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JP7562682B2 - キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞、その産生方法、およびその使用 - Google Patents

キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞、その産生方法、およびその使用 Download PDF

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JP7562682B2 JP2022545377A JP2022545377A JP7562682B2 JP 7562682 B2 JP7562682 B2 JP 7562682B2 JP 2022545377 A JP2022545377 A JP 2022545377A JP 2022545377 A JP2022545377 A JP 2022545377A JP 7562682 B2 JP7562682 B2 JP 7562682B2
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Description

関連出願
本出願は、２０２０年１月２７日付けで申請された米国仮出願第６２／９６６，４８７号に対する、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づく恩恵を主張するものであり、その内容は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に言及されている全ての出版物、遺伝子転写識別子、特許、特許、および特許出願は、個々の出版物、遺伝子転写識別子、特許、または特許出願が、参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式による配列リストと共に提出されている。配列リストは、2021_01_27_Seq_Listing_ST25.TXTの名称のファイルとして提供される。配列リストの電子フォーマットの情報は、その全体が参照により組み込まれる。
小胞にはいろいろな種類がある。細胞外小胞（ＥＶ）は、膜に基づく構造とすることができる。自然界において、ＥＶは、脂質、タンパク質、受容体、およびエフェクタ分子などの、異なるタイプの細胞荷物を受容細胞に運ぶ輸送手段として働くことができる。エクソソームは、多胞体と細胞膜との融合の後に細胞外環境に放出されるＥＶの一種である。エクソソームの産生は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および樹状細胞（ＤＣ）を含む細胞において示されている。しかしながら、より効率的なＥＶの生合成または局在化の必要性が依然として存在し、本発明はその必要性に対処するものである。
本明細書中では、効率的なＥＶの生合成または局在化のためのキメラ小胞局在化部分を含む非天然発生の小胞が提供される。単なる一例として、キメラ小胞局在化部分は、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含んでいてもよい。このようなキメラ小胞局在化部分は、更に、エクソソームを組織または特定の細胞型にターゲティングするための１つまたは複数の組織または細胞ターゲティング部分を含んでいてもよい。また、本発明は、キメラ小胞局在化部分を含有する融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクタ、そのようなベクタを含む遺伝子改変細胞、本発明の非天然発生の小胞を産生する方法、薬剤組成物、およびそれを含むキットを提供する。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点についての更なる理解は、本発明の原理が適用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付図面を参照することによって得られるであろう。
発現ベクタ９１、１１２、１３５、１４０、および１４１から産生されたＥＶ局在化融合タンパク質のマップである。数字は、上方の線上のマークのヌクレオチドの長さを表す。注目すべき生物学的配列の配置は、シグナル配列、エピトープ配列、親和性ペプチド、リンカ、グリコシル化部位、および小胞局在化部分（ＬＡＭＰ２についてはベクタ＃９１、ＣＬＳＴＮ１についてはベクタ＃１１２）、またはＰＴＧＦＲＮもしくはプロスタグランジンＦ２受容体インヒビタ（ベクタ＃１３５）、ＩＴＧＡ３もしくはインテグリンアルファ３（ベクタ＃１４０）、またはＩＬ３ＲＡもしくはインターロイキン３受容体サブユニットアルファ（ベクタ＃１４１）のＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むキメラ小胞局在化部分を表すのに使用される様々な矢印で示される。なお、ベクタ＃９１におけるＬＡＭＰ２のコード配列、およびベクタ＃１２１におけるＣＬＳＴＮ１のコード配列は、それぞれ天然のＬＡＭＰ２新生タンパク質および天然のＣＬＳＴＮ１新生タンパク質に存在するシグナル配列（最初の２８アミノ酸）を欠いた、それぞれの成熟タンパク質に関するものであることに留意されたい。
発現ベクタ１４２、１４３、１４４、および１４５から産生されたＥＶ局在化融合タンパク質のマップである。数字は、上方の線上のマークのヌクレオチドの長さを表す。注目すべき生物学的配列の配置は、シグナル配列、エピトープ配列、親和性ペプチド、リンカ、グリコシル化部位、およびＳＥＬＰＬＧもしくはＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ベクタ＃１４２）、ＩＴＧＢ１もしくはインテグリンベータ－１（ベクタ＃１４３）、またはＣＬＳＴＮ１もしくはカルシンテニン－１（ベクタ＃１４４）のＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むキメラ小胞局在化部分を表すのに使用される様々な矢印で示される。発現ベクタ（ベクタ＃１４５）は、ＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインを保持する一方、ＬＡＭＰ２細胞質ドメインを欠いてＥＶに局在する切断ＬＡＭＰ２小胞局在化部分に対する機能の制御として働き、ＬＡＭＰ２細胞質ドメインは、高度に正に荷電された４－アミノ酸ペプチド、ＫＫＰＲ（ベクタ＃１４５）で置換されている。
発現ベクタ９１（ＬＡＭＰ２）によってコード化され、当該発現ベクタがＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入されたときに産生されるＥＶ局在化融合タンパク質のアミノ酸配列を、注目すべき生物学的配列の位置と共に示す図である。太字の通常文字は、シグナル配列（翻訳配列の一部であって、ポリペプチドが細胞によって合成され、膜内に挿入されるのを助けるが、ＥＶに組み込まれる成熟タンパク質には存在しない）を意味する。小文字は、グリコシル化部位を意味する。下線付き文字は、エピトープ配列を意味する。枠付き文字は、リンカ配列を意味する。イタリック体の文字は、表面ドメインを意味する。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも考えられる）を意味する。強調表示された文字は、親和性ペプチドを意味する。ここで使用するシグナル配列は、ヒト細胞における最適な発現および分泌のためのシグナルペプチド配列であり、ここで使用するエピトープタグは、３ｘＦＬＡＧエピトープタグである。
発現ベクタ１１２（ＣＬＳＴＮ１）によってコード化され、当該発現ベクタがＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入されたときに産生されるＥＶ局在化融合タンパク質のアミノ酸配列を、注目すべき生物学的配列の位置と共に示す図である。太字は、シグナル配列（翻訳配列の一部であって、ポリペプチドが細胞によって合成され、膜内に挿入されるのを助けるが、ＥＶに組み込まれる成熟タンパク質には存在しない）を意味する。小文字は、グリコシル化部位を意味する。下線付き文字は、エピトープ配列を意味する。枠付き文字は、リンカ配列を意味する。イタリック体の文字は、表面ドメインを意味する。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも考えられる）を意味する。強調表示された文字は、親和性ペプチドＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号：６４）を意味する。ここで使用するシグナル配列は、ヒト細胞における最適な発現および分泌のためのシグナルペプチド配列であり、ここで使用するエピトープタグは、３ｘＦＬＡＧエピトープタグである。
発現ベクタ１３５（ＰＴＧＦＲＮのＬＡＭＰ２表面－膜膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分）およびベクタ１４０（ＩＴＧＡ３のＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含むキメラ局在化部分）によってコード化され、当該発現ベクタがＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入されたときに産生されるＥＶ局在化融合タンパク質のアミノ酸配列を、注目すべき生物学的配列の位置と共に示す図である。太字は、シグナル配列（翻訳配列の一部であって、ポリペプチドが細胞によって合成され、膜内に挿入されるのを助けるが、ＥＶに組み込まれる成熟タンパク質には存在しない）を意味する。小文字は、グリコシル化部位を意味する。下線付き文字は、エピトープ配列を意味する。枠付き文字は、リンカ配列を意味する。イタリック体の文字は、表面ドメインを意味する。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも考えられる）を意味する。強調表示された文字は、親和性ペプチドＴＨＶＳＰＮＱＧＧＬＰＳ（配列番号：６６）を意味する。ここで使用するシグナル配列は、ヒト細胞における最適な発現および分泌のためのシグナルペプチド配列であり、ここで使用するエピトープタグは、３ｘＦＬＡＧエピトープタグである。
発現ベクタ１４１（ＩＬ３ＲＡのＬＡＭＰ２表面－膜横断膜領域と細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分）およびベクタ１４２（ＳＥＬＰＬＧのＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分）によってコード化され、当該発現ベクタがＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入されたときに産生されるＥＶ局在化融合タンパク質のアミノ酸配列を、注目すべき生物学的配列の位置と共に示す図である。太字は、シグナル配列（翻訳配列の一部であって、ポリペプチドが細胞によって合成され、膜内に挿入されるのを助けるが、ＥＶに組み込まれる成熟タンパク質には存在しない）を意味する。小文字は、グリコシル化部位を意味する。下線付き文字は、エピトープ配列を意味する。枠付き文字は、リンカ配列を意味する。イタリック体の大文字は、表面ドメインを意味する。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも考えられる）を意味する。強調表示された文字は、親和性ペプチドＴＨＶＳＰＮＱＧＧＬＰＳ（配列番号：６６）を意味する。ここで使用するシグナル配列は、ヒト細胞における最適な発現および分泌のためのシグナルペプチド配列であり、ここで使用するエピトープタグは、３ｘＦＬＡＧエピトープタグである。
発現ベクタ１４３（ＩＴＧＢ１のＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分）およびベクタ１４４（ＣＬＳＴＮ１のＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分）によってコード化され、当該発現ベクタがＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入されたときに産生されるＥＶ局在化融合タンパク質のアミノ酸配列を、注目すべき生物学的配列の位置と共に示す図である。太字は、シグナル配列（翻訳された配列の一部であって、ポリペプチドが細胞によって合成され、膜内に挿入されるのを助けるが、ＥＶに組み込まれる成熟タンパク質には存在しない）を意味する。小文字は、グリコシル化部位を意味する。下線付き文字は、エピトープ配列を意味する。枠付き文字は、リンカ配列を意味する。イタリック体のテキストは表面ドメインを意味する。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも考えられる）を意味する。強調表示された文字は、親和性ペプチドＴＨＶＳＰＮＱＧＧＬＰＳ（配列番号：６６）を意味する。ここで使用するシグナル配列は、ヒト細胞における最適な発現および分泌のためのシグナルペプチド配列であり、ここで使用するエピトープタグは、３ｘＦＬＡＧエピトープタグである。
発現ベクタ１４５（表面－膜貫通ドメインを有する一方、ＬＡＭＰ２細胞質ドメインを欠いている切断ＬＡＭＰ２であって、正に荷電された４－アミノ酸ペプチド、ＫＰＲで置換されている）によってコード化され、当該発現ベクタがＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入されたときに産生されるＥＶ局在化融合タンパク質のアミノ酸配列を、注目すべき生物学的配列の位置と共に示す図である。太字は、シグナル配列（翻訳配列の一部であって、ポリペプチドが細胞によって合成され、膜内に挿入されるのを助けるが、ＥＶに組み込まれる成熟タンパク質には存在しない）を意味する。小文字は、グリコシル化部位を意味する。下線付き文字は、エピトープ配列を意味する。枠付き文字は、リンカ配列を意味する。イタリック体の文字は、表面ドメインを意味する。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも考えられる）を意味する。強調表示された文字は、ベクタ１４５における親和性ペプチドＴＨＶＳＰＮＱＧＧＬＰＳ（配列番号：６６）を意味する。ここで使用されるシグナル配列は、ベクタ１４５についてのヒト細胞における最適な発現および分泌のためのシグナルペプチド配列である。ここで使用するエピトープタグは、３ｘＦＬＡＧエピトープタグである。
発現ベクタ＃９１および＃１１２からそれぞれ産生される融合タンパク質における成熟ＬＡＭＰ２およびＣＬＳＴＮ１小胞局在化部分についてのアミノ酸配列を示す図である。イタリック体の文字は、表面ドメインを意味し、細胞外ドメインとトポロジ的に等価であり、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインと称されることもある。隣接する３つのドメイン（表面ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン）が示されている。イタリック体の文字は、表面ドメインを意味し、細胞外ドメインとトポロジ的に等価であり、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインと称されることもある。イタリック体の太字は、膜貫通ドメインを意味する。イタリック体の下線付き文字は、細胞質ドメイン（ＥＶにあるときは内腔ドメインとも称される）を意味する。
発現ベクタ＃１３５、＃１４０、および＃１４１から産生される融合タンパク質における成熟キメラ小胞局在化部分のアミノ酸配列を示す図である。キメラ小胞局在化部分は、アミノ末端におけるＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメインのアミノ酸配列（表面ドメインについては、イタリック体の文字で表示し、膜貫通ドメインについては、イタリック体の太字で表示）と、イタリック体の下線付き文字でカルボキシル末端に示された、ＰＴＧＦＲＮまたはプロスタグランジンＦ２受容体インヒビタ（ベクタ＃１３５）、ＩＴＧＡ３またはインテグリンアルファ３（ベクタ＃１４０）、ＩＬ３ＲＡまたはインターロイキン３受容体アルファ（ベクタ＃１４１）の細胞質ドメインのアミノ酸配列とを共有する。なお、これらのキメラ小胞局在化部分では、ＬＡＭＰ２の細胞質ドメインが置換されていることに留意されたい。
発現ベクタ＃１４２および＃１４３から産生される融合タンパク質における成熟キメラ小胞局在化部分のアミノ酸配列を示す図である。キメラ小胞局在化部分は、アミノ末端におけるＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメインのアミノ酸配列（表面ドメインについては、イタリック体で表示し、膜貫通ドメインについては、イタリック体の太字で表示）と、イタリック体の下線付き文字でカルボキシル末端に示された、ＳＥＬＰＬＧまたはＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ベクタ＃１４２）およびＩＴＧＢ１またはインテグリンベータ－１（ベクタ＃１４３）の細胞質ドメインのアミノ酸配列とを共有する。なお、これらのキメラ小胞局在化部分では、ＬＡＭＰ２の細胞質ドメインが置換されていることに留意されたい。
発現ベクタ＃１４４から産生された融合タンパク質における成熟キメラ小胞局在化部分および発現ベクタ＃１４５から産生された融合タンパク質における成熟切断ＬＡＭＰ２タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。ＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメインに対応するアミノ酸配列は、表面ドメインについてはイタリック体で表示され、膜貫通ドメインについてはイタリック体の太字で表示されている。ＬＡＭＰ２の細胞質ドメインは、ＣＬＳＴＮ１もしくはカルシンテニン－１（ベクタ＃１４４）の細胞質ドメイン、または高度に正に荷電されたテトラペプチド配列ＫＫＰＲ（ベクタ＃１４５）に置換され、イタリック体で下線付きの文字で表示されている。
図１３および１４は、ＥＶ上の組換えまたは融合タンパク質の平均存在量、および、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのトランスフェクションの後に、図１および図２の発現ベクタ構築物から産生される組換えまたは融合タンパク質について陽性である総ＥＶの割合（またはパーセント）、をそれぞれ示す。図１３は、示されたベクタ数でトランスフェクトされた細胞から単離されたＥＶ集団を示す。単離されたＥＶは、それぞれの組換えタンパク質または融合タンパク質のＥＶ表面ドメインにコードされているエピトープ配列に特異的なマウスモノクローナル抗体で染色された。Ｙ軸（エクソソームあたりの平均組換えタンパク質密度）は、組換えタンパク質または融合タンパク質を含むとして陽性に同定された各ＥＶに結合した抗体の相対量（平均値）を表し、抗体によって染色されなかったＥＶを除外するものであって、組換えタンパク質または融合タンパク質を含む各ＥＶに組み込まれた組換えタンパク質または融合タンパク質の存在量の間接的な尺度としての役割を果たす。模擬トランスフェクトされた細胞からのＥＶに関連するバックグラウンドシグナルは、これらの値から差し引かれている。 図１４は、検出可能な量の組換えタンパク質または融合タンパク質を示す総ＥＶ集団の割合を示している。
図１５および１６は、ベクタ＃９１構築物（ＥＶに組み込み後のシグナル配列を欠くＬＡＭＰ２小胞局在化部分を有する融合タンパク質）によって産生された融合タンパク質に対する、ＥＶ表面上の平均融合タンパク質存在量の増加倍率、および、ベクタ＃９１構築物（ＥＶに組み込み後のシグナル配列を欠くＬＡＭＰ２小胞局在化部分を有する融合タンパク質）によって産生された融合タンパク質に対する、組換えタンパク質または融合タンパク質について陽性の総ＥＶの割合（またはパーセント）の増加倍率、をそれぞれ示す。図１５は、ＥＶにおける組換えタンパク質の富化を示しており、Ａ）示されたベクタ数でトランスフェクトされた細胞から、ＥＶ集団を単離した。単離されたＥＶは、それぞれの組換えタンパク質のＥＶ表面ドメインにコードされているエピトープ配列に特異的なマウスモノクローナル抗体で染色された。Ｙ軸は、各ＥＶに結合した抗体の相対量（平均値）を表し、ベクタ＃９１と比較し、各ＥＶに組み込まれた組換えタンパク質の存在量の間接的な尺度としての役割を果たす。模擬トランスフェクトされた細胞からのＥＶに関連するバックグラウンドシグナルは、これらの値から差し引かれている。 図１６は、ＥＶにおける組換えタンパク質の富化を示しており、示されたベクタ数でトランスフェクトされた細胞から、ＥＶ集団を単離した。単離されたＥＶは、それぞれの組換えタンパク質のＥＶ表面ドメインにコードされているエピトープ配列に特異的なマウスモノクローナル抗体で染色された。Ｙ軸は、ベクタ＃９１と比較して、ＥＶ表面上に検出可能な量の組換えタンパク質を示す総ＥＶ集団の割合を表している。模擬トランスフェクトされた細胞からのＥＶに関連するバックグラウンドシグナルは、これらの値から差し引かれている。ベクタ＃９１によって産生される融合タンパク質と比較して、ベクタ＃１１２によって産生される融合タンパク質（ＣＬＳＴＮ１表面－膜貫通－細胞質ドメインを有するが、ＣＬＳＴＮ１シグナル配列を有さない、ＣＬＳＴＮ１小胞局在化部分を有する融合タンパク質）は、ＬＡＭＰ２－小胞局在化部分の約２５％という、かなり低いレベルの存在量（図１５における＃９１および＃１１２の値を比較する）に減縮する。驚くべきことに、細胞質ドメインＬＡＭＰ２をＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメインに置換すると、新たなキメラ小胞局在化部分は、その親ＬＡＭＰ２よりも融合タンパク質の存在量が約２倍（＃９１と＃１４４との比較値）、またはその親ＣＬＳＴＮ１よりも融合タンパク質の存在量が８倍以上（＃１１２と＃１４４との比較値）増加し、これは、ＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメインおよびＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメインが関与する相乗的相互作用を示すものであって、これによりＥＶ局在化の増大がもたらされる。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または同等の方法および材料は、いずれも、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの例示的な方法および材料について以下に記載する。例示的な核酸およびアミノ酸配列、および適用可能な場合には、それぞれの配列ＩＤ番号への参照が、本明細書内の表においてなされる。
ＥＶの効率的な生合成または局在化を増強するキメラ小胞局在化部分（「キメラ小胞ターゲティング部分」とも称される）を含む、修飾された細胞外小胞が提供される。また、ＥＶの効率的な生合成または局在化を増強するキメラ小胞局在化部分も提供される。キメラ小胞局在化部分を発現する組換えプラスミドを用い、本明細書に開示するキメラ小胞局在化部分をコードする核酸に基づき、細胞外小胞中で富化する特性を増強した哺乳動物細胞を遺伝的に改変することができる。キメラ小胞局在化部分は、インビトロで産生され得るか、または細胞から単離された後、ＥＶ産生細胞から細胞外小胞内に導入され得る。このようなキメラ小胞局在化部分は、更に１つまたは複数のターゲティング部分を含み得る。このようなターゲティング部分は、小胞表面に含まれるように操作することができる。本明細書において意図する小胞は、ペイロードを含むことができる。このようなペイロードは、小胞中に天然には存在しないものであることが好ましい。このようなペイロードは、対象の標的細胞または標的組織における表現型修飾を誘発するための天然または合成の生理活性分子とすることができる。いくつかの例では、ペイロードが、ある状態の治療に有用となる。いくつかの例において、ペイロードは、細胞または被験体における状態をスクリーニング、検出、および／または診断するためのレポータとなる。
本明細書で示すターゲティング部分は、目的とする細胞への適切なペイロードの選択的ターゲティングまたは集中的な送達を可能にすることができる。この選択的ターゲティングまたは集中的送達により、ターゲット外の組織および細胞型への治療薬の送達の減少および／または治療の有毒性の減少が可能となる。
細胞外小胞
細胞外小胞は、内部空間を取り囲む膜とすることができる。細胞外小胞は、リン脂質などの細胞膜と同じ物質でできた細胞由来の気泡または小胞とすることができる。細胞由来の細胞外小胞は、由来する細胞よりも小さくすることが可能であり、直径は、約２０ｎｍ～１０００ｎｍ（例えば、２０ｎｍ～１０００ｎｍ、２０ｎｍ～２００ｎｍ、９０ｎｍ～１５０ｎｍ）の範囲にある。このような小胞は、細胞膜からの外向きの出芽および分裂によって生み出され、内膜区画でアセンブルされて放出されるか、またはアポトーシスを起こした細胞もしくは小胞化細胞小器官から得られ、細胞小器官を含むことができる。それらは、エンドソーム内腔への内向き出芽により、エンドソームで産生することが可能であり、その結果、多胞体（ＭＶＢ）の管腔内小胞が得られ、多小胞体（ＭＶＢ）と細胞膜との融合時にエクソソームとして細胞外に放出される。それらは、細胞の破壊を伴う可能性のある直接的および間接的な操作によって、当該細胞から得ることができる。また、それらは、生きている生物もしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、および／または培養された細胞から得ることもできる。
細胞外小胞の例には、エクソソーム、エクトソーム、微小胞、ミクロソーム、またはその他の細胞由来膜小胞が含まれる。その他の細胞由来膜小胞には、脱落小胞、細胞膜由来小胞、および／またはエキソベシクルが含まれる。
本明細書で用いる「細胞外小胞」は、細胞によって産生されるものであり、管腔空間を囲むリン脂質膜二重層を含み得る。膜二重層には、起源の細胞に由来するタンパク質やその他の巨大分子が組み込まれている。内腔空間は、脂質、タンパク質、有機分子、ならびに核酸およびポリペプチドを含む巨大分子を封入する。
エクソソームは、細胞内のエンドソーム区画を由来とする分泌膜封止小胞とすることができる。エンドソーム区画、即ち多胞体は、細胞の細胞膜と融合し、小胞の細胞外空間にエクソソームとして放出される。更に、エクソソームは、二重層膜を含み得るものであって、内部空間内にあり、細胞外小胞の外表面に示され、および／または膜を貫通する、様々な高分子荷物を含むことができる。荷物は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、および／またはそれらの組み合わせを含むことができる。エクソソームの大きさは、約２０ｎｍから約３００ｎｍの範囲にある。更に、エクソソームは、約５０ｎｍ～約２２０ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。特定の実施形態において、エクソソームは、平均直径約１２０ｎｍ±２０ｎｍを有するのが好ましい。
いくつかの例において、エクソソームおよびその他の細胞外小胞は、インテグリンやテトラスパニンなどのタンパク質組成に基づいて特徴付けてマークすることができる。エクソソームおよびその他の細胞外小胞（ＥＶ）を特徴付けるために使用されるその他のタンパク質マーカとしては、ＴＳＧ１０１、ＡＬＧ－２相互作用タンパク質Ｘ（ＡＬＩＸ）、フロチリン１、ならびにエクソソームおよび／またはＥＶが形成される親細胞に由来する細胞接着分子が含まれる。タンパク質と同様に、脂質は、エクソソームやＥＶの主要な成分となり得るものであり、それらを特徴付けるために利用することができる。
更に、天然に存在するエクソソームは、エンドソームから生じることが可能であり、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０）、膜輸送および融合タンパク質（ＧＴＰ加水分解酵素、アネキシン、およびフロチリン）、テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ８２）などのタンパク質、ならびにＣＤ４７などのタンパク質を含有することができる。これらのタンパク質の中で、熱ショックタンパク質、アネキシン、およびＲａｂファミリーのタンパク質は、エクソソーム中に豊富に検出することができ、それらの細胞内集合および輸送に関与することができる。膜貫通タンパク質のファミリーであるテトラスパニンも、エクソソーム中に検出することができる。細胞内において、テトラスパニンは、融合、細胞移動、細胞間接着、およびシグナル伝達を媒介することができる。そのほかでエクソソームに見出される豊富なタンパク質には、インテグリンがあり、このインテグリンは、細胞外マトリックスへの細胞結合を促進する接着分子となり得る。インテグリンは、小胞を、それらの標的細胞に接着させるのに関与させることができる。ＣＤ５５およびＣＤ５９など、エクソソームの表面に見い出すことが可能なある種のタンパク質は、免疫細胞を循環させることによって、溶解からエクソソームを守ることができる一方、エクソソーム上のＣＤ４７は、免疫細胞によるエクソソームの取り込みを阻止する抗貪食シグナルとして機能することができる。エクソソームと結びつき得るその他のタンパク質としては、トロンボスポンジン、ラクトアドヘリン、ＡＬＩＸ（ＰＤＣＤ６ＩＰとしても知られる）、ＴＳＧ１０１２、およびＳＤＣＢ１が含まれる。エクソソームおよびその他の細胞外小胞の表面に天然に生じ得る膜タンパク質のクラスには、ＩＣＡＭ、ＭＨＣクラスＩ、ＬＡＭＰ２、ラクトアドヘリン（Ｃ１Ｃ２ドメイン）、テトラスパニン（ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３、およびＣＤ３７）、Ｔｓｇ１０１、Ｒａｂタンパク質、インテグリン、Ａｌｉｘ、ならびにグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）修飾タンパク質およびフロチリンなどの脂質ラフト関連タンパク質が含まれる。
エクソソームは、タンパク質の他に、脂質にも富むものとすることが可能であり、様々な種類の脂質を含む様々なエクソソームがある。エクソソームの脂質二重層は、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ３）、およびホスファチジルイノシトールなどの脂質の細胞膜型で構成することができる。エクソソーム中に見出すことができるその他の種類の脂質は、飽和脂肪酸鎖のほかに、コレステロール、セラミド、ホスホグリセリドである。エクソソームの追加の任意成分には、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、および非コードＲＮＡなどの核酸を含めることができる。エクソソームは、糖（例えば、単糖、多糖、またはグリカン）、またはその他の分子も含有することができる。
細胞外小胞は、断面直径などが、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００ｎｍ、および／または最大で約１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、または５０ｎｍの最長寸法を有することができる。いくつかの例において、小胞の最長寸法は、約１０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約１０ｎｍ～約２００ｎｍ、約２０ｎｍ～約２００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約４０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約３０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約１０ｎｍ～約３００ｎｍ、約２０ｎｍ～約３００ｎｍ、約３０ｎｍ～約３００ｎｍ、約４０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５００ｎｍ～約２０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約５００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約４０ｎｍ～約５００ｎｍなどの範囲とすることができる。複数の小胞に言及する場合、このような範囲は、天然に存在する小胞および混合物中の修飾された小胞を含む、全ての小胞の平均を表すものとすることができる。
本明細書中で使用する場合、「平均」という用語は、一群の測定についての平均、並数、または中間値を意味するものであってもよい。
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、例えば、直径、サイズ、温度、時間、量、および濃度など、範囲を含め、数値的指定の前に使用する場合に、(＋)または(－)の方向に１０％、５％、または１％だけ変化する可能性のある近似を示す。
本明細書中で使用する場合、単数形の「a」、「および」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の言及を含む。従って、例えば、「細胞」への言及には、複数のそのような細胞が含まれ、「培養物」への言及には、当業者等に公知の１つまたは複数の培養物およびその均等物への言及が含まれる。
いかなる理論にも拘束されることなく、「小胞局在化部分」（小胞ターゲティング部分とも称される）は、細胞外小胞に局在する巨大分子であり得る。一実施形態において、小胞局在化部分はポリペプチドである。一実施形態において、小胞局在化部分はタンパク質である。一実施形態において、タンパク質は単一のポリペプチド鎖である。一実施形態において、小胞局在化部分は、細胞外小胞に局在化するタンパク質である。一実施形態において、小胞局在化部分は膜タンパク質である。好ましい実施態様において、小胞局在化部分は、表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む膜貫通タンパク質である。細胞外小胞におけるこのような膜貫通タンパク質の局在化により、小胞の外表面にある表面ドメイン、小胞の脂質二重層を有する膜貫通ドメイン、および小胞の内腔にある細胞質ドメインが生じる。トポロジ的等価性により、表面ドメインは、エクソソームの表面上の表面ドメインが、細胞の表面上の細胞膜結合膜貫通タンパク質と同じトポロジ状態を共有するので、細胞外ドメインと称されることもあり、同様に、細胞質ドメインは、細胞質ドメインが最初に存在する細胞質ドメインの一部が、エンドソーム膜の内側への出芽によって生じた小胞の内腔に取り込まれ、ＥＶ産生細胞の細胞膜とのＭＶＢの融合時に、小胞がエクソソームとして分泌される前に、多小胞体（ＭＶＢ）の複数の管腔内小胞を最終的に産生するので、細胞質ドメインと称されることがある。
一実施形態において、小胞局在化部分は、単一パス膜貫通タンパク質であってもよい。単なる一例として、単一パス膜貫通タンパク質は、アミノ末端表面ドメインと、膜貫通ドメインによって結合されたカルボキシル末端細胞質ドメイン（内腔ドメイン）とを含み得る。例えば、新生または新規合成の単一パス膜貫通タンパク質は、更に、表面ドメインに先行するシグナルペプチドを含んでいてもよく、これは、真核生物における小胞体または原核生物における細胞膜などの膜への新生タンパク質のトランスロケーションに際して、シグナルペプチダーゼによって切断される。別の実施形態において、新生または新規合成の膜貫通タンパク質は、新生または新規合成の膜貫通タンパク質のシグナルペプチドを欠く成熟膜貫通タンパク質にプロセシングされ得る。
一例において、単一パス膜貫通タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質である。一実施形態において、単一パスＩ型膜貫通タンパク質は、アミノ末端表面ドメインと、膜貫通ドメインによって結合されたカルボキシル末端細胞質ドメイン（内腔ドメイン）とを含む。別の実施形態において、新生または新規合成の単一パスＩ型膜貫通タンパク質は、更に、表面ドメインに先行するシグナルペプチドを含み、これは、真核生物における小胞体または原核生物における細胞膜などの膜への新生タンパク質のトランスロケーションに際して、シグナルペプチダーゼによって切断される。更に別の実施形態において、新生または新規合成の単一パスＩ型膜貫通タンパク質は、新生または新規合成の単一パスＩ型膜貫通タンパク質のシグナルペプチドを欠く成熟単一パスＩ型膜貫通タンパク質にプロセシングされる。好ましい実施態様において、新生または新規合成の単一パスＩ型膜貫通タンパク質は、新生または新規合成の単一パスＩ型膜貫通タンパク質のシグナルペプチドを欠く成熟単一パスＩ型膜貫通タンパク質にプロセシングされ得る。
小胞局在化部分は、表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを有し得る。このようなタンパク質ドメインは、当業者に公知であり、本明細書に記載するタンパク質については、図面において、およびUniProtKB（UniProt Release 2019_11(11-Dec-2019); The UniProt Consortium (2019) UniProt: a worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acid Res. 47:D506-515）、およびGenome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13（GRC38.p13; GenBank assembly accession GCA_000001405.28 and RefSeq assembly accession GCF_000001405.39）など、本明細書において参照する公的に利用可能なデータベースからの受託番号に関連する注釈において、十分に解説がなされて定義されている。
本発明の一実施態様において、小胞局在化部分は、真核細胞、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトにおいて産生される。別の実施形態において、小胞局在化部分は、小胞局在化部分とターゲティング部分とを含む融合タンパク質において共有結合で、または小胞局在化部分を含むポリペプチドとターゲティング部分を含む第２のポリペプチドとの間に共有される１対の相互作用ドメインもしくは表面を介して非共有結合で、ターゲティング部分に結合され得る。
「キメラ小胞局在化部分」は、キメラ小胞局在化部分を産生するように、ある小胞局在化ドメインを別の小胞局在化ドメインと置換することによって産生され得る小胞局在化部分である。キメラ小胞局在化部分は、１つの小胞局在化部分の１つまたは複数の機能性ドメインを、別の異なる小胞局在化部分の１つまたは複数の機能性ドメインとを組み合わせることによって得ることができる。この組み合せは、少なくとも２つの小胞局在化部分の部分を含むことにより、ＥＶ表面上の平均組換えタンパク質密度および／または組換えタンパク質について陽性の総ＥＶの割合（またはパーセント）により定量化されるように、親小胞局在化部分のいずれよりもＥＶとの結びつきにおいて優れているキメラ小胞局在化部分を得る。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、膜貫通タンパク質、またはそれが由来する２つの親膜貫通タンパク質の表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔または細胞質ドメインを含む。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、上述の小胞局在化部分について記載したものと同じ表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および内腔または細胞質ドメインの配置を有する。単なる一例として、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分は、相乗的に相互作用して、細胞外小胞における蓄積を増加させることができる。これはＥＶの局在化を改善するだけでなく、ＥＶの組成を変化させ得るものである。
キメラ小胞局在化部分は、単一パス膜貫通タンパク質とすることができる。キメラ小胞局在化部分は、キメラＩ型膜貫通タンパク質ではあるが、Ｉ型膜貫通タンパク質とすることができる。キメラ小胞局在化部分は、キメラ単一パスＩ型膜貫通タンパク質ではあるが、単一パスＩ型膜貫通タンパク質とすることができる。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、膜貫通ドメインによって結合されたアミノ末端表面ドメインおよびカルボキシル末端細胞質ドメイン（内腔ドメイン）を含む。一実施形態において、新生または新規合成のキメラ小胞局在化部分は、更に、表面ドメインに先行するシグナルペプチドを含み、これは、真核生物における小胞体または原核生物における細胞膜などの膜への新生タンパク質のトランスロケーションに際し、シグナルペプチダーゼによって切断される。一実施形態において、新生または新規合成のキメラ小胞局在化部分は、新生または新規合成の膜貫通タンパク質のシグナルペプチドを欠く成熟形態にプロセシングされる。一実施形態において、新生または新規合成のキメラ小胞局在化部分は、新生または新規合成の膜貫通タンパク質のシグナルペプチドを欠く成熟形態にプロセシングされる。一実施形態において、細胞外小胞は、新生または新規合成のキメラ小胞局在化部分のシグナルペプチドを欠く成熟形態にプロセシングされたキメラ小胞局在化部分である膜貫通タンパク質を含む。一実施形態において、シグナルペプチドまたは成熟形態を欠くキメラ小胞局在化部分は、図１０～図１２または表５に示すようなキメラ小胞局在化部分のいずれかであってもよく、ベクタ＃１３５、＃１４０、＃１４１、＃１４２、＃１４３、および＃１４４におけるキメラ小胞局在化部分に相当する。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分について表５に示す核酸配列を用い、キメラ小胞局在化部分を含むポリペプチドを産生することができる。更に、ターゲティング部分およびキメラ小胞局在化部分を含むポリペプチドをコードするために、目的とするターゲティング部分のコード配列を含む核酸を、表５に示すようにキメラ小胞局在化部分のコード配列とインフレームで融合することができる。ターゲティング部分としての親和性ペプチドおよびキメラ小胞局在化部分を含むポリペプチドをコードするこのような核酸の例は、ベクタ＃１３５、＃１４０、＃１４１、＃１４２、＃１４３、および＃１４４について表３に見ることができ、また当該ポリペプチドのアミノ酸配列については、表３および図５～図８に見ることができる。
好ましい実施態様では、１つの小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、別の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを有したキメラ小胞局在化部分が得られるように、一方の小胞局在化部分の細胞質ドメインを用いて、他方の小胞局在化部分の細胞質ドメインと置き換える。ＡＢｃ、ＡｂＣ、Ａｂｃ、ａＢＣ、ａＢｃ、およびａｂＣの配置を有するキメラ小胞局在化部分を含む、異なる小胞局在化部分間の他のタイプのドメインスワッピングが考えられ、このとき、Ａ、Ｂ、およびＣは、それぞれ、第１の小胞局在化部分の表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに対応し、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、第２の小胞局在化部分の表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに対応する。同様に、表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを有する任意のキメラ小胞局在化部分について、３個または４個程度の異なる小胞局在化部分からのドメインを組み合わせることによって得られる、想定されるキメラ小胞局在化部分の可能な数は、それぞれ約２４および６０である。
所望のキメラ小胞局在化部分は、ＥＶへの優れた局在化を有するものであるが（キメラ小胞局在化部分に寄与する親小胞局在化部分に比して）、これらのキメラ小胞局在化部分のいくつかは、ＥＶと結びつく能力、またはＥＶの一部として組み込まれる能力以外の望ましい性質を有し得ることも考えられる。好ましい実施態様において、キメラ小胞局在化部分は、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含み、これは、第１の小胞局在化部分の完全長表面－膜貫通ドメイン、および第２の小胞局在化部分の完全長細胞質ドメインである。好ましい実施態様において、表面ドメインおよび膜貫通ドメインは、第１の小胞局在化部分に由来して連続的であり、第２の小胞局在化部分に由来する細胞質ドメインである。
別の実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、第１の小胞局在化部分の表面ドメインまたはその一部、および膜貫通ドメインまたはその一部と、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインまたはその一部とを含む。別の実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、表面ドメインまたはその一部、膜貫通ドメインまたはその一部、および細胞質ドメインまたはその一部を含み、このとき、各ドメインは、２つ以上の小胞局在化部分から選択される。
一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、更に、シグナルペプチドを含む。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分の新生または新規合成ポリペプチドは、Ｎ末端にシグナルペプチド配列を含む。一実施形態において、新生または新規合成ポリペプチドは、キメラ小胞局在化部分をコードするｍＲＮＡのリボソーム翻訳によって産生されている、または最初に産生されるポリペプチドである。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分の新生または新規合成ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端までを、シグナルペプチド、表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの順に含む。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分の新生または新規合成ポリペプチドは、更に、リンカ、親和性ペプチド、エピトープタグ、および／またはグリコシル化部位のいずれか１つまたは複数を含んでいてもよい。一実施形態において、シグナルペプチド配列は、天然に存在する配列または操作された（天然に存在しない）配列であってもよい。一実施形態において、操作されたシグナルペプチド配列は、ヒト細胞における強いタンパク質分泌および発現を指令する人工シグナルペプチド配列であってもよい。一実施形態において、操作されたシグナルペプチドは、ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡであってもよい。
適切な親和性ペプチドの例としては、表３に示すような、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）のターゲティング部分またはペプチドであるＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号：６４）、およびグリピカン－３（ＧＰＣ３）のターゲティング部分またはペプチドであるＴＨＶＳＰＮＱＧＧＬＰＳ（配列番号：６６）が含まれるが、これらに限定されない。適切なリンカの例としては、(Ｇｌｙ)８、(ＧＳ)６、(ＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＥＡＡＡＫ)ｎ （ｎ＝１～３）、Ａ(ＥＡＡＡＫ)４ＡＬＥＡ(ＥＡＡＡＫ)４Ａ、(ＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～４）、(Ａｌａ－Ｐｒｏ)ｎ (１０－３４ ａａ)、ならびにＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＦＧ、およびＬＥなどの切断可能なリンカのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。適切なエピトープタグの例としては、単一または３ｘＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｓ－タグ、ＨＡタグ、６ｘＨｉｓタグ、またはこれらの組み合わせといったＦＬＡＧタグが含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、シグナルペプチドを欠いている。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、成熟した、またはプロセシングされたポリペプチドである。一実施形態において、成熟した、またはプロセシングされたポリペプチドは、新生ポリペプチドのシグナルペプチド配列を欠いている。一実施形態において、成熟した、またはプロセシングされたポリペプチドは、グリコシル化部位を含む。一実施形態において、成熟した、またはプロセシングされたポリペプチドは、糖タンパク質である。一実施形態において、糖タンパク質は、グリカンを含む。一実施形態において、糖タンパク質は、Ｎ－結合型グリカン、Ｏ－結合型グリカン、ホスホグリカン、Ｃ－結合型グリカン、および／またはＧＰＩアンカを含む。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、ＥＶと結びついて、またはＥＶに組み込まれて見出される、成熟した、またはプロセシングされた小胞局在化ポリペプチドであり、成熟またはプロセシングの前に新生ポリペプチド中に存在するシグナルペプチド配列を欠いている。
「表面ドメイン」は、ＥＶ外の環境に曝露されるタンパク質またはポリペプチド一次配列のサブセットである。表面ドメインは、２つの膜貫通ドメインの間のループであってもよいし、タンパク質の末端（アミノあるいはカルボキシ）の１つを含むこともできる。膜二重層に対するタンパク質ドメインのトポロジは、タンパク質のどの部分が外部プロテアーゼによって消化されるかを評価することによって経験的に決定することができる。更に最近では、タンパク質の膜近傍領域の塩基性残基や酸性残基などの特徴的なアミノ酸パターンを用い、可能性のあるトポロジ（細胞外対細胞質ゾル）を、内在性膜タンパク質にアルゴリズム的に割り当てることが行われている。ＥＶは、細胞全体の細胞膜と同じ膜トポロジ配向（膜の外葉が細胞とＥＶとの間で同じ）を有するので、これらのアルゴリズムは、ＥＶ常在タンパク質にも適用することができる。このため、ＥＶ局在化膜貫通タンパク質の表面ドメインは、ＥＶと細胞膜とが同じ膜トポロジであることから、細胞外ドメインと称されることがある。例えば、「表面ドメイン」は、約１０～１５個のアミノ酸の短いペプチドであってもよい。一実施形態において、「表面ドメイン」は、非構造化ポリペプチドであってもよい。別の実施形態において、「表面ドメイン」は、内在性膜タンパク質の全表面ドメインである。更に別の実施形態において、「表面ドメイン」は、内在性膜タンパク質の表面ドメインの一部または部分である。一実施形態において、表面ドメインは、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対するアミノ末端である。一実施形態において、表面ドメインは、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分のＮ末端にあり、エクソソームなどの細胞外小胞の外部表面にある。
「膜貫通ドメイン」は、約１８～４０個の脂肪族、無極性および疎水性アミノ酸のスパンであってもよく、これらは、アルファヘリックス二次構造に集まり、膜二重層の一方の面から他方の面にまたがっている。このことは、ヘリックスのＮ－末端が、一方の膜小葉のリン脂質ヘッドグループまで少なくとも延在し、多くの場合は、これを超えて延在する一方、Ｃ－末端が、他方の小葉のリン脂質ヘッドグループまで延在していることを意味する。一実施形態において、膜貫通ドメインは、アミノ末端表面ドメインをカルボキシル末端細胞質ドメインと結合する。
「細胞質ドメイン」は、ＥＶ内または細胞内環境に曝露されるタンパク質またはポリペプチド一次配列のサブセットである。細胞質ドメインは、２つの膜貫通ドメインの間のループであってもよいし、タンパク質の末端（アミノあるいはカルボキシ）の一方を含むことができる。そのトポロジは、膜貫通ドメインや表面ドメインのものとは異なる。一実施形態において、細胞質ドメインは、細胞の細胞質側にある。別の実施形態において、細胞質ドメインは、小胞の内腔にある。一実施形態において、細胞質ドメインは、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分のＣ末端にある。
単なる一例として、本明細書に開示するタンパク質についての「表面ドメイン」、「膜貫通ドメイン」、および「細胞質ドメイン」に相当する配列は、本明細書において提供するタンパク質受託番号の記載中に見出すことができる。特に有用な例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ（UniProt Release 2019_11(11-Dec-2019)）内に目録化されたタンパク質であり、各受託番号アミノ酸配列のもとに、特徴および機能ドメインと共に提供される。例えば、本明細書中で提示する膜貫通小胞局在化部分の各々に関連するトポロジドメインは、「表面ドメイン」についての「細胞外」、「膜貫通ドメイン」についての「ヘリカル」、および「細胞質ドメイン」についての「細胞質」の記述を伴うＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号で見出すことができる。また、「シグナルペプチド」に対応するアミノ酸配列も、成熟膜貫通タンパク質からプロセシングされているものとして示される。更に、表面（細胞外）、膜貫通および細胞質（内腔または細胞質）ドメインを同定するために、公的に利用可能な他の多くのデータベースを使用することも可能であり、それらのデータベースは、Membranome：単一らせん膜貫通タンパク質の膜プロテオーム（membranome.org; Lomize, A. L. et al. (2017)、Membranome：単一パス膜貫通タンパク質のプロテオームワイド解析のためのデータベース、Nucleic Acids Res. 45:D250-D255 and Lomize, A. L. et al. (2018)、Membranome 2.0：バイトピックタンパク質およびその二量体のプロテオームワイドプロファイリングのためのデータベース、Bioinformatics 34:1061-1062、およびPDBTM：膜貫通タンパク質のタンパク質データバンク（pdbtm.enzim.hu; PDBTM version 2021-01-08) (Kozma, D. et al. (2013) Nucleic Acids Res.41:D524-D529)などである。これらの公表されているデータベース以外で、膜貫通タンパク質の分類、および表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの同定については、Goder, V. and Spiess, M. (2001) 膜タンパク質の形態形成：決定子及びダイナミクス FEBS Lett. 504:87-93、Tusnady, G. et al. (2004) タンパク質データバンクの膜貫通タンパク質：同定と分類 Bioinformatics 20:2964-2972、Chou、K.-C. and Shen, H.-B.(2007) MemType-2L、Pse-PSSMを介して進化情報を取り入れることにより膜タンパク質とその種類を予測するウェブサーバ Biochem. Biophys. Res. Comm. 360:339-345、Casadio R., Martelli P.L., Bartoli L., Fariselli P. (2010) 膜タンパク質のトポロジー予測：遠縁の相同体がどのように作用するか In：膜タンパク質の構造バイオインフォマティクス Springer, Viennaにおいて考察されている。
好ましい実施態様において、「キメラ小胞局在化部分」は、１つの小胞局在化部分の「表面－膜貫通ドメイン」と、２つ目の小胞局在化部分の「細胞質ドメイン」とを含み、このとき、２つの小胞局在化部分は、異なっており、別個のタンパク質であり、アイソフォームではない。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、１つの小胞局在化部分の「表面－膜貫通ドメイン」と、２つ目の小胞局在化部分の「細胞質ドメイン」とを含み、このとき、２つの小胞局在化部分は、異なっており、別個のタンパク質であり、アイソフォームではなく、「表面－膜貫通ドメイン」が突然変異を有していてもよい。突然変異は、生じた突然変異体が、突然変異していない対応物のＥＶ会合活性の少なくとも８０％、または少なくとも約９０％を保持する限り、欠失、挿入または置換であってもよい。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、対立遺伝子または相同体ではない２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、オルソログではない２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、パラログではない２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、パラログである２つの異なる遺伝子によってコードされる２つのタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、２つの非相同遺伝子によってコードされる２つのタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、２つ以上の非相同遺伝子によってコードされる２つ以上のタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、２つ以上の非相同性ヒト遺伝子によってコードされる２つ以上のタンパク質のドメインを組み合わせることによって得られる。一実施形態において、「キメラ小胞局在化部分」は、膜貫通タンパク質をコードする２つ以上のヒト遺伝子のドメインを組み合わせることによって産生される。好ましい実施態様において、「キメラ小胞局在化部分」は、２つの非相同なヒト遺伝子、または同一遺伝子ファミリー内にない２つのヒト遺伝子を組み合わることによって産生され、遺伝子は、膜貫通タンパク質をコードする。
タンパク質の「アイソフォーム」は、例えば、タンパク質を発現する遺伝子の選択的スプライシングから生じるタンパク質、タンパク質を発現する遺伝子の選択的プロモータ使用から生じるタンパク質、またはタンパク質の分解産物とすることができる。
「表面－膜貫通ドメイン」は、細胞外または細胞外ＥＶ溶媒に曝露されるドメインと、上述のような膜貫通ドメインとの両方を含む隣接ポリペプチドである。
「リンカ」は、一般的に非疎水性であり、ヘリックスまたはベータシートなどの二次構造要素をコードしない３～１０００個のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドであってもよい。適当な例としては、(Ｇｌｙ)８、(Ｇｌｙ)６、(ＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＳ) （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５） (ＥＡＡＡＫ)ｎ （ｎ＝１～３）、Ａ(ＥＡＡＡＫ)４ＡＬＥＡ(ＥＡＡＡＫ)４Ａ、(ＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～４）、(Ａｌａ－Ｐｒｏ)ｎ （１０－３４ ａａ）、ならびにＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＦＧ、およびＬＥなどの切断可能なリンカのうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用する場合、「単離された」とは、１つまたは複数の精製工程の後であるが、至純である必要はない状態を意味する。「単離された」細胞外小胞（例えば、エクソソーム）またはその組成物とは、小胞、細胞外小胞、細胞外小胞、エクソソーム、または組成物を、混合物中、または小胞、細胞外小胞もしくはエクソソームの外部に見出されるか、または精製もしくは分離の前に組成物の一部として見出される他の分子、物質、または細胞成分から分離する、１つまたは複数の精製工程を経た細胞外小胞、エクソソーム、またはその組成物を意味する。単離および精製は、組換え合成または無細胞タンパク質合成の従来の方法に従って達成することができる。対象となる分離手順には、アフィニティクロマトグラフィが含まれる。アフィニティクロマトグラフィでは、通常は生体高分子に存在する特異性の高い結合部位を利用し、特定のリガンドと結合する能力により分子を分離する。例えば、共有結合は、リガンドをタンパク質試料に過剰に提示するようにして、リガンドを不溶性で多孔性の支持媒体に付着させ、それによって、一方の分子種の天然の生体特異性結合を使用し、混合物から他方の種を分離して精製する。抗体を、アフィニティクロマトグラフィに使用してもよい。マイクロスフェアまたはマトリックスを、アフィニティクロマトグラフィの支持体として用いるのが好ましい。このような支持体は、当業者に公知であり、市販されており、リンカ分子に結合することが可能な活性化支持体を含む。例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドに基づくＡｆｆｉ－Ｇｅｌ支持体は、蠕動ポンプまたは重力流溶出によるほとんどの実験室規模の精製に適した低圧ゲルである。圧力安定マクロ多孔性ポリマに基づくＡｆｆｉ－Ｐｒｅｐ支持体は、分取およびプロセススケールの用途に適している場合がある。また、単離は、遠心分離、濾過、サイズ排除クロマトグラフィ、および小胞フローサイトメトリを含む方法を用いて行うこともできる。
いくつかの実施形態において、本明細書中の組成物は、目的とする組織または細胞を選択的にターゲットとする、単離または富化された小胞のセットを含む。このような小胞は、本明細書に記載するようなペイロードを搭載し、目的とする細胞または組織に送達することができる。
本発明の一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含んでいてもよい。好ましい実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、別個の／異なるタンパク質であり、アイソフォームではない。好ましい実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、別個の／異なるタンパク質であり、対立遺伝子変異体ではない。好ましい実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、別個の／異なるタンパク質であり、ホモログではない。好ましい実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、別個の／異なるタンパク質であり、オルソログではない。一実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、別個の／異なるタンパク質であるが、パラログである。好ましい実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、別個の／異なるタンパク質であり、パラログではない。
一実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、真核生物または真核生物由来の別個の／異なるタンパク質である。真核生物には、動物、植物、菌類、および原生生物のいずれかを含めることができる。一実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、哺乳動物または哺乳動物由来の別個の／異なるタンパク質である。哺乳動物としては、ヒト、サル、チンパンジー、類人猿、ゴリラ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ロバ、カンガルー、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ウサギ、およびリスを含めることができるが、これらに限定されない。一実施形態において、第１および第２の小胞局在化部分は、ヒトまたはヒト由来の別個の／異なるタンパク質である。
一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、組換えＤＮＡ法を用いて得られる。キメラ小胞局在化部分は、第１の小胞局在化部分および第２の小胞局在化部分のアミノ酸配列をコードする核酸の発現から産生することができる。キメラ小胞局在化部分をコードする核酸は、発現ベクタまたは発現系に導入することができる。核酸配列の例は、本明細書の表および本明細書と共に提供する配列リストに記載されている。発現ベクタまたは発現系は、ポリペプチドとしてキメラ局在化部分を発現する細胞に導入することができる。一実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であるのが好ましく、ヒト細胞であるのがより好ましい。一実施形態において、発現ベクタまたは発現系は、細胞外小胞、好ましくはエクソソームを産生する産生細胞に導入することができる。一実施形態において、産生細胞は、哺乳動物細胞である。好ましい実施形態において、産生細胞は、ヒト細胞である。これに代えて、発現ベクタまたは発現系を、インビトロ転写および翻訳系において使用し、ポリペプチドとしてキメラ小胞局在化部分を産生することもできる。一実施形態において、インビトロで産生されたキメラ小胞局在化部分は、単離することが可能である。一実施形態において、単離されたキメラ小胞局在化部分は、細胞から単離された細胞外小胞またはエクソソームに導入することができる。
適切な第１の小胞局在化部分の例としては、ＡＤＡＭ１０、ＡＬＣＡＭ、ＣＬＳＴＮ１、ＩＧＳＦ８、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＴＧＦＲＮ、およびＳＥＬＰＬＧが含まれるが、これらに限定されるわけではない。適切な小胞局在化部分の更なる例としては、増殖因子受容体、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－II成分、ＣＤ抗原、およびエスコートタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。適切な第２の小胞局在化部分の例としては、第１の小胞局在化部分について記載したものと同じ例が含まれるが、これらに限定されない。
小胞局在化部分は、更に、修飾アミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質を含んでいてもよい。修飾アミノ酸は、疎水性基の結合の結果として生じ得る。疎水性基の結合は、ミリスチン酸の結合のためのミリストイル化、パルミチン酸の結合のためのパルミトイル化、プレニル基の結合のためのプレニル化、ファルネシル基の結合のためのファルネシル化、ゲラニルゲラニル基の結合のためのゲラニルゲラニル化、またはホスホエタノールアミンリンカ、グリカンコアおよびリン脂質尾部を含むグリコシルホスファチジルイノシトールの結合のためのグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカ形成であってもよい。疎水性基の結合は、インビトロでの化学合成によって行ってもよいし、翻訳後修飾反応において酵素的に行ってもよい。
第１および第２の小胞局在化部分の例としては、ＡＣＥ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ９、ＡＧＲＮ、ＡＬＣＡＭ、ＡＮＰＥＰ、ＡＮＴＸＲ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ３、ＢＳＧ、ＢＴＮ２Ａ１、ＣＡＬＭ１、ＣＡＮＸ、ＣＤ１５１、ＣＤ１９、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ２２６、ＣＤ２４７、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５３、ＣＤ５８、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＨＭＰ１Ａ、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＣＨＭＰ２Ａ、ＣＨＭＰ３、ＣＨＭＰ４Ａ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ５、ＣＨＭＰ６、ＣＬＳＴＮ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＤＤＯＳＴ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＤＳＧ１、ＥＭＢ、ＥＮＧ、ＥＶＩ２Ｂ、Ｆ１１Ｒ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＧ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＹＰＡ、ＨＳＰＧ２、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＩＧＳＦ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＳＴ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＫＩＴ、ＬＡＭＰ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＩＬＲＡ６、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＭＡＮ２、ＬＲＲＣ２５、ＬＹ７５、Ｍ６ＰＲ、ＭＦＧＥ８、ＭＭＰ１４、ＭＰＬ、ＭＲＣ１、ＭＶＢ１２Ｂ、ＮＥＣＴＩＮ１、ＮＯＭＯ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＮＰＴＮ、ＮＲＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＸＮＢ２、ＰＬＸＮＤ１、ＰＲＯＭ１、ＰＴＧＥＳ２、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＰＲＡ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＪ、ＰＴＰＲＯ、ＲＰＮ１、ＳＤＣ１、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ＳＤＣＢＰ、ＳＤＣＢＰ２、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰＡ、ＳＬＩＴ２、ＳＮＦ８、ＳＰＮ、ＳＴＸ３、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＦＲＣ、ＴＬＲ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＣ、ＴＳＧ１０１、ＴＳＰＡＮ１４、ＴＳＰＡＮ７、ＴＳＰＡＮ８、ＴＹＲＯＢＰ、ＶＰＳ２５、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３６、ＶＰＳ３７Ａ、ＶＰＳ３７Ｂ、ＶＰＳ３７Ｃ、ＶＰＳ３７Ｄ、ＶＰＳ４Ａ、ＶＰＳ４Ｂ、ＶＴＩ１Ａ、およびＶＴＩ１Ｂ、またはその相同体、またはこれらの組み合わせのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。小胞局在化部分（上記）についてのアミノ酸配列および関連する核酸コード配列は、表１および表２において得ることができるが、配列が表の中で直接得られない場合、その配列は、表中で参照される受託番号およびデータベースから得ることができる。
一実施形態において、キメラ小胞局在化部分が由来する第１および第２の小胞局在化部分は、表１および表２に列挙した膜貫通タンパク質、またはその相同体のいずれかから得ることができる。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、表１に列挙した膜貫通タンパク質またはその相同体のいずれかから選択される第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、表２に列挙した膜貫通タンパク質またはその相同体のいずれかから選択される第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含む。別の実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、表２に列挙した膜貫通タンパク質またはその相同体のいずれかから選択される第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、表１に列挙した膜貫通タンパク質またはその相同体のいずれかから選択される第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含む。好ましい実施態様において、キメラ小胞局在化部分は、表１に列挙した膜貫通タンパク質またはその相同体のいずれかから選択される第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、表１に列挙した膜貫通タンパク質またはその相同体のいずれかから選択されるが、第１の小胞局在化ドメインについては選択されない、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含む。
一実施形態において、表１および表２に示すような核酸配列を用い、組換えＤＮＡ法によってキメラ小胞局在化部分を産生することができる。一実施形態において、表面ドメインの次の隣接アミノ酸が、後に続く膜貫通ドメインの最初のアミノ酸に結合され、膜貫通ドメインの最後のアミノ酸が、細胞質ドメインの最初のアミノ酸に結合される。一実施形態において、表１および表２における小胞局在化部分は、アミノ末端からカルボキシル末端への方向に、表面ドメインの最後のアミノ酸が膜貫通ドメインの最初のアミノ酸と結合され、更に、膜貫通ドメインの最後のアミノ酸が細胞質ドメインの最初のアミノ酸と結合される膜貫通タンパク質を含む。なお、表１のアミノ酸配列および表１の核酸配列、または表２の各ＥＮＳＴ数に関連する小胞局在化部分コード配列については、表面ドメインの最初のアミノ酸に最後のアミノ酸が結合したシグナルペプチド配列が更に存在することに留意されたい。細胞発現の際に、シグナルペプチドは、新生タンパク質から切断され、ＥＶに関連して見出される成熟小胞局在化部分を産生する。従って、表１および表２は、シグナルペプチドおよび核酸コード配列を有した完全長小胞局在化部分を示す。シグナルペプチド、表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの小胞局在部分のアミノ酸配列およびアミノ酸配列は、核酸コード配列と共に、更にＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、ならびにアンサンブル（Ensembl）のＥＮＳＰおよびＥＮＳＴ識別子に関連する受託番号を介してアクセスすることができる。
一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含む。第１の小胞局在化部分は、ＡＤＡＭ１０、ＡＬＣＡＭ、ＣＬＳＴＮ１、ＩＧＳＦ８、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＴＧＦＲＮ、およびＳＥＬＰＬＧのいずれか、またはそれらの相同体を含むことができる。第２の小胞局在化部分は、第１および第２の小胞局在化部分が異なったタンパク質または非相同タンパク質からのものである限り、同じ膜貫通タンパク質群から選択してもよい。ＡＤＡＭ１０、ＡＬＣＡＭ、ＣＬＳＴＮ１、ＩＧＳＦ８、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＴＧＦＲＮ、およびＳＥＬＰＬＧをコードするアミノ酸配列および核酸配列は、アンサンブル（Ensembl）のＥＮＳＰおよびＥＮＳＴ識別子（Hunt, S.E. et al. (2018) Database, 2018, 1-12; doi: 10.1093/database/bay119; Yates, A.D. et al., (2019) Nucleic Acids Res. 48:D682-D688）と共に、表１に示されている。
好ましい実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、ＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインを含み、図９に示すようなアミノ配列、またはゲノム参照コンソーシアムヒト構築物３８パッチリリース１３（GRCh38.p13; GenBankアセンブリ受託番号GCA_000001405.28およびRefSeqアセンブリ受託番号GCF_000001405.39）におけるアセンブルされた配列に基づいて、遺伝子ＩＤ ＥＮＳＧ０００００００５８９３からの転写物ＩＤ ＥＮＳＴ０００００３７１３３５によってコードされる受託番号ＥＮＳＰ０００００３６０３８６を有したＬＡＭＰ２タンパク質を有する。好ましい実施形態において、転写物ＩＤ ＥＮＳＴ０００００３７１３３５によってコードされる受託番号ＥＮＳＰ０００００３６０３８６を有したＬＡＭＰ２タンパク質はＬＡＭＰ２Ｂである。ＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインを含むキメラ小胞局在化部分は、更に、ＡＤＡＭ１０、ＡＬＣＡＭ、ＣＬＳＴＮ１、ＩＧＳＦ８、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＬＩＬＲＢ４、ＰＴＧＦＲＮ、またはＳＥＬＰＬＧ、またはその相同体もしくは一部の細胞質ドメインを含む。好ましい実施形態では、ＬＡＭＰ２表面膜貫通ドメインを含むキメラ小胞局在化部分は、更にＰＴＧＦＲＮ、ＩＴＧＡ３、ＩＬ３ＲＡ、ＳＥＬＰＬＧ、ＩＴＧＢ１、またはＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメイン、またはその相同体もしくは部分を含む。
本発明の一実施形態において、ＰＴＧＦＲＮの細胞質ドメインは、図５もしくは図１０に示すようなアミノ酸配列、またはその相同体もしくは一部を有する。単なる一例として、当該相同体または一部は、細胞外小胞におけるその蓄積を検出することによって求め得るＰＴＧＦＲＮの細胞質ドメイン活性の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を保持し得る。蓄積は、キメラ小胞局在化部分について陽性である細胞外小胞のパーセント、および／または、小胞フローサイトメトリによって測定されるように、局在化部分について陽性であり、かつ局在化部分を欠く細胞外小胞を無視した細胞外小胞における局在化部分の平均存在量に基づき、キメラ小胞局在化部分について評価することができる。細胞外小胞における局在化部分の平均存在量は、局在化部分について陽性の細胞外小胞における局在化部分の平均濃度、密度、または量とすることができる。一実施形態において、局在化部分について陽性である細胞外小胞の総数を含め、別の測定法を用いることもできる。
別の実施形態において、ＩＴＧＡ３の細胞質ドメインは、図５もしくは図１０で示すようなアミノ酸配列、またはその相同体もしくは一部を有する。単なる一例として、当該相同体または一部は、細胞外小胞におけるその蓄積を検出することによって求めることができるＩＴＧＡ３の細胞質ドメイン活性の少なくとも８０％、または少なくとも約９０％を保持し得る。
更に別の実施形態において、ＩＬ３ＲＡの細胞質ドメインは、図６もしくは図１０に示すようなアミノ酸配列、またはその相同体もしくは一部を有する。一例として、当該相同体または一部は、細胞外小胞におけるその蓄積を検出することによって求めることができるＩＬ３ＲＡの細胞質ドメイン活性の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を保持し得る。
更に、別の実施態様において、ＳＥＬＰＬＧの細胞質ドメインは、図６もしくは図１１に示すようなアミノ酸配列、またはその相同体もしくは一部を有する。本発明の一例において、当該相同体または一部は、細胞外小胞におけるその蓄積を検出することによって求めることができるＳＥＬＰＬＧの細胞質ドメイン活性の少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を保持する。
更に、本発明の一実施形態において、ＩＴＧＢ１の細胞質ドメインは、図７もしくは図１１に示すようなアミノ酸配列、またはその相同体もしくは一部を有していてもよく、このとき、当該相同体または一部は、細胞外小胞におけるその蓄積を検出することによって求めることができるＩＴＧＢ１の細胞質ドメイン活性の少なくとも８０％、または少なくとも約９０％を保持する。
更に、ＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメインは、図７もしくは図１２に示すようなアミノ酸配列、またはその相同体もしくは一部を有していてもよく、このとき、当該相同体または一部は、細胞外小胞におけるその蓄積を検出することによって求めることができるＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメイン活性の少なくとも８０％、または少なくとも約９０％を保持する。
一実施形態において、相同体は、共通の祖先遺伝子に由来するオルソログであり、異なる種において同じ機能を有するタンパク質をコードする。一実施形態において、相同体は、遺伝子重複によって進化した相同遺伝子に由来するパラログであって、類似するが同一ではない機能を有したタンパク質をコードする相同遺伝子に由来するパラログである。オルソログおよびパラログを含む相同タンパク質は、アミノ酸配列に基づき、公的に利用可能なデータベースにおいて、同定され、取りまとめられ、グループ化され、整列され得るものであり、当該データベースは、米国国立衛生研究所バイオテクノロジ情報センタにおけるＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（NCBI Resource Coordinators (2016) 米国国立衛生研究所バイオテクノロジ情報センタのデータベース資源 Nucleic Acids Res. 44:D7-D9）、ＯｒｔｈｏＤＢ（Waterhouse, R. M. et al. (2011) OrthoDB：２０１１年の真核生物オルソログの階層的カタログ Nucleic Acids Res. 39:D283-8）、ＨＯＧＥＮＯＭ（Penel, S. et al. (2009) 比較ゲノム学のための相同遺伝子ファミリのデータベース BMC Bioinfomatics 10:S3）、ＴｒｅｅＦａｍ（Ruan, J. et al. (2008) TreeFam: 2008 Update. Nucleic Acids Res. 36: D735-D740）、Ｇｅｎｅ Ｓｏｒｔｅｒ（Kent, W. J. et al. (2005) UCSC Gene Sorterとの関係の探索、およびデータのマイニング Genome Res. 15:737-41）、およびＩｎＰａｒａｎｏｉｄ（Sonnhammer, E. L. L. and Ostlund, G. (2015) InParanoid 8：２７３のプロテオーム（主に真核生物）間のオルトロジ解析 Nucleic Acids Res. 43:D234-D239）などである。
操作された細胞外小胞
いくつかの例において、本明細書中の細胞外小胞は、目的とする細胞または組織へのターゲティングを強化するために操作される。このように操作された小胞は、非天然で発生し得るものである。このように操作された小胞は、目的とする細胞、組織、または器官への親和性を増大させるために、機能化された部分（ターゲティング部分）を介して「ターゲティング」または「誘導」することができる。小胞は、1つまたは複数のターゲティング部分の異種発現を含むように操作することができる。
小胞の機能化は、エクソソームなどの小胞の修飾によって起こり、外因性タンパク質または核酸を提示する。本明細書中で使用する場合、「ターゲティング部分」は、小分子、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、核酸、または、ＥＶ輸送および／または標的細胞とのＥＶ相互作用に関与する他の分子を含むことができるが、これらに限定されない。ターゲティング部分は、小胞膜の内側または外側に示されてもよいし、内膜、外膜、または内膜と他の膜の両方に及んでいてもよい。細胞または組織の外側にある細胞表面受容体、リガンド、または部分をターゲティングするために、ターゲティング部分は、標的細胞表面受容体、リガンド、または部分に結合できるように、小胞膜の外側に同様に示される。ターゲティング部分は、天然の荷物が「空にされた」状態、天然に発生する荷物を「運ぶ」状態、または標的細胞または組織などへの送達のためのペイロードを装填した状態のエクソソームにおいて発現されてもよい。
一例において、操作された小胞は、目的とする細胞または組織を選択的にターゲティングするターゲティング部分（例えば、タンパク質、ペプチド、または核酸）を発現するように、機能化されるかまたは操作された小胞である。このように操作された小胞は、エクソソームとすることができる。いくつかの実施形態において、このように操作された小胞は、細胞外小胞である。好ましい実施形態において、操作された小胞は、エクソソームである。一実施形態において、操作された小胞は、ターゲティング部分に結合したキメラ小胞局在化部分を含む。好ましい実施態様において、操作された小胞は、小胞の外側に示されるターゲティング部分に結合したキメラ小胞局在化部分を含む。別の好ましい実施形態において、操作された小胞は、ＥＶの外側に示されるターゲティング部分に結合したキメラ小胞局在化部分を含む操作された細胞外小胞である。より好ましい実施形態において、操作された小胞は、エクソソームの外側に示されるターゲティング部分に結合されたキメラ小胞局在化部分を含む操作されたエクソソームである。
標的細胞
本明細書に記載の小胞は、目的とする細胞、組織、または器官を選択的にターゲティングするために使用することができる。いくつかの実施形態において、標的細胞は、真核細胞である。標的細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌなどの動物由来の細胞とすることができる。標的細胞は、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含む霊長類の細胞とすることができるが、これらに限定されない。
目的とするターゲティング部分
本明細書に開示する細胞外小胞のいずれも、目的とする１つまたは複数のターゲティング部分を含むことができる。それらは、小胞膜に埋め込んだり、小胞膜に提示したりすることができる。細胞外小胞は、エクソソームとすることが可能であり、ターゲティング部分は、エクソソームの外表面に示すことができる。例えば、ターゲティング部分を、キメラ局在化部分の表面ドメインに提示／接合／結合させることができる。
好ましい例において、本発明は、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分を含んだ本発明の細胞外小胞を提供し、このとき、ターゲティング部分は、第１の小胞局在化部分の表面ドメインに結合、または共有結合もしくは非共有結合で接合される。但し、本発明は、ＡＢｃ、ＡｂＣ、Ａｂｃ、ａＢＣ、ａＢｃ、およびａｂＣの配置を有したキメラ小胞局在化部分を含む、異なる小胞局在化部分間での別のタイプのドメインスワッピングを意図するものであって、Ａ、Ｂ、およびＣは、それぞれ、第１の小胞局在化部分の表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに対応し、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ、第２の小胞局在化部分の表面ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに対応する。これらの実施形態では、ターゲティング部分を、表面ドメイン上に示すことができる。
ターゲティング部分（組織特異的なターゲティング部分など）は、小分子、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸多糖類、治療薬、イメージング部分、または目的とする細胞または組織への小胞のターゲティングを容易にする他の分子を含むことができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマ形態を指すものであって、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾されるか、または誘導体化されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含めることができる。
本発明の一実施形態において、ターゲティング部分は、細胞または組織マーカ、例えば細胞表面受容体に結合する抗体、リガンド、またはその機能的エピトープとすることができる。
本明細書中で使用する場合、用語の抗体は、結合タンパク質として機能的に定義されると共に、免疫グロブリンの可変領域に由来するものと当業者が認識するアミノ酸配列を含むものとして構造的に定義されるタンパク質またはポリペプチドとすることができる。抗体は、免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子の断片、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子（異なる動物からの遺伝情報を組み合わせて生成）、または合成免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むことができる。認識された天然の免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子、および複数のＤセグメントおよびＪセグメントを含めることができる。軽鎖は、カッパおよびラムダのいずれかに分類することができる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類することができ、これらは、それぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、例えば、抗原結合断片Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ、およびＦａｂ'を産生するための様々なペプチダーゼによる消化によって産生される多数の十分に特徴付けられた断片として、または可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ジアボディ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ナノボディ（例えば、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ断片）、および小型化された「３Ｇ」断片（Nelson, A. L. (2010) 抗体断片 MAbs 2: 77-83; and Muyldermans, S. (2103) ナノボディ：天然の単一ドメイン抗体 Ann. Rev. Biochem. 82:775-797）などの組換えＤＮＡ技術によって産生される様々な断片として存在し得る。抗体は、多くの異なる種（例えば、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、ヒト、または齧歯類、例えばマウスまたはラット）から得ること、または合成することが可能である。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体とすることができる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル、複数または単一の鎖、断片のまたは完全な免疫グロブリンとすることができる。好ましい実施形態において、抗体はｓｃＦｖである。
本発明の一実施形態において、ターゲティング部分は、ペプチド（例えば、親和性ペプチド）である。別の実施形態において、ターゲティング部分は、抗体断片であってもよい。更に別の実施形態において、抗体断片は、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジアボディ、ｔａｓｃＦｖ、ビス－ｓｃＦｖ、ナノボディ、および小型化された「３Ｇ」断片のいずれであってもよい。好ましい実施形態において、抗体断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であって、重鎖（ＶＨ）の可変領域および軽鎖（ＶＬ）の可変領域が柔軟なリンカによって互いに結合される。重鎖断片の可変領域は、軽鎖断片の可変領域に先行することができ、また、その逆も可能である。柔軟なリンカは、多くの場合、例えば(ＧＧＧＧＳ)４リンカなどのグリシン－セリンリッチである。一実施形態において、ｓｃＦｖは、細胞または組織の表面上のターゲットに結合する。好ましい実施態様において、ｓｃＦｖは、（エクソソームのような）細胞外小胞に組み込まれ、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）の外側に示されるキメラ小胞局在化部分に結合される。より好ましい実施形態において、ｓｃＦｖは、キメラ小胞局在化部分に結合され、細胞外小胞（例えば、エクソソーム）の外側に示され、特定の細胞型または組織を優先的または選択的にターゲティングする。単なる一例として、抗体断片は、単特異的であってもよいし、また二重特異的であってもよい。本発明の一実施形態において、抗体断片は、多価であってもよい。
適切な抗体の例、特に単鎖Ｆｖ抗体、および断片には、Ｔｈｙ１、ＭＨＣクラスII、補体受容体２型（ＣＲ２）のＣ３ｄ結合領域、ＶＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、アルファ８インテグリン、インテグリンアルファ－Ｍ（ＣＤ１１ｂ）、およびＣＤ１６３のいずれかに対する抗体が含まれる。Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ抗体が調製され得る例示的な抗体としては、Ｔｈｙ１タンパク質に対するＯＸ７抗体（Suana、A.J. et al.、J. Pharmacol. Exp.Ther.2011;337:411-422）、ＭＨＣクラスIIタンパク質に対するＲＴ１抗体（Hultman、K.L. et al., ACS Nano.2008;2:477-484）、ＣＲ２のＣ３ｄ結合領域に対するモノクローナル抗体（Serkova、N.J. et al.、Radiology.2010;255:517-526）、ＶＣＡＭ－１に対するモノクローナル抗体（clone M/K2, Cambridge Bioscience）（Akhtar、A.M.、PLoS.One.2010; 5:e12800）、Ｅ－セレクチンに対するモノクローナル抗体ＭＥＳ－１（Asgeirsdottir, S.A. et al., Mol. Pharmacol. 2007; 72: 121-131）、抗α８インテグリン抗体（Santa Cruz Biotechnologies）（Scindia, Y. et al., Arthritis Rheum. 2008; 58: 3884-3891）、ＣＤ１１ｂに対するモノクローナル抗体（Shirai, T. Drug Targeting 2012; 20: 535-543）、および抗ＣＤ１６３モノクローナル抗体（ED2; sc-58965、Santa Cruz Biotechnology）（Sawano, T. et al. 2015. Oncology reports. 33: 2151-60）が含まれる。
本明細書に記載するターゲティング部分のいずれも、１つまたは複数の他の組織または細胞と比較して、目的とする標的細胞に対する小胞の選択性を強化することができる。１つまたは複数の選択的ターゲティング部分を、修飾された小胞上で、当該修飾された小胞が意図するターゲットに結合できるように発現させることができる。１つまたは複数のターゲティング部分は、そのような結合を可能にするのに十分な量のアミノ酸を露出させることができる。
本明細書に示す修飾された小胞は、目的とする細胞上に発現されたマーカと結合するか、または物理的に相互作用することによって、小胞を当該目的とする細胞または組織に選択的にターゲティングする１つまたは複数のターゲティング部分を含むことができる。
選択的ターゲティングまたは選択的結合または選択的相互作用に関して本明細書中で使用する用語「選択的な」または「選択的に」とは、少なくとも１つの別のタイプの細胞、組織、または器官と比較して、目的とする細胞、組織、または器官への優先的なターゲティング、結合、または相互作用を意味するものとすることができる。
タンパク質の「機能的断片」は、それが由来する完全長タンパク質の機能を保持するタンパク質の断片、例えば、完全長タンパク質の機能と同一のまたは類似したターゲティング機能または結合機能を保持するタンパク質の断片を意味するものとすることができる。抗体の「機能的断片」は、その抗原結合部分または断片とし得るものであって、これは、損なわれていない抗体についての結合特異性を付与するものである。機能は、完全長タンパク質の機能の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持する場合、完全長タンパク質の機能に類似するものとすることができる。機能は、例えば、アッセイ、例えば、インビボ結合アッセイ、細胞における結合アッセイ、またはインビトロ結合アッセイを用いて測定することができる。
一般に、「配列同一性」または「配列相同性」とは、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を意味する。本明細書中で使用する場合、「配列同一性」または「同一性」とは、２つの核酸配列またはアミノ酸配列との関連において、特定の比較ウインドウ上で最大限に合致するように並べられたときに同じである２つの配列中の残基を意味する。
本明細書中で使用する場合、「配列同一性パーセント」とは、２つの最適に並べられた配列を比較ウインドウ上で比較することによって定まる値を意味し、このとき、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、付加または欠失を含まない基準配列と比較して、付加または欠失（即ち、ギャップ）を含み得るものであって、２つの配列を最適に並べるためのものとし得る。パーセンテージは、両方の配列中で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が生じる位置の数を求めて、一致した位置の数を取得し、この一致した位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出することができる。
同一性を評価することを目的とするような配列比較は、ニードルマン・ワンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（例えば、必要に応じてデフォルト設定で、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/で入手可能な、EMBOSS Needle aligner、Needleman、S. B. and Wunsch、C. D. (1970) ２つのタンパク質のアミノ酸配列の類似性の探索に適用可能な一般的方法 J. Mol. Biol. 48:443-53）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、必要に応じてデフォルト設定で、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiで利用可能な、ＢＬＡＳＴアラインメントツール、Altschul, S. F. et al. (1990) 基本局所アラインメント検索ツール J. Mol Biol. 215:403-410、およびAltschul, S. F. et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST：新世代のタンパク質データベース検索プログラム Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）、およびスミス・ウォータマン（Smith-Waterman）アルゴリズム(例えば、必要に応じてデフォルト設定で、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/で利用可能な、EMBOSS Water aligner; Smith, T.F. and Waterman, M.S. (1981) 共通の分子サブ配列の同定 J. Mol. Biol 147:195-7）を含むが、これらに限定されない任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって実施することができる。最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを含む、選択されたアルゴリズムの任意の適切なパラメータを用いて評価することができる。
２つの配列間の「同一性パーセント」は、２つの最適に並べられた配列間の正確な一致の数を、基準配列の長さで除し、１００を乗じることによって算出される。また、同一性パーセントは、例えば、米国国立衛生研究所から入手可能なバージョン２．２．９を含む高度ＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを用い、配列情報を比較することによって求めることもできる。ＢＬＡＳＴプログラムは、Karlin and Altschul, Proc Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268(1990)のアラインメント法に基づくものとすることが可能であり、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)、Karlin and Altschul, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877(1993)、およびAltschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)で議論されているようなものとすることができる。簡潔に言うと、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一の並べられた記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のうちのより短い方の記号の総数で除することで、同一性を定義することができる。このプログラムは、比較される配列の全長にわたって同一性パーセントを求めるために使用することができる。例えばＢＬＡＳＴＰプログラムなどを使用し、短いクエリシーケンスによる検索を最適化するために、デフォルトパラメータを提供することができる。また、このプログラムは、Wootton, J. C. and Federhen, S. (1993) Computers Chem. 17:149-163のＳＥＧプログラムによって求められるように、クエリシーケンスのマスクオフセグメントに対してＳＥＧフィルタの使用を可能にすることができる。高い配列同一性は、約８０％～９９％の範囲の配列同一性、およびその間にある整数値の配列同一性を含むことができる。
「相同体（homologまたはhomologue）」は、別の配列と少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％の配列相同性を有する任意の配列を意味するものとすることができる。相同体（homologまたはhomologue）は、別の配列と少なくとも約９８％、９９％、または９９．５％の配列相同性を有する任意の配列を意味するものであるのが好ましい。いくつかの場合、相同体は、天然の配列または天然に存在する配列と、機能的または構造的な等価性を有するものとすることができる。いくつかの場合、相同体は、天然の配列または天然に存在する配列によってコードされる、ドメイン、モチーフ、またはタンパク質の一部と機能的または構造的な等価性を有するものとすることができる。
相同性の比較は、配列比較プログラムを用いて行うことができる。コンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性パーセント（％）を演算することが可能であり、また、２つ以上のアミノ酸または核酸配列が共有する配列同一性を演算することも可能である。配列相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなど、多くのコンピュータプログラムのいずれかによって得ることができる。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A; Devereux, J. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387)である。それ以外で、配列比較を行うことが可能なソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel、F. M. et al. (1999) Short Protocols in Molecular Biology、4th Ed. - Chapter 18を参照）、ＦＡＳＴＡ（Atschul、S. F. et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが含まれる。
相同性パーセントは、隣接する配列について計算することが可能であり、即ち、一方の配列が他方の配列と並んでおり、一方の配列中の各アミノ酸またはヌクレオチドが、他方の配列中の対応するアミノ酸またはヌクレオチドと、１残基ずつ直接比較される。これは「ギャップのない」アラインメントと称される。一般的に、このようなギャップのないアラインメントは、比較的短い残基数について行うことができる。
それ以外では、同一の配列対において、１つの挿入または欠失により、以下のアミノ酸またはヌクレオチド残基がアラインメントから排出される可能性があり、従って、全体的なアラインメントが実施された場合に、相同性パーセントの大幅な減少をもたらす可能性がある。従って、配列比較法は、全体的な相同性または同一性スコアを不当に悪化させることなく、挿入および欠失の可能性を考慮に入れた最適なアラインメントを生じるように設定することができる。これは、配列のアラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性や同一性を最大にしようとすることによって達成することができる。
ＢＬＡＳＴ２配列は、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために使用することが可能な、もう１つのツールである（FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8、および米国国立衛生研究所ホームページの国立バイオテクノロジ情報センタのウェブサイトを参照）。
また、相同配列は、機能的に等価な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有することもできる。意図的なアミノ酸置換は、アミノ酸特性（極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または残基の両親媒性など）の類似性に基づいてなされることが可能であり、従って、アミノ酸を官能基でグループ化することが有用である。アミノ酸は、その側鎖単独の特性に基づいてグループ化してもよい
本発明の実質的に相同な配列には、開示した配列の変異体、例えば、部位特異的突然変異誘発に起因するもの、ならびに合成的に生成された配列が含まれる。いくつかの場合において、変異体は、異なる対立遺伝子に起因する対立遺伝子変異体であってもよい。いくつかの場合において、変異体は、選択的転写開始部位または選択的スプライシングにより、同一の遺伝子または対立遺伝子に由来するものであってもよく、その結果、アイソフォームである変異体が生じる。
本発明の細胞外小胞は、目的とするマーカに対する１つまたは複数のターゲティング部分を含む（例えば、その表面上に）ものとすることができる。目的とするマーカは、本発明の小胞がターゲティングまたは結合することを意図する目的の標的細胞の細胞表面マーカとすることができる。いくつかの実施形態において、本発明の小胞は、目的のマーカまたは目的のマーカの相同体に対するターゲティング部分を含むもの（例えば、その表面上に）である。いくつかの例において、小胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の異なるターゲティング部分を含む。一実施形態において、小胞は、目的とするマーカに対する１つまたは複数のターゲティング部分に結合したキメラ小胞局在化部分を含む。目的のマーカは、細胞表面マーカとすることができる。一実施形態において、小胞は、２つ以上のキメラ小胞局在化部分を含み、このとき、各キメラ小胞局在化部分は、目的とする同じマーカをターゲティングする異なるターゲティング部分を含む。一実施形態において、小胞は、２つ以上のキメラ小胞局在化部分を含み、このとき、各キメラ小胞局在化部分は、目的とする異なるマーカをターゲティングする異なるターゲティング部分を含む。一実施形態において、小胞は、２つ以上のキメラ小胞局在化部分を含み、このとき、各キメラ小胞局在化部分は、同じ細胞に存在する、目的とする異なるマーカをターゲティングする異なるターゲティング部分を含む。一実施形態において、小胞は、２つ以上のキメラ小胞局在化部分を含み、このとき、各キメラ小胞局在化部分は、異なる細胞型に存在している、目的とする異なるマーカをターゲティングする異なるターゲティング部分を含む。一実施形態において、小胞は２つ以上のキメラ小胞局在化部分を含み、このとき、各キメラ小胞局在化部分は、組織に存在している、目的とする異なるマーカをターゲティングする異なるターゲティング部分を含む。一実施形態において、小胞は、２つ以上のキメラ小胞局在化部分を含み、このとき、各キメラ小胞局在化部分は、異なる組織に存在している、目的とする異なるマーカをターゲティングする異なるターゲティング部分を含む。いくつかの例において、小胞は、他の細胞よりも目的の細胞の方を選択的にターゲティングするのに十分な数のターゲティング部分を含む。いくつかの例において、小胞は、他の組織よりも目的の組織の方を選択的にターゲティングするのに十分な数のターゲティング部分を含む。
いくつかの場合において、小胞は、天然に存在する小胞の表面上のターゲティング部分の濃度よりも、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１７、１８、２０、２２、２５、２８、３０、３３、３５、３８、４０、４３、４４、４６、４８、５０、５２、５５、５７、５９、６２、６５、６８、７０、７２、７５、７８、８０、８２、８５、８９、９１、９２、９５、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４５、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０、１８５、２００、２１０、２２０、２３０、２５０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３８０、４００、４１０、４３０、４４０、４５０、４７０、４９０、５００、５１０、５２５、５４０、５６０、５８０、５９０、６００、６２０、６５０、６７０、６８０、６９０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、８９０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、または１０００倍高い濃度のターゲティング部分を含む。いくつかの場合において、小胞は、天然では小胞または細胞外小胞と結合していないターゲティング部分を含む。好ましい実施態様において、小胞は、キメラ小胞局在化部分に融合された目的のターゲティング部分を含む。別の好ましい実施形態において、小胞は、１つまたは複数のキメラ小胞局在化部分に融合された、目的とする２つ以上の目的のターゲティング部分を含む。
融合タンパク質
「融合タンパク質」は、２つの別個のポリペプチドまたは２つの別個のポリペプチドの部分に由来する単一のポリペプチドとすることができる。そのため、キメラ小胞の局在化は、融合タンパク質と考えることができる。目的とする１つまたは複数のターゲティング部分は、キメラ小胞局在化部分（例えば、融合タンパク質として）に、機能的に（直接的または間接的に）連結することができる。一実施形態において、ターゲティング部分は、ターゲティング部分を含む別個のポリペプチドと、キメラ小胞局在化部分を含む別のポリペプチドとにおける相互作用表面またはパートナによって媒介されるキメラ小胞局在化部分に非共有結合することができる。このような相互作用表面またはパートナは、ターゲティング部分および／またはキメラ小胞局在化部分にもともと存在してもよいし、またターゲティング部分および／またはキメラ小胞局在化部分に共有結合していてもよい。非共有結合または相互作用を維持する分子力には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、および疎水結合が含まれる。
これに代えて、別の実施形態では、ターゲティング部分を、キメラ小胞局在化部分に共有結合させることができ、これら２つを合わせてターゲティング部分およびキメラ小胞局在化部分を含む融合タンパク質と称することができる。融合タンパク質のキメラ小胞局在化部分は、目的とするターゲティング部分（または他の融合分子）を小胞にターゲティングすることができる。いくつかの実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、目的とするターゲティング部分（または他の融合分子）を小胞の膜にターゲティングする。キメラ小胞局在化部分は、エクソソームの膜をターゲットとするのが好ましい。いくつかの例において、融合タンパク質は、キメラ小胞局在化部分と、目的とする細胞受容体に結合するリガンド（ターゲティング部分）とで生成することができる。リガンドは、表面に露出することが可能であり、標的細胞の表面上の１つまたは複数の受容体に選択的に結合することができる。このようなターゲティング部分のこれらの融合タンパク質は、内因的または外因的に小胞（例えば、エクソソームおよびＥＶ）上に装填することができる。これに代えて、融合タンパク質またはそのようなターゲティング部分およびキメラ小胞局在化部分を別々にコードする核酸を用い、エクソソーム局在化部分およびターゲティング部分を発現させることができる。
ドメインスワッピングによってキメラ小胞局在化部分が産生され得る小胞局在化部分の例としては、ＡＣＥ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ９、ＡＧＲＮ、ＡＬＣＡＭ、ＡＮＰＥＰ、ＡＮＴＸＲ２、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ｂ３、ＢＳＧ、ＢＴＮ２Ａ１、ＣＡＬＭ１、ＣＡＮＸ、ＣＤ１５１、ＣＤ１９、ＣＤ１Ａ、ＣＤ１Ｂ、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ１、ＣＤ２２６、ＣＤ２４７、ＣＤ２７４、ＣＤ２７６、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４０、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ４４、ＣＤ４７、ＣＤ５３、ＣＤ５８、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８４、ＣＤ８６、ＣＤ９、ＣＨＭＰ１Ａ、ＣＨＭＰ１Ｂ、ＣＨＭＰ２Ａ、ＣＨＭＰ３、ＣＨＭＰ４Ａ、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ５、ＣＨＭＰ６、ＣＬＳＴＮ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＲ４、ＤＤＯＳＴ、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＤＳＧ１、ＥＭＢ、ＥＮＧ、ＥＶＩ２Ｂ、Ｆ１１Ｒ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＦＬＴ３、ＦＮ１、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＧ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＹＰＡ、ＨＳＰＧ２、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＩＣＡＭ３、ＩＧＳＦ８、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＳＴ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＫＩＴ、ＬＡＭＰ２、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＩＬＲＡ６、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ３、ＬＩＬＲＢ４、ＬＭＡＮ２、ＬＲＲＣ２５、ＬＹ７５、Ｍ６ＰＲ、ＭＦＧＥ８、ＭＭＰ１４、ＭＰＬ、ＭＲＣ１、ＭＶＢ１２Ｂ、ＮＥＣＴＩＮ１、ＮＯＭＯ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＮＰＴＮ、ＮＲＰ１、ＰＤＣＤ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＬＸＮＢ２、ＰＬＸＮＤ１、ＰＲＯＭ１、ＰＴＧＥＳ２、ＰＴＧＦＲＮ、ＰＴＰＲＡ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＪ、ＰＴＰＲＯ、ＲＰＮ１、ＳＤＣ１、ＳＤＣ２、ＳＤＣ３、ＳＤＣ４、ＳＤＣＢＰ、ＳＤＣＢＰ２、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＳＩＲＰＡ、ＳＬＩＴ２、ＳＮＦ８、ＳＰＮ、ＳＴＸ３、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＦＲＣ、ＴＬＲ２、ＴＭＥＤ１０、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＲＡＣ、ＴＳＧ１０１、ＴＳＰＡＮ１４、ＴＳＰＡＮ７、ＴＳＰＡＮ８、ＴＹＲＯＢＰ、ＶＰＳ２５、ＶＰＳ２８、ＶＰＳ３６、ＶＰＳ３７Ａ、ＶＰＳ３７Ｂ、ＶＰＳ３７Ｃ、ＶＰＳ３７Ｄ、ＶＰＳ４Ａ、ＶＰＳ４Ｂ、ＶＴＩ１Ａ、およびＶＴＩ１Ｂのいずれか、またはそのアイソフォーム、またはその同族体、またはその機能的断片、またはエクソソームポリペプチドを含む。好ましい実施態様において、ドメインスワッピングによって産生され得るキメラ小胞局在化部分としては、ＡＤＡＭ１０、ＡＬＣＡＭ、ＣＬＳＴＮ１、ＩＧＳＦ８、ＩＬ３ＲＡ、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＴＧＦＲＮ、およびＳＥＬＰＬＧのいずれか、またはそのアイソフォーム、またはその相同体、またはその機能的断片が含まれる。ドメインスワッピングは、表１および表２において示されるかまたは参照されるコード配列を用いた組換えＤＮＡ法によって最も容易に達成され、２つの異なるコード配列をフレーム内で正確に解剖および融合させ、キメラ小胞局在化部分をコードする単一の核酸を得る。例示的なキメラ小胞局在化部分をコードする核酸配列は、表３および表５において得ることができる。
一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、２つの非相同小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、オルソログではない２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、パラログではない２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、パラログである２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、対立遺伝子変異体ではない２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、アイソフォームではない２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、祖先遺伝子または遺伝子重複によって関連しない２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、遺伝子重複によって関連し、異なる遺伝子座（対立遺伝子ではない）で相同遺伝子によってコードされるパラログとなるように進化した２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、異なる、非相同タンパク質である２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよい。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよく、このとき、スワップされているドメインは、配列同一性を最大にするために配列アラインメントにおいて許容されるギャップを伴い、約９５％、９０％、７０％、５０％未満、または好ましくは約３０％未満のアミノ酸配列同一性を共有する。一実施形態において、キメラ小胞局在化部分は、２つの小胞局在化部分をドメインスワップすることによって産生されるようにしてもよく、このとき、スワップされるドメインは、より短いドメインと比較して、一次アミノ酸配列の長さが、約１．３倍、１．５倍、１．７倍、１．９倍、２．３倍、２．７倍、またはより好ましくは約３倍以上大きく異なる。小胞局在化部分のドメインは、小胞の膜に関連して決定され、表面ドメイン（小胞の外側、細胞外ドメインとも称されることがあり、トポロジ的に等価である）、膜貫通ドメイン（小胞の脂質二重層を貫通する）、および内腔ドメイン（小胞の内部にあって、小胞の形成前に細胞質ドメインとも称され、トポロジ的に等価である）として記述されるようにしてもよい。一実施形態において、小胞局在化部分に存在する３つのドメインは、１つまたは複数の他の小胞局在化部分を由来とする１つまたは複数のドメインと交換されるようにしてもよい。好ましい実施態様において、小胞局在化部分の細胞質ドメインまたは内腔ドメインは、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを有するキメラ小胞局在化部分を産生するように、第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインまたは内腔ドメインと交換される。
このような融合タンパク質を生成する方法、および融合タンパク質をエクソソームに標的化／局在化する方法は、例えば、Limoni SK, et al.Appl Biochem Biotechnol.2018 Jun 28. doi: 10.1007/s12010-018-2813-4.に記載されているようなものとすることができる。
核酸
操作された小胞の産生は、本明細書に記載する１つもしくは複数の細胞型特異的もしくは選択的なターゲティング部分、本明細書に記載する１つもしくは複数のターゲティング部分、本明細書に記載するキメラ小胞局在化部分を含む１つもしくは複数の小胞局在化部分、本明細書に記載する１つもしくは複数の融合タンパク質、またはそれらの組み合わせをコードする核酸の生成を含むことができる。
本発明にはベクタが含まれる。当業者に周知の方法を用い、コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクタを構築することができる。一般に、発現ベクタは、タンパク質をコードする核酸に機能的に連結された転写および翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列」とは、特定の発現系、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、無細胞合成などにおける機能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物系に適した制御配列は、例えば、プロモータ、必要に応じてオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞系は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサを利用することができる。
これらの方法には、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。これに代えて、目的とするポリペプチドをコードすることができるＲＮＡを化学的に合成してもよい。当業者は、本発明のポリペプチドのいずれかに適したコード配列を提供するために、周知のコドン使用量表および合成方法を容易に利用することができる。
いくつかの実施形態において、ベクタは、１つまたは複数の小胞局在化部分、好ましくはキメラ小胞局在化部分をコードする核酸に機能的に連結された１つまたは複数の細胞型特異的または選択的なターゲティング部分をコードする核酸を含む。核酸は、もう１つの核酸配列と機能的な関係におかれているときに、「操作可能に連結」されている。例えば、プロモータまたはエンハンサは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されており、また、リボソーム結合部位は、翻訳の開始を容易にするように配置される場合、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、「作動可能に連結されている」は、連結されたＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌リーダの場合には、連続していて、リーディングフェーズ中にあることを意味する。連結は、連結反応または増幅反応によってなされる。合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカは、従来の慣例に従って配列を連結するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、ベクタは、表３またはいくつかの図に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含む。一実施形態において、ベクタは、本明細書または表３またはいくつかの図に開示する小胞局在化部分から産生されるキメラ小胞局在化部分をコードする核酸を含む。一例において、ベクタは、目的とするターゲティング部分および細胞型特異的または選択的なターゲティング部分のうちのいずれか１つまたは複数をコードする核酸に機能的に連結されたキメラ小胞局在化部分をコードする核酸を含む。一実施形態において、細胞型特異的または選択的なターゲティング部分は、ペプチドである。一実施形態において、細胞型特異的または選択的なターゲティング部分は、抗体または抗体断片である。一実施形態において、細胞型特異的または選択的なターゲティング部分は、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ、またはＦａｂ'である。好ましい実施態様において、細胞型特異的または選択的なターゲティング部分は、ｓｃＦｖである。
核酸は、天然、合成、またはそれらの組み合わせとすることができる。核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。タンパク質をコードする核酸は、公知の合成技術を使用して産生することが可能であり、十分に確立された方法を使用して適切な発現ベクタに組み込まれ、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、およびエレクトロポレーションなどの既知技術を使用して、タンパク質発現のために細胞に導入されるタンパク質コード発現ベクタを形成することができる。核酸は、単離され、十分な純度で得ることができる。通常、ＤＮＡまたはＲＮＡとしての核酸は、他の天然に存在する核酸配列を実質的に含まずに得られ、一般的には、少なくとも約５０％、通常少なくとも約９０％の純度であり、典型的には「組換え体」であり、例えば、天然に存在する染色体上には通常関わっていない１つまたは複数のヌクレオチドが隣接する。
核酸の発現は、それ自身、または当業者に公知の別の調節配列によって調節することができる。本発明の核酸は、当該技術分野で利用可能な種々の技術を使用して、適切な宿主細胞に導入することができる。発現されたタンパク質は、エクソソームまたは細胞外小胞を局在化または形成し、産生細胞から放出され得る。このようなエクソソームまたは細胞外小胞は、培地から回収することができる。同様に、選択されたタンパク質は、組換え技術を用いて産生してもよいし、それ以外の方法で得てもよく、次に、エレクトロポレーション、またはトランスフェクション、例えば、エレクトロポレーション、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションなどにより、単離されたエクソソームに直接導入されるようにしてもよい。
また、核酸は、プラスミド、またはウイルスベクタなどの発現ベクタ、または線状ベクタ、または染色体ＤＮＡに組み込まれるベクタを含むことができる。発現ベクタは、ベクタが１つまたは複数の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含むことができる。このような配列は、様々な細胞についてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適している。真核宿主細胞、例えば哺乳動物細胞において、発現ベクタは、宿主細胞染色体に組み込まれ、次に、宿主染色体と共に複製することができるか、または発現ベクタは、エピソームであって、宿主染色体とは独立して複製することができる。
また、発現ベクタは、選択マーカとも称される選択遺伝子を含有することができる。選択遺伝子は、選択培地で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードすることができる。選択遺伝子を含むベクタで形質転換されなかった宿主細胞は、選択培地中で生存することはない。選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完するタンパク質、または（ｃ）例えば、桿菌に対するＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子など、天然培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードすることができる。例示的な選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を利用することができる。異種遺伝子で首尾よく形質転換されたこれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生することができ、従って、選択レジメンを生き延びることができる。細菌または真核生物（哺乳動物を含む）系で使用するための他の選択可能なマーカは、当業者に周知である。
哺乳類の神経系細胞において導入遺伝子を発現することができるプロモータの例は、ＥＦ１ａプロモータである。プロモータの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。他の構成的プロモータ配列も使用可能であり、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳癌ウイルスプロモータ（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ、ＭＮＤプロモータ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサを有する修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含む合成プロモータ）、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン－バーウイルス前初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータのほか、限定されるわけではないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、伸長因子－１ａプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、およびクレアチンキナーゼプロモータなどのヒト遺伝子プロモータを含むが、これらに限定されるわけではない。プロモータは非構成的プロモータとすることができる。
また、誘導性または抑制性プロモータも、本発明における使用が考えられる。誘導性プロモータの例としては、メタロチオネインプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、テトラサイクリンプロモータ、ｃ－ｆｏｓプロモータ、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモータからの発現をテトラサイクリンオペレータの制御下に置くサーモフィッシャ（ThermoFisher）のＴ－ＲＥｘ系、およびイントレキソン（Intrexon）のレオスイッチ（RheoSwitch）プロモータが含まれる。
発現ベクタは、通常、転写開始の頻度を調節するためのプロモータ要素、例えばエンハンサを有する。これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置することができるが、多くのプロモータは、同様に開始部位の下流に機能的要素を含むことが示されている。プロモータ要素間の間隔は柔軟であることが多いので、要素が互いに逆になったり、相対的に動いたりするときに、プロモータ機能を保つことができる。発現ベクタは、モノシストロン性構築物、バイシストロン性構築物、または複数のシストロン性構築物であってもよい。バイシストロン性構築物の場合、２つのシストロンは、２つのシストロンの間に位置するシストロンの制御領域と反対方向に配向することができる。構築物が２つ以上のシストロンを有する場合、これらシストロンは、転写のために２つのグループが反対方向を向いた状態で、２つのグループに配置することができる。
本明細書に記載のポリペプチドを修飾することが望ましい。変異ポリペプチドを生成するために、所定の核酸構築物中に改変体を生成する多くの方法があり得る。このような方法には、部位特異的突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅、核酸を含む細胞の突然変異誘発剤または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、ライゲーションおよび／またはクローニングと併せて大きな核酸を生成）、およびその他の技術（例えば、Gillam and Smith, Gene 8:81-97, 1979; Roberts et al., Nature 328:731-734, 1987を参照されたいが、これは、あらゆる目的のために、参照によりその全体が組み込まれる）を含めることができる。本明細書に記載するポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択された生物または細胞系における核酸の翻訳を増強することが可能な好ましいコドンを提供するために修飾することができる。
また、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載する別のポリヌクレオチドと実質的に等価物（相同体）であるヌクレオチド配列を含むことができる。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、更により典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有することができる。一実施形態において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、遺伝コドンの縮重に起因して、同じタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドと同等であると考えることができる。このようなポリヌクレオチドが、本明細書において予測される。
また、核酸は、本明細書に列挙するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、更により典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体を提供することができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅、または合成）、またはＲＮＡとすることができる。タンパク質の類似体または変異体（即ち、１つまたは複数のアミノ酸が、野生型ポリペプチドと異なるように設計されている）をコードする核酸は、部位特異的突然変異誘発を用いるか、またはプライマが所望の点突然変異を有するＰＣＲ増幅を用いて産生することができる。適切な突然変異誘発技術の詳細な説明については、Sambrook et al., 分子クローニング：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、および/または分子生物学における最新のプロトコル, Ausubel et al., eds、Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y (1994)を参照されたいが、あらゆる目的のために、参照によりその全体が組み込まれる。また、当業者に周知の方法を使用する化学合成も、そのような核酸を調製するために使用することが可能であり、Engels et al., Angew Chem Intl Ed. 28:716-34, 1989（あらゆる目的のために、参照によりその全体が組み込まれる）によって記載された方法などがある。
変異体を生成するためのアミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、類似の構造的および／または化学的特性を有した別のアミノ酸、即ち同類アミノ酸置換で置換することで得ることができる。アミノ酸置換は、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または関与する残基の両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれる。
エクスビボで核酸を細胞に導入する場合、核酸は、任意の付加的な賦形剤に加えて、核酸の細胞への移動を促進する物質、例えば、リポソームまたはカチオン性脂質などの核酸を導入するための試薬と組み合わせることができる。約２０～１０００Ｖ／ｃｍの範囲の電圧を適用するエレクトロポレーションを、エクソソームに核酸またはタンパク質を導入するために使用することができる。限定するものではないが、リポフェタミン（Lipofectamine、登録商標）メッセンジャＭＡＸ（MessengerMAX、商標）トランスフェクション試薬、リポフェタミン（Lipofectamine、登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬、リポフェタミン（Lipofectamine、登録商標）３０００トランスフェクション試薬、またはプラス（PLUS、商標）試薬を併用するリポフェタミン（Lipofectamine、登録商標）ＬＴＸ試薬などのカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションも使用することができる。使用するトランスフェクション試薬の量は、試薬、サンプル、および導入する荷物と共に変化し得る。これに代えて、本発明の核酸を保持するベクタを使用することもできる。特に、適当なベクタによって保持された本発明の核酸を含有する生体への投与に適した形態の組成物は、インビボの遺伝子治療に適したものとすることができる。
核酸構築物には、リンカペプチドを含めることができる。リンカペプチドは、らせん立体配座、β鎖立体配座、コイルベンド立体配座、ターン立体配座を採用することができる。リンカモチーフは、柔軟なリンカ、硬質のリンカ、または切断可能なリンカとすることができる。リンカペプチドは、ペプチドの安定性または折りたたみを増加させるために使用することができ、立体クラッシュを避け、発現を増加させ、生物学的活性を向上させ、インビボで特定の部位へのターゲティングを可能にし、またはその受容体に対するターゲティングドメインの結合親和性を増加させることにより、得られた融合ペプチドの薬物動態を変化させることができる。本明細書中で使用する場合、折りたたみとは、ポリペプチドおよびタンパク質の三次元構造を形成する過程を意味し、このとき、アミノ酸残基間の相互作用が、構造を安定化するように作用する。非共有相互作用は、構造を決定する上で重要であり、タンパク質との膜接触の効果は、正しい構造にとって重要なものとなり得る。天然に存在するタンパク質およびポリペプチド、またはその誘導体および変異体について、適切な折りたたみの結果は、典型的には、最適な生物学的活性をもたらす配列であり、活性、例えばリガンド結合、酵素活性などについてのアッセイによって簡便にモニタすることができる。
リンカペプチドは、一般に、小さな非極性（Ｇｌｙ）または非極性（Ｓｅｒ）アミノ酸から構成することができる。リンカペプチドは、主としてグリシンおよび／またはセリン残基のストレッチからなる配列を有することができる。しかし、柔軟性を維持するために、ＴｈｒおよびＡｌａなどのアミノ酸のほか、溶解性を改善するために、ＬｙｓやＧｌｕなどの極性アミノ酸を付加することができる。別の場合においては、硬質のリンカは、(ＸＰ)ｎなどのプロリンに富む配列を有することが可能であり、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを示す。別の場合において、切断可能なリンカは、それぞれジスルフィドまたはプロテアーゼ感受性配列などの還元的または酵素的切断の影響を受けやすいものを使用することができる。いくつかの場合において、リンカペプチドは、蛍光タンパク質などのリポータ部分に連結することができる。リンカ配列の例としては、(Ｇｌｙ)８、(Ｇｌｙ)６、(ＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５）、(ＧＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～５） (ＥＡＡＡＫ)ｎ （ｎ＝１～３）、Ａ(ＥＡＡＡＫ)４ＡＬＥＡ(ＥＡＡＡＫ)４Ａ、(ＧＧＧＧＳ)ｎ （ｎ＝１～４）、(Ａｌａ－Ｐｒｏ)ｎ （１０－３４ ａａ）、ならびにＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＬＦＧ、およびＬＥなどの切断可能なリンカのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
また、核酸配列は、得られた融合タンパク質を小胞表面に選別するための認識配列として機能するシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含むことができる。シグナル配列は、チロシンベースの選別シグナルを含むことが可能で、ＮＰＸＹを含むことが可能であり、Ｎはアスパラギンを、Ｐはプロリンを、Ｙはチロシンを、Ｘは任意のアミノ酸（アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、またはチロシン）を表す。いくつかの場合において、シグナル選別モチーフは、ＹＸＸＯコンセンサスモチーフを含むことが可能であり、このとき、Ｏは、かさばる疎水性側鎖を有したアミノ酸残基を表す。いくつかの場合において、選別シグナルは、(ＤＥ)ＸＸＸＬ(ＬＩ)コンセンサスモチーフを含むことができるが、このとき、Ｄはアスパラギン酸を、Ｅはグルタミン酸を、Ｘは任意のアミノ酸を、Ｌはロイシンを、Ｉはイソロイシンを表す。いくつかの場合において、シグナル配列は、(ＤＥ)ＸＸＸＬ(ＬＩ)またはＤＸＸＬＬコンセンサスモチーフなどのジ－ロイシンベースのシグナル配列モチーフを含むことが可能であり、このとき、Ｄはアスパラギン酸を、Ｅはグルタミン酸を、Ｘは任意のアミノ酸を、Ｌはロイシンを、Ｉはイソロイシンを表す。いくつかの場合において、消化性シグナルは、酸性クラスターを含むことができる。いくつかの場合において、シグナルペプチドは、ＦＷに富むコンセンサスモチーフを含むことが可能であり、このとき、Ｆはフェニルアラニンを、Ｗはトリプトファンを表す。いくつかの場合において、シグナルペプチドは、プロリンに富むドメインを含むことができる。いくつかの場合において、選別シグナルは、コンセンサスモチーフＮＰＦＸ (１，２) Ｄを含み、このとき、Ｎはアスパラギンを、Ｐはプロリンを、Ｆはフェニルアラニンを、Ｄはアスパラギン酸を、Ｘは任意のアミノ酸を表す。いくつかの場合において、コードされたシグナルペプチドは、アダプタタンパク質複合体ＡＰ－１、ＡＰ－２、ＡＰ－３、およびＡＰ－４によって認識され得る。いくつかの場合において、ＤＸＸＬＬシグナルは、ＧＧＡとして知られる別のファミリのアダプタによって認識される。いくつかの場合において、シグナルペプチドは、ユビキチン化することができる。本発明の一実施形態において、シグナルペプチドは、免疫グロブリンκ鎖シグナルペプチド配列、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤである。別の実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトシグナル配列である。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、演算により設計されたシグナルペプチドである。好ましい実施態様において、シグナルペプチド配列は、ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡである。
細胞外小胞の産生
本明細書中の核酸のいずれかは、１つまたは複数のキメラ小胞局在化部分と、目的とする１つまたは複数のターゲティング部分とを含む融合タンパク質の細胞中での異種発現に使用することが可能であり、このとき、融合タンパク質は、細胞によって産生される細胞外小胞を局在化させるか、または細胞によって産生される細胞外小胞の不可欠な部分である。一実施形態において、小胞は、細胞外小胞またはエクソソームである。更に、キメラ小胞局在化部分をコードする１つまたは複数の核酸と、目的とするターゲティング部分をコードする１つまたは複数の核酸とを、細胞内での異種発現に使用して、機能的に連結された１つまたは複数のキメラ小胞局在化部分と、目的とする１つまたは複数のターゲティング部分とを産生させることが可能であり、このとき、ターゲティング部分は、目的のターゲティング部分またはキメラ小胞局在化部分の中にもともと存在するか、または共有結合している相互作用パートナまたは表面を介し、非共有結合相互作用によってキメラ小胞局在化部分と会合し、かつ目的のターゲティング部分とキメラ小胞局在化部分との両方が、細胞によって産生される小胞、好ましくは細胞外小胞もしくはエクソソームに存在するか、または当該小胞、好ましくは細胞外小胞もしくはエクソソームと会合する。
このような異種発現に使用され、小胞が単離され得る一般的なＧＭＰグレードの細胞には、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎細胞株）、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－ＨなどＨＥＫ２９３の変異体、樹状細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＨＴ－１０８０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、およびそれらのいずれかの変異体、ならびに以下のタイプの同種異系幹細胞株のいずれかが含まれる。即ち、骨髄ＨＳＣなどの造血幹細胞、骨髄ＭＳＣまたは胎盤ＭＳＣなどの間葉系幹細胞、ｈＥＳＣ由来樹状細胞またはｈＥＳＣ由来オリゴデンドロサイト前駆細胞などといったヒト胚性幹細胞もしくはその更に分化した子孫、神経幹細胞（ＮＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一実施形態において、異種発現に使用される細胞のいずれかは、小胞、特に目的とする１つまたは複数のターゲティング部分に機能的に連結された１つまたは複数のキメラ小胞局在化部分を含む細胞外小胞の供給源として機能することができる。好ましい実施態様において、異種発現に用いられる細胞のいずれかは、小胞、特に、目的とする１つもしくは複数のターゲティング部分と共有結合された１つもしくは複数のキメラ小胞局在化部分、または１つもしくは複数のキメラ小胞局在化部分と目的とする１つもしくは複数のターゲティング部分とを含む融合タンパク質を含む細胞外小胞の供給源として機能することができる。
本明細書中のポリペプチドのいずれかは、当該ポリペプチドを含む小胞を生成する細胞（または細胞株）によって産生することができる。これに代えて、ターゲティング部分は、小胞を産生する細胞によって異種発現させることができる。一実施形態において、小胞を産生する細胞は、キメラ小胞局在化部分およびターゲティング部分を発現し、このとき、ターゲティング部分は、非共有結合によりキメラ小胞局在化部分と会合し、ターゲティング部分およびキメラ小胞局在化部分の両方が小胞と会合する。一実施形態において、ターゲティング部分は、小胞の外表面または外側に示される。一実施形態において、ターゲティング部分とキメラ小胞局在化部分との非共有結合は、ターゲティング部分を含むポリペプチドと、キメラ小胞局在化部分を含む第２のポリペプチドとの間の相互作用する表面またはパートナによって媒介される。このような相互作用する表面またはパートナは、ターゲティング部分を含むポリペプチドと、キメラ小胞局在化部分を含む第２のポリペプチドとに、もともと存在するか、または導入することができる。非共有結合または相互作用を維持する分子力には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、および疎水結合が含まれる。
好ましい実施態様において、小胞を産生する細胞はまた、キメラ小胞局在化部分およびターゲティング部分を含む融合タンパク質を発現し、それらは、細胞によって産生される小胞、好ましくは細胞外小胞またはエクソソームに組み込まれた単一ポリペプチドにおいて共有結合される。一実施形態において、細胞外小胞またはエクソソーム産生細胞は、産生細胞（ＥＶまたはエクソソームのための）と考え得る。一実施形態において、複数のターゲティング部分を、単一のキメラ小胞局在化部分に結合させることができる。別の実施形態において、１つまたは複数のターゲティング部分に共有結合した複数のタイプのキメラ小胞局在化部分は、小胞に存在してもよいし、また小胞と会合してもよく、このとき、各タイプのキメラ小胞局在化部分は、少なくとも１つのアミノ酸によって異なる。一実施形態において、ターゲティング部分は、小胞の生合成の間、または小胞の分泌もしくは単離の前に、産生細胞によって小胞に結合される。別の実施形態において、ターゲティング部分は、小胞が産生および／または単離された後、小胞に結合される。
修飾された細胞外小胞は、被験体、被験体から得られた初代細胞培養細胞、細胞株（例えば、不死化細胞株）、およびその他の細胞源から得ることができる。特定のマーカを有する修飾された細胞外小胞を、いくつかの方法で作成することができる。そのような方法の１つは、これらの操作された細胞からの送達ビヒクルとして回収される修飾された細胞外小胞に組み込まれるターゲティング部分を発現するために、培養中に直接細胞を操作することを含む。修飾された細胞外小胞の産生のために使用される細胞は、必ずしも目的とする細胞標的に関連するものでも、由来するものでもない。ひとたび得られると、小胞を、その大きさ、生化学的パラメータ、またはそれらの組合せに基づいて単離することができる。直接的な細胞操作と併せて、または独立して使用できる別の方法は、被験体によって産生される全ての小胞の広範な全体的な集団からの、所望のターゲティング部分を有する修飾された小胞の特定のサブ集団（サブタイプ）の物理的単離である。前述の２つの方法と併せて、または独立して使用することができる別の方法は、小胞表面上への所望のターゲティング部分（例えば、タンパク質／ポリペプチド）の直接的な取り込みである。この方法では、細胞外小胞の全体的な集団または細胞外小胞の特定集団を、細胞培養から単離する。次に、単離された小胞を処理して、所望のターゲティング部分を小胞に組み込み（例えば、リポソーム融合）、修飾された小胞を生成する。なお、これらの方法は、様々な方法で組み合わせることができることに留意されたい。
例えば、このプロセスは、修飾小胞の産生のための細胞の直接的な操作とすることが可能であり、その後、標的修飾小胞サブ集団を単離する。
１．所望の修飾小胞を産生するように細胞を操作する例
小胞産生細胞は、１つまたは複数のターゲティング部分をコードする核酸を保持するプラスミドまたはウイルスなどの核酸でトランスフェクトすることができる。実験ステップは以下のとおりとすることができる。
ａ．最適な増殖条件で産生細胞株を培養する。
ｂ．１つまたは複数のターゲティング部分をコードする核酸を保持するプラスミドまたはウイルスベクタを調製する。１つまたは複数のターゲティング部分をコードする核酸は、既知のエクソソーム表面タンパク質（ＬＡＭＰ２など）などの小胞局在化部分をコードする核酸、またはキメラ小胞局在化部分（例えば、ＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメイン、およびＣＬＳＴＮ１などの異なる小胞局在化部分の細胞質ドメインと置換されるＬＡＭＰ２の細胞質ドメインなど）と連結して、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分と、１つまたは複数のターゲティング部分とを含む融合タンパク質を作成することができる。
ｃ．(ｂ)で作成した構築物によって、小胞産生細胞株をトランスフェクトする。トランスフェクションは、エレクトロポレーションまたはリポソームベースの核酸導入などといった様々な方法で行うことができる。トランスフェクションは、一過性または安定なトランスフェクションとすることができる。ＥＶ産生細胞株を発現する安定な標的タンパク質（ターゲティング部分）を確立するためには、受容細胞ゲノムへの標的配列の組み込みが必要となる場合がある。好ましい実施形態において、安定な融合タンパク質を発現するＥＶ産生細胞株が確立され、このとき、目的とする１つまたは複数のターゲティング部分と、１つまたは複数の小胞局在化部分、好ましくは１つまたは複数のキメラ小胞局在化部分とを含む融合タンパク質をコードして発現する核酸を、レシピエント細胞ゲノムに組み込むことにより、ＥＶに組み込まれて、目的とする１つまたは複数のターゲティング部分を提示する融合タンパク質を発現させる。
ｄ．次に、トランスフェクトされた細胞培養物を、更なるエクソソーム収集のために、ＦＢＳを含まずに化学的に規定された培地中で増殖させる。あるいは、トランスフェクトされた細胞培養物を、エクソソーム産生のために、バイオリアクタに播種することができる。
ｅ．一定期間（例えば、１日、２日、３日、４日）後に、通常のフラスコまたは皿培養物またはバイオリアクタ培養物から、馴化培地を採取する。
ｆ．調整培地から修飾小胞を単離する。エクソソームは、治療的使用に有用なエクソソーム、例えば、良好な安定性を有し、十分な純度の、無傷のエクソソームを得る任意のプロトコルを用いて、適切な生物学的試料から得ることができる。単離方法には、超遠心分離、限外濾過、ポリマベースのプルダウン、または免疫親和性ベースのプルダウンが含まれるが、これらに限定されない。所望のＥＶターゲティング部分に相補的な抗体、リガンド、受容体、および／またはアプタマを、標的ＥＶサブ集団への結合およびその後の単離のために、免疫磁気ビーズまたはロッドに連結することができる。これに代えて、別の免疫富化／単離技術を使用することが可能である。選択された抗体カクテルを用いてエクソソームを捕捉するために使用され得る免疫親和性捕捉技術の例には、免疫沈降、カラム親和性クロマトグラフィ、磁気活性化細胞選別、蛍光活性化細胞選別、接着に基づく選別およびマイクロ流体に基づく選別が含まれるが、これらに限定されない。抗体カクテル中の抗体は、単一の溶液中で、または同時にもしくは連続して使用される２つ以上の溶液中で、一緒に使用することができる。
２．表面にペプチドターゲティング部分（例えば、親和性ペプチドまたは本明細書に記載するペプチドターゲティング部分のいずれかを含む）を有する小胞を操作する例
ａ．ピューロマイシン耐性および／または蛍光タンパク質などの選択マーカを含む、哺乳動物発現ベクタなどの適切な発現ベクタを得る。
ｂ．アミノ末端シグナル配列、ペプチドターゲティング部分（本明細書に記載する親和性ペプチドおよび／またはペプチドターゲティング部分のいずれかなど）、および小胞局在化部分（好ましくはキメラ小胞局在化部分）を含み、更にエピトープタグおよびリンカを発現ベクタ内に含む融合タンパク質をコードする核酸をクローニングし、このとき、核酸は、発現ベクタのプロモータ／エンハンサの制御下に置かれる。融合タンパク質の例は、図１および図２に概略的に示した融合タンパク質のいずれかとしてもよく、後述の図に示されるアミノ酸配列を有する。
ｃ．必要に応じ、発現ベクタは、ウイルスベクタであってよく、このとき、得られた(ｂ)の発現ベクタは、標準的なプロトコルに従い、ウイルス粒子を産生するために使用することができる。
ｄ．この時点で(ｂ)の融合タンパク質をコードする核酸を含むようになった発現ベクタで、小胞産生細胞株をトランスフェクトする（または、ウイルス粒子の場合には感染させる）。トランスフェクションは、エレクトロポレーション、またはリポソームベースの核酸導入などといった様々な方法で行うことができる。トランスフェクションは、一過性または安定なトランスフェクションとすることができる。ＥＶ産生細胞株を発現する安定な標的タンパク質（マーカ）を確立するためには、受容細胞ゲノムへの標的配列の組込みが必要となる場合がある。
ｅ．次に、トランスフェクトされた細胞培養物を、更なるエクソソーム収集のために、エクソソーム除去ＦＢＳを有した完全培地上で増殖させる。あるいは、トランスフェクトされた細胞培養物を、エクソソーム産生のために、バイオリアクタに播種することができる。
ｆ．一定期間（例えば、１日、２日、３日、４日）後に、通常のフラスコまたは皿培養物またはバイオリアクタ培養物から、馴化培地を採取する。
ｇ．当業者に公知の、または本明細書に記載するいずれかの技術を用い、調整培地から修飾小胞を単離する。
３．細胞培養物からの一般的な小胞集団から特定のＥＶサブ集団を物理的に単離する例
この方法は、上述の方法と組み合わせるか、または非操作細胞株上で単独の方法として用いることができる。目的のマーカを保持する小胞サブ集団は、親集団から単離することができる。目的のマーカは、小胞、好ましくは細胞外小胞またはエクソソームの表面に示されるのが好ましい。実験ステップは以下の通りである。
ａ．小胞産生細胞株を、その増殖条件下において、化学的に定義された培地を用い、またはＦＢＳを含まずに化学的に定義された培地中で培養する。あるいは、小胞産生細胞株を、エクソソーム産生のためのバイオリアクタに播種することができる。
ｂ．一定期間（例えば、１日、２日、３日、４日）後に、通常のフラスコまたは皿培養物またはバイオリアクタ培養物から、馴化培地を採取する。
ｃ．調整培地から小胞を単離する。単離方法には、超遠心分離、限外濾過、ポリマベースのプルダウン、または免疫親和性ベースのプルダウンが含まれるが、これらに限定されない。
ｄ．免疫親和性ベースのプルダウンを用いて、親ＥＶ集団から修飾小胞サブ集団を単離する。所望のＥＶマーカに相補的な抗体、リガンド、受容体、および／またはアプタマを、標的ＥＶサブ集団への結合およびその後の単離のために、免疫磁気ビーズまたはロッドに連結することができる。これに代えて、別の免疫富化／単離技術を使用することが可能である。
４．小胞表面上の１つまたは複数の所望のターゲティング部分の直接的な組み込みの例
通常のフラスコ／皿培養物、またはトランスフェクトされた細胞もしくはトランスフェクトされない細胞のバイオリアクタ培養物から産生された親小胞もしくは小胞サブ集団は、表面上の所望の選択マーカと直接的に結合することができる。好ましい実施態様において、１つまたは複数のターゲティング部分は、小胞局在化部分、好ましくは本発明のキメラ小胞局在化部分と共有結合される。更なる実施態様において、１つまたは複数のターゲティング部分と、小胞局在化部分、好ましくはキメラ小胞局在化部分とを含む融合タンパク質は、シグナル配列を欠いている。一実施形態において、１つまたは複数のターゲティング部分とキメラ小胞局在化部分とを含む融合タンパク質は、本明細書に開示するもののいずれかであってもよいが、シグナルペプチドを欠いているのが好ましい。実験ステップは以下の通りである。
ａ．小胞を精製し、小胞をエレクトロポレーションに適した緩衝液中で交換する。
ｂ．小胞表面上のタンパク質またはポリペプチドの結合は、以下によって達成することができる。
ｉ．所望の選択的ターゲティング部分を有する小胞のエレクトロポレーション。所望の選択的ターゲティング部分の挿入／組み込みのために、制御された電気パルスにより、小胞表面膜上の領域を透過性にする。
ｉｉ．小胞は、その表面に所望の選択的ターゲティング部分を保持する特定のリポソーム（または脂質／タンパク質複合体）と融合することもできる。この融合を介し、選択的ターゲティング部分は、その後、リポソーム修飾小胞複合体の表面上に効果的に存在することになる。Sato et al., Sci. Reports 6:21933, DOI: 10.1038/srep21933 (2016)を参照されたいが、あらゆる目的のために、参照によりその全体が組み込まれる。また、小胞は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と融合することもできる。
ｉ．小胞は、アミコン（Amicon、登録商標）管内のＭＥＳおよびＮａＣｌの緩衝液中で、小胞をターゲティング部分と混合することにより、直接的にターゲティング部分と結合することが可能であり、このとき、ターゲティング部分は、小胞の表面上のタンパク質に結合することができる。その後、アミコン（Amicon、登録商標）管で遠心沈殿を行い、浮遊ペプチドを除去することができる。
修飾された小胞は、コレステロールまたは他のリン脂質の有無にかかわらず、ターゲティング部分と直接的に結合することができる。修飾小胞タンパク質混合物は、穏やかな混合およびインキュベーション、または数サイクルの凍結および解凍を介して生成することができる。
修飾小胞は、被験体（自己）または同種細胞系から得ることが可能な真核細胞に由来するものとすることができる。被験体は、任意の生体であってよい。被験者の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびこれらのトランスジェニック種が含まれる。小胞は、遠心分離、濾過、または親和性クロマトグラフィカラムを用いて、循環細胞から富化および分離することができる。
ペイロード
本明細書に記載する修飾小胞系、例えばエクソソームなどの修飾小胞を用い、標的細胞にペイロードを送達することができる。いくつかの例において、ペイロードは、小胞、例えば脂質二重層中に埋め込まれる。これに代えて、またはこれに加えて、ペイロードを、小胞または脂質二重層で囲むこともできる。
上述したように、修飾小胞上のターゲティング部分は、体内の修飾小胞を標的細胞に移動させ、ターゲティング部分は、標的細胞の認識および相互作用にも関与する。目的とするこれらのターゲティング部分を有する修飾小胞は、また、標的細胞への送達を増強するために、リポソームまたはアデノ随伴ウイルスベクタなどといった他の送達ビヒクルと会合または融合させることができる。Gyorgy, Bence, et al. Biomaterials 35 (2014)26:7598-7609を参照されたい。修飾小胞は、標的細胞に送達すべきペイロードを運ぶことができる。
ペイロードは、例えば、小分子、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、リガンド、受容体、レポータ、薬剤、またはそれらの組合せ（例えば、２つ以上の薬剤、または脂質と組合わせた１つもしくは複数の薬剤）とすることができる。ペイロードの例としては、例えば、治療用生物製剤（例えば、抗体、組換えタンパク質、またはモノクローナル抗体）、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、その他のＲＮＡ）、レポータ、脂質、炭水化物、核酸構築物（例えば、ウイルスベクタ、プラスミド、レンチウイルス、発現構築物、その他の構築物）、オリゴヌクレオチド、アプタマ、細胞毒性剤、抗炎症剤、抗原ペプチド、小分子、ならびに遺伝子治療用の核酸およびポリペプチドが含まれる。また、ペイロードは、標的細胞への送達のための補助タンパク質を有するウイルス核酸構築物（導入遺伝子をコードする）などの複雑な分子構造であってもよく、このとき、（必要に応じて）核酸構築物を、逆転写し、核に送達し、組み込む（または染色体外に維持する）ことができる。必要に応じ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳおよび適切なガイドＲＮＡを用い、所望の導入遺伝子を有する構築物を、標的細胞の染色体中の部位に特異的にターゲティングすることができる。ペイロードは、細胞外小胞内部膜空間に装填されてもよいし、細胞外小胞の脂質二重層表面に示されるか、または部分的もしくは完全に埋め込まれてもよい。
薬学的ペイロードおよび生物学的ペイロードの例としては、臓器の疾患および症候群を治療するための薬剤、細胞毒性剤、および抗炎症薬が含まれる。いくつかの場合において、ペイロードは、フェンレチニド、ドキソルビシン、メルタンシン（即ち、ＤＭ１）、もしくはイマチニブ（即ち、グリベック、ＳＴＩ－５７１）、またはそれらのいずれかの組合せとすることができる。
ＲＮＡペイロードの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡが含まれる。ノンコーディングＲＮＡペイロードの例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｙＲＮＡ、および転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）が含まれる。特に、ｍｉＲＮＡおよびｌｎｃＲＮＡは、ホメオスタシスおよび細胞シグナル伝達経路の強力な調節因子であり、ＥＶによるこのようなＲＮＡの送達は、標的細胞に影響を及ぼす可能性がある。
修飾小胞によって運ばれる処理ペイロードとしては、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＤＮＡアプタマ、癌遺伝子を阻害するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９療法、条件毒性を誘発する細胞毒性導入遺伝子療法、毒性タンパク質をコードするスプライススイッチングオリゴヌクレオチドまたは導入遺伝子などの核酸を含めることができる。いくつかの例において、ペイロードは、表４に列挙する核酸ペイロードとすることができる。
いくつかの場合において、ペイロードは、レポータ部分とすることができる。レポータは、間接的または直接的に検出可能な部分である。レポータとしては、発色団、蛍光体、蛍光タンパク質、発光タンパク質、受容体、ハプテン、酵素、および放射性同位元素を含むが、これらに限定されるものではない。
レポータの例としては、蛍光レポータ、生物発光レポータ、酵素、およびイオンチャネルの１つまたは複数が含まれる。蛍光レポータの例としては、例えば、オワンクラゲまたはウミシイタケ由来の緑色蛍光タンパク質、およびそれらの活性変異体（例えば、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質など）、ハイドロイドクラゲ、カイアシ類、クシクラゲ類、アンスロゾアス（Anthrozoas）、およびサンゴイソギンチャク由来の蛍光タンパク質、ならびにそれらの活性変異体、ならびにフィコビリタンパク質、およびその活性変異体が含まれる。化学発光レポータとしては、例えば、ＣＰＳＤ（ジソジウム３－(４－メトキシスピロ{１,２－ジオキセタン－３,２'－(５'－クロロ)トリシクロ[３.３.１.１３,７]デカン}－４－イル)フェニルホスフェート）、１,２－ジオキセタン基質に基づくβ－ガラクトシダーゼ、ＮＡ－Ｓｔａｒ（登録商標）基質に基づくノイラミニダーゼなどの小分子基質に基づく胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）が含まれ、これらは全てサーモフィッシャーサイエンティフック（ThermoFisher Scientific）から市販されている。生物発光レポータとしては、例えば、エクオリン（および他のＣａ＋２調節光タンパク質）、ルシフェリン基質に基づくルシフェラーゼ、セレンテラジン基質に基づくルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ、ガウシア（Gaussia）、およびメトリジナ（Metridina））、およびウミホタル由来のルシフェラーゼ、ならびにそれらの活性変異体が含まれる。いくつかの実施形態において、生物発光レポータとしては、例えば、北米ホタルルシフェラーゼ、日本ホタルルシフェラーゼ、イタリアホタルルシフェラーゼ、東ヨーロッパホタルルシフェラーゼ、ペンシルベニアホタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、鉄道ワームルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシア（Gaussia）ルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、メトリダ（Metrida）ルシフェラーゼ、ＯＬｕｃ、および赤色ホタルルシフェラーゼが含まれ、これらは全てサーモフィッシャーサイエンティフック（ThermoFisher Scientific）および／またはプロメガ（Promega）から市販されている。酵素レポータとしては、例えば、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、およびカタラーゼが含まれる。イオンチャネルレポータとしては、例えば、ｃＡＭＰ活性化カチオンチャネルが含まれる。また、リポータとしては、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）レポータ、単一光子放射コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）レポータ、光音響レポータ、Ｘ線レポータ、および超音波レポータを含めることもできる。
核酸ペイロードは、オリゴヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその他の方法で合成された核酸とすることができる。核酸は、標的細胞におけるＲＮＡのスプライススイッチングを引き起こし、標的細胞における異常な遺伝子発現をオフにし、標的細胞の染色体における異常な（変異した）遺伝子を、所望の配列をコードする遺伝子と置き換えることができる。置換核酸は、導入遺伝子全体であってもよいし、突然変異／異常遺伝子の短いセグメントであってもよく、突然変異配列を所望の配列（例えば、野生型配列）と置き換える。これに代えて、核酸ペイロードは、所望の結果を生じるために、標的細胞中の野生型遺伝子配列を所望の配列に変化させることができる。また、ペイロード核酸は、通常は発現されない標的細胞に導入遺伝子を導入することもできる。また、ペイロード核酸は、標的細胞のゲノムからの核酸の所望の欠失を引き起こすこともできる。
ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、またはジンクフィンガヌクレアーゼなどのペイロード核酸と共に、適切なゲノム編集システムを用いることができる。相同組換えおよび非相同組換えの効率は、標的化二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するゲノム編集技術により助長することができる。ＤＳＢ生成技術の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガヌクレアーゼ、または同等のシステムである。Cong et al. サイエンス 339.6121 (2013): 819-823、Li et al. Nucleic Acids Res. (2011)、Gaj et al. バイオテクノロジの動向 31.7 (2013): 397-405を参照されたいが、いずれも、あらゆる目的のため、参照によりその全体が組み込まれる。ペイロード核酸は、ゲノム中の所望の部位に組み込むことが可能であり（例えば、標的細胞の染色体中の核酸を修復または置換するために）、または導入遺伝子は、例えばＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１、ヒトＲＯＳＡ２６、またはＰＳＩＰ１遺伝子座などのゲノムセーフハーバ部位を含むゲノム中の所望の部位に組み込むことが可能である。
ペイロードの導入
ペイロードは、物理的操作を含むいくつかの方法を介して小胞に組み込むことができる。物理的操作方法には、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔性膜を介した押出、電流、およびそれらの組合せが含まれ、これらは小胞膜の破壊を引き起こす。本明細書に記載する小胞への荷物の装填には、混合、共インキュベーションなどの受動的装填プロセス、またはエレクトロポレーション、超音波処理、機械的振動、多孔性膜を介する押し出し、電流、およびそれらの組合せなどの能動的装填プロセスを含めることができる。いくつかの実施形態において、このような装填は、小胞のアセンブリと同時に行うことができる。
目的とするペイロードは、ペイロードとのインキュベーションによって小胞に受動的に装填され、濃度勾配に沿って小胞内に拡散できるようになる。薬剤分子の疎水性は、装填効率に影響を及ぼし得る。疎水性薬剤は、小胞膜の脂質層と相互作用し、小胞の脂質二重層内に薬剤を安定に詰め込むことができる。いくつかの実施形態において、緩衝液に懸濁された精製エクソソーム溶液を、ペイロードと共にインキュベートすることができる。いくつかの好ましい実施形態において、ペイロードは、ＤＭＳＯを含み得る溶媒混合物中に溶解され、エクソソームへの受動拡散を可能にする。これに続いて、ペイロード－エクソソーム混合物は、カプセル化されていないペイロードから遊離される。好ましい実施形態では、遠心分離またはサイズ排除カラムを用いて、上清から沈殿物を除去する。エクソソーム画分の溶解および除去の後、ＬＣ／ＭＳ方法を、エクソソームペイロード製剤におけるペイロードの測定および特性評価に用いることができる。
目的とする核酸を精製エクソソームと共にインキュベートし、適切な脂質ベースのトランスフェクション試薬の存在下で精製エクソソームのトランスフェクションを可能にすることができる。遠心分離を用いて懸濁液を精製し、トランスフェクトされたエクソソーム集団を単離することができる。次に、トランスフェクトしたエクソソームを標的細胞に加えるか、またはインビボで使用することができる。
ペイロードは、ペイロードを運ぶエクソソームを産生する細胞と共にインキュベートすることによって、細胞内に拡散させることができる。例えば、薬剤で処理された細胞は、当該薬剤が装填されたエクソソームを分泌することができる。前述の実施例において、パスクッチ（Pascucci）らは、ＳＲ４９８７間葉系間質細胞を、低用量のパクリタキセルで２４時間にわたって処理し、次に、細胞を洗浄し、新たな培地により、新たなフラスコ中でそれらを再播種した。４８時間の培養後、細胞馴化培地を採取し、エクソソームを単離した。処理細胞からのパクリタキセル装填エクソソームは、未処理細胞からのエクソソームと比較して、インビトロでＣＦＰＡＣ－１ヒト膵臓細胞に対して有意で強い抗増殖活性を有していた（Pascucci, L. et al., Journal of Controlled Release, 192(2014):262‐270）。
細胞から分泌された細胞外小胞は、ペイロードと混合した後、ホモジナイザプローブを用いて超音波処理することができる。ソニケータプローブからの機械的せん断力は、エクソソームの膜の完全性を損なわせ、その後、この膜変形の際に、薬剤、特に親水性薬剤をエクソソーム内に拡散させることができる。
別の実施形態では、細胞からの細胞外小胞をペイロードと混合することが可能であり、制御された温度下で、１００～４００ｎｍの多孔性膜を有するシリンジベースの脂質押出機に、混合物を装填することができる。エクソソーム膜は、押し出しの過程で破壊され、薬剤との激しい混合が可能となる。いくつかの例において、効果的な押し出しの回数は、薬剤をエクソソーム内に効果的に送達するために、１～１０回の範囲で変化させることができる。
目的とするペイロードは、室温で一定時間エクソソームと共にインキュベートすることができる。その後、薬剤の封入を確実にするために、凍結・解凍サイクルを繰り返す。この方法により、得られたエクソソームのサイズの範囲を広範なものとすることができ、その後、混合物は、－８０℃で、または液体窒素中で急速に凍結され、室温で解凍される。有効な凍結・解凍サイクルの数は、有効な封入のために、２～７の範囲で変化させることができる。別の実施形態では、エクソソームとリポソームとの間の膜融合が、凍結・解凍サイクルを介して開始され、エクソソーム模倣粒子を生成することができる。
別の場合には、導電性溶液中に懸濁したエクソソームに電界を印加することにより、エクソソーム膜に小孔を形成することができる。エクソソームのリン脂質二重層は、電流によって乱すことができる。その後、ペイロードは、小孔を介してエクソソームの内部に拡散することができる。次に、エクソソーム膜の完全性は、薬物装填処置の後に回復させることができる。いくつかの例において、この方法を用い、核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを、エクソソームに装填することができる。
いくつかの場合では、トレハロース二糖類などの最適化された緩衝液中でエレクトロポレーションを行い、構造的完全性の維持を助け、エクソソームの凝集を阻止することができる。
膜透過は、サポニンなどの界面活性剤を用いたインキュベーションにより開始することができる。いくつかの例において、親水性分子は、この処理によってエクソソームの封入を補助することができる。
化学に基づくアプローチは、共有結合を介してエクソソームの表面に分子を直接付着させるためにも用いることができる。いくつかの例において、銅触媒アジドアルキン環状付加は、Wang et al., 2015 and Hood et al., 2016（参照によりその全体が組み込まれる）に示されるように、エクソソームの表面への小分子および巨大分子の生体共役反応に使用することができる。
別の実施形態において、高度に特異的な抗体に結合した蛍光体およびマイクロビーズは、細胞表面上の特定の抗原に結合することができる。特異的抗原結合マイクロビーズは、インビボでのエクソソームの単離および追跡に用いることができる。
医薬組成物
本明細書中に開示する薬学的組成物は、本明細書中に記載するような、ペイロードを伴う（または伴わない）本発明の修飾細胞外小胞および／またはリポソームを、１つまたは複数の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含むことができる。このような組成物としては、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート化剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含めることができる。一実施形態において、組成物は、静脈内投与もしくは頭蓋内投与、または中枢神経系への鼻腔内投与のために処方される。本明細書に記載する組成物は、凍結乾燥ＥＶ（例えば、エクソソーム）を含むことができる。好ましい実施形態において、組成物は、ＥＶまたはエクソソームと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
薬学的組成物は、治療する（または予防する）疾患に適した方法で投与することができる。投与量および投与回数は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度などの要因により決定されるが、臨床試験により適切な投与量が決定される場合もある。
適切な薬学的に許容される賦形剤は、当業者に周知である。単なる一例として、賦形剤としては、界面活性剤、親油性ビヒクル、疎水性ビヒクル、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、およびリン酸二カルシウムが含まれるが、これらに限定されない。
組成物は、非経口投与、例えば注射または注入に適した公知の形態に処方することができる。組成物は、懸濁剤、防腐剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤添加物、ならびに保存中の有効期間を延長するための保存剤を含んでいてもよい。
対象の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、埋め込み、または移植を含む任意の都合のよい方法で行うことができる。本明細書に記載する組成物は、患者に対し、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または頭蓋内注射により、経動脈、皮下、舌下、皮内、節内、髄内、筋肉内、鼻腔内、動脈内、輸入リンパ管内に投与してもよいし、また腹腔内に投与してもよい。一実施形態において、本発明の組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。一実施形態において、本明細書に記載の修飾小胞組成物は、静脈内注射によって投与される。組成物は、血液－脳関門、血管関門、またはその他の上皮関門の通過を可能にする方法で投与することができる。
本発明のキット
本発明の別の実施形態によれば、キットが提供される。本発明のキットには、本発明の組成物（本発明の細胞外小胞、キメラ小胞局在化部分、融合タンパク質、および核酸を含む）のいずれかを含むパッケージが含まれる。
用語「パッケージ」とは、本明細書に示す組成物を収容する任意の容器を意味する。好ましい実施形態において、パッケージは、ボックスまたはラッピングとすることができる。医薬品の包装に使用するパッケージ材料は、当業者に周知である。医薬品のパッケージ材料の例には、ブリスタパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ（あらかじめ充填したシリンジを含む）、ボトル、ならびに選択された製剤、および意図された投与および処置の様式に適した任意の包装材料が含まれるが、これらに限定されない。
また、このキットには、パッケージ内には含まれていないが、パッケージ外に付随する物品、例えばピペットなども含めることができる。
キットは、必要に応じ、治療を必要とする状態の被験体に本発明の組成物を投与するための取扱説明を含んでいてもよい。また、キットは、米国食品医薬品局などの規制当局によって承認された本明細書中の組成物の成分の使用に関する指示を含んでいてもよい。キットは、必要に応じ、本組成物のための標識または製品挿入物が含まれていてもよい。パッケージおよび／または製品挿入物自体が、規制当局によって承認される場合がある。キットには、パッケージ中に固相の組成物または液相の組成物（提供された緩衝液など）を含むことができる。また、キットは、方法を実施するための溶液を調製するための緩衝液、および液体を１つの容器から別の容器に移すためのピペットを含むこともできる。
また、キットは、必要に応じ、本明細書に記載する組合せの療法で使用するための１つまたは複数の別の組成物を含んでいてもよい。特定の実施態様において、パッケージは、腫瘍内送達、腫瘍周囲送達、腹腔内送達、髄腔内送達、筋肉内注射、皮下注射、静脈内送達、動脈内送達、脳室内送達、胸骨内送達、頭蓋内送達、または皮内注射などの投与手段のいずれかのための容器である。
表１：キメラ小胞局在化部分を産生するために使用される好ましい小胞局在化部分についての核酸配列およびアミノ酸配列
＊ Genome Reference Consortium Human Build 38 Patch Release 13 (GRCh38.p13; GenBank assembly accession GCA_000001405.28、およびRefSeq assembly accession GCF_000001405.39)において収集された配列に基づく。なお、同一の小胞局在部分に関する複数のリストには、５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）以外で転写物が異なる場合（即ち、コード配列が異なる場合）、小胞局在部分の複数のアイソフォームが生じる可能性がある異なる転写物（異なるＥＮＳＴ数）が反映されていることに留意されたい。
表２：キメラ小胞局在化部分を産生するために使用し得る追加の小胞局在化部分
＃および＊ UniProt Release 2019_11(2019年12月11日)。なお、アミノ酸配列のほか、小胞局在化部分の機能的構造およびドメイン構造は、それぞれの受託番号のもとに見出すことができる。
＠ Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13 (GRC38.p13; GenBank assembly accession GCA_000001405.28 and RefSeq assembly accession GCF_000001405.39)におけるアセンブルされた配列に基づく。小胞局在化部分をコードする核酸配列は、ＥＮＳＴ番号と関連する配列内に見出すことができる。なお、その遺伝子記号またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号を介して参照される各小胞局在化部分と関連する複数のＥＮＳＴ番号は、小胞局在化部分の複数のアイソフォームを示す可能性がある。
表３：キメラ小胞局在化部分（または小胞局在化部分）、およびエピトープタグ、ならびに必要に応じてターゲティング部分としての親和性ペプチドを含む図１および図２の融合タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列
表４：核酸ペイロード
表５：キメラ小胞局在化部分の核酸配列およびアミノ酸配列％
％ アミノ酸配列は、図９～図１２に示されるものに対応している。表面ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインの位置については、図および図に関連する簡単な説明を参照されたい。
本明細書に開示する発明は、以下の実験の詳細から、更によく理解されるであろう。但し、記載する具体的な方法および結果が、添付する特許請求の範囲に更に完全に記載されている発明の単なる例示であることを、当業者は容易に認識するであろう。特に断らない限り、本発明は、特定の手順、材料などに限定されるものではなく、それらは変化し得るものである。本明細書で用る用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図していないことも理解されるべきである。
実施例
例１：細胞外小胞（ＥＶ）の産生と単離
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞は、振盪フラスコ内の、無血清培地懸濁培養液中に保持した。２×１０６細胞／ｍＬの培養密度に達すると、各々の振盪フラスコ培養物を、図１～図２に示すベクタ構築物に対応する個々のプラスミドでトランスフェクトし、ＰＥＩ（ＭＷ：２５０００～１ｍｇ／ｍＬ）を用いて、図３～図８または表３に示すアミノ酸配列を有する融合タンパク質を産生した。トランスフェクション試薬混合物を、最終的な所望の培養液量の１０％のＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）製の還元血清培地において、最終培養液量１ｍＬあたり１μｇのＤＮＡで、ＤＮＡに対するＰＥＩの比率を２：１として、標識試験管内で調製し、最終培養液量１ｍＬあたり２μｇのＰＥＩを得た。例えば、最終的な培養液量３０ｍＬに対し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭの培地３．０ｍＬを、ＤＮＡ３０μｇを有した１５ｍＬの試験管に加え、穏やかにボルテックスした。６０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬで）を、ＤＮＡ＋培地を有した１５ｍＬの各試験管に加える。混合物は、ＰＥＩの添加後、直ちに、３ｘ、３ｓずつボルテックスされる。混合物を、室温で１５分間インキュベートした後、直ちに、それぞれのフラスコに加える。インキュベータは、１２５ＲＰＭの振盪プラットホーム上で、８％のＣＯ２を有して３７℃に設定される。
２４時間のトランスフェクションの後、トランスフェクション培地を新鮮な培地と交換し、更に９６時間にわたり細胞を増殖させた。培地を交換してから９６時間後、培養物を５０ｍＬの円錐管に移し、３２２０×ｇで３０分間にわたり遠心分離した。これらの培養物の上清を、アミコン（Amicon、登録商標）の遠心濾過ユニット（１００ｋＤａカットオフ）に移し、濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した。次に、キャプト（Capto、商標）コア（Core）７００（サイティバ（Cytiva））サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）レジンを用いてＥＶを濾過し、非ＥＶ関連タンパク質を除去する。最後に、０．２２μＭの遠心フィルタカラムユニットを用いて、ＥＶを滅菌濾過する。
ＥＶまたは修飾ＥＶの産生に使用し得るその他の適当な細胞株としては、ＨＥＫ２９３もしくはその変異体であるＨＥＫ２９３－Ｆ（セロソウラス（Cellosaurus））、フリースタイル（FreeStyle、商標）２９３－Ｆ（サーモフィッシャー（ThermoFisher））ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ－Ｋ１、またはＨｓ２３５．Ｓｋ（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－７２０１（商標））が含まれる。更に、上述の一過性トランスフェクション法は、キメラ小胞局在化部分の発現ベクタ、またはターゲティング部分－キメラ小胞局在化部分融合タンパク質などのキメラ小胞局在化部分と、薬物選択マーカなどの選択マーカとを含む融合タンパク質の発現ベクタを共トランスフェクトすること、および目的のキメラ小胞局在化部分または融合タンパク質ならびに選択マーカの両方を発現する二重トランスフェクタントを得るための選択マーカを選択することによって、安定な細胞株を生成することができる。ＥＶは、このような安定なトランスフェクタントの培養培地から採取することが可能であり、このとき、ＥＶは、目的のキメラ小胞局在化部分または融合タンパク質で修飾することができる。
例２：ターゲティング部分を有する小胞の調製
目的とする１つまたは複数のターゲティング部分をコードする核酸をクローニングするために、カセットが作成される。カセットは、エクソソーム上に示すための、ＬＡＭＰ２またはＣＬＳＴＮ１小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分（例えば、親小胞局在化部分について天然に見出される順序でＣＬＳＴＮ１細胞質ドメインにフレームで結合したＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメイン、即ち、表面－膜貫通－細胞質ドメイン）をコードするポリヌクレオチド、膜挿入（例えば、小胞体への挿入）のためのＮ末端シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに、必要に応じ、エピトープタグ、グリコシル化配列、およびリンカ配列をコードするポリヌクレオチドであって、後者は、所望の場合に、例えば、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分とグリコシル化配列との間のリンカ配列、および／またはグリコシル化配列とエピトープまたはシグナル配列との間のリンカなどといった機能的配列を分離するポリヌクレオチドを含む。ターゲティング部分のオープンリーディングフレームが、シグナル配列、および小胞局在化ドメインまたはキメラ小胞局在化ドメイン、ならびに、必要に応じ、エピトープタグ、グリコシル化配列、およびリンカ配列のオープンリーディングフレームにフレームで結合されて、シグナル配列、目的のターゲティング部分、小胞局在化ドメインまたはキメラ小胞局在化ドメイン、ならびに、必要に応じてエピトープタグ、グリコシル化配列、およびリンカ配列を含む融合タンパク質に対する単一のオープンリーディングフレームを産生するように、目的のターゲティング部分をコードするポリヌクレオチドを、カセット内にクローニングする。
目的のターゲティング部分は、親和性ペプチドまたはｓｃＦｖ抗体であってもよく、親和性ペプチドまたはｓｃＦｖ抗体を介して特定の細胞型または組織に向けられるようにしてもよい。融合タンパク質の核酸は、構成的にまたは誘導的に融合タンパク質の発現を可能にするために、発現ベクタに挿入される。発現ベクタは、薬剤耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン、またはＧ４１８）、または蛍光タンパク質のための遺伝子（例えば、ＧＦＰ、およびその変異体）などの選択可能または検出可能なマーカを含むのが好ましい。目的のターゲティング部分と、小胞局在化ドメインまたはキメラ小胞局在化ドメインとを含む例示的な融合タンパク質は、図中に見ることができる。
ＨＥＫ２９３もしくはその変異体、ＨＥＫ２９３－Ｆ（セロソウラス（Cellosaurus））、フリースタイル（FreeStyle、商標）２９３－Ｆ（サーモフィッシャー（ThermoFisher））ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ－Ｋ１、またはＨｓ２３５．Ｓｋ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－７２０１（商標））などの細胞株は、所望のマーカを有したカセットを含むベクタでトランスフェクトされる。陽性トランスフェクタントは、フローサイトメトリまたはその他の細胞選別方法によって得られる。別の場合において、陽性トランスフェクタントは、抗生物質選択を介して富化される。トランスフェクトされた細胞は、エクソソームを除去した培地、またはエクソソーム単離に適した化学的に定義された培地で増殖させる。培養期間の後、調整培地からＥＶが単離される。
調整培地中の細胞は、いずれも、遠心分離および濾過によって除去され、清澄培地中のＥＶが、限外濾過を用いて濃縮される。濃縮後、適切なカラム（例えば、セファクリル（Sephacryl）Ｓ－３００、キャプト・コア（Capto-Core）７００など）を用いた液体クロマトグラフィにより、エクソソームを単離する。
例３：インビボでの取り込み調査のために、蛍光色素で化学的にＥＶを標識し、定量分析のために、ＥＶの特性評価／マーキングを行うためのプロトコル
蛍光色素または蛍光タンパク質で標識された細胞外小胞は、溶液中のＥＶおよびＥＶの細胞への取り込みの追跡を可能にし、後者は、細胞によるＥＶの取り込みを示す細胞への蛍光色素または蛍光タンパク質の移動をもたらす。このような標識ＥＶは、ＥＶの表面上のターゲティング部分が、１つの細胞型を、別の細胞型よりも優先的にターゲティングする有効性を評価するのに有用である。
ＥＶのボディピ（Bodipy）標識：
１．ボディピ（Bodipy）－ＴＲセラミドの調製
凍結乾燥ボディピ（BODIPY）－ＴＲセラミド（２５０μｇ、７０５．７０８５ダルトン）を３５４．２５３９μＬのＤＭＳＯ中で、最終ストック濃度１ｍＭまで再懸濁する。
２．ボディピ（Bodipy）標識
ａ．単離したＥＶにＰＢＳを加え、各サンプルの最終容量を最大１ｍＬとする。
ｂ．１ｍＬのＥＶ試料に２０μＬのボディピ（Bodipy）ストック溶液（１ｍＭ）を加えて混合する。ＥＶサンプル中の最終色素濃度は２０μＭである。
ｃ．３７℃で１時間インキュベートする（遮光）。
３．ＥＶサンプルからの遊離ボディピ（Bodipy）クリーンアップ
ａ．インキュベーション終了時に、事前に洗浄された０．２２μｍ、３３ｍｍのＰＥＳ ＰＢＳマイレクス（Millex）フィルタを介して、ボディピ（Bodipy）ＥＶを濾過する。
ｂ．ボディピ（Bodipy）－ＥＶ溶液を、事前に洗浄（１Ｘ滅菌ＰＢＳ洗浄液）されたアミコン（Amicon）４ １００ｋＤａ内にピペットで入れる。
ｃ．３ｘ緩衝液交換（３０００ｇ、７分間）を行う。注意：膜や産生物を乾燥させ、更なる損失が生じるので、過度にスピンさせないこと。
ｄ．採取チャンバに滅菌ＰＢＳを加え、容量を０．５ｍＬにする。
ｅ．Ｐ２００を用い、膜ピペットの産生物から溶液を穏やかに洗い流す。
ｆ．０．２２μｍ、３３ｍｍのＰＥＳマイレクス（Millex）フィルタを介し、ボディピ（Bodipy）ＥＶサンプルを濾過する。
４．ボディピ（Bodipy）ＥＶの特性評価
ａ．吸収スペクトル測定を介してＥＶ標識の効率を分析する。
ｂ．ＮＴＡ測定により粒子濃度を分析する。
ｃ．ＥＶを４℃の暗所で保存する。
化学色素によるＥＶの標識の代わりとして、ＥＶは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変異体、またはタンパク質レポータなどの蛍光タンパク質融合物の使用により標識することができる。この代替法は、多くの場合、小胞局在部分－タンパク質レポータ遺伝子構築物を生成するための融合タンパク質の生成、およびエクソソームを得るためのこれら融合タンパク質の細胞発現を含む。
例４：骨格筋細胞によるＥＶ取り込みの蛍光に基づく解析のためのプロトコル
ＥＶ標的特異性を決定するために、ターゲティングＥＶ（ＴＥＶ）が調製され、当該ターゲティングＥＶは、蛍光標識されたＥＶの外部表面に示されるターゲティング部分を含み、２つの異なった細胞型を含む細胞共培養に曝露され、その中の１つが第２の蛍光色素で標識され、ターゲティング部分によって標識化される細胞マーカを発現する。細胞ベースのインビトロ取り込みアッセイを用い、細胞型または組織をターゲットとする目的のターゲティング部分（ターゲティングＥＶ、即ちＴＥＶ）を含むＥＶを評価する。蛍光色素で標識され、骨格筋標的タンパク質（即ち、骨格筋マーカタンパク質）を含有する骨格筋細胞株と、骨格筋細胞標的を含有しない陰性細胞株とを共培養する。共培養における両細胞型が、単独培養におけるそれらの機能的能力を表すことを確認するために、細胞生存率は、２４時間後に９５％を上回ることが確認され、密集度が４０～９０％の間にあることが確認される。次に、その共培養物に、所定の期間、ＥＶを「投与」する。ＥＶは、ニコチン性アセチルコリン受容体のｓｃＦｖ、またはニコチン性アセチルコリン受容体をターゲットとする３／５α－コノトキシンおよび誘導体などといった、骨格筋に見出されるニコチン性アセチルコリン受容体をターゲットとするターゲティングモチーフで操作されている（例えば、Tsetlin, V. and Kasheverov, I. (2014) ニコチン性アセチルコリン受容体に関する研究におけるペプチドおよびタンパク質神経毒ツールボックス In T. Heinbockel (Ed.), Neurochemistry, IntechOpen, DOI: 10.5772/58240、およびLebbe, E. K. M. et al. (2014) ニコチン性アセチルコリン受容体をターゲットとするコノトキシン: An Overview Mar. Drugs 12:2970-3004、およびMcIntosh, J. et al. (1999) 特定のニコチン性アセチルコリン受容体サブタイプをターゲットとするイモガイペプチド Ann. Rev. Biochem. 68:59-88を参照のこと）。この受容体は、骨格筋細胞株にのみ存在するが、陰性細胞株には存在しない。細胞取り込みは、蛍光色素を投与する前にＥＶを標識し、次にフローサイトメトリを介して蛍光を測定することによって評価され、同時に、標識された骨格筋細胞を陰性細胞系から区別することが可能となる。
１．細胞共培養の調製（アッセイの２４時間前）
ａ．セルトラッカー（CellTracker、商標）バイオレット（Violet）ＢＭＱＣの調製
ｉ．使用前に１０分間、室温でセルトラッカー（Cell Tracker、商標）バイオレット（Violet）ＢＭＱＣ色素を解凍する。
ｉｉ．５９μＬのＤＭＳＯを加え、５ｍＭのストック濃度を得て、ボルテックスおよびスピンを行う。
ｉｉｉ．４０μＬのセルトラッカー（CellTracker、商標）バイオレット（Violet）ＢＭＱＣを、４０ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ高グルコース＋１０％ＦＢＳ）に加え、５μＭの作業濃度とする。
ｂ．共培養系のための細胞標識（２細胞株共培養系において一方の細胞株のみを標識）
ｉ．Ｈｓ２３５．Ｓｋ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－７２０１（商標））細胞、またはＨｓｋＭＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－９５０－０１０（商標））細胞のための既存の細胞培地を除去し、それぞれのＴ－１７５に、２０ｍＬのセルトラッカー（CellTracker、商標）バイオレット（Violet）ＢＭＱＣを含有する培地を加え、３７℃で４５分間インキュベートする。
ｃ．共培養システムの設置
ｉ．セルトラッカー（CellTracker、商標）バイオレット（Violet）ＢＭＱＣ標識細胞（Ｈｓ２３５．Ｓｋ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－７２０１（商標））、またはＨｓｋＭＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－９５０－０１０（商標）））と、非標識細胞（ＨＥＫ２９３）との両方を、トリプシン（Trypsin）－ＥＤＴＡで採取する。注意：過剰な共培養培地（ＤＭＥＭ低グルコース＋１０％ＦＢＳ）を加え、積極的にピペットして単一細胞懸濁液とすること。
ｉｉ．細胞計数器の下でトリパンブルー染色を用い、細胞の生存率を計数し測定する。
ｉｉｉ．６ウェルプレートの各ウェルに、所望の濃度（単培養では３．４Ｅ５細胞、共培養では各細胞株の１．７Ｅ５細胞）で、細胞を平板培養する。各サンプルは共培養で２反復、単培養で１反復とする。
ｉｖ．実験前に、共培養を一晩増殖させる。
２．ボディピ（Bodipy）標識ＥＶと細胞共培養とのインキュベーション
ａ．適切な培地（ＤＭＥＭ低グルコース＋１０％ＦＢＳ）中に、１ｍＬのボディピ（Bodipy）－ＥＶ製剤を調製し、ウェルごとに作業濃度（１．０２Ｅ９粒子／ｍＬ）を有するようにする。
ｂ．培地を除去し、６ウェルプレートの各ウェルに、１ｍＬのボディピ（Bodipy）－ＥＶ／培地を加える。
ｃ．所望の時間（即ち、この実験では１時間および２時間）にわたってインキュベートする。
ｄ．トリプシン（Trypsin）ＥＤＴＡで細胞を採取する。
ｅ．細胞を微量遠心管に移す。細胞を３０００ｒｐｍで７分間回転させ、培地を吸引する。
ｆ．１ｍＬの氷冷ＰＢＳで細胞を洗浄する。５分間３０００ｒｐｍで細胞を回転させ、ＰＢＳを除去する。
ｇ．２００μＬのＰＢＳ中に細胞を再懸濁する。これで、細胞は、フローサイトメトリ解析の準備が整う。
例５：骨格筋細胞へのインビトロでの小胞送達
ＥＶは、培養ＨＥＫ２９３細胞の馴化培地上清から得られる。ＥＶは、超遠心分離（一般的なＥＶ集団を富化するためのサイズを選択）を用いて単離される。ＥＶは、例８に記載されているように、レポータ（例えば、ＣＰＳＤ）、またはレポータ（例えば、ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡが装填される。
Ｈｓ２３５．Ｓｋ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－７２０１（商標））などの骨格筋細胞株を、集団に成長させ、その後、レポータを有したＥＶを骨格筋細胞株に加える。骨格筋Ｈｓ２３５．Ｓｋ細胞をＥＶと共にインキュベートした後、余剰なＥＶを洗い流す。次に、細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＥＶからレポータを得た細胞を同定する。細胞へのＥＶ送達は、細胞内のレポータ活性によって同定される。
例６：骨格筋細胞へのインビボでの小胞送達
ＥＶは、Ｈｓ２３５．Ｓｋ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－７２０１（商標））の培地から得られる。ＥＶは、超遠心分離（一般的なＥＶ集団を富化するためのサイズを選択）を用いて単離される。ＥＶは、例８に記載されているように、レポータ（例えば、ＣＰＳＤ）、またはレポータ（例えば、ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡが装填される。本研究では、動物モデルＢ６．１２９Ｘ１－Ｎｆｅ２１２ｔｍ１Ｙｗｋマウスを用いた。
Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｎｆｅ２１２ｔｍ１Ｙｗｋマウスには、レポータＣＰＳＤを含有するＥＶが注入される。２４時間後、マウスを殺し、動物の骨格筋細胞を蛍光顕微鏡で調べる。骨格筋組織へのＥＶ送達は、骨格筋細胞におけるレポータ活性によって同定される。
例７：細胞培養産生からのＥＶ収量の評価
目的のターゲティング部分を提示するエクソソームは、本明細書に記載するように操作される。単離されたエクソソームの数は、ナノ粒子追跡分析を用いて定量される。
ＮＴＡ測定が、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）３．３分析ソフトウェア（マルバーンパナリティカル（Malvern Panalytical））を装備したナノサイト（NanoSight）ＮＳ３００装置により得られる。試料は、機器の線形範囲内の粒子数（１回にスクリーン上の２０～１５０個の粒子）を達成するために希釈される。サンプルは、ナノサイトサンプルアシスタント（NanoSight Sample Assistant）を用いてロードされ、１回の実行で最大９６個のサンプルの測定を自動化する。ゆっくりとした一定の流れで流れる各サンプルの３０秒間のビデオが、複数得られる。次に、これらの測定結果をバッチプロセス関数を用いて分析する。
例８：目的のマーカを保持する操作されたエクソソームへのペイロードの導入
エクソソームは、骨格筋マーカに向けられるターゲティング部分、例えば、骨格筋マーカに見出されるニコチン性アセチルコリン受容体の１つまたは複数のサブユニット（例えば、α１β１δε（成人）およびα１β１γδ（胎児）ｎＡＣｈＲ。Tsetlin, V. and Kasheverov, I. (2014) ニコチン性アセチルコリン受容体に関する研究におけるペプチドおよびタンパク質神経毒ツールボックス In T. Heinbockel (Ed.), Neurochemistry, IntechOpen, DOI: 10.5772/58240、Lebbe, E. K. M. et al. (2014) ニコチン性アセチルコリン受容体を標的とするコノトキシン: An Overview. Mar. Drugs 12:2970-3004)、およびMcIntosh, J. et al. (1999) 特定のニコチン性アセチルコリン受容体サブタイプを標的とするイモガイペプチド Ann. Rev. Biochem. 68:59-88を参照）として、ｓｃＦｖまたは親和性ペプチドなどの骨格筋マーカのターゲティング部分を組み込むように操作される。これに代えて、エクソソームは、以下のターゲティング部分、即ちＥＮＯ２、ＪＳＲＰ１、ＶＡＰＡ、ＴＭＯＤ１、またはその機能的断片のいずれか１つを含むように操作される。操作されたまたは単離されたエクソソームまたはＥＶには、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、導入遺伝子、またはｍｉＲＮＡが装填される。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２０６、およびｍｉＲ－４９９からなる群から選択することができる。あるいは、操作されたまたは単離されたエクソソームに、フェンレチニドが装填される。次に、装填されたエクソソームは、肥満被験者のインスリン抵抗性の改善、および／または被験者の肥満の減少のために用いられる。
約３００μｇ（約１×１０７のエクソソームから）の投入量のエクソソームタンパク質を、５０μＬの滅菌ＰＢＳ中に懸濁させる。エクソソーム、１０μＬのＥｘｏ－Ｆｅｃｔ試薬、および目的の核酸（２０ｐｍｏｌのｓｉ／ｍｉＲＮＡ、１μｇのｍＲＮＡ、または５μｇのプラスミドＤＮＡ）からなる反応混合物を一緒にして、反転により混合する。トランスフェクション溶液を、振盪器中において３７℃で１０分間インキュベートした後、氷上に置く。反応を止めるために、キットに付属のＥｘｏＱｕｉｃｋ－ＴＣ試薬３０μＬを、エクソソームサンプル懸濁液に加え、反転により混合する。トランスフェクトしたエクソソームサンプルを氷上に３０分間置く。サンプルを１３０００～１４０００ｒｐｍで遠心分離し、エクソソームをペレット化する。次に、トランスフェクトされたエクソソームをＰＢＳ中に再懸濁し、標的細胞に加えるか、または更なる用途のためにインビボで用いることができる。
これに代えて、エクソソームを、ターゲティング部分と、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分とを含む融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３または操作された細胞から単離するようにしてもよい。サンプルの単離ＥＶは、ＰＢＳ緩衝液において、２．１０Ｅ＋１１粒子／ｍＬの濃度で調製される。フェンレチニド（セレックケミカル（Selleck Chemicals）：カタログＮｏ：Ｓ５２３３）を、１００％のＤＭＳＯ中に溶解させた。フェンレチニド／ＤＭＳＯストック溶液は、５ｍＭまたは１０ｍＭとすることができる。フェンレチニドをＥＶに導入することにより、フェンレチニド（フェンレチニド－ＥＶ、別名フェン－ＥＶ、ＥＶ－フェン、またはＥＶ－フェンレチニド）を含むＥＶを得て、ＥＶに組み込まれていない小胞外（ＥＶとは関連しない）フェンレチニドからフェンレチニド－ＥＶを精製するためのプロトコルは、以下のとおりである。
Ａ．エクソソーム／原薬インキュベーション
１．ＥＶサンプルをＰＢＳで希釈し、１ｍＬあたり約２．１０Ｅ１１個の粒子の最終ＥＶ濃度とした。
２．２０００μＬのエクソソーム溶液ごとに、１００％のＤＭＳＯの中に１０ｍＭのフェンレチニド１２８．６７μＬを加え、適切なチューブフォーマットで、１Ｅ９ＥＶに対する原薬（フェンレチニド）質量（μｇ単位）の計数比が、１．２になるようにした。（本サンプルの最終ＤＭＳＯ濃度は、全容積の約６％であった。）
３．ＥＶは、薬液と共に、室温で数回上下させたピペットで混合し、延長インキュベーションは行わず、その後、直ちに以下のクリーンアップステップに従って処理した。
Ｂ．コーニング（Corning、登録商標）コスター（Costar、登録商標）スピンＸ（Spin X、登録商標）（０．２２μｍセルロースアセテート膜フィルタ）、大型薬剤物質除去用遠心管フィルタ
１．２０００μＬのフェンレチニド－ＥＶサンプルを、０．５ｍＬの４つのスピンＸ（SpinX、登録商標）フィルタ（コーニング（Corning、登録商標）コスター（Costar、登録商標）、ＶＷＲ，２９４４２－７５２；０．２２Ｊｌｍ酢酸セルロース膜フィルタ）に分割し、１０００×ｇで遠心濾過した。
２．サンプルをプールし、約２ｍＬの容量を得て、プロセス中の分析のために、濾過前および濾過後にアリコートを採取した。
Ｃ．遊離した／取り込まれない薬剤除去用のアミコン（Amicon、登録商標）ウルトラ（Ultra）－１５遠心フィルタ
１．１００ｋＤａアミコン（Amicon、登録商標）ウルトラ（Ultra）－１５濃縮管（シグマ／ミリポア（Sigma/Millipore）、ＵＦＣ９１００２４）をすすぐために、５ｍＬの１ｘＰＢＳ緩衝液を加え、３２２０×ｇで５分間遠心分離した。フロースルーは除去した。
２．（洗浄１）各濃縮管に、１３ｍＬの１ｘＰＢＳを加えた。２ｍＬの濾過したフェンレチニド－ＥＶサンプルを濃縮管に加え、約０．５ｍＬに濃縮するまで、サンプルを３２２０×ｇで遠心分離した。フロースルーは廃棄した。
３．（洗浄２）各濃縮管に、１４ｍＬのＰＢＳを加え、ピペットでよく混ぜた。濃縮管を、３２２０×ｇで遠心分離にかけ、サンプルを約０．５ｍＬまで濃縮した。フロースルーは廃棄した。
４．（洗浄３）各濃縮管に、１４ｍＬのＰＢＳを加え、ピペットでよく混ぜた。濃縮管を、３２２０×ｇで遠心分離にかけ、サンプルを約０．５ｍＬまで濃縮した。フロースルーは廃棄した。
５．Ｐ２００ピペットマン（Pipetman、登録商標）を用い、各濃縮管の濃縮膜を、濃縮サンプルですすいだ。フェンレチニド－ＥＶサンプルを、０．２２μｍのスピンＸ（Spin-X）フィルタに移し、１０００×ｇで５分間遠心濾過することにより、最終的な滅菌サンプルを得た。
Ｄ．取り込み後のＱＣ測定基準
１．薬剤定量：最終的な薬剤物質量、濃度、および取り込みは、最終的な薬剤封入ＥＶサンプルから定量した。プレートリーダ（シナジー（Synergy）Ｈ１Ｍ，バイオテック（BioTek）を使用）からの吸収スペクトルを用い、以下のステップにより最終的な薬剤定量を行った。
ａ．最終的なフェンレチニド－ＥＶサンプルを、ＰＢＳ中で１ＯＸ希釈し、２００μＬをＵＶ透過プレート（コーニング（Corning）、カタログＮｏ３６３５）に装填した。
ｂ．標準曲線は、当該標準曲線を作成するために、ＤＭＳＯ／ＰＢＳ（５０：５０）溶液中でフェンレチニド／１００％ＤＭＳＯストックの２段階希釈（約１２５μＭから０．５μＭ）を行うことによって作成された。フェンレチニド／ＤＭＳＯ／ＰＢＳ標準曲線サンプルも、ウェル内に２００μＬを有していた。
ｃ．バイオテック（BioTek）のシナジー（Synergy）Ｈ１プレートリーダにより、吸収スペクトルを測定した（２５０～８００ラン範囲）。
ｄ．フェンレチニド／ＤＭＳＯ／ＰＢＳサンプルから作成した標準曲線からの線形適合を用い、フェンレチニドＥＶサンプル中のフェンレチニド濃度を補間した。
２．サイズ測定：サンプルをナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）ナノサイト（NanoSight）ＮＳ３００（マルバーン（Malvern））上で流し、約１μＬ～１０００μＬの範囲のサンプル体積を用いてＥＶ粒子サイズ分布と計数を求めた。
１１８．２μｇのフェンレチニドを、封入効率２４．９％でＥＶ（２．０Ｅ１１粒子）内部に取り込み、ＰＢＳに最終濃度６０４μＭのフェンレチニド－ＥＶを獲得することができる。
目的のペイロードを細胞外小胞に装填するための上述の２つの方法に加えて、当該技術分野には、エレクトロポレーション、超音波処理、サポニンによる透過化、凍結・解凍周期、Ｃａ２＋法、ｐＨ勾配法、脂質小胞融合、機械的振動、多孔性膜を介する押し出し、電流、およびそれらの組み合わせを含め、目的のペイロードを装填するためのその他の方法が豊富にある。
例９：キメラ小胞局在化部分の構築
細胞外小胞に局在化する際の小胞局在化部分の性能を改善するために、キメラ小胞局在化部分を、図１および図２に模式的に示したように構築した。ベクタ９１構築物をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に導入すると、当該ベクタ９１構築物は、アミノ末端からカーボキシル末端までを、シグナル配列（改善された発現と小胞体会合のため）－グリコシル化部位（融合タンパク質の安定化のため）－表面ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインを有する成熟ＬＡＭＰ２（リソソーム関連膜タンパク質２）タンパク質（エクソソソームへの局在化のため）の順で含む融合タンパク質を産生する。なお、使用した成熟ＬＡＭＰ２タンパク質は、天然シグナル配列を欠いており、最初の２８アミノ酸は、通常、新生ＬＡＭＰ２タンパク質のＮ末端に見出されるが、小胞体などの細胞膜との会合に続いて除去され、その結果得られる処理された成熟ＬＡＭＰ２形態がエクソソームと会合して見出されることに留意されたい。融合タンパク質は、更に、ペプチドリンカを含んでいてもよい。グリシンおよびセリンアミノ酸に富むこのようなペプチドリンカは、シグナル配列、グリコシル化部位、およびＬＡＭＰ２タンパク質の間に見出すことができる。更に、場合によっては、シグナル配列とグリコシル化部位との間に、エピトープ配列（３ｘＦＬＡＧエピトープタグに対応するものなど）および親和性ペプチド配列を見出すことができる。適切な親和性ペプチドの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）のターゲティング部分またはペプチドであるＴＨＲＰＰＭＷＳＰＶＷＰ（配列番号：６４）、およびグリピカン－３（ＧＰＣ３）のターゲティング部分またはペプチドであるＴＨＶＳＰＮＱＧＧＬＰＳ（配列番号：６６）が含まれるが、これらに限定されない。このＬＡＭＰ２融合タンパク質は、１つの親小胞局在化部分として機能する（成熟ＬＡＭＰ２タンパク質（その天然ＬＡＭＰ２シグナルペプチド配列を欠く）を含む融合タンパク質の模式図については、図１、ベクタ＃９１を参照、産生されるＬＡＭＰ２融合タンパク質の配列については、図３、ベクタ＃９１を参照、表面ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するが、その天然シグナル配列に対応する最初の２８アミノ酸を欠く成熟ＬＡＭＰ２タンパク質の配列については、図９、ベクタ＃９１を参照）。図９～図１２または表５では、図３～図８または表３に示された融合タンパク質の配列から、表面ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を抽出し、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分アミノ酸配列のみを示すようにしている。表面ドメイン（イタリック体の文字）は、膜貫通ドメイン（イタリック体の太字）の前にあり、当該膜貫通ドメインは、表面ドメインと細胞質ドメイン（イタリック体の下線付き文字）との間にあって、これら２つのドメインを接続している。
図１のベクタ＃１１２について模式的に示すように、第２の親小胞局在化部分を、成熟ＣＬＳＴＮ１タンパク質コーディング配列により構築した。成熟ＣＬＳＴＮ１タンパク質コーディング配列は、新生完全長ＣＬＳＴＮ１タンパク質コーディング配列の最初の２８コドンを欠いており、新生ＣＬＳＴＮ１タンパク質の最初の２８アミノ酸は、その天然ＣＬＳＴＮ１シグナル配列に相当し、これは、新生タンパク質が小胞体と会合し、最終的にこの処理された成熟ＣＬＳＴＮ１タンパク質が多胞体（ＭＶＢ）から分泌される前に腔内小胞に取り込まれると、通常除去される（Hanson, P. I. and Cashikar, A. (2012) 多胞体形態形成 Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 28:337-362l、およびHessvik, N. P. and Llorente, A. (2018) エクソソームの生合成と放出に関する現在の知見 Cell. Mol. Life Sci. 75:193-208）。成熟ＣＬＳＴＮ１タンパク質の一次アミノ酸配列は、成熟ＬＡＭＰ２タンパク質と同様に、完全長新生ＣＬＳＴＮ１タンパク質（完全長新生ＬＡＭＰ２タンパク質と同様）とは、天然シグナル配列、即ち完全長新生タンパク質のＮ末端の最初の２８アミノ酸を欠いている点で異なる。哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）中のベクタ＃９１の発現から産生されるＬＡＭＰ２融合タンパク質と同様に、ＣＬＳＴＮ１融合タンパク質は、エピコープ配列およびグリコシル化部位と共に、融合タンパク質のアミノ末端に非天然シグナル配列の類似した配置を有する。リンカも同様に存在し、更に、親和性ペプチドが、ＣＬＳＴＮ１融合タンパク質中に存在する（融合タンパク質をコードする機能的配列のマップについては図１、ベクタ＃１１２を参照、ベクタ＃１１２から産生される親ＣＬＳＴＮ１融合タンパク質の配列については図４を参照、成熟ＣＬＳＴＮ１タンパク質の配列については図９を参照）。
キメラ小胞局在化部分は、主として、ＬＡＭＰ２の表面ドメインおよび膜貫通ドメイン（ＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメイン）、ならびに他の膜貫通タンパク質由来の細胞質ドメインに基づいて調製した。細胞外小胞（例えば、エクソソーム）に取り込まれた後に以下の特徴部分を有するＩ型膜貫通タンパク質を用いた。即ち、アミノ末端表面ドメイン、単一パス膜貫通ドメイン、およびカルボキシル末端内腔ドメイン（エクソソームの形成前であるが小胞体に挿入された後の細胞質ドメインとして、そのトポロジ的等価物とも称される）である。特に、ＬＡＭＰ２の細胞質ドメイン（内腔ドメイン）は、図１および図２に模式的に表されるように、ＰＴＧＦＲＮ（ベクタ＃１３５）、ＩＴＧＡ３（ベクタ＃１４０）、ＩＬ３ＲＡ（ベクタ＃１４１）、ＳＥＬＰＬＧ（ベクタ＃１４２）、ＩＴＧＢ１（ベクタ＃１４３）、およびＣＬＳＴＮ１（ベクタ＃１４４）の細胞質ドメインと置換される。これらのキメラ小胞局在化部分から調製した融合タンパク質のアミノ酸配列を、図３～図８、または表３に示している。配列は、図３～図８において、シグナル配列については大文字の太字で、エピトープ配列については下線付きの大文字で、親和性ペプチドについては網掛けの大文字で、ペプチドリンカ配列については枠付きの大文字で、グリコシル化部位については小文字で、表面ドメインについてはイタリック体の大文字で、膜貫通ドメインについては大文字の太字で、細胞質ドメインについては下線付きの大文字で示されている。
細胞外小胞でのＬＡＭＰ２タンパク質局在化についてのＬＡＭＰ２細胞質ドメインの効果を評価するために、成熟ＬＡＭＰ２タンパク質の細胞質ドメインを除去して、高度に荷電したテトラペプチドであるＫＫＰＲに置き換え、切断されたＬＡＭＰ２を、ＥＶの表面上で安定化した（その天然の細胞質ドメインを欠いてテトラペプチドＫＫＰＲに置き換えられた切断されたＬＡＭＰ２を有する融合タンパク質のマップについては図２、ベクタ＃１４５を参照、その天然の細胞質ドメインを欠く切断されたＬＡＭＰ２を有する融合タンパク質のアミノ酸配列については図８、＃１４５を参照）。
例１０：ＥＶ表面上の組換えタンパク質検出
ＥＶが、トランスフェクトされたプラスミドによってコードされる融合タンパク質構築物を提示し、かつ融合タンパク質が、正しい膜貫通トポロジで配向されることを確実にするために、単離されたＥＶを、蛍光体結合抗ＦＬＡＧタグ抗体および膜染料で染色する。小胞フローサイトメトリ（ｖＦＣ）（サイロフレックス－ベックマンコールター（Cytoflex - Beckman Coulter））を用い、染色した小胞を評価する。ＥＶは、膜染色陽性粒子として同定される。各ＥＶ上の組換えタンパク質の量は、タンパク質の一次配列に含まれるエピトープ配列に特異的に結合する蛍光体結合抗体を用いて検出され、融合タンパク質が、意図されたトポロジ（内腔のＣ末端ドメイン、ＥＶ表面のＮ末端ドメイン）に配向されている場合にのみ、ＥＶ表面上で有効となるようになっている。評価された各ＥＶ上の組換えタンパク質の量は、抗体シグナル／膜染色粒子によって定まる。
図１３において、ＥＶ集団は、指示されたベクタ番号でトランスフェクトされた細胞から単離された。単離したＥＶを、各組換えタンパク質のＥＶ表面ドメインにコードされるエピトープ配列に特異的なマウスモノクローナル抗体で染色した。Ｙ軸は、抗ＦＬＡＧエピトープタグ抗体によって標識されていないＥＶを無視して、各ＥＶに結合した抗体の相対量（平均値）を表し、各ＥＶに取り込まれた組換えタンパク質量の間接的尺度として機能する。模擬トランスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ）由来のＥＶに関連するバックグラウンドシグナルは、これらの値から差し引かれている。検出可能な量の組換えタンパク質を示す総ＥＶ集団の割合を図１４に示す。
例１１：第一の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、細胞質ドメインとを有するキメラ小胞局在化部分は、ＥＶの局在化を増大させることが可能
図１および図２に示す融合タンパク質であって、図３～図８または表３に示すアミノ酸配列を有する融合タンパク質の産生のための異なる発現ベクタ構築物の一過性トランスフェクション、および培養培地から単離されたＥＶにおける融合タンパク質の局在の分析により、細胞外小胞における融合タンパク質の蓄積効率において驚くべき変化が示された。多くの異なる小胞局在化部分ＰＴＧＦＲＮ（ベクタ＃１３５）、ＩＴＧＡ３（ベクタ＃１４０）、ＩＬ３ＲＡ（ベクタ＃１４１）、ＳＥＬＰＬＧ（ベクタ＃１４２）、ＩＴＧＢ１（ベクタ＃１４３）、およびＣＬＳＴＮ１（ベクタ＃１４４）から、ＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインと非天然細胞質ドメインとを有したキメラ小胞局在化部分を含む融合タンパク質を産生すると、細胞外小胞における融合タンパク質の局在化能力が劇的に向上し、ＥＶにおける融合タンパク質の存在量（図１３）、ならびに融合タンパク質について陽性のＥＶの割合またはパーセントの両方が増加した（図１４）。いずれの場合も、１つの小胞局在化部分であるＬＡＭＰ２タンパク質の細胞質ドメインを、第２の小胞局在化部分であるＰＴＧＦＲＮ（ベクタ＃１３５）、ＩＴＧＡ３（ベクタ＃１４０）、ＩＬ３ＲＡ（ベクタ＃１４１）、ＳＥＬＰＬＧ（ベクタ＃１４２）、ＩＴＧＢ１（ベクタ＃１４３）、およびＣＬＳＴＮ１（ベクタ＃１４４）のものと置換すると、融合タンパク質中のＦＬＡＧエピトープタグに向けられた抗ＦＬＡＧエピトープタグ抗体によって陽性に標識されたＥＶについて、ＥＶ表面に存在する融合タンパク質の存在量が増加し（図１３）、融合タンパク質について陽性の総ＥＶ集団の割合またはパーセントが増加した（図１４）。
図１３および図１４は、キメラ小胞局在化部分がＥＶに局在化するだけでなく、キメラ小胞局在化部分を、その非キメラ対応物の代わりに使用する場合に、融合タンパク質の局在化が改善されることを示している（＃１３５、＃１４０、＃１４１、＃１４２、＃１４３、および＃１４４を、＃９１または＃１１２と比較）。更に、ＬＡＭＰ２の細胞質ドメインを欠失させ、正に荷電したテトラペプチド、ＫＫＰＲに置換すると、ＬＡＭＰ２表面－膜貫通ドメインのＥＶに対する局在化がわずかに改善される（＃１４５と＃９１とを比較）。しかし、様々な小胞局在部分から移植された細胞質ドメインによるＥＶ局在化の改善は、はるかに強力であり、小胞局在部分（ＬＡＭＰ２など）の表面－膜貫通ドメインの安定したＥＶ局在化には、最小限の細胞質ドメイン（即ち、ＫＫＰＲ）を必要とし得る一方、細胞質ドメインは、ＥＶ局在化を調節可能であり、ＥＶ局在化の効率に影響を及ぼす可能性があることが示される
図１３のデータを正規化し、成熟ＬＡＭＰ２を含む融合タンパク質（その天然のシグナル配列を欠く新生ＬＡＭＰ２タンパク質、新生タンパク質のアミノ酸末端の最初の２８アミノ酸、ベクタ＃９１構築物）と比較した、ＥＶ表面上の融合タンパク質の存在量または濃度の増加倍率を、図１５に示す。同様に、図１４のデータを正規化し、ベクタ＃９９構築物によって産生された成熟ＬＡＭＰ２を含む融合タンパク質と比較した、融合タンパク質について陽性のＥＶのパーセントまたは割合の増加倍率を、図１６に示す。成熟ＬＡＭＰ２タンパク質の細胞質ドメインを、別の様々な小胞局在化部分の細胞質ドメインと置き換えると、図１５に見られるように、ＰＴＧＦＲＮ（ベクタ＃１３５）、ＩＴＧＡ３（ベクタ＃１４０）、ＩＬ３ＲＡ（ベクタ＃１４１）、ＳＥＬＰＬＧ（ベクタ＃１４２）、およびＩＴＧＢ１（ベクタ＃１４３）から得られる多くの細胞質ドメインについて、ＥＶにおける融合タンパク質の存在量が、約４倍増加する。ＥＶにおける融合タンパク質の濃度の増加と同様に、キメラ小胞局在化部分（ベクタ＃１３５、＃１４０、＃１４１、＃１４２、＃１４３、および＃１４４）を有する種々の融合タンパク質について陽性である総ＥＶの割合は、非キメラ小胞局在化部分、即ち、そのＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメインを、様々なキメラ小胞局在化部分（ベクタ＃１３５、＃１４０、＃１４１、＃１４２、＃１４３、および＃１４４）に提供する親ＬＡＭＰ２小胞局在化部分（ベクタ＃９１）を含む融合タンパク質よりも３～４倍増加する。
例１２：キメラ小胞局在化部分は、親小胞局在化部分よりもＥＶ局在化を劇的に改善することが可能
図１５は、ベクタ＃９１構築物によって産生された融合タンパク質（連続した表面－膜貫通－細胞質ドメインを有するが、天然のＬＡＭＰ２シグナル配列を有さない成熟ＬＡＭＰ２タンパク質を有する融合タンパク質）と比較した、ＥＶ表面上の融合タンパク質の存在量（または濃度）の増加倍率を、蛍光体結合抗ＦＬＡＧエピトープタグ抗体を用いた小胞フローサイトメトリによって検出されたものとして示している。ベクタ＃９１によって産生される融合タンパク質と比較して、ベクタ＃１１２によって産生される融合タンパク質（その表面－膜貫通－細胞質ドメインを有するが、天然のＣＬＳＴＮ１シグナル配列を有さない成熟ＣＬＳＴＮ１タンパク質との融合タンパク質）は、はるかに低いレベルとなる、成熟ＬＡＭＰ２含有融合タンパク質の約２５％の存在量に減縮する（図１５における、＃９１と＃１１２との比較値）。驚くべきことに、成熟ＬＡＭＰ２の細胞質ドメインを、成熟ＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメインに置換すると、新たなキメラ小胞局在化部分は、その親ＬＡＭＰ２よりも融合タンパク質の存在量が約２倍（＃９１と＃１４４との比較値）、またはその親ＣＬＳＴＮ１よりも融合タンパク質の存在量が８倍以上（＃１１２と＃１４４との比較値）増加し、これは、ＬＡＭＰ２の表面－膜貫通ドメインとＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメインとの間の相乗的相互作用を示すものである。
ＥＶにおける融合タンパク質の濃度の上昇をもたらす相乗的相互作用は、融合タンパク質について陽性の総ＥＶ集団の割合を分析する場合にも観察される（図１６）。特に、親ＬＡＭＰ２小胞局在化部分を含む融合タンパク質は、正規化値０．１５（＃１１２）を有する親ＣＬＳＴＮ１小胞局在化部分を含む融合タンパク質よりも、１．００（＃９１）の正規化値を有する総ＥＶ集団との関係において優れている。対照的に、２つの親小胞局在化部分（＃１４４）から産生されたキメラ小胞ドメインを含む融合タンパク質は、親ＬＡＭＰ２小胞局在化部分より３．５倍以上の増加、および親ＣＬＳＴＮ１小胞局在化部分より２５倍以上の増加を反映して、３．７９の正規化値を有する。キメラ小胞局在化部分を含む融合タンパク質によって約５５％（図１４、＃１４４参照）に達する総ＥＶ集団に関連した、このような劇的な増加は、予想外である。観察されたＥＶ局在化の増加は、ＬＡＭＰ２細胞質ドメインを置換するためのＣＬＳＴＮ１細胞質ドメインの使用に特有のものではない。他の多くの細胞質ドメインも、親のＬＡＭＰ２小胞局在化部分のものを超えてＥＶの局在化を増大させ、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＴＧＡ３、ＩＬ３ＲＡ、ＳＥＬＰＬＧ、およびＩＴＧＢ１の細胞質ドメインが、ＣＬＳＴＮ１の細胞質ドメインと同様に機能して、ＥＶの局在化を相乗的に増大させ、単一のＥＶに集中すると共に、総ＥＶ集団と会合し得ることを示す。
従って、ＥＶ表面上の融合タンパク質存在量、および融合タンパク質について陽性の総ＥＶ集団の割合（またはパーセント）の分析により、第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含むキメラ小胞局在化部分が相乗的に相互作用し、細胞外小胞での蓄積を増加できることが示された。このような発見により、キメラ小胞局在化部分が、異なるタンパク質のセットと相互作用し得るか、または２つの天然小胞局在化部分によって細胞外小胞に補充されたタンパク質のセットに対する親和性が変化するため、ＥＶの局在化を改善するだけでなく、ＥＶの組成を変化させる可能性があるアプローチが提供される。
図１３～図１６は、局在化部分を有するＥＶにおける小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分の存在量を示す棒グラフ（図１３および図１５）、ならびに小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分について陽性である総ＥＶの割合を示す棒グラフ（図１４および図１６）である。ＥＶは、各棒グラフの下部に示した発現構築物（ベクタ）で一過性にトランスフェクトされた細胞の培養培地から単離される。単離されたＥＶ集団は、抗ＦＬＡＧ抗体に結合させるために使用される第２の蛍光色素のスペクトル特性を有する膜染色蛍光色素で標識される。産生された全ての融合タンパク質が、表面ドメインに先行する３ｘＦＬＡＧエピトープを有するので、蛍光体結合抗ＦＬＡＧ抗体を用いて蛍光色素標識ＥＶ集団を検査し、小胞局在化部分またはキメラ小胞局在化部分を含む融合タンパク質の存在を検出する。得られたＥＶを、サイトフレックス（CytoFLEX）ベンチトップフローサイトメータ（ベックマンコールター（Beckman Coulter））における小胞フローサイトメトリ（ｖＦＣ）によって分析し、膜染色蛍光色素に基づいてＥＶを検出する。更に、第２の蛍光色素に基づき、抗ＦＬＡＧ抗体によって付加的に標識されたＥＶのサブセットを同定し、第２の蛍光色素に関連する蛍光を定量する。模擬トランスフェクトされた細胞から得られ、同様に処理されたＥＶに関連する蛍光（第２蛍光色素のもの）は、この蛍光がＦＬＡＧエピトープタグの存在とは関連しないので、差し引かれる。図１３は、示された発現ベクタによって発現される融合タンパク質について、抗ＦＬＡＧ抗体で陽性標識されたＥＶの平均抗体蛍光のプロットである。図１４は、抗ＦＬＡＧ抗体によって陽性に標識された総ＥＶのパーセントのプロットである。図１５および図１６は、成熟ＬＡＭＰ２タンパク質を含む融合タンパク質を発現する発現ベクタ＃９１に関連して、それぞれ図１３および図１４に報告されたレベルの倍率の変化を示す。
本明細書に記載され、引用された全ての刊行物、遺伝子転写物識別子、特許、および特許出願は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。開示する発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、および材料に限定されるものではなく、これらが変化し得ると理解される。また、本明細書中で使用する用語は、特定の実施態様の説明のみを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、本発明は、添付の特許請求範囲によってのみ限定されるものであることも理解される。
当業者は、通常の実験を用いるだけで、本明細書において説明した発明の特定の実施形態についての多くの均等物を理解し、確認し得る。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書において、本発明の好ましい実施形態を提示して説明したが、これらの実施形態が単なる例として示されたことは、当業者に明らかである。本発明から逸脱することなく、当業者は、多くの変形、変更、置換を行い得る。本明細書において説明した本発明の実施形態に対する様々な代替物を、本発明の実施の際に使用できると理解すべきである。添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、それにより、特許請求の範囲内およびその均等物の範囲内にある方法および構成が包含されることを意図するものである。

Claims (9)

  1. キメラ小胞局在化部分を含む非天然発生のエクソソームであって、
    ａ．第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、
    ｂ．第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含み、
    前記第１の小胞局在化部分は、リソソーム関連膜タンパク質２、アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）であり、前記第２の小胞局在化部分は、カルシンテニン１（ＣＬＳＴＮ１）、インターロイキン３受容体サブユニットアルファ（ＩＬ３ＲＡ）、インテグリンアルファ３（ＩＴＧＡ３）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１）、プロスタグランジンＦ２受容体インヒビタ（ＰＴＧＦＲＮ）、およびＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＳＥＬＰＬＧ）からなる群から選択され、
    前記第１の小胞局在化部分および前記第２の小胞局在化部分は、単一パス膜貫通タンパク質である、
    エクソソーム。
  2. 前記単一パス膜貫通タンパク質は、Ｉ型膜貫通タンパク質である、請求項１に記載のエクソソーム。
  3. 前記キメラ小胞局在化部分は、成熟キメラ小胞局在化部分である、請求項１に記載のエクソソーム。
  4. 前記キメラ小胞局在化部分は、前記第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインに先行するシグナルペプチドを含む、新生のまたは完全長キメラ小胞局在化部分から得られる、請求項１に記載のエクソソーム。
  5. 前記キメラ小胞局在化部分は、前記エクソソームに組み込まれ、前記エクソソームは脂質二重層と内腔で構成され、前記キメラ小胞局在化部分は、前記エクソソームの外側のアミノ末端表面ドメイン、前記エクソソームの前記脂質二重層における膜貫通ドメイン、および前記エクソソームの前記内腔におけるカルボキシ末端細胞質ドメインを有したトポロジを有する、請求項１に記載のエクソソーム。
  6. 請求項１に記載のエクソソームを産生する方法であって、
    ａ．産生細胞において、請求項１に記載の第１の小胞局在化部分の表面－膜貫通ドメインと、請求項１に記載の第２の小胞局在化部分の細胞質ドメインとを含む前記キメラ小胞局在化部分をコードする核酸を発現するステップと、
    ｂ．前記キメラ小胞局在化部分を含むエクソソームを単離するステップであって、前記エクソソームが、前記産生細胞によって培地中に分泌されるステップとを含む
    方法。
  7. 請求項１に記載のエクソソームと、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬剤組成物。
  8. 請求項１に記載のエクソソームと、取扱説明書とを含むキット。
  9. 前記第１の小胞局在化部分はＬＡＭＰ２Ｂであり、前記第２の小胞局在化部分はＰＴＧＦＲＮである、請求項１に記載のエクソソーム。
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