JP7522449B2 - Method and kit for controlling harmful arthropods that feed on plants - Google Patents
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Description
本発明は、植物体を食害する有害節足動物を防除する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and kit for controlling harmful arthropods that feed on plants.
有害節足動物防除の分野では、近年化学農薬に対する抵抗性系統の出現が大きな問題となっており、抵抗性を打破する新規防除技術の開発が望まれている。特に既存薬剤とは異なる作用点や作用機作をもつ薬剤の開発が求められている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、有害節足動物の特定の遺伝子発現だけを抑制するため、防除対象の有害節足動物だけを標的として周辺環境に対する影響が低い新防除技術として期待されている。しかし、有害節足動物は摂食による二本鎖ＲＮＡの取込み効率が著しく低いため、遺伝子組換えトウモロコシを用いた方法以外は実用化に至っていない。 In the field of harmful arthropod control, the emergence of strains resistant to chemical pesticides has become a major problem in recent years, and there is a demand for the development of new control technologies that can overcome resistance. In particular, there is a demand for the development of pesticides with different sites and mechanisms of action than existing pesticides. RNA interference (RNAi) suppresses only the expression of specific genes in harmful arthropods, and is therefore expected to be a new control technology that targets only the harmful arthropods being controlled and has little impact on the surrounding environment. However, because harmful arthropods have an extremely low efficiency of uptake of double-stranded RNA through ingestion, no method other than that using genetically modified corn has been put to practical use.
また、ＲＮＡ干渉を利用してｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを植物において発現させる技術として、宿主誘導遺伝子サイレンシング（Ｈｏｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ （ＨＩＧｓ））があるが（非特許文献１）、外来のｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを発現させる組換え植物を作出することになるため、規制により栽培が困難であったり、遺伝子組換え植物に抵抗感を覚えたりする人々には受け入れられにくかったりという問題が存在する。 In addition, there is a technique called host-induced gene silencing (HIGs) that uses RNA interference to express dsRNA/siRNA in plants (Non-Patent Document 1), but because it involves producing a recombinant plant that expresses foreign dsRNA/siRNA, there are problems with this technique, such as the difficulty of cultivating the plant due to regulations and the fact that it is difficult for people who are averse to genetically modified plants to accept it.
本発明は、遺伝子組換え植物の作出を必要とせず、ＲＮＡ干渉により効果的に有害節足動物を防除できる方法を提供することを目的とする。 The present invention aims to provide a method for effectively controlling harmful arthropods using RNA interference without the need to create genetically modified plants.
本発明者は、特定の３種類の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することにより、植物体においてＲＮＡ干渉により植物体を食害する有害節足動物を防除することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 The inventors discovered that by introducing siRNA that suppresses the expression of three specific types of genes into the cells of a plant that is the subject of damage or a bunker plant, it is possible to control harmful arthropods that damage the plant through RNA interference in the plant, and thus completed the present invention.
すなわち、本発明は、例えば、以下の発明を提供する。
［１］
植物体を食害する有害節足動物を防除する方法であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を有害節足動物の食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することを含む、方法。
［２］
上記溶液が、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、［１］に記載の方法。
［３］
上記溶液を上記植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することが、上記溶液を植物体の損傷部位より直接導入することである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
ｓｉＲＮＡを有害節足動物の食害対象の植物体又は天敵のバンカー植物体の細胞内に導入することで植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキットであって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、キット。
［５］
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、［４］に記載のキット。
［６］
ｓｉＲＮＡを食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することが、植物体の損傷部位より直接導入することである、［４］又は［５］に記載のキット。
［７］
すべてのｓｉＲＮＡを一つの混合溶液の形態で含む、［４］～［６］のいずれかに記載のキット。
That is, the present invention provides, for example, the following inventions.
[1]
A method for controlling harmful arthropods that damage plants, comprising the steps of:
A small double-stranded RNA (siRNA) that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod, or at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on a harmful arthropod;
An siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod;
The method comprises introducing a solution containing siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of the harmful arthropod into the cells of a plant body or a bunker plant body that is the target of feeding damage by the harmful arthropods.
[2]
The solution is
siRNA that suppresses at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod;
an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod;
The method according to [1], further comprising: siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase in a harmful arthropod.
[3]
The method according to [1] or [2], wherein introducing the solution into cells of the plant body or banker plant body is directly introducing the solution into a damaged site of the plant body.
[4]
A kit for controlling harmful arthropods that damage plants by introducing siRNA into cells of a plant that is a target of damage by the harmful arthropods or a banker plant that is a natural enemy,
A small double-stranded RNA (siRNA) that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod, or at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on a harmful arthropod;
An siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod;
A kit comprising an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase in a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod.
[5]
siRNA that suppresses at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod;
an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod;
The kit according to [4], further comprising an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase in a harmful arthropod.
[6]
The kit according to [4] or [5], wherein the siRNA is introduced into the cells of a plant body that is a target of damage or a banker plant body by directly introducing the siRNA into the cells of the plant body through a damaged site.
[7]
The kit according to any one of [4] to [6], comprising all of the siRNAs in the form of a single mixed solution.
本発明によれば、遺伝子組換え植物の作出を必要とせず、ＲＮＡ干渉により有害節足動物を防除できる方法を提供することができる。また、本発明によれば、ｓｉＲＮＡ溶液を植物に適用することにより、有害節足動物防除のタイミングの制御も可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a method for controlling harmful arthropods by RNA interference without the need to create genetically modified plants. In addition, according to the present invention, it is also possible to control the timing of controlling harmful arthropods by applying an siRNA solution to a plant.
［植物体を食害する有害節足動物を防除する方法］
本発明は一実施形態において、植物体を食害する有害節足動物を防除する方法（以下、「本防除方法」ともいう）であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、有害節足動物の食害対象の植物体又はバンカー植物体の細胞内に導入することを含む、方法を提供する。
[Method for controlling harmful arthropods that feed on plants]
In one embodiment, the present invention provides a method for controlling harmful arthropods that damage plants (hereinafter also referred to as the "control method"),
A small double-stranded RNA (siRNA) that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod, or at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on a harmful arthropod;
An siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod;
The method includes introducing a solution containing siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of the harmful arthropod into cells of a plant body or a bunker plant body that is the target of feeding damage by the harmful arthropods.
本防除方法は、有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、食害対象の植物体の細胞内に導入することで、例えば、有害節足動物の発育阻害若しくは致死が誘導され、当該植物体を食害対象とする有害節足動物を防除することができる。有害節足動物防除の効果は、例えば、成体（例えば、成虫）率の減少、有害節足動物（例えば、幼生又は成体、昆虫であれば幼虫又は成虫）の数の減少、有害節足動物の死骸の数の増加等によりはかることができる。 In this control method, a solution containing siRNA that suppresses at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of harmful arthropods, siRNA that suppresses the expression of a gene encoding an RNase in the harmful arthropods, and siRNA that suppresses the expression of a gene encoding a fatty acid synthase in the harmful arthropods is introduced into the cells of a plant body that is to be fed on, thereby, for example, inhibiting the growth or causing death of the harmful arthropods, thereby controlling the harmful arthropods that feed on the plant body. The effect of controlling harmful arthropods can be measured, for example, by a decrease in the adult (e.g., adult) rate, a decrease in the number of harmful arthropods (e.g., larvae or adults, or larvae or adults in the case of insects), an increase in the number of dead bodies of harmful arthropods, etc.
また、本防除方法は、天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、バンカー植物体の細胞内に導入することで、例えば、天敵節足動物の有害節足動物捕食能力を向上させ、天敵節足動物による捕食により有害節足動物を防除することもできる。天敵節足動物による捕食の効果は、例えば、有害節足動物（幼虫又は成虫）の数の減少によりはかることができる。 In addition, this control method can improve the ability of the natural enemy arthropods to prey on harmful arthropods by introducing into the cells of a bunker plant a solution containing siRNA that suppresses the expression of at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on harmful arthropods, siRNA that suppresses the expression of a gene encoding an RNA degrading enzyme in the natural enemy arthropod of the harmful arthropods, and siRNA that suppresses the expression of a gene encoding a fatty acid synthase in the natural enemy arthropod of the harmful arthropods, thereby controlling harmful arthropods through predation by the natural enemy arthropods. The effect of predation by the natural enemy arthropods can be measured, for example, by a reduction in the number of harmful arthropods (larvae or adults).
本明細書において、植物体は、特に制限されず、裸子植物又は被子植物であってもよく、単子葉植物又は双子葉植物であってもよく、果菜類、根菜類、葉菜類、穀物類、花き類等の農作物であってもよい。植物体としては、例えば、トマト、ピーマン、ジャガイモ、ナス等のナス科植物、キュウリ、カボチャ、メロン、スイカ等のウリ科植物、キャベツ、アブラナ、カブ、ダイコン、ワサビ、カリフラワー、クレソン、コマツナ、ハクサイ、タカナ、ブロッコリー、ミズナ等のアブラナ科植物、インゲンマメ、エダマメ、ダイズ、エンドウマメ、ソラマメ、アズキ、ラッカセイ、シロツメクサ等のマメ科植物、サツマイモ等のヒルガオ科植物、ネギ、ワケギ、ニンニク、タマネギ、ラッキョウ等のヒガンバナ科植物、イチゴ、バラ、ナシ、リンゴ、サクラ等のバラ科植物、ビート等のアカザ科植物、クワイ等のオモダカ科植物、ゴボウ、キクイモ、シュンギク、フキ、レタス、ヨモギ、キク等のキク科植物、サトイモ等のサトイモ科植物、ショウガ等のショウガ科植物、ニンジン、セリ、セルリー、パセリー、ミツバ等のセリ科植物、ヤマノイモ等のヤマノイモ科植物、ホウレンソウ等のヒユ科植物、ウド等のウコギ科植物、ミョウガ、ショウガ等のショウガ科植物、アスパラガス等のキジカクシ科植物、カーネーション等のナデシコ科植物、ウンシュウミカン等のミカン科植物、ブドウ等のブドウ科植物、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、モロコシ（ソルゴー）、エンバク等のイネ科植物、オオバコ等のオオバコ科植物、カタバミ、ムラサキカタバミ等のカタバミ科植物、ギシギシ等のタデ科植物、キスゲ等のススキノキ科植物、が挙げられる。有害節足動物の食害から防除する対象である植物体は、例えば、上記に挙げられた植物からなる群から選択されるものであってもよく、上記に挙げられた植物のうち、果菜類、根菜類、葉菜類、穀物類、花き類に該当する植物からなる群から選択されるものであってもよく、キュウリ、ナス、インゲン、ネギ、ピーマン、キャベツ、トマト、イチゴ、メロン、スイカ、ジャガイモ、サツマイモ、キク、カーネーション、イネ、麦、ミカン、及びブドウからなる群から選択されるものであってもよく、ウリ科植物であってもよい。また、植物体は遺伝子組み換え植物でない植物であってもよい。 In this specification, the plant body is not particularly limited and may be a gymnosperm or angiosperm, a monocotyledonous or dicotyledonous plant, or an agricultural crop such as fruit vegetables, root vegetables, leafy vegetables, grains, or ornamental plants. Examples of plants include solanaceae plants such as tomato, bell pepper, potato, and eggplant; gourd family plants such as cucumber, pumpkin, melon, and watermelon; cruciferous plants such as cabbage, rapeseed, turnip, radish, wasabi, cauliflower, watercress, komatsuna, Chinese cabbage, takana, broccoli, and mizuna; legumes such as kidney beans, edamame, soybeans, peas, broad beans, adzuki beans, peanuts, and white clover; convolvulaceae plants such as sweet potato; amaryllis family plants such as leeks, scallions, garlic, onions, and rakkyo; rose family plants such as strawberries, roses, pears, apples, and cherry blossoms; chenopodiaceae plants such as beets; Salamandaceae plants such as arrowhead; burdock, Jerusalem artichoke, garland chrysanthemum, butterbur, lettuce, and mugwort. , Asteraceae plants such as chrysanthemum, Araceae plants such as taro, Zingiberaceae plants such as ginger, Apiaceae plants such as carrot, Japanese parsley, celery, parsley, and mitsuba, Dioscoreaceae plants such as Chinese yam, Amaranthaceae plants such as spinach, Araliaceae plants such as Araliaceae, Zingiberaceae plants such as myoga and ginger, Asparagaceae plants such as asparagus, Caryophyllaceae plants such as carnation, Rutaceae plants such as Satsuma mandarin, Vitaceae plants such as grapes, Poaceae plants such as rice, wheat, barley, rye, oats, sorghum (sorghum), and oats, Plantagoceae plants such as plantain, Oxalidaceae plants such as wood sorrel and purple wood sorrel, Polygonaceae plants such as Rumex dock, and Hemerocallis family plants such as Hemerocallis sedge. The plant body to be protected from damage caused by harmful arthropods may be, for example, one selected from the group consisting of the plants listed above, or may be one selected from the group consisting of fruit vegetables, root vegetables, leafy vegetables, grains, and ornamental plants among the plants listed above, or may be one selected from the group consisting of cucumber, eggplant, green bean, leek, bell pepper, cabbage, tomato, strawberry, melon, watermelon, potato, sweet potato, chrysanthemum, carnation, rice, wheat, mandarin orange, and grape, or may be a Cucurbitaceae plant. The plant body may also be a non-genetically modified plant.
バンカー植物体とは、おとり植物とも呼ばれ、天敵節足動物を温存するために防除対象である植物の周囲に植える植物を意味する。バンカー植物体としては、例えば、ソルゴー、オオバコ、エンバク、ヨモギ、ギシギシ、キスゲ、シロツメクサ等が挙げられる。 A bunker plant, also known as a decoy plant, is a plant that is planted around a target plant to preserve its natural enemies. Examples of bunker plants include sorghum, plantain, oats, mugwort, dock, hemerocallis, and white clover.
ｓｉＲＮＡを含む溶液を細胞内に導入する植物体の器官は、特に制限されず、例えば、葉、茎、蕾、根、花又は実であってよく、これらの組み合わせであってもよい。 The organ of the plant into which the solution containing siRNA is introduced is not particularly limited, and may be, for example, a leaf, stem, bud, root, flower, or fruit, or a combination of these.
本明細書において、植物体を食害する有害節足動物は、植物体を食害する昆虫類、甲殻類、クモ類、ムカデ類等が含まれる。食害する植物体の器官は特に限定されず、害虫の種類によって異なるが、例えば、葉、茎、蕾、根、花又は実であってよい。また、害虫の食害の形態も害虫の種類のよって異なるが、例えば、植物体の器官を直接食する形態、及び植物の器官を吸汁する形態が挙げられる。例えば、後述するチョウ目昆虫の幼虫は、直接植物体の器官をかじって食べる昆虫であるが、アザミウマ目昆虫、カメムシ目昆虫及びアブラムシ類昆虫は植物の器官に口針を突き刺して中身を吸汁する形態で植物体を食害する吸汁性昆虫である。本実施形態の防除方法は、植物体の細胞内にｓｉＲＮＡを導入する方法であるため、ＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ＲＮＡ等の植物体の表面への散布では効果が期待できない吸汁性昆虫に対しても防除効果を発揮できる。 In this specification, harmful arthropods that damage plants include insects, crustaceans, spiders, centipedes, etc. that damage plants. The organs of the plant that are damaged are not particularly limited and may be, for example, leaves, stems, buds, roots, flowers, or fruits, although they may vary depending on the type of pest. The form of damage caused by the pest also varies depending on the type of pest, but examples include a form in which the pest directly eats the organs of the plant, and a form in which the pest sucks the sap from the organs of the plant. For example, the larvae of Lepidoptera insects described later are insects that directly bite and eat the organs of the plant, while Thripidae insects, Hemiptera insects, and Aphid insects are sap-sucking insects that damage plants by piercing their stylets into the organs of the plant and sucking the sap from the inside. The control method of this embodiment is a method of introducing siRNA into the cells of the plant, and therefore can exert a control effect even against sap-sucking insects that cannot be expected to be effective by spraying double-stranded RNA that induces RNA interference on the surface of the plant.
植物体を食害する有害節足動物としては、例えば、ミカンキイロアザミウマ、ミナミキイロアザミウマ及びネギアザミウマ等のアザミウマ目昆虫、カメムシ目昆虫、モモアカアブラムシ及びワタアブラムシ等のアブラムシ類昆虫、ツマグロヨコバイ等のヨコバイ類昆虫、トビイロウンカ及びセジロウンカ等のウンカ類昆虫、チャバネアオカメムシ及びホソヘリカメムシ等のカメムシ類昆虫、オンシツコナジラミ等のコナジラミ類昆虫、コナガ、ヨトウムシ、ハスモンヨトウ、シロイチモジヨトウ、コドリンガ、ボールワーム、タバコバッドワーム、マイマイガ、タバコガ及びスズメガ等のチョウ目昆虫、コロラドハムシ、ウリハムシ、アリモドキゾウムシ、マメコガネ及びニジュウヤホシテントウ等のコウチュウ目昆虫、トノサマバッタ及びサバクトビバッタ等のバッタ目昆虫、ハナバエ及びハモグリバエ等のハエ目昆虫、ハキリアリ及びハバチ等のハチ目昆虫、並びにナミハダニ等のダニ類等が挙げられる。防除対象となる植物体を食害する有害節足動物は、例えば、上記に挙げられた種からなる群から選択されるものであってもよく、アザミウマ目昆虫であってもよい。 Examples of harmful arthropods that feed on plants include thrips insects of the order Thripidae, such as western flower thrips, southern melanogaster, and onion thrips, Hemiptera insects, aphid insects such as the green peach aphid and the cotton aphid, leafhopper insects such as the green rice leafhopper, planthopper insects such as the brown planthopper and the white-backed planthopper, stinkbug insects such as the German winged green bug and the narrow-backed stinkbug, whitefly insects such as the greenhouse whitefly, diamondback moth, and cutworms. , Spodoptera insects such as Spodoptera litura, Spodoptera exigua, Codling moth, Ball worm, Tobacco budworm, Gypsy moth, Tobacco budworm, and Sphinx moth, Coleoptera insects such as Colorado potato beetle, Cucumber beetle, Sweet potato weevil, Japanese beetle, and 20-spotted ladybird beetle, Orthoptera insects such as Migratory locust and Desert locust, Diptera insects such as Flower fly and Leafminer, Hymenoptera insects such as Leafcutter ants and Sawflies, and Mites such as Two-spotted spider mite. Harmful arthropods that feed on plants to be controlled may be, for example, those selected from the group consisting of the above-mentioned species, or may be Thripidae insects.
植物体を食害する昆虫の天敵節足動物には、昆虫類、甲殻類、クモ類及びムカデ類等が含まれ、防除すべき有害節足動物の種類から適宜選択することができる。例えば、ハナカメムシ科に属する種、カスミカメムシ科に属する雑食性の種、ナガカメムシ科に属する種、サシガメ科に属する種、寄生バチ下目に属する種、ヤドリバエ科に属する種、ヒラタアブ亜科に属する種、テントウムシ科に属する肉食性の種、及びダニ目に属する肉食性の種は好適な天敵である。いずれの天敵を使用するかは、防除すべき対象生物の種類により適宜定まる。例えば、アザミウマ目やアブラムシ上科に属する種の天敵としては、ハナカメムシ科に属する種が挙げられる。特にアザミウマ目に属する種の天敵としては、ヒメハナカメムシ属に属する種、例えば、タイリクヒメハナカメムシ、ナミヒメハナカメムシ、コヒメハナカメムシ、ツヤヒメハナカメムシ、ミナミヒメハナカメムシ、シノビハナカメムシ、トリスチコロルヒメハナカメムシ又はオウシュウヒメハナカメムシが好適な天敵昆虫となる。また、アブラムシ上科に属する種やカイガラムシ上科に属する種の天敵としては、テントウムシ科に属する肉食性の種、例えば、ナミテントウ、フタモンテントウ、ナナホシテントウ、ダンダラテントウ、アカホシテントウ、ヒメアカホシテントウ、ヒメカメノコテントウ、オオテントウ、ヨツボシテントウ、ベダリアテントウ、アカヘリテントウ、ベニヘリテントウ又はシロジュウシホシテントウが好適な天敵昆虫となる。さらに、ハダニ科に属する種やアザミウマ目に属する種の天敵としては、カブリダニ科に属する種、例えば、スワルスキーカブリダニ、ミヤコカブリダニ、ケナガカブリダニ、ニセラーゴカブリダニ、ククメリスカブリダニ、キイカブリダニ、ヘアカブリダニ又はチリカブリダニが好適な天敵節足動物となる。また、ハダニ科に属する種、アザミウマ目に属する種及びアブラムシ上科に属する種のいずれにも好適な天敵節足動物としては、ナガカメムシ科に属する種、例えば、オオメカメムシが挙げられる。そして、コナジラミ科に属する種の天敵としては、カスミカメムシ科に属する種、例えば、タバコカスミカメ、クロヒョウタンカスミカメ又はコミドリチビトビカスミカメが好適な天敵昆虫となる。天敵昆虫は、例えば、上記に挙げられた種からなる群から選択されるものであってもよく、例えば、ヒメハナカメムシ属に属する種、カスミカメムシ科に属する種及びテントウムシ科に属する肉食性の種からなる群から選択されてもよく、ヒメハナカメムシ、タバコカスミカメ及びヒメカメノコテントウからなる群から選択されてもよい。 Natural enemies of insects that damage plants include insects, crustaceans, spiders, centipedes, etc., and can be appropriately selected from the type of harmful arthropod to be controlled. For example, species belonging to the family Anthocoridae, omnivorous species belonging to the family Miridae, species belonging to the family Lygaebuidae, species belonging to the family Triatominae, species belonging to the family Triatominae, species belonging to the infraorder Parasitoides, species belonging to the family Tachinidae, species belonging to the subfamily Carnivora, carnivorous species belonging to the family Coccinellidae, and carnivorous species belonging to the order Acarinae are suitable natural enemies. Which natural enemy to use is appropriately determined depending on the type of target organism to be controlled. For example, natural enemies of species belonging to the order Thripidae and the superfamily Aphidoidea include species belonging to the family Anthocoridae. In particular, as natural enemies of species belonging to the order Thrips, species belonging to the genus Anthocorax, for example, Orius strifei, Orius unicornis, Orius nigricans, Orius nigricans, Orius shinii, Orius serrata, Orius shinobii, Orius tristicolobus, and Orius europaea, are suitable natural enemy insects. As natural enemies of species belonging to the superfamily Aphidoidea and the superfamily Coccoidea, carnivorous species belonging to the family Coccinellidae, such as the two-spotted ladybird, the seven-spotted ladybird, the seven-spotted ladybird, the red-spotted ladybird, the small red-spotted ladybird, the small tortoiseshell ladybird, the large ladybird, the four-spotted ladybird, the bedlily ladybird, the red-spotted ladybird, the red-spotted ladybird, or the white-spotted ladybird, are suitable natural enemy insects. Furthermore, as natural enemies of species belonging to the family Tetranychidae and the order Thripidae, species belonging to the family Phytoseiidae, such as Phytoseiidae Swirlskii, Phytoseiidae Miyako, Phytoseiidae N. womersleyi, Phytoseiidae serrago, Phytoseiidae cucumeris, Phytoseiidae keratinosaurus, Phytoseiidae trichomes, or Phytoseiidae persimmons are suitable natural enemy arthropods. In addition, as a suitable natural enemy arthropod for any of the species belonging to the family Tetranychidae, the order Thripidae, and the superfamily Aphidoidea, there is a species belonging to the family Lygaeoidea, such as the large-headed stink bug. As a natural enemy for the species belonging to the family Aleyrodidae, there is a species belonging to the family Miridae, such as the tobacco mirid bug, the black gourd mirid bug, or the small green mirid bug. The natural enemy insect may be, for example, one selected from the group consisting of the species listed above, and may be, for example, one selected from the group consisting of the species belonging to the genus Anthocorax, the family Miridae, and the carnivorous species belonging to the family Coccinellidae, or may be selected from the group consisting of the pleurotus stink bug, the tobacco mirid bug, and the pleurotus pedunculata.
本防除方法は、標的とする遺伝子（標的遺伝子）の転写産物の分解を介してその遺伝子の発現を抑制する配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングであるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ））を利用した防除方法である。 This control method utilizes RNA interference (RNAi), a sequence-specific post-transcriptional gene silencing technique that suppresses the expression of a target gene through degradation of the transcription product of that gene.
低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））は、標的遺伝子の塩基配列の一部に相当する塩基配列で構成されるセンス鎖（パッセンジャー鎖）、及びそのアンチセンス鎖（ガイド鎖）からなる小分子二本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）である。ｓｉＲＮＡを真核細胞に導入することによってＲＮＡ干渉を誘導することができる。ｓｉＲＮＡの長さは通常１８～２５ヌクレオチド長（ｂｐ）である。例えば、ｓｉＲＮＡは、発現を抑制する遺伝子の部分配列と同一の塩基配列で構成されるｓｉＲＮＡであってもよい。 Small interference RNA (siRNA) is a small double-stranded ribonucleic acid (RNA) consisting of a sense strand (passenger strand) whose base sequence corresponds to a part of the base sequence of a target gene, and its antisense strand (guide strand). RNA interference can be induced by introducing siRNA into eukaryotic cells. The length of siRNA is usually 18 to 25 nucleotides (bp). For example, siRNA may be an siRNA consisting of a base sequence identical to a partial sequence of a gene whose expression is suppressed.
本防除方法における有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて公知の方法により設計することができる。例えば、Ｋｏｓｔｅｒにより開発された「亜りん酸トリエステル法」等が挙げられる。 The siRNA that suppresses gene expression in harmful arthropods or the natural enemies of harmful arthropods in this control method can be designed by known methods based on the nucleotide sequence of the target gene. For example, the "phosphite triester method" developed by Koster can be used.
本防除方法は、上記特定の３種類の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを準備する工程、及び／又は上記特定の３種類の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを混合する工程をさらに含んでもよい。上記混合する工程は、乾燥状態で行われてもよく、溶液中で行われてもよい。ｓｉＲＮＡは、例えば、以下のように設計することができる。標的遺伝子のセンス鎖の塩基配列として、１５～３５塩基等の連続した塩基配列を選択領域として選択する。アンチセンス鎖の塩基配列は、選択したセンス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列とする。センス鎖の選択領域は、標的遺伝子において特異的な配列であれば特に限定されない。ｓｉＲＮＡの設計は、ウェブサイト上でも多数公開されており、標的遺伝子の塩基配列を入力すれば、有効且つ適切なｓｉＲＮＡをウェブ上で設計することができる。ｓｉＲＮＡの一方の末端又は両末端には、標的遺伝子の塩基配列又はそれに相補的な塩基配列とは関連しない一以上のＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は核酸類似体からなる塩基配列が存在していてもよい。このようなｓｉＲＮＡの末端に存在する塩基数は、特に限定はしないが、１～２０個の範囲内であることが好ましい。具体的には、例えば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖側及びｓｉＲＮＡアンチセンス鎖側の３’末端側にＴＴ（チミン‐チミン）又はＵＵ（ウラシル‐ウラシル）等を付加する場合が挙げられる。設計したｓｉＲＮＡは、、当該技術分野における公知の化学合成（例えば、ホスホロアミダイト法）により合成することができる。 The control method may further include a step of preparing an siRNA that suppresses the expression of the three specific genes, and/or a step of mixing the siRNA that suppresses the expression of the three specific genes. The mixing step may be performed in a dry state or in a solution. The siRNA can be designed, for example, as follows. A continuous base sequence of 15 to 35 bases or the like is selected as the selected region as the base sequence of the sense strand of the target gene. The base sequence of the antisense strand is a base sequence complementary to the base sequence of the selected sense strand. The selected region of the sense strand is not particularly limited as long as it is a sequence specific to the target gene. Many siRNA designs are also published on websites, and effective and appropriate siRNA can be designed on the web by inputting the base sequence of the target gene. At one end or both ends of the siRNA, a base sequence consisting of one or more DNA, RNA, and/or nucleic acid analogs that is not related to the base sequence of the target gene or a base sequence complementary thereto may be present. The number of bases present at the end of such an siRNA is not particularly limited, but is preferably within the range of 1 to 20. Specifically, for example, TT (thymine-thymine) or UU (uracil-uracil) may be added to the 3'-end of the sense strand of the siRNA and the 3'-end of the antisense strand of the siRNA. The designed siRNA can be synthesized by chemical synthesis known in the art (e.g., the phosphoramidite method).
また、標的遺伝子の全体又は部分配列に対する二本鎖ＲＮＡを（例えば、インビトロ転写により）合成し、合成した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用することもできる。本防除方法において、各標的遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとして、このように準備されたｓｉＲＮＡ混合物の形で用いることもできる。標的遺伝子の部分配列は、標的遺伝子の種類及び遺伝子のＤＮＡの長さにもよるが、例えば、２００ｂｐ～１０００ｂｐ又は３００ｂｐ～６００ｂｐであってよい。標的遺伝子の全体又は部分配列に対する二本鎖ＲＮＡは、例えば、標的遺伝子の全体又は部分配列のオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして、インビトロ転写システムにより合成することができる。このような二本鎖ＲＮＡ合成のための市販キット、例えば、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してもよい。合成した二本鎖ＲＮＡを、ランダムに短く切断する二本鎖ＲＮＡ切断酵素としては、例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ及びＤｉｃｅｒが挙げられる。このような二本鎖ＲＮＡをランダムに短く切断するための市販キット、例えば、ＳｈｏｒｔＣｕｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩを使用してもよい。得られた様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物に含まれるｓｉＲＮＡの長さは、例えば、１８ｂｐ～２５ｂｐであってよい。 It is also possible to use a mixture of siRNAs with various sequences obtained by synthesizing double-stranded RNA (dsRNA) for the entire or partial sequence of a target gene (for example, by in vitro transcription) and randomly cleaving the synthesized double-stranded RNA (dsRNA) with a double-stranded RNA cleavage enzyme. In this control method, the siRNA for suppressing the expression of each target gene can be used in the form of a siRNA mixture prepared in this way. The partial sequence of the target gene may be, for example, 200 bp to 1000 bp or 300 bp to 600 bp, depending on the type of target gene and the length of the DNA of the gene. The double-stranded RNA for the entire or partial sequence of a target gene can be synthesized, for example, by an in vitro transcription system using an oligonucleotide of the entire or partial sequence of the target gene as the template DNA. A commercially available kit for synthesizing such double-stranded RNA, for example, T7 RiboMAX (trademark) Express RNAi System (Promega), may be used. Examples of double-stranded RNA cleaving enzymes that randomly cleave the synthesized double-stranded RNA into short lengths include RNase III and Dicer. Commercially available kits for randomly cleaving such double-stranded RNA into short lengths, such as ShortCut (registered trademark) RNase III, may also be used. The length of the siRNA contained in the resulting mixture of siRNAs with various sequences may be, for example, 18 bp to 25 bp.
本防除方法において、ｓｉＲＮＡにより発現が抑制される少なくとも３種の標的遺伝子は、有害節足動物の発育、生存、発生及び／若しくは生殖に関与する遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する遺伝子と、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子と、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子である。 In this control method, the at least three target genes whose expression is suppressed by siRNA are genes involved in the growth, survival, development and/or reproduction of harmful arthropods, or genes involved in the ability of natural enemy arthropods to prey on harmful arthropods, genes encoding RNA-degrading enzymes of harmful arthropods or natural enemy arthropods of harmful arthropods, and genes encoding fatty acid synthases of harmful arthropods or natural enemy arthropods of harmful arthropods.
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する遺伝子としては、例えば、抑制することで有害節足動物の発育阻害若しくは致死を誘導又は増殖を抑制する遺伝子が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、アポトーシス阻害遺伝子、解毒酵素遺伝子、神経ペプチド及びその受容体をコードする遺伝子、液胞型ＡＴＰａｓｅ（Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）サブユニットをコードする遺伝子、リボソームタンパク質の構造サブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子、膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子は、アポトーシス阻害遺伝子、解毒酵素遺伝子、神経ペプチド及びその受容体をコードする遺伝子、液胞型ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする遺伝子、リボソームタンパク質の構造サブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子、並びに膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子であってよい。 Examples of genes involved in the growth, survival, development and/or reproduction of harmful arthropods include genes that, when inhibited, induce growth inhibition or death or inhibit the growth of harmful arthropods. Examples of such genes include apoptosis inhibitor genes, detoxification enzyme genes, genes encoding neuropeptides and their receptors, genes encoding vacuolar ATPase (V-ATPase) subunits, genes encoding proteins that are structural subunits of ribosomal proteins, and genes encoding proteins that are subunits of multimeric complexes that form membrane vesicles. At least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of harmful arthropods may be one or more genes selected from the group consisting of apoptosis inhibitor genes, detoxification enzyme genes, genes encoding neuropeptides and their receptors, genes encoding vacuolar ATPase subunits, genes encoding proteins that are structural subunits of ribosomal proteins, and genes encoding proteins that are subunits of multimeric complexes that form membrane vesicles.
アポトーシス阻害遺伝子は、細胞死を阻害する遺伝子であり、発現を抑制すると細胞死が起こり、発育阻害又は致死が誘導される。アポトーシス阻害遺伝子としては、例えば、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ １（ＩＡＰ１）及びＩｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ２（ＩＡＰ２）が挙げられる。本防除方法において、アポトーシス阻害遺伝子は、ＩＡＰ１又はＩＡＰ２を含んでもよく、ＩＡＰ１及びＩＡＰ２の両方を含んでもよい。 An apoptosis inhibitor gene is a gene that inhibits cell death, and suppressing its expression causes cell death, leading to growth inhibition or lethality. Examples of apoptosis inhibitor genes include Inhibitor of apoptosis 1 (IAP1) and Inhibitor of apoptosis 2 (IAP2). In this control method, the apoptosis inhibitor gene may include IAP1 or IAP2, or may include both IAP1 and IAP2.
解毒酵素遺伝子は、生体外異物の解毒代謝を担う。例えば、植物防御物質及び殺虫剤等の薬剤に対して解毒作用を持つ酵素の遺伝子が含まれ、具体例としては、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）遺伝子が挙げられる。例えば、解毒酵素ＣＹＰ６ｋ１は、ネギアザミウマで薬剤抵抗性に関与することが知られている。 Detoxification enzyme genes are responsible for the detoxification metabolism of foreign substances. For example, they include genes for enzymes that have a detoxifying effect on plant defense substances and chemicals such as insecticides, and a specific example is the cytochrome P450 (CYP) gene. For example, the detoxification enzyme CYP6k1 is known to be involved in chemical resistance in onion thrips.
神経ペプチド及びその受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体に作用するニューロンによって生成される小さなタンパク質であり、シナプス伝達の遅発性で長期的な調節を担うペプチドとその受容体である。神経ペプチド及びその受容体としては、例えば、神経ペプチドＣＡＰＡ受容体（ｃａｐａＲ）、脱皮行動誘導ホルモン（Ｅｃｄｙｓｉｓ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ（ＥＴＨ））及びその受容体（ＥＴＨＲ）の遺伝子が挙げられる。ｃａｐａＲは、昆虫の水分調節に関わる遺伝子であり、抑制することで昆虫が干からびて死亡する。また、ＥＴＨ及びＥＴＨＲは、脱皮及び変態を誘導する遺伝子であり、抑制することで脱皮及び変態が抑制されるため、昆虫の発育阻害若しくは致死が誘導される。実際に、ＲＮＡ干渉によりＥＴＨ及びＥＴＨＲの発現を抑制することでミカンキイロアザミウマが致死したことが報告されている（特開２０１７－１３１２０１）。 Neuropeptides and their receptors are small proteins produced by neurons that act on G protein-coupled receptors, and are peptides and their receptors that are responsible for delayed and long-term regulation of synaptic transmission. Examples of neuropeptides and their receptors include the neuropeptide CAPA receptor (capaR), the ecdysis triggering hormone (ETH) and its receptor (ETHR) genes. capaR is a gene involved in water regulation in insects, and suppression of this gene causes the insect to dry out and die. In addition, ETH and ETHR are genes that induce molting and metamorphosis, and suppression of these genes inhibits molting and metamorphosis, thereby inducing growth inhibition or lethality of the insect. In fact, it has been reported that suppressing the expression of ETH and ETHR by RNA interference caused lethality in western flower thrips (Patent Publication No. 2017-131201).
液胞型ＡＴＰａｓｅ（Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）サブユニットとしては、例えば、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ－Ｂ（ｖａｓｃｕｏｌａｒ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｂ）が挙げられる。実際に、この遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することでミカンキイロアザミウマが致死することが報告されている。 An example of a vacuolar ATPase (V-ATPase) subunit is V-ATPase-B (vascular ATP synthase subunit B). In fact, it has been reported that suppressing the expression of this gene by RNAi is lethal to western flower thrips.
タンパク質合成に関与する構造成分であるリボソームタンパク質としては、例えば、細胞質のリボソーム小サブユニットの成分であるＳ４（ＲｐＳ４）及びＳ９（ＲｐＳ９）、リボソームに局在するＬ９およびＬ１９等が挙げられる。 Ribosomal proteins, which are structural components involved in protein synthesis, include, for example, S4 (RpS4) and S9 (RpS9), which are components of the small cytoplasmic ribosomal subunit, and L9 and L19, which are localized in the ribosome.
膜小胞膜を形成する多量体複合体のサブユニットであるタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、β－ｃｏａｔａｍｅｒ遺伝子が挙げられる。 An example of a gene that encodes a protein that is a subunit of a multimeric complex that forms a membrane vesicle is the β-coatamer gene.
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子は、例えば、ＩＡＰ１をコードする遺伝子、ＩＡＰ２をコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）をコードする遺伝子、Ｐ－４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子、ｃａｐａＲをコードする遺伝子、ＥＴＨをコードする遺伝子、ＥＴＨＲをコードする遺伝子、Ｖ－ＡＴＰａｓｅサブユニットをコードする遺伝子、ＲｐＳ４をコードする遺伝子、ＲｐＳ９をコードする遺伝子、β－ｃｏａｔａｍｅｒをコードする遺伝子、ニトロフェリン２をコードする遺伝子、カルボキシエステラーゼをコードする遺伝子、フェロモン結合タンパク質をコードする遺伝子、及びＴｓｅｔｓｅＥＰをコードする遺伝子からなる群から選択されてもよく、ＩＡＰ１をコードする遺伝子、ＩＡＰ２をコードする遺伝子及びシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）をコードする遺伝子からなる群から選択されてもよい。
At least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod may be selected from the group consisting of, for example, a gene encoding IAP1, a gene encoding IAP2, a gene encoding cytochrome P450 (CYP), a gene encoding P-450 monooxygenase, a gene encoding capaR, a gene encoding ETH, a gene encoding ETHR, a gene encoding a V-ATPase subunit, a gene encoding RpS4, a gene encoding RpS9, a gene encoding β-coatamer, a
ミナミキイロアザミウマのＩＡＰ１遺伝子の配列としては、配列番号１に示される配列が挙げられ、ミナミキイロアザミウマのＩＡＰ２遺伝子の配列としては、配列番号２に示される配列が挙げられる。ＩＡＰ１遺伝子は、配列番号１に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ＩＡＰ２遺伝子は、配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。上述した、ｄＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する場合、ｄｓＲＮＡの合成に使用するＩＡＰ１遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ｄｓＲＮＡの合成に使用するＩＡＰ２遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号７に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。また、合成されたｄｓＩＡＰ１遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１１に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよく、合成されたｄｓＩＡＰ２遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１２に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。 An example of the sequence of the IAP1 gene of Thrips palmi is the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and an example of the sequence of the IAP2 gene of Thrips palmi is the sequence shown in SEQ ID NO: 2. The IAP1 gene may comprise a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the IAP2 gene may comprise a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 2. When using a mixture of siRNAs having various sequences obtained by randomly cleaving dRNA with a double-stranded RNA cleaving enzyme as described above, a partial sequence of the IAP1 gene used to synthesize dsRNA may comprise, for example, a polynucleotide having a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO:6, and a partial sequence of the IAP2 gene used to synthesize dsRNA may comprise, for example, a polynucleotide having a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO:7. The synthesized dsRNA of the dsIAP1 gene may contain a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the synthesized dsRNA of the dsIAP2 gene may contain a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 12.
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。 The at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of harmful arthropods may be selected from a plurality of genes, or may be at least two genes. In the case of a plurality of genes, the siRNA that suppresses the expression of the at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of harmful arthropods may be an siRNA that simultaneously suppresses a plurality of genes, or may be an siRNA that suppresses each of the genes.
天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の天敵昆虫の脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を、食害対象のバンカー植物体の細胞内に導入することで、例えば、天敵節足動物の有害節足動物捕食能力を向上させ、天敵節足動物による捕食により植物体を食害する有害節足動物を防除することができる。天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する遺伝子としては、例えば、抑制することで有害節足動物捕食能力を向上する天敵節足動物の遺伝子が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、抑制することで天敵節足動物の食性を肉食に変更する遺伝子、及び抑制することで天敵節足動物の食欲を高める遺伝子が挙げられる。 By introducing a solution containing siRNA that suppresses the expression of at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on harmful arthropods, siRNA that suppresses the expression of a gene encoding an RNA degrading enzyme of a natural enemy arthropod of the harmful arthropods, and siRNA that suppresses the expression of a gene encoding a fatty acid synthase of a natural enemy insect of the harmful arthropods into the cells of a bunker plant body to be preyed on, for example, it is possible to improve the ability of the natural enemy arthropod to prey on harmful arthropods and to control harmful arthropods that prey on plants by predation by the natural enemy arthropods. Examples of genes involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on harmful arthropods include genes of natural enemy arthropods that improve the ability to prey on harmful arthropods when suppressed. Examples of such genes include genes that change the feeding habits of a natural enemy arthropod to carnivorous when suppressed, and genes that increase the appetite of a natural enemy arthropod when suppressed.
有害節足動物防除に天敵を使う上では、最初から有害節足動物ばかり食べる天敵では維持が大変である。そこで、普段は天敵節足動物には、バンカー植物とよばれる作物の近くにある植物を食べさせ増殖させる。例えば、植物を食害する有害節足動物が当該植物において増殖し出したところで、バンカー植物の細胞内にｓｉＲＮＡを導入することで天敵節足動物の食性を肉食に変更したり、天敵節足動物を飢餓状態にさせたりすることで、天敵節足動物の有害節足動物捕食能力を向上することが期待できる。抑制することで天敵節足動物の食性を肉食に変更する遺伝子としては、例えば、植物成分を受容する味覚受容体遺伝子が挙げられる。植物成分を受容する味覚受容体遺伝子の発現を抑制することにより、草食から肉食（アザミウマやアブラムシ等の害虫）へと食性の好みを変化することが考えられる。また、抑制することで天敵節足動物を飢餓状態にする遺伝子としては、例えば、インシュリン様ペプチド遺伝子が挙げられる。インシュリン様ペプチド遺伝子の発現を抑制することで昆虫を飢餓状態にさせ、食欲を高めることができることがショウジョウバエで報告されている。 When using natural enemies to control harmful arthropods, it is difficult to maintain a natural enemy that only eats harmful arthropods from the beginning. Therefore, natural enemy arthropods are usually fed on plants near crops called bunker plants to multiply. For example, when harmful arthropods that damage plants begin to multiply on the plants, it is expected that the natural enemy arthropod's ability to prey on harmful arthropods can be improved by introducing siRNA into the cells of the bunker plant to change the feeding habits of the natural enemy arthropods to carnivorous or by starving the natural enemy arthropods. An example of a gene that changes the feeding habits of the natural enemy arthropods to carnivorous by suppressing it is a taste receptor gene that receives plant components. It is thought that by suppressing the expression of a taste receptor gene that receives plant components, the feeding preference can be changed from herbivorous to carnivorous (pests such as thrips and aphids). In addition, an example of a gene that starves the natural enemy arthropods by suppressing it is an insulin-like peptide gene. It has been reported in fruit flies that suppressing the expression of insulin-like peptide genes can starve insects and increase their appetite.
本防除方法は、天敵の有害節足動物捕食能力向上のタイミングをコントロールできるという利点を有する。例えば、天敵の有害節足動物捕食能力向上する遺伝子を導入した組換え植物体を用いる場合には、最初から天敵の有害節足動物捕食能力が向上されることとなり、望ましいタイミングで天敵の有害節足動物捕食能力を向上させるということは困難である。 This control method has the advantage that it is possible to control the timing of the improvement of the natural enemy's ability to prey on harmful arthropods. For example, when using a recombinant plant body into which a gene that improves the natural enemy's ability to prey on harmful arthropods is introduced, the natural enemy's ability to prey on harmful arthropods is improved from the start, making it difficult to improve the natural enemy's ability to prey on harmful arthropods at the desired timing.
天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。 The at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on harmful arthropods may be selected from multiple sources, or may be at least two genes. In the case of multiple genes, the siRNA that suppresses the expression of the at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on harmful arthropods may be an siRNA that simultaneously suppresses multiple genes, or may be an siRNA that suppresses each of the genes.
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）をコードする遺伝子としては、例えば、ｄｓＲＮａｓｅ１及びｄｓＲＮａｓｅ２が挙げられる。これらの遺伝子は、消化管等で二本鎖ＲＮＡを分解する作用を持つ。 Examples of genes encoding RNA-degrading enzymes (RNases) of harmful arthropods or of arthropods that are natural enemies of harmful arthropods include dsRNase1 and dsRNase2. These genes have the ability to degrade double-stranded RNA in the digestive tract, etc.
ミナミキイロアザミウマのｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子の配列としては、配列番号３に示される配列が挙げられ、ミナミキイロアザミウマのｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子の配列としては、配列番号４に示される配列が挙げられる。ｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子は、配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子は、配列番号４に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。上述した、ｄＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する場合、ｄｓＲＮＡの合成に使用するｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号８に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよく、ｄｓＲＮＡの合成に使用するｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号９に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。また、合成されたｄｓＲＮａｓｅ１遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１３に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよく、合成されたｄｓＲＮａｓｅ２遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１４に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。 An example of the sequence of the dsRNase1 gene of Thrips palmi is the sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an example of the sequence of the dsRNase2 gene of Thrips palmi is the sequence shown in SEQ ID NO: 4. The dsRNase1 gene may comprise a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the dsRNase2 gene may comprise a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 4. When using a mixture of siRNAs with various sequences obtained by randomly cleaving dRNA with a double-stranded RNA cleaving enzyme as described above, a partial sequence of the dsRNase1 gene used to synthesize dsRNA may comprise, for example, a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to the sequence shown in SEQ ID NO:8, and a partial sequence of the dsRNase2 gene used to synthesize dsRNA may comprise, for example, a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to the sequence shown in SEQ ID NO:9. The synthesized dsRNA of the dsRNase1 gene may include a polynucleotide having a sequence that has at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 13, and the synthesized dsRNA of the dsRNase2 gene may include a polynucleotide having a sequence that has at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 14.
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子は、ｄｓＲＮａｓｅ１、ｄｓＲＮａｓｅ２又はこれらの組み合わせを含んでよい。 The at least one gene encoding an RNA-degrading enzyme of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod may be selected from a plurality of genes, or may be at least two genes. In the case of a plurality of genes, the siRNA that suppresses the expression of the at least one gene encoding an RNA-degrading enzyme of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod may be an siRNA that suppresses a plurality of genes simultaneously, or may be an siRNA that suppresses each gene. The at least one gene encoding an RNA-degrading enzyme of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod may include dsRNase1, dsRNase2, or a combination thereof.
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素（Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｆａｓｎ）は、二本鎖ＲＮＡの細胞内への取込みを阻害する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ５５８４ （２０１７））。
Fatty acid synthase (fasn) in harmful arthropods or their natural enemies inhibits the uptake of double-stranded RNA into cells (Dong et al.,
ミナミキイロアザミウマの脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の配列としては、配列番号５に示される配列が挙げられる。脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号５に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。上述した、ｄＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ切断酵素によりランダムに切断することにより得られた、様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する場合、ｄｓＲＮＡの合成に使用する脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子の部分配列は、例えば、配列番号１０に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含んでよい。また、合成された脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子のｄｓＲＮＡは、配列番号１５に示される配列と少なくとも８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列からなるＤＮＡにコードされたポリヌクレオチドを含んでもよい。 An example of the sequence of the gene encoding fatty acid synthase of Thrips palmi is the sequence shown in SEQ ID NO: 5. The gene encoding fatty acid synthase may include a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 5. When using the above-mentioned siRNA mixture of various sequences obtained by randomly cleaving dRNA with a double-stranded RNA cleavage enzyme, the partial sequence of the gene encoding fatty acid synthase used to synthesize dsRNA may include, for example, a polynucleotide consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO: 10. In addition, the dsRNA of the gene encoding the synthesized fatty acid synthase may contain a polynucleotide encoded by DNA consisting of a sequence having at least 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to the sequence shown in SEQ ID NO: 15.
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子は、複数選択されてもよく、少なくとも２つの遺伝子であってもよい。複数の遺伝子である場合には、有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、複数の遺伝子を同時に抑制するｓｉＲＮＡであってもよく、それぞれの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであってもよい。 The at least one gene encoding fatty acid synthase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod may be selected from a plurality of genes, or may be at least two genes. In the case of a plurality of genes, the siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod may be an siRNA that suppresses a plurality of genes simultaneously, or may be an siRNA that suppresses each of the genes.
ｓｉＲＮＡを含む溶液の種類は、ｓｉＲＮＡが植物細胞内で作用する限り特に制限されないが、例えば、水、ＴＥ、展着剤及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。展着剤は、農薬が植物表面に吸着、浸透するのを促進する薬剤である。従来、二本鎖ＲＮＡをナノカプセルに入れて保護する等により有害節足動物体内への取込み効率を改善することが図られていたが、ナノカプセルを用いるとコストがさらに上昇することが問題であった。本防除方法によれば、少なくとも３種の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを組み合わせて植物の細胞内に導入することで、有害節足動物の細胞内へのｓｉＲＮＡ取込み効率が改善されるため、Ｌｉｐｉｄや糖、ペプチドなどと共役させたり（Ｘ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ）、特別なナノカプセルを用いたり、特別な溶液を用いたりする必要はなく、簡便である。 The type of solution containing siRNA is not particularly limited as long as the siRNA acts in the plant cells, and examples include water, TE, a spreading agent, and a combination of these. A spreading agent is an agent that promotes the adsorption and penetration of pesticides onto the plant surface. In the past, attempts were made to improve the efficiency of uptake into the bodies of harmful arthropods by protecting double-stranded RNA in nanocapsules, but the use of nanocapsules has the problem of further increasing costs. According to this control method, siRNAs for at least three types of genes are combined and introduced into the plant cells, improving the efficiency of uptake of siRNA into the cells of harmful arthropods, and there is no need to conjugate with lipids, sugars, peptides, etc. (X-conjugated siRNA), use special nanocapsules, or use special solutions, making it simple.
溶液は、有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含むものであってもよい。 The solution may contain siRNA that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of the harmful arthropod, siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNA-degrading enzyme of the harmful arthropod, and siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding a fatty acid synthase of the harmful arthropod.
上記溶液に含まれるｓｉＲＮＡの総量は、植物の種類や器官によって適宜調整できるが、例えば、６ｎｇ～２０００ｎｇであってよく、１０ｎｇ～１０００ｎｇであってよく、３０ｎｇ～５００ｎｇであってよく、２０ｎｇ以上、４０ｎｇ以上又は５０ｎｇ以上であってよく、５０００ｎｇ以下、３０００ｎｇ以下、２０００ｎｇ以下、１０００ｎｇ以下又は５００ｎｇであってもよい。上記ｓｉＲＮＡの総量は、導入（例えば、塗布）１回分当たりの量であってもよく、植物体の葉１枚に相当する面積当たりの量であってもよく、例えば、５～１００ｃｍ２当たりの量であってもよく、１０～７０ｃｍ２当たりの量であってもよく、１０～５０ｃｍ２当たりの量であってもよい。有害節足動物に直接接触させる目的で植物体の表面に二本鎖ＲＮＡを散布するという方法もあるが、効果を得るためには、例えば葉全体（表裏含む）に二本鎖ＲＮＡを散布する必要があり、大量散布が必要となる。例えば、ｄｓＲＮＡを１０～５０ｃｍ２の葉全体に散布する方法では、１μＬ／０．０１ｃｍ２で葉表面に散布するとすると、濃度が１μｇ／μＬの場合、２０００～１００００μＬの液量（裏表に散布）、重量では２×１０６～１０×１０６ｎｇのｄｓＲＮＡが必要になる。本防除方法によれば、葉の一部の細胞内にｓｉＲＮＡを導入することにより葉全体に防除効果を及ぼすことができるため、必要量を大幅に減らすことができる。 The total amount of siRNA contained in the solution can be adjusted appropriately depending on the type and organ of the plant, but may be, for example, 6 ng to 2000 ng, 10 ng to 1000 ng, 30 ng to 500 ng, 20 ng or more, 40 ng or more, or 50 ng or more, 5000 ng or less, 3000 ng or less, 2000 ng or less, 1000 ng or less, or 500 ng. The total amount of siRNA may be the amount per introduction (e.g., application), or the amount per area equivalent to one leaf of the plant body, for example, the amount per 5 to 100 cm 2 , the amount per 10 to 70 cm 2 , or the amount per 10 to 50 cm 2. There is also a method of spraying double-stranded RNA on the surface of the plant body for the purpose of direct contact with harmful arthropods, but in order to obtain the effect, for example, it is necessary to spray double-stranded RNA on the entire leaf (including the front and back), which requires a large amount of spraying. For example, in a method of spraying dsRNA over the entire leaf of 10-50 cm2, if 1 μL/0.01 cm2 is sprayed on the leaf surface, a liquid volume of 2000-10000 μL (sprayed on both sides) and 2×10 6 to 10×10 6 ng of dsRNA are required when the concentration is 1 μg/μL. According to this control method, the control effect can be exerted on the entire leaf by introducing siRNA into some of the cells of the leaf, so the required amount can be significantly reduced.
ｓｉＲＮＡを含む溶液を植物体の細胞内に導入する方法としては、例えば、植物体の損傷部位より直接導入する方法、及び加圧により導入する方法等が挙げられる。植物の損傷部位より直接導入する方法としては、例えば、ハサミの先又は紙やすりにより植物体の器官（例えば、葉）の表面の一部又は全体を損傷し、ｓｉＲＮＡを含む溶液を塗布又は噴霧する方法が挙げられる。 Methods for introducing a solution containing siRNA into the cells of a plant body include, for example, a method for directly introducing the solution through a damaged site of the plant body, and a method for introducing the solution by applying pressure. A method for directly introducing the solution through a damaged site of a plant includes, for example, a method for damaging part or the entire surface of an organ of the plant body (e.g., a leaf) with the tip of scissors or sandpaper, and applying or spraying a solution containing siRNA.
［植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキット］
本発明は一実施形態において、
ｓｉＲＮＡを有害節足動物の食害対象の植物体又は天敵のバンカー植物体の細胞内に導入することで植物体を食害する有害節足動物を防除するためのキット（以下、「本キット」ともいう）であって、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子、又は天敵節足動物における有害節足動物捕食能力に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物又は有害節足動物の天敵節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含む、、キットも提供する。
[Kit for controlling harmful arthropods that damage plants]
In one embodiment, the present invention comprises:
A kit for controlling harmful arthropods that damage plants by introducing siRNA into cells of a plant that is a target of damage by the harmful arthropods or a banker plant that is a natural enemy of the harmful arthropods (hereinafter, also referred to as "the kit"),
A small double-stranded RNA (siRNA) that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod, or at least one gene involved in the ability of a natural enemy arthropod to prey on a harmful arthropod;
An siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod;
and an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase in a harmful arthropod or a natural enemy arthropod of a harmful arthropod.
本キットは、
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含むものであってもよい。
This kit includes:
The siRNA may include an siRNA that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod, an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNA-degrading enzyme of the harmful arthropod, and an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding a fatty acid synthase of the harmful arthropod.
ｓｉＲＮＡを植物体の細胞内に導入することが、植物体の損傷部位より直接導入することである場合には、例えば、紙やすり、ハサミ等の損傷させるための器具をさらに含んでもよい。 When the siRNA is to be introduced into the cells of the plant body directly through a damaged site of the plant body, the device may further include a tool for causing damage, such as sandpaper or scissors.
ｓｉＲＮＡが含まれる形態としては、ｓｉＲＮＡの活性を維持する限り、特に限定されず、乾燥状態で含まれても、溶液に含まれてもよい。ｓｉＲＮＡが乾燥状態で含まれる場合には、ｓｉＲＮＡの種類により別々に包装されても、複数種がまとめて包装されてもよい。ｓｉＲＮＡが溶液に含まれる場合には、ｓｉＲＮＡの種類により別々の溶液の形態で含まれてもよく、複数種又はすべてのｓｉＲＮＡを一つの混合溶液の形態で含んでもよい。 The form in which the siRNA is contained is not particularly limited as long as the activity of the siRNA is maintained, and may be contained in a dry state or in a solution. When the siRNA is contained in a dry state, the siRNA may be packaged separately according to the type, or multiple types may be packaged together. When the siRNA is contained in a solution, the siRNA may be contained in the form of separate solutions according to the type, or multiple types or all of the siRNA may be contained in the form of a single mixed solution.
ｓｉＲＮＡが含まれる溶液は、例えば、水、ＴＥ、展着剤及びこれらの組み合わせであってよい。 The solution containing the siRNA may be, for example, water, TE, a spreading agent, or a combination thereof.
本キットは、キットを用いて有害節足動物を防除する方法が記載された説明書をさらに含んでもよい。 The kit may further include instructions on how to use the kit to control arthropod pests.
植物体、有害節足動物、各遺伝子及びｓｉＲＮＡ等、本キットにおける具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。 The specific aspects of this kit, such as the plant body, harmful arthropods, genes, and siRNA, can be the same as those described above without any restrictions.
［実施例１ ＳＩＧｓによるミナミキイロアザミウマの防除］
（１）標的遺伝子の探索及び部分配列の人工合成
防除対象となるミナミキイロアザミウマ（Ｔｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ）の標的遺伝子をＧｅｎｂａｎｋを用いて探索し、以下に示す部分配列（４００ｂｐ）を株式会社ファスマックに委託して化学合成した。
[Example 1: Control of Thrips palmi using SIGs]
(1) Search for target gene and artificial synthesis of partial sequence A search for a target gene of Thrips palmi, which is a control target, was conducted using Genbank, and the partial sequence (400 bp) shown below was chemically synthesized by FASMAC Corporation.
（２）ｄｓＲＮＡの合成
上記部分配列のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより部分配列を増幅し（ｓｅｔ１，２）、Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、製品添付のプロトコルに従ってｄｓＲＮＡを合成した。
(2) Synthesis of dsRNA The partial sequences were amplified by PCR using the DNA of the partial sequences as a template (sets 1 and 2), and dsRNA was synthesized using T7 RiboMAX™ Express RNAi System (Promega) according to the protocol attached to the product.
合成したｄｓＲＮＡの配列を以下に示す。 The sequence of the synthesized dsRNA is shown below.
（３）ｓｉＲＮＡの合成
合成したｄｓＲＮＡを１０μｇ用いて、ＳｈｏｒｔＣｕｔ（登録商標）ＲＮａｓｅＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）のプロトコルに従って、１８ｂｐ～２５ｂｐの長さのｓｉＲＮＡの混合物を得た。作製したｓｉＲＮＡをエタノール沈殿を行って濃縮した後、ＴＥバッファーに溶解して－８０℃で保存した。使用の際には、４℃で解凍した後、各ｓｉＲＮＡを目的量採って混合した。
(3) Synthesis of siRNA Using 10 μg of the synthesized dsRNA, a mixture of 18 bp to 25 bp in length was obtained according to the protocol of ShortCut (registered trademark) RNase III (New England Biolabs). The prepared siRNA was concentrated by ethanol precipitation, dissolved in TE buffer and stored at -80°C. When used, the mixture was thawed at 4°C, and the desired amount of each siRNA was taken and mixed.
（４）キュウリ葉への塗布
図１に示すように各ｓｉＲＮＡ量を調整したｓｉＲＮＡ混合液を作製し、キュウリ本葉の表面をハサミの先又は紙やすりで傷つけ、ｓｉＲＮＡ混合液を傷口に滴下（５－２０μＬ）し、そのまま一晩風乾した。なお、キュウリ本葉１枚の大きさは約５０ｃｍ２であった。
(4) Application to cucumber leaves As shown in Figure 1, an siRNA mixture was prepared by adjusting the amount of each siRNA, the surface of a cucumber leaf was scratched with the tip of scissors or sandpaper, and the siRNA mixture was dripped onto the wound (5-20 μL) and air-dried overnight. The size of one cucumber leaf was approximately 50 cm2 .
（５）ミナミキイロアザミウマに対する発育阻害効果の判定
ミナミキイロアザミウマ１，２齢幼虫を処理した葉につけて、１０日間の間に成虫化した虫体の割合で効果を判定した。
(5) Evaluation of growth inhibition effect against Thrips palmi The agent was applied to leaves treated with 1st and 2nd instar larvae of Thrips palmi, and the effect was evaluated based on the proportion of insects that had evolved into adults within 10 days.
その結果を図１に示す。ｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２の３種のｓｉＲＮＡ混合液（各５０ｎｇ以上）を葉の傷口に塗布すると成虫化阻害が誘導される（成虫化が約２０％～６０％に低下する）ことが示された（＊；Ｐ＜０．０５、＊＊；Ｐ＜０．０１）。一方、葉の表面を傷つけずにｓｉＲＮＡを塗布した試験区（試験区６）、及びｓｉＲＮＡに代えてｄｓＲＮＡを塗布した試験区（試験区７）では、成虫化の阻害率は低かった。また、ＩＡＰ１，２のｓｉＲＮＡのみ使用した試験区（試験区５）においても、成虫化の阻害率は低かった。ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉の効果を昆虫に作用させるためには、昆虫の防除に直接寄与する遺伝子（本実施例ではＩＡＰ１，２）を抑制するｓｉＲＮＡだけでは足らず、ｄｓＲＮａｓｅ及びＦａｓｎの遺伝子の抑制も必要であることが示唆された。 The results are shown in Figure 1. It was shown that when a mixture of three types of siRNA (50 ng or more each) of dsRNase1, 2, Fasn, and IAP1, 2 was applied to the wounds of the leaves, inhibition of adulthood was induced (adulthood was reduced to about 20% to 60%) (*; P<0.05, **; P<0.01). On the other hand, the inhibition rate of adulthood was low in the test area where siRNA was applied without damaging the leaf surface (test area 6) and the test area where dsRNA was applied instead of siRNA (test area 7). The inhibition rate of adulthood was also low in the test area where only siRNA of IAP1, 2 was used (test area 5). It was suggested that in order to exert the effect of RNA interference by siRNA on insects, it is not enough to only use siRNA that suppresses genes that directly contribute to insect control (IAP1, 2 in this example), but it is also necessary to suppress the genes of dsRNase and Fasn.
また、処理後１０日目におけるキュウリ葉のミナミキイロアザミウマによる食害の様子を図２に示す。矢印は葉の表面を傷つけてｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡを塗布した部分を示す。それ以外の白くなっている部分は、ミナミキイロアザミウマに食害された部分である。ｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２の３種のｓｉＲＮＡ混合液を塗布した葉において、ミナミキイロアザミウマにより食害された部分が顕著に少なかった。 Figure 2 shows damage to cucumber leaves by Thrips palmi 10 days after treatment. The arrows indicate the areas where the leaf surface was scratched and siRNA or dsRNA was applied. The other white areas are areas that were damaged by Thrips palmi. In leaves that were applied with a mixture of three types of siRNA (dsRNase1, 2, Fasn, and IAP1, 2), the areas that were damaged by Thrips palmi were significantly less.
（６）遺伝子発現抑制効果の判定
葉につけてから２～４日後に幼虫を採取し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ社）のプロトコルに従いＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（タカラバイオ社）のプロトコルに従いＤＮＡに逆転写し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のプロトコルにしたがってＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により遺伝子発現抑制効果を判定した。
(6) Evaluation of gene expression suppression effect Larvae were collected 2 to 4 days after attachment to the leaves, and RNA was extracted according to the protocol of NucleoSpin RNA (Takara Bio Inc.). The RNA was reverse transcribed to DNA according to the protocol of Primescript RT Reagent kit (Takara Bio Inc.), and the gene expression suppression effect was evaluated by real-time PCR according to the protocol of SYBR Green Real time-PCR master (Thermo Fisher Scientific).
その結果を図３に示す。ｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２に対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した場合において、ミナミキイロアザミウマ幼虫のｉａｐ１遺伝子及びｉａｐ２遺伝子の発現が抑制されていることが確認された（＊＊；Ｐ＜０．０１）。なお、図３において、＋ｇｆｐはｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した結果、＋ｉａｐ１，２はｄｓＲＮａｓｅ１，２、Ｆａｓｎ及びＩＡＰ１，２に対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した結果、無処理は葉を傷つける処理も含め何も処理をしていない結果、を意味する。 The results are shown in Figure 3. When treated with an siRNA mixture containing siRNA against dsRNase1,2, Fasn, and IAP1,2, it was confirmed that the expression of the iap1 and iap2 genes in Thrips palmi larvae was suppressed (**; P<0.01). In Figure 3, +gfp means the result of treatment with an siRNA mixture containing siRNA against dsRNase1,2, Fasn, and GFP, +iap1,2 means the result of treatment with an siRNA mixture containing siRNA against dsRNase1,2, Fasn, and IAP1,2, and no treatment means the result of no treatment, including treatment of damaging the leaves.
［実施例２ ＳＩＧｓによるネギアザミウマにおける解毒酵素遺伝子発現の抑制］
実施例１と同様の方法により、ＧＦＰ、ネギアザミウマのＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ６ｋ１（ＣＹＰ６Ｋ１）、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎの部分配列を用いてｄｓＲＮＡを合成し、次いでｓｉＲＮＡを合成してｓｉＲＮＡ混合液を作製した。ｓｉＲＮＡ混合液は、ＧＦＰ、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎに対するｓｉＲＮＡを含むものと、ＣＹＰ６Ｋ１、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎに対するｓｉＲＮＡを含むものを作製した。キュウリ本葉の表面をハサミの先又は紙やすりで傷つけ、ｓｉＲＮＡ混合液を傷口に滴下（５－２０μＬ）し、そのまま一晩風乾した。
[Example 2: Suppression of detoxification enzyme gene expression in onion thrips by SIGs]
Using the same method as in Example 1, dsRNA was synthesized using partial sequences of GFP, Cytochrome P450 6k1 (CYP6K1) of onion thrips,
ネギアザミウマ薬剤抵抗性系統（成虫）を処理した葉につけ、４日後に雌成虫を採取し、ＲＮＡを抽出した。実施例１と同様の方法により、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により
ｃｙｐ６ｋ１遺伝子の発現を比較した。
Onion thrips drug-resistant strain (adults) were placed on the treated leaves, and after 4 days, female adults were collected and RNA was extracted. Expression of the cyp6k1 gene was compared by real-time PCR in the same manner as in Example 1.
その結果を図４に示す。ＣＹＰ６Ｋ１、ｄｓＲＮａｓｅ１，２及びＦａｓｎに対するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡ混合液を処理した試験区において、ｃｙｐ６ｋ１遺伝子の発現が約６０％低下したことが示された（＊＊；Ｐ＜０．０１）。
The results are shown in Figure 4. In the test group treated with a siRNA mixture containing siRNAs against CYP6K1,
Claims (5)
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含む溶液を有害節足動物の食害対象の植物体の細胞内に導入することを含み、
前記有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子が、抑制することで有害節足動物の発育阻害若しくは致死を誘導又は増殖を抑制する遺伝子である、方法。 A method for controlling harmful arthropods that damage plants, comprising the steps of:
A small double-stranded RNA (siRNA) that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod;
an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod ;
and introducing a solution containing siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase of a harmful arthropod into cells of a plant body that is a target of feeding damage by the harmful arthropod,
The method , wherein at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of the harmful arthropod is a gene that induces growth inhibition or death or suppresses the growth of the harmful arthropod by suppressing it.
有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と、
有害節足動物のＲＮＡ分解酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、
有害節足動物の脂肪酸合成酵素をコードする少なくとも一つの遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡと
を含み、
前記有害節足動物の発育、生存、発生及び／又は生殖に関与する少なくとも一つの遺伝子が、抑制することで有害節足動物の発育阻害若しくは致死を誘導又は増殖を抑制する遺伝子である、キット。 A kit for controlling harmful arthropods that damage plants by introducing siRNA into cells of the plant that is the target of damage by the harmful arthropods,
A small double-stranded RNA (siRNA) that suppresses the expression of at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of a harmful arthropod;
an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding an RNase of a harmful arthropod ;
and an siRNA that suppresses the expression of at least one gene encoding fatty acid synthase in a harmful arthropod ;
A kit , wherein at least one gene involved in the growth, survival, development and/or reproduction of the harmful arthropod is a gene that, when inhibited, induces growth inhibition or death or inhibits the growth of the harmful arthropod.
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Also Published As
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