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JP7507823B2 - ヒト化軽鎖マウス - Google Patents

ヒト化軽鎖マウス Download PDF

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Description

発明の分野
遺伝的に改変された非ヒト妊性動物は、ヒト重鎖可変配列と同起源の（ｃｏｇｎａｔｅ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変配列を発現する。マウスＡＤＡＭ６遺伝子座において機能的であるＡＤＡＭ６ａをコードする核酸配列を含む、遺伝的に改変されたマウス、細胞、胚、および組織は、機能的免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを形成するように再配列させることができるヒト免疫グロブリンラムダ軽鎖遺伝子セグメントを含むと記載される。改変は、ヒトおよび／またはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。ＡＤＡＭ６機能を含むマウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性核酸配列を含むマウスを含むと記載される。内因性マウス免疫グロブリンＶＨ領域遺伝子座の遺伝子改変を含み、且つさらにＡＤＡＭ６活性を含む遺伝的に改変された雄マウスは、該雄マウスに妊性を回復させる異所性核酸配列を含むマウスを含むと記載される。
遺伝的に改変された非ヒト妊性動物は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログの欠失または改変を含み、ＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログ）機能を全部または一部回復させる遺伝子改変を含み、該非ヒト動物は、λまたはκ軽鎖定常配列においてヒト免疫グロブリンλ可変配列を発現する。
背景
ヒト抗体遺伝子を含有するマウスは、当該技術分野において公知である。過去二十年の間の抗体の薬学的適用は、ヒト治療薬としての使用に好適である抗体の作製の多大な研究を喚起した。ヒトへとマウス抗体を反復して投与することは、長期処置レジメンを混乱させ得る免疫原性の問題を生じさせる結果となるので、マウス抗体に基づく初期抗体治療薬は、ヒト治療薬として理想的ではなかった。マウス抗体をよりヒトらしくし、あまりマウス様にしないようなマウス抗体のヒト化に基づく解決策が開発された。その後、抗体に使用するためのヒト免疫グロブリン配列を発現するための方法が続き、これらは、主として、ファージ、細菌または酵母におけるヒト免疫グロブリンライブラリのｉｎ ｖｉｔｒｏ発現に基づくものであった。最終的に、ヒト造血細胞を生着させたマウスにおいて、および内因性免疫グロブリン遺伝子座が無能化された染色体導入マウスまたはトランスジェニックマウスにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトリンパ球から有用なヒト抗体を作製する試みがなされた。トランスジェニックマウスの場合、ランダムに組み込まれた完全ヒト導入遺伝子が、該マウスにおいて発現する免疫グロブリン配列の源として機能するために、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子を無能化する必要があった。かかるマウスは、ヒト治療薬としての使用に好適なヒト抗体を作製できるが、該マウスの免疫系に関わる重大な問題を提示する。これらの問題は、（１）マウスに十分に多様な抗体レパートリーの産生を実行できなくさせる、（２）広範なリエンジニアリングフィックス（ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｉｘｅｓ）の使用を必要とする、（３）おそらくヒト要素とマウス要素間の不適合性のため、最適以下のクローン選択過程をもたらす、および（４）これらのマウスを、ヒト治療薬の作製に真に有用であるために必要なヒト可変配列の大きな且つ多様な集団の信頼できない源にしてしまう。
完全なヒト抗体導入遺伝子を含有するトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖定常配列に結合する再配列していないヒト免疫グロブリン重鎖可変配列（Ｖ、Ｄ、およびＪ配列）およびヒト軽鎖定常配列に結合する再配列していないヒト免疫グロブリン軽鎖可変配列（ＶおよびＪ）を含有するランダムに挿入された導入遺伝子を含有する。それゆえ、上記マウスは、完全にヒトである、内因性マウス遺伝子座以外の遺伝子座から再配列した抗体遺伝子を産生する。一般に、少なくとも一部のヒトλ配列を有するマウスも報告されているが、上記マウスは、ヒト重鎖配列およびヒトκ軽鎖配列を含有する。トランスジェニックマウスは一般に、損傷を受け、非機能的内因性免疫グロブリン遺伝子座、または内因性免疫グロブリン遺伝子座のノックアウトを有し、そのため、上記マウスは、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座でヒト抗体配列を再配列することができない。かかるトランスジェニックマウスの変化は、おそらく少なくとも一部、内因性マウス選択系内の完全なヒト抗体分子を結合させる最適以下のクローン選択過程のため、マウスにおいて十分に多様なヒト抗体レパートリーを産生するにはあまり最適ではない。
当技術分野において、ヒト抗体配列を含む免疫グロブリン配列を産生するのに有用であり、且つ十分に多様なヒト抗体レパートリーを産生するのに有用である改良された遺伝的に改変された非ヒト動物を作製することが依然として必要とされる。免疫グロブリン遺伝子セグメントを、ヒトλまたはヒトκ可変ドメインと同起源のヒト重鎖可変ドメインを含む、有用な再配列した免疫グロブリン遺伝子を形成するように再配列することができ、またはヒトλおよび／またはヒトκ軽鎖可変配列の十分に多様な選択を含有する遺伝子座を含む、変更された免疫グロブリン遺伝子座からタンパク質を作製することができるマウスも依然として必要とされる。ヒト重鎖可変ドメインと同起源である、ヒトκおよびヒトλセグメントの両方から抗体可変領域を産生することができる非ヒト動物が必要とされる。ヒトλ配列の遺伝的に改変された動物の利用の増加も必要とされる。
発明の背景
遺伝的に改変された非ヒト動物は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログの活性を低減させる、または消去する改変を含み、上記改変は、妊性の喪失を生じさせる結果となり、且つ上記動物はさらに、ＡＤＡＭ６活性（またはホモログもしくはオルソログ活性）の喪失または低減を補う、またはレスキューする活性をコードする配列を含み、且つ上記非ヒト動物はさらに、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域と同起源のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を発現させることができる改変を含むと記載される。様々な態様では、上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、λまたはκ定常領域に融合して発現する。
様々な態様では、ＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、ヒト免疫グロブリン配列と隣接する。様々な態様では、ＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、非ヒト免疫グロブリン配列と隣接する。様々な態様では、上記配列は、上記非ヒト動物の内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に存在する。様々な態様では、上記配列は、上記非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座と異なる染色体上に存在する。
遺伝的に改変された非ヒト動物は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログの活性を維持する改変を含み、上記改変は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入を含み、且つ上記非ヒト動物はさらに、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域と同起源のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を発現させることができる改変を含むと記載される。様々な態様では、上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、λまたはκ定常領域に融合して発現する。
様々な態様では、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの挿入は、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子の３’または下流で行われる。様々な態様では、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの挿入は、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６活性が、かかる挿入を含有しない非ヒト動物と同じまたは同等なレベルにあるように、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子（単数もしくは複数）が破壊されず、欠失されず、且つ／または機能的にサイレンシングされないように行われる。例示的破壊、欠失および／または機能的にサイレンシングされる改変は、上記非ヒト動物のＡＤＡＭ６遺伝子（単数または複数）によりコードされるＡＤＡＭ６タンパク質（単数または複数）の活性の低減、消去および／または喪失を生じさせる結果となる任意の改変を含む。
１つの態様では、非機能的内因性マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはＡＤＡＭ６遺伝子（例えば、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウトまたは内因性ＡＤＡＭ６遺伝子内での欠失）を生じさせる結果となる改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。
１つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための、核酸構築物、細胞、胚、マウスおよび方法を提供する。１つの実施形態において、上記内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座であり、上記改変は、雄マウスの細胞または組織のＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは消去する。
１つの態様では、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する；マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする内因性ヌクレオチド配列を含み、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つの遺伝子改変を含むマウスも提供する。
１つの態様では、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含むマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含むマウスを作製するための方法を提供する。
１つの態様では、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、これらの方法の適用により、改変された重鎖免疫グロブリン遺伝子座（またはその欠失）を含む雄マウスが得られ、該雄マウスは、交配によって子孫を産生することができる。１つの実施形態において、上記雄マウスは、マウス子宮からマウス卵管を通って移行してマウス卵子を受精させることができる精子を産生できる。
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の遺伝子改変を含むマウスを作製するための方法を提供し、該重鎖遺伝子座を改変するためのこれらの方法の適用により、妊性の低減を示す雄マウスが得られ、および該マウスは、その妊性低減を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、雄マウスの精子が、マウス子宮からマウス卵管を通って移動してマウス卵子を受精させることができないことを特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減は、ｉｎ ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を特徴とする。様々な実施形態において、上記妊性の低減を全部または一部回復させる遺伝子改変は、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列である。
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の、別の種（例えば、非マウス種）の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座での置換を含む。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、オルソロガス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座への挿入を含む。特定の実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部欠失を含み、該欠失は、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果となる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雄マウスにおける妊性の低減に関連づけられる。
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座の全部または一部の不活性化であって、内因性ＡＤＡＭ６機能の喪失を生じさせる結果とならない不活性化を含む。不活性化は、内因性非ヒト遺伝子セグメントを含む抗体の重鎖をコードするように再配列することが実質的にできない内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を生じさせる結果となる１つまたは複数の内因性非ヒト遺伝子セグメントの置換または欠失を含み得る。不活性化は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、抗体の重鎖をコードするように再配列することができないようにする他の改変であって、内因性遺伝子セグメントの置換または欠失を含まない改変を含み得る。例示的改変は、分子技法を介した、例えば、部位特異的組み換え部位の正確な配置（例えば、Ｃｒｅ－ｌｏｘ技術）を使用する染色体逆位および／または転座を含む。他の例示的改変は、上記非ヒト免疫グロブリン可変遺伝子セグメントと上記非ヒト免疫グロブリン定常領域との間の作動可能な連結を無能化することを含む。
１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、上記非ヒト動物のゲノムに、１つまたは複数の定常領域配列（例えば、ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ遺伝子）に作動可能に連結する別の種（例えば、非マウス種）の１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有するＤＮＡ断片を挿入することを含む。１つの実施形態において、上記ＤＮＡ断片は、上記非ヒト動物のゲノムにおいて再配列を行い、抗体の重鎖可変ドメインをコードする配列を形成することができる。１つの実施形態において、上記種はヒトである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変は、ＡＤＡＭ６活性（例えば、コードされたタンパク質の発現および／または機能）が上記挿入を含まない非ヒト動物と同じまたは同等であるように、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの、上記非ヒト動物の内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の下流または３’への挿入を含む。
１つの態様では、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からのマウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは消去する改変を有する雄マウスが、内因性ＡＤＡＭ６機能の低減または消去に起因して、妊性低減（例えば、交配による子孫産生能力の高度低減）を示すまたは本質的に不妊性であるように、該改変を含み、さらに、異所性ＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む、マウスを提供する。１つの態様において、マウスＡＤＡＭ６発現を低減させるまたは消去する改変は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変（例えば、挿入、欠失、置換など）である。
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、マウスが、マウス子宮からマウス卵管を通って進んでマウス卵子を受精させることのできる精子を産生できないことまたは実質的に産生できないこと含む。特定の実施形態において、上記マウスの射精体積中の産生された精子細胞の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％は、交尾後にｉｎ ｖｉｖｏで卵管を通って進むことができず、マウス卵子を受精させることができない。
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の低減または喪失は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成できないことまたは実質的に形成できないことを含む。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６機能の喪失は、雌マウスとの交尾によってマウス卵子を受精させることが実質的にできないことを含む。
１つの態様において、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能性を付与するタンパク質（またはタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列）を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは雄マウスであり、上記機能性は、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスと比較して強化された妊性を含む。
１つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。もう１つの特定の実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＨ、少なくとも１つのヒトＤＨおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記異所性タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にあるゲノム配列によってコードされている。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、組織特異的発現と関連づけられる。１つの実施形態において、上記組織特異的発現は、生殖組織に存在する。１つの実施形態において、上記タンパク質は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入されたゲノム配列によってコードされている。
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトまたはキメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラット軽鎖（例えば、ヒト可変、マウスまたはラット定常）とキメラヒト可変／マウスまたはラット定常重鎖とを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、転写活性プロモーター、例えばＲＯＳＡ２６プロモーター、に作動可能に連結されているキメラヒト可変／ラットまたはマウス定常軽鎖遺伝子を含む導入遺伝子を含む。さらなる特定の実施形態において、上記キメラヒト／マウスまたはラット軽鎖導入遺伝子は、上記マウスの生殖細胞系内に再配列ヒト軽鎖可変領域配列を含む。
１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における免疫グロブリン遺伝子座内にある。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶＨ、少なくとも１つのヒトＤＨおよび少なくとも１つのヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座内にある。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記転写活性遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの生殖細胞系にランダムに挿入された位置にある。
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いているマウスであって、マウスＡＤＡＭ６機能の喪失を補う異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスに、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含有する対応する野生型マウスに匹敵する子孫産生能力を付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記マウスの精子細胞の表面でＡＤＡＭ２および／またはＡＤＡＭ３および／またはＡＤＡＭ６の複合体を形成する能力を、上記マウスに付与する。１つの実施形態において、上記配列は、上記マウスに、マウス子宮からマウス卵管を通ってマウス卵子へと進んで該卵子を受精させる能力を付与する。
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、同じ年齢および系統の野生型マウスが６ヶ月の期間に産生する同腹子の数の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の数の同腹子を産生する。
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、６ヶ月に期間にわたって交配させたとき、実質的に同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で交配させた、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き該異所性ヌクレオチド配列を欠いている同じ年齢および同じまたは類似系統のマウスに比べて、少なくとも約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約４倍、約６倍、約７倍、約８倍または約１０以上後代を産生する。
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、４または６ヶ月の交配期間中に、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列を欠く、同じ期間交配させたマウスより、同腹子あたり平均少なくとも約２倍、３倍、４倍多い数の子を産生する。
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは雄マウスであり、該雄マウスは、交尾後約５～６時間の時点で卵管から回収したとき、該機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスに比べて少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、１００倍、１１０倍または１２０倍以上である卵管移動を表わす精子を産生する。
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、雌マウスと交尾させたとき、野生型マウスからの精子にほぼ等しい効率で約６時間以内に子宮を通り抜けて卵管に入って卵管を通り抜けることができる精子を産生する。
１つの実施形態において、上記機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を欠き、上記異所性ヌクレオチド配列を含む上記マウスは、該機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を欠いており該異所性ヌクレオチド配列を欠くマウスに比べて、匹敵する期間内に約１．５倍、約２倍、約３倍または約４倍以上の同腹子を産生する。
１つの態様では、免疫グロブリンタンパク質をコードする非マウス核酸配列をその生殖細胞系内に含むマウスを提供し、上記非マウス免疫グロブリン配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片の挿入を含む。１つの実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、ヒト免疫グロブリン軽鎖配列を含む。１つの実施形態において、上記配列は、１つまたは複数のＶ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪ遺伝子セグメントを含む；１つの実施形態において、上記配列は、１つまたは複数のＶ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つまたは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントは、未再配列である。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つまたは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントは、再配列される。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、または１つまたは複数のＶおよびＪ遺伝子セグメントの再配列後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再配列後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも２つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、再配列後、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする少なくとも１つの核酸配列をそのゲノム内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をＢ細胞内に含む。１つの実施形態において、上記マウスは、上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を非Ｂ細胞内に含む。
１つの態様では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその機能的断片を内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記雄マウスは、単一の未改変内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子またはそのオルソログもしくは（ｏｆ）ホモログもしくは機能的断片を内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座に含む。
１つの実施形態において、上記雄マウスは、ＡＤＡＭ６機能を付与するタンパク質をコードする異所性マウスＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
１つの実施形態において、上記雄マウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６対立遺伝子の場所、例えば、Ｖ遺伝子セグメント配列の３’および最初のＤ遺伝子セグメントの５’に近いマウスゲノム内の場所にＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。
１つの実施形態において、上記雄マウスは、免疫グロブリン可変遺伝子セグメントをコードする核酸配列の（ＡＤＡＭ６配列の転写方向に関して）上流、下流、または上流および下流に隣接するＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントであり、マウスにおいて機能的なマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列は、ヒトＶ遺伝子セグメント間にある；１つの実施形態において、上記マウスは、２つ以上のＶ遺伝子セグメントを含み、上記配列は、上記最後のＶ遺伝子セグメントと最後から二番目のＶ遺伝子セグメントの間の位置にある。１つの実施形態において、上記配列は、上記最後のＶ遺伝子セグメントおよび上記最初のＤ遺伝子セグメントの次に来る位置にある。
１つの実施形態において、上記雄マウスは、野生型雄マウスと同じまたは実質的に同じ内因性免疫グロブリン遺伝子座内の位置に配置されるＡＤＡＭ６配列またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片を含む。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、抗体の重鎖可変領域であって、内因性非ヒト遺伝子セグメントを含み、またはそれに由来する可変領域をコードすることができない。特定の実施形態において、上記内因性遺伝子座は、上記雄マウスにおいて抗体の重鎖可変領域をコードできないようにした該雄マウスのゲノムの位置に置かれる。様々な実施形態において、上記雄マウスは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと同じ染色体上に位置するＡＤＡＭ６配列を含み、上記ＡＤＡＭ６配列は、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
１つの態様では、非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子、または内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の欠失をその生殖細胞系内に含む雄マウスを提供し、該マウスの精子細胞は、雌マウスの卵管を通過することができ、卵子を受精させることができる。
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子および内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に対する改変を含む雄マウスを提供する。１つの実施形態において、上記改変は、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の下流または３’で作製される。１つの実施形態において、上記改変は、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、上記改変は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への挿入である。
１つの態様において、内因性マウスＡＤＡＭ６機能を低減させる遺伝子改変を含むマウスであって、全部もしくは一部機能的である内因性未改変対立遺伝子（例えば、ヘテロ接合体）によってあるいは雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性配列からの発現によってもたらされる、少なくともいくらかのＡＤＡＭ６機能性を含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスは、機能的ＡＤＡＭ６を欠いている雄マウスと比較して、交配により子孫を産生する能力を雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６機能を含む。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、マウスＡＤＡＭ６またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列の存在によって付与される。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能は、内因性免疫グロブリン遺伝子座であって、抗体の重鎖可変領域をコードすることができない内因性免疫グロブリン遺伝子座に存在する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子により付与される。雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６ホモログもしくはオルソログまたはその断片としては、十分な内因性マウスＡＤＡＭ６活性を欠く雄マウスにおいて観察される子孫産生能力の喪失、例えば、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスにおいて観察される能力の喪失を全部または一部回復させるものが挙げられる。この意味で、ＡＤＡＭ６ノックアウトマウスには、内因性遺伝子座またはその断片を含むが機能的でない、すなわち、ＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）をまったく発現しない、または野生型雄マウスの本質的に正常な子孫産生能力を支持するのに不十分であるレベルでＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ）を発現するマウスが含まれる。機能の喪失は、例えば、上記遺伝子座の構造遺伝子（すなわちＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域）の改変、または上記遺伝子座の調節領域（例えば、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子に対して５’のまたはＡＤＡＭ６ａもしくはＡＤＡＭ６ｂコーディング領域の３’の配列であって、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写、ＡＤＡＭ６ ＲＮＡの発現またはＡＤＡＭ６タンパク質の発現を全部または一部制御する配列）の改変に起因し得る。様々な実施形態において、雄マウスにおいて機能的であるオルソログもしくはホモログまたはその断片は、雄マウスの精子（または雄マウスの射精液中の大部分の精子細胞）がマウス卵管を通過してマウス卵子を受精させることを可能にするものである。
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン可変領域またはその機能的断片を発現する雄マウスは、雌マウスとの交配により子孫を産生する能力を該雄マウスに付与するのに十分なＡＤＡＭ６活性を含み、１つの実施形態において、雌マウスと交配するとき、上記雄マウスは、１つまたは２つの内因性未改変ＡＤＡＭ６対立遺伝子を有するマウスの子孫産生能力の、１つの実施形態では少なくとも２５％、１つの実施形態では少なくとも３０％、１つの実施形態では少なくとも４０％、１つの実施形態では少なくとも５０％、１つの実施形態では少なくとも６０％、１つの実施形態では少なくとも７０％、１つの実施形態では少なくとも８０％、１つの実施形態では少なくとも９０％、および１つの実施形態では該マウスの子孫産生能力とほぼ同じである、子孫産生能力を示す。
１つの実施形態において、雄マウスは、該雄マウスからの精子細胞が雌マウス卵巣を通り抜けることおよびマウス卵子を受精させることを可能にするために十分なＡＤＡＭ６（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）を発現する。
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６機能性は、マウス染色体配列に隣接する核酸配列によって付与される（例えば、上記核酸は、マウス染色体にランダムに組み込まれている；または例えば、上記核酸を特定の場所にターゲティングすることにより、例えば部位特異的リコンビナーゼ媒介（例えば、Ｃｒｅ媒介）挿入もしくは相同組換えにより、特定の場所に配置されている）。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は上記マウスの染色体とは異なる核酸上に存在する（例えば、上記ＡＤＡＭ６配列は、エピソーム上に、すなわち染色体外に、例えば、発現構築物、ベクター、ＹＡＣ、導入染色体などに存在する）。
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該マウスは、免疫グロブリン重鎖配列の少なくとも一部分、例えば、ヒト配列の少なくとも一部分を発現し、該マウスは、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは根絶する。１つの実施形態では、上記マウスは、ＡＤＡＭ６活性をコードする両方の対立遺伝子が、不在であるように、または雄マウスにおいて正常交配を支持するように実質的に機能しないＡＤＡＭ６を発現するように、改変される。１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする異所性核酸配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスのＡＤＡＭ６活性を維持し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、抗体の重鎖可変領域をコードすることができないようにする。特定の実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域に作動可能に連結される抗体の重鎖可変領域をコードするように再配列することができないようにする染色体逆位およびまたは（ａｎｄ ｏｒ）転座を含む。
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む遺伝子改変マウスおよび細胞を提供し、該改変は、該遺伝子座のＡＤＡＭ６配列から発現するＡＤＡＭ６活性を低減させるまたは消去するものであり、および該マウスは、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、異所性ＡＤＡＭ６配列によってコードされている。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその断片は、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から発現する。様々な実施形態において、上記マウスは、第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を低減させるまたは消去する第一の改変を含む第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子と、第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子からの機能的ＡＤＡＭ６の発現を実質的に低減させないまたは消去しない第二の改変を含む第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子とを含む。
様々な実施形態において、上記改変は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流、または５’への挿入である。様々な実施形態において、上記改変は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に配置される上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を維持する。
１つの実施形態において、上記第二の改変は、最後のマウスＶ遺伝子グメントの（マウスＶ遺伝子セグメントの転写方向性を基準にして）３’にあり、およびマウス（またはキメラヒト／マウス）免疫グロブリン重鎖定常遺伝子またはその断片（例えば、ヒトおよび／またはマウス：ＣＨ１および／またはヒンジおよび／またはＣＨ２および／またはＣＨ３をコードする核酸配列）の（定常配列の転写方向性を基準にして）５’にある。
１つの実施形態において、上記改変は、第一のＡＤＡＭ６対立遺伝子をコードする第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、および上記ＡＤＡＭ６機能は、機能的ＡＤＡＭ６をコードする第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での内因性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生じ、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態において、上記Ｖ、ＤおよびまたはＪ遺伝子セグメントの上記少なくとも１つの改変は、欠失、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置換、ラクダ科動物Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置換、ヒト化またはラクダ化Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントでの置換、重鎖配列の軽鎖配列での置換、ならびにその組み合わせである。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの改変は、上記重鎖遺伝子座における１つまたは複数の重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの欠失ならびに１つまたは複数の軽鎖Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメント（例えば、ヒト軽鎖Ｖおよび／またはＪ遺伝子セグメント）での置換である。
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子、および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記マウスの生殖細胞系における非免疫グロブリン遺伝子座での異所性ＡＤＡＭ６発現の結果として生ずる。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、生殖組織において転写活性である。
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記マウスの生殖細胞系における内因性ＡＤＡＭ６遺伝子の結果として生ずる。特定の実施形態において、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子は、マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントのそばに並列される。
１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能は、上記第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６配列の発現の結果として生ずる。１つの実施形態において、上記改変は、第一の遺伝子座の第一の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子および第二の遺伝子座の第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子におけるものであり、上記ＡＤＡＭ６機能または活性は、上記第二の免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での異所性ＡＤＡＭ６の発現の結果として生ずる。
１つの態様では、ＡＤＡＭ６のヘテロ接合またはホモ接合ノックアウトを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン配列またはラクダ科動物もしくはラクダ化ヒトもしくはマウス免疫グロブリン配列である、改変免疫グロブリン配列をさらに含む。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座に存在する。１つの実施形態において、上記改変免疫グロブリン配列は、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座にヒト重鎖可変遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、上記ヒト重鎖可変遺伝子配列は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内因性重鎖可変配列を置換する。
１つの態様では、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座から機能的内因性マウスＡＤＡＭ６を発現できないマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはその機能的断片をコードする異所性核酸配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、ＡＤＡＭ６ノックアウトに関してホモ接合性である雄マウスによって示される子孫産生能力の喪失をレスキューするタンパク質をコードする。特定の実施形態において、上記異所性核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
１つの態様では、機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスであって、該マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する異所性核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、内因性マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記内因性マウスＡＤＡＭ６配列は、野生型マウスにおける最も３’側の（ｔｈｅ ３’－ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｖ遺伝子セグメント（ＶＨ）と最も５’側の（ｔｈｅ ５’－ｍｏｓｔ）マウス免疫グロブリン重鎖Ｄ遺伝子セグメント（ＤＨ）の間にあるＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂコード配列を含む。
１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６ａもしくはその機能的断片をコードする配列、および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂもしくはその機能的断片をコードする配列を含み、該ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂまたはその機能的断片（単数もしくは複数）は、プロモーターに作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ヒトプロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、最も５’側のマウスＤＨ遺伝子セグメントに最も近い第一のＡＤＡＭ６遺伝子の第一コドンと、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの組換えシグナル配列との間にある配列を含み、この場合の５’は、マウス免疫グロブリン遺伝子の転写方向に関して示される。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ウイルスプロモーターである。特定の実施形態において、上記ウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。１つの実施形態において、上記プロモーターは、ユビキチンプロモーターである。
１つの実施形態において、上記プロモーターは、誘導性プロモーターである。１つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、非生殖組織での発現を調節する。１つの実施形態において、上記誘導性プロモーターは、生殖組織での発現を調節する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片（単数もしくは複数）の発現は、生殖組織において誘導性プロモーターによって発生調節される。
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂは、配列番号１のＡＤＡＭ６ａおよび／または配列番号２の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のＡＤＡＭ６ｂから選択される。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６プロモーターは、配列番号３のプロモーターである。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの第一コドンの（ＡＤＡＭ６ａの転写方向に関して）直ぐ上流の配列番号３の核酸配列であって、ＡＤＡＭ６コーディング領域の上流の配列番号３の端にわたる（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）核酸配列を含む。もう１つの特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６プロモーターは、ＡＤＡＭ６ａの開始コドンの上流約５から約２０ヌクレオチド以内からＡＤＡＭ６ａの開始コドンの約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂまたは３ｋｂ以上上流にわたる断片である。
１つの実施形態において、上記核酸配列は、ＡＤＡＭ６欠如のため不妊性であるまたは妊性が低いマウスの体内に配置されたとき、妊性を向上させるまたは妊性をほぼ野生型の妊性に回復させる、配列番号３またはその断片を含む。１つの実施形態において、配列番号３またはその断片は、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力を雄マウスに付与する。
１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウスの体内に配置され、またはマウスにおいて維持されたとき、野生型マウスと同じまたは同等の妊性のレベルを生ずる、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードする任意の配列である。妊性の例示的レベルは、雄マウスの、雌マウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させることができる精子細胞を産生する能力により実証され得る。
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする内因性ヌクレオチド配列の欠失と、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする異所性ヌクレオチド配列とを含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む内因性免疫グロブリン遺伝子座ヌクレオチド配列の欠失を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を含み、および上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にある、または該１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。
１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列でのすべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列内にあるか、該１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＤＨ遺伝子遺伝子座における１つまたは複数の内因性ＤＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントでの置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＪＨ遺伝子遺伝子座における１つまたは複数の内因性ＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの置換、ならびに内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子遺伝子座における、ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントでの置換を含み、この場合のマウスは、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座での挿入を含み、上記マウスは、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列は、存在するヒトＶＨ遺伝子セグメントの最も３’側の末端から二番目のＶＨ遺伝子セグメントと、存在するヒトＶＨ遺伝子セグメントの最終（ｕｌｔｉｍａｔｅ）３’ＶＨ遺伝子セグメントとの間に配置される。特定の実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、およびすべてのまたは実質的にすべてのヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子セグメントＶＨ１－２の下流かつヒト遺伝子セグメントＶＨ６－１の上流に配置されている。
特定の実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列での、すべてのまたは実質的にすべての内因性ＶＨ遺伝子セグメントの置換を含み、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、該１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド内にあるか、該１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントをコードするヌクレオチドに直接隣接する。
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の導入遺伝子上に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスの染色体外に存在する。
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むマウスであって、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再配列免疫グロブリン配列を含むＢ細胞を発現するマウスを提供し、該Ｂ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする遺伝子をそのゲノム内（例えば、Ｂ細胞染色体上）に含む。１つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている再配列免疫グロブリン配列は、ヒト重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；マウス重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ配列；ヒトまたはマウス軽鎖Ｖおよび／またはＪ配列を含む。１つの実施形態において、上記重鎖定常領域遺伝子配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせからなる群より選択されるヒトまたはマウス重鎖配列を含む。
１つの態様では、機能的にサイレンシングされた内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座を含むマウスを提供し、ＡＤＡＭ６機能が上記マウス内に維持され、さらに、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの、１つまたは複数のマウス重鎖定常領域の上流または５’への挿入を含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記マウスはさらに、機能的にサイレンシングされた内因性軽鎖遺伝子座を含み、上記マウスは、野生型マウスと同じまたは同等のＡＤＡＭ６活性を含み、さらに１つまたは複数のヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの、マウス軽鎖定常領域の上流または５’への挿入を含む。１つの実施形態において、上記ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントは、１２のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントは、１２のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントは、２８のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントは、２８のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントは、４０のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントは、４０のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記４のヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７を含む。様々な実施形態において、上記マウス軽鎖定常領域は、マウスＣκまたはマウスＣλである。
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、機能的にサイレンシングされた免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含み、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置換をさらに含み；機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス提供する。
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠き、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列の機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含むマウスであって、異性のマウスと交配して、該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む後代を産生することができるマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは雄である。１つの実施形態において、上記マウスは雌である。
１つの態様では、遺伝子改変マウスであって、内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座にヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含み；該内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座に内因性機能的ＡＤＡＭ６配列を欠き；および雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を発現する異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、染色体外のものである。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６タンパク質を発現する異所性ヌクレオチド配列は、上記マウスのゲノム内の１つまたは複数の遺伝子座に組み込まれている。特定の実施形態において、上記１つまたは複数の遺伝子座は、免疫グロブリン遺伝子座を含む。
１つの態様では、ヒトＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン重鎖配列を改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現するマウスであって、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性を含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスは、複数のヒトＶ遺伝子セグメント、複数のＤ遺伝子セグメント、および複数のＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、ヒトＤ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記Ｊ遺伝子セグメントは、ヒトＪ遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスは、ヒト化重鎖定常領域配列をさらに含み、該ヒト化は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列の置換を含む。特定の実施形態において、上記重鎖は、ヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＤ遺伝子セグメント、ヒトＪ遺伝子セグメント、ヒトＣＨ１配列、ヒトまたはマウスヒンジ配列、マウスＣＨ２配列、およびマウスＣＨ３配列に由来する。もう１つの特定の実施形態において、上記マウスは、ヒト軽鎖定常配列をさらに含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、５’および３’が内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントに隣接するＡＤＡＭ６遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖をコードすることができない。特定の実施形態において、上記マウスのＡＤＡＭ６遺伝子は、野生型マウスのものと同じ位置にあり、上記マウスの内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座は、抗体の重鎖をコードするように再配列することができない。
１つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、（該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
１つの実施形態において、上記Ｖ遺伝子セグメントは、（該Ｖ遺伝子セグメントの転写方向に関して）３’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
１つの実施形態において、上記Ｄ遺伝子セグメントは、（該Ｄ遺伝子セグメントの転写方向に関して）５’が、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列に隣接する。
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座の（Ｖ遺伝子セグメントの転写の方向を基準して）最も５’側のＤ遺伝子セグメントの５’および最も３’側のＶ遺伝子セグメントの３’にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性は、上記改変内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座における２つのヒトＶ遺伝子セグメントの間にあるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。１つの実施形態において、上記２つのヒトＶ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントおよびＶＨ６－１遺伝子セグメントである。
１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片、マウスＡＤＡＭ６ａ配列またはその機能的断片、およびその組み合わせから選択される配列を含む。
１つの実施形態において、上記２つのヒトＶ遺伝子セグメント間のヌクレオチド配列は、該ヒトＶ遺伝子セグメントを基準にして反対の転写配向に配置されている。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向に関して５’から３’へ、ＡＤＡＭ６ａ配列、続いてＡＤＡＭ６ｂ配列をコードする。
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトＶ遺伝子セグメントＶＨ１－２とＶＨ６－１の間のヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子配列の、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片での置換を含む。
１つの実施形態において、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６活性をコードする配列は、マウスＡＤＡＭ６配列またはその機能的断片である。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウスＤＦＬ１６．１遺伝子セグメント（例えば、上記改変内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性のマウスの場合）またはヒトＤＨ１－１遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスによって発現する免疫グロブリン重鎖のＤ遺伝子セグメントは、内因性マウスＤＦＬ１６．１遺伝子セグメントまたはヒトＤＨ１－１遺伝子セグメントに由来する。
１つの態様では、非再配列Ｂ細胞系列のＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むが、再配列免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞内に該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含まないマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、再配列Ｂ細胞系列のものではないすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞に存在する；１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記マウスの生殖細胞系細胞には存在するが、再配列Ｂ細胞の染色体には存在しない。
１つの態様では、再配列免疫グロブリン遺伝子座を含むＢ細胞をはじめとするすべてのまたは実質的にすべてのＤＮＡ保有細胞内にマウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を含むマウスを提供し、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、マウスＡＤＡＭ６遺伝子が野生型マウスにおいて出現する位置とは異なる、ゲノム内の位置に存在する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列は、上記再配列免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸上にある。１つの実施形態において、上記再配列免疫グロブリン遺伝子座に隣接する核酸は、染色体である。１つの実施形態において、上記染色体は、野生型マウスにおいて見出される染色体であり、該染色体は、マウス免疫グロブリン遺伝子座の改変を含む。
１つの態様では、ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログをそのゲノムに含むＢ細胞を含む、遺伝子改変マウスを提供する。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログは、免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６配列は、異種プロモーターによって駆動される導入遺伝子上にある。特定の実施形態において、上記異種プロモーターは、非免疫グロブリンプロモーターである。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する。
１つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の９０％以上は、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはそのホモログまたはその断片をコードする遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記マウスは雄マウスである。
１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞ゲノムは、上記ＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、第一の対立遺伝子を含むが第二の対立遺伝子を含まない。
１つの態様では、１つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子での改変を含むマウスを提供し、上記改変は１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持し、上記マウスはさらに、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの、マウス軽鎖定常領域の上流への挿入を含む。様々な実施形態において、上記マウス軽鎖定常領域は、マウスＣκまたはマウスＣλである。
１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、少なくとも１つの重鎖対立遺伝子から再配列した内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現することができないようにさせ、上記少なくとも１つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子内に配置される内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を維持する。
１つの実施形態において、上記マウスは、上記内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子の少なくとも１つから再配列した内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現することができず、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。特定の実施形態において、上記マウスは、２つの内因性免疫グロブリン重鎖対立遺伝子から再配列した内因性重鎖遺伝子セグメントを含む機能的重鎖を発現することができず、上記マウスは、１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子からＡＤＡＭ６タンパク質を発現する。
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性重鎖対立遺伝子から機能的重鎖を発現することができず、上記マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（上記マウス重鎖遺伝子座の転写方向に関して）１Ｍｂｐ内、２Ｍｂｐ内、３Ｍｂｐ内、４Ｍｂｐ内、５Ｍｂｐ内、１０Ｍｂｐ内、２０Ｍｂｐ内、３０Ｍｂｐ内、４０Ｍｂｐ内、５０Ｍｂｐ内、６０Ｍｂｐ内、７０Ｍｂｐ内、８０Ｍｂｐ内、９０Ｍｂｐ内、１００Ｍｂｐ内、１１０Ｍｂｐ内、または１２０Ｍｂｐ内、または１２０超Ｍｂｐ内の上流にある機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ－Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、上記機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントとの間の９０～１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。
１つの態様では、１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子での改変を含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記改変は、上記マウスが、上記１つまたは複数の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の少なくとも１つから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができないようにする。特定の実施形態において、上記マウスは、上記内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子のそれぞれから機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができない。
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができず、上記マウスは異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、各内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子から機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現することができず、上記マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列の（上記マウス重鎖遺伝子座の転写方向に関して）１Ｋｂ内、２Ｋｂ内、３Ｋｂ内、４Ｋｂ内、５Ｋｂ内、１０Ｋｂ内、２０Ｋｂ内、３０Ｋｂ内、４０Ｋｂ内、５０Ｋｂ内、６０Ｋｂ内、７０Ｋｂ内、８０Ｋｂ内、９０Ｋｂ内、１００Ｋｂ内、１１０Ｋｂ内、または１２０Ｋｂ内、または１２０超Ｋｂ内の上流にある異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。特定の実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、上記内因性重鎖遺伝子座に（例えば、遺伝子間Ｖ－Ｄ領域内、２つのＶ遺伝子セグメント間、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントとの間、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントとの間などに）ある。特定の実施形態において、上記異所性ＡＤＡＭ６配列は、最後のマウスＶ遺伝子セグメントと最初のマウスＤ遺伝子セグメントの間の９０から１００ｋｂ遺伝子間配列内にある。もう１つの特定の実施形態では、上記内因性９０から１００ｋｂ遺伝子間Ｖ－Ｄ配列が除去され、上記異所性ＡＤＡＭ６配列が、最後のＶ遺伝子セグメントと最初のＤ遺伝子セグメントとの間に配置されている。
１つの態様では、２つ以上の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子の欠失を含む、不妊性雄マウスを提供する。１つの態様では、雄性不妊形質の保有者である雌マウスであって、非機能的ＡＤＡＭ６対立遺伝子または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子ノックアウトをその生殖細胞系に含む雌マウスを提供する。
１つの態様では、抗体の重鎖をコードするように再配列することができない内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびまたは（ａｎｄ ｏｒ）Ｊ遺伝子セグメントを含むマウスを提供し、上記マウスのＢ細胞の大部分が機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。様々な実施形態において、上記マウスのＢ細胞の大部分がさらに、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流に、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態では、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域は、マウスＣκおよびマウスＣλから選択される。
１つの実施形態において、上記マウスは、抗体の機能的重鎖をコードするように再配列することができないインタクトな内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つおよび８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび４以下のＪ遺伝子セグメントならびにその組み合わせを含み、上記少なくとも１つおよび８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび４以下のＪ遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再配列することができない。特定の実施形態において、上記マウスは、インタクトな内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント内にある機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を含む内因性重鎖遺伝子座を含み、上記内因性重鎖遺伝子座は、８９のＶ遺伝子セグメント、１３のＤ遺伝子セグメント、および４のＪ遺伝子セグメントを含み、上記内因性重鎖遺伝子セグメントは、抗体の重鎖可変領域をコードするように再配列することができず、上記ＡＤＡＭ６遺伝子座は、上記マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質をコードする。
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを欠くマウスであって、該マウスのＢ細胞の大部分がＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の大部分は、ヒトラムダ可変ドメインおよび内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
１つの実施形態において、上記マウスには、２つ以上のＶ遺伝子セグメント、２つ以上のＤ遺伝子セグメント、２つ以上のＪ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを欠く。１つの実施形態において、上記マウスには、少なくとも１つ、かつ８９以下のＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ１３以下のＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つ、かつ４以下のＪ遺伝子セグメント、およびその組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを欠く。１つの実施形態において、上記マウスには、約３メガ塩基の上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む染色体１２由来のゲノムＤＮＡ断片を欠く。特定の実施形態において、上記マウスには、すべての機能的内因性重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを欠く。特定の実施形態において、上記マウスには、８９のＶＨ遺伝子セグメント、１３のＤＨ遺伝子セグメントおよび４つのＪＨ遺伝子セグメントを欠く。
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを生殖細胞系に有し、該免疫グロブリン重鎖遺伝子座への改変が、１つまたは複数のマウス免疫グロブリン可変領域配列の、１つまたは複数の非マウス免疫グロブリン可変領域配列での置換を含むものであるマウスであって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする核酸配列を含むマウスを提供する。好ましい実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨおよびＪＨ配列ならびに少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のＶＨ配列は、非マウス免疫グロブリン可変領域配列によって置換されている。さらなる好ましい実施形態において、上記免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＤＨ、ＪＨおよびすべてのＶＨ配列は、非マウス免疫グロブリン可変領域配列によって置換されている。上記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、再配列していない場合がある。好ましい実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、非マウス種の完全な非構成ＤＨおよびＪＨ領域ならびに少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０の非再配列ＶＨ配列を含む。さらなる好ましい実施形態において、上記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、上記非マウス種の、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ領域すべてを含む、完全可変領域を含む。上記非マウス種は、ホモサピエンスである場合があり、上記非マウス免疫グロブリン可変領域配列は、ヒト配列である場合がある。
１つの態様では、少なくとも１つのヒト可変ドメイン／非ヒト定常ドメイン免疫グロブリンポリペプチドを含む抗体を発現するマウスであって、免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座からマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現するマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、上記マウスのＢ細胞において発現され、該Ｂ細胞は、ヒト可変配列と非ヒト定常配列とを含む再配列免疫グロブリン配列を含む。
１つの実施形態において、上記非ヒト定常配列は、齧歯動物配列である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
１つの態様では、不妊性雄マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、ドナーＥＳ細胞の内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にすること（または該対立遺伝子をノックアウトすること）、該ドナーＥＳ細胞を宿主胚に導入すること、代理母において該宿主胚を妊娠させること、および該ドナーＥＳ細胞に全部または一部由来する後代を該代理母に出産させることを含む。１つの実施形態において、上記方法は、後代を交配させて不妊性雄マウスを得ることをさらに含む。
１つの態様では、対象となる遺伝子改変を有するマウスであって、不妊性であるマウスを作製するための方法を提供し、この方法は、（ａ）対象となる遺伝子改変をゲノム内で行う工程；（ｂ）上記ゲノムを改変して、内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子をノックアウトするか、または内因性ＡＤＡＭ６対立遺伝子を非機能的にする工程；および（ｃ）上記ゲノムをマウスの作製に用いる工程を含む。様々な実施形態において、上記ゲノムは、ＥＳ細胞からのものであり、または核移植実験で使用される。
１つの態様では、本明細書に記載のターゲティングベクター、ヌクレオチド構築物または細胞を使用して作製されるマウスを提供する。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスと、野生型マウスであるまたは遺伝子改変されている第二のマウスとの交配の後代を提供する。
１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖配列の、一つ以上の異種免疫グロブリン重鎖配列での置換を含むマウス系統を維持するための方法を提供する。１つの実施形態において、上記１つまたは複数の異種免疫グロブリン重鎖配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列である。
１つの実施形態において、上記マウス系統は、１つまたは複数のマウスＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび／または１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントをさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のヒトＶＨセグメント、少なくとも２７のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および少なくとも６のＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、定常領域遺伝子に作動可能に連結されている、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０または少なくとも８０のヒトＶＨセグメント、上記少なくとも２７のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび上記少なくとも６のＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、マウス定常領域遺伝子である。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／もしくはＣＨ４またはその組み合わせから選択されるマウス定常領域遺伝子配列を含む。
１つの実施形態において、上記方法は、上記マウス免疫グロブリン重鎖配列の置換に関してヘテロ接合性の雄マウスを産生する工程、および上記ヘテロ接合雄マウスを野生型雌マウスとまたはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌マウスと交配させる工程を含む。１つの実施形態において、上記方法は、ヘテロ接合雄と、野生型である雌またはヒト重鎖配列に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性である雌とを繰り返し交配させることにより上記系統を維持する工程を含む。
１つの実施形態において、上記方法は、ヒト重鎖配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性の雄または雌マウスから細胞を得る工程と、これらの細胞をドナー細胞として、またはこれらの細胞からの核をドナー核として利用する工程と、宿主細胞を使用してならびに／または代理母において該細胞および／もしくは核を妊娠させて遺伝子改変動物を作製するために該細胞または核を使用する工程とを含む。
１つの実施形態では、重鎖遺伝子座における置換に関してヘテロ接合性である雄マウスのみを雌マウスに交配させる。特定の実施形態において、上記雌マウスは、置換される重鎖遺伝子座に関してホモ接合性、ヘテロ接合性または野生型である。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座におけるλおよび／またはκ軽鎖可変配列の、異種免疫グロブリン軽鎖配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記異種免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒト免疫グロブリンλおよび／またはκ軽鎖可変配列である。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子をさらに含み、該導入遺伝子は、免疫グロブリン軽鎖定常領域配列に（非再領域配列については）作動可能に連結されているまたは（再配列の配列については）融合している、再配列または非再配列異種λまたはκ軽鎖配列（例えば、非再配列ＶＬおよび非再配列ＪＬ、または再配列ＶＪ）をコードする配列を含む。１つの実施形態において、上記異種λまたはκ軽鎖配列はヒトのものである。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、齧歯動物、ヒトおよび非ヒト霊長類から選択される。１つの実施形態において、上記定常領域配列は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。１つの実施形態において、上記導入遺伝子は、上記軽鎖配列の発現を駆動する非免疫グロブリンプロモーターを含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、転写活性プロモーターである。特定の実施形態において、上記プロモーターは、ＲＯＳＡ２６プロモーターである。
１つの態様では、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含む核酸構築物を提供し、該上流ホモロジーアームは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、該下流ホモロジーアームは、ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域配列と同一または実質的に同一である配列を含み、マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む配列が、該上流ホモロジーアームと該下流ホモロジーアームの間に配置されている。特定に実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする配列は、野生型マウスの場合に該マウスＡＤＡＭ６が連結されているマウスプロモーターに作動可能に連結されている。
１つの態様では、（ａ）ヒト可変領域遺伝子セグメントヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であるヌクレオチド配列と（ｂ）マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードするヌクレオチド配列とを含むターゲティングベクターを提供する。
１つの実施形態において、上記ターゲティングベクターは、上記マウスＡＤＡＭ６をコードする配列に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む。特定の実施形態において、上記プロモーターは、マウスＡＤＡＭ６プロモーターである。
１つの態様では、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を改変するためのヌクレオチド構築物であって、少なくとも１つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位と、マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする配列とを含む構築物を提供する。
１つの態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む、ＥＳ細胞、多能性細胞および人工多能性（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞をはじめとする（しかしこれらに限定されない）マウス細胞およびマウス胚を提供する。ＸＸである細胞およびＸＹである細胞を提供する。本明細書に記載の改変、例えば、前核注入により細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。ウイルス導入ＡＤＡＭ６遺伝子を含む細胞、胚およびマウス、例えば、該マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む形質導入構築物を含む細胞、胚およびマウスも提供する。
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いている遺伝子改変マウス細胞であって、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする異所性ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変マウス細胞を提供する。１つの実施形態において、上記細胞は、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変をさらに含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列の改変は、マウスＶＨ遺伝子セグメントの欠失、マウスＤＨ遺伝子セグメントの欠失、マウスＪＨ遺伝子セグメントの欠失およびその組み合わせから選択される欠失を含む。特定の実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数のマウス免疫グロブリンＶＨ、ＤＨおよび／またはＪＨ配列の、ヒト免疫グロブリン配列での置換を含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、ヒトＶＨ、ヒトＶＬ、ヒトＤＨ、ヒトＪＨ、ヒトＪＬおよびその組み合わせから選択される。
１つの実施形態において、上記細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または人工多能性細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、マウスＥＳ細胞である。
１つの態様では、再配列免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むマウスＢ細胞であって、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を該Ｂ細胞の染色体上に含むＢ細胞を提供する。１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、上記核酸配列の２つの対立遺伝子を含む。
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再配列マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に隣接する核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記再配列マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む核酸分子とは異なる核酸分子（例えば、Ｂ細胞染色体）上にある。
１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、マウスまたはヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子に作動可能に連結されている再配列非マウス免疫グロブリン可変遺伝子配列を含み、この場合のＢ細胞は、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列を含む。
１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、雄マウスにおいて機能的であるマウスＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片をコードする核酸配列とを含む染色体を含む、マウス体細胞を提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記核酸は、上記改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の単一のコピーを含む。１つの実施形態において、上記体細胞は、上記核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む。特定の実施形態において、上記体細胞は、Ｂ細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、生殖細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、幹細胞である。
１つの態様では、マウス生殖細胞であって、マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列を該生殖細胞の染色体上に含み、該マウスＡＤＡＭ６（またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片）をコードする核酸配列が、野生型マウス生殖細胞の染色体内の位置とは異なる染色体内の位置にあるマウス生殖細胞を提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、マウス免疫グロブリン遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座と同じ染色体上にある。１つの実施形態において、上記核酸配列は、上記生殖細胞の、マウス免疫グロブリン遺伝子座とは異なる染色体上にある。１つの実施形態において、上記マウス免疫グロブリン遺伝子座は、少なくとも１つのマウス免疫グロブリン配列の、少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列での置換を含む。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの非マウス免疫グロブリン配列は、ヒト免疫グロブリン配列である。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する多能性細胞、人工多能性細胞または全能性細胞を提供する。特定の実施形態において、上記細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する細胞または組織を提供する。１つの実施形態において、上記細胞または組織は、本明細書に記載のマウスの脾臓、リンパ節または骨髄に由来する。１つの実施形態において、上記細胞はＢ細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は、胚性幹細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は生殖細胞である。
１つの実施形態において、上記組織は、結合組織、筋組織、神経組織および上皮組織から選択される。特定の実施形態において、上記組織は生殖組織である。
１つの実施形態において、本明細書に記載のマウス由来の細胞および／または組織を、１つまたは複数のｅｘ ｖｉｖｏアッセイに使用するために単離する。様々な実施形態において、上記１つまたは複数のｅｘ ｖｉｖｏアッセイは、物理特性、熱特性、電気特性、機械特性または光学特性、外科手術技法、異なる種類の組織の相互作用の測定、画像化技法の開発、またはそれらの組み合わせを含む。
態様では、抗体を作製するための、本明細書に記載のとおりマウス由来の細胞または組織の使用を提供する。１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のとおりマウス由来の細胞または組織の使用を提供する。
１つの態様では、非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の染色体またはその断片を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、本明細書に記載の非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞は、核移植の結果として上記染色体またはその断片を含む。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスに由来する核を提供する。１つの実施形態において、上記核は、Ｂ細胞ではない２倍体細胞からのものである。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される免疫グロブリン可変領域をコードするヌクレオチド配列を提供する。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列を提供する。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列または免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を提供する。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスにおいて作製される抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ）を提供する。
１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製するための方法を提供し、この方法は、該マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）上流の１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントで置換する工程、および該マウスの該ＡＤＡＭ６遺伝子座の（免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの転写を基準にして）下流の１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントで置換する工程を含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の上流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＶおよびＤ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｊ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記マウスの内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座の下流の１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントを置換する、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態では、上記ＡＤＡＭ６遺伝子の上流および／または下流の上記１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを多能性細胞、人工多能性細胞、または全能性細胞中で置換して、遺伝子改変前駆細胞を形成し；該遺伝子改変前駆細胞を宿主に導入し；そして、該遺伝子改変前駆細胞を含む該宿主を妊娠させて、該遺伝子改変前駆細胞に由来するゲノムを含むマウスを形成する。１つの実施形態において、上記宿主は胚である。特定の実施形態において、上記宿主は、マウス前桑実胚（ｐｒｅ－ｍｏｒｕｌａ）（例えば８または４細胞期）、４倍体胚、胚性細胞の集合体、または胚盤胞から選択される。
１つの態様では、遺伝子改変マウスを作製する方法を提供し、この方法は、マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントとマウスＡＤＡＭ６（または雄マウスにおいて機能的なそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）ヌクレオチド配列とを含むマウスヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列で置換して、第一のキメラ遺伝子座を形成する工程、その後、マウスＡＤＡＭ６コード配列（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする配列）を、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む配列に挿入して、第二のキメラ遺伝子座を形成する工程を含む。
１つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントに作動可能に連結されているヒトＶＨ遺伝子セグメントまたはヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。さらなる特定の実施形態において、上記第二のキメラ遺伝子座は、マウスＣＨ２＋ＣＨ３配列と融合するヒトＣＨ１配列、またはヒトＣＨ１およびヒトヒンジ配列を含む第三のキメラ遺伝子座に作動可能に連結されている。
１つの態様では、妊性雄マウスを作製するための、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む異所性ヌクレオチド配列を含むマウスの使用を提供し、この使用は、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を含む上記異所性ヌクレオチド配列を含むマウスを、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を欠いているマウスと交配させること、および該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を有する後代を産生できる雌である後代を得ること、または該異所性ＡＤＡＭ６遺伝子座もしくは配列を含む雄であって、野生型雄マウスによって示される妊性とほぼ同じである妊性を示す雄である後代を得ることを含む。
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
１つの態様では、完全ヒトＦａｂまたは完全ヒトＦ（ａｂ）２を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
１つの態様では、不死化細胞系を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
１つの態様では、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含有するファージライブラリーを作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
１つの態様では、ヒト抗体を作製するための可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスからリンパ球を単離すること、（ｃ）上記リンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できるリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記リンパ球からの１つまたは複数の可変領域核酸配列を増幅し、それによって可変領域配列を生成することを含む。
１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの脾臓に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスのリンパ節に由来する。１つの実施形態では、上記リンパ球を上記マウスの骨髄に由来する。
１つの実施形態において、上記標識抗体は、蛍光団結合体化抗体である。１つの実施形態において、１つまたは複数の上記蛍光団結合体化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。
１つの実施形態において、上記リンパ球は、Ｂ細胞である。
１つの実施形態において、上記１つまたは複数の可変領域核酸配列は、重鎖可変領域配列を含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数の可変領域核酸配列は、軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態において、上記軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列である。１つの実施形態において、上記１つまたは複数の可変領域核酸配列は、重鎖およびκ軽鎖可変領域配列を含む。
１つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから脾臓を単離すること、（ｃ）上記脾臓からのＢリンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
１つの実施形態において、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから１つまたは複数のリンパ節を単離すること、（ｃ）上記１つまたは複数のリンパ節からのＢリンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。
１つの実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、（ａ）本明細書に記載のマウスを対象となる抗原で免疫すること、（ｂ）（ａ）の免疫したマウスから骨髄を単離すること、（ｃ）上記骨髄からのＢリンパ球を１つまたは複数の標識抗体に曝露すること、（ｄ）上記対象となる抗原に結合できる（ｃ）のＢリンパ球を同定すること、および（ｅ）上記Ｂリンパ球からの重鎖可変領域核酸配列およびκ軽鎖可変領域核酸配列を増幅し、それによって該重鎖可変領域配列およびκ軽鎖可変領域配列を生成することを含む。様々な実施形態において、上記１つまたは複数の標識抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび／またはその組み合わせから選択される。
様々な実施形態では、ヒト抗体を作製するための重鎖およびκ軽鎖可変領域配列を生成するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、増幅重および軽鎖可変領域配列をヒト重および軽鎖定常領域配列に融合させること、融合した重および軽鎖配列を細胞において発現させること、および発現された重および軽鎖配列を回収し、それによってヒト抗体を産生させることをさらに含む。
様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＧから選択される。様々な特定の実施形態において、上記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される。様々な実施形態において、上記ヒト重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４またはその組み合わせを含む。様々な実施形態において、上記軽鎖定常領域は、免疫グロブリンκ定常領域である。様々な実施形態において、上記細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５細胞、Ｌｎｃａｐ細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４３８細胞、ＰＣ３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＴＨＰ－１細胞、Ｕ８７細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＧＨ３細胞、ＰＣ１２細胞、ヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）およびＭＣ３Ｔ３細胞から選択される。特定の実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ細胞である。
１つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物－ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラマウス－ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラマウス－ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該抗体を得る工程を含む。
１つの実施形態において、上記逆キメラマウス－ヒト抗体は、マウスまたはラット重鎖定常遺伝子と融合するヒト重鎖可変ドメイン、およびマウスまたはラットまたはヒト軽鎖定常遺伝子と融合するヒト軽鎖可変ドメインを含む。
１つの実施形態において、上記抗原に対して特異的な上記逆キメラ齧歯動物－ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞の培養は、上記マウスから単離された少なくとも１つの細胞から産生された少なくとも１つのハイブリドーマ細胞で行う。
１つの態様において、対象となる抗原に対して特異的な完全ヒト抗体を産生させるための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のマウスを該抗原で免疫する工程、該抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物－ヒト抗体を産生するマウスから少なくとも１つの細胞を単離する工程、該抗原に対して特異的な該逆キメラ齧歯動物－ヒト抗体に由来する完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を産生させる工程、および該完全ヒト抗体を産生する少なくとも１つの細胞を培養する工程、および該完全ヒト抗体を得る工程を含む。
様々な実施形態において、上記抗原に対して特異的な逆キメラ齧歯動物－ヒト抗体を産生するマウスから単離される少なくとも１つの細胞は、脾細胞またはＢ細胞である。
様々な実施形態において、上記抗体は、モノクローナル抗体である。
様々な実施形態において、上記対象となる抗原での免疫を、タンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または該抗原を発現する細胞を用いて行う。
１つの態様では、免疫グロブリン可変領域またはその断片をコードする核酸配列を作製するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。１つの実施形態では、上記核酸配列を使用して、ヒト抗体またはその抗原結合断片を作製する。１つの実施形態では、上記マウスを使用して、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｓｃＦｖ、二重特異性ｓｃＦｖ、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、Ｖ－ＮＡＲ、ＶＨＨ、ＶＬ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）２、ＤＶＤ（すなわち、二重可変ドメイン抗原結合タンパク質）、ＳＶＤ（すなわち、単一可変ドメイン抗原結合タンパク質）または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ：ＢｉＴＥ）から選択される抗原結合タンパク質を作製する。
１つの態様では、機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列を欠くマウスに異所性ＡＤＡＭ６配列を導入するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供し、この使用は、本明細書に記載のマウスと、該機能的内因性マウスＡＤＡＭ６配列を欠くマウスとを交配させることを含む。
１つの態様では、異所性ＡＤＡＭ６配列を有するマウスを作製するための、本明細書に記載のマウスからの遺伝子材料の使用を提供する。１つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞の核を使用する核移植を含む。１つの実施形態において、上記使用は、本明細書に記載のマウスの細胞を、該細胞に由来する動物を産生するためにクローングすることを含む。１つの実施形態において、上記使用は、上記異所性ＡＤＡＭ６配列を含むマウスを作製するためのプロセスにおける、本明細書に記載のマウスの精子または卵子の利用を含む。
１つの態様では、改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む妊性雄マウスを作製するための方法であって、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む第一のマウス生殖細胞を、雄マウスにおいて機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む第二のマウス生殖細胞で受精させる工程；受精細胞を形成する工程；上記受精細胞を胚へと発生させる工程；および代理母において上記胚を妊娠させてマウスを得る工程を含む方法を提供する。
１つの実施形態において、上記受精は、雄マウスと雌マウスを交配させることによって達成される。１つの実施形態では、上記雌マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。１つの実施形態では、上記雄マウスが上記ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは断片を含む。
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含むゲノムを有するマウスの妊性を回復させるまたは強化するための、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログまたは対応するＡＤＡＭ６タンパク質の機能的断片をコードする核酸配列の使用を提供し、この場合の改変は、内因性ＡＤＡＭ６機能を低減させるまたは消去する。
１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの異所位置に組み込む。１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座に組み込む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。１つの実施形態では、上記核酸配列を上記マウスのゲノムの内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の位置に組み込む。
１つの態様では、ヒト疾患または障害の処置のために、薬物（例えば、抗原結合タンパク質）を製造するための、または薬物（例えば、抗原結合タンパク質）の可変配列をコードする配列を製造するための、本明細書に記載のマウスの使用を提供する。
１つの態様では、遺伝的に改変されたマウス細胞を提供し、上記細胞は、再配列した内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む重鎖を発現することができず、上記細胞は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする機能的ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記細胞はさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの挿入を含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結する重鎖遺伝子セグメントであり、再配列すると、ヒト可変領域を含む抗体の機能的重鎖をコードする。
遺伝的に改変された非ヒト動物、胚、細胞、組織、ならびに上記非ヒト動物を改変するための核酸構築物とそれらを作製し、且つそれらを使用するための方法および組成物を提供する。カッパ（κ）軽鎖との関連において、ラムダ（λ）可変領域（ヒトまたは非ヒト）を産生する動物および細胞を提供し、上記動物および細胞は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはそのオルソログの活性を消去または低減させる重鎖免疫グロブリン遺伝子座の改変を含み、上記動物はさらに、ＡＤＡＭ６活性（またはそのホモログまたはオルソログの活性）を全部または一部回復させる遺伝子改変を含む。妊性があり、ヒト重鎖可変ドメインと同起源のヒトλ可変ドメインを発現するマウスを提供し、上記マウスにおいて、上記ヒトλ可変ドメインは、λまたはκ定常領域と隣接して発現し、様々な実施形態において、上記λまたはκ可変領域は、内因性（例えば、マウスまたはラット）定常領域である。κまたはλ軽鎖との関連において、例えば、内因性マウス軽鎖遺伝子座から、ヒトλ可変領域を産生するマウスおよび細胞も提供する。ラムダ可変領域を含む抗体を作製する方法も提供する。同起源のラムダ可変領域と発現する重鎖を選択する方法も提供する。
体細胞変異した可変領域を含むキメラおよびヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）（マウス軽鎖定常ドメインに融合したヒトＶλおよびヒトＪλ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む軽鎖を有する抗体を含む）およびそれらをコードする核酸が提供される。
１つの態様において、マウス定常領域を含む軽鎖においてヒトλ可変領域配列を発現するマウスが提供される。１つの態様において、κ定常領域を含む軽鎖においてヒトλ可変領域配列を発現するマウスが提供される。１つの態様において、内因性マウス軽鎖遺伝子座から、ヒトλ可変領域配列を含む軽鎖を発現するマウスが提供される。１つの態様において、マウス定常領域配列に連結したヒトλ可変配列を含む再配列した軽鎖遺伝子を含むマウスが提供され；１つの実施形態において、そのマウス定常領域配列は、λ定常配列であり；１つの実施形態において、そのマウス定常領域配列は、κ定常配列である。
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、再配列していないヒトλ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶλ）およびヒトλ連結遺伝子セグメント（ｈＪλ）を含む。１つの実施形態において、その再配列していないｈＶλおよびｈＪλは、マウス軽鎖遺伝子座に存在する。１つの実施形態において、その再配列していないｈＶλおよび再配列していないｈＪλは、導入遺伝子上に存在し、ヒトまたはマウス定常領域配列に作動可能に連結されている。１つの実施形態において、その再配列していないｈＶλおよび再配列していないｈＪλは、エピソーム上に存在する。１つの実施形態において、そのマウスは、再配列していないｈＶλ配列およびｈＪλ配列ならびにマウス軽鎖定常領域（ＣＬ）核酸配列に由来する軽鎖を含む免疫グロブリンを作製することができる。遺伝的に改変されたマウスを作製するためおよび使用するための方法および組成物も提供される。（ａ）マウス重鎖定常領域に融合したヒト重鎖可変ドメイン（ｈＶＨ）、および（ｂ）マウスＣＬドメインに融合したヒト
を含む抗体が提供され、ここで、例えば、本発明のマウスにおける抗体または免疫細胞の選択中に、それらの可変ドメインの１つまたは複数が体細胞変異したものも含まれる。１つの実施形態において、再配列していないｈＶλおよび再配列していないｈＪλは、ヒトまたはマウスκ定常領域（Ｃκ）と作動可能に連結される。１つの実施形態において、その再配列していないｈＶλおよび再配列していないｈＪλは、ヒトまたはマウスλ定常領域（Ｃλ）と作動可能に連結される。
１つの態様において、マウスの生殖細胞系において内因性マウス軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖可変領域配列を含むマウスが提供され、ここで、そのヒトラムダ可変領域配列は、マウス免疫グロブリン定常領域遺伝子配列を含む軽鎖において発現する。
１つの実施形態において、内因性マウス軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。１つの実施形態において、内因性マウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウス軽鎖遺伝子座において内因性軽鎖可変配列を欠く。
１つの実施形態において、すべてまたは実質的にすべての内因性マウス軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、１つまたは複数のヒトλ可変領域遺伝子セグメントで置換される。
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒトＪλ配列を含む。１つの実施形態において、そのヒトＪλ配列は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片を含む。特定の実施形態において、そのヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片は、ｈＶλ３－２７からｈＶλ３－１にわたる。
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、ヒト軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片を含む。特定の実施形態において、そのヒトλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片は、ｈＶλ５－５２からｈＶλ１－４０にわたる。
１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、クラスターＡのゲノム断片およびクラスターＢのゲノム断片を含む。１つの実施形態において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、クラスターＡの少なくとも１つの遺伝子セグメントおよびクラスターＢの少なくとも１つの遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの１０％超が、２－８、２－２３、１－４０、５－４５および９－４９から選択される少なくとも２つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する。１つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの２０％超が、２－８、２－２３、１－４０、５－４５および９－４９から選択される少なくとも３つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する。１つの実施形態において、上記マウスの軽鎖ナイーブレパートリーの３０％超が、２－８、２－２３、１－４０、５－４５および９－４９から選択される少なくとも４つのｈＶλ遺伝子セグメントに由来する。
１つの態様において、マウス定常領域と融合したヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスが提供され、ここで、そのマウスは、約１：１というκの使用頻度（ｕｓａｇｅ）とλの使用頻度との比を示す。
１つの実施形態において、その免疫グロブリン軽鎖は、内因性マウス軽鎖遺伝子座から発現する。
１つの態様において、マウスκ軽鎖定常領域配列と近接する、λ軽鎖可変領域配列（Ｖλ）および少なくとも１つのＪ配列（Ｊ）を含むマウスが提供される。
１つの実施形態において、そのマウスは、機能的なマウスＶκおよび／またはマウスＪκ遺伝子セグメントを欠く。
１つの実施形態において、そのＶλは、ヒトＶλ（ｈＶλ）であり、そのＪは、ヒトＪλ（ｈＪλ）である。１つの実施形態において、そのｈＶλおよびｈＪλは、再配列していない遺伝子セグメントである。
１つの実施形態において、上記マウスは、複数の再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのｈＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、その複数の再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントは、少なくとも１２個の遺伝子セグメント、少なくとも２８個の遺伝子セグメントまたは少なくとも４０個の遺伝子セグメントである。
１つの実施形態において、その少なくとも１つのｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
１つの実施形態において、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座は、全体的にまたは部分的に欠失する。
１つの実施形態において、マウスκ軽鎖定常領域配列は、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に存在する。
１つの実施形態において、上記マウスのＢ細胞の約１０％～約４５％は、ヒトλ軽鎖可変（Ｖλ）ドメインおよびマウスκ軽鎖定常（Ｃκ）ドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。
１つの実施形態において、そのヒトλ可変ドメインは、３－１／１、３－１／７、４－３／１、４－３／７、２－８／１、３－９／１、３－１０／１、３－１０／３、３－１０／７、２－１４／１、３－１９／１、２－２３／１、３－２５／１、１－４０／１、１－４０／２、１－４０／３、１－４０／７、７－４３／１、７－４３／３、１－４４／１、１－４４／７、５－４５／１、５－４５／２、５－４５／７、７－４６／１、７－４６／２、７－４６／７、９－４９／１、９－４９／２、９－４９／７および１－５１／１からなる群より選択される再配列したｈＶλ／ｈＪλ配列に由来する。
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトκ軽鎖遺伝子座由来のヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域をさらに含み、ここで、そのヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、Ｖλ配列およびＪ配列と近接する。特定の実施形態において、ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、Ｖλ配列とＪ配列との間に配置される。
１つの態様において、（ａ）内因性マウス軽鎖遺伝子座に、少なくとも１２個～少なくとも４０個の再配列していないヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメント；（ｂ）少なくとも１２個～少なくとも４０個のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントと少なくとも１つのヒトＪλ配列との間に配置されたヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間配列を含むマウスが提供され；ここで、そのマウスは、ヒトＶλドメインおよびマウスＣκドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。
１つの態様において、λ可変配列およびκ定常配列を含む軽鎖を含む抗体を発現するマウスが提供される。
１つの実施形態において、そのマウスは、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。
１つの実施形態において、そのマウスの骨髄から得られる未熟Ｂ細胞の集団は、約１：１というκの使用頻度とλの使用頻度との比を示す。
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、マウスＣＬ遺伝子を含むマウス軽鎖遺伝子座に作動可能に連結された再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントは、ヒトの遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントは、マウスの遺伝子セグメントであり、ＣＬは、マウスＣκである。
１つの実施形態において、内因性マウス軽鎖遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、内因性マウス軽鎖遺伝子座は、λ軽鎖遺伝子座である。
１つの実施形態において、再配列していないＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、内因性マウス軽鎖遺伝子座に存在する。
１つの実施形態において、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、導入遺伝子上に存在する。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座に、１つまたは複数のヒトＶ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントによる１つまたは複数の重鎖Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントの置換をさらに含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣκ遺伝子を含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣλ遺伝子を含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列していないヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変遺伝子セグメント（Ｖλ）およびλ連結遺伝子セグメント（Ｊλ）を含む。
１つの実施形態において、軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（「ＶＬ遺伝子座」）は、少なくとも１つのヒトＶλ（ｈＶλ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＪλ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、最大４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのＶＬ遺伝子座は、ヒトλおよびヒトκゲノム配列を含む連続配列を含む。
１つの実施形態において、κ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（「κ遺伝子座」）は、少なくとも１つのヒトＶλ（ｈＶλ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＪλ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、最大４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのκ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＶλおよび少なくとも１つのｈＪλを含み、機能的なＶκ領域遺伝子セグメントを欠くかまたは実質的に欠き、機能的なＪκ領域遺伝子セグメントを欠くかまたは実質的に欠く。１つの実施形態において、上記マウスは、機能的なＶκ領域遺伝子セグメントを含まない。１つの実施形態において、上記マウスは、機能的なＪκ領域遺伝子セグメントを含まない。
１つの実施形態において、λ軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（「λ遺伝子座」）は、少なくとも１つのｈＶλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのλ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＪλ（ｈＪλ）遺伝子セグメントを含む。別の実施形態において、そのλ遺伝子座は、最大４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、複数のｈＶλを含む。１つの実施形態では、ヒトにおいて観察される約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％もしくは約９０％またはそれより多くのＶλ使用頻度を反映するλ軽鎖可変領域レパートリーの発現がもたらされるように、複数のｈＶλが選択される。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、遺伝子セグメントｈＶλ１－４０、１－４４、２－８、２－１４、３－２１およびそれらの組み合わせを含む。
１つの実施形態において、ｈＶλは、３－１、４－３、２－８、３－９、３－１０、２－１１および３－１２を含む。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、Ｖλ３－１２からＶλ３－１に及ぶヒトλ軽鎖遺伝子座の連続配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のｈＶλを含む。特定の実施形態において、ｈＶλは、３－１、４－３、２－８、３－９、３－１０、２－１１および３－１２を含む。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、Ｖλ３－１２からＶλ３－１に及ぶヒトλ遺伝子座の連続配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在し、内因性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性λ遺伝子座に存在し、内因性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、１３～２８個またはそれより多くのｈＶλを含む。特定の実施形態において、それらのｈＶλは、２－１４、３－１６、２－１８、３－１９、３－２１、３－２２、２－２３、３－２５および３－２７を含む。特定の実施形態において、κ遺伝子座は、Ｖλ３－２７からＶλ３－１に及ぶヒトλ遺伝子座の連続配列を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在し、内因性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性λ遺伝子座に存在し、内因性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、２９～４０個のｈＶλを含む。特定の実施形態において、κ遺伝子座は、Ｖλ３－２９からＶλ３－１に及ぶヒトλ遺伝子座の連続配列およびＶλ５－５２からＶλ１－４０に及ぶヒトλ遺伝子座の連続配列を含む。特定の実施形態において、遺伝的に改変されたマウスにおけるｈＶλ１－４０とｈＶλ３－２９との間のすべてまたは実質的にすべての配列は、ｈＶλ１－４０遺伝子セグメントの下流（３’非翻訳部分の下流）に天然に（例えば、ヒト集団において）見出されるおよそ９５９ｂｐのヒトλ配列、制限酵素部位（例えば、ＰＩ－ＳｃｅＩ）、それに続いて天然に見出されるｈＶλ３－２９遺伝子セグメントのおよそ３，４３１ｂｐ上流のヒトλ配列から本質的になる。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性マウスκ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性マウスκ遺伝子座に存在し、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性マウスλ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性マウスλ遺伝子座に存在し、内因性マウスκ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＪλを含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、複数のｈＪλを含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも２、３、４、５、６または７個のｈＪλを含む。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、４個のｈＪλを含む。特定の実施形態において、その４個のｈＪλは、ｈＪλ１、ｈＪλ２、ｈＪλ３およびｈＪλ７である。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、κ遺伝子座である。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在し、内因性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、１個のｈＪλを含む。特定の実施形態において、その１個のｈＪλは、ｈＪλ１である。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性κ遺伝子座に存在し、内因性λ軽鎖遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。別の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性λ遺伝子座に存在する。特定の実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、内因性λ遺伝子座に存在し、内因性κ遺伝子座は、部分的にまたは完全に欠失する。
１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＶλ、少なくとも１つのｈＪλおよびマウスＣκ遺伝子を含む。１つの実施形態において、ＶＬ遺伝子座は、少なくとも１つのｈＶλ、少なくとも１つのｈＪλおよびマウスＣλ遺伝子を含む。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一である。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウスκ遺伝子座に、１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントによる内因性マウスＶκ遺伝子セグメントの置換を含み、ここで、そのｈＶλ遺伝子セグメントは、内因性マウスＣκ領域遺伝子に作動可能に連結されており、そのマウスは、ヒトＶλ遺伝子セグメントを再配列し、ヒトＶλドメインおよびマウスＣκを含むリバースキメラ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ）免疫グロブリン軽鎖を発現する。１つの実施形態において、再配列していないマウスＶκ遺伝子セグメントの９０～１００％が、少なくとも１つの再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。特定の実施形態において、内因性マウスＶκ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも１つの再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも１２個、少なくとも２８個または少なくとも４０個の再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも７個の機能的な再配列していないｈＶλ遺伝子セグメント、少なくとも１６個の機能的な再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントまたは少なくとも２７個の機能的な再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つの再配列していないｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてのマウスＪκ遺伝子セグメントの置換を含む。１つの実施形態において、その少なくとも１つの再配列していないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ４、Ｊλ５、Ｊλ６、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントは、３－１、４－３、２－８、３－９、３－１０、２－１１、３－１２、２－１４、３－１６、２－１８、３－１９、３－２１、３－２２、２－２３、３－２５、３－２７、１－４０、７－４３、１－４４、５－４５、７－４６、１－４７、５－４８、９－４９、１－５０、１－５１、５－５２ｈＶλ遺伝子セグメントおよびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その少なくとも１つの再配列していないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性マウスλ遺伝子座に、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントによる内因性マウスＶλ遺伝子セグメントの置換を内因性マウスλ遺伝子座に含み、ここで、そのｈＶλ遺伝子セグメントは、マウスＣλ領域遺伝子に作動可能に連結されており、そのマウスは、ｈＶλ遺伝子セグメントを再配列し、ｈＶλドメインおよびマウスＣλを含むリバースキメラ免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。１つの実施形態において、再配列していないマウスＶλ遺伝子セグメントの９０～１００％が、少なくとも１つの再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。特定の実施形態において、内因性マウスＶλ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも１つの再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントで置換される。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも１２個、少なくとも２８個または少なくとも４０個の再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、その置換は、少なくとも７個の機能的な再配列していないｈＶλ遺伝子セグメント、少なくとも１６個の機能的な再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントまたは少なくとも２７個の機能的な再配列していないｈＶλ遺伝子セグメントによる置換である。１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つの再配列していないｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてのマウスＪλ遺伝子セグメントの置換を含む。１つの実施形態において、その少なくとも１つの再配列していないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ４、Ｊλ５、Ｊλ６、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントは、３－１、４－３、２－８、３－９、３－１０、２－１１、３－１２、２－１４、３－１６、２－１８、３－１９、３－２１、３－２２、２－２３、３－２５、３－２７、１－４０、７－４３、１－４４、５－４５、７－４６、１－４７、５－４８、９－４９、１－５０、１－５１、５－５２ｈＶλ遺伝子セグメントおよびそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、その少なくとも１つの再配列していないｈＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される。
１つの態様において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に配置されたヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列を含む遺伝的に改変されたマウスが提供される。
１つの実施形態において、そのヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列は、ｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントを含むマウスの内因性κ軽鎖遺伝子座に存在し、そのヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列は、ｈＶλ遺伝子セグメントとｈＪλ遺伝子セグメントとの間に配置される。特定の実施形態において、そのｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントは、そのマウスにおいて、機能的なヒトλ軽鎖可変ドメインを形成するように組み換わることができる。
１つの実施形態において、複数のｈＶλおよび１つまたは複数のｈＪλを含むマウスが提供され、転写の点から、ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列は、近位または最も３’側のｈＶλ配列の下流かつ最初のｈＪλ配列の上流または５’側に配置される。
１つの実施形態において、ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、ヒトＶκ４－１遺伝子セグメントの約１３０ｂｐ下流または３’側、ヒトＶκ４－１遺伝子セグメントの３’非翻訳領域の約１３０ｂｐ下流に位置する領域であり、ヒトＪκ１遺伝子セグメントの約６００ｂｐ上流または５’側までに及ぶ。特定の実施形態において、ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、約２２．８ｋｂのサイズである。１つの実施形態において、Ｖκ－Ｊκ遺伝子間領域は、ヒトＶκ４－１遺伝子セグメントの３’非翻訳領域の末端からヒトＪκ１遺伝子セグメントの約６００ｂｐ上流にわたるヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域と約９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上または約９５％以上同一である。１つの実施形態において、Ｖκ－Ｊκ遺伝子間領域は、配列番号１５８を含む。特定の実施形態において、Ｖκ－Ｊκ遺伝子間領域は、配列番号１５８の機能的な断片を含む。特定の実施形態において、Ｖκ－Ｊκ遺伝子間領域は、配列番号１５８である。
１つの態様において、列挙されたヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列を含む非ヒト動物、非ヒト細胞（例えば、ＥＳ細胞または多能性細胞）、非ヒト胚または非ヒト組織が提供され、ここで、その遺伝子間領域配列は、異所性のものである。特定の実施形態において、その異所性の配列は、ヒト化された内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子座に配置されている。１つの実施形態において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウシ、ヒツジおよび非ヒト霊長類から選択される。
１つの態様において、列挙されたヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列を含む単離された核酸構築物が提供される。１つの実施形態において、その核酸構築物は、マウス軽鎖遺伝子座に対してヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域配列を標的とするターゲティングアーム（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｒｍ）を含む。特定の実施形態において、そのマウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。特定の実施形態において、そのターゲティングアームは、ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域を改変された内因性マウスκ遺伝子座に標的化し、ここで、その標的化は、ｈＶλ配列とｈＪλ配列との間の位置に対するものである。
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスは、２つ以下の軽鎖対立遺伝子を含み、ここで、その軽鎖対立遺伝子は、（ａ）マウスＣＬ遺伝子を含む内因性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメント；および（ｂ）マウスＣＬ遺伝子を含む内因性マウス軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、内因性マウス軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。別の実施形態において、内因性マウス軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。
１つの実施形態において、上記２つ以下の軽鎖対立遺伝子は、κ対立遺伝子およびλ対立遺伝子、２つのκ対立遺伝子ならびに２つのλ対立遺伝子から選択される。特定の実施形態において、その２つの軽鎖対立遺伝子のうちの１つは、Ｃλ２遺伝子を含むλ対立遺伝子である。
１つの実施形態において、上記マウスは、１つの機能的な免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および１つの非機能的な軽鎖遺伝子座を含み、ここで、その機能的な軽鎖遺伝子座は、マウスＣκ遺伝子を含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、１つの機能的な免疫グロブリン軽鎖遺伝子座および１つの非機能的な軽鎖遺伝子座を含み、ここで、その機能的な軽鎖遺伝子座は、マウスＣλ遺伝子を含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、そのＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。
１つの実施形態において、上記マウスは、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子をさらに含む。１つの実施形態において、その少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子は、ヒト／マウス重鎖を発現するヒト重鎖遺伝子を含む内因性マウス重鎖遺伝子座に、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記マウスは、２つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子を含み、そのマウスは、ヒト／マウス重鎖を発現する。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性Ｃκ遺伝子を含む内因性マウスκ遺伝子座に、再配列していないｈＶκおよび再配列していないｈＪκを含む第１の軽鎖対立遺伝子；ならびに内因性Ｃκ遺伝子を含む内因性マウスκ遺伝子座に、再配列していないｈＶλおよび再配列していないｈＪλを含む第２の軽鎖対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、その遺伝的に改変されたマウスにおいて機能的な軽鎖対立遺伝子は、その第１および第２の軽鎖対立遺伝子だけである。特定の実施形態において、上記マウスは、非機能的なλ遺伝子座を含む。１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、λ定常領域を含む軽鎖を発現しない。
１つの実施形態において、上記マウスは、内因性Ｃκ遺伝子を含む内因性マウスκ遺伝子座に、再配列していないｈＶκおよび再配列していないｈＪκを含む第１の軽鎖対立遺伝子；ならびに内因性Ｃλ遺伝子を含む内因性マウスλ遺伝子座に、再配列されてい
ないｈＶλおよび再配列していないｈＪλを含む第２の軽鎖対立遺伝子を含む。特定の実施形態において、その遺伝的に改変されたマウスにおいて機能的な軽鎖対立遺伝子は、その第１および第２の軽鎖対立遺伝子だけである。１つの実施形態において、その内因性Ｃλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。
１つの実施形態において、上記マウスは、６個の免疫グロブリン対立遺伝子を含み、ここで、第１の対立遺伝子は、マウスＣκ遺伝子を含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第２の対立遺伝子は、マウスＣκ遺伝子を含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含み、第３の対立遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、マウス重鎖遺伝子を含む内因性マウス重鎖遺伝子座に、再配列していないＶＨおよびＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含み、そして第６の対立遺伝子は、（ａ）マウスＣλ遺伝子を含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むか、（ｂ）非機能的なλ遺伝子座を含むか、または（ｃ）全体的にもしくは部分的にλ遺伝子座の欠失を含む。
１つの実施形態において、上記の第１の対立遺伝子は、再配列していないｈＶλおよびｈＪλを含む。１つの実施形態において、上記の第２の対立遺伝子は、再配列していないｈＶκおよびｈＪκを含む。１つの実施形態において、上記の第３の対立遺伝子は、再配列していないｈＶλおよびｈＪλを含む。１つの実施形態において、上記の第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、再配列していないｈＶＨおよびｈＤＨおよびｈＪＨを含む。１つの実施形態において、上記の第６の対立遺伝子は、全体的にまたは部分的に欠失した内因性マウスλ遺伝子座を含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、６個の免疫グロブリン対立遺伝子を含み、ここで、第１の対立遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第２の対立遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、第３の対立遺伝子は、マウスＣκ遺伝子を含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含み、第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、マウス重鎖遺伝子を含む内因性マウス重鎖遺伝子座に、再配列していないＶＨおよびＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含み、そして第６の対立遺伝子は、（ａ）マウスＣκ遺伝子を含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に、再配列していない免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含むか、（ｂ）非機能的なκ遺伝子座を含むか、または（ｃ）κ遺伝子座の１つまたは複数のエレメントの欠失を含む。
１つの実施形態において、上記の第１の対立遺伝子は、再配列していないｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第２の対立遺伝子は、再配列していないｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第３の対立遺伝子は、再配列していないｈＶκおよびｈＪκ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第４および第５の対立遺伝子は、各々独立して、再配列していないｈＶＨおよびｈＤＨおよびｈＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記の第６の対立遺伝子は、機能的にサイレンシングされた内因性マウスκ遺伝子座を含む。
１つの実施形態において、上記遺伝的に改変されたマウスは、マウスＣＬドメインに作動可能に連結された再配列したｈＶλドメインを含む再配列した抗体遺伝子を含むＢ細胞を含む。１つの実施形態において、そのマウスＣＬドメインは、マウスＣκおよびマウスＣλドメインから選択される。特定の実施形態において、そのマウスＣλドメインは、Ｃλ２遺伝子に由来する。特定の実施形態において、そのマウスＣλドメインは、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλドメインに由来する。
１つの態様において、ＣκであるＣＬにおいてＶλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。１つの態様において、ヒトＣκ、ヒトＣλまたはマウスＣκから選択されるＣＬにおいてｈＶλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。１つの態様において、マウスＣκにおいてｈＶλ領域を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供される。
１つの実施形態において、上記マウスの脾細胞の約１０～５０％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９～２８％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約２３～３４％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９～１１％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約１９～３１％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９～１７％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約２１～３８％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約２４～２７％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約１０～１４％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約９～１３％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約３１～４８％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約１５～２１％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、上記マウスの脾細胞の約３０～３８％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であり、その約３３～４８％は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
１つの実施形態において、上記マウスの骨髄の約５２～７０％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約３１～４７％の未熟Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性／Ｂ２２０中等度陽性（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）／ＩｇＭ陽性）は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
１つの実施形態において、上記マウスの骨髄の約６０％は、Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性）であるか、またはその約３８．３％の未熟Ｂ細胞（すなわち、ＣＤ１９陽性／Ｂ２２０中等度陽性／ＩｇＭ陽性）は、マウスＣκドメインに融合したｈＶλドメインを
含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
１つの実施形態において、上記マウスは、ヒトＶおよびヒトＪ遺伝子セグメントに由来する可変ドメインならびにマウス定常領域遺伝子に由来する定常ドメインを含む軽鎖を含む抗体を発現する。１つの実施形態において、そのマウス定常領域遺伝子は、Ｃκ遺伝子である。別の実施形態において、そのマウス定常領域遺伝子は、Ｃλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのＣλ領域は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。特定の実施形態において、上記抗体は、ヒトＶ、ヒトＤおよびヒトＪ遺伝子セグメントに由来する可変ドメイン、ならびにマウス重鎖定常領域遺伝子に由来する重鎖定常ドメインを含む重鎖をさらに含む。１つの実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４配列を含む。別の実施形態において、そのマウス重鎖定常領域遺伝子は、重鎖定常ドメインのＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４配列を含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、再配列したヒトＶλ－Ｊλ配列およびマウスＣκ配列を含む軽鎖を含む抗体を発現する。１つの実施形態において、その再配列したヒトＶλ－Ｊλ配列は、３－１、４－３、２－８、３－９、３－１０、２－１４、３－１９、２－２３、３－２５、１－４０、７－４３、１－４４、５－４５、７－４６、１－４７、９－４９および１－５１遺伝子セグメントから選択されるｈＶλ遺伝子セグメントの再配列に由来する。１つの実施形態において、その再配列したヒトＶλ－Ｊλ配列は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントから選択されるｈＪλ遺伝子セグメントの再配列に由来する。
１つの実施形態において、上記マウスは、３－１／１、３－１／７、４－３／１、４－３／７、２－８／１、３－９／１、３－１０／１、３－１０／３、３－１０／７、２－１４／１、３－１９／１、２－２３／１、３－２５／１、１－４０／１、１－４０／２、１－４０／３、１－４０／７、７－４３／１、７－４３／３、１－４４／１、１－４４／７、５－４５／１、５－４５／２、５－４５／７、７－４６／１、７－４６／２、７－４６／７、９－４９／１、９－４９／２、９－４９／７および１－５１／１から選択されるヒトＶλ／Ｊλ配列を含む再配列した免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗体を発現する。特定の実施形態において、Ｂ細胞は、マウス重鎖定常ドメインと融合したヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびマウスκ軽鎖定常ドメインと融合したヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する。
１つの態様において、（ａ）再配列していないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する重鎖可変ドメインを含む重鎖（ここで、その重鎖可変ドメインは、マウス重鎖定常（ＣＨ）領域に融合している）；および（ｂ）再配列していないｈＶλおよびｈＪλに由来する軽鎖可変ドメインを含む軽鎖（ここで、その軽鎖可変ドメインは、マウスＣＬ領域に融合している）を含む抗体を発現するマウスが提供される。
１つの実施形態において、上記マウスは、（ｉ）すべてまたは実質的にすべての機能的なヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内因性マウスＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの置換、マウスＣＨ遺伝子を含む重鎖遺伝子座、（ｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内因性マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換、ならびにマウス
遺伝子を含む第１のκ軽鎖遺伝子座、（ｉｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶκおよびｈＪκ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内因性マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換、ならびにマウスＣκ遺伝子を含む第２のκ軽鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、Ｃλ領域を含む抗体を発現しない。１つの実施形態において、上記マウスは、Ｃλ遺伝子および／またはＶλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、非機能的なλ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、そのλ軽鎖遺伝子座は、全体的にまたは部分的に欠失している。
１つの実施形態において、上記マウスは、（ｉ）すべてまたは実質的にすべての機能的なヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内因性マウスＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの置換、マウスＣＨ遺伝子を含む重鎖遺伝子座、（ｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内因性マウスＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの置換ならびにマウスＣλ遺伝子を含む第１のλ軽鎖遺伝子座、（ｉｉｉ）すべて、実質的にすべてまたは複数の機能的なｈＶλおよびｈＪλ遺伝子セグメントによるすべてまたは実質的にすべての機能的な内因性マウスＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの置換ならびにマウスＣλ遺伝子を含む第２のλ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
１つの実施形態において、上記マウスは、Ｃκ遺伝子および／またはＶκおよび／またはＪκ遺伝子セグメントの欠失を含む。１つの実施形態において、上記マウスは、非機能的なκ軽鎖遺伝子座を含む。
１つの態様において、抗体を発現する遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、そのマウスによって産生される総ＩｇＧ抗体の１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超が、λ由来の可変ドメインを含み、そのマウスは、マウスＣκ領域と融合したκ由来の可変ドメインを含む抗体を発現する。特定の実施形態において、そのマウスによって産生される総抗体の約１５～４０％、２０～４０％、２５～４０％、３０～４０％または３５～４０％が、λ由来の可変ドメインを含む。
１つの実施形態において、上記のλ由来の可変ドメインは、ｈＶλおよびｈＪλに由来する。１つの実施形態において、上記のλ由来の可変ドメインは、マウスＣκ領域を含む軽鎖に存在する。特定の実施形態において、上記のλ由来の可変領域は、マウスＣλ領域を含む軽鎖に存在する。別の特定の実施形態において、そのＣλ領域は、Ｃλ２領域である。１つの実施形態において、κ由来の可変ドメインは、ｈＶκおよびｈＪκに由来し、特定の実施形態では、マウスＣκ領域を含む軽鎖に存在する。
１つの態様において、上流の相同性アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）および下流の相同性アームを含む単離されたＤＮＡ構築物が提供され、ここで、その上流および下流の相同性アームは、その構築物をマウスκ遺伝子座に標的化し、その構築物は、機能的な再配列していないｈＶλセグメントおよび機能的な再配列していないｈＪλセグメントならびに選択配列またはマーカー配列を含む。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、マウスＶλ２の上流のマウスλ配列を標的とするためのターゲティングアーム、リコンビナーゼ認識部位が５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスＪλ２の３’側のマウスλ配列を標的とするためのターゲティングアームを含む単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれた（Ｆｒｔ’ｅｄ）Ｈｙｇ－ＴＫカセットである。１つの実施形態において、その３’ターゲティングアームは、マウスＣλ２、Ｊλ４、Ｃλ４およびマウスエンハンサー２．４を含む。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ１に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、リコンビナーゼ認識部位が５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスＣλ１に対して３’側のマウスλ配列を標的とするための３’ターゲティングアームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、ｌｏｘで挟まれた（ｌｏｘｅｄ）ネオマイシンカセットである。１つの実施形態において、その３’ターゲティングアームは、マウスλ３’エンハンサーおよびマウスλ３’エンハンサー３．１を含む。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、リコンビナーゼ認識部位が５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにマウスＪλ２に対して３’側かつマウスＣλ２に対して５’側のマウスλ配列を標的とするための３’ターゲティングアームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたハイグロマイシン－ＴＫカセットである。１つの実施形態において、その３’ターゲティングアームは、マウスＣλ２－Ｊλ４－Ｃλ４遺伝子セグメントおよびマウスλエンハンサー２．４を含む。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、リコンビナーゼ認識部位が５’側および３’側で隣接した選択カセット、ｈＶλ３－１２下流からｈＪλ１の末端までのヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含むヒトゲノム断片、ならびにマウスＪλ２に対して３’側のマウスλ配列を標的とするための３’ターゲティングアームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたネオマイシンカセットである。１つの実施形態において、その３’ターゲティングアームは、マウスＣλ２－Ｊλ４－Ｃλ４遺伝子セグメントおよびマウスλエンハンサー２．４を含む。
１つの態様において、ｈＶλ３－１２下流からｈＪλ１の末端までのヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、リコンビナーゼ認識部位が５’側および３’側で隣接した選択カセット、ならびにｈＶλ２－８の末端に対して下流のｈＶλ３－２７由来のヒトλ軽鎖遺伝子座の連続した領域を含むヒトゲノム断片を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたハイグロマイシンカセットである。１つの実施形態において、そのヒトゲノム断片は、３’ターゲティングアームを構成する。特定の実施形態において、その３’ターゲティングアームは、ｈＶλ３－１２下流からｈＶλ２－８の末端までの約５３ｋｂのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。
１つの態様において、ｈＶλ３－２７下流からｈＶλ３－１２の末端までのヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、Ｖλ２に対して５’側のマウスλ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、リコンビナーゼ認識部位が５’側および３’側で隣接した選択カセット、ｈＶλ５－５２下流からｈＶλ１－４０の末端までのヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む第１のヒトゲノム断片、制限酵素部位、ならびにｈＶλ３－２９下流からｈＶλ８２Ｋの末端までのヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む第２のヒトゲノム断片を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、Ｆｒｔで挟まれたネオマイシンカセットである。１つの実施形態において、その制限酵素部位は、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）のための部位である。特定の実施形態において、そのホーミングエンドヌクレアーゼは、ＰＩ－ＳｃｅＩである。１つの（ｏｎ）実施形態において、上記の第２のヒトゲノム断片は、３’ターゲティングアームである。特定の実施形態において、その３’ターゲティングアームは、ｈＶλ３－２９下流からｈＶλ８２Ｋの末端までの約２７ｋｂのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。
１つの態様において、ｈＶλ５－５２下流からｈＶλ１－４０の末端までのヒトλ軽鎖遺伝子座の連続する領域を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、内因性Ｖκ遺伝子セグメントに対して５’側のマウスκ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、２個の並置されたリコンビナーゼ認識部位、その並置されたリコンビナーゼ認識部位に対して３’側の選択カセット、およびκ軽鎖可変遺伝子セグメントに対して５’側のマウスκ配列を標的とするための３’ターゲティングアームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その並置されたリコンビナーゼ認識部位は、互いに対して逆の向きである。特定の実施形態において、上記リコンビナーゼ認識部位は、異なる。別の特定の実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位である。１つの実施形態において、選択カセットは、ネオマイシンカセットである。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、マウスＪκ遺伝子セグメントに対して５’側のマウスκ遺伝子座を標的とするためのターゲティングアーム、選択カセット、その選択カセットに対して３’側のリコンビナーゼ認識部位、およびマウスＪκ遺伝子セグメントに対して３’側かつマウスκイントロンエンハンサーに対して５’側のマウスκ配列を標的とするための３’ターゲティングアームを含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。１つの実施形態において、その選択カセットは、ハイグロマイシン－ＴＫカセットである。１つの実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、転写に関して選択カセットと同じ向きである。特定の実施形態において、そのリコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘＰ部位である。
１つの態様において、転写の方向に関して５’から３’に向かって、内因性マウスＶκ遺伝子セグメントの５’側の配列を含む第１のマウスゲノム断片、第１のリコンビナーゼ認識部位、第２のリコンビナーゼ認識部位、および内因性マウスＪκ遺伝子セグメントの３’側かつマウスκイントロンエンハンサーの５’側の配列を含む第２のマウスゲノム断片を含む、単離されたＤＮＡ構築物が提供される。
１つの態様において、遺伝的に改変されたマウスが提供され、ここで、その遺伝的改変は、上または本明細書中に記載されるＤＮＡ構築物の１つまたは複数による改変を含む。
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための単離されたＤＮＡ構築物の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための方法における本明細書中に記載されるような単離されたＤＮＡ構築物の使用が提供される。
１つの態様において、上および本明細書中に記載されるようなＤＮＡ構築物を含むターゲティングベクターを含む非ヒト幹細胞が提供される。１つの態様において、非ヒト幹細胞が提供され、ここで、その非ヒト幹細胞は、本明細書中に記載されるマウスに由来する。
１つの実施形態において、上記非ヒト幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。特定の実施形態において、そのＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞である。
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト幹細胞の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト幹細胞の使用が提供される。
１つの態様において、マウス胚が提供され、ここで、そのマウス胚は、本明細書中に提供されるような遺伝的改変を含む。１つの実施形態において、ドナーＥＳ細胞を含む宿主マウス胚が提供され、ここで、そのドナーＥＳ細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的改変を含む。１つの実施形態において、上記マウス胚は、前桑実胚（ｐｒｅ－ｍｏｒｕｌａ）期の胚である。特定の実施形態において、その前桑実胚期の胚は、４細胞期の胚または８細胞期の胚である。別の特定の実施形態において、上記マウス胚は、胚盤胞である。
１つの態様において、本明細書中に記載されるようなマウスを作製するための本明細書中に記載されるようなマウス胚の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるようなマウス胚の使用が提供される。
１つの態様において、非ヒト細胞が提供され、ここで、その非ヒト細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的に改変されたマウスに由来する再配列した免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、その細胞は、Ｂ細胞である。１つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマである。１つの実施形態において、その細胞は、体細胞変異した、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
１つの態様において、非ヒト細胞が提供され、ここで、その非ヒト細胞は、本明細書中に記載されるような遺伝的に改変されたマウスに由来する再配列した免疫グロブリン軽鎖遺伝子配列を含む。１つの実施形態において、その細胞は、Ｂ細胞である。１つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマである。１つの実施形態において、その細胞は、体細胞変異した、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび／または免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする。
１つの態様において、本明細書中に記載されるような非ヒト動物を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト細胞の使用が提供される。１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト細胞の使用が提供される。１つの実施形態において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ウシおよび非ヒト霊長類から選択される。
１つの態様において、（ａ）ｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ遺伝子セグメントに由来する可変領域；ならびに（ｂ）マウスＣＬ遺伝子を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスＢ細胞が提供される。１つの実施形態において、そのマウスＣＬ遺伝子は、ＣκおよびＣλ遺伝子から選択される。特定の実施形態において、そのＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。特定の実施形態において、上記マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。１つの実施形態において、上記マウスＢ細胞は、さらに、（ｃ）ｈＶＨ、ｈＤＨに由来する可変領域および（ｄ）ｈＪＨセグメントを含む同起源の重鎖を発現する。１つの実施形態において、上記Ｂ細胞は、再配列したλ遺伝子を含まない。別の実施形態において、上記Ｂ細胞は、再配列したκ遺伝子を含まない。
１つの態様では、遺伝的に改変された非ヒト動物において抗体を作製する方法であって、（ａ）遺伝的に改変された非ヒト動物を抗原に曝露させる工程（上記動物は内因性軽鎖遺伝子座に少なくとも１つのｈＶλおよび少なくとも１つのｈＪλを含むゲノムを有し、上記内因性軽鎖遺伝子座は非ヒトＣＬ遺伝子を含む）、（ｂ）上記遺伝的に改変された動物に、上記抗原に対する免疫応答を生じさせる工程、および（ｃ）上記（ｂ）の動物から、上記抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または上記（ｂ）の動物から、上記抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程（上記抗体は、ｈＶλ、ｈＪλおよび動物ＣＬ遺伝子に由来する軽鎖を含む）を含む方法を提供する。特定の実施形態において、上記非ヒトＣＬ遺伝子は、マウスＣκ遺伝子である。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、および非ヒト霊長類から選択される。
１つの実施形態において、遺伝的に改変された非ヒト動物において抗体を作製する方法であって：（ａ）遺伝的に改変された動物を抗原に曝露させる工程（上記動物は内因性κ遺伝子座に少なくとも１つのｈＶλおよび上記κ遺伝子座に少なくとも１つのｈＪλを含むゲノムを有し、上記κ遺伝子座は非ヒトＣκ遺伝子を含む）、（ｂ）上記遺伝的に改変された動物に、上記抗原に対する免疫応答を生じさせる工程、および（ｃ）上記（ｂ）の動物から、上記抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または上記（ｂ）のマウスから、上記抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程（上記抗体は、ｈＶλ、ｈＪλおよび非ヒトＣκ遺伝子に由来する軽鎖を含む）を含む方法を提供する。
１つの実施形態において、上記κ軽鎖定常遺伝子は、ヒトＣκ遺伝子およびマウスＣκ遺伝子から選択される。
１つの実施形態において、遺伝的に改変された非ヒト動物において抗体を作製する方法であって：（ａ）遺伝的に改変された非ヒト動物を抗原に曝露させる工程（上記動物はλ軽鎖遺伝子座に少なくとも１つのｈＶλおよび上記λ軽鎖遺伝子座に少なくとも１つのＪλを含むゲノムを有し、上記λ軽鎖遺伝子座は非ヒトＣλ遺伝子を含む）、（ｂ）上記遺伝的に改変された動物に、上記抗原に対する免疫応答を生じさせる工程、および（ｃ）上記（ｂ）の動物から、上記抗原を特異的に認識する抗体を単離する工程、または上記（ｂ）の動物から、上記抗原を特異的に認識する免疫グロブリンドメインを含む細胞を単離する工程、あるいは上記Ｂの動物において、上記抗原と結合する重鎖および／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を同定する工程（上記抗体は、ｈＶλ、ｈＪλおよび非ヒトＣλ遺伝子に由来する軽鎖を含む）を含む方法を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ウシ、および非ヒト霊長類から選択される。
１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、ヒトＣλ遺伝子および非ヒトＣλ遺伝子から選択される。１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、ヒトＣλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのヒトＣλ遺伝子は、Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３およびＣλ７から選択される。１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、マウスまたはラットのＣλ遺伝子である。特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ１、Ｃλ２およびＣλ３から選択される。より特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、Ｃλ２である。別の特定の実施形態において、そのマウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
１つの態様において、遺伝的に改変された非ヒト動物において再配列した抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変された非ヒト動物を抗原に曝露する工程（ここで、その遺伝的改変は、内因性軽鎖遺伝子座にｈＶλおよびｈＪλを含み、その内因性軽鎖遺伝子座は、非ヒト動物ＣＬ遺伝子またはその機能的な断片を含む）；および（ｂ）上記非ヒト動物において再配列した免疫グロブリン遺伝子を同定する工程（ここで、その再配列した免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびＣＬ遺伝子またはその機能的な断片を含む）を包含する。
１つの実施形態において、上記方法はさらに、上記動物から重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列をクローニングする工程を包含し、ここで、その重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトＶλおよびマウスＣＬを含む抗体に由来する。
１つの実施形態において、上記マウスＣＬ遺伝子またはその機能的な断片は、ヒトＣＬ遺伝子およびマウスＣＬ遺伝子またはそれらの機能的な断片から選択される。
１つの実施形態において、遺伝的に改変された非ヒト動物において再配列した抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変された非ヒト動物を抗原に曝露する工程（ここで、その遺伝的改変は、κ軽鎖遺伝子座にｈＶλおよびｈＪλを含み、そのκ軽鎖遺伝子座は、非ヒトＣκ遺伝子またはその機能的な断片を含む）；および（ｂ）上記動物において再配列した免疫グロブリン遺伝子を同定する工程（ここで、その再配列した免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびＣκ遺伝子またはその機能的な断片を含む）を包含する。
１つの実施形態において、上記κ軽鎖定常遺伝子またはその機能的な断片は、ヒトＣκ遺伝子および非ヒト（例えば、マウスまたはラット）Ｃκ遺伝子またはそれらの機能的な断片から選択される。
１つの実施形態において、上記方法はさらに、上記動物から重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列をクローニングする工程を包含し、ここで、その重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトＶλおよび非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）Ｃκを含む抗体に由来する。
１つの実施形態において、遺伝的に改変された非ヒト動物において再配列した抗体遺伝子を作製するための方法が提供され、その方法は：（ａ）遺伝的に改変された非ヒト動物を抗原に曝露する工程（ここで、その遺伝的改変は、非ヒトλ軽鎖遺伝子座にｈＶλおよびｈＪλを含み、そのλ軽鎖遺伝子座は、非ヒトＣλ遺伝子またはその機能的な断片を含む）；および（ｂ）上記動物において再配列した免疫グロブリン遺伝子を同定する工程（ここで、その再配列した免疫グロブリン遺伝子は、λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントおよびＣλ遺伝子またはその機能的な断片を含む）を包含する。
１つの実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子またはその機能的な断片は、ヒトＣλ遺伝子およびマウスもしくはラットＣλ遺伝子またはそれらの機能的な断片から選択される。特定の実施形態において、上記λ軽鎖定常遺伝子は、マウスもしくはラットのＣλ遺伝子またはその機能的な断片である。
１つの実施形態において、上記方法は、重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を上記動物からクローニングする工程をさらに包含し、ここで、その重鎖および／または軽鎖可変領域は、ヒトＶλおよび非ヒト（例えば、マウスまたはラット）Ｃλを含む抗体に由来する。
１つの態様において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程、その動物に、その抗原に特異的に結合する抗体を作製する工程を含む免疫応答を開始させる工程、その動物において重鎖をコードする再配列した核酸配列およびその動物において抗体の同起源の軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列した核酸配列を同定する工程（ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する）、ならびにヒト定常ドメインに融合した重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列を使用して、所望の抗体を作製する工程（ここで、その所望の抗体は、ＣＬドメインに融合したＶλドメインを含む軽鎖を含む）を包含する。１つの実施形態において、そのＶλドメインは、ヒトのドメインであり、ＣＬドメインは、ヒトまたはマウスまたはラットのＣλドメインである。１つの実施形態において、そのＶλドメインは、マウスまたはラットのドメインであり、ＣＬドメインは、ヒトまたはマウスのＣκドメインである。
１つの実施形態において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程、その動物に、その抗原に特異的に結合する抗体を作製する工程を含む免疫応答を開始させる工程、その動物において重鎖をコードする再配列した核酸配列およびその動物において抗体の同起源の軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列した核酸配列を同定する工程（ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する）、ならびにヒト定常ドメインの核酸配列に融合した重鎖および軽鎖可変ドメインの核酸配列を使用して、所望の抗体を作製する工程（ここで、その所望の抗体は、Ｃκドメインに融合したＶλドメインを含む軽鎖を含む）を包含する。
１つの実施形態において、抗体を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程、その動物に、その抗原に特異的に結合する抗体を作製する工程を含む免疫応答を開始させる工程、その動物において重鎖可変ドメインをコードする再配列した核酸配列および抗体の同起源の軽鎖可変ドメイン配列をコードする再配列した核酸配列を同定する工程（ここで、その抗体は、その抗原に特異的に結合する）、ならびにヒト重鎖定常ドメインおよびヒト軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列に融合した核酸配列を使用して、ヒト配列に由来する抗体を作製する工程（ここで、その抗原に特異的に結合する抗体は、非ヒト（例えば、マウスまたはラット）Ｃλ領域に融合したヒトＶλドメインを含む軽鎖を含む）を包含する。
１つの実施形態において、上記Ｃλ領域は、マウスのものであり、１つの実施形態においては、Ｃλ１、Ｃλ２およびＣλ３から選択される。特定の実施形態において、上記マウスＣλ領域は、Ｃλ２である。
１つの態様において、再配列した抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）本明細書中に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程；（ｂ）その動物に免疫応答を開始させる工程；（ｃ）非ヒトＣＬドメインと融合した再配列したヒトＶλドメイン配列をコードする核酸配列を含む細胞をその動物において同定する工程（ここで、その細胞は、ヒトＶＨドメインおよび非ヒトＣＨドメインを含む同起源の重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する）；（ｄ）その細胞からヒトＶλドメインをコードする核酸配列および同起源のヒトＶＨドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程；および（ｅ）ヒトＶλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同起源のヒトＶＨドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。１つの実施形態では、非ヒト動物および非ヒトドメインは、マウスおよびラットから選択される。
１つの実施形態において、再配列した抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）本開示に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程；（ｂ）その動物に免疫応答を開始させる工程；（ｃ）非ヒト動物のＣκドメインをコードする核酸配列と、同じ核酸分子上で連続する再配列したヒトＶλドメイン配列をコードする核酸配列を含む細胞をその動物において同定する工程（ここで、その細胞は、ヒトＶＨドメインおよび非ヒト動物のＣＨドメインを含む同起源の重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する）；（ｄ）その細胞からヒトＶλドメインをコードする核酸配列および同起源のヒトＶＨドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程；および（ｅ）ヒトＶλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同起源のヒトＶＨドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。
１つの実施形態において、再配列した抗体軽鎖可変領域遺伝子配列を作製するための方法が提供され、その方法は、（ａ）本明細書中に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程；（ｂ）その動物にその抗原に対する免疫応答を開始させる工程；（ｃ）その動物の非ヒトＣλドメインと融合した再配列したヒトＶλドメイン配列をコードするＤＮＡを含む細胞をその動物において同定する工程（ここで、その細胞は、ヒトＶＨドメインおよびその動物の非ヒトＣＨドメインを含む同起源の重鎖もコードし、その細胞は、その抗原に結合する抗体を発現する）；（ｄ）その細胞から、再配列したヒトＶλドメインをコードする核酸配列および同起源のヒトＶＨドメインをコードする核酸配列をクローニングする工程；および（ｅ）ヒトＶλドメインをコードするクローニングされた核酸配列および同起源のヒトＶＨドメインをコードするクローニングされた核酸配列を使用して、完全ヒト抗体を作製する工程を包含する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記Ｃλドメインは、マウスＣλ２である。特定の実施形態において、上記マウスＣλドメインは、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
１つの態様において、内因性軽鎖定常領域（ＣＬ）に融合したヒトλ由来の軽鎖を発現する遺伝的に改変された非ヒト動物が提供され、ここで、その動物は、抗原で免疫されると、その動物の非ヒトＣＬドメインに融合したヒトＶλドメインを含む抗体を産生する。１つの実施形態において、その非ヒトＣＬドメインは、ＣκドメインおよびＣλドメインから選択される。１つの実施形態において、そのＣＬドメインは、Ｃκドメインである。１つの実施形態では、その動物はマウスである。１つの実施形態において、そのマウスＣＬドメインは、Ｃλドメインである。特定の実施形態において、そのＣλドメインは、Ｃλ２である。特定の実施形態において、そのマウスＣλドメインは、マウスＣλ２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるＣλ遺伝子に由来する。
１つの態様において、複数の免疫グロブリン重鎖と会合する複数の免疫グロブリンλ軽鎖を発現する、本明細書中に記載されるような改変された内因性κまたはλ軽鎖遺伝子座を含む遺伝的に改変された非ヒト動物が提供される。１つの実施形態において、その重鎖は、ヒト配列を含む。様々な実施形態において、そのヒト配列は、可変配列、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびそれらの組み合わせから選択される。１つの実施形態において、複数の免疫グロブリンλ軽鎖は、ヒト配列を含む。様々な実施形態において、そのヒト配列は、可変配列、定常配列およびそれらの組み合わせから選択される。１つの実施形態において、上記動物は、無能力にされた（ｄｉｓａｂｌｅｄ）内因性免疫グロブリン遺伝子座を含み、導入遺伝子または染色体外エピソームから重鎖および／またはλ軽鎖を発現する。１つの実施形態において、上記動物は、一部もしくは全部の内因性非ヒト重鎖遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊ）、および／または一部もしくは全部の内因性非ヒト重鎖定常配列（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせ）および／または一部もしくは全部の内因性非ヒト軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ、定常またはそれらの組み合わせ）の内因性（非ヒト）遺伝子座に、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン配列による置換を含む。１つの実施形態では、上記非ヒト動物はマウスである。
１つの態様において、ヒトλ由来の軽鎖を有する抗体の作製に適した非ヒト動物が提供され、ここで、その非ヒト動物において産生されるすべてまたは実質的にすべての抗体は、ヒトλ由来の軽鎖とともに発現する。１つの実施形態において、そのヒトλ由来の軽鎖は、内因性軽鎖遺伝子座から発現する。１つの実施形態において、その内因性軽鎖遺伝子座は、κ軽鎖遺伝子座である。特定の実施形態において、上記動物はマウスであり、上記κ軽鎖遺伝子座は、マウスκ軽鎖遺伝子座である。
１つの態様において、ヒト抗体用のλ由来軽鎖を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるような非ヒト動物から軽鎖配列および重鎖配列を得る工程、ならびにヒト抗体を作製する際にその軽鎖配列および重鎖配列を使用する工程を包含する。
１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、その方法は、本明細書中に記載されるような非ヒト動物を抗原に曝露する工程；その非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程；およびその抗原に結合する抗原結合タンパク質をその非ヒト動物から得る工程、またはその抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製する際に使用される配列をその非ヒト動物から得る工程を包含する。
１つの態様において、本明細書中に記載されるような非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）に由来する細胞が提供される。１つの実施形態において、その細胞は、胚性幹細胞、多能性細胞、人工多能性細胞、Ｂ細胞およびハイブリドーマから選択される。
１つの態様において、本明細書中に記載されるような遺伝的改変を含む細胞が提供される。１つの実施形態において、その細胞は、マウス細胞である。１つの実施形態において、その細胞は、ハイブリドーマおよびクアドローマから選択される。１つの実施形態において、その細胞は、マウス定常配列と融合したヒトλ可変配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。特定の実施形態において、そのマウス定常配列は、マウスκ定常配列である。
１つの態様において、本明細書中に記載されるような非ヒト動物に由来する組織が提供される。
１つの態様において、抗原結合タンパク質を作製するための本明細書中に記載されるような非ヒト動物または細胞の使用が提供される。１つの実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質である。１つの実施形態において、そのヒトタンパク質は、ヒト抗体である。
１つの態様において、本明細書中に記載されるような非ヒト動物、細胞、組織または方法によって作製される抗原結合タンパク質が提供される。１つの実施形態において、その抗原結合タンパク質は、ヒトタンパク質である。１つの実施形態において、そのヒトタンパク質は、ヒト抗体である。
別段示されないかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書中に記載されるいずれの実施形態および態様も、互いと組み合わせて使用することができる。他の実施形態は、次の記載を精査することによって当業者に明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非ヒト動物であって、以下：
（ａ）１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、
（ｂ）１つまたは複数のヒトＶＨ、１つまたは複数のヒトＤＨおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入および
（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列であって、該ＡＤＡＭ６タンパク質が異所性ＡＤＡＭ６核酸配列から発現するヌクレオチド配列を含む、
非ヒト動物。
（項目２）
前記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域が、マウス、ラットまたはハムスター定常領域から選択される、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記非ヒト軽鎖定常領域が、齧歯動物定常領域である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記齧歯動物軽鎖定常領域が、マウスＣκ領域である、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記齧歯動物軽鎖定常領域が、ラットＣκ領域である、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記齧歯動物軽鎖定常領域が、マウスＣλ領域である、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記齧歯動物軽鎖定常領域が、ラットＣλ領域である、項目１または２に記載の非ヒト動物。
（項目８）
前記非ヒト動物が少なくとも１２～少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目９）
前記非ヒト動物が、１２のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、項目８に記載の非ヒト動物。
（項目１０）
前記非ヒト動物が、２８のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、項目８に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記非ヒト動物が、４０のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、項目８に記載の非ヒト動物。
（項目１２）
前記少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントが、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせから選択される、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記非ヒトが、少なくとも４つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記少なくとも４つのヒトＪλ遺伝子セグメントが、少なくともＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７を含む、項目１３に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記非ヒト動物において異所性である、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１６）
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型非ヒトＡＤＡＭ６遺伝子座に比較して同じ場所に存在する、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、前記非ヒト動物のゲノムにおいて異所性の場所に存在する、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記免疫グロブリン遺伝子セグメントが、重鎖遺伝子セグメントである、項目１８に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記重鎖遺伝子セグメントが、ヒトである、項目１９に記載の非ヒト動物。
（項目２１）
前記重鎖遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の内因性重鎖遺伝子セグメントである、項目１９に記載の非ヒト動物。
（項目２２）
前記非ヒト動物が、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に、内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを欠く、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２３）
前記非ヒト動物が、該非ヒト動物において免疫グロブリンＶＬドメインを形成するように再配列することができない、内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２４）
全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントで置換される、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２５）
全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントが、１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントで置換される、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２６）
全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物においてインタクトであり、該非ヒト動物が、内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントと内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域との間に挿入される１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２７）
前記インタクトな内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを、前記非ヒト動物において抗体のＶＬドメインを形成するように再配列することができないようにする、項目２６に記載の非ヒト動物。
（項目２８）
前記非ヒト動物がさらに、ヒトκ軽鎖遺伝子座からのヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域を含み、該ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域が、前記１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントと隣接する、先行する項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２９）
前記ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域が、ヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントとの間に配置される、項目２８に記載の非ヒト動物。
（項目３０）
先行する項目のいずれか１項に記載の前記非ヒト動物由来の細胞または組織。
（項目３１）
抗原結合タンパク質を作製するための、項目３０に記載の細胞または組織の使用。
（項目３２）
ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、項目３０に記載の細胞または組織の使用。
（項目３３）
前記細胞がＢ細胞である、項目３１または３２に記載の使用。
（項目３４）
前記組織が前記非ヒト動物の脾臓、骨髄またはリンパ節由来である、項目３１または３２に記載の使用。
（項目３５）
完全なヒト抗体を作製するための、項目３０に記載の細胞または組織の使用。
（項目３６）
ヒトＶλドメインおよび／またはヒトＶＨドメインを作製するための、項目３０に記載の細胞または組織の使用。
（項目３７）
前記細胞または組織が、マウス由来である、項目３１～３６のいずれか１項に記載の使用。
（項目３８）
対象となる抗原に結合する抗体を作製する方法が提供され、該方法は、以下：
（ａ）項目１～２９のいずれか１項に記載の非ヒト動物を対象となる抗原に曝露する工程、
（ｂ）該非ヒト動物の１つまたは複数のＢリンパ球であって、該対象となる抗原に結合する抗体を発現する該１つまたは複数のＢリンパ球を単離する工程、
（ｃ）該対象となる抗原と結合する該抗体の免疫グロブリン軽鎖であって、ヒトＶλドメインおよび非ヒト軽鎖定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列を同定する工程、および
（ｄ）（ｃ）の該核酸配列とヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列を使用し、該対象となる抗原に結合するヒト抗体を作製する工程
を含む方法。
（項目３９）
前記非ヒト軽鎖定常領域が、マウスＣκである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記非ヒト軽鎖定常領域が、マウスＣλである、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記抗体が、ヒトＶＨドメインおよび非ヒトＣＨドメインを含む免疫グロブリン重鎖を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
（ａ）前記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に、１つまたは複数の再配列していないヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数の再配列していないヒトＪλ遺伝子セグメント、
（ｂ）該非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、
該非ヒト動物が、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現することができる、
遺伝的に改変された非ヒト動物。
（項目４４）
前記非ヒト動物が、ヒトＶＨドメインおよび非ヒト重鎖定常領域を含む重鎖と、ヒトＶλドメインおよび非ヒト軽鎖定常領域を含む軽鎖とを含有する抗体を発現する、項目４３に記載の非ヒト動物。
（項目４５）
前記非ヒト軽鎖定常ドメインが、ＣκまたはＣλドメインである、項目４３または４２に記載の非ヒト動物。
（項目４６）
前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片が、前記マウスの生殖細胞系の異所性配列によりコードされる、項目４３～４５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目４７）
前記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片が、前記非ヒト動物の内因性配列によりコードされる、項目４３～４６のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目４８）
前記非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座が、免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座である、項目４３～４７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目４９）
前記非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座が、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である、項目４３～４７のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目５０）
前記非ヒト動物が、前記内因性軽鎖遺伝子座に内因性ＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを欠く、項目４３～４９のいずれか１項の非ヒト動物。
（項目５１）
前記ＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントが、Ｖκおよび／またはＪκ遺伝子セグメントである、項目５０に記載の非ヒト動物。
（項目５２）
前記ＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントが、Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントである、項目５０に記載の非ヒト動物。
（項目５３）
前記非ヒト動物の前記ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントが、１つまたは複数のヒトＶλおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントにより置換される、項目４３～５２のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目５４）
前記ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントが、κ遺伝子セグメントである、項目５３に記載の非ヒト動物。
（項目５５）
前記ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントが、λ遺伝子セグメントである、項目５３に記載の非ヒト動物。
（項目５６）
前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片からのものである、項目４３～５５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目５７）
クラスターＡの前記断片が、ヒトＶλ３－２７からヒトＶλ３－１にわたる、項目５６に記載の非ヒト動物。
（項目５８）
クラスターＡの前記断片が、ヒトＶλ３－１２からヒトＪλ１にわたる、項目５６に記載の非ヒト動物。
（項目５９）
前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片からのものである、項目４３～５５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６０）
クラスターＢの前記断片が、ヒトＶλ５－５２からヒトＶλ１－４０にわたる、項目５９に記載の非ヒト動物。
（項目６１）
前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片からのものおよびクラスターＢの断片からのものである、項目４３～５５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６２）
前記非ヒト動物が、少なくとも１２のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、項目４３～６１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６３）
前記非ヒト動物が、少なくとも２８のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、項目４３～６１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６４）
前記非ヒト動物が、少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、項目４３～６１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６５）
前記少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントが、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４３～６１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６６）
前記非ヒト動物が、齧歯動物である、項目４３～６５のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目６７）
前記齧歯動物が、マウスまたはラットである、項目６６に記載の非ヒト動物。
（項目６８）
抗原結合タンパク質を作製するための、項目４３～６７のいずれか１項に記載の非ヒト動物の使用。
（項目６９）
前記抗原結合タンパク質が、ヒトである、項目６８に記載の使用。
（項目７０）
抗原結合タンパク質が、抗体である、項目６８に記載の使用。
（項目７１）
項目４３～６７のいずれか１項に記載の非ヒト動物由来の細胞または組織。
（項目７２）
前記組織が、脾臓、骨髄またはリンパ節由来である、項目７１に記載の細胞または組織。（項目７３）
前記細胞がＢ細胞である、項目７１に記載の細胞または組織。
（項目７４）
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目７１に記載の細胞または組織。
（項目７５）
前記細胞が、生殖細胞である、項目７１に記載の細胞または組織。
（項目７６）
ヒトＶλドメインまたはヒトＶκドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、ヒトＶＨドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを発現する妊性非ヒト雄動物であって、改変された重鎖可変領域遺伝子座および該雄非ヒト動物において機能的である異所性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む、妊性非ヒト雄動物。
（項目７７）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目７６に記載の妊性雄非ヒト動物。
図１Ａは、約１メガ塩基（Ｍｂ）のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座（白抜きの記号）での約３メガ塩基（Ｍｂ）のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座（黒塗りの記号）の直接ゲノム置換の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
図１Ｂは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の２つのほぼ同一のリピートのうちの約０．５メガ塩基（Ｍｂ）の第一のリピート、すなわち近位リピート（白抜きの記号）での約３メガ塩基（Ｍｂ）のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座（黒塗りの記号）の直接ゲノム置換の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。
図２Ａは、すべてのマウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの欠失ならびに３つのヒトＶＨ、すべてのヒトＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントでの置換を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての最初の３工程（Ａ～Ｃ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの第一の挿入のためのターゲティングベクター（３ｈＶＨ ＢＡＣｖｅｃ）が示されており、このターゲティングベクターは、６７ｋｂ ５’マウスホモロジーアーム、選択カセット（白抜きの長方形）、部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）、１４５ｋｂヒトゲノム断片および８ｋｂ ３’マウスホモロジーアームを有する。後続のターゲティングベクターから挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメント、追加の選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。
図２Ｂは、７７の追加のヒトＶＨ遺伝子セグメントの挿入および最後の選択カセットの除去を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての追加の６工程（Ｄ～Ｉ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。最初のヒト重鎖遺伝子セグメント挿入物（３ｈＶＨ－ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子）への追加のヒトＶＨ遺伝子セグメントの挿入のためのターゲティングベクター（１８ｈＶＨ ＢＡＣｖｅｃ）が示されており、このターゲティングベクターは、２０ｋｂ ５’マウスホモロジーアーム、選択カセット（白抜きの長方形）、１９６ｋｂヒトゲノム断片および６２ｋｂヒトホモロジーアームを有し、該ヒトホモロジーアームは、示されている最初のヒト重鎖遺伝子セグメント挿入物の５’端とオーバーラップしており、該ヒト遺伝子セグメントに対して５’に部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）がある。後続のターゲティングベクターによって挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメントならびに追加の選択カセット（白抜きの長方形）が示されている。
図２Ｃは、すべてのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失（Ｉｇκ－ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子）を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての最初の３工程（Ａ～Ｃ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。上記ターゲティングベクターから挿入される選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。
図２Ｄは、上記近位リピートにおけるすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの挿入および最後の選択カセットの欠失（４０ｈＶκｄＨｙｇハイブリッド対立遺伝子）を生じさせる結果となるマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座の直接ゲノム置換についての追加の５工程（Ｄ～Ｈ）の詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。後続のターゲティングベクターによって挿入されるヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメントならびに追加の選択カセット（白抜きの長方形）が示されている。
図３Ａは、標的胚性幹（ＥＳ）細胞におけるヒト重鎖遺伝子配列の挿入およびマウス重鎖遺伝子配列の喪失を検出するための定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）プライマー／プローブの場所を含む、スクリーニング戦略の一般説明図（縮尺不定）を示すものである。未改変マウス染色体（上部）および正しくターゲティングされた染色体（下部）上の欠失領域（「喪失」プローブＣおよびＤ）、挿入された領域（「ｈＩｇＨ」プローブＧおよびＨ）および隣接領域（「保持」プローブＡ、Ｂ、ＥおよびＦ）のためのｑＰＣＲプライマー／プローブセットを用いた、ＥＳ細胞およびマウスにおける第一のヒト重鎖遺伝子挿入についてのスクリーニング戦略が示されている。
図３Ｂは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントの第一の挿入についての、親ＥＳ細胞および改変ＥＳ細胞における実測プローブコピー数の代表的算定を示すものである。プローブＡからＦについての実測プローブコピー数は、２／２ΔΔＣｔと算定された。ΔΔＣｔは、ａｖｅ［ΔＣｔ（試料）－ｍｅｄΔＣｔ（対照）］として算定され、この式中のΔＣｔは、被験プローブと基準プローブ（アッセイに依存して４と６の間の基準プローブ）の間のＣｔの差である。用語ｍｅｄΔＣｔ（対照）は、親ＥＳ細胞からの多数（＞６０）の非標的ＤＮＡ試料の中央値ΔＣｔである。各改変ＥＳ細胞クローンを６つひと組（ｓｅｘｔｕｐｌｉｃａｔｅ）でアッセイした。親ＥＳ細胞におけるＩｇＨプローブＧおよびＨのコピー数を算定するために、これらのプローブが改変ＥＳ細胞では１のコピー数を有すると仮定し、増幅が観察されなかったとしても３５の最大Ｃｔを用いた。
図３Ｃは、プローブＤおよびＨのみを使用して算定した各遺伝子型の４匹のマウスについてのコピー数の代表算定を示すものである。野生型マウス：ＷＴマウス；ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの最初の挿入物に関してヘテロ接合性のマウス：ＨＥＴマウス；ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの最初の挿入物に関してホモ接合性のマウス：Ｈｏｍｏマウス。
図４Ａは、細菌相同組換え（ＢＨＲ）による３ｈＶＨ ＢＡＣｖｅｃの構築に用いた３工程についての詳細な説明図（縮尺不定）を示すものである。ターゲティングベクターから挿入されたヒト（白抜きの記号）およびマウス（黒塗りの記号）免疫グロブリン遺伝子セグメント、選択カセット（白抜きの長方形）および部位特異的組換え部位（白抜きの三角形）が示されている。
図４Ｂは、ＮｏｔＩ消化後の３つのＢＡＣクローン（Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示すものである。マーカーＭ１、Ｍ２およびＭ３は、それぞれ、ローレンジ、ミドルレンジおよびラムダラダーＰＦＧマーカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）である。
図５Ａは、漸増量のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の逐次的改変の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。重鎖ヒト化の３つの異なる段階それぞれからホモ接合型マウスを作製した。白抜きの記号はヒト配列を示し、黒塗りの記号はマウス配列を示す。
図５Ｂは、漸増量のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子セグメントでのマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の逐次的改変の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。κ軽鎖ヒト化の３つの異なる段階それぞれからホモ接合型マウスを作製した。白抜きの記号はヒト配列を示し、黒塗りの記号はマウス配列を示す。
図６は、野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスにおけるＢ細胞集団のＦＡＣＳドットプロットを示すものである。野生型（ｗｔ）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（Ｖ１）、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（Ｖ２）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３（Ｖ３）マウスの脾臓（最上段、上から三段目および最下段）または鼠蹊リンパ節（上から二段目）からの細胞を、表面ＩｇＭを発現するＢ細胞（最上段、および上から二段目）、κもしくはλ軽鎖のいずれかを含有する表面免疫グロブリン（上から三段目）または特定のハプロタイプの表面ＩｇＭ（最下段）について染色し、集団をＦＡＣＳによって分離した。
図７Ａは、接合部の多様性およびヌクレオチド付加の証拠となる、ＶＨ－ＤＨ－ＪＨ（ＣＤＲ３）接合部周辺のランダムに選択したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の代表重鎖ＣＤＲ３配列を示すものである。重鎖ＣＤＲ３配列をＤＨ遺伝子セグメント使用頻度に従ってグループ分けし、その生殖細胞系を各グループの上に太字で提供する。各重鎖ＣＤＲ３配列についてのＶＨ遺伝子セグメントを各配列の５’端のカッコ内に記入する（例えば、３－７２は、ヒトＶＨ３－７２である）。各重鎖ＣＤＲ３についてのＪＨ遺伝子セグメントを各配列の３’端のカッコ内に記入する（例えば、３は、ヒトＪＨ３である）。示されている各配列についての配列番号は、上から下に進んで、次のとおりである：配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；配列番号３６；配列番号３７；配列番号３８；配列番号３９。
図７Ｂは、接合部の多様性およびヌクレオチド付加の証拠となる、Ｖκ－Ｊκ（ＣＤＲ３）接合部周辺のランダムに選択したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の代表軽鎖ＣＤＲ３配列を示すものである。各軽鎖ＣＤＲ３配列についてのＶκ遺伝子セグメントを各配列の５’端のカッコ内に記入する（例えば、１－６は、ヒトＶκ１－６である）。各軽鎖ＣＤＲ３についてのＪκ遺伝子セグメントを各配列の３’端のカッコ内に記入する（例えば、１は、ヒトＪκ１である）。示されている各配列についての配列番号は、上から下に進んで、次のとおりである：配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３；配列番号４４；配列番号４５；配列番号４６；配列番号４７；配列番号４８；配列番号４９；配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；配列番号５５；配列番号５６；配列番号５７；配列番号５８。
図８は、３８（非免疫ＩｇＭ）、２８（非免疫ＩｇＧ）、３２（ＩｇＧからの非免疫Ｉｇκ）、３６（免疫ＩｇＧ）または３６（ＩｇＧからの免疫Ｉｇκ）配列セットの中の各ヌクレオチド（ＮＴ；左縦列）およびアミノ酸（ＡＡ；右縦列）位置で変化した配列のパーセントとして（マッチする生殖細胞系配列へのアラインメント後に）スコアを付けたＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体の重鎖および軽鎖の体細胞超変異頻度を示すものである。陰影のあるバーは、ＣＤＲの場所を示す。
図９Ａは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。
図９Ｂは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＡアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。
図９Ｃは、野生型マウス（白抜きのバー）またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（黒塗りのバー）におけるＩｇＥアイソタイプについての血清免疫グロブリンのレベルを示すものである。
図１０Ａは、ＩＬ－６Ｒのエクトドメインでの２ラウンドの免疫後（採血試料（ｂｌｅｅｄ）１）または３ラウンドの免疫後（採血試料２）の７匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）および５匹の野生型（ＷＴ）マウスからの血清のインターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に対する抗原特異的ＩｇＧ力価を示すものである。
図１０Ｂは、７匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）マウスおよび５匹の野生型（ＷＴ）マウスからのＩＬ－６Ｒ特異的ＩｇＧアイソタイプ特異的力価を示すものである。
図１１Ａは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて産生された抗インターロイキン－６受容体モノクローナル抗体の親和性分布を示すものである。
図１１Ｂは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（ＶＩ）マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスにおいて産生された抗インターロイキン－６受容体モノクローナル抗体の抗原特異的遮断を示すものである。
図１２は、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒト化内因性重鎖遺伝子座へのマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの挿入のために使用したターゲティングベクター（ｍＡＤＡＭ６ターゲティングベクター）が示されており、このターゲティングベクターは、５’および３’端に工学的に作製された制限酵素認識部位を含む部位特異的組換え部位（Ｆｒｔ）が隣接する選択カセット（ＨＹＧ：ハイグロマイシン）を有する。
図１３は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント１－２（ＶＨ１－２）と６－１（ＶＨ６－１）の間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）の概略説明図（縮尺不定）を示すものである。ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子を欠失させ、ヒト重鎖遺伝子座にユニークな制限酵素認識部位を挿入する細菌相同組換えのためのターゲティングベクター（ｈＡＤＡＭ６Ψターゲティングベクター）が示されており、このターゲティングベクターは、５’および３’端に工学的に作製された制限酵素認識部位を含む部位特異的組換え部位（ｌｏｘＰ）が隣接する選択カセット（ＮＥＯ：ネオマイシン）を有する。部位特異的組換え部位が隣接する選択カセットを含む、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードするゲノム断片を含有する、結果として得られる標的ヒト化重鎖遺伝子座の説明図（縮尺不定）が示されている。
図１４Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む挿入されたマウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の骨髄中のＩｇＭおよびＢ２２０の表面発現についてのシングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）でゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟（Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋）Ｂ細胞の百分率を各等高線図に記入する。
図１４Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の大腿骨から単離した骨髄中の未熟（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟（Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋）Ｂ細胞の総数を示すものである。
図１５Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の骨髄中のｃ－ｋｉｔおよびＣＤ４３の表面発現についてのＣＤ１９＋ゲートＢ細胞のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。プロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３－ｃｋｉｔ－）細胞の百分率を各等高線図のそれぞれ右上および左下象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）に記入する。
図１５Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子を含む異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の大腿骨から単離した骨髄中のプロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３－ｃｋｉｔ－）細胞の総数を示すものである。
図１６Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の骨髄中のＣＤ１９およびＣＤ４３の表面発現についてのシングレットでゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。未熟Ｂ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３－）細胞、プレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３ｉｎｔ）細胞およびプロＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋）細胞の百分率を各等高線図に記入する。
図１６Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の骨髄中の未熟Ｂ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３－）細胞およびプレＢ（ＣＤ１９＋ＣＤ４３ｉｎｔ）細胞のヒストグラムを示すものである。
図１７Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の脾細胞におけるＣＤ１９およびＣＤ３の表面発現についてのシングレットでゲートしたリンパ球のＦＡＣＳ等高線図を示すものである。Ｂ（ＣＤ１９＋ＣＤ３－）細胞およびＴ（ＣＤ１９－ＣＤ３＋）細胞の百分率を各等高線図に記入する。
図１７Ｂは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の脾臓におけるＩｇλおよびＩｇκ軽鎖の表面発現についてのＣＤ１９＋ゲートＢ細胞のＦＡＣｓ等高線図を示すものである。Ｉｇλ＋（左上象限）Ｂ細胞およびＩｇκ＋（右下象限）Ｂ細胞の百分率を各等高線図に記入する。
図１７Ｃは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の総数を示すものである。
図１８Ａは、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋κ＋／＋）ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウス（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）の脾臓におけるＩｇＤおよびＩｇＭの表面発現についてのＣＤ１９＋ゲートＢ細胞のＦＡＣｓ等高線図を示すものである。成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤｈｉｇｈＩｇＭｉｎｔ）の百分率を各等高線図に記入する。右の等高線図上の矢印は、ＩｇＭおよびＩｇＤ表面発現に関連したＢ細胞の成熟過程を図示するものである。
図１８Ｂは、ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉｇｈＩｇＤｉｎｔからＣＤ１９＋ＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉｇｈへの変異の間の、ヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座（Ｈ＋／＋κ＋／＋）に関してホモ接合性のマウスの脾臓ならびにマウスＡＤＡＭ６遺伝子（Ｈ＋／＋Ａ６ｒｅｓκ＋／＋）をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重鎖およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座に関してホモ接合性のマウスの脾臓におけるＢ細胞の総数を示すものである。
図１９は、Ｖλ遺伝子セグメントのクラスター（Ａ、ＢおよびＣ）およびＪλとＣλとの領域対（Ｊ－Ｃ対）を含むヒトλ軽鎖遺伝子座が一定の割合で拡大されていない詳細な説明図を示している。
図２０は、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座を不活性化するために使用されたターゲティングストラテジーが一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２１は、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座を不活性化するために使用されたターゲティングストラテジーが一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２２Ａは、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含むヒトλ軽鎖配列を用いて内因性マウスλ軽鎖遺伝子座を標的とするための最初のターゲティングベクター（１２／１－λターゲティングベクター）が一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２２Ｂは、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメント（１２／１－κターゲティングベクター）、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメント（１２／４－κターゲティングベクター）、１２個のｈＶλ遺伝子セグメント、ヒトＶκ－Ｊκゲノム配列およびｈＪλ１遺伝子セグメント（１２（κ）１－κターゲティングベクター）、ならびに１２個のｈＶλ遺伝子セグメント、ヒトＶκ－Ｊκゲノム配列ならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメント（１２（κ）４－κターゲティングベクター）を含むヒトλ軽鎖配列を用いて内因性マウスκ軽鎖遺伝子座を標的とするための４個の最初のターゲティングベクターが一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２３Ａは、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントをマウスλ軽鎖遺伝子座に漸進的に挿入するためのターゲティングストラテジーが一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２３Ｂは、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントをマウスκ遺伝子座に漸進的に挿入するためのターゲティングストラテジーが一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２４は、ヒトκ遺伝子間配列、複数のｈＪλ遺伝子セグメントまたはその両方を含むハイブリッド軽鎖遺伝子座を構築するための独特のヒトλ－κハイブリッドターゲティングベクターを作製するために使用された標的化工程および分子操作工程が一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２５Ａは、内因性Ｃλ２遺伝子に作動可能に連結された４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントを含む改変されたマウスλ軽鎖遺伝子座についての遺伝子座の構造が一定の割合で拡大されていない全体的な説明図を示している。
図２５Ｂは、内因性Ｃκ遺伝子に作動可能に連結された連続するヒトＶκ－Ｊκゲノム配列ありまたはなしで、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個または４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む４個の独立した改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座についての遺伝子座の構造が一定の割合で拡大されていない全般的な説明を示している。
図２６Ａは、野生型マウス（ＷＴ）、ヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（１２ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）ならびに４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－１ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされたＩｇλ＋およびＩｇκ＋脾細胞のコンタープロット（ｃｏｎｔｏｕｒ ｐｌｏｔ）を示している。
図２６Ｂは、野生型（ＷＴ）、ヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（１２ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）ならびに４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－１ｈＪλ）から回収された脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の総数を示している。
図２７Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）由来の、シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）に対してゲーティングされ、かつＢおよびＴ細胞（それぞれＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）について染色された脾細胞のコンタープロットを示している。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされ、かつＩｇλ＋およびＩｇκ＋発現について染色された、脾細胞のコンタープロットを示している。
図２７Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）から回収された脾臓におけるＣＤ１９＋、ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋およびＣＤ１９＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞の総数を示している。
図２７Ｃは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされ、かつ免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）および免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色された、脾細胞のコンタープロットを示している。コンタープロットの各々において、成熟Ｂ細胞（ＷＴについては７２、４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλについては５１）および移行Ｂ細胞（ＷＴについては１３、４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλについては２２）が表示されている。
図２７Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）から回収された脾臓におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞、移行Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｌｏ）および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）の総数を示している。
図２８Ａの上のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）由来の、ＢおよびＴ細胞（それぞれＣＤ１９＋およびＣＤ３＋）について染色された骨髄のコンタープロットを示している。下のパネルは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）由来の、ＣＤ１９＋に対してゲーティングされ、かつｃｋｉｔ＋およびＣＤ４３＋について染色された、骨髄のコンタープロットを示している。下のパネルのコンタープロットでは、プロＢ細胞（ｐｒｏ Ｂ ｃｅｌｌ）およびプレＢ細胞（ｐｒｅ Ｂ ｃｅｌｌ）が表示されている。
図２８Ｂは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）の大腿骨から回収された骨髄中のプロＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３＋ｃｋｉｔ＋）およびプレＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４３－ｃｋｉｔ－）の数を示している。
図２８Ｃは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）由来の、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）およびＢ２２０について染色されたシングレットに対してゲーティングされた骨髄のコンタープロットを示している。コンタープロットの各々において、未熟、成熟およびプロ／プレＢ細胞が表示されている。
図２８Ｄは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）の大腿骨から単離された骨髄中の未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）の総数を示している。
図２８Ｅは、野生型マウス（ＷＴ）ならびにヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλおよび４個のＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス（４０ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλ）の大腿骨から単離された、ＩｇλおよびＩｇκ発現について染色された未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）および成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）に対してゲーティングされた骨髄のコンタープロットを示している。
図２９は、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された１８個の独立したＲＴ－ＰＣＲクローンのＶλ－Ｊλ－Ｃκジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。Ａ６＝配列番号１１５；Ｂ６＝配列番号１１６；Ｆ６＝配列番号１１７；Ｂ７＝配列番号１１８；Ｅ７＝配列番号１１９；Ｆ７＝配列番号１２０；Ｃ８＝配列番号１２１；Ｅ１２＝配列番号１２２；１－４＝配列番号１２３；１－２０＝配列番号１２４；３Ｂ４３＝配列番号１２５；５－８＝配列番号１２６；５－１９＝配列番号１２７；１０１０＝配列番号１２８；１１Ａ１＝配列番号１２９；７Ａ８＝配列番号１３０；３Ａ３＝配列番号１３１；２－７＝配列番号１３２。小文字の塩基は、組換え中の変異および／またはＮ付加に起因する非生殖細胞系の塩基を示している。ｈＪλ１およびマウスＣκのヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク４領域（ＦＷＲ４）内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
図３０は、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に連続したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含むヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された１２個の独立したＲＴ－ＰＣＲクローンのＶλ－Ｊλ－Ｃλジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。５－２＝配列番号１４５；２－５＝配列番号１４６；１－３＝配列番号１４７；４Ｂ－１＝配列番号１４８；３Ｂ－５＝配列番号１４９；７Ａ－１＝配列番号１５０；５－１＝配列番号１５１；４Ａ－１＝配列番号１５２；１１Ａ－１＝配列番号１５３；５－７＝配列番号１５４；５－４＝配列番号１５５；２－３＝配列番号１５６。小文字の塩基は、組換え中の変異および／またはＮ付加に起因する非生殖細胞系の塩基を示している。各ヒトＪλおよびマウスＣκのヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク４領域（ＦＷＲ４）内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
図３１は、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞ＲＮＡから増幅された３個の独立したＲＴ－ＰＣＲクローンのＶλ－Ｊλ－Ｃλジャンクションのヌクレオチド配列アラインメントを示している。２Ｄ１＝配列番号１５９；２Ｄ９＝配列番号１６０；３Ｅ１５＝配列番号１６１。小文字の塩基は、組換え中の変異および／またはＮ付加に起因する非生殖細胞系の塩基を示している。ｈＪλ１およびマウスＣλ２のヌクレオチド配列によってコードされるフレームワーク４領域（ＦＷＲ４）内のコンセンサスアミノ酸が、配列アラインメントの下に表示されている。
詳細な説明
本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
別様に定義しない限り、本明細書において用いるすべての用語および句は、その用語または句が用いられている文脈から相反することが明確に指摘されるまたは明確に分かる場合を除き、その用語および句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載するものに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、今は特定の方法および材料を記載する。言及するすべての出版物は、参照により本明細書に援用されている。
遺伝子セグメントの量を指すために用いるときの句「実質的な」または「実質的に」（例えば、「実質的にすべての」Ｖ遺伝子セグメント）は、機能的遺伝子セグメントと非機能的遺伝子セグメントの両方を含み、および様々な実施形態において、例えば、すべての遺伝子セグメントの８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上を含む；様々な実施形態において、「実質的にすべての」遺伝子セグメントは、例えば、機能的（すなわち、非偽遺伝子）遺伝子セグメントの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。
用語「置換」は、ゲノム内の配列を該ゲノム配列の遺伝子座において異種配列（例えば、マウスにおけるヒト配列）で置換するようなやり方でＤＮＡ配列を細胞のゲノムに配置する場合のものを含む。そのようにして配置されたＤＮＡは、そのようにして配置された配列を得るために使用した源ＤＮＡの一部である１つまたは複数の調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域、適切な組換えシグナル配列など）を含み得る。例えば、様々な実施形態において、上記置換は、そのように置かれた（ｐｌａｃｅｄ）ＤＮＡ配列（異種配列を含む）から遺伝子産物の産生をもたらす結果となる、異種配列に代えての内因性配列の置き換えであり、該内因性配列の発現ではない；上記置換は、内因性ゲノム配列の、該内因性ゲノム配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列での置換である（例えば、上記内因性ゲノム配列は、免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードしており、上記ＤＮＡ断片は、一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子またはドメインをコードする）。様々な実施形態において、内因性遺伝子またはその断片は、対応するヒト遺伝子またはその断片で置換される。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置換される内因性遺伝子もしくは断片のオルソログである、置換される内因性遺伝子もしくは断片のホモログである、または置換される内因性遺伝子もしくは断片と構造および／もしくは機能の点で実質的に同一もしくは同じである、ヒト遺伝子または断片である。
用語「連続する」は、同じ核酸分子上に存在することに対する言及を包含し、例えば、２つの核酸配列が、同じ核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子上に存在するが別の核酸配列によって中断されている場合、それらは「連続している」。例えば、再配列したＶ（Ｄ）Ｊ配列の最後のコドンは、定常領域配列の最初のコドンに直接続いていないが、そのＶ（Ｄ）Ｊ配列は、定常領域遺伝子配列と「連続している」。別の例では、２個のＶ遺伝子セグメント配列が、同じゲノム断片上に存在する場合、それらは「連続している」が、それらは、Ｖ領域のコドンをコードしない配列によって分かれていることがあり、例えば、それらは、制御配列、例えば、プロモーターまたは他の非コード配列によって分かれていることがある。１つの実施形態において、連続配列は、野生型ゲノムに見出されるように配置されたゲノム配列を含むゲノム断片を含む。
語句「～に由来する」は、言及されている遺伝子または遺伝子セグメント「に由来する」可変領域に関して使用されるとき、特定の再配列していない遺伝子セグメントまたはその可変ドメインを発現する遺伝子を形成するように再配列した遺伝子セグメントまでその配列をさかのぼることができること（適用可能な場合、スプライシングの差異（ｓｐｌｉｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）および体細胞変異を説明する）を含む。
語句「機能的」は、可変領域遺伝子セグメントまたは連結遺伝子セグメントに関して使用されるとき、発現する抗体レパートリーの使用のことを指す；例えば、ヒトでは、Ｖλ遺伝子セグメント３－１、４－３、２－８などが機能的である一方、Ｖλ遺伝子セグメント３－２、３－４、２－５などは、非機能的である。
「重鎖遺伝子座」は、野生型マウスにおいて重鎖可変（ＶＨ）、重鎖多様性（ＤＨ）、重鎖連結（ＪＨ）および重鎖定常（ＣＨ）領域のＤＮＡ配列が見出される、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
「κ遺伝子座」は、野生型マウスにおいてκ可変（Ｖκ）、κ連結（Ｊκ）およびκ定常（Ｃκ）領域のＤＮＡ配列が見出される、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
「λ遺伝子座」は、野生型マウスにおいてλ可変（Ｖλ）、λ連結（Ｊλ）およびλ定常（Ｃλ）領域のＤＮＡ配列が見出される、染色体上の位置、例えば、マウス染色体上の位置を含む。
用語「細胞」は、配列を発現することに関連して使用されるとき、組み換え核酸配列を発現するのに適切な任意の細胞を含む。細胞は、原核生物および真核生物のもの（単一の細胞または複数の細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの菌株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、Ｂ細胞、または細胞融合物、例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどを含む。一部の実施形態において、上記細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウス細胞である。一部の実施形態において、上記細胞は、真核生物細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上記細胞由来の細胞系。一部の実施形態において、上記細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）を含む。
語句「相補性決定領域」、または用語「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に典型的に（すなわち、野生型動物において）出現する生体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系配列または再配列しているもしくは再配列していない配列により、且つ例えば、ナイーブまたは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によりコードされることができる。一部の状況において（例えば、ＣＤＲ３において）、ＣＤＲは、連続していない（例えば、再配列していない核酸配列において）が、Ｂ細胞の核酸配列において、例えば、上記配列をスプライシングまたは結合させた結果として（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ－Ｄ－Ｊ組み換え）、連続する２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によりコードされることができる。
語句「遺伝子セグメント」または「セグメント」は、Ｖ（軽鎖または重鎖）またはＤもしくはＪ（軽鎖または重鎖）免疫グロブリン遺伝子セグメントの言及を含み、再配列したＶ／ＪまたはＶ／Ｄ／Ｊ配列を形成する再配列（例えば、内因性リコンビナーゼにより媒介される）に関与することができる免疫グロブリン遺伝子座（例えば、ヒトおよびマウス）での再配列していない配列を含む。別段の指示がない限り、上記Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントは、１２／２３ルールに従ったＶ／Ｊ組み換えまたはＶ／Ｄ／Ｊ組み換えを可能にする組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含む。別段の指示がない限り、上記セグメントはさらに、天然の、またはその機能的等価物（例えば、Ｖセグメントプロモーター（単数または複数）およびリーダー（単数または複数））に関連する配列を含む。
用語「再配列していない」は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメント（重鎖の場合、Ｄ遺伝子セグメントも同様）が、別々に維持されているが、Ｖ（Ｄ）Ｊレパートリーのうちの単一のＶ，（Ｄ），Ｊを含む再配列したＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を形成するように連結されることが可能である、免疫グロブリン遺伝子座の状態を含む。
語句「マイクロモル濃度範囲（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ ｒａｎｇｅ）」は、１～９９９マイクロモル濃度を意味することを意図し、語句「ナノモル濃度範囲」は、１～９９９ナノモル濃度を意味することを意図し、語句「ピコモル濃度範囲」は、１～９９９ピコモル濃度範囲を意味することを意図する。
用語「非ヒト動物」は、任意の非ヒト動物、例えば、円口類、硬骨魚、軟骨魚類、例えば、サメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、および鳥類を含むことを意図する。適切な非ヒト動物は哺乳類を含む。適切な哺乳類は、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、および齧歯動物を含む。適切な非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含む齧歯動物のファミリーから選択される。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。
遺伝モデルとしてのマウスは、トランスジェニックおよびノックアウト技術によって大きく向上され、これらの技術により特定の遺伝子の指向性過発現または欠失の効果の研究が可能になった。あらゆるその利点にもかかわらず、上記マウスは、マウスをヒト疾患についての不完全なモデルにならしめるおよびヒト治療薬を試験するまたはそれらを作製するための不完全なプラットホームにならしめる遺伝的障害をやはり提示する。第一に、ヒト遺伝子の約９９％はマウスホモログを有する（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら（２００２）Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４２０，５２０－５６２）が、可能性のある治療薬は、多くの場合、所期のヒト標的のマウスオルソログと交叉反応することができない、または不適切に交叉反応する。この問題を未然に防ぐために、選択標的遺伝子を「ヒト化」することができる、すなわち、マウス遺伝子を消去して、対応するオルソロガスヒト遺伝子配列により置換することができる（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号および同第７，１０５，３４８号明細書；これらは参照により本明細書に援用されている）。最初、「ノックアウト・プラス・トランスジェニックヒト化（ｋｎｏｃｋｏｕｔ－ｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」戦略によりマウス遺伝子をヒト化する努力は、上記内因性遺伝子の欠失（すなわち、ノックアウト）を保有するマウスとランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を保有するマウスとの交配を必要とした（例えば、Ｂｒｉｌ，Ｗ．Ｓ．ら（２００６）Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｃＤＮＡ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａｎ Ａｒｇ（５９３） ｔｏ Ｃｙｓ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９５：３４１－３４７；Ｈｏｍａｎｉｃｓ，Ｇ．Ｅ．ら（２００６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍａｐｌｅ ｓｙｒｕｐ ｕｒｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ、ＢＭＣ
Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ７：３３；Ｊａｍｓａｉ，Ｄ．ら（２００６）、Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＢＡＣ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ／ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ
ｆｏｒ ＨｂＥ／ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ８８（３）：３０９－１５；Ｐａｎ，Ｑ．ら（２００６）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｌｅ ｆｏｒ
ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｉｎ ｐｒｅＴ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｐｒｅＴＣＲ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎ ＣＤ３ｄｅｌｔａ／ｅｐｓｉｌｏｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅＴＣＲ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ
ＣＤ３ｇａｍｍａ－ ａｎｄ ＣＤ３ｇａｍｍａｄｅｌｔａ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：１７４１－１７５０参照）。しかし、これらの努力は、サイズ制限によって妨げられた；従来のノックアウト技術は、大きなマウス遺伝子を該遺伝子の大きなヒトゲノムカウンターパートで直接置換するのに十分なものではなかった。該マウス遺伝子の同じまさにその遺伝子の場所で（すなわち内因性マウス遺伝子座で）ヒトカウンターパート遺伝子により内因性マウス遺伝子を直接置換する直接相同置換の直接的なアプローチは、技術的な難しさのため、滅多に試みられない。今まで、直接置換に対する努力は手の込んだ厄介な手順を必要とし、それ故、取り扱うことができる遺伝子材料の長さおよび操作することができる精度が限定された。
外因的に導入されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスの前駆体Ｂ細胞内で再配列する（Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ｋ．およびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １：２３１－２３６）。この発見は、ヒト抗体を発現させるためにノックアウト・プラス・トランスジェニックアプローチを用いるマウスの工学的作製に活用された（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ら（１９９４）Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ＹＡＣｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ７，１３－２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（２００５）．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，１１１７－１１２５；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ
ｆｏｕｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．ら（２００７）Ｆｒｏｍ
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ，ｔｈｅ
ｆｉｒｓｔ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，１１３４－１１４３）。内因性マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ら（２０００）Ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓ－ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ ｍｉｃｅ： ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｉｇ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｋａｐｐａ ｌｏｃｉ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７，７２２－７２７）。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した；それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした（Ｇｉｂｓｏｎら，Ｔ．Ｂ．（２００６）Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ａ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ－ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｃｌｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ ６：２９－３１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、２００７；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．ら（２００７）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ（ＨｕＭａｘ－ＣＤ４）：ｔｗｏ Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １０９（１１）：４６５５－６２；Ｌｏｎｂｅｒｇ、２００５；Ｍａｋｅｒ，Ａ．Ｖ．ら（２００５）Ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ４ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２：ａ ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ １２：１００５－１０１６；ＭｃＣｌｕｎｇ,Ｍ．Ｒ．，Ｌｅｗｉｅｃｋｉ，Ｅ．Ｍ．（
２００６）Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ ｉｎ ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５４，８２１－８３１）。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたＢ細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。上記不全は、（１）ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現（Ｇａｒｒｅｔｔら，Ｆ．Ｅ．（２００５）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｎｅａｒ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ３’ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｉｇｈ ｌｏｃｕｓ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｍｏｄｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｂ－Ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ａｔ ＣＴＣＦ ｓｉｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５，１５１１－１５２５；Ｍａｎｉｓ，Ｊ．Ｐ．ら（２００３）Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ３’ＩｇＨ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３９，７５３－７６０；Ｐａｗｌｉｔｚｋｙ．Ｉ．（２００６）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ５’ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｉｇｈ ｌｏｃｕｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏ－Ｂ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＰＵ．１， Ｐａｘ５，ａｎｄ Ｅ２Ａ．Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６，６８３９－６８５１）；（２）Ｂ細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のＢ細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用（Ｈｏｍｂａｃｈ，Ｊ．ら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｔｈｅ ＩｇＭ
ｃｌａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ．３４３，７６０－７６２）；および（３）親和性選択（Ｒａｏ，Ｓ．Ｐ．ら（２００２）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ｏｎ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ ｃｅｌｌｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，１８５９－１８６８）および免疫グロブリン血清濃度（Ｂｒａｍｂｅｌｌ，Ｆ．Ｗ．ら（１９６４）Ａ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ
ｏｆ Ｇａｍｍａ－Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｎａｔｕｒｅ ２０３：１３５２－１３５４；Ｊｕｎｇｈａｎｓ，Ｒ．Ｐ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．（１９９６）Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＩｇＧ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｓ ｔｈｅ ｂｅｔａ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｅｏｎａｔａｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９３，５５１２－５５１６；Ｒａｏら、２００２；Ｈｊｅｌｍ，Ｆ．ら、２００６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６４，１７７－１８４；Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ． ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．（２００７）Ｆｃ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９６，１７９－２０４）を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスＦｃ受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのｉｎ ｓｉｔｕヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」（すなわち、ヒトＶ：マウスＣ）抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。
内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における置換と共に、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子（例えば、キメラ免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子もしくは完全ヒト完全マウスなど）と共に、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における異種（例えば、別の種からの）免疫グロブリン配列による置換を含む遺伝子改変動物を作製することができる。上記異種免疫グロブリン重鎖配列が由来する種は多種多様であり得、免疫グロブリン軽鎖配列置換に利用される免疫グロブリン軽鎖配列、または免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子に関しても多種多様であり得る。
様々な実施形態において、免疫グロブリン可変領域核酸配列、例えば、Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントは、ヒトまたは非ヒト動物から得られる。Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメントの供給に好適な非ヒト動物としては、例えば、硬骨魚、軟骨魚、例えばサメおよびエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、鳥類（例えば、ニワトリ）が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、例えば、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ（例えば、雌ウシ、ウシ、バッファロー）、シカ、ラクダ、フェレットおよび齧歯動物および非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、マーモセット、アカゲザル、ヒヒ）が挙げられる。好適な非ヒト動物は、ラット、マウスおよびハムスターを含む齧歯動物のファミリーから選択される。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。この文脈から明白であるように、様々な非ヒト動物（例えば、サメ、エイ、哺乳類（例えば、ラクダ、齧歯動物、例えばマウスおよびラット））を可変ドメインまたは可変領域遺伝子セグメントの源として使用することができる。
上記文脈によると、非ヒト動物は、可変配列またはセグメントと併用される定常領域配列の源としても使用される。例えば、ヒトまたは非ヒト可変配列に作動可能に連結される導入遺伝子（例えば、齧歯動物、例えばマウスもしくはラットもしくはハムスター、定常配列に作動可能に連結されたヒトまたは非ヒト霊長類可変配列）において齧歯動物定常配列を使用することができる。したがって、様々な実施形態において、ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメントを齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域遺伝子配列に作動可能に連結させる。一部の実施形態では、上記ヒトＶ、Ｄおよび／またはＪセグメント（または１つまたは複数の再配列ＶＤＪもしくはＶＪ遺伝子）を、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる導入遺伝子におけるマウス、ラットまたはハムスター定常領域遺伝子配列に作動可能に連結または融合させる。
特定の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座におけるＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメントの、１つまたは複数のヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントでの置換を含み、該１つまたは複数のヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメントが、内因性免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に作動可能に連結されているものであるマウスを提供し、この場合のマウスは、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座に導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、マウスまたはラットまたはヒト定常領域に作動可能に連結された非再配列または再配列ヒトＶＬおよびヒトＪＬセグメントを含む。
特定の実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座での１つまたは複数の（ｏｎ
ｏｒ ｍｏｒｅ）ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの挿入を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記挿入は、内因性免疫グロブリン重鎖定常遺伝子の上流であり、１つの実施形態において、上記挿入は、内因性可変（Ｖ）遺伝子セグメントの下流であり、１つの実施形態において、上記挿入は、内因性多様性（Ｄ）遺伝子セグメントの下流であり、１つの実施形態において、上記挿入は、内因性結合（Ｊ）遺伝子セグメントの下流である。様々な実施形態において、上記挿入は、その結果、上記１つまたは複数のヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントが、１つまたは複数の内因性重鎖定常遺伝子と作動可能な連結で配置される。
子孫を産生するマウスの能力を維持しながら、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座でマウス生殖細胞系免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座を大規模にｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子置換するための方法を記載する。具体的には、上記マウス定常領域をインタクトで残しながら、６メガ塩基のマウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子遺伝子座両方を該遺伝子のヒトカウンターパートでの正確に置換することを記載する。結果として、マウス定常領域を維持しながら、マウスの生殖細胞系免疫グロブリン可変レパートリーすべてが等価のヒト生殖細胞系免疫グロブリン可変配列で正確に置換されたマウスを生み出した。上記ヒト可変領域をマウス定常領域に連結させて、再配列して生理的に適切なレベルで発現するキメラヒト－マウス免疫グロブリン遺伝子座を形成する。発現する抗体は、「逆キメラ」である。すなわち、それらはヒト可変領域配列およびマウス定常領域配列を含む。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するヒト化免疫グロブリン可変領域を有するこれらのマウスは、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと呼ばれる。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウスは、野生型マウスのものと本質的に区別できない完全機能的体液性免疫系を示す。上記ヒト化マウスは、Ｂ細胞発生の全ての段階で正常な細胞集団を提示する。上記ヒト化マウスは、正常なリンパ器官形態を示す。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの抗体配列は、正常なＶ（Ｄ）Ｊ再配列および正常な体細胞超変異頻度を示す。これらのマウスにおける抗体集団は、正常なクラススイッチ（例えば、正常なアイソタイプシススイッチ）の結果として生ずるアイソタイプ分布を表わす。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを免疫することにより、治療候補として好適なヒト免疫グロブリン可変ドメインを有する大量の多様な抗体レパートリーを産生する頑強な体液性免疫応答が得られる。このプラットホームは、薬学的に許容され得る抗体および他の抗原結合タンパク質を作製するための豊富な自然親和性成熟ヒト免疫グロブリン可変領域配列源を提供する。
マウス免疫グロブリン可変配列の、ヒト免疫グロブリン可変配列での正確な置換により、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを作製することができる。とはいえ、非常に大きな長さのヒト免疫グロブリン配列の逐次的リコンビニアリング（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）による、重および軽鎖遺伝子座における内因性マウス免疫グロブリン配列の、等価ヒト免疫グロブリン配列での正確の置換は、マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の分岐進化のため、一定の課題を提起し得る。例えば、免疫グロブリン遺伝子座内に散在する遺伝子間配列は、マウスとヒトの間で同一ではなく、一部の状況では、機能的に等価でないこともある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座におけるその相違は、特に内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の一定の部分をヒト化または操作するとき、やはりヒト化マウスに異常を生じさせる結果となる場合がある。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座における一部の改変は有害である。有害な改変としては、例えば、改変されたマウスの交配および子孫産生能力の喪失を挙げることができる。様々な実施形態において、マウスの上記ゲノムのヒト免疫グロブリン配列を工学的に作製することは、改変されたマウス系統に存在しないとき有害となる内因性配列を維持する方法を含む。例示的有害な作用は、改変系統の増殖不能であり、必須の遺伝子の機能の喪失、ポリペプチドを発現することの不能などを含み得る。かかる有害な作用は、上記マウスのゲノムに工学的に作製された改変に直接または間接的に関連し得る。
すべてのマウス定常鎖遺伝子および遺伝子座転写制御領域を含むハイブリッド遺伝子座内の隣接マウス配列をインタクトなままおよび機能的なまま、マウス重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＶＨ－ＤＨ－ＪＨおよびＶκ－Ｊκ）の６メガ塩基可変領域の、対応する１．４メガ塩基ヒトゲノム配列での正確な大規模ｉｎ ｓｉｔｕ置換を行った（図１Ａおよび図１Ｂ）。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，６５２－６５９参照）を用いて、ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶκおよびＪκ遺伝子配列を、ヒト生殖細胞系可変遺伝子座のオーバーラップ断片を担持する１３のキメラＢＡＣターゲティングベクターの段階的挿入により、マウスＥＳ細胞に導入した。
マウス免疫グロブリン遺伝子のヒト化は、今日までのマウスゲノムへの最大の遺伝子改変を代表する。ランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子での以前の努力は、（上で論じた）ある程度の成果を上げたが、上記マウス免疫グロブリン遺伝子の、該遺伝子のヒトカウンターパートでの直接置換は、ほかの点では正常なマウスにおいて完全ヒト抗体を効率的に産生することができる効率を劇的に増加させる。さらに、かかるマウスは、無能化された内因性遺伝子座および完全ヒト抗体導入遺伝子を保有するマウスと比較して、実質的に任意の抗原での免疫後に得ることができる完全ヒト抗体の多様性の劇的増大を示す。様々な分化段階で有意に低減されたＢ細胞集団を示すランダムに組み込まれたヒト導入遺伝子を有するマウスとは対照的に、置換されヒト化された遺伝子座の多彩なバージョンが完全に正常な成熟および未熟Ｂ細胞レベルを示す。ヒト遺伝子導入マウスにおけるヒト遺伝子セグメント数を増加させる努力は、かかる欠陥を低減させたが、拡張されたそれらの免疫グロブリンレパートリーは、野生型マウスと比較してＢ細胞集団の低減を全部は修正しなかった。
免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウス（すなわち、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス）において観察される野生型に近い体液性免疫機能にもかかわらず、ランダムに組み込まれた導入遺伝子を利用する一部のアプローチでは遭遇しない、免疫グロブリンの直接置換を利用すると遭遇する他の課題がある。マウスとヒトの間の免疫グロブリン遺伝子座の遺伝子組成の相違は、免疫グロブリン遺伝子セグメントが置換されたマウスの繁殖にとって有益な配列の発見をもたらした。具体的には、上記内因性免疫グロブリン遺伝子座内にあるマウスＡＤＡＭ遺伝子は、妊性におけるその役割のため、免疫グロブリン遺伝子座が置換されたマウスに最適に存在する。
マウスＡＤＡＭ６のゲノムの場所および機能
いずれかの機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力を欠く雄マウスは、驚くべきことに、交配して子孫を産生する該マウスの能力の欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントをヒト可変領域遺伝子セグメントで置換することによって機能的ＡＤＡＭ６タンパク質を発現する能力を欠く。ＡＤＡＭ６遺伝子座が、ＤＨ遺伝子セグメントの上流にあるＶＨ遺伝子セグメント遺伝子座の３’端の近位の、上記内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このＡＤＡＭ６機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性マウス重鎖可変遺伝子セグメントの、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントでの置換に関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該置換に関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、頻度が低く、サイズが小さい。その代り、上記置換に関してヘテロ接合性の雄を用いて、上記置換に関してホモ接合性の雌と交配させて、上記置換に対してヘテロ接合性の後代を産生し、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させた。上記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおける機能的ＡＤＡＭ６タンパク質の不在であると本発明者らは決定した。
様々な態様において、損傷した（すなわち、非機能的またはわずかに機能的な）ＡＤＡＭ６遺伝子を含む雄マウスは、妊性の低減または消去を示す。マウス（および他の齧歯動物）ではＡＤＡＭ６遺伝子が免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあるため、本発明者らは、置換された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを繁殖させるために、または該マウスの系統を作り、維持するために、様々な改変交配または繁殖スキームを利用することを決定した。内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の置換に関してホモ接合性の雄マウスの低い妊性または不妊性は、マウス系統のかかる改変の維持を困難にする。様々な実施形態において、上記系統の維持は、上記置換に関してホモ接合性の雄マウスによって示される不妊問題の回避を含む。
１つの態様では、本明細書に記載のマウスの系統を維持するための方法を提供する。マウスの上記系統は、異所性ＡＤＡＭ６配列を含む必要がなく、様々な実施形態において、マウスの上記系統は、ＡＤＡＭ６のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
上記マウス系統は、雄マウスにおいて妊性の低減または喪失を生じさせる結果となる内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変を含む。１つの実施形態において、上記改変は、ＡＤＡＭ６遺伝子の調節領域および／またはコーディング領域の欠失を含む。特定の実施形態において、上記改変は、その改変を含む雄マウスの妊性を低減させるまたは消去する内因性ＡＤＡＭ６遺伝子（調節領域および／またはコーディング領域）の改変を含む；特定の実施形態において、上記改変は、その改変に関してホモ接合性である雄マウスの妊性を低減させるまたは消去する。
１つの実施形態において、上記マウス系統は、ＡＤＡＭ６遺伝子のノックアウト（例えば、機能的ノックアウト）または欠失に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから細胞を単離すること、および宿主胚において上記ドナー細胞を用いること、および代理母において上記宿主胚およびドナー細胞を妊娠させること、および上記遺伝子改変を含む後代を上記代理母から得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、ＥＳ細胞である。１つの実施形態において、上記ドナー細胞は、多能性細胞、例えば導入多能性細胞である。
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから、上記改変を含む核酸配列を単離すること、および上記核酸配列を宿主核に導入すること、および好適な動物において上記核酸配列および上記宿主核を含む細胞を妊娠させることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記核酸配列を宿主卵母細胞の胚に導入する。
１つの実施形態では、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であるマウスから核を単離すること、および上記核を宿主細胞に導入すること、および好適な動物において上記核および宿主細胞を妊娠させて、上記改変に関してホモ接合性またはヘテロ接合性である後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。
１つの実施形態では、上記遺伝子改変を含む雄マウスからの精液を用いる、雌マウス（野生型、上記改変に関してホモ接合性、または上記改変に関してヘテロ接合性）のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を用いることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である。１つの実施形態において、上記雄マウスは、上記遺伝子改変に関してホモ接合性である。
１つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄マウスを雌マウスと交配させて、上記遺伝子改変を含む後代を得ること、上記遺伝子改変を含む雄および雌後代を同定すること、および上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性である雄を、野生型である、上記遺伝子改変に関してホモ接合性であるまたはヘテロ接合性である雌との交配に用いて、上記遺伝子改変を含む後代を得ることによって、上記マウス系統を維持する。１つの実施形態では、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雄と、野生型雌、上記遺伝子改変に関してヘテロ接合性の雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性の雌とを交配させる工程を繰り返して、上記マウス系統での上記遺伝子改変を維持する。
１つの態様では、内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖配列での置換を含むマウス系統を維持するための方法であって、上記マウス系統を交配させて、ヘテロ接合型雄マウスを産生する工程を含み、上記ヘテロ接合性雄マウスを交配させて、上記系統において上記遺伝子改変を維持する方法を提供する。特定の実施形態において、上記系統は、ホモ接合性雄と野生型雌、または上記遺伝子改変に関してホモ接合性もしくはヘテロ接合性の雌とのいずれの交配によっても維持されない。
上記ＡＤＡＭ６タンパク質は、タンパク質のＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、ＡＤＡＭは、Ａ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ Ａｎｄ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ）の頭文字である。タンパク質のＡＤＡＭファミリーは、大きく、多様であり、細胞接着をはじめとする多様な機能を有する。ＡＤＡＭファミリーの一部のメンバーは、精子形成および受精に関与する。例えば、ＡＤＡＭ２は、精子－卵子相互作用に関与するタンパク質ファーティリンのサブユニットをコードする。ＡＤＡＭ３、すなわちシリテスティンは、透明帯への精子の結合に必要であるようである。ＡＤＡＭ２またはＡＤＡＭ３いずれかの不在は不妊性を生じさせる結果となる。ＡＤＡＭ２、ＡＤＡＭ３およびＡＤＡＭ６は、マウス精子細胞の表面で複合体を形成すると仮定されている。
ヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ１－２とＶＨ６－１の間で通常見出されるヒトＡＤＡＭ６遺伝子は、偽遺伝子であるようである（図１２）。マウスには２つのＡＤＡＭ６遺伝子－ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ－があり、これらは、マウスＶＨ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域において見つけられ、上記マウスにおいて、ＡＤＡＭ６ａ遺伝子およびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子は、周囲の免疫グロブリン遺伝子セグメントのものとは反対の転写配向に配向する（図１２）。マウスの場合、正常な受精には機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座が明らかに要求される。そこで、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が欠けているまたは非機能的内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する雄マウスにおいて示される受精の徹底的低減を補うまたはレスキューすることができる、ＡＤＡＭ６遺伝子座または配列を指す。
ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂをコードする、マウスにおける上記遺伝子間配列の位置が、内因性マウス重鎖を改変するとき該遺伝子間配列に改変を受けやすくさせる。ＶＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、またはＤＨ遺伝子セグメントを欠失させるもしくは置換するとき、結果として得られるマウスは重度の妊性欠損を示す確率が高い。この欠損を補償するために、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の改変に起因するＡＤＡＭ６活性の喪失を補うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むようにマウスを改変する。様々な実施形態において、補足性ヌクレオチド配列は、妊性欠損をレスキューするマウスＡＤＡＭ６ａ、マウスＡＤＡＭ６ｂ、またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片をコードするものである。代替として、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を保存するのに適切な方法を、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座に隣接する内因性免疫グロブリン重鎖配列が、機能的内因性重鎖可変領域をコードするように再配列することができないようにしながら、使用することができる。例示的な代替方法は、内因性重鎖定常遺伝子に作動可能に連結される機能的重鎖可変領域をコードするように再配列することができないような方法で、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座を配置するマウス染色体の大部分の操作を含む。様々な実施形態において、上記方法は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含有するマウス染色体断片の逆位および／または転座を含む。
妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を任意の好適な位置に配置することができる。上記配列を上記遺伝子間領域に配置することができ、またはゲノム内の任意の好適な位置に（すなわち、異所的に）配置することができる。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド配列を、マウスゲノムにランダムに組み込む導入遺伝子に導入することができる。１つの実施形態では、上記配列をエピソームで、すなわちマウス染色体上ではなく別々の核酸上で、維持することができる。好適な位置としては、転写許容性または活性である位置、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、１９９７、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：３７８９－３７９４）、ＢＴ－５遺伝子座（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８５：３５－４７）またはＯｃｔ４遺伝子座（Ｗａｌｌａｃｅら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１４５５－１４６４）が挙げられる。転写活性遺伝子座へのヌクレオチド配列のターゲティングは、例えば米国特許第７，４７３，５５７号明細書に記載されており、この参考文献は参照により本明細書に援用されている。
あるいは、妊性をレスキューする上記ヌクレオチド配列を誘導性プロモーターとカップリングさせて、適切な細胞および／または組織、例えば生殖組織、での最適な発現を促進することができる。例示的誘導性プロモーターとしては、物理的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）および／または化学的手段によって活性化されるプロモーター（例えば、ＩＰＴＧもしくはテトラサイクリン）が挙げられる。
さらに、上記ヌクレオチド配列の発現を他の遺伝子に関連づけて、特定の発生段階または特定の組織内での発現を実現することができる。かかる発現は、上記ヌクレオチド配列を、特定の発生段階で発現する遺伝子のプロモーターと作動可能に連結させることによって実現することができる。例えば、宿主種のゲノムへと工学的に作製された１つの種からの免疫グロブリン配列を、その宿主種からのＣＤ１９遺伝子（Ｂ細胞特異的遺伝子）のプロモーター配列と作動可能に連結させる。免疫グロブリンが発現する正確な発生段階でのＢ細胞特異的発現が実現される。
挿入されたヌクレオチド配列の頑強な発現を実現するためのさらにもう１つの方法は、構成的プロモーターの利用である。例示的構成的プロモーターとしては、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＵＢＣ、ＥＦ１Ａ、ＰＧＫおよびＣＡＧＧが挙げられる。同様に、所望のヌクレオチド配列を選択された構成的プロモーターと作動可能に連結させ、それにより、該ヌクレオチド配列によってコードされているタンパク質（単数または複数）の高い発現レベルが得られる。
用語「異所性」は、自然界で通常は遭遇しない位置への転位または配置（例えば、核酸配列の、該核酸配列が野生型マウスにおいて見出されるのと同じ位置でない位置への配置）を含むことを意図したものである。様々な実施形態において、この用語は、その対象がその正常なまたは正しい位置外にあるという意味で用いられる。例えば、「．．．をコードする異所性ヌクレオチド配列」という句は、マウスでは通常遭遇しない位置に出現するヌクレオチド配列を指す。例えば、マウスＡＤＡＭ６タンパク質（または雄マウスに対して同じまたは同様の妊性の恩恵をもたらすそのオルソログもしくはホモログもしくは断片）をコードする異所性ヌクレオチド配列の場合、該配列は、野生型マウスにおいて通常見出される位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に配置されることがある。かかる場合、野生型マウスにおける位置とは異なるマウスのゲノム内の位置に上記配列を配置することにより、マウス配列の新規配列接合部を生み出すこととなる。マウスＡＤＡＭ６の機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６－／－マウスにおいて観察される妊性喪失（例えば、交配により子孫を産生する雄マウスの能力の喪失）のレスキューをもたらす配列である。機能的ホモログまたはオルソログは、ＡＤＡＭ６ａのアミノ酸配列に対しておよび／またはＡＤＡＭ６ｂのアミノ酸配列に対して少なくとも約８９％以上の同一性、例えば９９％以下の同一性を有するタンパク質、ならびにＡＤＡＭ６ａおよび／またはＡＤＡＭ６ｂの欠失またはノックアウトを含む遺伝子型を有するマウスの首尾よく交配する能力を補うまたはレスキューすることができるタンパク質を含む。
上記異所位置は、（例えば、マウスＡＤＡＭ６配列を含有する導入遺伝子のランダム挿入の場合のように）どこでもよく、または例えば、野生型マウスにおける（例えば、改変内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座内だがその天然の位置の上流または下流のいずれか、例えば、改変免疫グロブリン遺伝子座内だが、異なる遺伝子セグメント間、またはマウスＶ－Ｄ遺伝子間配列内の異なる位置における）その場所に近い（しかし、正確に同じではない）位置であってもよい。異所性の配置の一例は、上記周囲の内因性重鎖遺伝子セグメントが、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再配列することができないようにしながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座内に、野生型マウスに通常見い出される位置を維持することである。この例において、これは、例えば、上記可変領域遺伝子座に隣接する位置に配置された工学的に作製された部位特異的組み換え部位を使用する、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を含有する上記染色体断片の逆位により、実現され得る。従って、組み換えの際に、上記内因性重鎖可変領域遺伝子座を、上記内因性重鎖定常領域遺伝子からかなり離れた距離に配置し、それにより内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードする再配列を防止する。機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を維持しながら、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の機能的サイレンシングを実現する他の例示的方法は、本開示および／または当技術分野において公知の方法と組み合わせて読むと、当業者であれば明らかである。上記内因性重鎖遺伝子座のかかる配置とともに、上記内因性ＡＤＡＭ６遺伝子は維持され、上記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能的にサイレンシングされる。
異所性配置の別の例は、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座内への配置である。例えば、１つまたは複数の内因性ＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換であって、内因性ＡＤＡＭ６配列を除去する置換を含むマウスを、マウスＡＤＡＭ６配列がヒトＶＨ遺伝子セグメントを含有する配列内に配置されるように工学的に作製することができる。結果として得られる改変は、ヒト遺伝子配列内に（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列を生じさせることとなり、このヒト遺伝子配列内へのマウスＡＤＡＭ６配列の（異所性）配置は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の位置（すなわち、２つのＶセグメント間）に近い場合もあり、またはマウスＡＤＡＭ６配列の位置（すなわち、Ｖ－Ｄ遺伝子間領域内）に近い場合もある。マウスの生殖細胞系内のヒト遺伝子配列（例えば、免疫グロブリン遺伝子配列）内にまたは該ヒト遺伝子配列に隣接した（異所性）マウスＡＤＡＭ６配列の接合により作られる、結果として生ずる配列接合部は、野生型マウスのゲノム内の同じまたは同様の位置と比較して新しいものになる。
様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログを欠く非ヒト動物を提供し、この欠如が該非ヒト動物を不妊性にするか、該非ヒト動物の妊性を実質的に低減させる。様々な実施形態において、上記ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログ欠如は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因する。妊性の実質的低減は、例えば、妊性（例えば、交配頻度、同腹子あたりの子、１年あたりの同腹子、など）の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％またはそれより多くの低減である。様々な実施形態では、非ヒト動物の雄において機能的であるマウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を上記非ヒト動物に補充し、この補充されたＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片により、妊性低減の全部または実質的部分がレスキューされる。妊性の実質的部分のレスキューは、例えば、上記非ヒト動物が、非改変（すなわち、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログへの改変を有さない動物）重鎖遺伝子座と比較して少なくとも７０％、８０％または９０％またはそれより多い妊性を示すような妊性の回復である。
様々な実施形態において、上記遺伝子改変動物（すなわち、例えば免疫グロブリン重鎖遺伝子座の改変に起因して、機能的ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログを欠く動物）に付与する配列は、ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログから選択される。例えば、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、１つの実施形態では、マウスＡＤＡＭ６遺伝子の付加によってレスキューされる。１つの実施形態において、マウスにおけるＡＤＡＭ６機能の喪失は、マウス、例えば齧歯動物、に対して近縁の種、例えば、異なる系統または種のマウス、任意の種のラット、齧歯動物、のオルソログまたはホモログを付加することによってレスキューされ、この場合、上記マウスのオルソログまたはホモログの付加により、ＡＤＡＭ６機能の喪失またはＡＤＡＭ６遺伝子の喪失に起因する妊性の喪失がレスキューされる。他の種からのオルソログおよびホモログは、様々な実施形態において系統発生的に関連した種から選択され、および様々な実施形態において、約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上または９７％以上である内因性ＡＤＡＭ６（またはオルソログ）との同一性パーセントを示し、およびＡＤＡＭ６に関連したまたは（非マウスの場合は）ＡＤＡＭ６オルソログに関連した妊性喪失をレスキューする。例えば、ＡＤＡＭ６機能を欠く遺伝子改変雄ラット（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域で置換された内因性免疫グロブリン重鎖可変領域を有するラット、またはラット免疫グロブリン重鎖領域のノックアウトを有するラット）の場合、そのラットの妊性の喪失は、ラットＡＤＡＭ６の付加によって、または一部の実施形態ではラットＡＤＡＭ６のオルソログ（例えば、別のラット系統もしくは種からの、または１つの実施形態ではマウスからの、ＡＤＡＭ６オルソログ）の付加によってレスキューされる。
このように、様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログ）をコードする核酸配列、または該核酸配列と作動可能に連結された調節領域の改変に起因して妊性を示さないまたは妊性の低減を示す遺伝子改変動物は、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列を含み、この場合、妊性の喪失を補うまたは回復させる核酸配列は、同じ種の異なる系統からのものであるか、系統発生的に類縁の種からのものである。様々な実施形態において、上記補足性核酸配列は、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片である。様々な実施形態において、上記補足性ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、妊性の欠陥を有する遺伝子改変動物に近縁である非ヒト動物からのものである。例えば、上記遺伝子改変動物が特定の系統のマウスである場合、ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片を、別の系統のマウスから得ることができ、類縁種のマウスから得ることができる。１つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物が齧歯目（ｏｒｄｅｒ Ｒｏｄｅｎｔｉａ）のものである場合、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の別の動物からのものである。１つの実施形態において、上記妊性の欠陥を含む遺伝子改変動物は、ネズミ亜目（ｓｕｂｏｒｄｅｒ Ｍｙｏｍｏｒｏｐｈａ）（例えば、トビネズミ（ｊｅｒｂｏａｓ）、ジャンピングマウス（ｊｕｍｐｉｎｇ ｍｉｃｅ）、カンガルーハムスター、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウスおよびラット（ｔｒｕｅ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タケネズミ、モグラネズミ）のものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択される。
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、トビネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ）からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｍｕｒｏｉｄｅａ）からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ上科からのものであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、トビネズミ上科からのものである。
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は齧歯動物である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科内の異なる種からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、カンガルーハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ）およびメクラネズミ科（例えば、デバネズミ、タケネズミおよびモグラネズミ）から選択される科からのものであり；および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、同じ科の異なる種から選択される。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）から選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、アレチネズミ、トゲマウス、またはタテガミネズミから選択される種からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーからのものであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科の異なる種からのものである。特定の実施形態において、上記遺伝子改変齧歯動物は、ネズミ科のマウスであり、および上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ科のラット、アレチネズミ、トゲマウスまたはタテガミネズミからのものである。
様々な実施形態において、１つの科の中の齧歯動物の１つまたは複数の齧歯動物ＡＤＡＭ６オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログを欠く同じ科（例えば、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）；ネズミ科（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ））の遺伝子改変齧歯動物に妊性を回復させる。
様々な実施形態において、ＡＤＡＭ６オルソログ、ホモログおよびその断片を、該オルソログ、ホモログまたは断片が、ＡＤＡＭ６活性を欠く遺伝子改変雄非ヒト動物（例えば、ＡＤＡＭ６またはそのオルソログのノックアウトを含む齧歯動物、例えばマウスまたはラット）に妊性を回復させるかどうか確認することにより、機能性について評価する。様々な実施形態において、機能性は、内因性ＡＤＡＭ６またはそのオルソログもしくはホモログを欠く遺伝子改変動物の精子の、遺伝子改変動物の同じ種の卵管を移動して卵子を受精させる能力と定義される。
様々な態様において、マウスＡＤＡＭ６（例えば、雄マウスにおいて機能的であるそのオルソログまたはホモログまたは断片）に同様の妊性の恩恵をもたらすタンパク質をコードする異所性ヌクレオチド配列を含有する、内因性重鎖可変領域遺伝子座またはその部分の欠失または置換を含むマウスを作製することができる。上記異所性ヌクレオチド配列としては、異なるマウス系統または異なる種、例えば異なる齧歯動物種、のＡＤＡＭ６ホモログまたはオルソログ（またはその断片）であるタンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、妊性の恩恵、例えば、指定された期間にわたっての同腹子数の増加、および／または同腹子あたりの子の数の増加、および／またはマウス卵管を通り抜けてマウス卵子を受精させる雄マウスの精子細胞の能力、を付与するヌクレオチド配列が挙げられる。
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質と少なくとも８９％から９９％同一である（例えば、マウスＡＤＡＭ６ａまたはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％から９９％同一である）ホモログまたはオルソログである。１つの実施形態において、上記異所性ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６ａと少なくとも８９％同一のタンパク質、マウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも８９％同一のタンパク質、およびその組み合わせから独立して選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする。１つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるまたはマウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと約８９％以上同一であるように改変されているラット、ハムスター、マウス、またはモルモットタンパク質である。１つの実施形態において、上記ホモログまたはオルソログは、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと同一であるか、マウスＡＤＡＭ６ａおよび／またはマウスＡＤＡＭ６ｂと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
１つの態様では、（ａ）１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、（ｂ）１つまたは複数のヒトＶＨ、１つまたは複数のヒトＤＨおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入、および（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域は、齧歯動物定常領域である（例えば、マウス、ラットまたはハムスター定常領域から選択される）。１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常領域は、齧歯動物定常領域である。特定の実施形態において、上記軽鎖定常領域は、マウスＣκまたはラットＣκ領域である。特定の実施形態において、上記軽鎖定常領域は、マウスＣλまたはラットＣκ領域である。適切な非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラットおよびハムスターを含む。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、少なくとも１２から少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、１２のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、２８のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、４０のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。様々な実施形態において、上記少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７から選択される。特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、少なくとも４つのヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記少なくとも４つのヒトＪλ遺伝子セグメントは、少なくともＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７を含む。
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物において異所性である。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片（上記非ヒト動物において機能的である）をコードするヌクレオチド配列は、野生型非ヒトＡＤＡＭ６遺伝子座と比較して同じ場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、上記非ヒト動物のゲノムの異所的な場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ヌクレオチド配列はマウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子セグメントはヒトである。１つの実施形態において、上記重鎖遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物の内因性重鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、上記マウスは、１つまたは複数の内因性の再配列していない重鎖遺伝子セグメントを含む異所性の連続配列を含み、上記ＡＤＡＭ６配列は、上記異所性の連続配列内にある。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを欠く。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、上記非ヒト動物の免疫グロブリンＶＬドメインを形成するよう再配列することができない内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶκおよびＪκ遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントで置換される。１つの実施形態において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶλおよびＪλ遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントで置換される。１つの実施形態において、全てまたは実質的に全ての内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物においてインタクトであり、上記非ヒト動物は、内因性免疫グロブリンＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントと内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域との間に挿入される１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記インタクトな内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、上記非ヒト動物において抗体のＶＬドメインを形成するように再配列することができないようにする。様々な実施形態において、上記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。様々な実施形態において、上記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座である。様々な実施形態において、上記内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントである。様々な実施形態において、上記内因性免疫グロブリンＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントである。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物はさらに、ヒトκ軽鎖遺伝子座からのヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域を含み、該ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントに隣接する。特定の実施形態において、上記ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントとの間に配置される。
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞および／または組織を提供し、該細胞および／または組織は、（ａ）１つまたは複数のヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、（ｂ）１つまたは複数のヒトＶＨ、１つまたは複数のヒトＤＨおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入、および（ｃ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域は、マウス定常領域である。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域はラット定常領域である。１つの実施形態において、上記非ヒト重鎖および／または軽鎖定常領域は、ハムスター定常領域である。
１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、上記細胞および／または組織において異所性である。１つの実施形態において、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、野生型非ヒトＡＤＡＭ６遺伝子座に比較して同じ場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞および／または組織はマウス由来であり、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、異所的な場所に存在する。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞および／または組織はマウス由来であり、上記ヌクレオチド配列は、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードし、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。１つの実施形態において、内因性重鎖遺伝子セグメントの連続配列は、上記非ヒト動物において異所的に配置され、異所的に配置された内因性重鎖遺伝子セグメントの上記連続配列は、上記マウスにおいて（例えば、雄マウスにおいて）機能的であるＡＤＡＭ６遺伝子を含む。
１つの態様では、抗原結合タンパク質を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供し、該非ヒト動物は、（ａ）（ｉ）ヒトＶλドメインおよび非ヒト軽鎖定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖および（ｉｉ）ヒトＶＨドメインおよび非ヒト定常領域を含む免疫グロブリン重鎖を含む抗体および（ｂ）ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現する。１つの実施形態において、上記抗原結合タンパク質はヒトである。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物であり、上記非ヒト定常領域は、齧歯動物定常領域である。特定の実施形態において、上記齧歯動物はマウスである。
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物由来の非ヒト細胞または組織を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト細胞または組織は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子と隣接する１つまたは複数のヒト免疫グロブリンＶλ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのヒト免疫グロブリンＪλ遺伝子セグメントと、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と隣接する１つまたは複数のヒトＶＨ、１つまたは複数のヒトＤＨおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントとを含み、上記細胞または組織は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現する。１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常領域遺伝子は、マウスＣκまたはマウスＣλである。
１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、異所性である。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、野生型非ヒト細胞と同じ位置にある。様々な実施形態において、上記非ヒト細胞は、マウスＢ細胞である。様々な実施形態において、上記非ヒト細胞は、胚性幹細胞である。
１つの実施形態において、上記組織は、上記非ヒト動物の脾臓、骨髄またはリンパ節由来である。
１つの態様では、ハイブリドーマまたはクアドローマを作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞または組織の使用を提供する。
１つの態様では、本明細書に記載の改変されたゲノムを含む非ヒト細胞を提供し、該非ヒト細胞は、卵母細胞、宿主胚または本明細書に記載の非ヒト動物からの細胞と、異なる非ヒト動物からの細胞との融合物である。
１つの態様では、完全なヒト抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞または組織の使用を提供する。１つの実施形態において、上記完全なヒト抗体は、本明細書に記載の非ヒト動物から単離されたヒトＶＨドメインおよびヒトＶλドメインを含む。
１つの態様では、対象となる抗原に結合する抗体を作製する方法を提供し、該方法は、（ａ）対象となる抗原に本明細書に記載の非ヒト動物を曝露させる工程、（ｂ）上記非ヒト動物の１つまたは複数のＢリンパ球を単離する工程（上記１つまたは複数のＢリンパ球が上記対象となる抗原と結合する抗体を発現する）、および（ｃ）対象となる抗原と結合する上記抗体の免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列を同定する工程（上記免疫グロブリン軽鎖が、ヒトＶλドメインおよび非ヒト軽鎖定常ドメインを含む）、ならびに（ｄ）対象となる上記抗原と結合するヒト抗体を作製するために、上記（ｃ）の核酸配列とヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列とを使用する工程を含む。
１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常ドメインは、マウスＣκである。１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常ドメインは、マウスＣλである。１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスである。
１つの態様では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座での改変を含む妊性雄マウスを提供し、該妊性雄マウスは、該雄マウスにおいて機能的である異所性ＡＤＡＭ６配列を含む。
ヒト化重鎖マウスにおける異所性ＡＤＡＭ６
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。ＢＡＣ工学は、マウスＥＳ細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。
ヒト抗体を作るマウスは、ここしばらくの間に利用可能になった。これらのマウスは、ヒト治療用抗体の開発の重要な前進の代表であるが、その有用性を制限する多数の重大な異常を提示する。例えば、これらのマウスは、損なわれたＢ細胞発生を提示する。この損なわれた発生は、トランスジェニックマウスと野生型マウスの間の様々な相違に起因し得る。
ヒト抗体は、成熟、増殖、またはクローン選択中の生存についてのシグナルを伝達するマウス細胞の表面のマウスプレＢ細胞受容体またはＢ細部受容体と最適に相互作用しない可能性がある。完全ヒト抗体は、マウスＦｃ受容体系と最適に相互作用しない可能性があるし、マウスは、ヒトＦｃ受容体との１対１の対応を提示しないＦｃ受容体を発現する。結局、完全ヒト抗体を作る様々なマウスは、野生型Ｂ細胞発生に要求され得るすべての真正マウス配列を含まない、例えば、下流エンハンサー要素および他の遺伝子座制御要素を含まない。
完全ヒト抗体を作製するマウスは、何らかの形で無能化されている内因性免疫グロブリン遺伝子座を一般に含み、可変および定常免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むヒト導入遺伝子が、そのマウスゲノム内のランダムな場所に導入される。内因性遺伝子座が、機能的免疫グロブリン遺伝子を形成するように遺伝子セグメントを再配列できないほど無能化されている限り、たとえＢ細胞発生が損なわれていたとしても、かかるマウスにおいて完全ヒト抗体を作製するという目的を達成することができる。
ヒト導入遺伝子遺伝子座から完全ヒト抗体を作製せざるを得ないのだが、マウスにおけるヒト抗体の産生は、好ましくない過程であるようである。一部のマウスでは、この過程は、トランススイッチの機序によりキメラヒト可変／マウス定常重鎖（軽鎖ではなく）が形成される結果をもたらすには好ましいものではない。この機序により、完全ヒト抗体をコードする転写産物は、ヒトアイソタイプからマウスアイソタイプへとトランスでアイソタイプスイッチされる。完全ヒト導入遺伝子は、マウス重鎖定常領域遺伝子の非損傷コピーを保持する内因性遺伝子座から離れた場所にあるため、この過程はトランスでの過程となる。かかるマウスではトランススイッチが容易に分かるが、この現象はＢ細胞発生のレスキューにやはり不十分であり、Ｂ細胞発生は明らかに害されたままである。いずれにせよ、トランススイッチ現象は軽鎖に関して起こらないので、かかるマウスにおいてトランススイッチされた抗体は、完全ヒト軽鎖を保持する；おそらく、トランススイッチは、シスでの正常なアイソタイプスイッチに（それとは異なるにせよ）用いられる内因性遺伝子座におけるスイッチ配列に依存する。したがって、完全ヒト抗体を作製するように工学的に作製されたマウスが、マウス定常領域を有する抗体を作製するためにトランススイッチ機序を選択する場合であっても、その戦略は、正常Ｂ細胞発生のレスキューにやはり不十分である。
抗体ベースのヒト治療薬の作製における主な関心事は、特定のエピトープを特異的に認識し、望ましい親和性で、通常は－常にではないが－高い親和性で、そのエピトープを結合する有用な可変ドメインを同定するために十分多様なヒト免疫グロブリン可変領域配列を作製することである。（本明細書に記載する）ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの開発前は、マウス定常領域と共にヒト可変領域を発現するマウスが、導入遺伝子からヒト抗体を作製するマウスとの何らかの有意差を示すことになるという指摘はなかった。しかし、その仮定は間違っていた。
内因性マウス遺伝子座におけるヒト免疫グロブリン可変領域でのマウス免疫グロブリン可変領域の正確な置換を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、Ｂ細胞発生に関して野生型マウスとの驚くべき、また注目すべき類似性を提示する。驚くべき、また実にすばらしい発生の点で、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、免疫に応答して産生される可変領域が完全ヒトのものであるという１つの重要な点のみが野生型マウスと異なる、本質的に正常な野生型応答を免疫に対して提示した。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、内因性遺伝子座におけるマウス免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）および免疫グロブリン軽鎖（例えば、κ軽鎖、Ｉｇκ）の生殖細胞系可変領域の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域での正確な大規模置換を含有する。合計で約６メガ塩基のマウス遺伝子座が約１．５メガ塩基のヒトゲノム配列で置換される。この正確な置換により、結果として、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する重および軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。マウスＶＨ－ＤＨ－ＪＨおよびＶκ－Ｊκセグメントの正確な置換は、隣接するマウス配列をインタクトなままおよび機能的なままハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座に残す。上記マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。Ｂ細胞発生はいずれの重要な点でも妨害されず、抗原チャレンジすると上記マウスにおいて多様性に富んだヒト可変領域が産生される。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、重およびκ軽鎖についての免疫グロブリン遺伝子セグメントがヒトおよびマウスにおいて同様に再配列するので実現可能であるのだが、その遺伝子座は同じまたはほぼ同じであるというわけではない――明らかにそれらはそうではない。しかし、その遺伝子座は、すべてのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３００万塩基対の連続するマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの等価の配列を基本的にカバーする約１００万塩基の連続するヒトゲノム配列で置換することによって重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化を達成することができるほどに類似する。
一部の実施形態では、一定のマウス定常領域遺伝子配列の、ヒト遺伝子配列でのさらなる置換（例えば、マウスＣＨ１配列の、ヒトＣＨ１での置換、およびマウスＣＬ配列の、ヒトＣＬ配列での置換）により、結果として、例えば完全ヒト抗体断片、例えば完全ヒトＦａｂの作製に好適な、ヒト可変領域および部分ヒト定常領域を有する抗体を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスが得られる。ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、正常な可変遺伝子セグメント再配列、正常な体細胞超変異および正常なクラススイッチを示す。これらのマウスは、野生型マウスと区別できない体液性免疫系を示し、および、マウスにヒト可変領域遺伝子セグメントの完全レパートリーを欠く場合でさえ、正常な細胞集団をすべてのＢ細胞発生段階で提示し、正常なリンパ器官構造を提示する。これらのマウスの免疫は、可変遺伝子セグメント使用頻度の広範な多様性を提示する頑強な体液性応答を生じさせる結果となる。
マウス生殖細胞系可変領域遺伝子セグメントの正確な置換により、部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスの作製が可能になる。部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、再配列し、超変異し、正常にクラススイッチするため、ヒト可変領域を含むマウスでは部分ヒト免疫グロブリン遺伝子座により抗体が産生される。その可変領域をコードするヌクレオチド配列を同定し、クローニングして、選ばれた任意の配列、例えば、特定の用途に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ系において）融合させ、その結果、全部がヒト配列に由来する抗体または抗原結合タンパク質を得ることができる。
リコンビニアリング法による大規模ヒト化を用いてマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を改変して、マウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含む３メガ塩基以下のマウス重鎖免疫グロブリン遺伝子座を、いくつかのまたは本質的にすべてのヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する１メガ塩基以下のヒトゲノム配列を有する等価のヒト遺伝子セグメントで正確に置換した。本質的にすべてのヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードする２つのリピートの一方を含むヒトゲノムの二分の一メガ塩基以下のセグメントを使用して、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの本質的にすべてを含有するマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の３メガ塩基セグメントを置換した。
かかる置換免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間で通常は見出される内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の破壊または欠失を含み得る。この領域の破壊は、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の機能性の低減または消去をもたらし得る。ヒト重鎖レパートリーの最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントを置換に使用すると、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子であるように見える偽遺伝子を含有する遺伝子間領域がこれらのＶＨ遺伝子セグメント間、すなわち、ヒトＶＨ１－２とＶＨ１－６の間に存在する。しかし、このヒト遺伝子間配列を含む雄マウスは、妊性の低減を示す。
上記の置換遺伝子座を含み、マウスＡＤＡＭ６をコードする異所性核酸配列も含むマウスであって、本質的に正常な妊性を示すマウスを記載する。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座のヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントの間に配置されたマウスＡＤＡＭ６ａ配列および／またはマウスＡＤＡＭ６ｂ配列またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記異所性核酸配列は、改変内因性重鎖遺伝子座のヒトＶＨ１－２とＶＨ１－６の間に配置された配列番号３である。配列番号３のＡＤＡＭ６遺伝子の転写方向は、周囲のヒトＶＨ遺伝子セグメントの転写の方向に対して逆である。本明細書における例は、示されるヒトＶＨ遺伝子セグメント間に異所性配列を配置することによる妊性のレスキューを示すが、マウスゲノム内の任意の好適な転写許容遺伝子座への（またはさらには染色体外への）異所性配列の配置が雄マウスの妊性を同様にレスキューすると予想されることは、当業者であれば認める。
マウスＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片を含む異所性配列を有する機能的ＡＤＡＭ６遺伝子座を欠いているマウスを補足する現象は、非機能的なまたは最小機能的な内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座を有する任意のマウスのレスキューに適用できる一般的な方法である。それ故、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＡＤＡＭ６破壊改変を含む非常に多数のマウスを本発明の組成物および方法でレスキューすることができる。したがって、本発明は、内因性ＡＤＡＭ６機能を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座の多種多様な改変を有するマウスを含む。一部の（非限定的）例を本明細書に提供する。記載するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに加えて、ＡＤＡＭ６に関する組成物および方法を非常に多くの用途に、例えば、重鎖遺伝子座を多種多様な方法で改変するときに用いることができる。
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＤＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスであって、ＣＨ１領域および／またはヒンジ領域を欠くマウスを提供する。１つの実施形態において、上記マウスは、（ａ）ヒトＶＨ－マウスＣＨ１－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＨ－マウスヒンジ－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３；および（ｃ）ヒトＶＨ－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３から選択される免疫グロブリン鎖の二量体である単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する。
１つの態様では、１つまたは複数のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶＨ、ｍＤＨおよび／またはｍＪＨ）の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶＨ、ｈＤＨおよび／またはｈＪＨ）での置換を有するマウスであって、１つまたは複数のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｍＶκおよび／またはｍＪκ）の、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよび／またはｈＪκ）での置換をさらに含むマウスにおいて、妊性をレスキューするヌクレオチド配列をヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列内（例えば、ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントとＶＨ１－６遺伝子セグメントの間）に配置する。１つの実施形態において、上記ヌクレオチド配列は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（本明細書において参照として援用される、米国特許第６，５９６，５４１号および米国特許第７，１０５，３４８号）において、ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントとヒトＶＨ１－６遺伝子セグメントとの間に配置される。１つの実施形態において、そのように改変された上記ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、全てまたは実質的に全てのヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント（全てｈＶＨ、ｈＤＨ、およびｈＪＨのもの）および全てまたは実質的に全てのヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメント（ｈＶκおよびｈＪκのもの）による置換を含む。
１つの実施形態において、上記１つまたは複数のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも８９のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１３のＤＨ遺伝子セグメント、少なくとも４のＪＨ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、約１メガ塩基のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも８０のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２７のＤＨ遺伝子セグメント、少なくとも６のＪＨ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。
１つの実施形態において、上記１つまたは複数のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約３メガ塩基のマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも１３７のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約二分の一メガ塩基のヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の（免疫グロブリンκ定常領域に関して）近位リピートを含む。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の少なくとも４０のＶκ遺伝子セグメント、少なくとも５のＪκ遺伝子セグメントまたはその組み合わせを含む。
１つの実施形態では、上記ヌクレオチド配列を２つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの間に配置する。特定の実施形態において、上記２つのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントである。
１つの態様では、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、上記内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座に存在するマウス遺伝子セグメントの中央に存在し、上記遺伝子座は、内因性重鎖定常領域を含有する機能的重鎖をコードするように再配列することができない。１つの実施形態において、上記内因性マウス重鎖遺伝子座は、少なくとも１つおよび８９以下のＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび１３以下のＤＨ遺伝子セグメント、少なくとも１つおよび４以下のＪＨ遺伝子セグメントならびにその組み合わせを含む。様々な実施形態において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、上記マウスにおいて機能的である１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質をコードし、上記１つまたは複数のＡＤＡＭ６タンパク質は、配列番号１、配列番号２および／またはその組み合わせを含む。
１つの態様において、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）は、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを置換するヒトＶＨ遺伝子セグメントの中央に存在する。１つの実施形態では、少なくとも８９のマウスＶＨ遺伝子セグメントを除去し、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換し、およびマウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’端に直ぐ隣接して存在するか、２つのヒトＶＨ遺伝子セグメント間に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約２０キロ塩基（ｋｂ）から約４０キロ塩基（ｋｂ）以内の２つのＶＨ遺伝子セグメント間に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約２９ｋｂから約３１ｋｂ以内の２つのＶＨ遺伝子セグメント間に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約３０ｋｂ以内に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、挿入されたヒトＶＨ遺伝子セグメントの３’末端の約３０，１８４ｂｐ以内に存在する。特定の実施形態において、上記置換は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ１－２およびＶＨ６－１を含み、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、該ＶＨ１－２遺伝子セグメントの下流かつ該ＶＨ６－１遺伝子セグメントの上流に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントの間に存在し、この場合、該マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の５’端は、該ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントの３’末端から約１３，８４８ｂｐであり、および該ＡＤＡＭ６遺伝子座の３’端は、該ヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントから約２９，７３７ｂｐ５’側に存在する。特定の実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、マウスの細胞内にＡＤＡＭ６機能を付与する配列番号３またはその断片を含む。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒトＶＨ遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＨ１－２－マウスＡＤＡＭ６遺伝子座－ヒトＶＨ６－１。特定の実施形態では、ヒトＶＨ１－２とヒトＶＨ６－１間のＡＤＡＭ６偽遺伝子をマウスＡＤＡＭ６遺伝子座で置換する。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントについての配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＨ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に存在する。最も５’側のＤＨセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうと、このとおりであるはずである。
同様に、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを置換する、上記１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメント（例えば、ＶκまたはＶλセグメント）で改変されるマウスは、上に記載したように、例えばマウスＡＤＡＭ６遺伝子座もしくはその機能的断片を含む下流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターを利用することにより、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を維持するように改変することができ、あるいは２つのヒトＶＬ遺伝子セグメント間に、またはヒトＶＬ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖλ＋ｍ／ｈＤＨ）もしくはＪ遺伝子セグメントとの間（ヒトであろうとマウスであろうと、例えば、Ｖκ＋ＪＨ）に位置する異所配列で損傷マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を置換するように改変することができる。１つの実施形態において、上記置換は、２つ以上のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み、および上記マウスＡＤＡＭ６遺伝子座またはその機能的断片は、２つの最も３’側のＶＬ遺伝子セグメント間に存在する。そこで、特定の実施形態において、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの構成は、以下のものである（ヒト遺伝子セグメントの転写方向に関して上流から下流に）：ヒトＶＬ３’－１－マウスＡＤＡＭ６遺伝子座－ヒトＶＬ３’。１つの実施形態において、転写方向に関して、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のマウスＡＤＡＭ６ａおよびマウスＡＤＡＭ６ｂのうちの１つまたは複数の配向は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの配向と比較して逆である。あるいは、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座は、最も３’側のヒトＶＬ遺伝子セグメントと最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントの間の遺伝子間領域に存在する。最も５’側のＤＨセグメントがマウスであろうと、ヒトであろうとこのとおりであるはずである。
１つの態様では、１つまたは複数の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの置換を有する、および少なくとも１つの内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントを含むマウスを提供する。かかるマウスにおいて、上記内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの改変は、最も５’側のＤＨ遺伝子セグメントではなく、最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの１つまたは複数についての改変を含み得、この場合、上記１つまたは複数の最も３’側のＶＨ遺伝子セグメントの改変が、上記内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を破壊しないようにまたは非機能的にしないように注意する。例えば、１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換を含み、および上記マウスは、１つまたは複数の内因性ＤＨ遺伝子セグメントおよび機能的内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む。
もう１つの実施形態において、上記マウスは、最も３’側の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの改変、および１つまたは複数の内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントの改変を含み、該改変は、内因性ＡＤＡＭ６遺伝子座が機能的なままである程度まで該内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座の完全性が維持されるように行う。一例では、かかる改変を二工程で行う：（１）上流ホモロジーアームと、機能的マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは部分を含む下流ホモロジーアームとを有するターゲティングベクターを利用して、最も３’側の内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントを１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換する工程；（２）次に、マウスＡＤＡＭ６遺伝子座のすべてまたは機能的部分を含む上流ホモロジーアームを有するターゲティングベクターで内因性マウスＤＨ遺伝子セグメントを置換する工程。
様々な態様において、改変が内因性マウスＡＤＡＭ６の機能を破壊する場合、マウスＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的ホモログをコードする異所性配列を含有するマウスの利用は有用である。内因性マウスＡＤＡＭ６機能を破壊する確率は、マウス免疫グロブリン遺伝子座への改変を行うとき、特に、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域および周囲の配列を改変するときに高い。したがって、かかるマウスは、全部もしくは一部が欠失している、全部もしくは一部がヒト化されている、または全部もしくは一部が（例えば、ＶκもしくはＶλ配列で）置換されている免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスを作製するときに特に有益である。下に記載するマウスに対して記載の遺伝子改変を行うための方法は当業者に公知である。
マウスＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性配列またはマウスＡＤＡＭ６タンパク質の妊性の恩恵をもたらす実質的に同一もしくは同様のタンパク質をコードする異所性配列を含有するマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６配列を破壊するかまたは欠失させるマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座への改変に関連して特に有用である。ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を発現するマウスに関連して主として記載したが、かかるマウスは、内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子を破壊する任意の遺伝子改変に関連して有用である。これが、マウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の改変を含有する多種多様な遺伝子改変マウスを包含することは、当業者であれば認める。これらには、例えば、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントのすべてまたは一部分の欠失または置換を、他の改変にかかわらず有するマウスが含まれる。非限定的な例を下に記載する。
一部の態様では、マウスにおいて機能的な異所性マウス、齧歯動物または他のＡＤＡＭ６遺伝子（またはオルソログもしくはホモログもしくは断片）と１つまたは複数のヒト免疫グロブリン可変および／または定常領域遺伝子セグメントとを含む遺伝子改変マウスを提供する。様々な実施形態において、マウスにおいて機能的である他のＡＤＡＭ６遺伝子オルソログまたはホモログまたは断片は、ウシ、イヌ、霊長類、ウサギまたは他の非ヒト配列を含み得る。
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＤＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ１ヌクレオチド配列の、ヒトＣＨ１ヌクレオチド配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、マウスヒンジヌクレオチド配列の、ヒトヒンジヌクレオチド配列での置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座（ＶＬおよびＪＬ）の、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子座での置換をさらに含む。１つの実施形態において、上記マウスは、マウス免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列の、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域ヌクレオチド配列での置換をさらに含む。特定の実施形態において、上記ＶＬ、ＪＬおよびＣＬは、免疫グロブリンκ軽鎖配列である。特定の実施形態において、上記マウスは、ヒトヒンジおよびヒトＣＨ１配列と融合したマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３免疫グロブリン定常領域配列を含むので、該マウス免疫グロブリン遺伝子座が再配列して、（ａ）ヒト可変領域、ヒトＣＨ１領域、ヒトヒンジ領域ならびにマウスＣＨ２およびマウスＣＨ３領域を有する重鎖と、（ｂ）ヒト可変ドメインおよびヒト定常領域を含む免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子とを含む結合タンパク質をコードする遺伝子を形成する。
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置換と、必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび／もしくはヒトＪＨ遺伝子セグメントでの置換と、または必要に応じて、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のＶＬ、１つまたは複数のＤＨ、および１つまたは複数のＪ遺伝子セグメント（例えば、ＪκまたはＪλ）での置換を含み、これらの遺伝子セグメントは、内因性マウスヒンジ領域に作動可能に連結されており、該マウスは、転写方向に５’から３’へと、ヒトＶＬ－ヒトまたはマウスＤＨ－ヒトまたはマウスＪ－マウスヒンジ－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３を含有する再配列免疫グロブリン鎖遺伝子を形成する。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪκ領域である。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪＨ領域である。１つの実施形態において、上記Ｊ領域は、ヒトＪλ領域である。１つの実施形態において、上記ヒトＶＬ領域は、ヒトＶλ領域およびヒトＶκ領域から選択される。
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスまたはヒト定常領域と、ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪκ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪＨ；ヒトＶκ、ヒトＤＨおよびヒトＪλ；ヒトＶλ、ヒトＤＨおよびヒトＪκに由来する可変領域とを有する、単一可変ドメイン抗体を発現する。特定の実施形態では、列挙したＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメント間でのまたは列挙したＶおよびＪ遺伝子セグメント間での生産的再配列の発生が可能になるように、組換え認識配列を改変する。
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのＤＨ遺伝子セグメントおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスであって、ＣＨ１および／またはヒンジ領域を欠くマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ１ドメインをコードする配列を欠く。１つの実施形態において、上記マウスにはヒンジ領域をコードする配列を欠く。１つの実施形態において、上記マウスにはＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードする配列を欠く。
特定の実施形態において、上記マウスは、マウスＣＨ３ドメインに結合しているマウスＣＨ２ドメインに融合しているヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（λまたはκ）を含む結合タンパク質を発現する。
１つの態様では、機能的ＡＤＡＭ６タンパク質（またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片）をコードする異所性ＡＤＡＭ６配列と、すべてのまたは実質的にすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＬ遺伝子セグメントでの置換と、すべてのもしくは実質的にすべてのマウスＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントの、ヒトＪＬ遺伝子セグメントでの置換とを含むマウスを提供する。
１つの実施形態において、上記マウスは、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ１およびヒンジ領域、またはＣＨ１領域およびヒンジ領域およびＣＨ２領域をコードする免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列の欠失を含む。
１つの実施形態において、上記マウスは、以下のものから選択されるホモ二量体を含む単一可変ドメイン結合タンパク質を作製する：（ａ）ヒトＶＬ－マウスＣＨ１－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３；（ｂ）ヒトＶＬ－マウスヒンジ－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３；（ｃ）ヒトＶＬ－マウスＣＨ２－マウスＣＨ３。
１つの態様では、無能化または欠失された内因性マウスＡＤＡＭ６遺伝子座を含む、無能化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスであって、ヒトまたはマウスまたはヒト／マウスもしくは他のキメラ抗体を発現する核酸配列を含むマウスを提供する。１つの実施形態において、上記核酸配列は、組み込まれた導入遺伝子上に存在し、該導入遺伝子は、マウスゲノムにランダムに組み込まれている。１つの実施形態において、上記核酸配列は、野生型マウスでは見出さないエピソーム（例えば、染色体）上にある。
１つの実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。特定の実施形態において、上記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖遺伝子座から選択される。特定の実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性κ軽鎖遺伝子座および無能化されたλ軽鎖遺伝子座を含み、この場合のマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよびヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインを含む抗体を発現する。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖ドメインは、ヒトκ軽鎖ドメインおよびヒトλ軽鎖ドメインから選択される。特定の実施形態において、上記マウスは、無能化された内因性κ軽鎖遺伝子座を含み、該マウスは、ヒトＶλドメインを含む、ヒト／マウス（すなわち、ヒト可変／マウス定常）免疫グロブリン重鎖およびヒト／マウス免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を発現する。１つの実施形態において、上記ヒト／マウス免疫グロブリン軽鎖は、マウスＣκを含む。１つの実施形態において、上記ヒト／マウス免疫グロブリン軽鎖は、マウスＣλを含む。特定の実施形態において、上記マウスＣλはＣλ２である。
１つの態様では、キメラ抗体を発現する遺伝子改変動物であって、該遺伝子改変動物において機能的であるＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログを発現する遺伝子改変動物を提供する。
１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物はマウスであり、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログは、該遺伝子改変動物とは異なる系統であるマウス系統からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物（例えば、ハムスター、新世界ラットまたはマウス、ハタネズミ）であり、および上記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、ネズミ科の齧歯動物（例えば、純種のマウスおよびラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）からのものである。１つの実施形態において、上記遺伝子改変動物は、ネズミ科の齧歯動物であり、上記ＡＤＡＭ６タンパク質オルソログまたはホモログは、キヌゲネズミ科の齧歯動物からのものである。
１つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと齧歯動物の定常領域配列とを含む。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、キヌゲネズミ科の齧歯動物およびネズミ科の齧歯動物から選択される。特定の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、マウスである。特定の実施形態において、上記キヌゲネズミ科およびネズミ科の齧歯動物は、ラットである。１つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト可変ドメインと、マウスまたはラットから選択される動物からの定常ドメインとを含む；特定の実施形態において、上記マウスまたはラットは、キヌゲネズミ科およびネズミ科から選択される。１つの実施形態において、上記キメラ抗体は、ヒト重鎖可変ドメインと、ヒト軽鎖可変ドメインと、マウスおよびラットから選択される齧歯動物由来の定常領域配列とを含み、この場合のヒト重鎖可変ドメインおよびヒト軽鎖は同起源のものである。特定の実施形態において、同起源のものとしては、ヒト重鎖およびヒト軽鎖可変ドメインが、該ヒト軽鎖可変ドメインと該ヒト重鎖可変ドメインを一緒に発現してその可変ドメインを個々のＢ細胞の表面に一緒に提示する単一Ｂ細胞からのものである、同起源のものが挙げられる。
１つの実施形態では、上記キメラ抗体を免疫グロブリン遺伝子座から発現させる。１つの実施形態では、上記キメラ抗体の重鎖可変ドメインを再配列内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現させる。１つの実施形態では、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再配列内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現させる。１つの実施形態では、上記キメラ抗体の重鎖可変ドメインおよび／または上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再配列導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の動物のゲノムに組み込まれている非再配列核酸配列から誘導された再配列核酸配列）から発現させる。１つの実施形態において、上記キメラ抗体の軽鎖可変ドメインを再配列導入遺伝子（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子座以外の遺伝子座の動物のゲノムに組み込まれている非再配列核酸配列から誘導された再配列核酸配列）から発現させる。
特定の実施形態では、上記導入遺伝子を転写活性遺伝子座、例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、例えばネズミ（例えばマウス）ＲＯＳＡ２６遺伝子座から発現させる。
１つの態様では、非ヒト動物であって、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座が非ヒトＡＤＡＭ６配列またはそのオルソログもしくはホモログを含む、非ヒト動物を提供する。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される齧歯動物である。
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウスＡＤＡＭ６配列とオルソロガスおよび／または相同性である配列であり、そのオルソログまたはホモログは、非ヒト動物において機能的である。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択され、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、マウス、ラットおよびハムスターから選択される非ヒト動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるマウス種、ラットおよびハムスターから選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はラットであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるラット種、マウスおよびハムスターから選択される齧歯動物からのものである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物はハムスターであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、異なるハムスター種、マウスおよびラットから選択される齧歯動物からのものである。
特定の実施形態において、上記非ヒト動物は、ネズミ亜目からのものであり、上記ＡＤＡＭ６配列は、トビネズミ上科の齧歯動物およびネズミ上科の齧歯動物から選択される動物からのものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のマウスであり、上記ＡＤＡＭ６オルソログまたはホモログは、ネズミ上科のマウスまたはラットまたはハムスターからのものである。
１つの実施形態において、上記ヒト化重鎖遺伝子座は、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒト、キメラおよび／または齧歯動物（例えば、マウスもしくはラット）定常領域遺伝子に作動可能に連結されている。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はマウスである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はラットである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子はハムスターである。１つの実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記定常領域遺伝子は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３配列を含む。
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列に隣接する。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、ヒト免疫グロブリン重鎖配列内に位置する。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、Ｖ、Ｄおよび／またはＪ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、２つのＶ遺伝子セグメント間に位置する。１つの実施形態において、上記非ヒトＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＤ遺伝子セグメントの間に並置されている。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｖ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間に位置する。１つの実施形態において、上記マウスＡＤＡＭ６配列は、Ｄ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間に並置されている。
１つの態様では、免疫グロブリン遺伝子座からヒトＶＬドメインと同起源のヒトＶＨドメインを発現するＢ細胞を含む遺伝子改変非ヒト動物であって、該免疫グロブリン遺伝子座から非免疫グロブリン非ヒトタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、ＡＤＡＭタンパク質である。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭタンパク質は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのホモログもしくはオルソログもしくは機能的断片である。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記ネズミ上科の齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。
１つの実施形態において、上記非免疫グロブリン非ヒトタンパク質は、齧歯動物タンパク質である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ科のものである。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、ネズミ上科のものである。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
１つの実施形態において、上記ヒトＶＨおよびＶＬドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に直接またはリンカーによって結合する。特定の実施形態において、上記定常ドメイン配列は、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびその組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態において、上記ヒトＶＬドメインは、ＶκまたはＶλドメインから選択される。
１つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物であって、その生殖細胞系にヒト免疫グロブリン配列を含み、雄非ヒト動物の精子がｉｎ ｖｉｖｏ移動欠陥を特徴とする、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記ｉｎ ｖｉｖｏ移動欠陥は、上記雄非ヒト動物の精子が同じ種の雌非ヒト動物の子宮から卵管を通って移動することができないことを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物には、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を欠く。特定の実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片は、ＡＤＡＭ６ａおよび／もしくはＡＤＡＭ６ｂタンパク質またはその機能的断片を含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
１つの態様では、ＡＤＡＭ６タンパク質またはそのオルソログもしくはホモログもしくは機能的断片をコードする非ヒト配列に隣接するヒト免疫グロブリン配列を含む非ヒト動物を提供する。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン重鎖配列である。１つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＤＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のＤＨ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪＨ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記免疫グロブリン配列は、天然ヒトレパートリーにおいて高頻度である１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントは、２つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、３つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、４つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、５つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、６つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、７つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、８つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、９つ以下のＶＨ遺伝子セグメント、１０以下のＶＨ遺伝子セグメント、１１以下のＶＨ遺伝子セグメント、１２以下のＶＨ遺伝子セグメント、１３以下のＶＨ遺伝子セグメント、１４以下のＶＨ遺伝子セグメント、１５以下のＶＨ遺伝子セグメント、１６以下のＶＨ遺伝子セグメント、１７以下のＶＨ遺伝子セグメント、１８以下のＶＨ遺伝子セグメント、１９以下のＶＨ遺伝子セグメント、２０以下のＶＨ遺伝子セグメント、２１以下のＶＨ遺伝子セグメント、２２以下のＶＨ遺伝子セグメントまたは２３以下のＶＨ遺伝子セグメントを含む。
特定の実施形態において、上記１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントは、５つのＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントは、１０のＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントは、１５のＶＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のＶＨ遺伝子セグメントは、２０のＶＨ遺伝子セグメントを含む。
様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１、ＶＨ１－２、ＶＨ１－３、ＶＨ２－５、ＶＨ３－７、ＶＨ１－８、ＶＨ３－９、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１６、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－２０、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ１－２４、ＶＨ２－２６、ＶＨ４－２８、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３５、ＶＨ３－３８、ＶＨ４－３９、ＶＨ３－４３、ＶＨ１－４５、ＶＨ１－４６、ＶＨ３－４８、ＶＨ３－４９、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－５３、ＶＨ１－５８、ＶＨ４－５９、ＶＨ４－６１、ＶＨ３－６４、ＶＨ３－６６、ＶＨ１－６９、ＶＨ２－７０、ＶＨ３－７２、ＶＨ３－７３およびＶＨ３－７４から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２、ＶＨ１－８、ＶＨ１－１８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－７、ＶＨ３－９、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ３－３３、ＶＨ３－４３、ＶＨ３－４８、ＶＨ４－３１、ＶＨ４－３４、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－５９、ＶＨ５－５１およびＶＨ６－１から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－１８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－７、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ３－３３、ＶＨ３－４８、ＶＨ４－３４、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－５９およびＶＨ５－５１から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－１８、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－７、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ３－４３、ＶＨ３－４８、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－５９およびＶＨ５－５１から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－３９およびＶＨ４－５９から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０およびＶＨ４－３９から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－２３およびＶＨ４－３９から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－２３およびＶＨ４－３９から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２３およびＶＨ３－３０から選択される。様々な実施形態において、上記ＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－３０およびＶＨ４－３９から選択される。
特定の実施形態において、ヒト免疫グロブリン配列は、少なくとも１８のＶＨ遺伝子セグメント、２７のＤＨ遺伝子セグメントおよび６のＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、少なくとも３９のＶＨ遺伝子セグメント、２７のＤＨ遺伝子セグメントおよび６のＪＨ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、少なくとも８０のＶＨ遺伝子セグメント、２７のＤＨ遺伝子セグメントおよび６のＪＨ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物はマウスであり、該マウスは、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントでの置換を含み、該ヒトＶＨ遺伝子セグメントはマウスＣＨ領域遺伝子に作動可能に連結されているので、該マウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントを再配列し、およびヒトＶＨドメインとマウスＣＨを含む逆キメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。１つの実施形態では、非再配列マウスＶＨ遺伝子セグメントの９０～１００％が、少なくとも１つの非構成ヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換されている。特定の実施形態では、上記内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントのすべてまたは実質的にすべてが、少なくとも１つの非再配列ヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換されている。１つの実施形態において、上記置換は、少なくとも１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の非再配列ヒトＶＨ遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、上記置換は、少なくとも１２の機能的非再配列ヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的非再配列ヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３の機能的非再配列ヒトＶＨ遺伝子セグメントでのものである。１つの実施形態において、上記マウスは、すべてのマウスＤＨおよびＪＨセグメントの、少なくとも１つの非再配列ヒトＤＨセグメントおよび少なくとも１つの非再配列ヒトＪＨセグメントでの置換を含む。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの非再配列ヒトＤＨセグメントは、１－１、１－７、１－２６、２－８、２－１５、３－３、３－１０、３－１６、３－２２、５－５、５－１２、６－６、６－１３、７－２７およびその組み合わせから選択される。１つの実施形態において、上記少なくとも１つの非再配列ヒトＪＨセグメントは、１、２、３、４、５、６およびその組み合わせから選択される。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１－２、１－８、１－２４、１－６９、２－５、３－７、３－９、３－１１、３－１３、３－１５、３－２０、３－２３、３－３０、３－３３、３－４８、３－５３、４－３１、４－３９、４－５９、５－５１、６－１ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組み合わせから選択される。
様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト／マウスまたはキメラヒト／ラットまたはキメラヒト／ハムスター、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。１つの実施形態において、上記定常領域は、齧歯動物（例えば、マウスまたはラットまたはハムスター）定常領域である。特定の実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。様々な実施形態において、上記定常領域は、少なくともＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン重鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン重鎖遺伝子座にあり、この非重鎖遺伝子座は、転写活性遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非重鎖遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。
様々な態様において、上記非ヒト動物は、該非ヒト動物の生殖細胞系にヒト免疫グロブリン軽鎖配列（例えば、１つまたは複数の非再配列軽鎖ＶおよびＪ配列、または１つまたは複数の再配列ＶＪ配列）をさらに含む。特定の実施形態において、上記免疫グロブリン軽鎖配列は、免疫グロブリンλ軽鎖配列である。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つまたは複数のＶλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つまたは複数のＪλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、１つまたは複数のＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のＪλ遺伝子セグメントを含む。
特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも１２のＶλ遺伝子セグメントおよび１つのＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも１２のＶλ遺伝子セグメントおよび４つのＪλ遺伝子セグメントを含む。
特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも２８のＶλ遺伝子セグメントおよび１つのＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも２８のＶλ遺伝子セグメントおよび４つのＪλ遺伝子セグメントを含む。
特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも４０のＶλ遺伝子セグメントおよび１つのＪλ遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、少なくとも４０のＶλ遺伝子セグメントおよび４つのＪλ遺伝子セグメントを含む。
様々な実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えばマウス、ラットまたはハムスター）の生殖細胞系における定常領域と作動可能な連結状態にある。１つの実施形態において、上記定常領域は、ヒト、キメラヒト／齧歯動物、マウス、ラットまたはハムスター定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスまたはラット定常領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスλ定常（ｍＣκ）領域またはラットκ定常（ｒＣκ）領域である。特定の実施形態において、上記定常領域は、マウスλ定常
領域またはラットλ定常（ｒＣλ）領域である。１つの実施形態において、上記マウスＣλ領域は、マウスＣλ２領域である。
１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。特定の実施形態において、上記非ヒト動物の生殖細胞系における免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記ヒト免疫グロブリン軽鎖配列は、転写活性である非ヒト動物の生殖細胞系における非免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。特定の実施形態において、上記非免疫グロブリン遺伝子座は、ＲＯＳＡ２６遺伝子座である。
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の細胞にコードされている１つまたは複数の可変領域核酸配列に由来する可変ドメインを含むヒト抗体の作製方法を提供する。
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物から単離された１つまたは複数の可変領域核酸配列に由来する抗体または抗体断片を含むポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは抗体である。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、重鎖のみの抗体である。１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、一本鎖可変断片（例えば、ｓｃＦｖ）である。
１つの態様では、抗体を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。様々な実施形態において、上記抗体は、上記非ヒト動物から単離された１つまたは複数の可変領域核酸配列に由来する１つまたは複数の可変ドメインを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントを含む。特定の実施形態において、上記可変領域核酸配列は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。
ヒトλ可変ドメインを発現するマウス
ＡＤＡＭタンパク質活性の喪失（例えば、ＡＤＡＭ６－依存性）により妊性を低減させる改変を含む遺伝的に改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラットなど）を、内因性非ヒト、または（例えば、トランスジェニック）ヒトの定常軽鎖遺伝子にヒトλ可変配列を含む本明細書に記載の非ヒト動物と交配させることができる。例えば、損傷を受けたＡＤＡＭ６遺伝子（または欠失したＡＤＡＭ６遺伝子）を含むマウスまたはラットなどの非ヒト動物、例えば、ヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を持つ動物を、ヒトまたは非ヒト（例えば、内因性マウスまたはラット）軽鎖定常領域遺伝子に連結したヒトλセグメントおよびＪＬセグメントを含む軽鎖遺伝子座（内因性またはトランスジェニック）を含むマウスと組み合わせ、該非ヒト動物は、上記ＡＤＡＭ依存性妊性を回復させる活性を含む。上記ＡＤＡＭ依存性妊性を回復させる遺伝子改変は、非ヒト動物、例えば、ヒト化重鎖を持つマウスにおいて、またはヒト化λ可変セグメントを持つマウスにおいてのいずれかであってよい。後代は、ヒト化重鎖（すなわち、ヒト重鎖可変ドメインの発現をもたらす）およびヒト化軽鎖遺伝子座（すなわち、ヒトまたは非ヒトλまたはκ領域に融合したヒトλ軽鎖可変ドメインの発現をもたらす）を形成する遺伝子を含み、動物は、上記ＡＤＡＭ６活性またはＡＤＡＭ６のオルソログもしくはホモログの活性を欠くマウスと比較して増大した妊性を示す。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）遺伝子操作マウスは、内因性マウス遺伝子座に、ヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントによる再配列していないＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの置換を含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有するキメラ抗体を発現する（例えば、米国特許第７，６０５，２３７号を参照のこと）。他のほとんどの報告は、無能力にされた内因性免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおいて、完全ヒト導入遺伝子から完全ヒト抗体を発現するマウスに関する。
抗体軽鎖は、２個の別個の遺伝子座：カッパー（κ）およびラムダ（λ）のうちの１つによってコードされる。マウス抗体軽鎖は、主にκタイプである。マウス抗体を産生するマウス、および完全ヒト抗体またはキメラヒト－マウス抗体を産生する改変されたマウスは、軽鎖の使用頻度に偏りを示す。ヒトもまた、軽鎖の偏りを示すが、マウスほど顕著でない；マウスにおけるκ軽鎖とλ軽鎖との比は、約９５：５である一方で、ヒトのその比は、約６０：４０である。マウスにおけるより顕著な偏りは、抗体の多様性に深刻な影響を及ぼすとは考えられていない。なぜなら、マウスにおいて、第１の例において、λ可変遺伝子座はそれほど多様性がないからである。このことは、ヒトではそうではない。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、非常に多様である。
ヒトλ軽鎖遺伝子座は、１，０００ｋｂに及び、可変（Ｖ）または連結（Ｊ）セグメントをコードする８０を超える遺伝子を含む（図１９）。ヒトλ軽鎖遺伝子座のうち、観察されるすべてのＶλドメインの過半数が、遺伝子セグメント１－４０、１－４４、２－８、２－１４および３－２１によってコードされる。全体的に見て、約３０程度のヒトＶλ遺伝子セグメントが、機能的であると考えられている。Ｊλ遺伝子セグメントは７つ存在し、そのうち４つ（Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７）だけが、一般的に機能的なＪλ遺伝子セグメントとされている。
ヒトλ軽鎖遺伝子座が、機能的な軽鎖タンパク質を形成するように組み換わることができるいくつかの可変領域遺伝子セグメントを有するという点において、ヒトのλ軽鎖遺伝子座は、マウスとヒトの両方のλ遺伝子座と構造が似ている。ヒトλ軽鎖遺伝子座は、およそ７０個のＶ遺伝子セグメントおよび７個のＪλ－Ｃλ遺伝子セグメント対を含む。これらのＪλ－Ｃλ遺伝子セグメント対の４つだけが、機能的であるとみられる。いくつかの対立遺伝子において、第５のＪλ－Ｃλ遺伝子セグメント対は、報告によると偽遺伝子（Ｃλ６）である。７０個のＶλ遺伝子セグメントは、３８個の機能的な遺伝子セグメントを含むとみられる。７０個のＶλ配列は、３個のクラスターに配置されており、そのすべてが、異なるＶ遺伝子ファミリー群の異なるメンバーを含む（クラスターＡ、ＢおよびＣ；図１９）。これは、ヒトＶ領域を有する抗体を非ヒト動物において生成するための、相対的に利用されていない多様性の潜在的に豊富な供給源である。
全く対照的に、マウスλ軽鎖遺伝子座は、（系統に応じて）２つまたは３つのマウスＶλ領域遺伝子セグメントしか含まない（図２０）。少なくともこのために、マウスにおけるκへの大きな偏りは、抗体多様性全体に対して特に不利益でないと考えられている。
マウスλ軽鎖遺伝子座の公開されているマップによると、その遺伝子座は、およそ２００ｋｂ以内の遺伝子セグメントの２つのクラスターから本質的になる（図２０）。その２つのクラスターは、独立した再配列が可能なＶ、ＪおよびＣ遺伝子の２セットを含む：Ｖλ２－Ｊλ２－Ｃλ２－Ｊλ４－Ｃλ４およびＶλ１－Ｊλ３－Ｃλ３－Ｊλ１－Ｃλ１。Ｖλ２は、すべてのＪλ遺伝子セグメントと組み換わることが見出されているが、Ｖλ１は、もっぱらＣλ１と組み換わるとみられる。Ｃλ４は、スプライス部位を欠損した偽遺伝子であると考えられている。
マウスκ軽鎖遺伝子座は、著しく異なる。組換え事象に関与してマウスκ遺伝子座から機能的な軽鎖タンパク質をもたらす遺伝子セグメントの構造および数は、相当に複雑である（図２１）。したがって、マウスλ軽鎖は、典型的なマウスでは抗体集団の多様性に大きくは寄与しない。
とりわけ、マウスにおいてヒトλ軽鎖遺伝子座の豊富な多様性を利用することは、軽鎖Ｖドメインのより完全なヒトレパートリーに対して供給源をもたらす可能性がある。この多様性を利用する以前の試みでは、マウスゲノムにランダムに組み込まれたヒトλ軽鎖遺伝子座の塊（ｃｈｕｎｋ）を含むヒト導入遺伝子が使用された（例えば、米国特許第６，９９８，５１４号および米国特許第７，４３５，８７１号を参照のこと）。報告によると、これらのランダムに組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）導入遺伝子を含むマウスは、完全ヒトλ軽鎖を発現するが、しかしながら、場合によっては、片方または両方の内因性軽鎖遺伝子座がインタクトなまま残る。そのヒトλ軽鎖配列は、マウスの発現抗体レパートリーにおいてマウス軽鎖（κまたはλ）と競合するので、この状況は、望ましくない。
対照的に、本発明者らは、マウス軽鎖遺伝子座から直接１つまたは複数のλ軽鎖核酸配列を発現すること（内因性マウス軽鎖遺伝子座における置換によるものを含む）ができる遺伝的に改変されたマウスを記載する。内因性遺伝子座からヒトλ軽鎖配列を発現することができる遺伝的に改変されたマウスは、ヒト重鎖遺伝子座を含むマウスとさらに交配され得、それゆえ完全にヒトのものであるＶ領域（重鎖および軽鎖）を含む抗体を発現するために使用され得る。様々な実施形態において、それらのＶ領域は、マウス定常領域とともに発現する。様々な実施形態において、内因性マウス免疫グロブリン遺伝子セグメントは存在せず、それらのＶ領域は、ヒト定常領域とともに発現する。これらの抗体は、数多くの用途（診断的な用途と治療的な用途の両方）において有益であると判明するだろう。
ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントに由来する結合タンパク質をマウスにおいて発現させる様々な実施形態について、多くの利点を実現することができる。内因性軽鎖遺伝子座、例えば、マウスκまたはλ遺伝子座にヒトλ配列を配置することによって、利点を実現することができる。そのようなマウスから産生される抗体は、マウスＣＬ領域（具体的には、マウスＣκまたはＣλ領域）に融合したヒトＶλドメインを含む軽鎖を有し得る。そのマウスは、ヒトＣＬ領域（具体的には、Ｃκおよび／またはＣλ領域）とともに使用するための、同定およびクローニングに適したヒトＶλドメインも発現する。そのようなマウスにおけるＢ細胞発生は、その他の点では正常であるので、ＣλまたはＣκ領域との関係において適合性のＶλドメイン（体細胞変異したＶλドメインを含む）を生成することが可能である。
免疫グロブリンκまたはλ軽鎖遺伝子座に再配列していないＶλ遺伝子セグメントを含む遺伝的に改変されたマウスが記載される。Ｃκおよび／またはＣλ領域に融合したヒトＶλドメインを有する軽鎖を含む抗体を発現するマウスが記載される。
１つの態様では、遺伝的に改変された非ヒト動物は、（１）上記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に１つまたは複数の再配列していないヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数の再配列していないヒトＪλ遺伝子セグメント、（２）上記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数（ｏｎｅ ｍｏｒｅ）のヒトＤＨ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、上記非ヒト動物は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現することができ、上記ＡＤＡＭ６タンパク質は、上記非ヒト動物の雄において機能的であると記載される。１つの態様では、遺伝的に改変された非ヒト動物は、ヒトＶＨドメインおよび非ヒト重鎖定常領域を含む重鎖と、ヒトＶλドメインおよび非ヒト軽鎖定常領域を含む軽鎖とを含有する抗体を発現し、上記非ヒト動物は、ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片を発現することができると記載される。様々な実施形態において、上記非ヒト動物は齧歯動物である。１つの実施形態において、上記齧歯動物は、マウスまたはラットである。
１つの実施形態において、上記非ヒト軽鎖定常ドメインは、ＣκまたはＣλドメインである。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片は、上記マウスの生殖細胞系の異所性配列によりコードされる。１つの実施形態において、上記ＡＤＡＭ６タンパク質またはその機能的断片は、上記非ヒト動物の内因性配列によりコードされる。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座である。１つの実施形態において、上記非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、上記内因性軽鎖遺伝子座に内因性ＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントを欠く。特定の実施形態において、上記ＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖκおよび／またはＪκ遺伝子セグメントである。特定の実施形態において、上記ＶＬおよび／またはＪＬ遺伝子セグメントは、Ｖλおよび／またはＪλ遺伝子セグメントである。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、１つまたは複数のヒトＶλおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントにより置換される。特定の実施形態において、上記非ヒト動物のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、κ遺伝子セグメントである。特定の実施形態において、上記非ヒト動物のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、λ遺伝子セグメントである。
１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントは、上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡの断片からのものである。特定の実施形態において、クラスターＡの上記断片（ｆｒａｇｍｅｎ）は、ヒトＶλ３－２７～ヒトＶλ３－１にわたる。特定の実施形態において、クラスターＡの上記断片は、ヒトＶλ３－１２からヒトＪλ１にわたる。１つの実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントは、上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢの断片からのものである。特定の実施形態において、クラスターＢの上記断片は、ヒトＶλ５－５２からヒトＶλ１－４０にわたる。特定の実施形態において、上記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントは、本明細書に記載の上記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の、クラスターＡの断片からのものおよびクラスターＢの断片からのものである。
１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、少なくとも１２のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、少なくとも２８のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。１つの実施形態において、上記非ヒト動物は、少なくとも４０のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む。
１つの実施形態において、上記少なくとも１つのヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびその組み合わせからなる群から選択される。
１つの態様では、妊性非ヒト雄動物を提供し、該妊性非ヒト動物は、（１）ヒトＶλドメインまたはヒトＶκドメインを含む免疫グロブリン軽鎖、および（２）ヒトＶＨドメインを含む免疫グロブリン重鎖を発現し、上記雄非ヒト動物は、改変された重鎖可変領域遺伝子座および上記雄非ヒト動物において機能的である異所性ＡＤＡＭ６遺伝子を含む。１つの実施形態において、上記雄非ヒト動物はマウスである。
１つの態様では、抗原結合タンパク質を作製するための、本明細書に記載の非ヒト動物の使用を提供する。１つの実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、ヒトである。１つの実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、抗体である。１つの実施形態において、上記抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の非ヒト動物由来のヒトＶＨドメインおよび／またはヒトＶλドメインを含む。
１つの態様では、本明細書に記載の非ヒト動物由来の細胞または組織を提供する。１つの実施形態において、上記組織は、脾臓、骨髄またはリンパ節に由来する。１つの実施形態において、上記細胞はＢ細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。１つの実施形態において、上記細胞は生殖細胞である。
１つの態様では、本明細書に記載の遺伝的に改変された非ヒト動物の２倍体ゲノムを含む卵母細胞を提供する。
免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の無効の（ｓｔｅｒｉｌｅ）転写物
マウスにおいてヒト免疫グロブリンλ配列を発現するというテーマのバリエーションは、そのような発現が可能な遺伝的に改変されたマウスの様々な実施形態に反映される。したがって、いくつかの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、ヒト遺伝子座由来のある特定の非コード配列（単数または複数）を含む。１つの実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、内因性κ軽鎖遺伝子座にヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含み、さらに、ヒトκ軽鎖ゲノム断片を含む。特定の実施形態において、そのヒトκ軽鎖ゲノム断片は、天然にはヒトＶκ遺伝子セグメントとヒトＪκ遺伝子セグメントとの間に見出される非コード配列である。
上記ヒトおよびマウスκ軽鎖遺伝子座は、開始コドンまたはオープンリーディングフレームのいずれかを欠く無効の転写物をコードし、かつκ軽鎖遺伝子座の転写を制御するエレメントとされている、配列を含む。これらの無効の転写物は、最も近位のＶκ遺伝子セグメントの下流または３’側、かつκ軽鎖定常領域遺伝子（Ｃκ）の上流に存在するκ軽鎖イントロンエンハンサー（Ｅκｉ）の上流または５’側に位置する遺伝子間配列から生じる。その無効の転写物は、その遺伝子間配列の再配列から生じ、それにより、Ｃκに融合したＶκＪκ１セグメントが形成される。
Ｃκ遺伝子の上流のκ軽鎖遺伝子座の置換によって、無効の転写物をコードする遺伝子間領域が除去される。それゆえ、様々な実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントによる、マウスＣκ遺伝子の上流のマウスκ軽鎖配列の置換は、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むが無効の転写物をコードするκ軽鎖遺伝子間領域を含まないヒト化されたマウスκ軽鎖遺伝子座をもたらす。
本明細書中に記載されるように、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントによる内因性マウスκ軽鎖遺伝子座のヒト化（ここで、そのヒト化によって遺伝子間領域が除去される）は、λ軽鎖の使用頻度の著明な増加に加えて、κ軽鎖遺伝子座の使用頻度の著しい低下をもたらす。それゆえ、その遺伝子間領域を欠くヒト化マウスは、そのマウスがヒト軽鎖可変ドメイン（例えば、ヒトλまたはκドメイン）を有する抗体を産生し得る点で有用であるが、その遺伝子座からの使用頻度は低下する。
転写に関して、最終的なヒトＶλ遺伝子セグメントと第１のヒトＪλ遺伝子セグメントとの間にκ遺伝子間領域を含むＶλ遺伝子座を作製するためのヒトκ遺伝子間領域の挿入に加えて、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントによる内因性マウスκ軽鎖遺伝子座のヒト化も記載され；それは、κ遺伝子間領域を欠く遺伝子座よりも高発現のＢ細胞集団を示す。この知見は、その遺伝子間領域が（無効の転写物を介して直接または間接的に）内因性λ軽鎖遺伝子座からの使用頻度を抑制するという仮説と一致する。そのような仮説の下では、その遺伝子間領域を含めることによって、内因性λ軽鎖遺伝子座の使用頻度が低下し、それにより、そのマウスは選択が制限されるが、改変された遺伝子座（λをκに）を使用して抗体が生成される。
様々な実施形態において、ヒトλ軽鎖配列による、マウスＣκ遺伝子の上流のマウスκ軽鎖配列の置換は、転写の点から最も３’側のＶλ遺伝子セグメントの３’非翻訳領域と第１のヒトＪλ遺伝子セグメントに対して５’側との間に配置されたヒトκ軽鎖遺伝子間領域をさらに含む。あるいは、そのような遺伝子間領域は、内因性λ軽鎖遺伝子座において欠失を作製することによって、置換される内因性κ軽鎖遺伝子座（マウスＣκ遺伝子の上流）から取り除かれ得る。同様に、この実施形態では、それらのマウスは、ヒトλ軽鎖配列を含む内因性κ軽鎖遺伝子座から抗体を産生する。
ヒトＶλドメインを発現するようにマウスを操作するアプローチ
内因性ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）領域に融合したヒトＶλドメインを有する軽鎖を含む抗体を産生する遺伝的に改変されたマウスを作製する様々なアプローチが記載される。様々な実施形態において、片方または両方の内因性軽鎖遺伝子座の欠失を含む遺伝的改変が記載される。例えば、内因性抗体レパートリーからマウスλ軽鎖を排除するために、第１のＶλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターの欠失、およびヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントによる第２の遺伝子クラスターのＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントの全体的または部分的な置換が行われ得る。遺伝的に改変されたマウス胚、細胞、ならびにそのマウス、マウス胚および細胞を作製するためのターゲティング構築物も提供される。
内因性Ｃλ遺伝子は、インタクトなままであり、ゆえに正常な機能性および内因性重鎖の定常領域と会合する能力を保持するので、様々な実施形態において、１つの内因性Ｖλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターの欠失および別の内因性Ｖλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターのＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントの置換では、その動物における天然の抗体定常領域の会合および機能の相対的に最小限の破壊が用いられる。したがって、そのような実施形態では、その改変は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む機能的な抗体分子の組み立てのために機能的な軽鎖定常領域に依存する他の内因性重鎖定常領域に影響しない。さらに、様々な実施形態において、その改変は、内因性重鎖および軽鎖、例えば、マウスＣλ領域に連結したｈＶλドメインを含む、膜に結合した機能的な抗体分子の組み立てにも影響しない。少なくとも１つの機能的なＣλ遺伝子が、内因性遺伝子座に保持されるので、ヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントによる内因性Ｖλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターのＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントの置換を含む動物は、その動物の発現抗体レパートリーに存在するヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントによって、免疫応答中に抗原に結合することができる正常なλ軽鎖を産生することができるはずである。
欠失した内因性マウスＶλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターの略図（一定の割合で拡大されていない）が、図２０に提供される。図示されるように、マウスλ軽鎖遺伝子座は、２つの遺伝子クラスターに組織化され、その両方が、機能的マウスλ軽鎖を形成するように組み換わることができる機能的遺伝子セグメントを含む。内因性マウスＶλ１－Ｊλ３－Ｃλ３－Ｊλ１－Ｃλ１遺伝子クラスターは、組換え部位が隣接したネオマイシンカセットを有するターゲティング構築物（ターゲティングベクター１）によって欠失する。他方の内因性遺伝子クラスター（Ｖλ２－Ｖλ３－Ｊλ２－Ｃλ２－Ｊλ４－Ｃλ４）は、組換え部位が隣接したハイグロマイシン－チミジンキナーゼカセットを有するターゲティング構築物（ターゲティングベクター２）によって部分的に欠失する。この第２のターゲティング事象では、Ｃλ２－Ｊλ４－Ｃλ４内因性遺伝子セグメントは保持される。第２のターゲティング構築物（ターゲティングベクター２）は、上記の第１のターゲティング構築物（ターゲティングベクター１）における組換え部位とは異なる組換え部位を用いて構築され、それにより、標的化が成功した後にその選択カセットの選択的な欠失が可能になる。得られる二重標的化された（ｄｏｕｂｌｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ）遺伝子座は、内因性λ軽鎖を産生することができないという点において、機能的にサイレンシングされている。この改変された遺伝子座は、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの挿入のために使用され、それにより、ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む内因性マウスλ遺伝子座が作製され得る（ここで、改変された遺伝子座において組換えが生じると、その動物は、内因性マウスＣλ遺伝子セグメントに連結した再配列したヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖を産生する）。
内因性λ遺伝子セグメントを非機能的にするようにマウスを遺伝的に改変することは、様々な実施形態において、その抗体レパートリーにおいてもっぱらκ軽鎖を示すマウスをもたらし、そのマウスは、その免疫応答におけるλ軽鎖の役割の評価にとって有用になり、また、Ｖκドメインを含むがＶλドメインを含まない抗体レパートリーの作製にとって有用になる。
内因性マウスλ軽鎖遺伝子座において組み換えられているマウスＣλ遺伝子に連結したｈＶλを発現する遺伝的に改変されたマウスは、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。ヒトＶλおよびＪλ遺伝子セグメントによる内因性マウスＶλ２－Ｖλ３－Ｊλ２遺伝子セグメントの置換の略図（一定の割合で拡大されていない）が図２２Ａに提供される。図示されるように、非機能的にされた内因性マウスλ軽鎖遺伝子座は、組換え部位が隣接したネオマイシンカセットを含むターゲティング構築物（１２／１－λターゲティングベクター）によって置換される。Ｖλ２－Ｖλ３－Ｊλ２遺伝子セグメントは、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび単一のｈＪλ遺伝子セグメントを含むヒトλ配列を含むゲノム断片で置換される。
したがって、この第１のアプローチによって、１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントが、単一のｈＪλ遺伝子セグメントに隣接する内因性λ軽鎖遺伝子座に配置される（図２２Ａ）。
改変された内因性λ軽鎖遺伝子座に対するさらなる改変は、より多くのｈＶλ遺伝子セグメントを挿入する同様の手法を用いて達成され得る。例えば、さらなるヒトｈＶλ遺伝子セグメントの漸進的な挿入のために使用される２つの追加のターゲティング構築物（＋１６－λおよび＋１２－λターゲティングベクター）の略図が図２３Ａに提供される。図示されるように、特定のヒトｈＶλ遺伝子セグメントを含む追加のゲノム断片が、ヒトλ軽鎖配列の先の挿入によって提供された相同性を用いて、逐次的な工程で、改変された内因性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。図示される各ターゲティング構築物を用いた組換えの際、逐次的な様式で、２８個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントが、改変された内因性λ軽鎖遺伝子座に挿入される。これにより、マウスＣλ遺伝子に連結したヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖タンパク質を産生するキメラ遺伝子座が作製される。
ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントをマウスλ遺伝子座に挿入する上記のアプローチは、Ｃλ２－Ｊλ４－Ｃλ４遺伝子セグメントの下流に配置されたエンハンサーを維持する（Ｅｎｈ２．４、ＥｎｈおよびＥｎｈ３．１と命名される、図２２Ａおよび図２３Ａ）。このアプローチによって、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座に単一の改変された対立遺伝子がもたらされる（図２５Ａ）。
マウスＣλ遺伝子セグメントに作動可能に連結したｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む軽鎖を発現するマウスを作製するための組成物および方法（内因性マウスλ軽鎖遺伝子座からそのような遺伝子を発現するマウスを作製するための組成物および方法を含む）が提供される。それらの方法は、選択的に、１つの内因性マウスＶλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターを非機能的にする工程（例えば、標的化された欠失によって）ならびにその内因性マウスλ軽鎖遺伝子座においてｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを使用してマウスにおいてｈＶλドメインを発現させる工程を包含する。
あるいは、第２のアプローチでは、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントが、内因性κ軽鎖遺伝子座に配置され得る。その遺伝的改変は、様々な実施形態において、内因性κ軽鎖遺伝子座の欠失を含む。例えば、内因性抗体レパートリーからマウスκ軽鎖を排除するために、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失が行われ得る。遺伝的に改変されたマウス胚、細胞、ならびにそのマウス、マウス胚および細胞を作製するためのターゲティング構築物も提供される。
上で述べられた理由のために、マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの欠失では、相対的に最小限の破壊が用いられる。欠失したマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの略図（一定の割合で拡大されていない）が図２１に提供される。２個の正確に配置されたターゲティングベクター（各々が部位特異的組換え部位を使用する）の間に位置するマウス配列のリコンビナーゼによって媒介される欠失を介して、内因性マウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが欠失する。第１のターゲティングベクター（Ｊκターゲティングベクター）は、マウスＪκ遺伝子セグメントを欠失させる第１のターゲティング事象において使用される。第２のターゲティングベクター（Ｖκターゲティングベクター）は、最も遠位のマウスＶκ遺伝子セグメントの５’に位置する配列を欠失させる、第２の逐次的なターゲティング事象において使用される。両方のターゲティングベクターが、部位特異的組換え部位を含み、それにより、標的化が成功した後に、両方の選択カセットおよび介在するすべてのマウスκ軽鎖配列の選択的欠失が可能になる。得られる欠失した遺伝子座は、内因性κ軽鎖を産生することができないという点において、機能的にサイレンシングされている。この改変された遺伝子座は、ｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの挿入のために使用され、それにより、ｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含む内因性マウスκ遺伝子座が作製され得る（ここで、改変された遺伝子座において組換えが生じると、その動物は、内因性マウスＣκ遺伝子セグメントに作動可能に連結した再配列したｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むλ軽鎖を産生する）。ヒトλ軽鎖配列を含む様々なターゲティングベクターが、この欠失したマウスκ遺伝子座と組み合わせて使用されることにより、マウスＣκ領域と作動可能に連結したヒトλ遺伝子セグメントを含むハイブリッド軽鎖遺伝子座が作製され得る。
したがって、第２のアプローチによって、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、単一のヒトＪλ遺伝子セグメントに隣接するマウスκ軽鎖遺伝子座に配置される（１２／１－κターゲティングベクター，図２２Ｂ）。
様々な実施形態において、このアプローチに対する変法は、遺伝子セグメントおよび／または制御配列を付加することにより、マウス抗体レパートリー内のマウスκ遺伝子座からのヒトλ軽鎖配列の使用頻度が最適化され得る。
第３のアプローチでは、１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントが、４個のｈＪλ遺伝子配列に隣接するマウスκ軽鎖遺伝子座に配置される（１２／４－κターゲティングベクター，図２２Ｂ）。
第３のアプローチでは、１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子間配列および単一のｈＪλ遺伝子配列に隣接するマウスκ軽鎖遺伝子座に配置される（１２（κ）１－κターゲティングベクター，図２２Ｂ）。
第４のアプローチでは、１つまたは複数のｈＶλ遺伝子セグメントが、ヒトκ遺伝子間配列、４個のｈＪλ遺伝子配列に隣接するマウスκ軽鎖遺伝子座に配置される（１２（κ）４－κターゲティングベクター図２２Ｂ）。
マウスκ遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを挿入する上記アプローチのすべてが、Ｃκ遺伝子の上流にκイントロンエンハンサーエレメント（Ｅκｉと命名される，図２２Ｂおよび図２３Ｂ）を維持し、かつＣκ遺伝子の下流に３’κエンハンサー（Ｅκ３’と命名される，図２２Ｂおよび図２３Ｂ）を維持する。それらのアプローチは、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座に４個の別個の改変された対立遺伝子をもたらす（図２５Ｂ）。
様々な実施形態において、遺伝的に改変されたマウスは、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座のノックアウトを含む。１つの実施形態において、そのλ軽鎖遺伝子座は、Ｖλ２からＪλ２に及ぶ領域およびＶλ１からＣλ１に及ぶ領域を欠失させるストラテジーによってノックアウトされる（図２０）。内因性λ軽鎖遺伝子座が内因性λドメインを発現する能力を低下させるかまたは排除する任意のストラテジーが、本開示における実施形態での使用に適している。
遺伝的に改変されたマウス由来のラムダドメイン抗体
マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座にヒトλ配列を含むマウスは、マウスＣＬ（ＣκまたはＣλ）領域に融合したｈＶλ領域を含む軽鎖を発現する。これらは、（ａ）機能的にサイレンシングされた軽鎖遺伝子座（例えば、内因性マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座のノックアウト）を含むマウス；（ｂ）内因性マウスＣλ遺伝子に作動可能に連結したｈＶおよびｈＪ遺伝子セグメントを含む内因性マウスλ軽鎖遺伝子座を含むマウス；（ｃ）内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したｈＶκおよびｈＪκ遺伝子セグメントを含む内因性マウスκ軽鎖遺伝子座を含むマウス；および（ｄ）一方のκ対立遺伝子がｈＶκおよびｈＪκを含み；他方のκ対立遺伝子がｈＶλおよびｈＪλを含み；一方のλ対立遺伝子がｈＶλおよびｈＪλを含み、一方のλ対立遺伝子がサイレンシングされているかもしくはノックアウトされているか、または両方のλ対立遺伝子が、ｈＶλおよびｈＪλを含み；かつ各々がｈＶＨ、ｈＤＨおよびｈＪＨを含む２個の重鎖対立遺伝子を含むマウスと都合よく交配される。
ＣκまたはＣλとの関係において発現するｈＶλドメインを含む抗体を使用して、ヒトＣλをコードする遺伝子を有する発現構築物にｈＶλドメインをコードする核酸をクローニングすることによって、完全ヒト抗体を作製する。得られる発現構築物は、ｈＣλに融合した完全なｈＶλドメインを示す抗体の発現に適した宿主細胞にトランスフェクトされる。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の作製および使用の仕方を説明するために提供するものであり、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではない。別の指示が無い限り、温度は摂氏で示し、圧力は大気圧または近大気圧である。
実施例１。マウス免疫グロブリン遺伝子のヒト化
ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）を使用して、マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化のための１３の異なるＢＡＣターゲティングベクター（ＢＡＣｖｅｃ）を工学的に作製した。表１および２は、マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化にそれぞれ利用したすべてのＢＡＣｖｅｃを構築するために行った工程の詳細な説明を示すものである。
ヒトおよびマウスＢＡＣの同定。ＢＡＣライブラリーを用いてスポットしたフィルターのハイブリダイゼーションにより、またはマウスＢＡＣライブラリーＤＮＡプールのＰＣＲスクリーニングにより、免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座の５’および３’端にわたるマウスＢＡＣを同定した。対象となる領域に対応するプローブを使用して、標準条件下でフィルターをハイブリダイズした。対象となる標的領域に隣接するユニークなプライマーペアを使用してＰＣＲによりライブラリープールをスクリーニングした。同じプライマーを使用する追加のＰＣＲを行って、所与のウェルをデコンボリュートし、対象となる対応するＢＡＣを単離した。ＢＡＣフィルターとライブラリープールの両方を１２９ＳｖＪマウスＥＳ細胞（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）から生成した。全免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座をカバーするヒトＢＡＣを、ＢＡＣライブラリー（Ｃａｌｔｅｃｈ Ｂ、ＣもしくはＤライブラリーおよびＲＰＣＩ－１１ライブラリー、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてスポットしたフィルターのハイブリダイゼーションとＰＣＲベースの方法によるヒトＢＡＣライブラリープール（Ｃａｌｔｅｃｈライブラリー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のスクリーニングによるか、またはＢＡＣ末端配列データベース（Ｃａｌｔｅｃｈ Ｄ ｌｉｂｒａｒｙ、ＴＩＧＲ）の使用によるかの、いずれかによって同定した。
細菌相同組換えおよびライゲーションによるＢＡＣｖｅｃの構築。細菌相同組換え（ＢＨＲ）を記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３；Ｚｈａｎｇら，Ｙ．， Ｂｕｃｈｈｏｌｚ， Ｆ．， Ｍｕｙｒｅｒｓ， Ｊ．Ｐ．， ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｔ， Ａ．Ｆ．（１９９８，）．Ａ ｎｅｗ ｌｏｇｉｃ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２０，１２３－１２８）とおりに行った。殆どの場合、ＰＣＲ由来ホモロジーボックスのクローン化カセットへのライゲーション、続いてライゲーション産物のゲル単離、そして標的ＢＡＣを保有するＢＨＲコンピテント細菌へのエレクトロポレーションによって線状断片を生成した。適切な抗生物質ペトリ皿での選択の後、正しく組換えられたＢＡＣを、両方の新規接合部にわたってのＰＣＲ、続いてパルスフィールドゲルでの制限酵素分析（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｄ．Ｃ． ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．（１９８４）Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｉｚｅｄ ＤＮＡｓ ｂｙ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ ３７，６７－７５）、そしてヒト配列全域にわたって分布するプライマーを使用するＰＣＲによるスポットチェックによって同定した。
３工程の逐次的ＢＨＲ工程を用いて、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の最初のヒト化工程のための３ｈＶＨ ＢＡＣｖｅｃを構築した（図４Ａおよび表１）。第一工程（工程１）では、ヒト親ＢＡＣのヒトＶＨ１－３遺伝子セグメントから上流に、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座と相同性の領域（ＨＢ１）と細菌にカナマイシン耐性をおよび動物細胞にＧ４１８耐性を付与する遺伝子（ｋａｎＲ）と部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ）とを含有するカセットを導入した。第二工程（工程２）では、最後のＪＨセグメントから直ぐ下流に、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座と相同性の第二の領域（ＨＢ２）と細菌にスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（ｓｐｅｃＲ）とを含有する第二のカセットを導入した。この第二工程は、ＪＨ６から下流のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座配列とＢＡＣベクタークロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍＲ）とを欠失させることを含んだ。次に、第三工程（工程３）では、最初の２工程の間に付加されたＩ－ＣｅｕＩ部位を使用して二重改変ヒトＢＡＣ（Ｂ１）を線形化し、２つの相同性領域（ＨＢ１およびＨＢ２）によるＢＨＲによってマウスＢＡＣ（Ｂ２）に組み込んだ。第一（ｃｍ／ｋａｎ）、第二（ｓｐｅｃ／ｋａｎ）および第三（ｃｍ／ｋａｎ）工程のための薬剤選択は、所望の産物に特異的であるように設計した。制限酵素での消化後にパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により改変ＢＡＣクローンを分析して、適切な構築物を決定した（図４Ｂ）。
同様に、重鎖およびκ軽鎖遺伝子座のヒト化のために１２の追加のＢＡＣｖｅｃを工学的に作製した。場合によっては、選択マーカーの注意深い配置と共に、ＢＨＲによる両方の親ＢＡＣｖｅｃへの稀な制限酵素認識部位導入による、ＢＨＲの代わりにＢＡＣライゲーションを行って、２つの大きなＢＡＣを結合した。これにより、特定の薬剤マーカーの組み合わせでの選択の際に、所望のライゲーション産物の生残が可能になった。稀な制限酵素での消化後のライゲーションによって得た組換えＢＡＣを、ＢＨＲによって得たものと同様に（上に記載したように）同定し、スクリーニングした。
Figure 0007507823000004
Figure 0007507823000005
Figure 0007507823000006
Figure 0007507823000007
胚性幹（ＥＳ）細胞の改変およびマウスの産生。記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）ようなＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法を用いて、ＥＳ細胞（Ｆ１Ｈ４）ターゲティングを行った。胚盤胞（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）または８細胞注入（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、２００７）のいずれかによる改変ＥＳ細胞からのマウスの誘導は、記載されているとおりであった。ＰＣＲベースのアッセイでプローブとプライマーのユニークなセットを用いてＥＳ細胞またはマウスからのＤＮＡをスクリーニグすることにより、標的ＥＳ細胞およびマウスを確認した（例えば、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。すべてのマウス研究は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの施設内動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）によって監督され、承認された。
核型分析および蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。核型分析は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ニュージャージー州カムデン）によって行われた。ＦＩＳＨは、標的ＥＳ細胞を用いて、記載されている（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）とおりに行った。マウスＢＡＣ ＤＮＡまたはヒトＢＡＣ ＤＮＡのいずれかに対応するプローブを、ニック翻訳（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により蛍光標識ｄＵＴＰヌクレオチドスペクトルオレンジまたはスペクトルグリーン（Ｖｙｓｉｓ）で標識した。
免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座。重鎖遺伝子座の可変領域のヒト化は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３参照）を用いて、９工程の逐次的工程で、すべてのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含有する約３百万塩基対（Ｍｂ）の連続するマウスゲノム配列を、等価ヒト遺伝子セグメントを含有する約１Ｍｂの連続するヒトゲノム配列で直接置換することによって達成した（図１Ａおよび表１）。
ＪＨ遺伝子セグメントと定常領域遺伝子の間のイントロン（Ｊ－Ｃイントロン）は、転写エンハンサー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．（１９８３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ、Ｅｍｂｏ Ｊ ２，１３７３－１３７８）、その後にアイソタイプスイッチ中の組換えに必要な単純リピート領域（Ｋａｔａｏｋａ， Ｔ．， Ｋａｗａｋａｍｉ， Ｔ．， Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｎ．， ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ， Ｔ．（１９８０）Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇａｍｍａ １－ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｃｌａｓｓ
ｓｗｉｔｃｈ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７７，９１９－９２３）を含有する。マウス内でのヒト化重鎖遺伝子座の効率的発現およびクラススイッチ両方を保存するために、マウス重鎖イントロンエンハンサーおよびスイッチドメインを維持するようにヒトＶＨ－ＤＨ－ＪＨ領域とマウスＣＨ領域の間の接合部（近位接合部）を選択した。合成オリゴヌクレオチドによって駆動される細菌相同組換えを用いるＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法（上記）の使用により、すべての置換においてこのおよび後続の接合部の正確なヌクレオチド位置が実現可能であった。このようにして、近位接合部を最後のＪＨ遺伝子セグメントから約２００ｂｐ下流に配置し、遠位接合部を、ヒト遺伝子座の最も５’側のＶＨ遺伝子セグメントの数百上流、かつＪ５５８．５５としても公知のマウスＶＨ１－８６遺伝子セグメントから約９ｋｂ下流に配置した。上記マウスＶＨ１－８６（Ｊ５５８．５５）遺伝子セグメントは最遠位重鎖可変遺伝子セグメントであり、このセグメントは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは偽遺伝子であるが、標的１２９対立遺伝子において不十分なＲＳＳ配列であるにもかかわらず潜在的に活性であると報告されている。上記マウス重鎖遺伝子座の遠位端は、報告によれば、遺伝子座発現および／または再配列を調節する制御要素を含有し得る（Ｐａｗｌｉｔｚｋｙら、２００６）。
ヒト免疫グロブリンＤＮＡ配列のマウスへの第一の挿入は、約７５ｋｂのマウスホモロジーアームを使用して、３つのＶＨ、２７すべてのＤＨおよび９つのＪＨヒト遺伝子セグメントを含有するヒト重鎖遺伝子座の１４４ｋｂの近位端をマウスＩｇＨ遺伝子座の近位端に挿入し、相伴って１６．６ｋｂのマウスゲノムを欠失させることによって達成した（工程Ａ、図２Ａ；表１および３、３ｈＶＨ）。この大きな１４４ｋｂ挿入および随伴する１６．６ｋｂ欠失を単一の工程（工程Ａ）で行い、この工程は０．２％の頻度で行われた（表３）。欠失マウス配列内のおよび欠失マウス配列に隣接するプローブならびに挿入ヒト配列内のプローブを使用する天然対立遺伝子の喪失（ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｎａｔｉｖｅ－ａｌｌｅｌｅ：ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）により、正しくターゲティングされたＥＳ細胞にスコアを付けし、全挿入にわたって複数のプローブを使用して大きなヒト挿入物の完全性を検証した（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。多ラウンドの逐次的ＥＳ細胞ターゲティングが予想されたので、この工程およびすべての後続の工程で標的ＥＳ細胞クローンを核型分析（上記）に付し、２０のうち少なくとも１７のスプレッドにおいて正常な核型を示すクローンのみを後続の工程に用いた。
工程Ａからの標的ＥＳ細胞をＢＡＣｖｅｃで再ターゲティングし、それにより、重鎖遺伝子座の遠位端に１９ｋｂ欠失を生じさせた（工程Ｂ、図２Ａ）。工程ＢのＢＡＣｖｅｃは、工程ＡのＢＡＣｖｅｃに含有されているネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）とは対照的にハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）を含有した。これら２つのＢＡＣｖｅｃからの耐性遺伝子は、同じ染色体へのターゲティング成功により、該２つの耐性遺伝子ばかりでなくＶＨ１－８６以外のすべてのマウスＶＨ遺伝子セグメントおよびＤＱ５２以外のすべてのＤＨ遺伝子セグメントを含有するおおよそ３Ｍｂのマウス重鎖可変遺伝子遺伝子座をｌｏｘＰ部位に隣接させるように、ならびにＤＱ５２およびすべてのマウスＪＨ鎖遺伝子セグメントが工程Ａにおいて欠失するように設計した。同じ染色体上に二重にターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、３ｈＶＨ近位カセットを高Ｇ４１８においてホモ接合性にさせること（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９２）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｎｔ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，２３９１－２３９５）および遠位ｈｙｇカセットの運命を追跡することによって同定した。ｌｏｘＰ部位が隣接するような手法で改変された４Ｍｂ以下のサイズのマウスセグメントは、薬剤選択不在の場合でさえ、高効率（約１１％以下）でのＣＲＥリコンビナーゼの一過的発現によりＥＳ細胞において首尾よく欠失した（Ｚｈｅｎｇら，Ｂ．（２０００）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｗｉｔｈ Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ： ｒａｎｇｅ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ， ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，６４８－６５５）。同様の手法で、本発明者らは、一過的ＣＲＥ発現後に８％のＥＳ細胞クローンにおいて３Ｍｂ欠失を実現した（工程Ｃ、図２Ａ、表３）。欠失マウス配列のいずれかの末端におけるプローブ、ならびにｎｅｏおよびｈｙｇの喪失、および唯一残存するｌｏｘＰ部位を含有する欠失点にわたるＰＣＲ産物の出現を用いるＬＯＮＡアッセイによって欠失にスコアを付けた。さらに、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって欠失を確認した（データを示さない）。
各工程が２１０ｋｂ以下のヒト遺伝子配列の正確な挿入を含む、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学法を用いる一連の５工程（工程Ｅ～Ｈ、図２Ｂ）で、ヒト重鎖可変領域の残部を３ｈＶＨ対立遺伝子に付加させた。各工程について、各新たなＢＡＣｖｅｃの近位端を前の工程の最遠位ヒト配列とオーバーラップするように設計し、各新たなＢＡＣｖｅｃの遠位端は、工程Ａにおいて使用したのと同じ遠位マウス相同領域を含有した。工程Ｄ、ＦおよびＨのＢＡＣｖｅｃはｎｅｏ選択カセットを含有したが、工程ＥおよびＧのものは、ｈｙｇ選択カセットを含有し、したがって、Ｇ４１８とハイグロマイシンの間で交互に選択した。工程Ｄにおけるターゲティングを、３ｈＶＨハイブリッド対立遺伝子の遠位ｌｏｘＰ部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の喪失によってアッセイした。工程ＥからＩについてのターゲティングは、前の選択カセットの喪失によってアッセイした。最後の工程（工程Ｉ、図２Ｂ）では、Ｆｒｔ部位（ＭｃＬｅｏｄ，Ｍ．ら（１９８６）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｓｉｔｅ ｄｕｒｉｎｇ ＦＬＰ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｐｌａｓｍｉｄ ２ ｍｉｃｒｏｎｓ ｃｉｒｃｌｅ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６：３３５７－３３６７）が隣接するｎｅｏ選択カセットを、一過的ＦＬＰｅ発現（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，Ｆ．ら（１９９８）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＦＬＰ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ｃｙｃｌｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６，６５７－６６２）によって除去した。工程Ｄ、ＥおよびＧについてのＢＡＣｖｅｃのヒト配列は、２つの親ヒトＢＡＣ各々に由来したが、工程ＦおよびＨからのヒト配列は、単一のＢＡＣからのものであった。挿入ヒト配列にわたって複数のプローブを使用して、ヒト配列の保持を工程ごとに確認した（上記したとおり、例えば図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。各工程で、正常な核型および生殖細胞系の潜在力を有するクローンのみを次の工程に進めた。最後の工程からのＥＳ細胞は、９種の逐次的操作（表３）の後、依然として生殖細胞系に寄与することができた。重鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性のマウスは、生育可能であり、健常であるように見え、および本質的に野生型の体液性免疫系を実証した（実施例３参照）。
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免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座。重鎖のものに類似した手法で、すべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する約３Ｍｂのマウス配列を、近位ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する約０．５Ｍｂのヒト配列で直接置換することにより、８工程の逐次的工程でκ軽鎖可変領域をヒト化した（図１Ｂ；表２および４）。
ヒトκ軽鎖遺伝子座の可変領域は、８００ｋｂスペーサーによって隔てられた２つのほぼ同一の４００ｋｂリピートを含有する（Ｗｅｉｃｈｈｏｌｄ，Ｇ．Ｍ．ら（１９９３）Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｃｏｐｉｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｉｎ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｐｏｌａｒｉｔｙ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １６，５０３－５１１）。これらのリピートは非常に類似しているので、近位リピートを使用することによりマウスにおいてほぼすべての遺伝子座多様性を再現することができる。さらに、遠位リピートを欠くκ軽鎖遺伝子座の天然ヒト対立遺伝子が報告されている（Ｓｃｈａｉｂｌｅ，Ｇ．ら（１９９３）Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ： ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｃａｕｃａｓｏｉｄ ａｎｄ ｎｏｎ－Ｃａｕｃａｓｏｉｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ９１，２６１－２６７）。本発明者らは、約３Ｍｂのマウスκ軽鎖可変遺伝子配列を約０．５Ｍｂのヒトκ軽鎖可変遺伝子配列で置換して、すべてのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを近位ヒトＶκおよびすべてのヒトＪκ遺伝子セグメントで有効に置換した（図２Ｃおよび２Ｄ；表２および４）。重鎖遺伝子座について実施例１において記載する方法とは対照的に、任意のヒト配列を付加する前に３工程のプロセスですべてのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントを含有する全マウスＶκ遺伝子領域を欠失させた。最初、ｎｅｏカセットを可変領域の近位端に導入した（工程Ａ、図２Ｃ）。次に、ｈｙｇカセットをκ遺伝子座の遠位端に挿入した（工程Ｂ、図２Ｃ）。残存する３ＭｂのマウスＶκ領域と共に両方の耐性遺伝子の欠失がＣＲＥ処理により誘導されるように、ｌｏｘＰ部位を各選択カセットの中に再び置いた（工程Ｃ、図２Ｃ）。
重鎖について用いた方法（実施例１参照）に類似した方法を用いて、１５０ｋｂ以下のヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列を１工程で挿入して、免全疫グロブリンκ軽鎖可変領域を含有する約４８０ｋｂサイズのヒトゲノム断片を４工程の逐次的工程（図２Ｄ；表２および４）で挿入した。最後のハイグロマイシン耐性遺伝子を一過的ＦＬＰｅ発現によって除去した。重鎖と同様に、いずれの工程後にも、標的ＥＳ細胞クローンを全ヒト挿入物の完全性、正常な核型および生殖細胞系の潜在性について評価した。κ軽鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性のマウスが産生され、健常であることおよび正常な外観のものであることが判明した。
Figure 0007507823000009
実施例２
複数のヒト化免疫グロブリン対立遺伝子の組み合わせによる完全ヒト化マウスの産生
幾つかの箇所に、実施例１に記載したようなヒト免疫グロブリン重鎖またはκ軽鎖可変レパートリーの一部分を保有するＥＳ細胞を微量注射し、得られたマウスを交配させて、ヒト生殖細胞系免疫グロブリンレパートリーの徐々に大きな断片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの複数のバージョンを生み出した（表５；図５Ａおよび５Ｂ）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（Ｖ１）マウスは、１８のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを、１６のヒトＶκ遺伝子セグメントおよびすべてのヒトκ遺伝子セグメントと併せて有する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（Ｖ２）およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）（Ｖ３）マウスは、合計３９のＶＨおよび３０のＶκおよび８０のＶＨおよび４０のＶκをそれぞれ保有する増加した可変レパートリーを有する。マウスＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメント、ならびにＶκおよびＪκ遺伝子セグメントをコードするゲノム領域は完全に置換されていたので、任意のバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにより産生される抗体が、マウス定常領域に連結されたヒト可変領域を含有する。マウスλ軽鎖遺伝子座は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの様々な実施形態においてインタクトなままであり、すべてのバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）κ軽鎖遺伝子座の発現効率についてのコンパレータとして役立つ。
免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖両方のヒト化について二重にホモ接合性のマウスを、実施例１で記載した対立遺伝子のサブセットから産生させた。二重ホモ接合型マウスを産生するための交配コースの間に観察されたすべての遺伝子型は、大体メンデル比で発生した。ヒト重鎖対立遺伝子の各々についてホモ接合性の雄後代は、妊性低減を示した。妊性低減は、マウスＡＤＡＭ６活性の喪失に起因した。マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座は、２つのはめ込んだ機能的ＡＤＡＭ６遺伝子（ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ）を含有する。マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化の間、挿入されたヒトゲノム配列は、ＡＤＡＭ６偽遺伝子を含有した。マウスＡＤＡＭ６は、妊性に要求され得、それ故、ヒト偽遺伝子の存在にもかかわらずヒト化重鎖可変遺伝子遺伝子座におけるマウスＡＤＡＭ６遺伝子の欠如がこれらのマウスにおける妊性低減をもたらした可能性がある。実施例７～９は、欠失したマウスＡＤＡＭ６遺伝子のヒト化重鎖可変遺伝子遺伝子座への正確な配置戻し、およびヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにおける野生型レベルの妊性の回復を記載する。
Figure 0007507823000010
実施例３
ヒト化免疫グロブリン遺伝子を有するマウスにおけるリンパ球集団
３つの異なるバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける成熟Ｂ細胞集団をフローサイトメトリーによって評価した。
簡単に言うと、標準的な方法を用いて、骨髄、脾臓および胸腺からの細胞懸濁液を作製した。ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ＦＡＣＳ染色緩衝液中５×１０５細胞／ｍＬで細胞を再懸濁させ、抗マウスＣＤ１６／３２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でブロッキングし、適切な抗体カクテルで染色し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）で固定し、これらの作業はすべて製造業者の指示に従って行った。最終細胞ペレットを０．５ｍＬ染色緩衝液に再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（商標）およびＢＤ ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ ＰＲＯ（商標）ソフトウェアを使用して分析した。すべての抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を質量希釈／カクテルで調製し、０．５ｍｇ／１０５細胞の最終濃度まで添加した。骨髄（Ａ～Ｄ）染色用の抗体カクテルは、次のとおりであった：Ａ：抗マウスＩｇＭｂ－ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＭａ－ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＡＰＣ；Ｂ：抗マウスＣＤ４３（Ｓ７）－ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＡＰＣ；Ｃ：抗マウスＣＤ２４（ＨＳＡ）－ＰＥ；抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＡＰＣ；Ｄ：抗マウスＢＰ－１－ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＡＰＣ。脾臓および鼠蹊リンパ節（Ｅ～Ｈ）染色用の抗体カクテルは、次のとおりであった：Ｅ：抗マウスＩｇＭｂ－ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＭａ－ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＡＰＣ；Ｆ：抗マウスＩｇ、
Figure 0007507823000011
 軽鎖－ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇκ軽鎖－ＰＥ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＡＰＣ；Ｇ：抗マウスＬｙ６Ｇ／Ｃ－ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）－ＰＥ、抗マウスＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ；Ｈ：抗マウスＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）－ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）－ＰＥ、抗マウスＣＤ８ａ－ＡＰＣ。結果を図６に示す。
ホモ接合型ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの脾臓またはリンパ節から単離したリンパ球をマーカーＢ２２０およびＩｇＭの表面発現について染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した（図６）。試験したすべてのバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおけるＢ２２０＋ＩｇＭ＋成熟Ｂ細胞集団のサイズは、それらが含有するＶＨ遺伝子セグメントの数にかかわらず、実質的に野生型マウスのものと同一であった。加えて、ホモ接合性ハイブリッドヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有するマウスも、正常マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有するが３つしかＶＨ遺伝子セグメントを有さないマウス、またはホモ接合性ハイブリッドヒト化κ軽鎖と正常マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有するマウスでさえも、その末梢区画に正常な数のＢ２２０＋ＩｇＭ＋細胞を有した（示さず）。これらの結果は、ヒト可変遺伝子セグメントおよびマウス定常領域を有するキメラ遺伝子座が、成熟Ｂ細胞区画に十分に集合できることを示している。さらに、重鎖またはκ軽鎖遺伝子座のいずれかにおける可変遺伝子セグメントの数、およびしたがって抗体レパートリーの理論的多様性は、成熟Ｂ細胞の野生型集団を産生する能力と相関しない。対照的に、ランダムに組み込まれた完全ヒト免疫グロブリン導入遺伝子および不活性化マウス免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスは、これらの区画に低減数のＢ細胞を有し、その欠損の重度は、導入遺伝子に含まれている可変遺伝子セグメントの数に依存する（Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．およびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．（１９９８）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ
ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８，４８３－４９５）。これは、「ｉｎ ｓｉｔｕ遺伝子ヒト化」戦略が、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」アプローチで実現されるランダムに組み込まれる導入遺伝子とは基本的に異なる機能的帰結をもたらす結果となることの証拠となる。
対立遺伝子排除および遺伝子座選択
対立遺伝子排除を維持する能力を、異なるバージョンのヒト化免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスで調査した。
１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃおよびＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃヘテロ接合胚に由来するＦ１ ＥＳ系列（Ｆ１Ｈ４（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３））で免疫グロブリン遺伝子座のヒト化を行った。ヒト重鎖生殖細胞系可変遺伝子配列を１２９Ｓ６対立遺伝子にターゲティングする。この対立遺伝子はＩｇＭａハプロタイプを保有するが、未改変マウスＣ５７６ＢＬ／６Ｎ対立遺伝子はＩｇＭｂハプロタイプを有する。ＩｇＭのこれらの対立遺伝子形態は、ＩｇＭａまたはＩｇＭｂ対立遺伝子において見出される多型に特異的な抗体を使用してフローサイトメトリーにより区別することができる。図６（最下段）に示されているように、各バージョンのヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスにおいて同定されたＢ細胞は、単一の対立遺伝子、ＩｇＭａ（ヒト化対立遺伝子）またはＩｇＭｂ（野生型対立遺伝子）のいずれか、しか発現しない。これは、対立遺伝子排除に関与する機序が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいてインタクトであることの証拠となる。加えて、ヒト化対立遺伝子（ＩｇＭａ）について陽性のＢ細胞の相対数は、存在するＶＨ遺伝子セグメントの数に大体比例する。ヒト化免疫グロブリン遺伝子座は、１８のヒトＶＨ遺伝子セグメントを有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１ヘテロ接合体マウスではＢ細胞のおおよそ３０％において発現し、ならびに３９および８０のヒトＶＨ遺伝子セグメントをそれぞれ有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２および３（示さず）ヘテロ接合体マウスではＢ細胞の５０％において発現する。注目に値することとして、ヒト化マウス対立遺伝子を発現する細胞の、野生型マウス対立遺伝子を発現する細胞に対する比（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１マウスについては０．５およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２マウスについては０．９）は、ヒト化遺伝子座に含有される可変遺伝子セグメント数の、野生型遺伝子座に含有される可変遺伝子セグメントの数に対する比（ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１マウスについては０．２およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２マウスについては０．４）より大きい。これは、対立遺伝子選択の確率が、１つもしくは他の染色体のランダム選択と任意の特定のＶセグメントＲＳＳのランダム選択の間の中間であることを示している。さらに、一方の対立遺伝子が組み換えに利用できるようになり、その過程を完了し、組換えを遮断し、その後、他方の対立遺伝子が利用能になるＢ細胞が、すべてではないが、一部存在し得る。加えて、ハイブリッドヒト化重鎖遺伝子座または野生型マウス重鎖遺伝子座のいずれかに由来する表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）を有する細胞の一様な分布は、該ハイブリッド遺伝子座が正常レベルで動作している証拠である。対照的に、ランダムに組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、野生型マウス免疫グロブリン遺伝子座との競合が不十分である（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら（１９８９）Ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．ＰＮＡＳ ８６，６７０９－６７１３；Ｇｒｅｅｎら、１９９４；Ｔｕａｉｌｌｏｎ，Ｎ．ら（１９９３）Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ：ｇｅｎｅ－ｓｅｇｍｅｎｔ ｕｓｅ ｉｎ ｍｕ ａｎｄ ｇａｍｍａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０，３７２０－３７２４）。これは、さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスによって産生される免疫グロブリンが、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」アプローチによって作製されるマウスにおけるランダムに組み込まれた導入遺伝子によって産生されるものとは機能的に異なることの証拠となる。
１２９Ｓ６またはＣ５７ＢＬ／６Ｎでは、非ヒト化κ軽鎖遺伝子座に対するヒト化κ軽鎖遺伝子座の対立遺伝子排除の調査にＣκ領域の多型を利用できない。しかし、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスすべてが野生型マウスλ軽鎖遺伝子座を有するので、ヒト化κ軽鎖遺伝子座の再配列および発現がマウスλ軽鎖発現を防止できるかどうかを観察することが可能である。マウスλ軽鎖を発現する細胞の数に対するヒト化κ軽鎖を発現する細胞の数の比は、κ軽鎖遺伝子座に挿入されたヒトＶκ遺伝子セグメントの数にかかわらず、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスでは野生型マウスと比べて比較的不変であった（図６、上から三段目）。加えて、二重陽性（κ＋λ）細胞数の増加は無く、このことから、ハイブリッドκ軽鎖遺伝子座での生産的組換えが、マウスλ軽鎖遺伝子座の組換えの適切な抑制をもたらす結果となることが示された。対照的に、ランダムに組み込まれたκ軽鎖導入遺伝子と－野生型マウスλ軽鎖遺伝子座ではなく－不活性化されたマウスκ軽鎖遺伝子座を含有するマウスは、λ／κ比の劇的増大を示す（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８）。これは、導入されたκ軽鎖導入遺伝子が、かかるマウスでは十分に機能しないことを意味する。これは、さらに、「ノックアウト・プラス・トランスジェニック」マウスによって作製されるものと比較してＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスによって作製される免疫グロブリンにおいて観察される異なる機能的帰結の証拠となる。
Ｂ細胞発生。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける成熟Ｂ細胞集団は、（上に記載したように）野生型マウスのものと似ているため、早期Ｂ細胞分化の欠陥を成熟Ｂ細胞集団の増殖によって補償することが可能である。フローサイトメトリーを用いてＢ細胞集団を分析することによって、様々なＢ細胞分化段階を調査した。表６は、特定の細胞表面マーカーを使用して、野生型同腹子と比較したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおける、ＦＡＣｓにより定義した各Ｂ細胞系列の細胞の画分の比を示すものである。
早期Ｂ細胞発生は骨髄で起こり、異なるＢ細胞分化段階は、細胞表面マーカー発現のタイプおよび量の変化によって特徴づけられる。これらの表面発現における差異は、細胞内部の免疫グロブリン遺伝子座で起こる分子の変化と相関する。プロＢ細胞からプレＢ細胞への移行には機能的重鎖タンパク質の再配列および発現の成功が必要であるが、プレＢから成熟Ｂ期への移行は、κまたはλ軽鎖の正しい再配列および発現によって支配される。したがって、Ｂ細胞分化段階間の非効率的移行は、所与の段階のＢ細胞の関連集団の変化によって検出することができる。
Figure 0007507823000012
いずれのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいてもＢ細胞分化に大きな欠陥は認められなかった。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて、ヒト重鎖遺伝子セグメントの導入はプロＢからプレＢへの移行に影響を及ぼすようには見えず、またヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの導入はプレＢからＢへの移行に影響を及ぼさない。これは、ヒト可変領域およびマウス定常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ）を保有する「逆キメラ」免疫グロブリン分子が、Ｂ細胞シグナル伝達および共受容体分子に関連して正常に機能して、マウス環境で適切なＢ細胞分化をもたらすことを実証している。対照的に、ランダムに組み込まれた免疫グロブリン導入遺伝子および不活性化された内因性重鎖またはκ軽鎖遺伝子座を含有するマウスでは、Ｂ細胞分化中の異なる集団間のバランスが様々な程度に摂動される（ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８）。
実施例４
ヒト化免疫グロブリンマウスにおける可変遺伝子レパートリー
脾細胞およびハイブリドーマ細胞を含む複数の源からのヒト可変領域の逆転写酵素・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）により、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスのヒト化抗体レパートリーにおけるヒト可変遺伝子セグメントの使用頻度を分析した。可変領域配列、遺伝子セグメント使用頻度、体細胞超変異、および再配列可変領域遺伝子セグメントの接合部多様性を決定した。
簡単に言うと、ＴＲＩＺＯＬ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＱｉａｇｅｎ ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１×１０７～２×１０７脾細胞または約１０４～１０５ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してマウス定常領域特異的プライマーでプライミングした。重鎖とκ軽鎖の両方についてのヒト可変領域の各ファミリーのためのプールされたリーダープライマーとペアで上述の３’定常特異的プライマーを個々に使用して、各試料からの２～５μＬのＲＮＡを用いて反応を行った。試薬およびプライマーの容量、およびＲＴ－ＰＣＲ／ＰＣＲ条件は、製造業者の指示に従って行った。プライマー配列は、複数の源の基づいた（Ｗａｎｇ，Ｘ．およびＳｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．（２０００）Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＴ－ＰＣＲ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４４：２１７－２２５；Ｉｇ－ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ）。適宜、プールされたファミリー特異的フレームワークプライマーと第一の反応で使用したのと同じマウス３’免疫グロブリン定常特異的プライマーとを用いて第二のネステッドＰＣＲ反応を行った。各反応からのアリコート（５μＬ）をアガロース電気泳動によって分析し、ＭＯＮＴＡＧＥ（商標）Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してアガロースから反応生成物を精製した。ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製生成物をクローニングし、エレクトロポレーションによりＤＨ１０β大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。各形質転換反応から個々のクローンを選択し、２ｍＬのＬＢブロス培養液（ＬＢ ｂｒｏｔｈ
ｃｕｌｔｕｒｅ）中で抗生物質選択しながら一晩３７℃で成長させた。キットベースアプローチ（Ｑｉａｇｅｎ）により細菌培養物からプラスミドＤＮＡを精製した。
免疫グロブリン可変遺伝子の使用頻度。ＡＢＩ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、重鎖クローンとκ軽鎖クローン両方のプラスミドＤＮＡをＴ７リバースプライマーまたはＭ１３リバースプライマーのいずれかで配列決定した。生配列データをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（ｖ４．５、Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）にインポートした。各配列をコンティグに組み立て、ＩＭＧＴ
Ｖ－Ｑｕｅｓｔ（Ｂｒｏｃｈｅｔ， Ｘ．， Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ．Ｐ．， ａｎｄ
Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ， Ｖ． （２００８）．ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ：ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＩＧ ａｎｄ ＴＲ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｖ－Ｊ ａｎｄ Ｖ－Ｄ－Ｊ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６：Ｗ５０３－５０８）検索機能を用いてヒト免疫グロブリン配列にアラインして、ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨおよびＶκ、Ｊκセグメント使用頻度を同定した。体細胞超変異および組換え接合部分析のために配列を生殖細胞系配列と比較した。
ＲＡＧ相補性（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＲＡＧ－２－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ： ａｎ ａｓｓａｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０，４５２８－４５３２）による最初の重鎖改変（３ｈＶＨ－ＣＲＥハイブリッド対立遺伝子、図２Ａの最下部）を含有するＥＳ細胞からマウスを産生させ、脾細胞ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。挿入されたヒト遺伝子セグメント内でのＶ（Ｄ）Ｊ組換えおよびその後のマウスＩｇＭ定常ドメインまたはＩｇＧ定常ドメインのいずれかへのスプライシングによって生ずることになる予測キメラ重鎖ｍＲＮＡに特異的なプライマーセット（上記）使用して、そのｃＤＮＡを増幅させた。これらのｃＤＮＡクローンに由来する配列（示さず）は、正しいＶ（Ｄ）Ｊ組換えがヒト可変遺伝子配列内で発生したこと、再配列したヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントがインフレームでマウス定常ドメインへと正しくスプライシングしたこと、およびクラススイッチ組換えが発生したことを実証した。後続のハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座のｍＲＮＡ産物のさらなる配列分析を行った。
同様の実験で、免疫していない野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからのＢ細胞をフローサイトメトリーによりＢ２２０およびＩｇＭまたはＩｇＧの表面発現に基づいて分離した。Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋または表面ＩｇＧ＋（ｓＩｇＧ＋）細胞をプールし、ＲＴ－ＰＣＲ増幅およびクローニング（上記）の後にＶＨおよびＶκ配列を得た。非免疫ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１マウス（表７）およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３マウス（表８）からの１セットのＲＴ－ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡにおける代表的な遺伝子使用頻度を記録した（＊不完全ＲＳＳ（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＲＳＳ）；†欠けているか偽遺伝子）。
Figure 0007507823000013
Figure 0007507823000014
表７および８に示したように、機能的ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのほぼすべてが利用される。この実験のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスでは検出されなかったが記載した機能的可変遺伝子セグメントのうちの幾つかは、不完全組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を保有すると報告されており、それ故、発現することは期待されないことになる（Ｆｅｅｎｅｙ，Ａ．Ｊ．（２０００）Ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２１，１９５－２０２）。ナイーブレパートリーと免疫レパートリーの両方から単離された、様々なＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの免疫グロブリン配列の幾つかの他のセットの分析は、これらの遺伝子セグメントの使用頻度を、より低い頻度においてではあるが示した（データを示さない）。集合体遺伝子使用頻度データは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスが含有するすべての機能的ヒトＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが、様々なナイーブおよび免疫レパートリーにおいて観察されることを示した（データを示さない）。ヒトＶＨ７－８１遺伝子セグメントは、ヒト重鎖遺伝子座配列の分析で同定されている（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｆ．ら（１９９８）Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｌｏｃｕｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：２１５１－２１６２）が、全ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３マウスゲノムの再配列決定により確認したところ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスには存在しない。
抗体の重および軽鎖の配列が、特に再配列可変ドメイン内の短鎖ポリペプチドセグメントにおいて、例外的な可変性を示すことは公知である。これらの領域は、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知であり、抗体分子の構造内に抗原の結合部位を作る。介在ポリペプチド配列は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖と軽鎖の両方に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）および４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）がある。１つのＣＤＲ、ＣＤＲ３、は、このＣＤＲがＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントとＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの両方の組換えによって作られ、抗原と遭遇する前に相当量のレパートリー多様性を生じさせる点でユニークである。この接合は、エキソヌクレアーゼ活性によるヌクレオチド欠失と末端デオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）による非テンプレートコード付加（ｎｏｎ－ｔｅｍｐｌａｔｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ）の両方のため正確ではなく、それ故、組換え過程の結果として新規配列を可能とする。ＦＲは、全体としては可変領域の高い変異性のため実質的な体細胞変異を示すことができるが、しかし、可変性は、可変領域全域に均等に分布されない。ＣＤＲは、抗原結合を可能にする、抗体分子の表面に集中および局在する高可変領域である。接合部多様性を実証する、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの選択された抗体のＣＤＲ３接合部周囲の重鎖および軽鎖配列を、図７Ａおよび７Ｂにそれぞれ示す。
図７Ａに示すように、非テンプレートコードヌクレオチド付加（Ｎ－付加）が、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの抗体におけるＶＨ－ＤＨ接合とＤＨ－ＪＨ接合の両方において認められ、これは、ヒトセグメントに関するＴｄＴの正しい機能を示している。ＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメントの、該セグメントの生殖細胞系カウンターパートと比較しての終点は、エンドヌクレアーゼ活性も発生したことを示している。重鎖遺伝子座とは異なり、ヒトκ軽鎖再配列は、ＶκおよびＪκセグメントの組換えによって形成されるＣＤＲ３でのＴｄＴ付加が殆どまたは全く示さない（図７Ｂ）。これは、プレＢ細胞からＢ細胞への移行のときの軽鎖再配列中にマウスにおけるＴｄＴ発現の欠如に起因すると予想される。再配列ヒトＶκ領域のＣＤＲ３で観察される多様性は、主として、組換え事象中にエキソヌクレアーゼ活性によって導入される。
体細胞超変異。体細胞超変異と呼ばれるプロセスにより、胚中心反応中に再配列免疫グロブリン遺伝子の可変領域にさらなる多様性が加えられる。体細胞変異可変領域を発現するＢ細胞は、濾胞樹状細胞によって提示される抗原への接近について他のＢ細胞と競合する。抗原に対してより高い親和性を有するこれらのＢ細胞は、末梢へと出ていく前にさらに増殖し、クラススイッチされる。それ故、スイッチされたアイソタイプを発現するＢ細胞は、典型的に抗原に遭遇し、胚中心反応を経たものであり、ナイーブＢ細胞に比べて増加した変異数を有する。さらに、主としてナイーブｓＩｇＭ＋Ｂ細胞からの可変領域配列は、抗原選択を受けたｓＩｇＧ＋Ｂ細胞からの可変配列より相対的に少ない変異を有すると予想されよう。
免疫していないＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからのｓＩｇＭ＋もしくはｓＩｇＧ＋Ｂ細胞または免疫したマウスからのｓＩｇＧ＋Ｂ細胞からの、ランダムＶＨまたはＶκクローンからの配列を、その生殖細胞系可変遺伝子セグメントと比較し、生殖細胞系配列に対する変化に注釈を付けた。得られたヌクレオチド配列をコンピュータで翻訳し、アミノ酸変化をもたらす変異にも注釈を付けた。すべての可変領域からデータを照合し、所与の位置での変化率を算定した（図８）。
図８に示すように、免疫していないＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからのｓＩｇＧ＋Ｂ細胞に由来するヒト重鎖可変領域は、同じ脾細胞プールからのｓＩｇＭ＋Ｂ細胞に比べてより多くのヌクレオチドを示し、免疫したマウスに由来する重鎖可変領域は、さらに多くの変化を示す。変化の数は、フレームワーク領域に比べて相補性決定領域（ＣＤＲ）において増えており、これは抗原選択を示す。ヒト重鎖可変領域からの対応するアミノ酸配列も、ＩｇＭに比べてＩｇＧのほうが有意に多い変異の数、および免疫したＩｇＧほうがさらにいっそう多い数を示す。これらの変異もまた、フレームワーク配列と比較してＣＤＲ内においてのほうが頻度が高いようであり、これは、抗体がｉｎ ｖｉｖｏで抗原選択されたことを示唆している。ヌクレオチド変異数とアミノ酸変異数の同様の増加が、免疫したマウスからのＩｇＧ＋Ｂ細胞に由来するＶκ配列に見出される。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて観察された遺伝子使用頻度および体細胞超変異は、これらのマウスにおいて、存在する本質的にすべての遺伝子セグメントが、完全機能性逆キメラ抗体を形成するように再配列できることを実証している。さらに、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）抗体は、マウス免疫系内で、親和性選択および成熟に至るよう充分に関与して、その標的抗原を効果的に中和できる完全成熟ヒト抗体を作製する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、複数のクラスの抗原への頑強な免疫応答を開始することができ、その結果、高親和性でもあり治療使用に好適でもある広範なヒト抗体の利用がもたらされる（データを示さない）。
実施例５。リンパ系構造および血清アイソタイプの分析
Ｈ＆Ｅで染色した野生型またはＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスからの組織試料の脾臓、鼠蹊リンパ節、バイエル板および胸腺の全体構造を光学顕微鏡法によって調査した。野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから採集した血清中の免疫グロブリンアイソタイプのレベルを、ＬＵＭＩＮＥＸ（商標）技術を用いて分析した。
リンパ系器官構造。リンパ系組織の構造および機能は、造血細胞の正しい発生に一部依存する。Ｂ細胞発生または機能の欠陥は、リンパ系組織の構造の変化として示され得る。染色組織切片の分析により、野生型マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの間に二次リンパ系器官の外観の有意差は確認されなかった（データを示さない）。
血清免疫グロブリンレベル。各アイソタイプの発現レベルは、野生型マウスとＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスで類似している（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）。これは、可変遺伝子セグメントのヒト化が、クラススイッチまたは免疫グロブリン発現および分泌に明白な有害作用を及ぼさず、したがって、これらの機能に必要なすべての内因性マウス配列を明白に維持することを実証している。
実施例６。
ヒト化免疫グロブリンマウスにおける免疫および抗体産生
異なるバージョンのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを抗原で免疫して、外来抗原攻撃に対する体液性応答を調査した。
免疫およびハイブリドーマ開発。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスをタンパク質、ＤＮＡ、ＤＮＡとタンパク質の組み合わせ、または抗原を発現する細胞の形態の抗原で免疫することができる。典型的には、動物に３週間ごとに合計２から３回、追加免疫する。各抗原を追加免疫後、各動物から血清試料を採集し、血清力価決定により抗原特異的抗体応答について分析する。融合前に、必要に応じて５μｇのタンパク質またはＤＮＡの融合前最終追加免疫を、腹腔内注射および／または静脈内注射によってマウスに施した。脾細胞を回収し、電気融合チャンバ内で製造業者の提案プロトコル（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、メリーランド州グレンバーニー）に従ってＡｇ８．６５３骨髄腫細胞に融合させる。培養の１０日後、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を用いてハイブリドーマを抗原特異性についてスクリーニングする。あるいは、免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから抗原特異的Ｂ細胞を直接単離し、本明細書に記載のものを含む標準的な技術を用いてスクリーニングして、対象となる抗原に特異的なヒト抗体を得る。
血清力価決定。動物抗抗原血清応答をモニターするために、各追加免疫の約１０日後に血清試料を採集し、抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いてその力価を決定する。簡単に言うと、Ｎｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）９６ウエルプレートを２μｇ／ｍＬの抗原で一晩、４℃で被覆し、それをウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でブロッキングする。３倍希釈系列の血清試料を１時間、室温でプレートに結合させる。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳでそのプレートを洗浄し、総ＩｇＧ力価についてはＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウエストグローヴ）をまたはアイソタイプ特異的力価についてはビオチン標識アイソタイプ特異的ポリクローナル抗体もしくは軽鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）をそれぞれ使用して結合ＩｇＧを検出する。ビオチン標識抗体については、プレート洗浄後、ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を添加する。ＢＤ ＯＰＴＥＩＡ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などの比色基質を使用してすべてのプレートを顕色させる。１Ｍリン酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの光吸収を記録し、Ｇｒａｐｈ ＰａｄからのＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析する。バックグラウンドシグナルの２倍のシグナルを得るために必要な希釈度を力価と定義する。
１つの実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをヒトインターロイキン－６受容体（ｈＩＬ－６Ｒ）で免疫した。ｈＩＬ－６Ｒで免疫したＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスについての血清力価の代表セットを図１０Ａおよび１０Ｂに示す。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスは、同様の力価範囲でこのＩＬ－６Ｒに対する強い応答を開始した（図１０Ａ）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型コホートからの数匹のマウスは、単回抗原追加免疫後に最大応答に達した。これらの結果は、この抗原に対する免疫応答強度および動態は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスにおいて同様であったことを示す。これらの抗原特異的抗体応答をさらに分析して、血清中で見出される抗原特異的抗体の特定のアイソタイプを調査した。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）群と野生型群の両方が主としてＩｇＧ１応答を惹起した（図１０Ｂ）。これは、体液性応答中のクラススイッチが各タイプのマウスにおいて同様であることを示唆している。
溶液中の抗原への抗体結合の親和性決定。抗原に対する抗体結合親和性を決定するために、ＥＬＩＳＡベースの溶液競合アッセイが典型的に設計される。
簡単に言うと、順化培地中の抗体を、０から１０ｍｇ／ｍＬの範囲の抗原タンパク質の希釈系列とプレミックスする。次に、その抗体と抗原の混合物の溶液を２から４時間、室温で、結合平衡に達するまでインキュベートする。次に、その混合物中の遊離抗体の量を、定量的サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＰＢＳ溶液中の１μｇ／ｍＬの抗原タンパク質で一晩、４℃で９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＢ（商標）プレート（ＶＷＲ、ペンシルバニア州ウエストチェスター）を被覆し、その後、ＢＳＡでの非特異的ブロッキングを行う。次に、その抗体－抗原混合物溶液をこれらのプレートに移し、その後、１時間インキュベートする。次に、そのプレートを洗浄緩衝液で洗浄し、プレートに結合した抗体をＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）で検出し、ＢＤ ＯＰＴＥＩＡ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）などの比色基質を使用して顕色させた。１Ｍリン酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍでの光吸収を記録し、Ｇｒａｐｈ ＰａｄからのＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェアを使用してデータを分析する。溶液中の抗原の濃度に対するシグナルの依存度を４パラメータフィット分析で分析し、ＩＣ５０（溶液中に抗原が存在しない抗体試料からのシグナルの５０％低減を達成するために必要な抗原濃度）として報告する。
１つの実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをｈＩＬ－６Ｒで免疫した（上記のとおり）。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）および野生型マウスからの抗ｈＩＬ６Ｒ抗体についての親和性測定値の代表セットを示すものである。
免疫したマウスに３回目の抗原追加免疫を施した後、ＥＬＩＳＡにより血清力価を決定する。選択した野生型およびＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスコホートから脾細胞を単離し、Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成し、選択下で成長させた（上記のとおり）。産生された合計６７１の抗ＩＬ－６Ｒハイブリドーマのうち、２３６は、抗原特異的抗体を発現することが判明した。抗原陽性ウェルから回収した培地を使用して、溶液競合ＥＬＩＳＡを用いて抗原への結合の抗体親和性を決定した。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体は、溶液中の抗原への結合に関して広範な親和性を示す（図１１Ａ）。さらに、２３６の抗ＩＬ－６Ｒハイブリドーマのうちの４９は、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいてＩＬ－６の受容体への結合を遮断することが判明した（データを示さない）。さらに、これらの４９の抗ＩＬ－６Ｒ遮断抗体は、野生型マウスの並行免疫に由来する遮断抗体のものと同様の範囲の高い溶液親和性を示した（図１１Ｂ）。
実施例７。マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの構築
ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術（上記）を用いて、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子のヒト化重鎖遺伝子座への挿入のためのターゲティングベクターを構築して、Ｆｒｅｄ Ａｌｔ博士（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した細菌人工染色体（ＢＡＣ）９２９ｄ２４を改変した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するゲノム断片と、ヒト化重鎖遺伝子座のヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントの間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子（ｈＡＤＡＭ６Ψ）の標的欠失のためのハイグロマイシンカセットとを含有するように、９２９ｄ２４ ＢＡＣ ＤＮＡを工学的に作製した（図１２）。
先ず、マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子と約８００ｂｐの上流（５’）配列と約４８００ｂｐの下流（３’）配列とを含有するゲノム断片を９２９ｄ２４ ＢＡＣクローンからサブクローニングした。マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子と約３００ｂｐの上流（５’）配列と約３４００ｂｐの下流（３’）配列とを含有する第二のゲノム断片を、別途、９２９ｄ２４ ＢＡＣクローンからサブクローニングした。マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子およびＡＤＡＭ６ａ遺伝子を含有する２つのゲノム断片を、Ｆｒｔ組換え部位が隣接するハイグロマイシンカセットにライゲートして、ターゲティングベクター（マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクター、図２０；配列番号３）を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座へのライゲーションのためにマウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子に続いてそのターゲティングベクターの５’末端上およびマウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子に続いてその３’末端上に異なる制限酵素認識部位を工学的に作製した（図１２の下部）。
このマウス重鎖遺伝子座の、このヒト重鎖遺伝子座での置換を含有するＢＡＣクローンには、マウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの後続のライゲーションのために、ヒト化遺伝子座のヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントとヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントの間にあるヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子を含む別の改変を施した（図１３）。
簡単に言うと、ｌｏｘＰ組換え部位が隣接するネオマイシンカセットを、ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントの３’（ｈＡＤＡＭ６Ψに対して５’）およびヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントの５’（ｈＡＤＡＭ６Ψに対して３’；図１３の中央参照）の位置に、ヒトゲノム配列を含有するホモロジーアームを含有するように、工学的に作製した。このターゲティング構築物の挿入部位の場所は、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の約１．３ｋｂ５’側かつ約３５０ｂｐ３’側であった。このターゲティング構築物にマウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターと同じ制限酵素認識部位も含めて、ヒトＡＤＡＭ６偽遺伝子の欠失を含有する改変ＢＡＣクローンとマウスＡＤＡＭ６ターゲティングベクターの間での後続のＢＡＣライゲーションを可能にした。
両方の構築物に由来するＢＡＣ ＤＮＡの消化後、そのゲノム断片を互いにライゲートして、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂヌクレオチド配列を含む、異所に配置されたゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を含有する、工学的に作製したＢＡＣクローンを構築した。ヒト化重鎖遺伝子座内のヒトＡＤＡＭ６遺伝子の欠失と、ＥＳ細胞へのマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列の挿入のための最終のターゲティング構築物は、５’から３’へ、ヒトＶＨ１－２遺伝子セグメントの３’の約１３ｋｂのヒトゲノム配列を含有する５’ゲノム断片；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の下流の約８００ｂｐのマウスゲノム配列；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子；マウスＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の上流の約４８００ｂｐのゲノム配列；５’Ｆｒｔ部位；ハイグロマイシンカセット；３’Ｆｒｔ部位；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子の下流の約３００ｂｐのマウスゲノム配列；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子；マウスＡＤＡＭ６ａ遺伝子の上流の約３４００ｂｐのマウスゲノム配列；そしてヒトＶＨ６－１遺伝子セグメントの５’の約３０ｋｂのヒトゲノム配列を含有する３’ゲノム断片を含有した（図１３の下部）。
工学的に作製したＢＡＣクローン（上記）を使用して、ヒト化重鎖遺伝子座を含有するマウスＥＳ細胞をエレクトロポレートして、ヒト化重鎖遺伝子座内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む、異所に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ＥＳ細胞を作製した。ヒト化重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（Ｌｉｅ，Ｙ．Ｓ．およびＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ５’ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙｓ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９（１）：４３－４８）によって同定した。ヒト化重鎖遺伝子座の改変部分の外側の上流および下流領域を、該改変領域内に配置したプライマーおよびプローブを使用してＰＣＲにより確認して、ヒト化重鎖遺伝子座内の異所性マウスゲノム配列の存在およびハイグロマイシンカセットの存在を確認した。上流挿入点にわたるヌクレオチド配列には、次のものが含まれ、これは、該挿入点の上流のヒト重鎖ゲノム配列と、該挿入点に存在するマウスゲノム配列に隣接して連結されている（下のカッコ内に入っている）Ｉ－ＣｅｕＩ制限酵素認識部位とを示すものである：（ＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴ ＴＡＧＴＡＡＴＣＧＴ ＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧ ＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡ ＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧ ＣＧＡＴＧＧＡＡＧＡ ＴＧＧＧＡＧＴＡＣＧ ＧＧＧＣＧＴＴＧＧＡ ＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧ ＣＣＡＣＡＣＡＧＣＧ ＣＡＧＣＣＴＴＣＧＴ ＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣ ＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡ ＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴ ＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡ Ｇ）ＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧ ＡＴＴＣＴＣＴＧＴＴ ＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣ
ＡＧＧＧＴＣＴＧＣＣ ＴＣＣＡＣＧＡＧＡＡ ＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣ ＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧ ＡＣＴＧＴＧＴＴＣＴ ＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣ ＣＴＧＴＣＡＧＴＧＧ（配列番号４）。標的領域の３’端の下流挿入点にわたるヌクレオチド配列には、次のものが含まれ、これは、マウスゲノム配列と、該挿入点の下流のヒト重鎖ゲノム配列に隣接して連結されている（下のカッコ内に入っている）ＰＩ－ＳｃｅＩ制限酵素認識部位とを示すものである：（ＡＧＧＧＧＴＣＧＡＧ ＧＧＧＧＡＡＴＴＴＴ ＡＣＡＡＡＧＡＡＣＡ ＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧ ＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡ ＣＡＴＧＡＧＧＧＣＣ ＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣ ＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣ ＧＧＧＡＧＣＴＣＣＡ ＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣ ＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴ ＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣ ＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧ ＡＣＡＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴ）ＡＴＣＣＣＣＣＡＣＣ ＡＡＧＣＡＡＡＴＣＣ ＣＣＣＴＡＣＣＴＧＧ ＧＧＣＣＧＡＧＣＴＴ ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＧ ＧＧＡＡＡＡＴＧＡＡ ＴＣＣＣＴＧＡＧＧＴ ＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣ ＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡ ＡＴＴＣＡＡＣＴＡＧ（配列番号５）。
上に記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスの工学的作製方法（例えば、米国特許第７，６５９８，４４２号、同第７，５７６，２５９号および同第７，２９４，７５４号参照）により８細胞期マウス胚に導入した。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム配列を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスを、該ヒト化重鎖遺伝子座内のマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３）の改良法を用いる遺伝子型解析によって同定した。
マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を含有するヒト化重鎖遺伝子座を保有するマウスをＦＬＰｅデリーター（ｄｅｌｅｔｏｒ）マウス系統（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．Ｉ．ら（２０００）Ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｄｅｌｅｔｅｒ ｍｉｃｅ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ＦＬＰｅ ｉｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：１３９－１４０参照）と交配させて、例えばＥＳ細胞期でまたは胚で除去されないターゲティングベクターによって導入された一切のＦｒｔ’ｅｄハイグロマイシンカットを除去した。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットをマウス内に保持した。
子を遺伝子型解析し、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有するヒト化重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性の子を、マウスＡＤＡＭ６遺伝子発現および妊性の特徴づけのために選択した。
実施例８。ＡＤＡＭ６レスキューマウスの特徴づけ
フローサイトメトリー。ヒト重およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性（Ｈ／κ）の２５週齢の３匹のマウスと、ヒト重鎖遺伝子座の両方の対立遺伝子内にマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性マウスゲノム断片を有するヒト重およびヒトκ軽鎖についてホモ接合性（Ｈ／κ－Ａ６）の１８～２０週齢の３匹のマウスを、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でのＦＡＣｓによるリンパ球細胞集団の同定および分析のために屠殺した。リンパ球を特定の細胞系列についてゲートし、Ｂ細胞発生の様々な段階を経る発達について分析した。動物から採集した組織としては、血液、脾臓および骨髄が挙げられる。ＥＤＴＡが入っているＢＤマイクロテイナーチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を採集した。ウシ胎仔血清とピルビン酸ナトリウムとＨＥＰＥＳと２－メルカプトエタノールと非必須アミノ酸とゲンタマイシンとを補充した完全ＲＰＭＩ培地でフラッシュすることにより大腿骨から骨髄を採集した。血液、脾臓および骨髄調製物からの赤血球を塩化アンモニウム系溶解緩衝液（例えば、ＡＣＫ溶解緩衝液）で溶解し、その後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。
細胞集団を染色するために、様々な組織源からの１×１０６細胞を氷上で１０分間、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートし、その後、下記の抗体カクテルの１つまたは組み合わせで３０分間、氷上で標識した。
骨髄：抗マウスＦＩＴＣ－ＣＤ４３（１Ｂ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ－ｃｋｉｔ（２Ｂ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７－ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０－Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａ７００－ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
末梢血および脾臓：抗マウスＦＩＴＣ－κ（１８７．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ－λ（ＲＭＬ－４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７－ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－ＣＤ３（１４５－２Ｃ１１、ＢＤ）、Ａ７００－ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ）、ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０－Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。標識された抗体と共にインキュベートした後、細胞を洗浄し２％ホルムアルデヒドで固定した。データ収集をＬＳＲＩＩフローサイトメーターで行い、ＦｌｏｗＪｏで分析した。代表Ｈ／κおよびＨ／κ－Ａ６マウスからの結果を図１４～１８に示す。
結果は、Ｈ／κ－Ａ６マウスのＢ細胞が、骨髄および末梢区画においてＨ／κマウスと同様の様式でＢ細胞発生段階を経て発達すること、それらが末梢に入ると正常な成熟パターンを示すことを実証している。Ｈ／κ－Ａ６マウスは、Ｈ／κマウスと比較して増大したＣＤ４３ｉｎｔＣＤ１９＋細胞集団を明示した（図１６Ｂ）。これにより、Ｈ／κ－Ａ６マウスにおける、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性マウスゲノム断片を含有するヒト化重鎖遺伝子座からＩｇＭ発現の促進を示すことができる。末梢では、Ｈ／κ－Ａ６マウスのＢおよびＴ細胞集団は、正常であり、Ｈ／κマウスと同様であるようである。
精巣の形態および精子の特徴づけ。ヒト化免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座を有するマウスにおける不妊性が、精巣および／または精子産生の欠陥に起因するかどうかを決定するために、精巣の形態および精巣上体の精子含有量を調査した。
簡単に言うと、１群につき５匹のマウスからなる２群（群１：ヒト重鎖およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス、ｍＡＤＡＭ６－／－；群２：ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてヘテロ接合性およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス、ｍＡＤＡＭ６＋／－）から精巣をインタクトな精巣上体と共に切開し、計量した。次に、その検体を固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色剤で染色した。精巣切片（マウス１匹につき２つの精巣、合計２０）を形態の欠陥および精子産生の証拠について調査し、一方、精巣上体切片を精子の存在について調査した。
この実験では、ｍＡＤＡＭ６－／－マウスとｍＡＤＡＭ６＋／－マウスの間で精巣重量または形態の差は観察されなかった。精巣および精巣上体の両方において、すべての遺伝子型の精子が観察された。これらの結果は、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の不在が、精巣形態の検出可能な変化をもたらさないこと、ならびにマウスにおいてこれら２つの遺伝子の存在下および不在下で精子が産生されることを確証する。したがって、雄ＡＤＡＭ６－／－マウスの妊性の欠陥が低い精子産生量に起因する可能性は低い。
精子の運動能および移動。他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーを欠くマウスは、精子の運動能または移動の欠陥に起因して不妊性である。精子の移動は、子宮から卵管に進む精子の能力と定義され、通常、マウスの受精に必要である。マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの欠失がこのプロセスに影響を及ぼすかどうかを決定するために、ｍＡＤＡＭ６－／－マウスにおける精子の移動を評価した。精子の運動能もまた調べた。
簡単に言うと、（１）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてヘテロ接合性およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＡＤＡＭ６＋／－＋）；（２）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性およびヒトκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＡＤＡＭ６－／－）；（３）ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性および野生型κ軽鎖についてホモ接合性のマウス（ＡＤＡＭ６－／－ｍκ）；および（４）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）の精巣から精子を得た。検査により精子数または総合的精子運動能に重大な異常は認められなかった。すべてのマウスについて、卵丘細胞分散（ｃｕｍｕｌｕｓ ｄｉｓｐｅｒｓａｌ）が観察された。これは、各精子試料がｉｎ ｖｉｔｒｏで卵丘細胞に侵入して透明帯を結合できることを示していた。これらの結果は、ＡＤＡＭ６－／－マウスが、卵丘に侵入して透明帯を結合し得る精子を有することを確証する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス卵子の受精（ＩＶＦ）を、上記のマウスからの精子を使用して行った。ＩＶＦの翌日にＡＤＡＭ６－／－マウスについてやや少ない数の卵割胚が存在し、卵子に結合した精子の低減数も存在した。これらの結果は、ＡＤＡＭ６－／－マウスからの精子が、卵子に曝露されると、卵丘に侵入して透明帯を結合し得ることを確証する。
もう１つの実験では、子宮から卵管を通って移動するＡＤＡＭ６－／－マウスからの精子の能力を精子移動アッセイで決定した。
簡単に言うと、５匹の過排卵雌マウスの第一の群を、５匹のＡＤＡＭ６－／－雄と用意した。５匹の過排卵雌マウスの第二の群を、５匹のＡＤＡＭ６＋／－雄と用意した。これらの交配ペアを交尾について観察し、交尾の５から６時間後、分析のためにすべての雌から子宮および付属の卵管を除去し、フラッシュした。フラッシュ溶液を卵子について点検して排卵を検証し、精子数を得た。精子移動を２つの異なる方法で評価した。第一に、両方の卵管を子宮から除去し、食塩水でフラッシュし、確認された一切の精子を計数した。卵子の存在も排卵の証拠として書き留めた。第二に、卵管を子宮に付属したまま残し、両方の組織を固定し、パラフィンに包埋し、切片にして染色した（上記のとおり）。切片を子宮内の精子の存在についても、両方の卵管における精子の存在についても調査した。
５匹のＡＤＡＭ６－／－雄と交配させた５匹の雌については、卵管からのフラッシュ溶液中に精子が殆ど見つからなかった。５匹のＡＤＡＭ６＋／－雄と交配させた５匹の雌の卵管からのフラッシュ溶液は、５匹のＡＤＡＭ６－／－雄と交尾させた５匹の雌の卵管からのフラッシュ溶液中に存在するものより約２５から３０倍多い精子レベル（平均、ｎ＝１０卵管）を示した。
子宮および卵管の組織学的切片を調製した。その切片を子宮および卵管（ｃｏｌｌｉｃｕｌｕｓ ｔｕｂａｒｉｕｓ）においての精子の存在について調査した。卵管および子宮の組織学的切片の検査により、ＡＤＡＭ６－／－マウスと交配させた雌マウスについては子宮では精子を認めるが卵管では認められないことが明らかにされた。さらに、ＡＤＡＭ６－／－マウスと交配させた雌からの切片により、精子が子宮卵管境界（ＵＴＪ）で認められないことが明らかになった。ＡＤＡＭ６＋／－マウスと交配させた雌からの切片では、ＵＴＪおよび卵管において精子が同定された。
これらの結果は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いているマウスがｉｎ ｖｉｖｏ移動欠陥を示す精子を作ることを確証する。すべての場合、精子が子宮内に観察された。これは、交配および精子放出は正常に行われたようであるが、精子数または組織学的観察のいずれかによって測定すると、交配後に卵管内で精子は殆どまたは全く観察されなかったことを示していた。これらの結果は、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いているマウスが、子宮から卵管への移動不能を示す精子を産生することを確証する。精子が子宮卵管境界（ｕｔｅｒｉｎｅ－ｔｕｂｕｌｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を越えて、卵子が受精する卵管へと移動することができないため、この欠陥は不妊性をもたらすようである。纏めると、これらの結果のすべてが、マウスＡＤＡＭ６遺伝子は、正常移動能を有する精子を子宮から出て子宮卵管境界および卵管を通って移動するように方向づけ、そうして卵子に近づいて受精事象を実現するという仮説の支持に向けられる。ＡＤＡＭ６がこれを実現する機序は、上記ＡＤＡＭ６タンパク質の作用によって直接的に行われることもあり、または下に記載するような、精子細胞における他のタンパク質、例えば他のＡＤＡＭタンパク質、との協調発現により方向づけられることもある。
ＡＤＡＭ遺伝子ファミリー発現。ＡＤＡＭタンパク質の複合体が、成熟中の精子の表面に複合体として存在することは公知である。他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーを欠くマウスは、精子が成熟するにつれてこの複合体を喪失し、成熟精子において複数のＡＤＡＭタンパク質の低減を示す。ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子の欠如が、他のＡＤＡＭタンパク質に対して同様に影響を及ぼすかどうかを決定するために、精巣（未熟精子）および精巣上体（成熟中の精子）からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットを分析して、他のＡＤＡＭ遺伝子ファミリーメンバーの発現レベルを決定した。
この実験では、４匹のＡＤＡＭ６－／－マウスおよび４匹のＡＤＡＭ６＋／－マウスからのタンパク質抽出物を分析した。その結果は、ＡＤＡＭ２およびＡＤＡＭ３の発現が影響を受けないことを精巣抽出物中で示した。しかし、ＡＤＡＭ２とＡＤＡＭ３の両方が、精巣上体抽出物中では劇的に低減していた。これは、ＡＤＡＭ６－／－マウスの精液中のＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂの不在が、精子が成熟するにつれて他のＡＤＡＭタンパク質（例えば、ＡＤＡＭ２およびＡＤＡＭ３）の発現およびおそらく機能に対して直接影響を及ぼし得ることを明示する。これは、ＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂが、精子の表面にＡＤＡＭタンパク質複合体の部分として存在し、そのことが正しい精子移動にとって極めて重要であり得ることを示唆している。
実施例９。ＡＤＡＭ６レスキューマウスにおけるヒト重鎖可変遺伝子使用
ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用する定量的ＰＣＲアッセイ（上記のとおり）によりマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子を欠いている（ｍＡＤＡＭ６－／－）か、マウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ遺伝子をコードする異所性ゲノム断片を含有する（ＡＤＡＭ６＋／＋；実施例１を参照のこと）かのいずれかの、ヒト重およびκ軽鎖可変遺伝子遺伝子座についてホモ接合性のマウスについて、選択ヒト重鎖可変遺伝子使用頻度を決定した。
簡単に言うと、マウスＣＤ１９ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｍＡＤＡＭ６－／－マウスおよびＡＤＡＭ６＋／＋マウスの脾臓からのＣＤ１９＋Ｂ細胞を精製し、ＲＮＥＡＳＹ（商標）Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを精製した。ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅオンカラム処理剤（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＲＮＡを除去した。Ｆｉｒｓｔ Ｓｔａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して約２００ｎｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、ＡＢＩ ７９００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＴＡＱＭＡＮ（商標） Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した。各遺伝子の相対発現をマウスκ定常（ｍＣκ）に対して正規化した。表９は、この実験に使用したセンス／アンチセンス／ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＭＧＢプローブの組み合わせを示す。
Figure 0007507823000015
この実験では、分析した試料において４つすべてのヒトＶＨ遺伝子の発現が観察された。さらに、発現レベルは、ｍＡＤＡＭ６－／－マウスとＡＤＡＭ６＋／＋マウスの間で類似するものであった。これらの結果は、改変部位に対して遠位にあるヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ３－２３およびＶＨ１－６９）および改変部位に対して近位にあるヒトＶＨ遺伝子（ＶＨ１－２およびＶＨ６－１）の両方ともすべてが、機能的に発現するヒト重鎖を形成するように組み換えることができた。これらの結果は、ヒト重鎖ゲノム配列に挿入されたマウスＡＤＡＭ６ａおよびＡＤＡＭ６ｂ配列を含む異所性ゲノム断片が、その遺伝子座内でのヒト重鎖遺伝子セグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換えに影響を及ぼさなかったこと、およびこれらのマウスが、通常の様式でヒト重鎖遺伝子セグメントを組換えて、機能的重鎖免疫グロブリンタンパク質を産生することができることを明示している。
実施例１０。マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の欠失
マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを改変して、マウスκおよびλ軽鎖遺伝子座を不活性化するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照のこと）を用いて様々なターゲティング構築物を作製した。
マウスλ軽鎖遺伝子座の欠失。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３－１３５ｋ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＤＮＡを相同組換えによって改変して、Ｖλ－Ｊλ－Ｃλ遺伝子クラスターの標的化欠失によって内因性マウスλ軽鎖遺伝子座を不活性化した（図２０）。
簡潔には、Ｖλ１遺伝子セグメントの５’側の配列を含む５’マウス相同性アームおよびＣλ１遺伝子セグメントの３’側の配列を含む３’マウス相同性アームとともにｌｏｘＰ部位が隣接したネオマイシンカセットを含むターゲティングベクターを用いて、Ｖλ１－Ｊλ３－Ｃλ３－Ｊλ１－Ｃλ１遺伝子セグメントを含む近位のクラスター全体を単一のターゲティング事象において欠失させた（図２０，ターゲティングベクター１）。
第２のターゲティング構築物を調製して、該ターゲティング構築物がＶλ２遺伝子セグメントの５’側の配列を含む５’マウス相同性アームおよび内因性Ｃλ２遺伝子セグメントに対して５’側の配列を含む３’マウス相同性アームを含むこと以外、Ｖλ２－Ｊλ２－Ｃλ２－Ｊλ４－Ｃλ４を含む遠位の内因性マウスλ遺伝子クラスターを正確に欠失させた（図２０，ターゲティングベクター２）。したがって、その第２のターゲティング構築物は、内因性マウスλ遺伝子座にＣλ２－Ｊλ４－Ｃλ４をインタクトなままで残して、Ｖλ２－Ｊλ２を正確に欠失させた。不活性化された内因性λ遺伝子座（上に記載されたような）を含むＥＳ細胞を、当該分野で公知の核型分析およびスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））によって確かめた。次いで、その改変されたＥＳ細胞からＤＮＡを単離し、ＣＲＥリコンビナーゼによる処理に供することによって、ネオマイシンマーカー遺伝子を含む近位のターゲティングカセットの欠失が媒介され、それにより、ただ１つのｌｏｘＰ部位だけが欠失点に残った（図２０，下）。
マウスκ軽鎖遺伝子座の欠失。上に記載された方法と同様の方法を用いていくつかのターゲティング構築物を作製して、相同組換えによってマウスＢＡＣクローンＲＰ２３－３０２ｇ１２およびＲＰ２３－２５４ｍ０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＤＮＡを改変することにより、２工程プロセスでマウスκ軽鎖遺伝子座を不活性化した（図２１）。
簡潔には、ハイグロマイシン－チミジンキナーゼ（ｈｙｇ－ＴＫ）カセットに対して３’に単一のｌｏｘＰ部位を含むｈｙｇ－ＴＫカセットを含むターゲティングベクターを用いて、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座のＪκ遺伝子セグメント（１－５）を単一のターゲティング事象において欠失させた（図２１，Ｊκターゲティングベクター）。このターゲティングベクターを作製するために使用された相同性アームは、内因性マウスＪκ遺伝子セグメントの５’側および３’側のマウスゲノム配列を含んだ。第２のターゲティング事象では、最も遠位の内因性マウスＶκ遺伝子セグメントに対して上流（５’）のマウスゲノム配列の一部を欠失させるための第２のターゲティングベクターを調製した（図２１，Ｖκターゲティングベクター）。このターゲティングベクターは、逆向きのｌｏｘ５１１部位、ｌｏｘＰ部位およびネオマイシンカセットを含んだ。このターゲティングベクターを作製するために使用された相同性アームは、最も遠位のマウスＶκ遺伝子セグメントの上流のマウスゲノム配列を含んだ。それらのターゲティングベクターを、ＥＳ細胞においてＤＮＡを標的とするために逐次的な様式で（すなわち、Ｊκに次いでＶκを）使用した。二重標的化染色体（すなわち、両方のターゲティングベクターで標的化された単一の内因性マウスκ遺伝子座）を有するＥＳを、当該分野で公知の核型分析およびスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））によって確かめた。次いで、その改変されたＥＳ細胞からＤＮＡを単離し、Ｃｒｅリコンビナーゼによる処理に供することによって、２つの並置したｌｏｘ部位が互いに対して逆向きのままである一方、内因性マウスＶκ遺伝子セグメントおよび両方の選択カセットの欠失が媒介された（図２１，下；配列番号５９）。
このようにして、下に記載されるターゲティングベクターを用いて再配列していないヒトλ生殖細胞系遺伝子セグメントを正確な様式で漸進的に挿入するための、インタクトなエンハンサーおよび定常領域を含む２つの改変された内因性軽鎖遺伝子座（κおよびλ）が作製された。
実施例１１。ヒトλ軽鎖ミニ遺伝子座によるマウス軽鎖遺伝子座の置換
上に記載された方法と同様の方法を用いて内因性マウスκおよびλ軽鎖遺伝子座にヒトλ遺伝子セグメントを漸進的に挿入するための複数のターゲティングベクターを工学的に作製した。複数の独立した最初の改変を、内因性軽鎖遺伝子座に対して行ったところ、その各々が、マウス軽鎖定常遺伝子およびエンハンサーに作動可能に連結したｈＶλおよびＪλ遺伝子セグメントを含むキメラ軽鎖遺伝子座をもたらした。
１２個のヒトＶλおよび１個のヒトＪλ遺伝子セグメントを含むヒトλミニ遺伝子座。ＲＰ１１－７２９ｇ４と命名されたヒトＢＡＣクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、クラスターＡからの初めの１２個の連続したヒトＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントまたは４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含むように、一連の最初のターゲティングベクターを工学的に作製した。図２２Ａおよび図２２Ｂは、それぞれマウスλおよびκ軽鎖遺伝子座においてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの最初の挿入を行うために構築されたターゲティングベクターを示している。
最初のターゲティングベクターの第１のセットについては、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む７２９ｇ４ ＢＡＣクローンからの１２４，１２５ｂｐのＤＮＡ断片を、３’マウス相同性アームのライゲーション用にｈＪλ１遺伝子セグメントの９９６ｂｐ下流（３’）にＰＩ－ＳｃｅＩ部位を含むように工学的に作製した。２個の異なるセットの相同性アームを、このヒト断片へのライゲーションに使用した；一方のセットの相同性アームは、１３５ｋ１５ ＢＡＣクローンからの内因性マウスλ配列を含み（図２２Ａ）、もう一方のセットは、それぞれマウスＢＡＣクローンＲＰ２３－３０２ｇ１２およびＲＰ２３－２５４ｍ０４からのマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの５’側および３’側の内因性κ配列を含んだ（図２２Ｂ）。
１２／１－λターゲティングベクターの場合（図２２Ａ）、実施例１に記載された改変されたマウスλ遺伝子座のマウスＣλ２－Ｊλ４－Ｃλ４およびエンハンサー２．４を含む２７，８４７ｂｐのＤＮＡ断片の５’末端にＰＩ－ＳｃｅＩ部位を工学的に作製した。約２８ｋｂのマウス断片を、約１２４ｋｂのヒトλ断片へのライゲーションによって３’相同性アームとして使用することにより、５’から３’に向かって、ｈＪλ１遺伝子セグメント、そのｈＪλ１遺伝子セグメントの３’側の９９６ｂｐのヒトλ配列、マウスＣλ２遺伝子に対して５’側の１２２９ｂｐのマウスλ配列、マウスＣλ２遺伝子、および上記約２８ｋｂのマウス断片の残りの部分を含む３’ジャンクションが作製された。ヒトＶλ３－１２遺伝子セグメントから上流（５’）は、内因性マウスλ遺伝子座の５’側の配列に対応する２３，７９２ｂｐのマウスゲノムＤＮＡを含む５’マウス相同性アームの開始部（ｓｔａｒｔ）より前に、追加の１４５６ｂｐのヒトλ配列であった。５’相同性アームと上記ヒトλ配列の始まりとの間は、Ｆｒｔ部位が隣接したネオマイシンカセットであった。
したがって、１２／１－λターゲティングベクターは、５’から３’に向かって、内因性λ遺伝子座の５’側の約２４ｋｂのマウスλゲノム配列を含む５’相同性アーム、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂのヒトゲノムλ配列、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、ならびに内因性Ｃλ２－Ｊλ４－Ｃλ４遺伝子セグメント、マウスエンハンサー２．４配列およびそのエンハンサー２．４の下流（３’）の追加のマウスゲノム配列を含む約２８ｋｂのマウスゲノム配列を含む３’相同性アームを含んだ（図２２Ａ）。
同様の様式において、１２／１－κターゲティングベクター（図２２Ｂ）は、内因性κ遺伝子座に対するターゲティングが相同組換えによって達成され得るようにマウスκ配列を含むマウス相同性アームを使用したことを除いて、同じ約１２４ヒトλ断片を使用した。したがって、１２／１－κターゲティングベクターは、５’から３’に向かって、内因性κ遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのマウスゲノム配列を含む５’相同性アーム、Ｉ－ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む約１２４ｋｂのヒトゲノムλ配列、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、ならびに内因性マウスＣκ遺伝子、ＥκｉおよびＥκ３’およびＥκ３’の下流（３’）の追加のマウスゲノム配列を含む約２８ｋｂのマウスゲノム配列を含む３’相同性アームを含んだ（図２２Ｂ，１２／１－κターゲティングベクター）。
これらの２つの最初のターゲティングベクターのいずれかによる相同組換えによって、内因性マウス軽鎖定常遺伝子およびエンハンサー（ＣκまたはＣλ２およびＥκｉ／Ｅκ３’またはＥｎｈ２．４／Ｅｎｈ３．１）遺伝子に作動可能に連結した１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む改変されたマウス軽鎖遺伝子座（κまたはλ）が作製された（それは、組換えが生じると、キメラλ軽鎖の形成をもたらす）。
１２個のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび４個のヒトＪλ遺伝子セグメントを有するヒトλミニ遺伝子座。キメラλ軽鎖遺伝子座に多様性を付加する別のアプローチでは、クラスターＡ由来の初めの１２個の連続したヒトＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントをマウスκ軽鎖遺伝子座に挿入するために、第３の最初のターゲティングベクターを工学的に作製した（図２２Ｂ，１２／４－κターゲティングベクター）。各Ｊλ遺伝子セグメントならびに各Ｊλ遺伝子セグメントのすぐ隣りの５’領域と３’領域の両方からの約１００ｂｐのヒトゲノム配列を含む、ｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むＤＮＡセグメントをデノボＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。ＰＩ－ＳｃｅＩ部位を、この約１ｋｂのＤＮＡ断片の３’末端に工学的に作製し、クロラムフェニコールカセットにライゲートした。ヒトＢＡＣクローン７２９ｇ４のｈＪλ１遺伝子セグメントに対して５’位および３’位におけるヒトλ配列から相同性アームをＰＣＲ増幅した。この中間体ターゲティングベクターによる相同組換えを、５’Ｆｒｔ部位に対して５’側にＩ－ＣｅｕＩ部位も含むＦｒｔ部位が隣接したネオマイシンカセットでヒトＶλ３－１２遺伝子セグメントの上流（５’）に対して事前に標的化されていた（ｈａｄ ｂｅｅｎ
ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ）、改変された７２９ｇ４ ＢＡＣクローンにおいて行った。その二重標的化された７２９ｇ４ ＢＡＣクローンは、５’から３’に向かって、Ｉ－ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個のｈＶλ遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂの断片、ヒトＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含む約１ｋｂの断片、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ。この中間体ターゲティングベクターを、Ｉ－ＣｅｕＩとＰＩ－ＳｃｅＩとで一緒に消化し、続いて、改変されたマウスＢＡＣクローン（上に記載されたもの）にライゲートすることにより、第３のターゲティングベクターを作製した。
このライゲーションによって、ヒトλ配列を内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入するための第３のターゲティングベクターがもたらされ、それは、５’から３’に向かって、内因性マウスκ遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのゲノム配列を含む５’マウス相同性アーム、Ｉ－ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個のｈＶλ遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂの断片、ｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含む約１ｋｂの断片、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、ならびに内因性マウスＣκ遺伝子、ＥκｉおよびＥκ３’およびＥκ３’の下流（３’）の追加のマウスゲノム配列を含む約２８ｋｂのマウスゲノム配列を含む３’相同性アームを含んだ（図２２Ｂ，１２／４－κターゲティングベクター）。この第３のターゲティングベクターによる相同組換えによって、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結した、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それは、組換えが生じると、キメラヒトλ／マウスκ軽鎖の形成をもたらす）。
組み込まれたヒトκ軽鎖配列を有するヒトλミニ遺伝子座。同様の様式で、内因性κ軽鎖遺伝子座へのヒトλ遺伝子セグメントの最初の挿入を行うために工学的に作製されたターゲティングベクター（図２２Ｂ，１２／１－κおよび１２／４－κターゲティングベクター）と類似の２個の追加のターゲティングベクターを工学的に作製し、連続するヒトλおよびκゲノム配列を含む独特に構築されたターゲティングベクターを用いてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを漸進的に挿入した。これらのターゲティングベクターは、ヒトＶκ４－１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間に天然に位置する約２３ｋｂのヒトκゲノム配列を含むように構築された。このヒトκゲノム配列を、これらの２つの追加のターゲティングベクターにおいてヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントとの間に特異的に配置した（図２２Ｂ，１２（κ）１－κおよび１２（κ）４－κターゲティングベクター）。
上記ヒトκゲノム配列を含む両方のターゲティングベクターを、上に記載された改変されたＲＰ１１－７２９ｇ４ ＢＡＣクローンを用いて作製した（図２４）。この改変されたＢＡＣクローンを、ＮｏｔＩおよびＡｓｉＳＩ制限酵素認識部位が隣接したスペクチノマイシン選択カセットで標的化した（図２４，左上）。スペクチノマイシンカセットによる相同組換えによって、二重標的化された７２９ｇ４ ＢＡＣクローンがもたらされ、それは、５’から３’に向かって、Ｉ－ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、初めの１２個のｈＶλ遺伝子セグメントを含む約１２３ｋｂの断片、ｈＶλ３－１遺伝子セグメントの九量体配列の約２００ｂｐ下流（３’）のＮｏｔＩ部位、スペクチノマイシンカセットおよびＡｓｉＳＩ部位を含んだ。ヒトκ配列を含む別個のヒトＢＡＣクローン（ＣＴＤ－２３６６ｊ１２）を独立して２回標的化して、ｈＶκ４－１遺伝子セグメントとｈＪκ１遺伝子セグメントとの間の位置に制限酵素認識部位を工学的に作製することによって、二重標的化された改変された７２９ｇ４ ＢＡＣクローンに含まれるｈＶλ遺伝子セグメントとのライゲーション用の約２３ｋｂの断片のその後のクローニングを可能にした（図２４，右上）。
簡潔には、２３６６ｊ１２ ＢＡＣクローンは、約１３２ｋｂのサイズであり、ｈＶκ遺伝子セグメント１－６、１－５、２－４、７－３、５－２、４－１、それらのＶκ遺伝子セグメントの下流のヒトκゲノム配列、ｈＪκ遺伝子セグメント１－５、ｈＣκ、およびヒトκ遺伝子座の約２０ｋｂの追加のゲノム配列を含む。まず、このクローンを、Ｆｒｔ部位が隣接したハイグロマイシンカセットおよび３’Ｆｒｔ部位の下流（３’）にＮｏｔＩ部位を含むターゲティングベクターで標的化した。このターゲティングベクターに対する相同性アームは、そのＢＡＣクローン内のＶκ遺伝子セグメントの５’側および３’側のヒトゲノム配列を含んだ（それにより、このターゲティングベクターによる相同組換えが生じると、Ｖκ遺伝子セグメントは欠失し、ｈＶκ４－１遺伝子セグメントの約１３３ｂｐ下流にＮｏｔＩ部位が工学的に作製された）（図２４，右上）。この改変された２３６６ｊ１２ ＢＡＣクローンを、３’末端において２つのターゲティングベクターで独立して標的化し、クロラムフェニコールカセットでｈＪκ遺伝子セグメントを欠失させた（このクロラムフェニコールカセットは、ｈＪλ１遺伝子セグメント、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位およびＡｓｉＳＩ部位、または４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含むヒトλゲノム断片（上掲）、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位およびＡｓｉＳＩ部位のいずれかも含んだ）（図２４，右上）。これらの２個の類似のターゲティングベクターに対する相同性アームは、ｈＪκ遺伝子セグメントの５’側および３’側の配列を含んだ。これらの第２のターゲティングベクターおよび改変された２３６６ｊ１２ ＢＡＣクローンによる相同組換えによって二重標的化された２３６６ｊ１２クローンが得られ、それは、５’から３’に向かって、５’Ｆｒｔ部位、ハイグロマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、ＮｏｔＩ部位、Ｖκ４－１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間の遺伝子間領域を含むヒトκ遺伝子座の２２，８００ｂｐのゲノム断片、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７を含むヒトλゲノム断片のいずれか、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ（図２４，右上）。二重標的化された７２９ｇ４および２３６６ｊ１２クローンを用いた２つのライゲーション工程によって、２つの追加の改変を行うための２つの最終的なターゲティングベクターが得られた。
二重標的化された７２９ｇ４および２３６６ｊ１２クローンをＮｏｔＩおよびＡｓｉＳＩで消化したところ、それぞれ、ネオマイシンカセットおよびｈＶλ遺伝子セグメントを含む１つの断片、ならびにＶκ４－１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間の遺伝子間領域を含むヒトκ遺伝子座の約２３ｋｂのゲノム断片、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むゲノム断片のいずれか、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含む別の断片を得た。これらの断片のライゲーションによって２つの独特のＢＡＣクローンが生成され、それらは、５’から３’に向かって、ｈＶλ遺伝子セグメント、Ｖκ４－１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間のヒトκゲノム配列、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むゲノム断片のいずれか、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位ならびにクロラムフェニコールカセットを含んだ（図２４，下）。次いで、これらの新しいＢＡＣクローンをＩ－ＣｅｕＩおよびＰＩ－ＳｃｅＩで消化することにより、上流のネオマイシンカセットおよび連続するヒトλおよびκ配列を含む独特の断片が放出され、それらを、５’から３’に向かって、内因性κ遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列、Ｉ－ＣｅｕＩ部位、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、ｈＶλ遺伝子セグメント（３－１２から３－１）、Ｖλ３－１の約２００ｂｐ下流のＮｏｔＩ部位、ヒトＶκ４－１遺伝子セグメントとＪκ１遺伝子セグメントとの間に天然に見出される約２３ｋｂのヒトκ配列、ｈＪλ１遺伝子セグメントまたはｈＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７遺伝子セグメントを含むゲノム断片のいずれか、マウスＥκｉ、マウスＣκ遺伝子およびＥκ３’を含む改変されたマウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２にライゲートした（図２２，１２ｈＶλ－ＶκＪκ－ｈＪλ１および１２ｈＶλ－ＶκＪκ－４ｈＪλターゲティングベクター）。これらの両方のターゲティングベクターによる相同組換えによって、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結した、１２個のｈＶλ遺伝子セグメント、ヒトκゲノム配列および１個または４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む２つの別個の改変されたマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラヒトλ／マウスκ軽鎖の形成をもたらす）。
実施例１２。ヒトλ軽鎖ミニ遺伝子座への追加のヒトＶλ遺伝子セグメントの工学的作製
同様のターゲティングベクターおよび方法（図２３Ａ，＋１６－λターゲティングベクターおよび図２３Ｂ，＋１６－κターゲティングベクター）を用いて、追加のｈＶλ遺伝子セグメントを、実施例１１に記載された最初の各改変物に独立して付加した。
１６個の追加のヒトＶλ遺伝子セグメントの導入。１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを実施例１１に記載された改変された軽鎖遺伝子座に付加するためのターゲティングベクターを構築する際に使用された上流（５’）の相同性アームは、内因性κまたはλ軽鎖遺伝子座の５’側のマウスゲノム配列を含んだ。３’相同性アームは、すべてのターゲティングベクターに関して同じであり、実施例１１に記載されたような改変物のヒトλ配列の５’末端と重複す
るヒトゲノム配列を含んだ。
簡潔には、１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを、実施例１１に記載された改変されたマウス軽鎖遺伝子座に導入するための２つのターゲティングベクターを工学的に作製した（図２３Ａおよび図５Ｂ，＋１６－λまたは＋１６－κターゲティングベクター）。クラスターＡ由来の２１個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントを含むヒトＢＡＣクローンＲＰ１１－７６１Ｉ１３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の約１７２ｋｂのＤＮＡ断片を、内因性κまたはλ軽鎖遺伝子座に対して５’側のマウスゲノム配列を含む５’相同性アームおよびヒトゲノムλ配列を含む３’相同性アームを用いて工学的に作製した。これらのターゲティング構築物において使用された５’マウスκまたはλ相同性アームは、実施例１１に記載されたものと同じ５’相同性アームだった（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。３’相同性アームは、実施例１１に記載されたヒトゲノムλ配列の約１２３ｋｂの断片の等価な５’末端に対応するヒトゲノムλ配列の５３，０５７ｂｐの重複を含んだ。これらの２つのターゲティングベクターは、５’から３’に向かって、内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのゲノム配列または内因性λ軽鎖遺伝子座の５’側の約２４ｋｂのマウスゲノム配列を含む５’マウス相同性アーム、５’Ｆｒｔ部位、ハイグロマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、および２１個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントを含む１７１，４５７ｂｐのヒトゲノムλ配列（そのうちの約５３ｋｂは、実施例１２に記載されたヒトλ配列の５’末端と重複し、このターゲティング構築物に対する３’相同性アームとして働く）を含んだ（図２３Ａおよび図２３Ｂ，＋１６－λまたは＋１６－κターゲティングベクター）。これらのターゲティングベクターによる相同組換えによって、独立して改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座（各々が、内因性マウス定常遺伝子（ＣκまたはＣλ２）に作動可能に連結した２８個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントを含む）が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラ軽鎖の形成をもたらす）。
同様の様式において、＋１６－κターゲティングベクターを使用することによっても、組み込まれたヒトκ配列ありおよびなしで複数のｈＪλ遺伝子セグメントを組み込む実施例１１に記載されたその他の最初の改変物（図２２Ｂ）に、１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを導入した。その他の最初の改変物を含む内因性マウスκ遺伝子座におけるこのターゲティングベクターによる相同組換えによって、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列ありおよびなしで２８個のｈＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含むマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それらは、組換えが生じると、キメラλ－κ軽鎖の形成をもたらす）。
１２個の追加のヒトＶλ遺伝子セグメントの導入。同様のターゲティングベクターおよび方法を用いて、追加のｈＶλ遺伝子セグメントを、上に記載された各改変物に独立して付加した。追加のｈＶλ遺伝子セグメントを含むターゲティングベクターによる相同組換えから生じる最終的な遺伝子座の構造は、図２５Ａおよび図２５Ｂに示されている。
簡潔には、上に記載された改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座に１２個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを導入するために、ターゲティングベクターを工学的に作製した（図２３Ａおよび図２３Ｂ，＋１２－λまたは１２－κターゲティングベクター）。クラスターＢ由来の１２個の連続したｈＶλ遺伝子セグメントを含むヒトＢＡＣクローンＲＰ１１－２２Ｉ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の９３，６７４ｂｐのＤＮＡ断片を、内因性マウスκまたはλ軽鎖遺伝子座に対して５’側のマウスゲノム配列を含む５’相同性アームおよびヒトゲノムλ配列を含む３’相同性アームを用いて工学的に作製した。このターゲティング構築物において使用された５’相同性アームは、上に記載された１６個のｈＶλ遺伝子セグメントの付加に使用されたものと同じ５’相同性アームだった（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。ＢＡＣクローンＲＰ１１－７６１Ｉ１３由来のヒトλ配列の２７，４６８ｂｐのゲノム断片に含まれるヒトＶλ３－２９Ｐ遺伝子セグメントに対して約３４３１ｂｐだけ５’側にＰＩ－ＳｃｅＩ部位を工学的に作製することによって、３’相同性アームを作製した。このＰＩ－ＳｃｅＩ部位は、＋１６－λまたは＋１６－κターゲティングベクター（図２３Ａおよび図２３Ｂ）を用いて、追加のヒトλ配列の約９４ｋｂの断片と、先の改変におけるヒトλ配列の５’末端と重複するヒトλ配列の約２７ｋｂの断片とを連結するライゲーション点として働いた。これらの２つのターゲティングベクターは、５’から３’に向かって、内因性κ軽鎖遺伝子座の５’側の約２３ｋｂのマウスゲノム配列または内因性λ軽鎖遺伝子座の５’側の約２４ｋｂのマウスゲノム配列を含む５’相同性アーム、５’Ｆｒｔ部位、ネオマイシンカセット、３’Ｆｒｔ部位、ならびに１６個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびＰＩ－ＳｃｅＩ部位を含む１２１，１８８ｂｐのヒトゲノムλ配列（そのうちの約２７ｋｂは、１６個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントの挿入からのヒトλ配列の５’末端と重複し、このターゲティング構築物に対する３’相同性アームとして働く）を含んだ（図２３Ａおよび図２３Ｂ，＋１２－λまたは１２－κターゲティングベクター）。これらのターゲティングベクターによる相同組換えによって、内因性マウス定常遺伝子（ＣκまたはＣλ２）に作動可能に連結した４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびヒトＪλ１を含む改変されたマウスκおよびλ軽鎖遺伝子座が独立して作製された（それらは、組換えが生じると、キメラ軽鎖の形成をもたらす）（図２３Ａおよび図２３Ｂの下部）。
同様の様式において、＋１２－κターゲティングベクターを使用することによっても、組み込まれたヒトκ配列ありおよびなしで複数のｈＪλ遺伝子セグメントを組み込むその他の最初の改変物（図２２Ｂ）に、１２個の追加のｈＶλ遺伝子セグメントを導入した。その他の改変物を含む内因性マウスκ遺伝子座におけるこのターゲティングベクターによる相同組換えによって、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列ありおよびなしで４０個のｈＶλ遺伝子セグメントならびにｈＪλ１、２、３および７遺伝子セグメントを含むマウスκ軽鎖遺伝子座が作製された（それは、組換えが生じると、キメラλ－κ軽鎖の形成をもたらす）。
実施例１３。ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有する標的とされたＥＳ細胞の同定
上記の実施例に従って作製された標的とされたＢＡＣ ＤＮＡを使用して、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレートすることにより、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを発現するキメラマウス作製用の改変されたＥＳ細胞を作製した。再配列していないヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含むＥＳ細胞を定量的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによって同定した。特異的プライマーセットおよびプローブを、ヒトλ配列および付随する選択カセットの挿入（対立遺伝子の獲得，ＧＯＡ）、内因性マウス配列および任意の選択カセットの喪失（対立遺伝子の喪失，ＬＯＡ）、ならびに隣接するマウス配列の保持（対立遺伝子の保持，ＡＲ）についてデザインした。ヒトλ配列の追加の各挿入については、追加のプライマーセットおよびプローブを使用して、その追加のヒトλ配列の存在を確かめ、ならびに先のプライマーセットおよびプローブを使用して、先に標的とされていたヒト配列の保持を確かめた。表１０は、定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用されたプライマーおよび関連するプローブを示している。表１１は、ＥＳ細胞クローンにおいてヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの各区分（ｓｅｃｔｉｏｎ）の挿入を確かめるために使用された組み合わせを示している。
ヒトＶλ５－５２－Ｖλ１－４０遺伝子セグメントを含むターゲティング構築物の挿入によって導入されたＦｒｔで挟まれたネオマイシンカセットを除去するために、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するＥＳ細胞は必要に応じて、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。そのネオマイシンカセットは必要に応じて、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、米国特許第６，７７４，２７９号）と交配させることによって除去され得る。そのネオマイシンカセットは、必要に応じて、それらのマウスに保持される。
Figure 0007507823000016
Figure 0007507823000017
Figure 0007507823000018
実施例１４。内因性軽鎖遺伝子座からヒトλ軽鎖を発現するマウスの作製
上に記載された標的とされたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９を参照のこと）。ヒトλ遺伝子セグメントを独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０マウス）を、独特のヒトλ遺伝子セグメント（上掲）の存在を検出する対立遺伝子アッセイの変法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上掲）を用いたジェノタイピングによって同定した。
ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウスのκ：λ軽鎖使用頻度。単一のｈＪλ遺伝子セグメントとともにｈＶλ遺伝子セグメント（図２３Ｂ）の連続した３つの挿入の各々についてホモ接合のマウス、およびヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む、単一のｈＪλ遺伝子セグメントまたは４個のヒトＪλ遺伝子セグメントとともにｈＶλ遺伝子セグメント（図２２Ｂ）の第１の挿入についてホモ接合のマウスを、フローサイトメトリーを用いて脾細胞におけるκおよびλ軽鎖発現について解析した。
簡潔には、マウスの群（１群あたり３～７匹の動物の範囲）から脾臓を回収し、スライドガラスを用いて粉砕した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）を用いて赤血球（ＲＢＣ）を溶解した後、脾細胞を、マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マウスＣＤ３（１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇκ（１８７．１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウスＩｇλ（ＲＭＬ－４２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に特異的な蛍光色素結合体化抗体で染色した。ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを取得し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。表１２は、各遺伝的改変を有する動物の群由来の脾細胞において観察されたＢ細胞（ＣＤ１９＋）、κ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ－）およびλ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ－Ｉｇλ＋）発現についての平均パーセント値を示している。
同様の実験において、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメント（図２２Ｂの下部）の第１の挿入についてホモ接合のマウスならびに４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび１個のｈＪλ遺伝子セグメント（図２３Ｂの下部または図２５Ｂの上部）についてホモ接合のマウス由来の脾性コンパートメントのＢ細胞の含有量を、フローサイトメトリーを用いて（上に記載されたように）ＩｇκおよびＩｇλ発現について解析した。図２６Ａは、各群からの代表的なマウスについてのＣＤ１９＋Ｂ細胞におけるＩｇλおよびＩｇκ発現を示している。脾臓１つあたりのＣＤ１９＋Ｂ細胞の数もまた、各マウスについて記録した（図２６Ｂ）。
別の実験では、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメント（図２６Ｂの下部）についてホモ接合のマウス由来の脾臓コンパートメントおよび骨髄コンパートメントのＢ細胞の含有量を、様々な細胞表面マーカーのフローサイトメトリーを用いて、Ｂ細胞発生の経過について解析した。
簡潔には、野生型ならびにマウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウスの２つの群（各々Ｎ＝３、９～１２週齢、雄および雌）を屠殺し、脾臓および骨髄を回収した。完全ＲＰＭＩ培地（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Ｈｅｐｅｓ、２－メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびゲンタマイシンが補充されたＲＰＭＩ培地）で流すことによって大腿骨から骨髄を回収した。脾臓および骨髄の調製物由来のＲＢＣを、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で溶解した後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。１×１０６細胞を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに氷上で１０分間インキュベートした後、氷上で３０分間、選択された抗体パネルで標識した。
骨髄パネル：抗マウスＦＩＴＣ－ＣＤ４３（１Ｂ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰＥ－ｃｋｉｔ（２Ｂ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７－ＩｇＭ（ＩＩ／４１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ－Ｈ７－ＣＤ１９（ＩＤ３，ＢＤ）およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ－ＣＤ３（１７Ａ２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。
骨髄および脾臓パネル：抗マウスＦＩＴＣ－Ｉｇκ（１８７．１，ＢＤ）、ＰＥ－Ｉｇλ（ＲＭＬ－４２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７－ＩｇＭ（ＩＩ／４１，ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－ＩｇＤ（１１－２６ｃ．２ａ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ－ＣＤ３（１７Ａ２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ－Ｈ７－ＣＤ１９（ＩＤ３，ＢＤ）。
染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中で固定した。ＦＡＣＳＣＡＮＴＯＩＩ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてデータを取得し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。図２７Ａ～図２７Ｄは、各群からの代表的な１匹のマウスの脾性コンパートメントについての結果を示している。図２８Ａ～図２８Ｅは、各群からの代表的な１匹のマウスの骨髄コンパートメントについての結果を示している。表１３は、様々な遺伝的改変を有する動物の群由来の脾細胞において観察されたＢ細胞（ＣＤ１９＋）、κ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ＋Ｉｇλ－）およびλ軽鎖（ＣＤ１９＋Ｉｇκ－Ｉｇλ＋）発現についての平均パーセント値を示している。表１４は、野生型ならびにマウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウスの骨髄において観察されたＢ細胞（ＣＤ１９＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）、未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）、κ軽鎖を発現する未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋Ｉｇκ＋）およびλ軽鎖を発現する未熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋Ｉｇλ＋）についての平均パーセント値を示している。この実験は、上に記載された追加のマウス群を用いて繰り返され、同様の結果を明らかに示した（データ示さず）。
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ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウスにおけるヒトＶλ遺伝子の使用頻度。ヒトλ配列の第１の挿入（ｈＶλ３－１２－ｈＶλ３－１およびｈＪλ１，図２３Ｂ）についてヘテロ接合のマウスおよびヒトλ配列の第３の挿入（ｈＶλ５－５２－ｈＶλ３－１およびｈＪλ１，図２３Ｂ）についてホモ接合のマウスを、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によってヒトλ軽鎖遺伝子の使用頻度について解析した。
簡潔には、脾臓を回収し、滅菌された使い捨てバッグ中の、５％ＨＩ－ＦＢＳを含む１０ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）で灌流した。次いで、１個の脾臓が入った各バッグをＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（商標）（Ｓｅｗａｒｄ）に入れ、中位の設定で３０秒間ホモジナイズした。ホモジナイズされた脾臓を０．７μｍセルストレーナーで濾過し、次いで、遠心分離機でペレットにし（１０００ｒｐｍで１０分間）、ＲＢＣをＢＤ ＰＨＡＲＭ ＬＹＳＥ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３分間溶解した。脾細胞をＲＰＭＩ－１６４０で希釈し、再度遠心分離した後、１ｍＬのＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に再懸濁した。ペレットになった脾細胞から、当該分野で公知の標準的な手法を用いてＲＮＡを単離した。
ヒトｈＶλ遺伝子セグメントおよびマウスＣκ遺伝子に特異的なプライマー（表１５）を用いて、脾細胞ＲＮＡにおいてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そのベクター内の、クローニング部位が隣接する位置に配置されるプライマーＭ１３順方向（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ ＧＧＣＣＡＧ；配列番号１１３）およびＭ１３逆方向（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣ；配列番号１１４）を用いて配列決定した。ヒトλ配列の第１および第３の挿入物に由来する合計８４個のクローンの配列決定を行うことにより、ｈＶλ遺伝子の使用頻度を決定した（表１６）。選択されたＲＴ－ＰＣＲクローンについてのｈＶλ－ｈＪλ１－ｍＣκジャンクションのヌクレオチド配列を図２９に示す。
同様の様式において、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトλ軽鎖遺伝子配列（すなわち、ヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメント，図２５Ｂの下部）の第３の挿入についてホモ接合のマウスを、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いるＲＴ－ＰＣＲによってヒトλ軽鎖遺伝子の使用頻度について解析した（上に記載されたように）。２６個の選択されたＲＴ－ＰＣＲクローンについてのヒトλ軽鎖遺伝子セグメントの使用頻度を表１７に示す。選択されたＲＴ－ＰＣＲクローンについてのｈＶλ－ｈＪλ－ｍＣκジャンクションのヌクレオチド配列を図３０に示す。
同様の様式において、内因性マウスＣλ２遺伝子に作動可能に連結したヒトλ軽鎖遺伝子セグメント（１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１，図２２Ａおよび図２３Ａ）の第１の挿入についてホモ接合のマウスを、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いるＲＴ－ＰＣＲによってヒトλ軽鎖遺伝子の使用頻度について解析した（上に記載されたように）。ｈＶλ遺伝子セグメントに特異的なプライマー（表１５）を、マウスＣλ２遺伝子に特異的な２つのプライマー；Ｃλ２－１（配列番号１６２）またはＣλ２－２（配列番号１６３）のうちの１つと対にした。
ｈλ１に対して再配列した複数のｈＶλ遺伝子セグメントが、内因性マウスλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウス由来のＲＴ－ＰＣＲクローンから観察された。選択されたＲＴ－ＰＣＲクローンについてのｈＶλ－ｈＪλ－ｍＣλ２ジャンクションのヌクレオチド配列を図３１に示す。
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図２９は、単一のｈＪλ遺伝子セグメントとともにｈＶλ遺伝子セグメントの第１および第３の挿入を有するマウス由来のＲＴ－ＰＣＲクローンについてのｈＶλ－ｈＪλ１－ｍＣκジャンクションの配列を示している。図２９に示されている配列は、マウスＣκ遺伝子に対して組み換えられたｈＪλ１とともに種々のｈＶλ遺伝子セグメントを含む独特の再配列を示している。１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１を含む単一の改変された内因性κ遺伝子座を有するヘテロ接合マウスと、４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１を含む２個の改変された内因性κ遺伝子座を有するホモ接合マウスの両方ともが、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトλ遺伝子セグメントを生成することができ、ヒトλ軽鎖を発現するＢ細胞を産生することができた。これらの再配列は、それらのキメラ遺伝子座が、これらのマウスの複数の独立したＢ細胞においてヒトλ遺伝子セグメントを独立して再配列することができたことを実証する。さらに、ｈＪλ１とともに再配列すると観察された１６個の異なるｈＶλ遺伝子セグメントによって証明されるように（表１６）、内因性κ軽鎖遺伝子座に対するこれらの改変は、いずれのｈＶλ遺伝子セグメントも作動不能にせず、またＢ細胞発生中にキメラ遺伝子座が複数のｈＶλおよびｈＪλ（Ｊλ１）遺伝子セグメントの組換えを妨げなかった。さらに、これらのマウスは、内因性免疫グロブリン軽鎖レパートリーの一部としてマウスＣκ遺伝子に作動可能に連結した再配列したヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントを含む機能的な抗体を産生した。
図３０は、ヒトＶκ－Ｊκゲノム配列を含む４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントについてホモ接合のマウス由来の選択されたＲＴ－ＰＣＲクローンについてのｈＶλ－ｈＪλ－ｍＣκジャンクションの配列を示している。図３０に示されている配列は、キメラ遺伝子座全体にわたって複数の異なるｈＶλ遺伝子セグメントを含む独特の追加の再配列を示している（複数の異なるｈＪλ遺伝子セグメントは、再配列され、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結している）。４０個のｈＶλ遺伝子セグメントおよび４個のｈＪλ遺伝子セグメントを含む改変された内因性κ遺伝子座を有するホモ接合マウスもまた、マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結したヒトλ遺伝子セグメントを生成することができ、ヒトλ軽鎖を発現するＢ細胞を産生することができた。これらの再配列は、すべての段階のキメラ遺伝子座が、これらのマウスの複数の独立したＢ細胞においてヒトλ遺伝子セグメントを独立して再配列することができたことをさらに実証する。さらに、２６個の選択されたＲＴ－ＰＣＲクローン由来の４つすべてのｈＪλ遺伝子セグメントとともに再配列することが観察された１２個の異なるｈＶλ遺伝子セグメントによって証明されるように（表１７）、内因性κ軽鎖遺伝子座に対するこれらの追加の改変は、ヒトλ遺伝子セグメントの各挿入が、いずれのｈＶλ遺伝子セグメントおよび／またはＪλ遺伝子セグメントも作動不能にせず、またＢ細胞発生中にキメラ遺伝子座がｈＶλ遺伝子セグメントおよびＪλ遺伝子セグメントの組換えを妨げなかったことを実証する。さらに、これらのマウスも同様に、内因性免疫グロブリン軽鎖レパートリーの一部としてマウスＣκ領域に作動可能に連結したヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントを含む機能的な抗体を産生した。
図３１は、１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１についてホモ接合のマウス由来の３個の個別のＲＴ－ＰＣＲクローンについてのｈＶλ－ｈＪλ－ｍＣλ２ジャンクションの配列を示している。図３１に示されている配列は、第１の挿入の長さにわたって異なるｈＶλ遺伝子セグメントを含む追加の独特の再配列を示している（ｈＪλ１は、再配列され、マウスＣλ２遺伝子に作動可能に連結しれている）（２Ｄ１＝Ｖλ２－８Ｊλ１；２Ｄ９＝Ｖλ３－１０Ｊλ１；３Ｅ１５＝Ｖλ３－１Ｊλ１）。１つのクローンが、ｈＶλ－ｈＪλジャンクションにおけるＮの付加に起因して、非産生性の再配列を明らかに示した（２Ｄ１，図３１）。これは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えでは珍しいことではない。なぜなら、組換え中の遺伝子セグメントの連結は不正確であると示されているからである。このクローンは、これらのマウスの軽鎖レパートリーに存在する非産生性の組換え体を代表するが、これは、抗体遺伝子間のジャンクションの多様性に寄与する遺伝的メカニズムが、これらのマウスにおいて正常に作動しており、それにより、より高い多様性を有する軽鎖を含む抗体レパートリーがもたらされることを実証する。
１２個のｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１を含む改変された内因性λ遺伝子座を有するホモ接合マウスもまた、内因性マウスＣλ遺伝子に作動可能に連結したヒトλ遺伝子セグメントを生成することができ、マウスＣλ領域に連結したｈＶλ領域を含むリバースキメラλ軽鎖を発現するＢ細胞を産生することができた。これらの再配列はさらに、その他の軽鎖遺伝子座（すなわち、λ遺伝子座）に配置されたヒトλ軽鎖遺伝子セグメントが、これらのマウスの複数の独立したＢ細胞においてヒトλ遺伝子セグメントを独立して再配列することができたことを実証する。さらに、内因性λ軽鎖遺伝子座に対する改変は、ヒトλ遺伝子セグメントの挿入が、いずれのｈＶλ遺伝子セグメントおよび／またはｈＪλ１遺伝子セグメントも作動不能にせず、またＢ細胞発生中にキメラ遺伝子座がｈＶλ遺伝子セグメントおよびｈＪλ１遺伝子セグメントの組換えを妨げなかったことを実証する。さらに、これらのマウスもまた、内因性免疫グロブリン軽鎖レパートリーの一部としてマウスＣλ領域に作動可能に連結したヒトＶλ－Ｊλ遺伝子セグメントを含む機能的な抗体を産生した。
機能的な軽鎖は、脾臓と骨髄の両方におけるＢ細胞発生の様々なチェックポイントにおいて必要とされるので、この実施例で示されるように、内因性κおよびλ軽鎖遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有するマウスは、ヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを再配列すること、ならびにそれらをそのマウスの通常の抗体レパートリーの一部としてマウスＣκおよび／またはＣλ領域との関係において発現することができる。さらに、Ｂ細胞の初期のサブセット（例えば、プレ－、プロ－および移行Ｂ細胞）が、これらのマウスにおいて野生型同腹仔と比べて正常な表現型を明らかに示す（図２７Ｄ、２８Ａおよび２８Ｂ）。骨髄および末梢Ｂ細胞集団において軽微な欠陥が観察された（これは、自己反応性未熟Ｂ細胞のサブセットの欠失および／またはヒトλ軽鎖とマウス重鎖との最適以下の会合に起因し得る）。しかしながら、これらのマウスにおいて観察されたＩｇκ／Ｉｇλ使用頻度は、マウスにおいて観察される軽鎖発現よりもヒト軽鎖発現に似た状況を明らかに示す。
実施例１５。内因性軽鎖遺伝子座からヒトλ軽鎖を発現するマウスの交配
内因性マウス軽鎖遺伝子座におけるヒトλ遺伝子セグメントの使用頻度を最適化するために、再配列していないヒトλ遺伝子セグメントを有するマウスを、対立する（ｏｐｐｏｓｉｎｇ）内因性軽鎖遺伝子座（κまたはλ）に欠失を含む別のマウスと交配させる。例えば、内因性κ遺伝子座に配置されたヒトλ遺伝子セグメントだけが、内因性λ軽鎖遺伝子座にも欠失を有するマウスに存在する機能的な軽鎖遺伝子セグメントである。この様式では、得られる後代は、上記の実施例に記載されたようにヒトλ軽鎖だけを発現する。交配は、当該分野において認められている標準的な手法によって、およびあるいは、営利会社、例えば、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって、行われる。内因性κ遺伝子座にヒトλ軽鎖遺伝子セグメントを有し、かつ内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、独特のリバースキメラ（ヒト－マウス）λ軽鎖の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。
再配列していないヒトλ軽鎖遺伝子座を有するマウスは、ヒト重鎖可変遺伝子遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子遺伝子座の置換を含むマウス（米国特許第６，５９６，５４１号，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓを参照のこと。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）遺伝子操作マウス）とも交配される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスには、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結したヒト重鎖可変領域を含むゲノムを有するマウスが部分的に含まれる（そのマウスは、抗原刺激に応答してヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を産生する）。それらの抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、単離され得、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結され得る。次いで、そのＤＮＡは、抗体の完全ヒト重鎖を発現することができる細胞において発現され得る。好適な交配スケジュールが行われると、ヒト重鎖遺伝子座による内因性マウス重鎖遺伝子座の置換を有し、かつ内因性κ軽鎖遺伝子座に再配列していないヒトλ軽鎖遺伝子座を有するマウスが得られる。目的の抗原で免疫されると、体細胞変異したヒト重鎖可変領域およびヒトλ軽鎖可変領域を含む抗体が単離され得る。
実施例１６。ヒト重鎖およびヒトλ軽鎖を発現するマウスからの抗体の産生
再配列していないヒトλ軽鎖遺伝子座を含むマウスを他の内因性Ｉｇ遺伝子座の改変および欠失（上に記載されたような）を含む様々な所望の系統と交配させた後、選択されたマウスを目的の抗原で免疫する。
一般には、単一の再配列したヒト生殖細胞系軽鎖領域のうちの１つを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを抗原でチャレンジし、その動物の血清からリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）を回収する。そのリンパ細胞をミエローマ細胞系と融合させることにより、不死のハイブリドーマ細胞系が調製され、そのようなハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択することにより、ヒト重鎖およびヒトλ軽鎖を含む、免疫に使用した抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が同定され得る。その重鎖およびλ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、その重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプの定常領域に連結し得る。内因性マウスλ遺伝子座と比べてさらにｈＶλ遺伝子セグメントが存在するおかげで、軽鎖レパートリーの多様性は、劇的に増加し、免疫されると抗原特異的レパートリーに対してより高い多様性を付与する。得られるクローニングされた抗体配列は、続いて、ＣＨＯ細胞などの細胞において生成され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡが、抗原特異的リンパ球（例えば、Ｂ細胞）から直接単離され得る。
はじめに、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。上に記載されたように、それらの抗体を特徴付け、親和性、選択性、エピトープなどをはじめとした望ましい特徴について選択する。それらのマウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換することにより、体細胞変異したヒト重鎖、および本発明の再配列していないヒトλ軽鎖遺伝子座に由来するヒトλ軽鎖を含む完全ヒト抗体が生成される。好適なヒト定常領域としては、例えば、野生型のまたは改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。
実施例１７。ＡＤＡＭ６マウスおよびヒトλ可変マウスの交配
内因性ＡＤＡＭ６遺伝子またはそのオルソログもしくはホモログの改変を含み、さらに上記マウスにＡＤＡＭ６機能を付与する遺伝子を含む、本明細書に記載のマウスのいずれかを、ヒトまたはマウスλまたはκ定常遺伝子に作動可能に連結したヒトλ可変セグメント（例えば、ＶおよびＪセグメント）を含む改変を含むマウスと交配させる。上記ヒトλ可変セグメントを含むマウスは、改変された内因性λまたはκ遺伝子座に、または導入遺伝子上に存在する可変セグメントを有することができる。マウスを交配させ、必要な場合、その後代をさらに異種交配させ、場合に応じて、上記ＡＤＡＭ６機能を示し、且つヒトまたはマウスのλまたはκ定常領域との関係においてヒトλ配列も発現する妊性マウスについてスクリーニングする。
異所性ＡＤＡＭ６配列（またはマウスにＡＤＡＭ６機能を付与するＡＤＡＭ６のオルソログもしくはホモログの配列）をさらに含むヒト化重鎖可変遺伝子座（全てまたは実質的に全てのマウスＶ、Ｄ、およびＪセグメントを置換するヒトＶ、Ｄ、およびＪセグメント）を含むマウスを、上記マウスλ遺伝子座および／または上記マウスκ遺伝子座での、ヒトλ軽鎖ＶおよびＪセグメントによる、全てまたは実質的に全ての軽鎖ＶおよびＪセグメントの置換を含むマウスと交配させる。必要な場合、後代をさらに交配させ、重鎖定常配列と融合させたヒトＶＨおよび、λまたはκ軽鎖定常配列と融合させた同起源のヒトλＶＬを含む抗体を発現するマウスを同定する。
上記マウスを対象となる抗原に曝露させ、免疫応答を生じさせる。対象となる抗原に特異的な抗体を同定し、ヒトＶＨ配列およびヒトλ可変配列（マウスκ定常領域に連結したヒトλ可変配列を含む）を同定し、ヒト定常領域遺伝子と組み合わせて上記可変ドメイン配列を工学的に作製することによりヒト抗体を作製するために使用する。
一例において、上記内因性マウス重鎖遺伝子座での、全てまたは実質的に全てのマウス重鎖Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントの、ヒトＶ、Ｄ、おびＪセグメントによる置換を含み、λ定常配列に作動可能に連結した内因性マウスλ遺伝子座での、全てまたは実質的に全てのλ軽鎖可変配列の、１つまたは複数のヒトλ可変配列による置換を含む軽鎖対立遺伝子を含み、内因性κ遺伝子座での、全てまたは実質的に全てのκ軽鎖可変配列の、１つまたは複数のヒトλ可変配列による置換を含む軽鎖対立遺伝子を含むマウスを、交配により作製する。上記動物は、対象となる抗原に曝露され、免疫応答を開始させる。マウスλまたはマウスκ定常領域でヒトλ可変ドメインと同起源のヒト重鎖可変ドメインを含む、上記対象となる抗原と結合する抗体を同定する。上記可変ドメインをコードする核酸配列を使用し、ヒト定常領域配列と組み合わせて上記可変配列を工学的に作製することにより完全なヒト抗体を作製する。
本実施例に記載のマウスは、本明細書本文および図面に記載の上記Ｖκ－Ｊκ遺伝子間領域の１つまたは複数を含む。

Claims (19)

  1. ヒト重鎖又はヒトλ軽鎖可変領域配列を生成する方法であって、
    （ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原で免疫する工程であって、前記マウスは、
    （ｉ）生殖細胞系ゲノムを有し、前記生殖細胞系ゲノムが、
    （１）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の上流への、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの挿入と、
    （２）マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入と、
    （３）マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質とマウスＡＤＡＭ６ｂタンパク質とをコードするヌクレオチド配列の挿入であって、前記ヌクレオチド配列が、前記マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在し、前記マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質と前記マウスＡＤＡＭ６ｂタンパク質とが前記ヌクレオチド配列から発現される、前記ヌクレオチド配列の挿入と
    を含み、
    （ｉｉ）前記抗原で免疫されると抗体を産生し、前記抗体の各々が、マウス重鎖定常ドメインに作動可能に連結したヒト重鎖可変ドメインと、マウスκ軽鎖定常ドメインに作動可能に連結したヒトλ軽鎖可変ドメインとを含み、前記ヒトλ軽鎖可変ドメインが、前記マウスのゲノムまたはその体細胞超変異バリアントにおいて、再配列されたヒトλ軽鎖Ｖ／Ｊ配列から発現され、かつ
    （ｉｉｉ）妊性である、前記免疫する工程と
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ、前記遺伝的に改変されたマウスによって産生された抗体のヒト重鎖またはヒトλ軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヒト重鎖またはヒトλ軽鎖可変領域配列を同定する工程と
    を含む、方法。
  2. 抗原に特異的に結合する抗体の完全ヒト重鎖または完全ヒト軽鎖をコードするヌクレオチド配列を作製する方法であって、
    （ａ）遺伝的に改変されたマウスを抗原で免疫する工程であって、前記マウスは、
    （ｉ）生殖細胞系ゲノムを有し、前記生殖細胞系ゲノムが、
    （１）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の上流への、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの挿入と、
    （２）マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入と、
    （３）マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質とマウスＡＤＡＭ６ｂタンパク質とをコードするヌクレオチド配列の挿入であって、前記ヌクレオチド配列が、前記マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在し、前記マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質と前記マウスＡＤＡＭ６ｂタンパク質とが前記ヌクレオチド配列から発現される、前記ヌクレオチド配列の挿入と
    を含み、
    （ｉｉ）前記抗原で免疫されると抗体を産生し、前記抗体の各々が、マウス重鎖定常ドメインに作動可能に連結したヒト重鎖可変ドメインと、マウスκ軽鎖定常ドメインに作動可能に連結したヒトλ軽鎖可変ドメインとを含み、前記ヒトλ軽鎖可変ドメインが、前記マウスのゲノムまたはその体細胞超変異バリアントにおいて、再配列されたヒトλ軽鎖Ｖ／Ｊ配列から発現され、かつ
    （ｉｉｉ）妊性である、前記免疫する工程と、
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ、前記遺伝的に改変されたマウスによって産生された抗体のヒト重鎖またはヒトλ軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヒト重鎖またはヒトλ軽鎖可変領域配列を同定する工程と
    （ｃ）ヒト重鎖またはヒト軽鎖定常領域配列に、前記ヒト重鎖またはヒトλ軽鎖可変領域配列をそれぞれ作動可能に連結させ、完全ヒト重鎖または完全ヒト軽鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程と
    を含む、方法。
  3. 遺伝的に改変されたマウスを作製する方法であって、
    その生殖細胞系ゲノムにおいて、
    （ａ）マウス免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の上流への、１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの挿入と、
    （ｂ）マウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子の上流への、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つまたは複数のヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つまたは複数のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入と、
    （ｃ）マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質とマウスＡＤＡＭ６ｂタンパク質とをコードするヌクレオチド配列の挿入であって、前記ヌクレオチド配列が、前記マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座に存在し、前記マウスＡＤＡＭ６ａタンパク質と前記マウスＡＤＡＭ６ｂタンパク質とが前記ヌクレオチド配列から発現される、前記ヌクレオチド配列の挿入と
    を導入することを含む、方法。
  4. 前記マウスの前記ゲノムが、前記マウスにおいて再配列して免疫グロブリン軽鎖を形成することができない、内因性ＶＬ遺伝子セグメントおよび／または内因性ＪＬ遺伝子セグメントを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントの挿入が、少なくとも１２個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントの挿入が、少なくとも２８個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントの挿入が、少なくとも４０個のヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ヌクレオチド配列が、２つのヒトＶＨ遺伝子セグメントの間に位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ヌクレオチド配列が、ＶＨ遺伝子セグメントとＤＨ遺伝子セグメントの間に位置する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントが、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ７およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントが、少なくとも４個のヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも４個のヒトＪλ遺伝子セグメントが、少なくともＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３およびＪλ７を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. すべての内因性Ｖκ遺伝子セグメントおよび内因性Ｊκ遺伝子セグメントが、前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントで置換される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記マウスが、ヒトκ軽鎖遺伝子座に由来するヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域をさらに含み、前記ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントおよび１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントと連続している、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ヒトＶκ－Ｊκ遺伝子間領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメントとヒトＪλ遺伝子セグメントの間に配置される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、Ｖλ３－１、Ｖλ４－３、Ｖλ２－８、Ｖλ３－９、Ｖλ３－１０、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１２またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、ヒトＶλ２－１４、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１９、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－２２、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２５、Ｖλ３－２７またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントが、ヒトＶλ１－４０、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４４、Ｖλ５－４５、Ｖλ７－４６、Ｖλ１－４７、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－５２またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 少なくとも２つのλ軽鎖エンハンサーが、前記１つまたは複数のヒトＶλ遺伝子セグメントと前記１つまたは複数のヒトＪλ遺伝子セグメントの両方の下流に位置する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
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