その半減期を変更もしくは改善するか、または免疫応答の可能性もしくは程度を減少させるように、化学修飾されていてもよい。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達の前に、ｇＲＮＡと複合体化させてもよい。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９の分割バージョンおよびＣａｓ９のより小さいオルソログは、ＨＤＲのドナーで可能なように、ＡＡＶにパッケージすることができる。これらの構成要素のそれぞれを送達することができる、一連の非ウイルス性送達方法もまた、存在し得るか、または非ウイルス性方法およびウイルス性方法を、タンデムで利用してもよい。例えば、ナノ粒子を使用して、タンパク質およびガイドＲＮＡを送達してもよく、一方で、ＡＡＶを使用して、ドナーＤＮＡを送達してもよい。
自己不活性化（ＳＩＮ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、本明細書に開示される。ＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、１つまたは複数のセグメントを含み得る。ＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＡＡＶ系であり得る。ＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＡＡＶ５系であり得る。
第１のセグメントは、部位特異的変異誘発を誘導する１つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）。第１のセグメントは、開始コドン、終止コドン、ポリ（Ａ）終結部位、およびイントロンをさらに含み得る。そのようなポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、またはそれらの任意のバリアントであり得る。プロモーターとして機能するヌクレオチド配列が、第１のセグメントに作動可能に連結されていてもよい。プロモーターは、空間制限プロモーター（spatially-restricted promoter）、ｓｇＲＮＡを１つの方向に駆動し、Ｃａｓ９を反対の方向（opposite orientation）に駆動する、二方向性プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。空間制限プロモーターは、任意のユビキタスプロモーター、任意の組織または細胞型特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肺前駆細胞特異的プロモーター、光受容器特異的プロモーター、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）選択的プロモーターからなる群から選択され得る。プロモーターは、ｓＥＦ１αプロモーターであってもよく、ＧＲＫ１プロモーターであってもよい。
第２のセグメントは、ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、配列番号５２８７～５２９１（図２Ｂ）、５３１９～５３２２（図２Ｅ）、５３５８（図２Ｈ）、５３０２～５３０４、５３５１～５３５６、および５３６０のうちのいずれかを含み得る。ｓｇＲＮＡは、ＳＩＮ部位およびゲノム標的配列に実質的に相補的であり得る。「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏの温度および溶液のイオン強度の条件下において、非共有結合して、例えば、ワトソン・クリック塩基対を形成するか、配列特異的な逆平行様式で別の核酸に「アニールする」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸が、相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にする、ヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当技術分野において公知のように、標準的なワトソン・クリック塩基対合は、アデニン（Ａ）がチミジン（Ｔ）と対合すること、アデニン（Ａ）がウラシル（Ｕ）と対合すること、およびグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対合すること［ＤＮＡ、ＲＮＡ］を含む。一部の例では、ｓｇＲＮＡは、少なくとも１つの位置を除き、ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的であり得る。一部の例では、ｓｇＲＮＡは、少なくとも２つの位置を除き、ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的であり得る。
１つまたは複数の第３のセグメントは、第１のセグメントの５’末端（開始コドンの上流および／もしくは転写開始部位の下流）、第１のセグメントを分割するイントロン（天然もしくはキメラ）内、または第１のセグメントの３’末端（終止コドンとポリ（Ａ）終結部位との間）に位置し得る。別の例では、１つまたは複数の第３のセグメントは、第１のセグメントの５’末端および第１のセグメントを分割するイントロン（天然もしくはキメラ）内に位置し得る。第３のセグメントは、１００ヌクレオチド未満の長さであり得る。例えば、第３のセグメントは、２０～９９、３０～９９、４０～９９、５０～９９、６０～９９、７０～９９、８０～９９、および９０～９９ヌクレオチドの長さであり得る。第３のセグメントは、５０ヌクレオチド未満の長さであり得る。例えば、第３のセグメントは、２０～４９、２５～４９、３０～４９、３５～４９、４０～４９、および４５～４９ヌクレオチドの長さであり得る。
１つまたは複数の第３のセグメントは、自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含み得る。ＳＩＮ部位またはＰ２３Ｈ標的部位は、本明細書において使用される場合、Ｐ２３Ｈ変異を含むＲＨＯ遺伝子の２０～５０ヌクレオチドの配列である（配列番号５３１３および５３１４）（表５）。ＳＩＮ部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。
Figure 0007522656000006
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、ＳＩＮ部位内に位置するプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズし、これにより、ｇＲＮＡ－エンドヌクレアーゼ複合体またはｓｇＲＮＡ－エンドヌクレアーゼ複合体による編集が生じ、最終的に、エンドヌクレアーゼの不活性化がもたらされる（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）。Ｐ２３Ｈ変異を含むＲＨＯ遺伝子の２０～５０ヌクレオチドの配列を含むＳＩＮ部位は、ｓｇＲＮＡのうちの１つまたは複数が、少なくとも１～２つの位置において、ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的でない可能性があるとしても、配列番号５２８７～５２９１（図２Ｂ）、５３１９～５３２２（図２Ｅ）、および５３５８（図２Ｈ）を含むｓｇＲＮＡのうちのいずれかにより標的とされ得る。
他の例では、ＳＩＮ部位は、表５に列挙される配列と比較して、長さが短くてもよい。例えば、ＳＩＮ部位は、配列番号５２７７～５２８１（図２Ａ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３１５～５３１８（図２Ｄ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３５７（図２Ｇ）およびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５２９７～５３０１（図２Ｃ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３２３～５３２６（図２Ｆ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３５９（図２Ｉ）およびＰＡＭであり得る。
他の例では、ＳＩＮ部位は、ｓｇＲＮＡの対応するプロトスペーサー配列よりも短くてもよい。例えば、ｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列は、２４ヌクレオチドの長さであり得、一方で、対応するＳＩＮ部位は、より短いプロトスペーサー（わずか２３、２２、２１、２０、１９、１８、または１７ヌクレオチドの長さ）およびＰＡＭを含んでもよい。この短縮されたＳＩＮ部位（依然としてｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列に対応している）は、ゲノム標的配列が、短縮されたＳＩＮ部位よりも効率的に切断されるのを可能にする。この理由のため、配列番号５２７７～５２８１（図２Ａ）、５３１５～５３１８（図２Ｄ）、および５３５７（図２Ｇ）、または配列番号５２９７～５３０１（図２Ｃ）、５３２３～５３２６（図２Ｆ）、および５３５９（図２Ｉ）における配列のうちのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド短縮されていてもよく、ＰＡＭ配列とともにＳＩＮ部位として使用することができる。これらの例では、ＳＩＮ部位は、２０ヌクレオチドを上回る長さであってもよく、２０ヌクレオチド未満の長さであってもよい。
ＳＩＮ－ＡＡＶ系において、エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数のｓｇＲＮＡによって、１つまたは複数のガイド標的配列へとガイドされ得る。１つまたは複数のゲノム標的配列は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異であり得る。エンドヌクレアーゼは、さらに、エンドヌクレアーゼおよび系の構成要素を発現するＳＩＮ－ＡＡＶ系へとガイドされてもよい。標的とされ得るＳＩＮ－ＡＡＶ系の構成要素の例としては、ＳＩＮ－ＡＡＶ系のベクターの必須配列（例えば、ウイルス逆方向末端反復）、編集に重要な遺伝子の発現を駆動するプロモーター（例えば、ｓｇＲＮＡもしくはエンドヌクレアーゼ遺伝子）、Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、コードされる遺伝子を分割するイントロン、またはＣａｓ９もしくはＣｐｆ１のＯＲＦの５’もしくは３’に位置するかまたはイントロンに位置するノンコーディング領域（ＳＩＮ部位）が挙げられる。これにより、１つまたは複数の標的ゲノムローカスの編集をもたらし、その後、エンドヌクレアーゼおよび／または系の他の必須構成要素（例えば、ｓｇＲＮＡ）の発現の低減または排除をもたらす、自己制限性編集活性が生じる。ＳＩＮ－ＡＡＶ系における遺伝子のこの自己制限型発現（self-limited expression）は、オフターゲット編集の低減、および編集が成功した細胞が患者の免疫系によって標的とされる危険性の低減をもたらすことができる。
１つまたは複数のベクターは、本開示のＳＩＮ－ＡＡＶ系をコードし得る。１つのみのベクターによりＳＩＮ－ＡＡＶ系全体をコードする場合、この系は、「オールインワン（all-in-one）」ＳＩＮ系と称される。例えば、第１のセグメント、第２のセグメント、および第３のセグメントが、「オールインワン」ＳＩＮ ＡＡＶ系に一緒に提供され得る。２つのベクターによりＳＩＮ－ＡＡＶ系全体をコードする場合、その系は、「オールインツー（all-in-two）」ＳＩＮ系と称される。例えば、第１のセグメントおよび第３のセグメントが、「オールインツー」ＳＩＮ ＡＡＶ系の第１のベクターにおいて提供され得、第２のセグメントが、第２のベクターにおいて提供され得る。
オールインワンＳＩＮ－ＡＡＶ系
１つの例では、オールインワンＳＩＮ系は、エンドヌクレアーゼＯＲＦおよびｓｇＲＮＡ遺伝子を含むベクターを含み得る。ベクターは、エンドヌクレアーゼＯＲＦの５’および３’の位置、ならびにエンドヌクレアーゼＯＲＦを分割するイントロン内に、ＳＩＮ部位をさらに含み得る。ｓｇＲＮＡは、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり得る。ｓｇＲＮＡはまた、ゲノム標的配列に実質的に相補的であり得る。したがって、ｓｇＲＮＡの配列は、それが、ベクター上のＳＩＮ部位および１つまたは複数のゲノム標的配列の両方とハイブリダイズすることができるようなものである。１つもしくは複数のゲノム標的またはＳＩＮ部位とハイブリダイズする場合、ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ塩基を含み得る。系は、標的とされるゲノムローカスにおける自己制限編集、続いて、エンドヌクレアーゼ遺伝子の切除および／または不活性化をもたらし得る。
別の例では、オールインワンＳＩＮ系は、エンドヌクレアーゼＯＲＦ、第１のｓｇＲＮＡ遺伝子、および第２のｓｇＲＮＡ遺伝子を含むベクターを含み得る。ベクターは、以下の位置のうちの１つまたは複数に、ＳＩＮ部位をさらに含み得る：エンドヌクレアーゼＯＲＦの５’、エンドヌクレアーゼＯＲＦの３’、またはエンドヌクレアーゼＯＲＦを分割するイントロン内。第１のｓｇＲＮＡの配列は、１つまたは複数のゲノム標的配列とハイブリダイズすることができるようなものである。第２のｓｇＲＮＡの配列は、ベクター上のＳＩＮ部位とハイブリダイズすることができるようなものである。１つもしくは複数のゲノム標的またはＳＩＮ部位とハイブリダイズする場合、ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ塩基を含み得る。追加のｓｇＲＮＡが、追加のゲノムまたはＳＩＮ系標的の編集を可能にするために、系に組み込まれてもよい。系は、標的とされるゲノムローカスにおける自己制限編集（self-limited editing）、続いて、エンドヌクレアーゼ遺伝子の切除および／または不活性化をもたらし得る。
別の例では、オールインワンＳＩＮ系は、エンドヌクレアーゼＯＲＦ、第１のｓｇＲＮＡ遺伝子、および第２のｓｇＲＮＡ遺伝子を含むベクターを含み得る。第１のｓｇＲＮＡの配列は、１つまたは複数のゲノム標的配列とハイブリダイズすることができるようなものである。第２のｓｇＲＮＡの配列は、ベクター上のエンドヌクレアーゼＯＲＦ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）内またはその近傍でハイブリダイズし、インデル生成を介してエンドヌクレアーゼ遺伝子の不活性化をもたらすことができるようなものである。追加のｓｇＲＮＡが、追加のゲノムまたはＳＩＮ系標的の編集を可能にするために、系に組み込まれてもよい。１つもしくは複数のゲノム標的またはエンドヌクレアーゼＯＲＦとハイブリダイズする場合、２つまたはそれを上回るｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ塩基を含み得る。系は、標的とされるゲノムローカスにおける自己制限編集、続いて、エンドヌクレアーゼ遺伝子の不活性化をもたらし得る。
上述のものなど、オールインワン系では、適切なウイルスベクターの作製は、所望されるよりも早期に起こるエンドヌクレアーゼ遺伝子の不活性化ならびに（例えば、選択した細胞株におけるウイルスベクターの作製およびパッケージングの間の）ＡＡＶキャプシドにパッケージされたＤＮＡにおける変異誘発されたＳＩＮ部位の蓄積に起因して、困難な場合がある。この問題を解決するために、エンドヌクレアーゼ遺伝子ローカスにおける編集を指示する、エンドヌクレアーゼＯＲＦおよび／またはｓｇＲＮＡ遺伝子を、１つまたは複数の細胞／組織特異的プロモーターから発現させることができる。細胞／組織特異的プロモーターは、編集が所望される細胞において活性であり得、ベクターの作製およびパッケージングに使用される細胞において早期段階では不活性であり得る。加えて、１つまたは複数の誘導性プロモーター系、例えば、テトラサイクリンにより制御される転写活性化（すなわち、ｔｅｔ－ＯＮまたはｔｅｔ－ＯＦＦ）を使用して、目的の遺伝子の発現を制御することができる。早すぎる不活性化の問題に対する他の解決策としては、ｍｉＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、もしくは他のアンチセンスオリゴヌクレオチドにより遺伝子の発現を調節すること、ｓｇＲＮＡの転写を遮断すること（例えば、ｔｅｔ－ＯＦＦ系の使用）、またはＣａｓ９へのｓｇＲＮＡローディングを阻害することが挙げられる。
オールインツーＳＩＮ－ＡＡＶ系
１つの例では、オールインツーＳＩＮ系は、エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦを提供するため第１のベクターを含み得る（図５Ａ～Ｂ）。ＳＩＮ部位は、第１のベクターにおいて、エンドヌクレアーゼＯＲＦの５’およびエンドヌクレアーゼＯＲＦを分割するイントロン内に位置し得る（図５Ａ～Ｂ）。ＳＩＮ部位は、表５に示されるように、配列番号５３１３～５３１４のいずれか１つであり得る。ＳＩＮ部位は、表５に列挙される配列と比較して、長さが短くてもよい。例えば、ＳＩＮ部位は、配列番号５２７７～５２８１（図２Ａ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３１５～５３１８（図２Ｄ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３５７（図２Ｇ）およびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５２９７～５３０１（図２Ｃ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３２３～５３２６（図２Ｆ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３５９（図２Ｉ）およびＰＡＭであり得る。他の例では、ＳＩＮ部位は、ｓｇＲＮＡの対応するプロトスペーサー配列よりも短くてもよい。例えば、ｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列は、２４ヌクレオチドの長さであり得、一方で、対応するＳＩＮ部位は、より短いプロトスペーサー（わずか２３、２２、２１、２０、１９、１８、または１７ヌクレオチドの長さ）およびＰＡＭを含んでもよい。短縮された（またはトランケート型（truncated））ＳＩＮ部位（依然としてｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列に対応する）を使用することにより、ＲＮＰ複合体が、短縮されたＳＩＮ部位自体と比較して、より効率的にゲノム標的配列を切断するのを可能にする。この理由のため、配列番号５２７７～５２８１（図２Ａ）、５３１５～５３１８（図２Ｄ）、および５３５７（図２Ｇ）、または配列番号５２９７～５３０１（図２Ｃ）、５３２３～５３２６（図２Ｆ）、および５３５９（図２Ｉ）における配列のうちのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド短縮されていてもよく、ＰＡＭ配列とともにＳＩＮ部位として使用することができる。第２のベクターでは、単一のｓｇＲＮＡがコードされ得る（図５Ｄ）。ｓｇＲＮＡは、配列番号５２８７～５２９１（図２Ｂ）、５３１９～５３２２（図２Ｅ）、５３５８（図２Ｈ）、５３０２～５３０４、５３５１～５３５６、および５３６０のうちのいずれかを含み得る。ｓｇＲＮＡは、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり得る。ｓｇＲＮＡはまた、ゲノム標的配列に実質的に相補的であり得る。したがって、ｓｇＲＮＡの配列は、それが、第１のベクター上のＳＩＮ部位および１つまたは複数のゲノム標的配列（例えば、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異）の両方とハイブリダイズすることができるようなものであり得る。１つもしくは複数のゲノム標的またはＳＩＮ部位とハイブリダイズする場合、ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ塩基を含み得る。系は、標的とされるゲノムローカスにおける自己制限編集、続いて、エンドヌクレアーゼ遺伝子の切除および／または不活性化をもたらし得る。
別の例では、オールインツーＳＩＮ系は、エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦを提供するため第１のベクターを含み得る。ＳＩＮ部位は、第１のベクターにおいて、エンドヌクレアーゼＯＲＦの５’およびエンドヌクレアーゼＯＲＦを分割するイントロン内に位置し得る。ＳＩＮ部位は、表５に示されるように、配列番号５３１３～５３１４のいずれか１つであり得る。ＳＩＮ部位は、表５に列挙される配列と比較して、長さが短くてもよい。例えば、ＳＩＮ部位は、配列番号５２７７～５２８１（図２Ａ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３１５～５３１８（図２Ｄ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３５７（図２Ｇ）およびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５２９７～５３０１（図２Ｃ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３２３～５３２６（図２Ｆ）における配列のうちのいずれか１つおよびＰＡＭであり得る。ＳＩＮ部位は、配列番号５３５９（図２Ｉ）およびＰＡＭであり得る。他の例では、ＳＩＮ部位は、ｓｇＲＮＡの対応するプロトスペーサー配列よりも短くてもよい。例えば、ｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列は、２４ヌクレオチドの長さであり得、一方で、対応するＳＩＮ部位は、より短いプロトスペーサー（わずか２３、２２、２１、２０、１９、１８、または１７ヌクレオチドの長さ）およびＰＡＭを含んでもよい。短縮された（またはトランケート型）ＳＩＮ部位（依然としてｓｇＲＮＡのプロトスペーサー配列に対応する）を使用することにより、ＲＮＰ複合体が、短縮されたＳＩＮ部位自体と比較して、より効率的にゲノム標的配列を切断するのを可能にする。この理由のため、配列番号５２７７～５２８１（図２Ａ）、５３１５～５３１８（図２Ｄ）、および５３５７（図２Ｇ）、または配列番号５２９７～５３０１（図２Ｃ）、５３２３～５３２６（図２Ｆ）、および５３５９（図２Ｉ）における配列のうちのいずれか１つは、１、２、３、４、５、６、または７ヌクレオチド短縮されていてもよく、ＰＡＭ配列とともにＳＩＮ部位として使用することができる。オールインツー系は、２つのｓｇＲＮＡ遺伝子を含む、第２のベクターをさらに含み得る。第２のベクターから発現されると、第１のｓｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ分子に結合し、１つまたは複数のゲノム標的ローカス（例えば、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異）における編集を指示することができる。第１のｓｇＲＮＡは、配列番号５２８７～５２９１（図２Ｂ）、５３１９～５３２２（図２Ｅ）、５３５８（図２Ｈ）、５３０２～５３０４、５３５１～５３５６、および５３６０のうちのいずれかを含み得る。第２のベクターから発現されると、第２のｓｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ分子に結合し、ＳＩＮ部位を直接編集することができる。追加のｓｇＲＮＡが、追加のゲノムまたはＳＩＮ系標的の編集を可能にするために、系に組み込まれてもよい。１つもしくは複数のゲノム標的またはＳＩＮ部位とハイブリダイズする場合、２つまたはそれを上回るｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ塩基を含み得る。一部の例では、ゲノムローカスを標的とする１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、第１のベクターにコードされてもよく、または第１および第２のベクターの両方の組合せでコードされてもよい。系は、標的とされるゲノムローカスにおける自己制限編集、続いて、エンドヌクレアーゼ遺伝子の切除および／または不活性化をもたらし得る。
別の例では、オールインツーＳＩＮ系は、エンドヌクレアーゼＯＲＦを含む第１のベクターおよび２つのｓｇＲＮＡ遺伝子を含む第２のベクターを含み得る。第２のベクターから発現されると、第１のｓｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ分子に結合し、１つまたは複数のゲノム標的ローカス（例えば、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異）における編集を指示することができる。ｓｇＲＮＡは、配列番号５２８７～５２９１（図２Ｂ）、５３１９～５３２２（図２Ｅ）、５３５８（図２Ｈ）、５３０２～５３０４、５３５１～５３５６、および５３６０のうちのいずれかを含み得る。第２のベクターから発現されると、第２のｓｇＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ分子と結合し、第１のベクター上のエンドヌクレアーゼＯＲＦ（Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）内またはその近傍で編集を指示し、インデル生成を介してエンドヌクレアーゼ遺伝子の不活性化をもたらすことができる。追加のｓｇＲＮＡが、追加のゲノムまたはＳＩＮ系標的の編集を可能にするために、系に組み込まれてもよい。１つもしくは複数のゲノム標的またはエンドヌクレアーゼＯＲＦ内もしくはその近傍にハイブリダイズする場合、２つまたはそれを上回るｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のミスマッチ塩基を含み得る。一部の例では、ゲノムローカスを標的とする１つまたは複数のｓｇＲＮＡは、第１のベクターにコードされてもよく、または第１および第２のベクターの両方の組合せでコードされてもよい。系は、標的とされるゲノムローカスにおける自己制限編集、続いて、エンドヌクレアーゼ遺伝子の不活性化をもたらし得る。
レンチウイルス
一部の態様では、レンチウイルスベクターまたは粒子は、送達媒体として使用され得る。レンチウイルスは、ウイルスのＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙのサブグループである。レンチウイルス粒子は、それらの遺伝子材料を標的／宿主細胞のゲノムへと組み込むことができる。レンチウイルスの例として、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ビスナ・マエディおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。ＬＶは、標的細胞のインタクトな核膜を通過するそれらの固有の能力により、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染できる。Greenberg et al., University of Berkeley, California; 2006）。遺伝子送達媒体を形成するレンチウイルス粒子は、複製欠損であり、ＨＩＶ病原性遺伝子を弱毒化することによって生成される。例えば、遺伝子Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、ＥｎｖおよびＴａｔは、切り取られて生物学的に安全なベクターが作製される。レンチウイルス媒体、例えばＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２由来のものは、非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組込みおよび長期間の発現を媒介できる。本明細書において使用されるとき、「組換え」という用語は、レンチウイルス配列および非レンチウイルスレトロウイルス配列の両方を含有するベクターまたは他の核酸を指す。
宿主細胞に感染することができるレンチウイルスを産生するために、３種類のベクターがウイルス産生細胞において共発現される必要がある：目的の導入遺伝子および自己不活性化３’－ＬＴＲ領域を含有する骨格ベクター、ウイルス構造タンパク質を発現する１つの構築物ならびに封入のための水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）をコードする１つのベクター（Naldini, L. et al., Science 1996; 272, 263-267）。他の構造遺伝子からのＲｅｖ遺伝子の分離は、逆組換え（reverse recombination）の可能性を低減することによってバイオセイフティーをさらに増加させる。高力価レンチウイルス粒子を産生するために使用できる細胞株として、２９３Ｔ細胞、２９３ＦＴ細胞および２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞が挙げられるが、これらに限定されない（Witting et al., Human Gene Therapy, 2012; 23: 243－249; Ansorge et al., Joural of Genetic Medicne, 2009; 11: 868-876）。
組換えレンチウイルス粒子を生成するための方法は、当技術分野、例えば、ＷＯ２０１３０７６３０９（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３６４５）；ＷＯ２００９１５３５６３（ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１５２７）；米国特許第７，６２９，１５３号および同第６，８０８，９０５号において考察されている。
光受容体、網膜色素上皮およびガングリオン細胞などの細胞型は、レンチウイルス（ＬＶ）ベクターで良好に標的とされる。光受容体およびガングリオン細胞への送達の効率は、ＬＶベクターよりもＡＡＶで顕著に高い。
薬学的に許容される担体
本明細書で想定される、始原細胞を対象へと投与するｅｘ ｖｉｖｏ方法は、始原細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
治療用組成物は、細胞組成物と併せた、生理学的に忍容可能な担体と、任意選択で、本明細書で記載される、少なくとも１つのさらなる生体活性薬剤であって、その中に、有効成分として溶解または分散させた生体活性薬剤とを含有しうる。場合によって、治療用組成物は、治療目的で、哺乳動物またはヒト患者へと投与される場合、そうであることが所望されない限りにおいて、実質的に免疫原性ではない。
一般に、本明細書で記載される始原細胞は、薬学的に許容される担体を伴う懸濁液として投与することができる。当業者は、細胞組成物中で使用される、薬学的に許容される担体は、緩衝剤、化合物、低温保存剤、保存剤、または他の薬剤を、対象へと送達される細胞の生存率に実質的に干渉する量では含まないことを認識する。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性の維持を可能とする浸透圧緩衝剤と、任意選択で、細胞生存率を維持するか、または投与時における生着を増強する栄養物質とを含みうる。このような処方物および懸濁液は、当業者に公知であり、かつ／または規定の実験を使用して、本明細書で記載される始原細胞を伴う使用に適合させることができる。
細胞組成物はまた、乳化手順が、細胞の生存率に有害な影響を及ぼさないことを条件として、乳化することもでき、リポソーム組成物として提示することもできる。細胞および任意の他の有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に対して適合性であり、本明細書で記載される治療法における使用に適する量の賦形剤と混合することができる。
細胞組成物中に含まれるさらなる薬剤は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含みうる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。
当技術分野では、生理学的に忍容可能な担体が周知である。例示的な液体担体は、有効成分および水に加えて、材料を含有しないか、または、生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理学的生理食塩液、またはリン酸緩衝生理食塩液など、これらの両方などの緩衝剤を含有する滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、１つを超える緩衝液塩のほか、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有しうる。液体組成物はまた、水に加えた液相および水を除く液相も含有しうる。このようなさらなる液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水－油エマルジョンである。特定の障害または状態の処置において有効な細胞組成物中で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性格に依存する場合があり、標準的な臨床法により決定することができる。
ガイドＲＮＡ製剤
本開示のガイドＲＮＡは、特定の投与方式および剤形に応じて、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、製剤および投与経路に応じて、生理学的に適合性のｐＨを達成し、約３のｐＨ～約１１のｐＨ、ｐＨ約３～ｐＨ約７の範囲となるように製剤化することができる。場合によって、ｐＨは、ｐＨ約５．０～ｐＨ約８の範囲に調整することができる。場合によって、組成物は、本明細書で記載される、治療有効量の少なくとも１つの化合物を、１または複数の薬学的に許容される賦形剤と併せて含みうる。任意選択で、組成物は、本明細書で記載される化合物の組合せを含む場合もあり、細菌の増殖の処理または防止において有用な、第２の有効成分（例えば、かつ、限定なしに述べると、抗菌剤または抗微生物剤）を含む場合もあり、本開示の試薬の組合せを含む場合もある。
適切な賦形剤は、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子など、大型で、ゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子を含む。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、アスコルビン酸）、キレート化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、かつ、限定なしに述べると、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、かつ、限定なしに述べると、油、水、生理食塩液、グリセロール、およびエタノール）、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含みうる。
投与および効能
所望の効果（複数可）をもたらすような、損傷または修復部位など、所望の部位における、導入された細胞の、少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、前駆細胞の、対象への配置の文脈では、「～を投与すること」、「～を導入すること」、および「～を移植すること」という用語は、互換的に使用される。細胞、例えば、前駆細胞、またはそれらの分化した後代を、対象における所望の場所への送達をもたらす、任意の適切な経路により投与することができ、この場合、移植された細胞または細胞の構成要素のうちの少なくとも一部は、依然として生存可能なままである。対象への投与後における細胞生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短期から数日間、数年間もの長期、またはさらに患者の生涯、すなわち、長期にわたる生着でありうる。例えば、本明細書で記載される一部の態様では、有効量の光受容細胞または網膜前駆細胞を、腹腔内または静脈内経路などの全身投与経路を介して投与する。
所望の効果（複数可）をもたらすような、損傷または修復部位など、所望の部位における、導入されたｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼの、少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼの少なくとも１つの、対象への配置の文脈では、「～を投与すること」、「～を導入すること」、および「～を移植すること」という用語は、互換的に使用される。ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼは、対象における所望の場所への送達をもたらす、任意の適切な経路により投与することができる。
本明細書では、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語が、互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望される任意の対象を指す。一部の態様では、対象は、哺乳動物である。一部の態様では、対象は、ヒトである。
予防的に提供される場合、本明細書に記載される前駆細胞は、常染色体優性ＲＰの任意の症状に先立って、対象へと投与することができる。したがって、前駆細胞集団の予防的投与は、常染色体優性ＲＰを防止する機能を果たす。
本明細書に記載される方法に従って投与される前駆細胞集団は、１つまたは複数のドナーから得られた、同種異系前駆細胞を含み得る。そのような前駆細胞は、例えば、肝臓、筋肉、心臓など、任意の細胞または組織起源のものであり得る。「同種異系」とは、同じ種の１つまたは複数の異なるドナーから得られた前駆細胞、または前駆細胞を含む生物学的試料を指し、ここで、１つまたは複数のローカスにおける遺伝子は、同一ではない。例えば、対象へと投与される光受容体または網膜前駆細胞集団は、１つまたは複数の血縁のないドナー対象に由来する場合もあり、１つまたは複数の同一でない兄弟姉妹（sibling）に由来する場合もある。一部の事例では、遺伝子的に同一な動物または一卵性双生児から得られた集団など、同系前駆細胞集団を使用してもよい。前駆細胞は、自家細胞であってもよい、すなわち、前駆細胞を、対象から得るか、または単離し、同じ対象へと投与する、すなわち、ドナーとレシピエントとが同じである。
「有効量」という用語は、常染色体優性ＲＰの、少なくとも１つまたは複数の徴候または症状を防止または緩和するのに必要とされる、前駆細胞またはそれらの後代の集団の量を指し、所望の効果を生じる、例えば、常染色体優性ＲＰを有する対象を処置するのに十分な、組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えば、常染色体優性ＲＰを有するかまたはその危険性がある対象へと投与されると、特定の効果を促進するのに十分な、前駆細胞または前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発生を防止もしくは遅延させるか、疾患の症状の経過を変更する（例えば、疾患の症状の進行を緩徐化させることであるが、これに限定されない）か、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量も含むであろう。任意の所与の事例について、適切な「有効量」とは、日常の実験を使用して、当業者により決定され得ることが理解される。
本明細書で記載される多様な態様における使用のために、有効量の始原細胞は、始原細胞少なくとも１０２個、始原細胞少なくとも５×１０２個、始原細胞少なくとも１０３個、始原細胞少なくとも５×１０３個、始原細胞少なくとも１０４個、始原細胞少なくとも５×１０４個、始原細胞少なくとも１０５個、始原細胞少なくとも２×１０５個、始原細胞少なくとも３×１０５個、始原細胞少なくとも４×１０５個、始原細胞少なくとも５×１０５個、始原細胞少なくとも６×１０５個、始原細胞少なくとも７×１０５個、始原細胞少なくとも８×１０５個、始原細胞少なくとも９×１０５個、始原細胞少なくとも１×１０６個、始原細胞少なくとも２×１０６個、始原細胞少なくとも３×１０６個、始原細胞少なくとも４×１０６個、始原細胞少なくとも５×１０６個、始原細胞少なくとも６×１０６個、始原細胞少なくとも７×１０６個、始原細胞少なくとも８×１０６個、始原細胞少なくとも９×１０６個、またはこれらの倍数個を含む。始原細胞は、１または複数のドナーから導出することもでき、自家供給源から得ることもできる。本明細書で記載される一部の例では、始原細胞は、それを必要とする対象への投与の前に、培養物中で拡大することができる。
常染色体優性ＲＰを有する患者の細胞において発現される機能性ＲＨＯタンパク質のレベルにおけるわずかな増加および漸増は、疾患の１つもしくは複数の症状を軽減するため、長期にわたる生存を増加させるため、および／または他の処置に付随する副作用を低減するために、有益であり得る。そのような細胞をヒト患者へと投与したときに、増加したレベルの機能性ＲＨＯタンパク質を生じる前駆細胞の存在が、有益である。一部の事例では、対象の有効な処置により、処置される対象における総ＲＨＯと比べて、少なくとも約３％、５％、または７％の機能性ＲＨＯタンパク質が生じる。一部の例では、機能性ＲＨＯは、総ＲＨＯの少なくとも約１０％である。一部の例では、機能性ＲＨＯタンパク質は、総ＲＨＯタンパク質の少なくとも約２０％～３０％である。同様に、一部の状況では、正常化された細胞は、罹患した細胞と比べて、選択的利点を有するため、機能性ＲＨＯタンパク質のレベルが有意に上昇した細胞は、比較的限定的な亜集団の導入であっても、様々な患者において、有益であり得る。しかしながら、機能性ＲＨＯタンパク質のレベルが上昇した前駆細胞は、わずかなレベルであっても、患者における常染色体優性ＲＰの１つまたは複数の側面を改善するのに有益であり得る。一部の例では、そのような細胞が投与された患者における光受容細胞または網膜前駆細胞のうちの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くが、増加したレベルの機能性ＲＨＯタンパク質を産生している。
「投与された」とは、所望の部位において、細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、始原細胞組成物の、対象への送達を指す。細胞組成物は、対象において有効な処置をもたらす、任意の適切な経路により、すなわち、対象における所望の位置への送達をもたらす投与であって、送達される組成物のうちの少なくとも一部、すなわち、細胞少なくとも１×１０４個を、所望の部位へと、ある期間にわたり送達する投与により投与することができる。
本方法の一態様では、医薬組成物は、腸内（腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口を経由して）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、脳室内（脳室に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈に）、静脈内ボーラス、静脈内滴注、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病理学的腔に）、腔内（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、吹送（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、点耳、耳介（耳にまたは耳を経由して）、頬側（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯科的（単数または複数の歯に）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内部）、仙骨内（馬尾内部）、脳槽内（小脳延髄大槽（cisterna magna cerebellomedularis）内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内（dental intracornal）、冠内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体（corporus cavernosa）の膨張性空隙内）、椎間板内（椎間板内部）、腺管内（腺の管内部）、十二指腸内（十二指腸内部）、硬膜内（硬膜内部またはその下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内部）、歯肉内（歯肉内部）、回腸内（小腸遠位部分内部）、病巣内（局在化した病変部の内部またはそこへの直接の導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ管内（リンパ内部）、髄内（骨の骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、心筋内（心筋内部）、眼内（眼内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺内部）、肺内（肺またはその気管支内部）、洞内（intrasinal）（副鼻腔または眼窩周囲腔内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑膜内（関節の滑膜腔内部）、腱内（腱内部）、精巣内（精巣内部）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部）、胸郭内（胸郭内部）、小管内（器官の細管内部）、腫瘍内（腫瘍内部）、鼓室内（中耳内部）、血管内（単数または複数の血管内部）、脳室内（脳室内部）、イオン導入（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流のよって）、灌注（irrigation）（開放創傷部または体腔を浸すかまたは洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を通じて胃内に）、閉塞包帯技法（後で領域を閉鎖する包帯剤によって被覆する局所経路の投与）、眼部（外眼部に）、口腔咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的または全身的な効果のための経口または経鼻吸入により気道内部へ）、眼球後（橋（pons）背後または眼球背後）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通じてまたはそれを越えて）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓膜（鼓室を越えてまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、ならびに脊髄などであるがこれらに限定されない経路を介して、投与され得る。
投与方式は、注射、注入、点滴、および／または内服を含む。「注射」は、限定せずに述べると、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内注、脳脊髄内、ならびに胸骨内（intrasternal）注射および注入を含む。一部の例では、経路は静脈内である。細胞を送達するためには、注射または注入による投与を行うことができる。
細胞は、全身投与されうる。「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、始原細胞の集団の、標的部位、組織、または臓器への直接投与以外の投与であって、代わりに、それが、対象の循環系に入り、したがって、代謝および他の同様の過程下に置かれるような投与を指す。
当業者は、常染色体優性ＲＰを処置するための組成物を含む処置の効能を決定しうる。しかし、ごく一例として述べると、機能性常染色体優性ＲＰのレベルの徴候または症状の任意の１つまたは全てが、有益な形で変更される（例えば、少なくとも１０％増加する）か、または疾患の、他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、改善されるかまたは軽快する場合に、処置は、「有効な処置」と考えられる。効能はまた、入院または医療的介入の必要により評価される、個体の非悪化（例えば、疾患の進行が止まるか、もしくは少なくとも緩徐化する）により測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書で記載されている。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む）における、疾患の任意の処置を含み、（１）疾患の阻害、例えば、症状の進行を止めるか、もしくは緩徐化させること；または（２）疾患を和らげること、例えば、症状の減退を引き起こすこと；および（３）症状の発症の可能性を防止または低減することを含む。
本開示に従った処置により、個体における機能性ＲＨＯの量を増加、減少または変更することによって、常染色体優性ＲＰと関連する１つまたは複数の症状を改善することができる。常染色体優性ＲＰに関連する典型的な徴候として、例えば、夜盲、視力、眼底所見、後嚢下白内障、硝子体内の塵様粒子、網膜深部の白色斑点、視神経乳頭のヒアリン体、滲出性血管症および区画性常染色体優性ＲＰが挙げられる。
キット
本開示は、本明細書で記載される方法を実行するためのキットを提示する。キットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または本明細書で記載される方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子のうちの１または複数、あるいはこれらの任意の組合せを含みうる。
キットは、（１）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（３）ベクターおよびまたはポリペプチドを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
キットは、（１）（ｉ）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）ベクターを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、単一分子ガイドゲノムターゲティング核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、二重分子ゲノムターゲティング核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、２つまたはこれを超える、二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含みうる。キットは、核酸ターゲティング核酸をコードするベクターを含みうる。
上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、所望の遺伝子改変を生じさせるように挿入されるポリヌクレオチドをさらに含みうる。
キットの構成要素は、別個の容器内の場合もあり、単一の容器内で組み合わせる場合もある。
上記の任意のキットは、１または複数のさらなる試薬をさらに含む場合があるが、この場合、このようなさらなる試薬は、バッファ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞へと導入するためのバッファ、洗浄バッファ、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける作製のための試薬、配列決定のためのアダプターなどから選択される。バッファは、安定化バッファ、修復バッファ、希釈バッファなどでありうる。キットはまた、オンターゲットへの結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を容易とするかもしくは増強するか、またはターゲティングの特異性を改善するのに使用しうる、１または複数の構成要素も含みうる。
上記で言及した構成要素に加えて、キットは、キットの構成要素を使用して、方法を実施するための指示をさらに含みうる。方法を実施するための指示は、適切な記録媒体上に記録することができる。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基板上に印刷することができる。指示は、キット内に、添付文書として存在する場合もあり、キットまたはその構成要素の容器（すなわち、パッケージングまたは部分パッケージングと関連する）の表示中に存在する場合などもある。指示は、適切なコンピュータ読取り用保存媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子保存データファイルとして存在しうる。一部の場合には、実際の指示は、キット内に存在しないが、遠隔の供給源から、指示を得る（例えば、インターネットを介して）ための手段を提供することができる。この場合の例は、指示を閲覧することができ、かつ／または指示をダウンロードしうるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るためのこの手段は、適切な基板上に記録することができる。
可能性がある他の治療アプローチ
遺伝子編集は、特異的配列を標的とするように操作されたヌクレアーゼを使用して行うことができる。現在のところ、ヌクレアーゼの４つ主要な種類：メガヌクレアーゼおよびそれらの誘導体、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系が存在する。特に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性が、タンパク質－ＤＮＡ間相互作用を介するのに対し、ＲＮＡ－ＤＮＡ間相互作用は、主にＣａｓ９をガイドするので、ヌクレアーゼプラットフォームは、デザインの難易度、標的化の密度、および作用方式において様々である。Ｃａｓ９切断は、異なるＣＲＩＳＰＲ系間で異なる隣接モチーフ、ＰＡＭも必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９は、ＮＧＧ ＰＡＭを使用して切断し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴおよびＮＮＮＮＧＣＴＴを含むＰＡＭを含む部位で切断できる。多数の他のＣａｓ９オルソログは、代替ＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的とする。
本開示の方法では、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかし、治療のための標的部位など、本明細書で記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬなど、エンドヌクレアーゼの他の形態へと適用することもでき、ヌクレアーゼの組合せの使用へと適用することもできる。しかし、本開示の教示を、このようなエンドヌクレアーゼへと適用するためには、とりわけ、特異的標的部位へと導かれるタンパク質を操作することが必要となろう。
さらなる結合性ドメインをＣａｓ９タンパク質へと融合させて、特異性を増大させることができる。これらの構築物の標的部位は、同定されたｇＲＮＡ指定部位へとマップされるが、亜鉛フィンガードメインなどのための、さらなる結合モチーフを要求するであろう。Ｍｅｇａ－ＴＡＬの場合は、メガヌクレアーゼを、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインへと融合させることができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増大させ、切断をもたらしうる。同様に、不活化Ｃａｓ９またはｄｅａｄ Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインへと融合させることができ、これは、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位と、融合させたＤＮＡ結合性ドメインのための隣接結合性部位とを要求する。これは、さらなる結合性部位がなければ、結合を減少させるように、触媒性の不活化に加えて、ｄＣａｓ９の何らかのタンパク質操作を要求する可能性が高い。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）とは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩの触媒性ドメインへと連結された、操作亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインから構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてだけ機能するため、１対のＺＦＮを、逆ＤＮＡ鎖上にあり、それらの間に正確な間隔を伴う、コグネイトの標的「半部位」配列に結合するように操作して、触媒的に活性のＦｏｋＩ二量体の形成を可能としなければならない。それ自体では配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間で、ゲノム編集における開始ステップとして、ＤＮＡ二本鎖切断が作出される。
各ＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、夥多なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２アーキテクチャーによる、３～６つの亜鉛フィンガーであって、各フィンガーが、標的ＤＮＡ配列の１つの鎖のヌクレオチドのトリプレットを主に認識する亜鉛フィンガーから構成されることが典型的であるが、４番目のヌクレオチドとの交差相互作用もまた、重要でありうる。ＤＮＡとの鍵となる接触点を作る位置における、フィンガーのアミノ酸の変更は、所与のフィンガーの配列特異性を変更する。したがって、４フィンガーによる亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識するが、この場合、トリプレットの優先性は、可変的な程度で、隣接するフィンガーの影響を受けうるが、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の複合物である。ＺＦＮの重要な側面は、個々のフィンガーを修飾するだけで、ほぼ任意のゲノムアドレスへと、たやすく再ターゲティングしうるが、これを十分に行うには、かなりの熟練が要求されることである。ＺＦＮの大半の適用では、それぞれ、１２～１８ｂｐずつを認識する、４～６フィンガーのタンパク質が使用される。よって、１対のＺＦＮは、２４～３６ｂｐの標的配列の組合せであって、半部位間の、典型的に５～７ｂｐのスペーサーを含まない組合せを認識することが典型的であろう。結合性部位は、１５～１７ｂｐを含む大型のスペーサーにより、さらに分離することができる。この長さの標的配列は、デザイン工程時に、リピートの配列または遺伝子の相同体を除外することを仮定すると、ヒトゲノム内で固有である可能性が高い。しかしながら、ＺＦＮタンパク質－ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではないので、オフ標的結合および切断イベントが、２つのＺＦＮの間のヘテロ二量体、またはＺＦＮの一方もしくは他方によるホモ二量体として生じる。後者の可能性は、互いとだけ二量体化することが可能であり、それら自体では二量体化しえない、偏性ヘテロ二量体変異体としてもまた公知の、「プラス」および「マイナス」変異体を創出するように、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作することにより効果的に排されている。偏性ヘテロ二量体を強いることにより、ホモ二量体の形成が防止される。これは、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を大いに増強している。
当技術分野では、様々なＺＦＮベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告され、多数の参考文献が、ＺＦＮのデザインを導くのに使用される規則およびパラメータについて記載している（例えば、Segalら、Proc Natl Acad Sci USA、９６巻（６号）：２７５８～６３頁（１９９９年）；Dreier Bら、J Mol Biol.、３０３巻（４号）：４８９～５０２頁（２０００年）；Liu Qら、J Biol Chem.、２７７巻（６号）：３８５０～６頁（２００２年）；Dreierら、J Biol Chem、２８０巻（４２号）：３５５８８～９７頁（２００５年）；およびDreierら、J Biol Chem.、２７６巻（３１号）：２９４６６～７８頁（２００１年）を参照されたい）。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）とは、モジュラーヌクレアーゼの別のフォーマットであって、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインを、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインへと連結し、１対のＴＡＬＥＮが、タンデムに働いて、標的化ＤＮＡ切断を達成するフォーマットを表す。ＺＦＮとの主要な差違は、ＤＮＡ結合ドメインおよび関連する標的ＤＮＡ配列認識特性の性格である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、元来、植物の細菌性病原体であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．において記載された、ＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸のリピートによるタンデムアレイであって、典型的には、最大で２０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ配列であり、全標的配列の長さを最大で４０ｂｐとする、標的ＤＮＡ配列内の単一の塩基対を、各リピートが認識するタンデムアレイから構成される。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２および１３位における、２つのアミノ酸だけを含む、反復可変二残基（repeat variable diresidue）（ＲＶＤ）により決定される。塩基である、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミンは主に、４つのＲＶＤ：それぞれ、Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ、およびＡｓｎ－Ｇｌｙにより認識される。これは、亜鉛フィンガーの場合より、はるかに単純な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼデザインのために、後者を上回る利点を表す。しかしながら、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性を低減するように、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体バリアントの使用から利益を得ている。
それらの触媒機能を失活させた、ＦｏｋＩドメインのさらなるバリアントも作り出されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対の片方が、不活性のＦｏｋＩドメインを含有する場合は、標的部位において、ＤＳＢではなく、一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）だけが生じる。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの一方を失活させた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」変異体の使用と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動しうるが、効率は、ＤＳＢによる場合より低下する。主要な利益は、オフターゲットのニックは、ＮＨＥＪにより媒介される誤修復を受けやすいＤＳＢと異なり、迅速かつ正確に修復されることである。
当技術分野では、様々なＴＡＬＥＮベースの系が記載されており、それらの改変も、定期的に報告されている（例えば、Boch、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０９～１２頁（２００９年）；Makら、Science、３３５巻（６０６９号）：７１６～９頁（２０１２年）；およびMoscouら、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０１頁（２００９年）を参照されたい）。「Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用については、複数のグループにより記載されている（例えば、Cermakら、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁（２０１１年）；Liら、Nucleic Acids Res.、３９巻（１４号）：６３１５～２５頁（２０１１年）；Weberら、PLoS One.、６巻（２号）：ｅ１６７６５頁（２０１１年）；Wangら、J Genet Genomics、４１巻（６号）：３３９～４７頁、Epub、２０１４年５月１７日（２０１４年）；およびCermak Tら、Methods Mol Biol.、１２３９巻：１３３～５９頁（２０１５年）を参照されたい）。
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）とは、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、ＤＮＡを、高特異性で切断する（ゲノム内の固有の部位であることが多い）、配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥの、少なくとも６つの公知のファミリーであって、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、およびファージを含む、広範囲にわたる宿主に由来する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号５２７１）、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、およびＶｓｒ様を含む、それらの構造により分類されるファミリーが存在する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集における最初のステップとして、標的ローカスにおけるＤＳＢを作り出すことができる。加えて、一部の天然および操作ＨＥは、ＤＮＡの単一の鎖だけを切断し、これにより、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きい標的配列およびそれらがもたらす特異性のために、ＨＥは、部位特異的ＤＳＢを作り出すのに魅力的な候補物質となっている。
当技術分野では、様々なＨＥベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告されている；例えば、Steentoft et al., Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort and Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez and Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012)による総説を参照されたい。
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッド体のヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインと、触媒的に活性のＨＥとの融合体を使用し、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を利用する（例えば、Boisselら、NAR、４２巻：２５９１～２６０１頁（２０１４年）；Kleinstiverら、G3、４巻：１１５５～６５頁（２０１４年）；ならびにBoisselおよびScharenberg、Methods Mol. Biol.、１２３９巻：１７１～９６頁（２０１５年）を参照されたい）。
さらなる変化形では、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャーは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）の、ＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインである、Ｉ－ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）との融合体である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質で、約３０ｂｐ離れて位置し、非適合性の粘着末端を伴う２つのＤＳＢを発生させる（例えば、Wolfsら、NAR、４２巻、８８１６～２９頁（２０１４年）を参照されたい）。既存のヌクレアーゼベースの手法の他の組合せが進化し、本明細書で記載される、ターゲティングされたゲノム修飾の達成において有用となることが予期される。
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１－Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
上記で記載したヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性と機能的特性とを組み合わせることにより、ゲノム編集のためのさらなる手法であって、固有の欠点のうちの一部を潜在的に克服しうる手法を提供する。例として述べると、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集系は、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、ＤＳＢを創出することが典型的である。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９の場合、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧであるＰＡＭ配列内のさらなる２塩基を加えた）とのワトソン－クリック型塩基対合を経るガイドＲＮＡ内の、２０または２４ヌクレオチドの配列により駆動される。このような配列は、ヒトゲノム内では、固有となるのに十分に長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ間相互作用の特異性は絶対的ではなく、場合によって、顕著な無差別性が、特に、標的配列の５’側において許容され、特異性を駆動する塩基の数を有効に低減する。これに対する１つの解決法は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒性機能を完全に失活させる（ＲＮＡにガイドされるＤＮＡ結合機能だけを保持しながら）代わりに、ＦｏｋＩドメインを、失活させたＣａｓ９へと融合させることであった（例えば、Tsaiら、Nature Biotech、３２巻：５６９～７６頁（２０１４年）；およびGuilingerら、Nature Biotech.、３２巻：５７７～８２頁（２０１４年）を参照されたい）。ＦｏｋＩは、触媒的に活性となるには、二量体化しなければならないため、２つのガイドＲＮＡは、２つのＦｏｋＩ融合体を、近接してテザリングして、二量体を形成し、ＤＮＡを切断することが要求される。これは本質的に、標的部位の組合せにおける塩基の数を二倍化し、これにより、ＣＲＩＳＰＲベースの系によるターゲティングの厳密性を増大させる。
さらなる例として述べると、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合性ドメインの、Ｉ－ＴｅｖＩなど、触媒的に活性なＨＥへの融合は、オフ標的切断をさらに低減しうることを期待して、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方のほか、Ｉ－ＴｅｖＩの切断配列特異性も利用する。
本発明の方法および組成物
このように、本開示は、特に、以下の非限定的な本発明に関する：
第１の方法である、方法１では、本開示は、ヒト細胞においてＲＨＯ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子またはＲＨＯ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内または近傍に、１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって編集されたヒト細胞を作り出すステップを含み、ＳＳＢまたはＤＳＢは、ＲＨＯ遺伝子内もしくはその近傍に、またはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つまたは複数の変異の恒久的な欠失、挿入、修正、またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらす、方法を提示する。
別の方法である、方法２では、本開示は、ヒト細胞においてＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって：ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍に、Ｐ２３Ｈ変異の恒久的な欠失、挿入、修正またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢをもたらし、それによって編集されたヒト細胞を作り出すステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法３では、本開示は、常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、患者の細胞においてＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法４では、本開示は、編集するステップが、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍に、Ｐ２３Ｈ変異の恒久的な欠失、挿入、修正またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらし、ＲＨＯタンパク質活性の回復をもたらす、１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢをもたらすことを含む、方法３に記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法５では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、方法１～２または４のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法６では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入することを含む、方法５に記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法７では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のＲＮＡを導入することを含む、方法５に記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法８では、本開示は、１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾ＲＮＡである、方法６または７のいずれかに記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法９では、本開示は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、方法５に記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１０では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のｇＲＮＡを導入することをさらに含む、方法１～９のいずれかに記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１１では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、方法１０に記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１２では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法１０～１１のいずれかに記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１３では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、方法９～１１のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１４では、本開示は、細胞へと野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含む、方法１～１３のいずれかに記載の常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１５では、本開示は、野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらの断片もしくは組合せ、またはＲＨＯ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、方法１４に提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１６では、本開示は、ドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、方法１４～１５のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１７では、本開示は、ドナー鋳型が、３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、方法１４～１５のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１８では、本開示は、以下：細胞へと１つのｇＲＮＡ、および野生型ＲＨＯ遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み；１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍に位置するローカスに、ＳＳＢまたはＤＳＢをもたらす、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ＳＳＢまたはＤＳＢは、ローカスにおける染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列の挿入を容易にし、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異の恒久的な挿入、または修正をもたらし；ｇＲＮＡが、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍に位置するローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２または４のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法１９では、本開示は、以下：細胞へと、１つまたは複数のｇＲＮＡおよび、野生型ＲＨＯ遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み；１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍に、１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、１対のＳＳＢまたはＤＳＢは、第１のものが５’ローカスにあり、第２のものが３’ローカスにあり、５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへのポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列の挿入を容易にし、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡの恒久的な挿入、または修正をもたらし；第１のガイドＲＮＡが５’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが３’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２または４のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２０では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、方法１８～１９のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２１では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つまたは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法１８～２０のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２２では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、方法１８～２１のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２３では、本開示は、野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、それらの断片もしくは組合せ、またはＲＨＯ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、方法１８～２２のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２４では、本開示は、ドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、方法１８～２３のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２５では、本開示は、ドナー鋳型が、３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、方法１８～２４のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２６では、本開示は、ＳＳＢまたはＤＳＢが、ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、第２のエクソン、第３のエクソン、第４のエクソン、第５のエクソン、またはそれらの組合せにある、方法１８～２５のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２７では、本開示は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、病理学的バリアントＰ２３Ｈを対象とする、方法１０～１３または２０～２２のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２８では、本開示は、挿入または修正が、ＨＤＲによるものである、方法１～２または４～２７のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法２９では、本開示は、ドナー鋳型が、病理学的バリアントＰ２３Ｈに対する相同性アームを有する、方法１８～１９のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３０では、本開示は、以下：細胞へと、２つのｇＲＮＡおよび野生型ＲＨＯ遺伝子の少なくとも一部を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入することをさらに含み；１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍に、１対のＤＳＢをもたらす、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、１対のＤＳＢは、第１のものが５’ＤＳＢローカスにあり、第２のものが３’ＤＳＢローカスにあり、５’ＤＳＢローカスと３’ＤＳＢローカスとの間の染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍の５’ＤＳＢローカスと３’ＤＳＢローカスとの間における染色体ＤＮＡの恒久的な欠失をもたらし；第１のガイドＲＮＡが、５’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２または４のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３１では、本開示は、２つのｇＲＮＡが２つのｓｇＲＮＡである、方法３０に提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３２では、本開示は、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡが、２つの修飾ｇＲＮＡまたは２つの修飾ｓｇＲＮＡである、方法３０～３１のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３３では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、方法３０～３２のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３４では、本開示は、５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの両方が、ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、第１のイントロン、第２のエクソン、第２のイントロン、第３のエクソン、第３のイントロン、第４のエクソン、第４のイントロン、第５のエクソン、第５のイントロンまたはこれらの組合せ内またはその近傍にある、方法３０～３３のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３５では、本開示は、欠失が、１ｋｂまたはそれを下回る欠失である、方法３０～３４のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３６では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ別個の脂質ナノ粒子中に製剤化されるか、またはすべてが１つの脂質ナノ粒子中に共製剤化されるかのいずれかである、方法１８～１９および３０のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３７では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型が、それぞれ、別個のＡＡＶベクター中に製剤化されるか、またはすべてが１つのＡＡＶベクター中に共製剤化されるかのいずれかである、方法１８～１９および３０のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３８では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方が、ＡＡＶベクターによって細胞へと送達される、方法１８～１９および３０のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法３９では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子に製剤化され、ｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞へと送達され、ドナー鋳型が、ＡＡＶベクターによって細胞へと送達される、方法１８～１９および３０のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法４０では、本開示は、ＡＡＶベクターが自己不活性化ＡＡＶベクターである、方法３７～３９のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法４１では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子が、染色体３：１２９，５２８，６４０～１２９，５３５，１６９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ－ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、方法１～４０のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法４２では、本開示は、ＲＨＯタンパク質活性の回復が、野生型または正常なＲＨＯタンパク質活性と比較される、方法２または４～４１のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法４３では、本開示は、ポリヌクレオチドドナー鋳型が、ＲＨＯのエクソン１を含み、最大５ＫＢである、方法１４に提示されたゲノム編集によってヒト細胞におけるＲＨＯ遺伝子を編集するための方法を提示する。
別の方法である、方法４４では、本開示は、ポリヌクレオチドドナー鋳型が、ＡＡＶによって送達される、方法４３に提示されたゲノム編集によってヒト細胞におけるＲＨＯ遺伝子を編集するための方法を提示する。
別の方法である、方法４５では、本開示は、ヒト細胞が、光受容細胞、網膜前駆細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、方法１～２のいずれかに提示されたゲノム編集によってヒト細胞におけるＲＨＯ遺伝子を編集するための方法を提示する。
別の方法である、方法４６では、本開示は、細胞が光受容細胞、網膜前駆細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、方法３～４２のいずれかに提示された常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法を提示する。
別の方法である、方法４７では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９０を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法４８では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法４９では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３１９を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５０では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２０を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５１では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５２では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２２を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５３では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３５８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５４では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９０および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５５では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９１および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５６では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３１９および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５７では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２０および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５８では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２１および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法５９では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２２および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６０では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３５８および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６１では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２９０を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６２では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２９１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６３では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３１９を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６４では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２０を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６５では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６６では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２２を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６７では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３５８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６８では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが配列番号５２９０および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法６９では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが配列番号５２９１および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７０では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが配列番号５３１９および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７１では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｓｇＲＮＡが配列番号５３２０および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む方法を提示する。
別の方法である、方法７２では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが配列番号５３２１および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７３では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが配列番号５３２２および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７４では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが配列番号５３５８および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７５では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２８７を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７６では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２８８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７７では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２８９を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７８では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２８７を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法７９では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２８８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法８０では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２８９を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを患者へと投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法８１では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３６のいずれかの自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法８２では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子内にＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３６のいずれかの自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を投与するステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法８３では、本開示は、細胞におけるＣａｓ９発現を制御する方法であって、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３６のいずれかの自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を細胞と接触させるステップを含む、方法を提示する。
別の方法である、方法８４では、本開示は、ヒト細胞が、活性欠損を有し、編集されたヒト細胞が機能性ＲＨＯを発現する、方法１に提示されたヒト細胞におけるＲＨＯ遺伝子を編集するための方法を提示する。
別の方法である、方法８５では、本開示は、ヒト細胞が、活性欠損を有し、編集されたヒト細胞が機能性ＲＨＯを発現する、方法２に提示されたヒト細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための方法を提示する。
第１の組成物である、組成物１では、本開示は、常染色体優性ＲＰを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物２では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、組成物１の１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物３では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、組成物１～２のいずれかの１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物４では、本開示は、細胞が光受容細胞、網膜前駆細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、組成物１～３のいずれかの１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物５では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５２９０の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物６では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５２９１の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物７では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３１９の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物８では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２０の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物９では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２１の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１０では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２２の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１１では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３５８の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１２では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５２９０および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１３では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５２９１および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１４では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３１９および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１５では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２０および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１６では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２１および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１７では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２２および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１８では、本開示は、常染色体優性ＣＯＲＤを有する患者由来の細胞におけるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３５８および、配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡを提示する。
別の組成物である、組成物１９では、本開示は、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
第１の治療である、治療１では、本開示は、常染色体優性網膜色素変性を有する患者を処置するための治療であって、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための少なくとも１つまたは複数のｇＲＮＡを含み、１つまたは複数のｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療を提示する。
別の治療である、治療２では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、治療２の治療を提示する。
別の治療である、治療３では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、治療１または２のいずれかの治療を提示する。
別の治療である、治療４では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入するステップ；ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入するステップ；および、必要に応じて１つまたは複数のドナー鋳型を導入するステップを含む方法によって形成される、常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するための治療であって、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療を提示する。
別の治療である、治療５では、本開示は、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３６のいずれかの自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む治療を提示する。
別の治療である、治療６では、本開示は、無菌である、治療５の治療を提示する。
第１のキットである、キット１では、本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏで常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのキットであって、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと；１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼと；必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型とを含む、キットを提示する。
別のキットである、キット２では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、キット１のキットを提示する。
別のキットである、キット３では、本開示は、１つまたは複数のドナー鋳型を含む、キット１または２のいずれかのキットを提示する。
別のキットである、キット４では、本開示は、ドナー鋳型が３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、キット３のキットを提示する。
別のキットである、キット５では、本開示は、ドナー鋳型が病理学的バリアントＰ２３Ｈに対する相同性アームを有する、キット３のキットを提示する。
別のキットである、キット６では、本開示は、ｉｎ ｖｉｖｏで常染色体優性ＲＰを有する患者を処置するためのキットであって、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３６のいずれか１つ；および必要に応じて１つまたは複数のドナー鋳型を含む、キットを提示する。
別のキットである、キット７では、本開示は、１つまたは複数のドナー鋳型を含む、キット６のキットを提示する。
別のキットである、キット８では、本開示は、ドナー鋳型が３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、キット７のキットを提示する。
別のキットである、キット９では、本開示は、ドナー鋳型が病理学的バリアントＰ２３Ｈに対する相同性アームを有する、キット７のキットを提示する。
第１の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１では、本開示は、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントであって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０を含む、第２のセグメントと；自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントとを含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ゲノム標的配列に実質的に相補的である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２では、本開示は、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントであって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９１を含む、第２のセグメントと；自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントとを含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ゲノム標的配列に実質的に相補的である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３では、本開示は、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）またはその任意のバリアントである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１または２の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４では、本開示は、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドがＳａＣａｓ９またはその任意のバリアントであり；ＳＩＮ部位が、ＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’に位置する５’ＳＩＮ部位、またはＳａＣａｓ９ ＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンもしくはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系５では、本開示は、５’ＳＩＮ部位が、配列番号５３００を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系６では、本開示は、３’ＳＩＮ部位が配列番号５２８０を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４～５の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系７では、本開示は、５’ＳＩＮ部位が、配列番号５３０１を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系８では、本開示は、３’ＳＩＮ部位が配列番号５２８１を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４および７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系９では、本開示は、５’ＳＩＮ部位がＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流およびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の下流に位置する、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４～５および７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１０では、本開示は、５’ＳＩＮ部位がＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の上流に位置する、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４～５および７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１１では、本開示は、３’ＳＩＮ部位がＳａＣａｓ９ ＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンもしくはキメラ挿入イントロン内に位置する、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系４、６および８の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１２では、本開示は、ＳＩＮ部位がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～１１の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１３では、本開示は、ＰＡＭがＮＮＧＲＲＴまたはその任意のバリアントである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１２の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１４では、本開示は、ゲノム標的配列がロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～１３の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１５では、本開示は、部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１のセグメントが、開始コドン、終止コドンおよびポリ（Ａ）終結部位をさらに含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～１４の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６では、本開示は、第１のセグメントおよび第３のセグメントが、第１のベクターにおいて一緒に提供され、第２のセグメントが、第２のベクターに提供される、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～１５の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１７では、本開示は、第１のセグメント、第２のセグメントおよび第３のセグメントが１つのベクターにおいて一緒に提供される、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～１５の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１８では、本開示は、第３のセグメントが第１のまたは第２のベクターにおいて、第１のセグメントの５’位置に存在する、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６～１７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１９では、本開示は、第３のセグメントが第１のまたは第２のベクターにおいて、第１のセグメントの３’位置に存在する、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６～１７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２０では、本開示は、１つまたは複数の第３のセグメントが第１のまたは第２のベクターにおいて、第１のセグメントの５’末端および３’末端に存在する、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６～１７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２１では、本開示は、第１のベクターが配列番号５３４１を含み、第２のベクターが配列番号５３３９を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２２では、本開示は、第１のベクターが配列番号５３４１を含み、第２のベクターが配列番号５３４０を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２３では、本開示は、第１のベクターが配列番号５３４２を含み、第２のベクターが配列番号５３３９を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２４では、本開示は、第１のベクターが配列番号５３４２を含み、第２のベクターが配列番号５３４０を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２５では、本開示は、第３のセグメントが１００ヌクレオチド未満の長さである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～２４の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２６では、本開示は、第３のセグメントが５０ヌクレオチド未満の長さである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２５の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２７では、本開示は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、少なくとも１つの位置を除き、ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～２６の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２８では、本開示は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、少なくとも２つの位置を除き、ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～２７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２９では、本開示は、プロモーターをコードする核酸配列が、第１のセグメントに作動可能に連結されている、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～２８の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３０では、本開示は、プロモーターが、空間制限プロモーター、ｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡを１つの方向に駆動させ、ＳａＣａｓ９を反対の方向に駆動させる二方向性プロモーター、または誘導性プロモーターである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系２９の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３１では、本開示は、空間制限プロモーターが、以下：任意の組織または細胞型特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肺前駆細胞特異的プロモーター、光受容器特異的プロモーター、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）選択的プロモーターからなる群から選択される、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３０の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３２では、本開示は、ベクターが１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１６～１７の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３３では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターがＡＡＶ５血清型キャプシドベクターである、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３２の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３４では、本開示は、以下：ＳａＣａｓ９またはその任意のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントと；自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントとを含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって；ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり；ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡがゲノム標的配列に実質的に相補的であり；ＳＩＮ部位が、配列番号５３１３～５３１４からなる群から選択される配列を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３５では、本開示は、以下：ＳｐＣａｓ９またはその任意のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントと；自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントとを含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって；ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり；ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡがゲノム標的配列に実質的に相補的であり；ＳＩＮ部位が、配列番号５２７７～５２７９または配列番号５２９７～５２９９からなる群から選択される配列を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３６では、本開示は、ＳＩＮ部位が配列番号５２７７～５２７９または配列番号５２９７～５２９９からなる群から選択されるいずれか１つの配列より１、２、３、４、５、６または７ヌクレオチド短い配列を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３５の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３５では、本開示は、以下：ＳａＣａｓ９またはその任意のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと；ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントと；自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントとを含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって；ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり；ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡがゲノム標的配列に実質的に相補的であり；ＳＩＮ部位が、配列番号５２８０～５２８１、５３１５～５３１８および５３５７または配列番号５３００～５３０１、５３２３～５３２６および５３５９からなる群から選択される配列を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
別の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３６では、本開示は、ＳＩＮ部位が配列番号５２８０～５２８１、５３１５～５３１８および５３５７または配列番号５３００～５３０１、５３２３～５３２６および５３５９からなる群から選択されるいずれか１つの配列より１、２、３、４、５、６または７ヌクレオチド短い配列を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系３５の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提示する。
第１の遺伝子改変細胞である、遺伝子改変細胞１では、本開示は、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系１～３６のいずれかの自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む遺伝子改変細胞を提示する。
別の遺伝子改変細胞である、遺伝子改変細胞２では、本開示は、細胞が、以下：古細菌細胞、細菌細胞、真核生物細胞、真核生物単細胞生物、体細胞、胚細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚細胞、カエル細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞およびヒト細胞からなる群から選択される、遺伝子改変細胞１の遺伝子改変細胞を提示する。
第１の核酸である、核酸１では、本開示は、配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８からなる群から選択されるスペーサー配列を含むｇＲＮＡをコードする核酸を提示する。
別の核酸である、核酸２では、本開示は、ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、核酸１の核酸を提示する。
第１のベクターである、ベクター１では、本開示は、配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２および５３５８からなる群から選択されるスペーサー配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを提示する。
別のベクターである、ベクター２では、本開示は、ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、ベクター１のベクターを提示する。
別のベクターである、ベクター３では、本開示は、ＡＡＶである、ベクター１または２のいずれか１つのベクターを提示する。
別のベクターである、ベクター４では、本開示は、ＡＡＶ５血清型（sertoype）キャプシドベクターである、ベクター１～３のいずれか１つのベクターを提示する。
定義
本明細書に既に記載した定義に加えて、次の定義は本開示に関連する。
「変更」または「遺伝子情報の変更」という用語は、細胞のゲノムにおける任意の変化を指す。遺伝的障害を処置する文脈で、変更には、挿入、欠失、および修正が含まれ得るが、これらに限定されない。
「挿入」という用語は、ＤＮＡ配列における１つまたは複数のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、数個のヌクレオチドの小さな挿入から、大きなセグメント、例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子の挿入までの範囲に及び得る。
「欠失」という用語は、ＤＮＡ配列における１つもしくは複数のヌクレオチドの喪失もしくは除去、または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。一部の事例では、欠失は、例えば、数個のヌクレオチド、エクソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の配列全体の喪失を含み得る。一部の事例では、遺伝子の欠失は、遺伝子またはその遺伝子産物の機能または発現の排除または低減を指す。これは、遺伝子内またはその近傍の配列の欠失だけでなく、その遺伝子の発現を破壊する他の事象（例えば、挿入、ナンセンス変異）によっても生じ得る。
「修正」という用語は、本明細書において使用されるとき、挿入によってか、欠失によってか、または置換によってかにかかわらず、細胞内のゲノムの１つまたは複数のヌクレオチドの変化を指す。そのような修正は、構造か機能かにかかわらず、修正されたゲノム部位に、より好ましい遺伝子型または表現型の結果をもたらし得る。「修正」の１つの非限定的な例としては、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の構造または機能を回復させる、変異体または欠陥のある配列の野生型配列への修正が挙げられる。変異の性質に応じて、修正は、本明細書に開示される様々な戦略を介して達成することができる。１つの非限定的な例では、ミスセンス変異が、変異を含む領域を、その野生型対応物で置き換えることによって、修正され得る。別の例として、遺伝子における重複変異（例えば、反復増殖）を、余分な配列を除去することによって、修正することができる。
「ノックイン」という用語は、ゲノムへのＤＮＡ配列またはその断片の付加を指す。ノックインしようとするそのようなＤＮＡ配列としては、単一のまたは複数の遺伝子全体を挙げることができ、遺伝子と関連する調節配列、または前述のものの任意の部分もしくは断片を挙げることができる。例えば、野生型タンパク質をコードするｃＤＮＡを、変異体遺伝子を有する細胞のゲノムに挿入することができる。ノックイン戦略は、欠陥のある遺伝子を、全体的または部分的に置き換えることを必要とするものではない。一部の事例では、ノックイン戦略は、既存の配列の提供される配列での置換、例えば、変異体対立遺伝子の野生型コピーでの置換をさらに含んでもよい。一方、「ノックアウト」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現の排除を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊を生じる、ヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによって、ノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係な配列で置き換えることによって、ノックアウトすることができる。最後に、「ノックダウン」という用語は、本明細書において使用されるとき、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性もしくは機能が減弱され得るか、またはタンパク質のレベルが、低減もしくは排除され得る。
「～を含むこと」または「～を含む」という用語は、本開示に必須であるが、必須であってもそうでなくても、未指定の要素の包含に対しても開かれた、組成物、治療、キット、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素（複数可）に言及して使用される。
「～から本質的になる」という用語は、所与の態様に要求される要素を指す。用語は、本開示のその態様の、基本的かつ新規のまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない、さらなる要素の存在を許容する。
「～からなる」という用語は、態様についてのその記載において列挙されない任意の要素を除外して、本明細書で記載される組成物、治療、キット、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素を指す。
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。
本明細書で列挙される任意の数値範囲は、数値精度が同じである（すなわち、指定された桁数と同じ桁数を有する）全ての部分範囲であって、列挙された範囲内に包含される部分範囲について記載する。例えば、「１．０～１０．０」という列挙範囲は、本明細書の本文中で、「２．４～７．６」という範囲が、明示的に列挙されていない場合であってもなお、例えば、「２．４～７．６」など、列挙された最小値である１．０と、列挙された最大値である１０．０との間（およびこれらを含む）の、全ての部分範囲について記載する。したがって、本出願者は、本明細書で明示的に列挙される範囲内に包含される、同じ数値精度の、任意の部分範囲を、明示的に列挙するように、特許請求の範囲を含む本明細書を矯正する権利を留保する。任意のこのような部分範囲を明示的に列挙するように矯正することが、記載、記載の十分性、ならびに３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ａ）およびＥＰＣ １２３（２）条下の要件を含む、新規事項の要件に準拠するように、全てのこのような範囲は本明細書で固有に記載される。文脈により、明示的に指定またはそうでないことが要求されない限りにおいて、本明細書で記載される、全ての数値パラメータ（値、範囲、量、百分率などを表す数値パラメータ）はまた、「約」という語が、数の前に明示的に現れない場合であってもなお、「約」という語を前置しているかのように読むことができる。加えて、本明細書で記載される数値パラメータは、報告される有効桁数である、数値精度に照らして、通常の丸め法を適用することにより解釈されるものとする。また、本明細書で記載される数値パラメータは、必然的に、パラメータの数値を決定するのに使用される基礎的な測定法に特徴的な、固有のばらつきを有することも理解される。
本明細書で特定される任意の特許、刊行物、または他の開示材料は、別に示されない限り、組み込まれる材料が本明細書で明白に示される既存の説明、定義、記述、または他の開示材料と矛盾しない範囲でのみ、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。そのため、および必要な範囲内でのみ、本明細書で示される明らかな開示は、参照により組み込まれる任意の矛盾する材料に優先する。本明細書に参照により組み込まれると述べられているが、本明細書で示される既存の定義、記述、または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその部分は、その組み込まれる材料と既存の開示材料との間で矛盾が生じない限りにおいてのみ組み込まれる。出願人らは、本明細書に参照により組み込まれる、任意の主題またはその部分を明白に列挙するために、本明細書を補正する権利を有する。
本開示の１つまたは複数の態様の詳細が、以下に付随する実施例において記載されている。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を、本開示の実施または試験において使用することができるが、想定される材料および方法の具体的な例が、記載されている。本開示の他の特性、目的、および利点は、本説明から明らかである。本説明例において、単数形は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、本説明が、優先される。
本開示は、本発明の例示的で非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照して、より完全に理解される。
実施例では、変異体遺伝子のフレームシフトおよび発現のサイレンシングまたはゲノムローカスにおけるＰ２３Ｈ変異の恒久的な修正、または異種ローカスでの発現をもたらし、ＲＨＯタンパク質活性を回復させる、本明細書において「ゲノム改変」と称されるＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内もしくは近傍に、定義された治療的ゲノム欠失、挿入、または置き換えを作り出すための例示的なゲノム編集技法としての、ＣＲＩＳＰＲ系の使用について説明する。定義された治療改変の導入は、本明細書において説明され、例示されるように、網膜色素変性（ＲＰ）の潜在的な改善のための新規な治療戦略を代表する。
（実施例１）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）Ｃａｓ９ ＰＡＭ部位
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を、ＳｐＣａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。領域を配列ＮＲＧを有するＰＡＭについてスキャンした。ＮＲＧ ＰＡＭの上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７～２４ｂｐ）を、次いで同定した。
（実施例２）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｓａ）Ｃａｓ９ ＰＡＭ部位
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を、ＳａＣａｓ９ ＰＡＭについてスキャンした。領域を配列ＮＮＧＲＲＴを有するＰＡＭについてスキャンした。ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭの上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７～２４ｂｐ）を、次いで同定した。
（実施例３）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓｔ）Ｃａｓ９ ＰＡＭ部位
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を、ＳｔＣａｓ９ ＰＡＭについてスキャンした。領域を配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するＰＡＭについてスキャンした。ＮＮＡＧＡＡＷ ＰＡＭの上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７～２４ｂｐ）を、次いで同定した。
（実施例４）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔｄ）Ｃａｓ９ ＰＡＭ部位
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を、ＴｄＣａｓ９ ＰＡＭについてスキャンした。領域を配列ＮＡＡＡＡＣを有するＰＡＭについてスキャンした。ＮＡＡＡＡＣ ＰＡＭの上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７～２４ｂｐ）を、次いで同定した。
（実施例５）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ｎｍ）Ｃａｓ９ ＰＡＭ部位
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を、ＮｍＣａｓ９ ＰＡＭについてスキャンした。領域を配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するＰＡＭについてスキャンした。ＮＮＮＮＧＨＴＴ ＰＡＭの上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７～２４ｂｐ）を、次いで同定した。
（実施例６）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ＰＡＭ部位
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を、Ｃｐｆ－１ ＰＡＭについてスキャンした。領域を配列ＹＴＮを有するＰＡＭについてスキャンした。ＹＴＮ ＰＡＭの上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７～２４ｂｐ）を、次いで同定した。
（実施例７）
ガイド鎖のバイオインフォマティクス解析
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、編集が望ましいゲノム配列などのオンターゲット部位、または編集が望ましくないゲノム配列などのオフターゲット部位にＲＮＰ複合体を向けさせることができる。どの候補ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡがオンターゲットおよび／またはオフターゲット活性を有する可能性があるかをさらに習得するために、オンターゲット部位およびオフターゲット部位の両方において、理論的結合および実験的に査定した活性の両方を含む一段階プロセスまたは多段階プロセスで、候補ガイドをスクリーニングおよび選択した。これらのプロセスは、さらなる開発のための高特異性ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの選択を可能にする。
例示として、意図される染色体位置以外の染色体位置での効果の可能性を査定するために、以下により詳細に説明および例示するように、オフターゲット結合を査定するために使用可能な様々なバイオインフォマティクスツールの１つまたは複数を使用して、隣接するＰＡＭを有する、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異内または近傍の部位などの、特定のオンターゲット部位に適合する配列を有する候補ガイドを、同様の配列を有するオフターゲット部位で切断するそれらの潜在性について査定した。
その後、オフターゲット活性について比較的低い潜在性を有することが予測される候補は、それらのオンターゲット活性、およびその後様々な部位でのオフターゲット活性を測定するために実験的に査定された。選択したローカスで所望の遺伝子編集レベルを達成するために十分に高いオンターゲット活性を有し、他の染色体ローカスでは改変の可能性を低減させるために比較的低いオフターゲット活性を有するガイドが好まれた。オンターゲット活性対オフターゲット活性の比は、ガイドの「特異性」と呼ばれる。
予測されるオフターゲット活性の最初のスクリーニングのために、最も可能性があるオフターゲット部位を予測するために使用された、いくつかの公知かつ一般に利用可能なバイオインフォマティクスツールがあり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ系における標的部位への結合は相補的配列間のワトソン・クリック塩基対形成により駆動されるので、相違の程度（およびそれゆえオフターゲット結合の潜在性の低減）は本質的に、標的部位に対する、潜在的オフターゲット部位における、一次配列の差、ミスマッチおよびバルジ、すなわち、非相補的塩基に変えられた塩基、ならびに塩基の挿入または欠失に関連する。ＣＯＳＭＩＤ（ＣＲＩＳＰＲ Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（ウェブ上でcrispr.bme.gatech.eduにて使用可能）と呼ばれる例示的なバイオインフォマティクスツールは、かかる類似点をコンパイルする。他のバイオインフォマティクスツールとして、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、およびＣＣＴｏｐが挙げられるが、これらに限定されない。
変異および染色体再編の有害作用を低減させるために、バイオインフォマティクスを使用して、オフターゲット切断を最小限にした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系についての研究は、特に、ＰＡＭ領域から遠位位置での、塩基対ミスマッチおよび／またはバルジを有するＤＮＡ配列へのガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションに起因するオフターゲット活性の可能性を示唆した。それゆえ、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間の挿入および／または欠失を有する、潜在的オフターゲット部位を同定したバイオインフォマティクスツールを有することは、重要であった。オフターゲット予測アルゴリズムＣＣＴｏｐに基づくバイオインフォマティクスツールを使用して、潜在的ＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位のゲノムを探索した（ＣＣＴｏｐは、crispr.cos.uni-heidelberg.de/においてウェブ上で利用可能である）。出力は、ミスマッチの数および位置に基づいて潜在的オフターゲット部位のリストをランク付けし、より多くの情報に通じた標的部位の選択を可能にし、オフターゲット切断の可能性が高い部位の使用を回避する。
ある領域におけるｇＲＮＡ標的化部位の見積もられたオンターゲット活性および／またはオフターゲット活性を比較検討する（weigh）、追加のバイオインフォマティクスパイプラインを使用した。活性を予測するために使用した他の特徴として、問題の細胞種、ＤＮＡのアクセシビリティ、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、および他のＣＨＩＰ－ｓｅｑデータについての情報が挙げられる。ｇＲＮＡ対の相対的位置および方向、局所配列特徴、ならびにマイクロホモロジーなどの、編集効率を予測する追加の要素を比較検討した。
（実施例８）
オンターゲットおよびオフターゲット活性についての細胞におけるガイドの試験
過去に調査されたガイドＲＮＡの特異性をさらに評価するために、最も低いオフターゲット活性を有すると予測された選択ガイドＲＮＡをＴＩＤＥ分析を使用してインデル頻度を評価することによって、遺伝子操作されたＫ５６２細胞におけるオンターゲットおよびオフターゲット活性について試験した。得られたデータは、選択されたガイドＲＮＡがオフターゲット活性を最小化する一方で変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を効率的に編集する証拠を提示する。
Ｋ５６２細胞のゲノムは、ヒトロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子の２つの野生型対立遺伝子を含有し、細胞をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを安定に発現するように操作した。これらの細胞に野生型ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡまたは変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。野生型ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡとして、ヒトロドプシンＷＴ ２０マー（配列番号５２８５）およびヒトロドプシンＷＴ １９マー（配列番号５２８６）が挙げられる。変異体 Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡとして、ヒトロドプシンＰ２３Ｈ ２０マー（配列番号５２９０）およびヒトロドプシンＰ２３Ｈ １９マー（配列番号５２９１）が挙げられる（図２Ｂ）。トランスフェクトしたＫ５６２細胞を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質を発現するＫ５６２細胞であるが、いかなるガイドＲＮＡでもトランスフェクトされない対照細胞と比較した。
ゲノムＤＮＡをトランスフェクションの４８～７２時間後に細胞から回収し、ＲＨＯ遺伝子のコドン２３周辺をＰＣＲ増幅した。ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソンの非コード上流領域に位置するフォワードプライマーおよびコード領域に位置するリバースプライマーをゲノムＤＮＡから野生型ＲＨＯ遺伝子を増幅するために使用した。Ｋ５６２細胞のゲノムがＲＨＯ遺伝子の野生型バージョンだけを含有していることから、これらのＫ５６２細胞を野生型ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡについてのオンターゲット編集効率および変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡについてのオフターゲット編集効率を測定するために使用した。オンターゲットおよびオフターゲット活性を遊離ＤＮＡ末端のＮＨＥＪ修復によって導入される挿入、欠失および変異の率によって測定した。配列分析は、野生型ＲＨＯ遺伝子（配列番号５２８５～５２８６）をターゲティングするｇＲＮＡについて、８０％を超えるローカスが成功裏に編集されたことを明らかにした（図３）。変異させたＰ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子（配列番号５２９０～５２９１）をターゲティングするｇＲＮＡについて、オフターゲット編集が低く、対照細胞におけるバックグラウンドレベルと同様であったことが見出された（図３）。
変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子（配列番号５２９０～５２９１）をターゲティングするｇＲＮＡのオンターゲット編集効率およびオフターゲット編集効率を試験するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質を発現するＫ５６２細胞に変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡをトランスフェクトし、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子または野生型ＲＨＯ遺伝子のいずれかをコードするプラスミドをトランスフェクトした。遺伝子操作されたＫ５６２細胞がそれらのゲノム中にＲＨＯ遺伝子の野生型バージョンだけを有することから、プラスミドをＲＨＯ遺伝子（ＲＨＯ遺伝子のＰ２３Ｈ変異させたバージョンまたはＲＨＯ遺伝子の野生型バージョンのいずれか）の外因性コピーを導入するために使用した。これらのトランスフェクトしたＫ５６２細胞を対照細胞と比較した。対照細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質を発現し、プラスミドでトランスフェクトされているが、いかなるガイドＲＮＡでもトランスフェクトされないＫ５６２細胞であった。トランスフェクトしたＫ５６２細胞から生じた配列を分析する場合、これらの細胞におけるプラスミドＤＮＡ（ゲノムＤＮＡではなく）だけを変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子（配列番号５２９０～５２９１）をターゲティングするｇＲＮＡについてのオンターゲット編集効率およびオフターゲット編集効率を確立するために使用した。例えば、変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡについてのオンターゲット活性を試験するために、Ｋ５６２細胞を、変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡでトランスフェクトし、ＲＨＯ遺伝子のＰ２３Ｈ変異させたバージョンをコードするプラスミドでトランスフェクトした。別個の実験では、変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡについてのオフターゲット活性を試験するために、Ｋ５６２細胞に変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を標的とするｇＲＮＡをトランスフェクトし、ＲＨＯ遺伝子の野生型バージョンを含有するプラスミドをトランスフェクトした。プラスミドのプロモーター領域（天然ＲＨＯプロモーターではない）に位置するフォワードプライマーおよびＲＨＯ遺伝子におけるリバースプライマーをいずれかのＲＨＯコードプラスミドからのＤＮＡ産物を増幅するために使用した。いずれのプラスミドもＲＨＯ遺伝子の上流の非コード領域を含有せず、それによりＲＨＯ遺伝子のコドン２３周辺のゲノムＤＮＡを増幅するために使用されるプライマーでＰＣＲ産物を産生できなかった。生じたプラスミド－特異的ＰＣＲ産物またはゲノム－特異的ＰＣＲ産物を、次いでそれぞれの増幅ＰＣＲ産物の内部に位置するプライマーで配列決定し、ＴＩＤＥ分析に供し、ウェブツールをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）による標的ローカスのゲノム編集を迅速に査定するために使用した。２つの標準的キャピラリー配列決定反応からの定量的配列追跡データに基づいて、ＴＩＤＥソフトウエアは、編集の有効性を定量し、標的化細胞プールのＤＮＡにおける優勢なタイプの挿入および欠失（インデル）を識別する。詳細な説明および例についてBrinkman et al, Nucl. Acids Res. (2014)を参照されたい。本技術は、以前使用されたサンガー配列決定法よりもはるかに迅速かつ安価にＤＮＡおよびＲＮＡを配列決定できるようにし、それによりゲノミクスおよび分子生物学の研究を改革した。
配列決定分析は、変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子（配列番号５２９１）をターゲティングする１９マーｇＲＮＡが対照細胞より約１５倍多いオンターゲット編集を引き起こすことが見出され、変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子（配列番号５２９０）をターゲティングする２０マーｇＲＮＡが対照細胞より約３４倍多いオンターゲット編集を引き起こすことが見出されたことを明らかにした（図４）。１９マーｇＲＮＡは、対照細胞と同様のオフターゲット編集を示した一方で、２０マーは対照細胞と比較してわずかに増加したオフターゲット編集を示した（図４）。これらのデータは、選択されたガイドＲＮＡ（配列番号５２９０～５２９１）が、オフターゲット活性を最小化する一方で変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯ遺伝子を効率的に編集する証拠を提示する。
有意な編集活性を有するｇＲＮＡは、ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異のフレームシフトまたは修正を測定するために培養細胞中で追跡することができる。オフターゲット事象も追跡できる。様々な細胞をトランスフェクトでき、遺伝子修正のレベルおよび可能なオフターゲット事象を測定できる。これらの実験は、ヌクレアーゼおよびドナーの設計および送達の最適化を可能にする。
（実施例９）
オフターゲット活性の細胞におけるガイドの試験
ゲノムレベルでのオフターゲット編集の程度を決定するために、次いで最良のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡ）をＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ、Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ｓｅｑ、および／またはＤｉｇｅｎｏｍｅ－ｓｅｑを使用して標的化ゲノムワイドオフターゲット編集について試験する。オフターゲット効果は、ヒト細胞において試験する。
（実施例１０）
ＨＤＲ遺伝子編集についての異なるアプローチの試験
オンターゲット活性およびオフターゲット活性の両方についてｇＲＮＡを試験した後、変異修正およびノックイン戦略をＨＤＲ遺伝子編集について試験する。これらの試験により、様々なＨＤＲ遺伝子編集戦略の最適化が可能となり、それらそれぞれの有効性に基づく比較がなされる。
変異修正アプローチのために、ドナーＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド（インタクトなＰＡＭ配列／変異させたＰＡＭ配列）、長い一本鎖ＤＮＡ分子（インタクトなＰＡＭ配列／変異させたＰＡＭ配列）または長い二本鎖ＤＮＡ分子（インタクトなＰＡＭ配列／変異させたＰＡＭ配列）として提供する。加えて、ドナーＤＮＡ鋳型は、ＡＡＶによって送達される。
ｃＤＮＡノックインアプローチのために、ＲＨＯ染色体領域に対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、４０ｎｔよりも長いＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン（第１のコーディングエクソン）、ＲＨＯ遺伝子の完全なＣＤＳおよびＲＨＯ遺伝子の３’ＵＴＲおよび続く少なくとも４０ｎｔのイントロンを含んでよい。ＲＨＯ染色体領域に対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、８０ｎｔよりも長いＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、ＲＨＯ遺伝子の完全なＣＤＳおよびＲＨＯ遺伝子の３’ＵＴＲおよび続く少なくとも８０ｎｔのイントロンを含んでよい。ＲＨＯ染色体領域に対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、１００ｎｔよりも長いＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、ＲＨＯ遺伝子の完全なＣＤＳおよびＲＨＯ遺伝子の３’ＵＴＲおよび続く少なくとも１００ｎｔのイントロンを含んでよい。ＲＨＯ染色体領域に対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、１５０ｎｔより長いＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、ＲＨＯ遺伝子の完全なＣＤＳおよびＲＨＯ遺伝子の３’ＵＴＲおよび続く少なくとも１５０ｎｔのイントロンを含んでよい。ＲＨＯ染色体領域に対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、３００ｎｔより長いＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、ＲＨＯ遺伝子の完全なＣＤＳおよびＲＨＯ遺伝子の３’ＵＴＲおよび続く少なくとも３００ｎｔのイントロンを含んでよい。ＲＨＯ染色体領域に対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡは、４００ｎｔより長いＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、ＲＨＯ遺伝子の完全なＣＤＳおよびＲＨＯ遺伝子の３’ＵＴＲおよび続く少なくとも４００ｎｔのイントロンを含んでよい。
代替的にＤＮＡ鋳型は、本明細書に示すとおり組換えＡＡＶ粒子によって送達される。
ＲＨＯ ｃＤＮＡのノックインは、任意の選択された染色体位置へと、または「セーフハーバー」ローカス、すなわちアルブミン遺伝子、ＡＡＶＳ １遺伝子、ＨＲＰＴ遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、グロビン遺伝子、ＴＴＲ遺伝子、ＴＦ遺伝子、Ｆ９遺伝子、Ａｌｂ遺伝子、Ｇｙｓ２遺伝子およびＰＣＳＫ９遺伝子の１つに実施され得る。第１のエクソンへのｃＤＮＡのＨＤＲ媒介ノックインの効率の評価は、次の領域、例えば：ＡＡＶＳ１ １９ｑ１３．４－ｑｔｅｒ、ＨＲＰＴ １ｑ３１．２、ＣＣＲ５ ３ｐ２１．３１、グロビン１１ｐ１５．４、ＴＴＲ １８ｑ１２．１、ＴＦ ３ｑ２２．１、Ｆ９ Ｘｑ２７．１、Ａｌｂ ４ｑ１３．３、Ｇｙｓ２ １２ｐ１２．１、ＰＣＳＫ９ １ｐ３２．３；ＲＨＯに対応する５’ＵＴＲまたは代替５’ＵＴＲ、ＲＨＯの完全なＣＤＳおよびＲＨＯの３’ＵＴＲまたは修飾３’ＵＴＲおよび少なくとも８０ｎｔの第１のイントロンのうちの１つに対する相同性アームを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡなどの「セーフハーバー」部位へのｃＤＮＡノックインを利用でき、代替的に同じＤＮＡ鋳型配列はＡＡＶによって送達される。
（実施例１１）
リードＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ＤＮＡドナー組合せの再評価
遺伝子編集についての異なる戦略を試験した後、リードＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ＤＮＡドナー組合せを欠失、組換えの効率、およびオフターゲット特異性について細胞において再評価する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡまたはＲＮＰは、送達のために、脂質ナノ粒子へと製剤化し、ｓｇＲＮＡはナノ粒子へと製剤化するまたは組換えＡＡＶ粒子として送達され、ドナーＤＮＡはナノ粒子へと製剤化するまたは組換えＡＡＶ粒子として送達される。
（実施例１２）
自己不活性化（ＳＩＮ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
Ｃａｓ９および／またはガイドＲＮＡをコードする核酸をウイルスベクターを介して送達する場合、核酸の少なくとも１つを送達するためにＳＩＮベクターを使用することは有利であり得る。特異性を有する標的化核酸を編集する様々なＳＩＮベクターの能力をさらに調査するために実験を実施した。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）へと融合されたＣａｓ９標的部位を含有する２つのレポーター細胞株を生成した。第１のレポーター細胞株は、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスでＢＦＰへと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有する。第２のレポーター細胞株は、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスでＢＦＰへと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有する。それにより、レポーター細胞株によって構成されるＣａｓ９標的部位－ＢＦＰ遺伝子融合物は、Ｃａｓ９標的部位での編集活性についてレポートするために使用できる。編集活性は、フレームシフト変異を介したＢＦＰシグナルの喪失を引き起こすことができる。Ｃａｓ９ベクターと本開示に従ったガイドＲＮＡとの様々な組合せが、ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ変異体Ｃａｓ９標的部位を標的化する編集において有効であったことが見出された。様々な組合せも特異的であり、野生型ＲＨＯ Ｃａｓ９標的部位の編集が最小であり、ＢＦＰシグナル喪失のバックグラウンドレベルと同様であった。
これらの２つのレポーター細胞株を生成するために、ｐＤＬ１２４およびドナープラスミドを使用した。ｐＤＬ１２４は、ＳｐＣａｓ９ ＯＲＦをＣＭＶプロモーター下に、およびＵ６プロモーター駆動ｓｇＲＮＡを含有し、ギブソンアセンブリーによって構築した。Ｕ６プロモーター駆動ｓｇＲＮＡは、ベータ－チューブリンのＣ末端から３残基目に対応するコドンを切断できる。ドナープラスミド（図８）は、Ｃａｓ９標的部位（野生型ＲＨＯ遺伝子またはＰ２３Ｈ変異を含むＲＨＯ遺伝子のいずれか）を含む。これら２つの各ドナープラスミドは、ＧｅｎｅＡｒｔ ｓｅｒｖｉｃｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成した。
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（細胞２００，０００個）をｐｒｏｇｒａｍ ＤＮ－１００の下でヌクレオフェクションによって０．５μｇのｐＤＬ１２４および０．５μｇのドナープラスミドでトランスフェクトした。ｐＤＬ１２４を使用して、ドナープラスミド由来のＣａｓ９標的部位（すなわち、野生型ＲＨＯ遺伝子またはＰ２３Ｈ変異を含むＲＨＯ遺伝子）をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のベータ－チューブリン遺伝子ローカスに２つの相同性アーム（ｔｕｂｂエクソン４）の間で組み入れるために、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のベータ－チューブリン遺伝子ローカスでの二本鎖切断を生成した。相同組換えは、Ｔ２Ａペプチドへと融合されたベータ－チューブリンの発現をもたらす。Ｃａｓ９標的部位は、終止コドンを含まず、青色蛍光タンパク質（ｍＴａｇＢＦＰ２）およびブラストサイジン選択マーカー（ｂｓｄ）は、ベータ－チューブリンについてと同じリーディングフレーム内にコードされている。正確に組み入れられたＣａｓ９標的部位を有する細胞を２～５μｇ／ｍｌブラストサイジンを補充した１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で富化し、細胞分取によって単離した。トランスフェクション２４時間前に、各レポーター細胞株を６ウエルプレートの１ウエルあたり細胞５００，０００個、２．５ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に播種した。
図６Ａは、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１（図５Ａ）および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１０（図５Ｄ）でトランスフェクトした場合に得られた結果を示す。ｐＳＩＡ０１０は、Ｐ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列（配列番号５３３９）およびＥＧＦＰを含むプラスミドである。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１は、ＳａＣａｓ９をコードし、ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１３）の５’に位置するＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）およびＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１４）内に位置する天然に存在するイントロンまたはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位を含む。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１における５’ＳＩＮ部位（配列番号５３１３）は、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡによって標的とされる配列番号５３００を含む。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１における３’ＳＩＮ部位（配列番号５３１４）は、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡによっても標的とされる配列番号５２８０を含む（表６）。
Figure 0007522656000007
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした（図６Ｃ）。
図６Ｂは、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１（図５Ａ）および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１１（図５Ｄ）でトランスフェクトした場合に得られた結果を示す。ｐＳＩＡ０１１は、Ｐ２３Ｈ １９マー ｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするＡＡＶ配列（配列番号５３４０）およびＥＧＦＰを含むプラスミドである。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１は、ＳａＣａｓ９をコードし、ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１３）の５’に位置するＳＩＮ 部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）およびＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１４）内に位置する天然に存在するイントロンまたはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位を含む。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１における５’ＳＩＮ部位（配列番号５３１３）は配列番号５３０１を含み、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡによって標的とされる。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１における３’ＳＩＮ部位（配列番号５３１４）は配列番号５２８１を含み、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡによって標的とされる（表７）。
Figure 0007522656000008
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした（図６Ｄ）。
図６Ｅは、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２（図５Ｂ）および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１０（図５Ｄ）でトランスフェクトした場合に得られた結果を示す。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２はＳａＣａｓ９をコードし、ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１３）の５’に位置するＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）およびＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１４）内に位置する天然に存在するイントロンまたはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位を含む。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２における５’ＳＩＮ部位（配列番号５３１３）は配列番号５３００を含み、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡによって標的とされる。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２における３’ＳＩＮ部位（配列番号５３１４）は配列番号５２８０を含み、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡによっても標的とされる（表６）。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした（図６Ｇ）。
図６Ｆは、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２（図５Ｂ）および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした場合に得られた結果を示す（図５Ｄ）。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２は、ＳａＣａｓ９をコードし、ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１３）の５’に位置するＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）およびＳａＣａｓ９ ＯＲＦ（配列番号５３１４）内に位置する天然に存在するイントロンまたはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位を含む。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２における５’ＳＩＮ部位（配列番号５３１３）は配列番号５３０１を含み、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡによって標的とされる。ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２における３’ＳＩＮ部位（配列番号５３１４）は配列番号５２８１を含み、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡによって標的とされる（表７）。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して１．２５μｇ ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした（図６Ｈ）。
図６Ｉは、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ 非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１０（図５Ｄ）でトランスフェクトした場合の結果を示す。非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９はＳａＣａｓ９をコードし、ＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）を含まない。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ 非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした（図６Ｌ）。
図６Ｊは、ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ 非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１１（図５Ｄ）でトランスフェクトした場合に得られた結果を示す。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して１．２５μｇ 非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９および１．２５μｇ ｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした（図６Ｍ）。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合された野生型ＲＨＯ遺伝子（Ｃａｓ９標的部位）を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用してトランスフェクション試薬だけ（ＤＮＡ不含有）でトランスフェクトした（図６Ｋ）。
ベータ－チューブリン遺伝子ローカスで青色蛍光タンパク質へと融合されたＰ２３Ｈ変異（Ｃａｓ９標的部位）を含むＲＨＯ遺伝子を有するレポーター細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用してトランスフェクション試薬だけ（ＤＮＡ不含有）でトランスフェクトした（図６Ｎ）。
トランスフェクション後７２時間で、レポーター細胞をトリプシン－ＥＤＴＡとのインキュベーションによってプレートから解離させ、フローサイトメトリーによって青色蛍光（ＢＦＰ）および緑色蛍光（ＧＦＰ）について分析した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のＣａｓ９標的部位（Ｃａｓ９標的部位が野生型ＲＨＯ遺伝子か、またはＰ２３Ｈ変異を含むＲＨＯ遺伝子であるかに関わらず）でのゲノム編集によって誘導されたフレームシフトは、ＢＦＰの喪失をもたらす。ＥＧＦＰおよびｓｇＲＮＡは、同じベクター上にコードされ、ＥＧＦＰはトランスフェクションマーカーとしての機能を果たす。したがって、ｐＳＩＡ０１０（Ｐ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ－配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列を含む）またはｐＳＩＡ０１１（Ｐ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ－配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶ配列を含む）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞は、ＧＦＰ陽性である。
トランスフェクトした細胞における遺伝子編集をゲート内にプロットされた細胞集団において見積もった（図６Ａ～６Ｎ）。図６Ａ～６Ｎにおける太字の百分率は、ゲート内のＢＦＰ陰性およびＧＦＰ陽性細胞を示す。ＢＦＰ陰性は、遺伝子編集がこれらのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のＣａｓ９標的部位で生じたことを意味する。ＧＦＰ陽性は、これらのトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞がＥＧＦＰおよびｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを含有することを意味する。
図６Ａは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１およびＰ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の約０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｂは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１およびＰ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の約０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｃは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の４２．４１％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
図６Ｄは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の１９．４２％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
図６Ｅは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の約０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｆは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の約０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｇは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の４６．２３％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
図６Ｈは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞の遺伝子編集であって、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の１８．５８％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
図６Ｉは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞で、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の約０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｊは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞で、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の約０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｋは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞で、ＤＮＡが使用されなかったときにこれらの細胞の０％が、編集された野生型ＲＨＯ遺伝子を有したことを示す。
図６Ｌは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞で、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の４９．９７％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
図６Ｍは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞で、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトしたときにこれらの細胞の２６．３０％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
図６Ｎは、ゲートにおけるＣａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞で、ＤＮＡが使用されなかったときにこれらの細胞の０％が、編集されたＰ２３Ｈ変異を有したことを示す。
ゲノム編集は、疑似トランスフェクトした細胞では誘導されなかったことから、疑似トランスフェクトした細胞の大部分は、ＢＦＰ陽性である（図６Ｋおよび６Ｎ）。
Ｃａｓ９発現を制限するＳＩＮベクターの能力を決定するために、Ｃａｓ９タンパク質の発現レベルを図６Ａ～Ｎによって説明される実験において使用された細胞についてイムノブロット（図７Ａ～Ｂ）によって測定した。ＳＩＮ Ｃａｓ９ベクターは、配列番号５２９０または５２９１を含むいずれかのガイドＲＮＡによって標的とされたときに両方のレポーター細胞株においてＣａｓ９の発現の減少を示した。
トランスフェクション後７２時間で、レポーター細胞もＰＢＳ中に回収し、全タンパク質を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に抽出した。５マイクログラムの全タンパク質をＮＵＰＡＧＥ ４～１２％ポリアクリルアミド／Ｔｒｉｓ－Ｂｉｓゲルで分離し、ニトロセルロース膜上に移した。ＳａＣａｓ９、ＥＧＦＰ（トランスフェクション対照として）およびベータアクチン（内部対照として）をＣａｓ９モノクローナル抗体、ＧＦＰ Ｔａｇポリクローナル抗体およびベータアクチンローディング対照モノクローナル抗体をそれぞれ使用して検出した。
図７Ａ（レーン１）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１（図５Ａ）および、Ｐ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ａ（レーン２）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２（図５Ｂ）およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ａ（レーン３）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９発現を示す。
図７Ａ（レーン４）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、いかなるＤＮＡでもトランスフェクトされない、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞においてＣａｓ９発現がないことを示す。
図７Ａ（レーン５）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１（図５Ａ）および、Ｐ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ ｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ａ（レーン６）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２（図５Ｂ）およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ａ（レーン７）は、Ｃａｓ９標的部位として野生型ＲＨＯ遺伝子を有し、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９発現を示す。
図７Ｂ（レーン１）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１（図５Ａ）および、Ｐ２３Ｈ ２０マーｓｇＲＮＡ ｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）をコードするｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ｂ（レーン２）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２（図５Ｂ）およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ｂ（レーン３）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）およびｐＳＩＡ０１０でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９発現を示す。
図７Ｂ（レーン４）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、いかなるＤＮＡでもトランスフェクトされない、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞においてＣａｓ９発現がないことを示す。
図７Ｂ（レーン５）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１（図５Ａ）および、Ｐ２３Ｈ １９マーｓｇＲＮＡ ｓｇＲＮＡ（配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡ）をコードするｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ｂ（レーン６）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２（図５Ｂ）およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９不活性化を示す。
図７Ｂ（レーン７）は、Ｃａｓ９標的部位としてＰ２３Ｈ変異を有し、非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）およびｐＳＩＡ０１１でトランスフェクトした、ＨＥＫ２９３ＦＴレポーター細胞におけるＣａｓ９発現を示す。
上で考察のとおり、トランスフェクション後にＣａｓ９のそれら自体の発現を制限する自己不活性化（ＳＩＮ）ＡＡＶベクターの２つのバージョンを作出した。バージョン１ベクターの一例を図５Ａに示す。バージョン２ベクターの一例を図５Ｂに示す。バージョン１およびバージョン２ベクターの両方は、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ ＲＮＰによる切断に脆弱性である２つのＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位とも称される）を含む。これらの部位の内の１つでのＣａｓ９媒介二本鎖切断は、Ｃａｓ９遺伝子におけるプロモーターまたはポリアデニル化シグナルのいずれかの除去をもたらし得る。これらの部位の両方での同時に生じたＣａｓ９媒介二本鎖切断は、Ｃａｓ９遺伝子の欠失をもたらし得る。両方の可能性がＣａｓ９発現を阻害する。
バージョン１ベクターがバージョン２ベクターよりもさらに効率的な自己不活性化をもたらすことが観察された。バージョン１ベクターは、Ｃａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流およびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の下流に位置する５’ＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位）を含む。バージョン２ベクターは、Ｃａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の上流に位置する５’ＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位）を含む。バージョン１ベクターでは、非相同末端結合から生じた変異は、フレームシフトを作出する場合があり、Ｃａｓ９遺伝子ＯＲＦにおいて早期終止コドンの導入を生じさせる。バージョン２ベクターでは、ＳＩＮ部位（Ｐ２３Ｈ標的部位）が５’ＵＴＲ中、ＯＲＦの外側にあることから、かかる変異は、Ｃａｓ９ ＯＲＦにおけるそのような変化を作り出す見込みがない。これらの変異は、転写開始をまだ破壊できるが、Ｃａｓ９発現へのそれらの全体的な効果は、バージョン１ベクターにおける変異より少ない可能性がある。さらに、いずれかのベクター中に変異が作り出されると、効率的な追加編集のために部位がもはや十分な相同性をｓｇＲＮＡスペーサー配列と共有しないため２つ目は見込みがない。生じる編集が発現を阻害する可能性があることは重要である。少なくともこれらの理由のために、２つのベクターバージョン間に観察されたＳＩＮ効率に差異がある。
導入されたＳＩＮ部位がＣａｓ９の転写および翻訳に影響しないことを確認するために、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を１．２５μｇのｐＤＬ１０７（ＧＦＰをコードするがｓｇＲＮＡをコードしない）および（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２または（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間前に、細胞を６ウエルプレートの１ウエルあたり細胞５００，０００個、２．５ｍｌの１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に播種した。トランスフェクション後７２時間で、すべてのトランスフェクトした細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって分析し、全タンパク質を０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に抽出した。５マイクログラムの全タンパク質をＮＵＰＡＧＥ ４～１２％ポリアクリルアミド／Ｔｒｉｓ－Ｂｉｓゲルで分離し、ニトロセルロース膜上に移した。ＳａＣａｓ９、ＥＧＦＰ（トランスフェクション対照として）およびベータアクチン（内部対照として）をＣａｓ９モノクローナル抗体、ＧＦＰ Ｔａｇポリクローナル抗体およびベータアクチンローディング対照モノクローナル抗体をそれぞれ使用して検出した。結果は、（１）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．１、（２）ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９ ｖｅｒ．２、および（３）非－ＳＩＮ－ＡＡＶ ＳａＣａｓ９でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞においてＳａＣａｓ９発現が等しかったことを示した（データ未記載）。
（実施例１３）
Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞株の生成
ゲノムＤＮＡの文脈において（実施例８において使用したプラスミドＤＮＡとは対照的に）Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子配列を標的とするガイドＲＮＡのオンターゲット試験を可能にするために、ホモ接合体ｇ．１２９５２８８０１Ｃ＞Ａ変異を含むＫ５６２細胞株（Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞株）を野生型Ｋ５６２細胞を使用して生成した。野生型Ｋ５６２細胞は、ヒトロドプシン遺伝子の２つの野生型対立遺伝子を含有する。Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞株を生成するために使用した野生型Ｋ５６２細胞は、ドキシサイクリン誘導性（inducibile）プロモーター下でＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを安定に発現するようにも予め操作した。
Ｌｏｎｚａのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅおよびＫ５６２細胞のために推奨されるプログラムを使用して、野生型Ｋ５６２細胞を、ＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）および一本鎖ＤＮＡオリゴ（３～６μｇ）でトランスフェクトした。
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を２．５μｇ ＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｖ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１μｇ（約２５ｐＭ）合成ｇＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて作製した。合成ｇＲＮＡは、次の未修飾プロトスペーサー領域：ＵＡＧＵＡＣＵＧＵＧＧＧＵＡＣＵＣＧＡ（配列番号５３４３）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの専有ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んだ。野生型Ｋ５６２ゲノム中に二重切断を導入するために使用する合成ｇＲＮＡを、所望のＰ２３Ｈ変異がゲノムに導入されると、ＲＮＰによって認識されるＰＡＭ配列がもはやＰＡＭ配列としての機能を果たさないように設計し、それにより成功裏にＨＤＲを受けた細胞のゲノムのさらなる編集を妨げた（図９Ｂ）。
ＨＤＲのための鋳型として使用した単一鎖ＤＮＡオリゴは、以下：
Figure 0007522656000009
 であった。
トランスフェクトした細胞をトランスフェクション後３～７日間培養物中で回復させた。単一細胞を９６ウエルプレートに自動分取し、コロニーを単一細胞から生じさせた。ゲノムＤＮＡを細胞の各コロニーから単離し、ヒトロドプシン遺伝子のコドン２３における所望の一塩基変異の存在について配列決定した。両方の対立遺伝子へと導入されたＰ２３Ｈ変異を有する数個のコロニーを単離した（図９Ａ～Ｂ）。
（実施例１４）
オンターゲット／オフターゲット活性についてのＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞における合成ガイドＲＮＡの試験
実施例１３において構築した細胞株（および既存の野生型ＲＨＯ細胞株）をＴＩＤＥ分析を使用してインデル頻度を評価することによって、オンターゲット／オフターゲット活性について選択ガイドＲＮＡを試験するために使用した。これらの実験では、過去の実験においてのとおりウイルスベクターまたはプラスミドベクターから転写したガイドＲＮＡよりむしろ、合成ガイドＲＮＡをＲＨＯ内のＰ２３Ｈ変異を標的とするために使用した。加えて、ゲノムＤＮＡにコードされるＲＨＯ遺伝子ＤＮＡ配列を標的とした。これらの条件下で、本開示のガイドＲＮＡが変異体Ｐ２３Ｈ ＲＨＯローカスの特異的な編集を示したことを見出した。
野生型ＲＨＯ細胞およびＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞をＳａＣａｓ９発現を誘導するためにトランスフェクションの４８時間前にドキシサイクリンを用いて最初に処置した。
４８時間後、両方の細胞型（１ウエルあたり２００，０００個）を、野生型ＲＨＯ遺伝子を標的とする合成ｓｇＲＮＡ １μｇまたはＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とする合成ｓｇＲＮＡ １μｇのいずれかで別々にトランスフェクトした。野生型ＲＨＯ細胞およびＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞をＬｏｎｚａのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅおよびＫ５６２細胞のために推奨されるプログラムを使用してトランスフェクトした。Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、以下：ヒトロドプシンＰ２３Ｈ ２０マー（配列番号５２９０）およびヒトロドプシンＰ２３Ｈ １９マー（配列番号５２９１）を含む（図２Ｂ）。野生型ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡは、以下：ヒトロドプシンＷＴ ２０マー（配列番号５２８５）およびヒトロドプシンＷＴ １９マー（配列番号５２８６）を含む（図２Ｂ）。トランスフェクトしたＫ５６２細胞（野生型ＲＨＯ細胞またはＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞）をＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質を発現するが、いかなるガイドＲＮＡでもトランスフェクトされないＫ５６２細胞である対照細胞と比較した。
ゲノムＤＮＡをトランスフェクション後４８～７２時間で細胞から回収し、ＲＨＯ遺伝子のコドン２３周辺をＰＣＲ増幅した。ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソンの非コード上流の領域に位置するフォワードプライマー（配列番号５３４７）およびコード領域に位置するリバースプライマー（配列番号５３４８）をＰＣＲ増幅のために使用した。
野生型ＲＨＯ細胞のゲノムがＲＨＯ遺伝子の野生型バージョンだけを含有し、Ｐ２３Ｈ変異体対立遺伝子を含有しないことから、これらの野生型ＲＨＯ細胞を使用して、野生型ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡのオンターゲット編集効率およびＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡのオフターゲット編集効率について測定した。Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞のゲノムがＲＨＯ遺伝子のＰ２３Ｈ変異体バージョンだけを含有し、野生型対立遺伝子を含有しないことから、これらのＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞を使用して、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡのオンターゲット編集効率および野生型ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｇＲＮＡのオフターゲット編集効率について測定した。オンターゲットおよびオフターゲット活性をＲＮＰがＤＳＢを編集部位に作り出した場合に産生される遊離ＤＮＡ末端のＮＨＥＪ修復によって導入された挿入、欠失および変異の率によって測定した。
配列分析は、配列番号５２９０を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡについて、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの８９％が成功裏に編集され（図１０、試料６）、オフターゲット編集が低く（図１０、試料３）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１０、試料５）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５２９１を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡについて、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの１０．６％が成功裏に編集され（図１０、試料７）、オフターゲット編集が低く（図１０、試料４）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１０、試料５）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５２８５を含み、野生型ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡについて、野生型ＲＨＯローカスの８０．６％が成功裏に編集され（図１０、試料１）、オフターゲット編集が１５．５％（図１０、試料８）であったことを明らかにした。
配列分析は、配列番号５２８６を含み、野生型ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡについて、野生型ＲＨＯローカスの８４．２％が成功裏に編集され（図１０、試料２）、オフターゲット編集が低く（図１０、試料９）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１０、試料１０）と同様であることを明らかにした。
（実施例１５）
オンターゲット／オフターゲット活性についてのｓｇＲＮＡをコードするプラスミドの試験
トランスフェクトしたプラスミドによってコードされるｓｇＲＮＡの、特異性を有して標的化ゲノムＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子ＤＮＡを編集する能力も試験した。実施例１４におけるのと同じ２つの細胞株を使用して、本開示のｓｇＲＮＡが特異性を有して標的化Ｐ２３Ｈ変異体ＤＮＡの編集を指示できることが見出された。
Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを１８～２４ヌクレオチドのＤＮＡ挿入物（表８）をＵ６プロモーター下でプラスミドへと、ＤＮＡ挿入物がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによってｓｇＲＮＡへと転写されるようにクローニングすることによって構築した。Ｕ６プロモーターに加えて、プラスミドは、ＣＭＶプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質も含む。
各プラスミドからのｓｇＲＮＡ発現を駆動するために使用したＵ６プロモーター／ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは、ｓｇＲＮＡの５’末端にグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを付加した。例えば、１９ヌクレオチド（１９マー）の長さであるｓｇＲＮＡをコードするクローニングされたＤＮＡ挿入物は、５’Ｇが付加された後に２０ヌクレオチド（２０マー）になる。Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とする大部分のｓｇＲＮＡについて、余分なＧは、ロドプシン遺伝子の天然配列の一部であり（配列番号５３１５、５３１７、５２８１および５３５７）、一方Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とする他のｓｇＲＮＡについては、５’Ｇはミスマッチヌクレオチドである（すなわち、「ハンギング５’Ｇ」）（配列番号５３１６、５３１８および５２８０）（表８）。
Figure 0007522656000010
野生型ＲＨＯ細胞およびＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞を、ＳａＣａｓ９発現を誘導するためにトランスフェクション４８時間前に１～１０μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いて最初に処置した。
４８時間後、両方の細胞型（１ウエルあたり２００，０００個）を、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（表８：配列番号５３６１、５３６２、５３６３、５３６４、５３６５、５３６６または５３６７）１μｇでトランスフェクトした。野生型ＲＨＯ細胞およびＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞を、Ｌｏｎｚａのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅおよびＫ５６２細胞のために推奨されるプログラムを使用してトランスフェクトした。トランスフェクトしたＫ５６２細胞（野生型ＲＨＯ細胞またはＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質を発現するが、いかなるガイドＲＮＡでもトランスフェクトされないＫ５６２細胞である対照細胞と比較した。
１～１０μｇ／ｍＬドキシサイクリンを用いた処置をトランスフェクション後４８～７２時間再開した。次いでゲノムＤＮＡをトランスフェクション後４８～７２時間、細胞から回収し、ＲＨＯ遺伝子のコドン２３周辺をＰＣＲ増幅した。ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソンの非コード上流領域に位置するフォワードプライマー（配列番号５３４７）およびコード領域に位置するリバースプライマー（配列番号５３４８）をＰＣＲ増幅のために使用した。
野生型ＲＨＯ細胞のゲノムがＲＨＯ遺伝子の野生型バージョンだけを含有し、Ｐ２３Ｈ変異体対立遺伝子を含有しないことから、野生型ＲＨＯ細胞を使用して、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡについてのオフターゲット編集効率を測定した。Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞のゲノムがＲＨＯ遺伝子のＰ２３Ｈ変異体バージョンだけを含有し、野生型対立遺伝子を含有しないことから、これらのＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ細胞を使用して、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡについてのオンターゲット編集効率を測定した。
配列分析は、配列番号５３５８を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの７．６％が成功裏に編集され（図１１、試料１）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料２）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５２９１を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの３２．３％が成功裏に編集され（図１１、試料３）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料４）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５２９０を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの１３．６％が成功裏に編集され（図１１、試料５）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料６）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５３２２を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの８．５％が成功裏に編集され（図１１、試料７）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料８）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５３２１を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの３０．１％が成功裏に編集され（図１１、試料９）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料１０）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５３２０を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの１４．８％が成功裏に編集され（図１１、試料１１）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料１２）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
配列分析は、配列番号５３１９を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの３．６％が成功裏に編集され（図１１、試料１３）、オフターゲット編集が低く（図１１、試料１４）対照細胞でのバックグラウンドレベル（図１１、試料１６）と同様であることを明らかにした。
第２の実験からの配列分析は、配列番号５２９１を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの５９．６％が成功裏に編集された（図１２、試料１）ことを明らかにした。
第２の実験からの配列分析は、配列番号５３２１を含み、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞について、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯローカスの４２．１％が成功裏に編集された（図１２、試料２）ことを明らかにした。
（実施例１６）
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
２種の異なるＲＨＯノックインマウス系統を使用してヒトＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異体対立遺伝子を特異的に切断し、Ｐ２３Ｈ変異体ＲＨＯ対立遺伝子へとフレームシフト変異を導入し、かつｉｎ ｖｉｖｏ系においてＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯ対立遺伝子の発現を抑制する、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ系の性能をさらに実証した。
ｈＲＨＯ－ＧＦＰマウスと称される、第１のＲＨＯノックインマウス系統では、ＲＨＯ遺伝子の両方のマウスコピーを野生型ヒトＲＨＯ遺伝子（すべてのイントロンおよびエクソンを含む）で置換し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合して、２つのｈＲＨＯ－ＧＦＰ対立遺伝子を含み、マウスＲＨＯ対立遺伝子が残っていないホモ接合体マウスを作り出した。
Ｐ２３Ｈ－ｈＲＨＯ－ＲＦＰマウスと称される、第２のＲＨＯノックインマウス系統では、ＲＨＯ遺伝子の１つのマウスコピーをＰ２３Ｈ変異体ヒトＲＨＯ遺伝子（すべてのイントロンおよびエクソンを含む）で置換し、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）に融合して、１つのＰ２３Ｈ－ｈＲＨＯ－ＲＦＰ変異体対立遺伝子および１つのマウスＲＨＯ対立遺伝子を含むヘテロ接合体マウスを作り出した。
両方のＲＨＯノックインマウス系統は、マウス系統をＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ；Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）において作製したＤｒ．Ｔｈｅｏｄｏｒｅ Ｗｅｎｓｅｌの研究室から得た。
これらのマウス系統におけるＲＨＯタンパク質への蛍光タグ（例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰ）の融合は、細胞内のタンパク質分布のモニタリング、およびＲＨＯタンパク質発現のレベルのモニタリングを可能にする。異なる蛍光タンパク質を使用する２つのヒト対立遺伝子の蛍光タグ付けは、その天然配列が１アミノ酸で異なるだけであり、天然タンパク質を検出するための抗体を使用する場合は互いに識別できない野生型ＲＨＯタンパク質とＰ２３Ｈ変異体ＲＨＯタンパク質との間の識別も可能にする。
非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９（図５Ｃ）およびｐＳＩＡ０１０（図５Ｄ）含む二重ベクター系をｉｎ ｖｉｖｏ実験のために使用した。使用した非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９は、本ベクターが（ｓＥＦ１αプロモーターの代わりに）ＳａＣａｓ９発現を駆動する光受容細胞特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターを含むことを除いて図５Ｃに示す非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９と同一である。ｐＳＩＡ０１０は、Ｕ６プロモーター（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）によって駆動されるｓｇＲＮＡをコードする。ｓｇＲＮＡは配列番号５２９０を含み、ヒトＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を標的にする。使用したｐＳＩＡ０１０は、本ベクターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）（ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰの代わりに）をコードすることを除いて図５Ｄに示すｐＳＩＡ０１０と同一である。ＢＦＰは、形質導入されていない細胞とｐＳＩＡ０１０によって形質導入された細胞との分離を可能にする蛍光標識を提供する。両方のＡＡＶベクター（非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１０）は、ｉｎ ｖｉｖｏで光受容細胞を形質導入するために適切なＡＡＶ血清型である血清型ＡＡＶ５であった。
非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９およびｐＳＩＡ０１０をＳａＣａｓ９コードベクター（非－ＳＩＮ ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９）およびｓｇＲＮＡコードベクター（ｐＳＩＡ０１０）を１：１の比で使用して網膜下注射によって生後１４から２９日目にＰ２３Ｈ－ｈＲＨＯ－ＲＦＰマウス（図１３、試料１）および対照ｈＲＨＯ－ＧＦＰマウス（図１３、試料２）へと送達した。各ベクターは、ベクターゲノム粒子２．５×１０９または５×１０９個のいずれかの投与量を有した。形質導入の３または８週間後に、網膜を切開し、タンパク質分解酵素の混合物（プロナーゼ）で消化して単一細胞懸濁物を達成し、続いて、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）を行い、形質導入された細胞と形質導入されていない細胞とを分取した。
ゲノムＤＮＡを、次世代ディープシーケンシングを使用するＳａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ誘導編集のその後の定量分析のために形質導入細胞から単離した。配列決定のために、ヒトＲＨＯ配列だけを特異的に増幅するプライマーを使用した。プライマー特異性のための対照として、配列決定プライマーを使用するＰＣＲは、ヒトＲＨＯ配列を含むゲノムＤＮＡ試料について２００ｂｐのバンドを生成した。２００ｂｐバンドは、マウスＲＨＯ配列を含むがヒトＲＨＯ配列を含まないゲノムＤＮＡ試料については生成されなかった。
対立遺伝子特異的な、Ｐ２３Ｈ変異体ヒトＲＨＯ対立遺伝子のオンターゲット編集が配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡをコードするｐＳＩＡ０１０ ＡＡＶベクターを使用した場合に観察された（図１３、試料１；および表９、列１～１０）。配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡは、Ｐ２３Ｈ変異体ヒトＲＨＯ対立遺伝子に完全な相補性および野生型ヒトＲＨＯ対立遺伝子に１個のミスマッチを有する。
野生型ＲＨＯ遺伝子の最小オフターゲット編集が、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡをコードする同じｐＳＩＡ０１０ ＡＡＶベクターを使用した場合に観察された（図１３、試料２；および表９、列１１～１６）。
例示的な例についての注釈
本開示は、本開示の様々な例および／またはその潜在的適用を例示する目的のために様々な具体的な態様の説明を提供するが、変形および改変が当業者に想起されることが理解される。したがって、本明細書で説明する発明（単数または複数）は、少なくともそれらが請求されるのと同程度に広いものであり、本明細書で提供される特定の例示的な例により、より狭く定義されるものではないと理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒト細胞においてロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子を編集するための方法であって、
前記ヒト細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＲＨＯ遺伝子または前記ＲＨＯ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらし、それによって、編集されたヒト細胞を作り出すステップであって、前記ＳＳＢまたはＤＳＢは、前記ＲＨＯ遺伝子内もしくはその近傍に、またはその発現もしくは機能に影響を及ぼす、１つまたは複数の変異の恒久的な欠失、挿入、修正、またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらす、ステップ
を含む、方法。
（項目２）
ヒト細胞においてロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、
前記ヒト細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍に、前記Ｐ２３Ｈ変異の恒久的な欠失、挿入、修正、またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらす１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらし、それによって、編集されたヒト細胞を作り出すステップ
を含む、方法。
（項目３）
網膜色素変性（ＲＰ）を有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、前記患者の細胞においてロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するステップを含む、方法。
（項目４）
前記編集するステップが、
前記細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍に、前記Ｐ２３Ｈ変異の恒久的な欠失、挿入、修正、またはその発現もしくは機能のモジュレーションをもたらし、ＲＨＯタンパク質活性の回復をもたらす、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらすこと
を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、項目１～２、または４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記細胞へと、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記細胞へと、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾ＲＮＡである、項目６または７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞へと、１つまたは複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目１０～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、項目９～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記細胞へと、野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、その断片もしくは組合せ、または前記ＲＨＯ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、項目１４～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記ドナー鋳型が、３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、項目１４～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞へと、１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、および前記野生型ＲＨＯ遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップ
をさらに含み、
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍に位置するローカスに、１つの一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、前記ＳＳＢまたはＤＳＢは、前記ローカスにおける染色体ＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列の挿入を促進し、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異の恒久的な挿入または修正をもたらし、
前記ｇＲＮＡが、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍に位置する前記ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、項目２または４に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞へと、１つまたは複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、および前記野生型ＲＨＯ遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップ
をさらに含み、
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍に、１対の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、１対のＳＳＢまたはＤＳＢは、第１のものが５’ローカスにあり、第２のものが３’ローカスにあり、前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間における染色体ＤＮＡへの前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列の挿入を促進し、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間における前記染色体ＤＮＡの恒久的な挿入または修正をもたらし、
第１のガイドＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、項目２または４に記載の方法。
（項目２０）
前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目１８～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、項目１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記野生型ＲＨＯ遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、イントロン領域、その断片もしくは組合せ、または前記ＲＨＯ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、項目１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、項目１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記ドナー鋳型が、３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、項目１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＳＳＢまたはＤＳＢが、前記ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、第２のエクソン、第３のエクソン、第４のエクソン、第５のエクソン、またはそれらの組合せにある、項目１８～２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、病理学的バリアントＰ２３Ｈを対象とする、項目１０～１３または２０～２２に記載の方法。
（項目２８）
前記挿入または修正が、相同組換え修復（ＨＤＲ）によるものである、項目１～２または４～２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記ドナー鋳型が、病理学的バリアントＰ２３Ｈに対する相同性アームを有する、項目１８～１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞へと、２つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）、および前記野生型ＲＨＯ遺伝子の少なくとも一部分を含むポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップ
をさらに含み、
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍に、１対の二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、前記１対のＤＳＢは、第１のものが５’ＤＳＢローカスにあり、第２のものが３’ＤＳＢローカスにあり、前記５’ＤＳＢローカスと前記３’ＤＳＢローカスとの間の染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、ＲＨＯ遺伝子における前記Ｐ２３Ｈ変異内またはその近傍の前記５’ＤＳＢローカスと前記３’ＤＳＢローカスとの間における前記染色体ＤＮＡの恒久的な欠失をもたらし、
第１のガイドＲＮＡが、前記５’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、前記３’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、項目２または４に記載の方法。
（項目３１）
前記２つのｇＲＮＡが、２つの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡが、２つの修飾ｇＲＮＡまたは２つの修飾ｓｇＲＮＡである、項目３０～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、項目３０～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記５’ＤＳＢおよび３’ＤＳＢの両方が、前記ＲＨＯ遺伝子の第１のエクソン、第１のイントロン、第２のエクソン、第２のイントロン、第３のエクソン、第３のイントロン、第４のエクソン、第４のイントロン、第５のエクソン、第５のイントロンのいずれか、またはこれらの組合せ内またはその近傍にある、項目３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記欠失が、１ｋｂまたはそれを下回る欠失である、項目３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ、別個の脂質ナノ粒子中に製剤化されるか、またはすべてが１つの脂質ナノ粒子中に共製剤化されるかのいずれかである、項目１８～１９、および３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ、別個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に製剤化されるか、またはすべてが１つのＡＡＶベクター中に共製剤化されるかのいずれかである、項目１８～１９、および３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子中に製剤化され、前記ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方が、ＡＡＶベクターによって前記細胞へと送達される、項目１８～１９、および３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子中に製剤化され、前記ｇＲＮＡが、電気穿孔によって前記細胞へと送達され、ドナー鋳型が、ＡＡＶベクターによって前記細胞へと送達される、項目１８～１９、および３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ＡＡＶベクターが、自己不活性化ＡＡＶベクターである、項目３７～３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ＲＨＯ遺伝子が、第３染色体：１２９，５２８，６４０～１２９，５３５，１６９（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ－ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
ＲＨＯタンパク質活性の前記回復が、野生型または正常なＲＨＯタンパク質活性と比較される、項目２、または４～４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型が、ＲＨＯのエクソン１を含み、最大５ＫＢである、項目１４に記載の方法。
（項目４４）
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型が、ＡＡＶによって送達される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ヒト細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、項目１～２に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、項目３～４４に記載の方法。
（項目４７）
網膜色素変性（ＲＰ）を有する患者に由来する細胞において、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）であって、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡ。
（項目４８）
１つまたは複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目４７に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡ。
（項目４９）
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目４７または４８に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
（項目５０）
前記細胞が、光受容細胞、網膜前駆細胞、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、項目４７～４９に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
（項目５１）
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための少なくとも１つまたは複数のｇＲＮＡを含む治療であって、前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療。
（項目５２）
前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、項目５１に記載の治療。
（項目５３）
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、項目５１または５２に記載の治療。
（項目５４）
１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入するステップ、
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入するステップ、
１つまたは複数のドナー鋳型を導入するステップ
を含む方法によって形成される、常染色体優性網膜色素変性（ＲＰ）を有する患者を処置するための治療であって、
前記１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療。
（項目５５）
ｉｎ ｖｉｖｏで網膜色素変性（ＲＰ）を有する患者を処置するためのキットであって、
ＲＨＯ遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、および５３５８における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、
１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、
必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型と
を含む、キット。
（項目５６）
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、項目５５に記載のキット。
（項目５７）
１つまたは複数のドナー鋳型を含む、項目５５～５６のいずれかに記載のキット。
（項目５８）
前記ドナー鋳型が、３ｑ２２．１領域に対する相同性アームを有する、項目５７に記載のキット。
（項目５９）
前記ドナー鋳型が、病理学的バリアントＰ２３Ｈに対する相同性アームを有する、項目５７に記載のキット。
（項目６０）
配列番号５２９０の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６１）
配列番号５２９１の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６２）
配列番号５３１９の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６３）
配列番号５３２０の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６４）
配列番号５３２１の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６５）
配列番号５３２２の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６６）
配列番号５３５８の核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６７）
配列番号５２９０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６８）
配列番号５２９１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目６９）
配列番号５３１９、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目７０）
配列番号５３２０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目７１）
配列番号５３２１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目７２）
配列番号５３２２、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目７３）
配列番号５３５８、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つの核酸配列を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。
（項目７４）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目７５）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目７６）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３１９を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目７７）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２０を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目７８）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目７９）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２２を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８０）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３５８を含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８１）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８２）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５２９１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８３）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３１９、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８４）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８５）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８６）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３２２、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８７）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、配列番号５３５８、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを投与するステップを含む、方法。
（項目８８）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目８９）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５２９１を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目９０）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３１９を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目９１）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２０を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目９２）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目９３）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３２２を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目９４）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、配列番号５３５８を含むｓｇＲＮＡを、前記患者へと投与するステップを含む、方法。
（項目９５）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目９６）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５２９１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目９７）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５３１９、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目９８）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５３２０、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目９９）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５３２１、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目１００）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５３２２、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目１０１）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、ｓｇＲＮＡを前記患者へと投与するステップを含み、前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５３５８、および配列番号５３２７～５３３８のうちのいずれか１つを含む、方法。
（項目１０２）
部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントであって、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０を含む、第２のセグメントと、
自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントと
を含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり、
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ゲノム標的配列に実質的に相補的である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０３）
部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントであって、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９１を含む、第２のセグメントと、
自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントと
を含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり、
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ゲノム標的配列に実質的に相補的である、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０４）
部位特異的変異誘発を誘導する前記ポリペプチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）またはその任意のバリアントである、項目１０２または１０３のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０５）
部位特異的変異誘発を誘導する前記ポリペプチドが、ＳａＣａｓ９またはその任意のバリアントであり、前記ＳＩＮ部位が、ＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’に位置する５’ＳＩＮ部位、または前記ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンもしくはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位である、項目１０２～１０４のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０６）
前記５’ＳＩＮ部位が、配列番号５３００を含む、項目１０５に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０７）
前記３’ＳＩＮ部位が、配列番号５２８０を含む、項目１０５～１０６のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０８）
前記５’ＳＩＮ部位が、配列番号５３０１を含む、項目１０５に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１０９）
前記３’ＳＩＮ部位が、配列番号５２８１を含む、項目１０５および１０８のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１０）
前記５’ＳＩＮ部位が、前記ＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流およびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の下流に位置する、項目１０５～１０６、および１０８のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１１）
前記５’ＳＩＮ部位が、前記ＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の上流に位置する、項目１０５～１０６、および１０８のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１２）
前記３’ＳＩＮ部位が、前記ＳａＣａｓ９ ＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンまたはキメラ挿入イントロン内に位置する、項目１０５、１０７、または１０９のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１３）
前記ＳＩＮ部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、項目１０２～１１２のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１４）
前記ＰＡＭが、ＮＮＧＲＲＴまたはその任意のバリアントである、項目１１３に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１５）
前記ゲノム標的配列が、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異である、項目１０２～１１４のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１６）
部位特異的変異誘発を誘導するポリペプチド（polpeptide）をコードするヌクレオチド配列を含む前記第１のセグメントが、開始コドン、終止コドン、およびポリ（Ａ）終結部位をさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１７）
前記第１のセグメントおよび前記第３のセグメントが、第１のベクターにおいて一緒に提供され、前記第２のセグメントが、第２のベクターにおいて提供される、項目１０２～１１６のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１８）
前記第１のセグメント、第２のセグメント、および第３のセグメントが、１つのベクターにおいて一緒に提供される、項目１０２～１１６のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１１９）
前記第３のセグメントが、前記第１または第２のベクターにおいて、前記第１のセグメントの５’の位置に存在する、項目１１７～１１８のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２０）
前記第３のセグメントが、前記第１または第２のベクターにおいて、前記第１のセグメントの３’の位置に存在する、項目１１７～１１８のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２１）
前記１つまたは複数の第３のセグメントが、前記第１および第２のベクターにおいて、前記第１のセグメントの５’末端および３’末端に存在する、項目１１７～１１８のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２２）
前記第１のベクターが、配列番号５３４１を含み、前記第２のベクターが、配列番号５３３９を含む、項目１１７に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２３）
前記第１のベクターが、配列番号５３４１を含み、前記第２のベクターが、配列番号５３４０を含む、項目１１７に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２４）
前記第１のベクターが、配列番号５３４２を含み、前記第２のベクターが、配列番号５３３９を含む、項目１１７に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２５）
前記第１のベクターが、配列番号５３４２を含み、前記第２のベクターが、配列番号５３４０を含む、項目１１７に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２６）
前記第３のセグメントが、１００ヌクレオチド未満の長さである、先行する項目のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２７）
前記第３のセグメントが、５０ヌクレオチド未満の長さである、項目１２６に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２８）
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、少なくとも１つの位置を除き、前記ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である、先行する項目のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１２９）
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、少なくとも２つの位置を除き、前記ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である、先行する項目のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３０）
プロモーターをコードする核酸配列が、前記第１のセグメントに作動可能に連結されている、先行する項目のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３１）
前記プロモーターが、空間制限プロモーター、ｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡを１つの方向に駆動し、ＳａＣａｓ９を反対の方向に駆動する、二方向性プロモーター、または誘導性プロモーターである、項目１３０に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３２）
前記空間制限プロモーターが、任意の組織または細胞型特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肺前駆細胞特異的プロモーター、光受容器特異的プロモーター、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）選択的プロモーターからなる群から選択される、項目１３１に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３３）
前記第１のベクターおよび前記第２のベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目１１７～１１８のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３４）
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ５血清型キャプシドベクターである、項目１３３に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３５）
ＳａＣａｓ９またはその任意のバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと、
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントと、
自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントと
を含む自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であって、
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＳＩＮ部位に実質的に相補的であり、
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ゲノム標的配列に実質的に相補的であり、
前記ＳＩＮ部位が、配列番号５３１３～５３１４からなる群から選択される配列を含む、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系。
（項目１３６）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を編集するための方法であって、項目１０２～１３５のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を投与するステップを含む、方法。
（項目１３７）
ＲＨＯ遺伝子内のＰ２３Ｈ変異を有する患者を処置するための方法であって、項目１０２～１３５のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を投与するステップを含む、方法。
（項目１３８）
項目１０２～１３５のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、遺伝子改変細胞。
（項目１３９）
古細菌細胞、細菌細胞、真核生物細胞、真核生物単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、項目１３８に記載の遺伝子改変細胞。
（項目１４０）
細胞においてＣａｓ９発現を制御する方法であって、前記細胞を、項目１０２～１３５のいずれか一項に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と接触させるステップを含む、方法。
（項目１４１）
常染色体優性網膜色素変性を有する患者を処置するための治療であって、項目１０２～１３５のいずれかに記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、治療。
（項目１４２）
ｉｎ ｖｉｖｏで常染色体優性網膜色素変性を有する患者を処置するためのキットであって、
項目１０２～１３５に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系と、
必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型と
を含む、キット。

Claims (29)

  1. 自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む組成物であって、前記自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、
    （ａ）Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含む第１のセグメント；
    （ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む第２のセグメントであって、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２８７～５２９１、５３１９～５３２２、及び５３５８の核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、第２のセグメント；および、
    （ｃ）自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む１つまたは複数の第３のセグメント
    を含み、
    前記ＳＩＮ部位は、
    （ｉ）５’ＳＩＮ部位が、前記Ｃａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流およびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の下流に位置し、または、
    （ｉｉ）５’ＳＩＮ部位が、前記Ｃａｓ９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の上流に位置し、かつ、
    （ｉｉｉ）３’ＳＩＮ部位が、前記Ｃａｓ９の前記ＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンもしくはキメラ挿入イントロン内に位置する、組成物。
  2. 前記Ｃａｓ９が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）またはその任意のバリアントである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記５’ＳＩＮ部位が、前記Ｃａｓ９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流およびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の下流に位置する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記５’ＳＩＮ部位が、前記Ｃａｓ９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の上流に位置する、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記Ｃａｓ９のＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンもしくはキメラ挿入イントロン内に位置する３’ＳＩＮ部位をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ＳＩＮ部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ＰＡＭが、ＮＮＧＲＲＴである、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ゲノム標的配列が、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子におけるＰ２３Ｈ変異である、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記第１のセグメントが、開始コドン、終止コドン、及びポリ（Ａ）終結部位をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記第１のセグメントおよび前記第３のセグメントが、第１のベクターにおいて共に提供され、前記第２のセグメントが、第２のベクターにおいて提供される、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記第１のセグメント、第２のセグメント、および第３のセグメントが、一つのベクターにおいて共に提供されている、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記第１のベクターが配列番号５３４１を含み、前記第２のベクターが配列番号５３３９を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記第１のベクターが配列番号５３４１を含み、前記第２のベクターが配列番号５３４０を含む、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記第１のベクターが配列番号５３４２を含み、前記第２のベクターが配列番号５３３９を含む、請求項１１に記載の組成物。
  15. 前記第１のベクターが配列番号５３４２を含み、前記第２のベクターが配列番号５３４０を含む、請求項１１に記載の組成物。
  16. 前記第３のセグメントが、１００ヌクレオチド未満の長さである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記第３のセグメントが、５０ヌクレオチド未満の長さである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、少なくとも１つの位置を除き、前記ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、少なくとも２つの位置を除き、前記ＳＩＮ部位のヌクレオチド配列に完全に相補的である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  20. プロモーターをコードする核酸配列が、前記第１のセグメントに作動可能に連結されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記プロモーターが、空間制限プロモーター、ｇＲＮＡもしくはｓｇＲＮＡを１つの方向に駆動させ、Ｃａｓ９を反対の方向に駆動させる二方向性プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記空間制限プロモーターが、任意の組織または細胞型特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、骨格筋特異的プロモーター、肺前駆細胞特異的プロモーター、光受容器特異的プロモーター、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）選択的プロモーターからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記第１のベクターおよび第２のベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１５に記載の組成物。
  24. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ５血清型キャプシドベクターである、請求項２３に記載の組成物。
  25. 自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む組成物であって、
    （ａ）Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、第１のセグメントと、
    （ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のセグメントであって、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０および配列番号５２９１を含む、第２のセグメントと、
    （ｃ）自己不活性化（ＳＩＮ）部位を含む、１つまたは複数の第３のセグメントと
    を含み、
    前記ＳＩＮ部位は、
    （ｉ）５’ＳＩＮ部位が、前記ＳａＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流およびＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の下流に位置し、または、
    （ｉｉ）５’ＳＩＮ部位が、前記ＳａＣａｓ９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）の上流に位置し、かつ、
    （ｉｉｉ）３’ＳＩＮ部位が、ＳａＣａｓ９のＯＲＦ内に位置する天然に存在するイントロンもしくはキメラ挿入イントロン内に位置し、
    前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＳＩＮ部位に相補的であり、
    前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ゲノム標的配列に相補的である、組成物。
  26. 前記５’ＳＩＮ部位が、配列番号５３００、５２８０、５３０１、または５２８１を含む、請求項２５に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む組成物。
  27. ヒト細胞におけるロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子を編集するための組成物であって、前記組成物が前記ヒト細胞に導入される、請求項１～１５、２５、および２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ヒト細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、請求項２７に記載の組成物。
  29. 常染色体優性網膜色素変性を処置するための医薬の調製における、請求項１～１５、２５および２６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
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