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JP7558575B2 - レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集 - Google Patents

レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２２日に出願された米国特許仮出願シリアル番号第６２／７４８，７０３号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により、基礎研究及び臨床適用のために哺乳動物ゲノムを迅速に改変する能力が大幅に向上した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡを使用してＣａｓ９を特定のＤＮＡ標的配列に誘導し、そこで二本鎖ＤＮＡ切断を誘発し、細胞修復経路を作動させてフレームシフト突然変異を導入するか、または相同組換え修復（ＨＤＲ）を介してドナー配列を挿入する。これらの著しい進歩にもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ＨＤＲを使用したゲノム編集のための大型ＤＮＡ配列の標的化送達は、依然として非効率的であり、かなり大きな隣接相同領域を含むドナー鋳型を必要とし、かつｐ５３ ＤＮＡ損傷経路を誘発する（Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＮＡＲ ４３：ｅ２１、Ｈａｐｐａｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：９２７－３０、Ｉｈｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４：９３９－４６）。総合すると、これらはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集の効率を著しく制限する。したがって、統合的なゲノム編集の改善が必要とされている。
対照的に、レンチウイルス酵素であるインテグラーゼ（ＩＮ）は、標的配列の相同性を必要としないプロセスを介して大型レンチウイルスゲノムの宿主細胞ＤＮＡへの挿入を触媒するのに、必要かつ十分である。レンチウイルスＤＮＡのＩＮ媒介性挿入は、ＤＮＡに非特異的に結合するＣ末端ドメインに部分的に起因して、ＤＮＡ標的配列の特異性がほとんどない状態で生じる（Ｌｕｔｚｋｅ ＆ Ｐｌａｓｔｅｒｋ １９９８，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：４８４１－４８）。
遺伝子治療技術に関する現在の制限により、大部分のヒト単一遺伝子疾患の治療が妨げられている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集は、近年、哺乳動物ゲノムの有害な突然変異を修復するための治療的アプローチの開発に関して注目されている。これは、疾患及び障害を引き起こす可能性のあるヒトゲノム内の多数の患者特異的突然変異に起因して、依然として相当な難題である。エクソン－イントロン境界を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡにより、これらの突然変異群を標的とするエクソンスキッピング戦略が可能となるが、しかしながら、これらの戦略の有効性は依然として試験されておらず、すべての患者に適用できるわけではない。
多くの遺伝子の遺伝子導入発現は、動物モデルにおいて疾患結果を予防しかつ回復させることができるが、一部の遺伝子の大型のサイズは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などの従来の遺伝子編集アプローチ、またはＡＡＶ（限度約４．９ｋｂ）などの従来のウイルス遺伝子治療アプローチのサイズ制限を大幅に超過しており、ヒト遺伝子治療への使用が妨げられている。ＡＡＶによって送達される、より小さな操作された遺伝子を使用するアプローチは現在臨床試験中であるが、これらの戦略が長期的な回復をもたらすかどうか、及び特定の突然変異を有する患者にのみに適用可能かどうかは、依然として明らかになっていない。
対照的に、レンチウイルスベクターは大型遺伝子を送達することができ、宿主ゲノムへの組み込みにより永続的な修復が可能となる。しかし、レンチウイルス組み込みの現在のランダムな性質は、オフターゲット突然変異及び疾患を引き起こす可能性があり、これにより臨床用途へのこれらの使用が妨げられている（Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２３：１５２９－４１）。レンチウイルス配列は、ゲノム組み込みに必要な非特異的ＤＮＡ結合ドメインを利用する、ウイルスにコードされた酵素インテグラーゼ（ＩＮ）によって宿主ゲノムに挿入される（Ａｎｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ ２：２４１－６４）。
したがって、ゲノム物質の編集の改善が必要とされている。本発明は、この必要性を満たす。
一態様では、本発明は、融合タンパク質を提供する。一実施形態では、融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列を有するレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、第２のアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び第３のアミノ酸配列を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮからなる群から選択される。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＩＮ触媒コアドメイン（ＣＣＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも７０％同一である配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、配列番号１～４０のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３及びＣｐｆ１からなる群から選択される。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、レトロトランスポゾンＮＬＳは、Ｔｙ１ ＮＬＳまたはＴｙ２ ＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つと少なくとも７０％同一である配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも７０％同一である配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７～９８のうちの１つの配列を含む。
一態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。一実施形態では、核酸は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも７０％同一である配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号１５５～１９６から選択される配列を含む。
一態様では、本発明は、遺伝物質を編集する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）本発明の融合タンパク質または本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子、（ｂ）遺伝物質内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸、ならびに（ｃ）Ｕ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を遺伝物質に投与することを含む。一実施形態では、遺伝物質の編集方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。一実施形態では、遺伝物質の編集方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法である。
一態様では、本発明は、遺伝物質を編集するための系を提供する。一実施形態では、この系は、（ａ）本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列、ならびに（ｃ）ドナー鋳型核酸をコードする核酸配列であって、このドナー鋳型核酸がＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含む核酸配列を、１つ以上のベクターに含む。一実施形態では、融合タンパク質は、レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一実施形態では、核酸は、同じベクター上に存在する。一実施形態では、核酸は、異なるベクター上に存在する。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは、遺伝子の標的ＤＮＡ配列に実質的にハイブリダイズする。一実施形態では、Ｕ３配列及びＵ５配列は、レトロウイルスＩＮに特異的である。
一態様では、本発明は、ゲノム編集成分を送達するための系を提供する。一実施形態では、この系は、（ａ）触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質に融合されたインテグラーゼを含むｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする配列を含むパッケージングプラスミド、（ｂ）ドナー配列、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲをコードする配列を含む導入プラスミド、ならびに（ｃ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドを含む。一実施形態では、パッケージングプラスミドは、ガイドＲＮＡ配列をコードする配列をさらに含む。
一実施形態では、この系は、（ａ）ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする配列を含むパッケージングプラスミド、（ｂ）ドナー配列、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲをコードする配列を含む導入プラスミド、（ｃ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミド、ならびに（ｄ）ＶＰＲ、インテグラーゼ及び触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含むＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドを含む。一実施形態では、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドは、ガイドＲＮＡ配列をコードする配列をさらに含む。
一実施形態では、この系は、（ａ）ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージングプラスミド、（ｂ）ガイドＲＮＡ、融合タンパク質（インテグラーゼ及び触媒的に死んだＣａｓを含む）、５’ＬＴＲならびに３’ＬＴＲをコードする核酸配列を含む導入プラスミド、ならびに（ｃ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミドを含む。
以下の本発明の実施形態の詳細な説明は、添付図面と併せて読むとより良好に理解されるであろう。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
哺乳動物のゲノムＤＮＡを編集するためのレトロウイルスインテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化の向上を実証する実験結果を示す。ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の概略図を示す。 哺乳動物のゲノムＤＮＡを編集するためのレトロウイルスインテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化の向上を実証する実験結果を示す。ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化を示す。 哺乳動物のゲノムＤＮＡを編集するためのレトロウイルスインテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化の向上を実証する実験結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞中のＥＦ１－アルファの３’ＵＴＲＥを標的とするＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を組み込むための、ＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の酵素活性を実証する実験結果を示す。 ウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）とＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９の融合により、標的特異的な方法で大型ＤＮＡ配列を組み込むことができることを示す核酸編集技術の概略図を示す。このアプローチにより、通常は非組み込みＡＡＶベクターの制限を超える大型遺伝子配列を、安全かつ永続的に送達することができる。 哺乳動物細胞における個々の組み込み事象の忠実度を定量化及び特性決定するために使用した、ＧＦＰレポーター細胞株の実験設計及び実験結果を示す。 ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性の相同組換え修復及びレトロウイルスインテグラーゼ媒介性のランダムＤＮＡ組み込みの概略図を示す。 インテグラーゼ－Ｃａｓゲノム編集の概略図を示す。 ドナーベクター、平滑末端鋳型の作製、及び３’プロセシング鋳型の作製の概略図を示す。 ＩＮｓｒｔ鋳型、ａｍｉｌＣＰ配列を標的とするＩＮ－ｄＣａｓ９ベクターをＣｏｓ７細胞にコトランスフェクトした、コトランスフェクションの実験設計を示す。 ＩＧＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－２Ａ－ピューロマイシン－ｐＡカセットをヒトＨＥＫ２９３細胞株にノックインするための、ヒトＥＦ１－アルファ遺伝子座の３’ＵＴＲに特異的な対形成したガイドＲＮＡの実験設計、及びトランスフェクションの４８時間後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の画像を示す。 指向性編集を示す概略図を示す。 ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子を作製するための多重ゲノム編集を示す概略図を示す。 ＡからＣを含み、ＩＮΔＣ－Ｃａｓ９融合タンパク質の核局在化に対するＴｙ１ ＮＬＳ様配列の効率を実証する実験結果を示す。Ａは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用した、Ｃｏｓ－７細胞で発現したＣ末端の古典的なＳＶ４０ ＮＬＳ、Ｔｙ１ ＮＬＳ、またはＴｙ２ ＮＬＳを含有するＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の検出を示す。Ｂは、酵母タンパク質から単離されたＴｙ１ ＮＬＳ様配列が、強力な核局在化をもたらすことができるか（ＭＡＫ１１）、または明らかな局在化活性をもたらさない（ＩＮＯ４及びＳＴＨ１）ことを示す。Ｃは、Ｔｙ１、Ｔｙ２及びＴｙ１ ＮＬＳ様配列の配列を示す。Ｔｙ１及びＴｙ２は、長さ及び残基組成の両方において高度に保存されている。スケールバー＝１０μｍ。 ＡからＣを含み、Ｔｙ１ ＮＬＳが哺乳動物細胞中のＣａｓ９ ＤＮＡ編集を向上させることを実証する実験結果を示す。Ａは、ｈＵ６駆動単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグ、ＳＶ４０ ＮＬＳ及びＣ末端のＮＰＭ ＮＬＳを含有するＣＡＧ駆動Ｃａｓ９タンパク質とをコードするｐｘ３３０ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現プラスミドの図を示す。Ｔｙ１ ＮＬＳを、ｐｘ３３０（ｐｘ３３０－Ｔｙ１）のＮＰＭ ＮＬＳの代わりにクローニングした。Ｂは、上流の２０ｎｔの標的配列（ｔｓ）が下流のルシフェラーゼオープンリーディングフレームからのオープンリーディングを中断する、フレームシフト活性化ルシフェラーゼレポーターが作製されたことを示す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘発されるフレームシフトは、下流のレポーターを再構成し、ルシフェラーゼを発現させる。Ｃは、フレームシフト応答性ルシフェラーゼレポーターと、標的配列に特異的な単一ガイドＲＮＡを含有するｐｘ３３０との共発現が、非標的化ｓｇＲＮＡと比較して、ルシフェラーゼ活性の約２０倍の活性化をもたらしたことを示す。ｐｘ３３０－Ｔｙ１の共発現は、ｐｘ３３０と比べて約４４％の向上をもたらした。 ＡからＥを含み、編集のためのゲノム標的化戦略を示す。ＤＮＡドナー配列の組み込みは、所望の用途に応じて様々なゲノム位置を標的とすることができる。Ａは、遺伝子カセットを保有するＤＮＡドナー配列の送達が、遺伝子間の「セーフハーバー」遺伝子座を標的とし、隣接遺伝子または必須遺伝子の発現の破壊を防止できることを示す。Ｂは、遺伝子カセットを保有するＤＮＡドナー配列の送達が、非必須「セーフハーバー」遺伝子座を標的とし、隣接遺伝子または必須遺伝子の発現の破壊を防止できることを示す。Ｃは、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）をコードするＤＮＡ配列の組み込みを、遺伝子のイントロン領域（例えば、疾患遺伝子座）に送達することができ、これにより、組み込まれた配列を発現させ、下流の配列の発現を防止できることを示す。Ｄは、スプライスアクセプター配列（ＳＡ）をコードするＤＮＡ配列の組み込みを、遺伝子のイントロン領域（例えば、疾患遺伝子座）に送達することができ、これにより、組み込まれた配列を発現させ、下流の配列の発現を防止できることを示す。Ｅは、３’ＵＴＲへの内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を含有するＤＮＡドナー配列の組み込みにより、内在性遺伝子座からの発現を妨害することなく発現させることができることを示す。 レンチウイルスの生活環の図を示す。レトロウイルスのサブクラスであるレンチウイルスは、それらのプロウイルスゲノムの永続的な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）コピーを宿主細胞ＤＮＡに組み込む、一本鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスの形質導入後、レンチウイルスＲＮＡゲノムは、ウイルスにコードされた逆転写酵素（ＲＴ）により平滑末端ｄｓＤＮＡとしてコピーされ、インテグラーゼＩ（ＩＮ）により宿主ゲノムに挿入される。レンチウイルスゲノムは、そのＵ３末端及びＵ５末端で、ＩＮによるプロウイルスゲノムの組み込みに必要な短い（約２０塩基対）配列モチーフに隣接している。レトロウイルスＤＮＡのＩＮ媒介性挿入は、ＤＮＡ標的配列特異性をほとんど伴わずに生じ、活性遺伝子座へ組み込むことができるが、これは、正常遺伝子機能を破壊する可能性があり、ヒトにおいて疾患を引き起こす可能性がある。 哺乳動物細胞におけるゲノム編集を示す。レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列の標的化非相同挿入を可能とする。ヒトＵ６駆動単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びインテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質をコードする哺乳動物発現ベクターの図を示す。 哺乳動物細胞におけるゲノム編集を示す。レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列の標的化非相同挿入を可能とする。Ｕ３／Ｕ５ウイルスモチーフに隣接するＩＧＲ ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ－２Ａ－ピューロマイシン（ｐｕｒｏ）カセットを含有するｄｓＤＮＡドナー鋳型を示す図を示す。 哺乳動物細胞におけるゲノム編集を示す。レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列の標的化非相同挿入を可能とする。ＣＯＳ－７細胞中で安定して発現するＣＭＶ－ｅＧＦＰレポーター導入遺伝子へのこのドナー鋳型のインテグラーゼ－Ｃａｓ９媒介性組み込みの概略図を示す。 哺乳動物細胞におけるゲノム編集を示す。レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列の標的化非相同挿入を可能とする。ＣＯＳ－７中で安定して発現するＣＭＶ－ｅＧＦＰレポーター導入遺伝子へのこのドナー鋳型のインテグラーゼ－Ｃａｓ９媒介性組み込みが、ｍＣｈｅｒｒｙを発現させると同時にｅＧＦＰ発現の破壊を生じさせることを示す概略図を示す。 哺乳動物細胞におけるゲノム編集を示す。レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列の標的化非相同挿入を可能とする。編集したＣＯＳ－７細胞中のｅＧＦＰ発現の喪失及びｍＣｈｅｒｒｙ発現の獲得を示す実験結果を示す。 従来のレンチウイルス遺伝子送達系を示す。隣接するロングターミナルリピート（ＬＴＲ）間でウイルスタンパク質をコードするレンチウイルスゲノムの図を示す。 従来のレンチウイルス遺伝子送達系を示す。レンチウイルスゲノムが強力な遺伝子送達ツールとして利用されていることを示す概略図を示す。レンチウイルス粒子を使用して、ドナー導入遺伝子配列をパッケージングし、送達し、安定して発現させることができる。レンチウイルスベクター遺伝子発現系では、ウイルスポリタンパク質はウイルスゲノムから取り除かれ、別々の哺乳動物発現プラスミドを使用して発現される。次に、目的のドナーＤＮＡ配列をウイルスポリタンパク質の代わりに、隣接するＬＴＲ配列の間にクローニングすることができる。哺乳動物パッケージング細胞におけるこれらのベクターのコトランスフェクションにより、コードされたドナー配列を送達及び組み込むことができるレンチウイルス粒子が形成されるが、しかしながら、後続のウイルス増殖に必要なインテグラーゼ及び他のウイルスタンパク質についてのコード情報は必要とされない。レンチウイルス粒子は、ウイルスタンパク質（例えば、インテグラーゼ及び逆転写酵素）ならびにｄｓＤＮＡドナー配列の両方を送達するための天然のベクターであり、哺乳動物細胞へのインテグラーゼ媒介性の挿入に要する必要なウイルス末端配列を含有する。レンチウイルスベクターの作製を示す。 従来のレンチウイルス遺伝子送達系を示す。レンチウイルスゲノムが強力な遺伝子送達ツールとして利用されていることを示す概略図を示す。レンチウイルス粒子を使用して、ドナー導入遺伝子配列をパッケージングし、送達し、安定して発現させることができる。レンチウイルスベクター遺伝子発現系では、ウイルスポリタンパク質はウイルスゲノムから取り除かれ、別々の哺乳動物発現プラスミドを使用して発現される。次に、目的のドナーＤＮＡ配列をウイルスポリタンパク質の代わりに、隣接するＬＴＲ配列の間にクローニングすることができる。哺乳動物パッケージング細胞におけるこれらのベクターのコトランスフェクションにより、コードされたドナー配列を送達及び組み込むことができるレンチウイルス粒子が形成されるが、しかしながら、後続のウイルス増殖に必要なインテグラーゼ及び他のウイルスタンパク質についてのコード情報は必要とされない。レンチウイルス粒子は、ウイルスタンパク質（例えば、インテグラーゼ及び逆転写酵素）ならびにｄｓＤＮＡドナー配列の両方を送達するための天然のベクターであり、哺乳動物細胞へのインテグラーゼ媒介性の挿入に要する必要なウイルス末端配列を含有する。ドナー導入遺伝子配列を送達し、安定して発現するレンチウイルス粒子の形質導入を示す。 標的化レンチウイルス組み込みを示す。既存のレンチウイルス送達系を改変して、哺乳動物細胞におけるゲノム編集のための、標的化レンチウイルスドナー鋳型の組み込みを目的とした編集成分を導入することができる。ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードするレンチウイルスパッケージングプラスミド（例えば、ｐｓＰａｘ２）内に、インテグラーゼ（またはそのＣ末端非特異的ＤＮＡ結合ドメインを欠くインテグラーゼ）にｄＣａｓ９を直接融合させる１つのアプローチを示す。 標的化レンチウイルス組み込みを示す。既存のレンチウイルス送達系を改変して、哺乳動物細胞におけるゲノム編集のための、標的化レンチウイルスドナー鋳型の組み込みを目的とした編集成分を導入することができる。修飾ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質が他のウイルス成分とともにポリタンパク質として翻訳され、ガイドＲＮＡとともに搭載されレンチウイルス粒子にパッケージングされることを示す。このアプローチでは、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質は、プロテアーゼ切断（ＰＲ）に必要な配列を保持しており、これにより、粒子成熟中にｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質から正常に切断される。哺乳動物細胞の形質導入により、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質、ｓｇＲＮＡ及びレンチウイルスドナー配列を含むウイルスタンパク質が送達される。 標的化レンチウイルス組み込みを示す。既存のレンチウイルス送達系を改変して、哺乳動物細胞におけるゲノム編集のための、標的化レンチウイルスドナー鋳型の組み込みを目的とした編集成分を導入することができる。レンチウイルスの形質導入時に、逆転写酵素によるｓｓＲＮＡゲノムの逆転写によって正確なウイルス末端配列（Ｕ３及びＵ５）を含有するｄｓＤＮＡ配列が生成され、この配列はＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質により哺乳動物ゲノムに組み込まれることを示す。 ウイルスタンパク質への融合を介した標的化レンチウイルス組み込みを示す。標的化レンチウイルス遺伝子の組み込みを達成するための１つのアプローチとして、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスタンパク質Ｒ、ＶＰＲ）とのＮ末端及びＣ末端融合体としてのＩＮ－ｄＣａｓ９の発現及びパッケージングを示す。ウイルスプロテアーゼ切断配列がＶＰＲとＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質との間に含まれており、これにより、成熟後にＩＮ－ｄＣａｓ９がＶＰＲから遊離する。 ウイルスタンパク質への融合を介した標的化レンチウイルス組み込みを示す。パッケージング細胞とレンチウイルス成分とのコトランスフェクションにより、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを含有するウイルス粒子が生成されることを示す。ウイルス粒子形成に必要なパッケージングプラスミド（例えば、ｐｓＰａｘ２）は、パッケージングプラスミドの状態でインテグラーゼ内にその触媒活性を阻害する突然変異を含んでおり、それにより非インテグラーゼ－Ｃａｓ９媒介性組み込みを阻害する。 ウイルスタンパク質への融合を介した標的化レンチウイルス組み込みを示す。ウイルスの形質導入時に、ＩＮ－ｄＣａｓ９タンパク質がタンパク質として送達され、レンチウイルスドナー配列の組み込みを媒介することを示す。ＩＮ－ｄＣａｓ９融合体及びｓｇＲＮＡをリボタンパク質として送達する利点は、これが標的細胞中で一過性にのみ発現することである。 導入プラスミドへの導入を介した標的化レンチウイルス組み込みを示す。ウイルス導入プラスミド（またはＡＡＶなどの他のウイルスベクター）内からのＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質及び／またはガイドＲＮＡの発現が、標的化レンチウイルス遺伝子の組み込みを達成するための１つのアプローチであることを示す。 導入プラスミドへの導入を介した標的化レンチウイルス組み込みを示す。このアプローチでは、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質とｓｇＲＮＡとを含有する導入プラスミドを、レンチウイルス粒子を生成するのに必要なパッケージングプラスミド及びエンベローププラスミドとともにコトランスフェクトすることを示す。レンチウイルスを使用する場合、パッケージングプラスミドには、非特異的組み込みを阻害するための触媒性突然変異をインテグラーゼ内に含める。 導入プラスミドへの導入を介した標的化レンチウイルス組み込みを示す。哺乳動物細胞を形質導入すると、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質及びｓｇＲＮＡの発現は、標的化組み込みのためにそれ自身のウイルスドナーベクターを標的とすること（自己組み込み）ができる成分を生成することを示す。この方法は、標的遺伝子の破壊のために、または遺伝子ドライブとして使用される。 レンチウイルスドナー配列の共送達を示す。ドナーＤＮＡ配列をコードするレンチウイルス粒子との共形質導入は、組み込まれたドナー鋳型として機能することを示す。 レンチウイルスドナー配列の共送達を示す。このアプローチにおいて、自身のウイルスをコードする配列の自己組み込みの防止は、異なるレトロウイルス科のメンバーに由来するインテグラーゼ酵素及びそれらの対応する導入プラスミドを使用することにより行われ得ることを示す。ＩＮ（ＦＩＶ）－ｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするＨＩＶレンチウイルス粒子の作製を示す。 レンチウイルスドナー配列の共送達を示す。このアプローチにおいて、自身のウイルスをコードする配列の自己組み込みの防止は、異なるレトロウイルス科のメンバーに由来するインテグラーゼ酵素及びそれらの対応する導入プラスミドを使用することにより行われ得ることを示す。ＦＩＶ導入プラスミドを含むＦＩＶレンチウイルス粒子の作製を示す。 レンチウイルスドナー配列の共送達を示す。ＩＮ（ＦＩＶ）－ｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするＨＩＶレンチウイルス粒子を利用して、ＦＩＶレンチウイルス粒子内にコードされたＦＩＶドナー鋳型を組み込むことを示す。 哺乳動物初代細胞における標的化レンチウイルス組み込みを示す。このデータは、マウス胚性線維芽細胞のＲＯＳＡ２６mG/+遺伝子座への、ＩＲＥＳ－ｔｄＴＯカセットをコードするレンチウイルスドナー鋳型のレンチウイルスパッケージング、送達及び標的化組み込みを示す。２日後、ＩＲＥＳ－ｔｄＴＯレポーターをコードするレンチウイルスで形質導入したＭＥＦ中で、遍在性の赤色蛍光タンパク質の発現が検出可能であったが、ＧＦＰ蛍光が保持されていた。注目すべきことに、形質導入の７日後、ＲＯＳＡ２６mG/+一次細胞において緑色蛍光を欠くｔｄＴＯ赤色蛍光細胞が培養液中で検出可能であった。 哺乳動物の安定細胞株における標的化レンチウイルス組み込みを示す。このデータは、ＣＯＳ－７細胞中で安定して発現するＣＭＶ－ｅＧＦＰへの、ＩＲＥＳ－ｔｄＴＯカセットをコードするレンチウイルスドナー鋳型のレンチウイルスパッケージング、送達及び標的化組み込みを示す。 レンチウイルス粒子の標的化組み込みのためのＤＮＡ結合ドメインを示す。インテグラーゼの非特異的ＤＮＡ結合ドメインをｄＣａｓ９のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに置き換えることにより、レンチウイルス粒子での送達を介したｄｓＤＮＡドナー鋳型の標的化組み込みが可能となる。代替ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥＮなど）は、ウイルスインテグラーゼへの融合体として標的化組み込みに利用することができる。同様のレンチウイルス産生アプローチを使用して、以前の我々のパッケージング戦略におけるｄＣａｓ９を特定の配列を標的とするＴＡＬＥＮに置き換える。ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質の状態でインテグラーゼへの融合体としてパッケージング及び送達されるＴＡＬＥＮを示す。 レンチウイルス粒子の標的化組み込みのためのＤＮＡ結合ドメインを示す。インテグラーゼの非特異的ＤＮＡ結合ドメインをｄＣａｓ９のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに置き換えることにより、レンチウイルス粒子での送達を介したｄｓＤＮＡドナー鋳型の標的化組み込みが可能となる。代替ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥＮなど）は、ウイルスインテグラーゼへの融合体として標的化組み込みに利用することができる。同様のレンチウイルス産生アプローチを使用して、以前の我々のパッケージング戦略におけるｄＣａｓ９を特定の配列を標的とするＴＡＬＥＮに置き換える。ウイルスタンパク質への融合体としてのインテグラーゼへの融合体として、パッケージング及び送達されるＴＡＬＥＮを示す。 レンチウイルス粒子の標的化組み込みのためのＤＮＡ結合ドメインを示す。インテグラーゼの非特異的ＤＮＡ結合ドメインをｄＣａｓ９のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに置き換えることにより、レンチウイルス粒子での送達を介したｄｓＤＮＡドナー鋳型の標的化組み込みが可能となる。代替ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥＮなど）は、ウイルスインテグラーゼへの融合体として標的化組み込みに利用することができる。同様のレンチウイルス産生アプローチを使用して、以前の我々のパッケージング戦略におけるｄＣａｓ９を特定の配列を標的とするＴＡＬＥＮに置き換える。導入プラスミド内にコードされたインテグラーゼへの融合体としてパッケージング及び送達されるＴＡＬＥＮを示す。 ＡからＣを含み、Ｔｙ１ ＮＬＳが哺乳動物細胞中のＣａｓ９ ＤＮＡ編集を向上させることを実証する実験結果を示す。Ａは、ｈＵ６駆動単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と、Ｎ末端の３ｘＦＬＡＧタグ、ＳＶ４０ ＮＬＳ及びＣ末端のＮＰＭ ＮＬＳを含有するＣＡＧ駆動Ｃａｓ９タンパク質とをコードするｐｘ３３０ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現プラスミドの図を示す。Ｔｙ１ ＮＬＳを、ｐｘ３３０（ｐｘ３３０－Ｔｙ１）のＮＰＭ ＮＬＳの代わりにクローニングした。Ｂは、上流の２０ｎｔの標的配列（ｔｓ）が下流のルシフェラーゼオープンリーディングフレームからのオープンリーディングを中断する、フレームシフト活性化ルシフェラーゼレポーターが作製されたことを示す結果を示す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって誘発されるフレームシフトは、下流のレポーターを再構成し、ルシフェラーゼを発現させる。Ｃは、フレームシフト応答性ルシフェラーゼレポーターと、標的配列に特異的な単一ガイドＲＮＡを含有するｐｘ３３０との共発現が、非標的化ｓｇＲＮＡと比較して、ルシフェラーゼ活性の約２０倍の活性化をもたらしたことを実証する結果を示す。ｐｘ３３０－Ｔｙ１の共発現は、ｐｘ３３０と比べて約４４％の向上をもたらした。 ＴＡＬＥＮを利用して、ドナーＤＮＡ鋳型のレトロウイルスインテグラーゼ媒介性の組み込みを誘導することができることを示す概略図を示す。 プラスミドＤＮＡ組み込みアッセイの模式図を示す。 １６ｂｐ離したＴＡＬＥＮ対は約６倍多いクロラムフェニコール耐性コロニーを生じさせたが、２８ｂｐ離したＴＡＬＥＮ対は非標的化インテグラーゼと同様であったことを実証する実験データを示す。 ＡからＣを含み、実験結果を示す。Ａは、ｅ ｃｏｌｉ中のａｍｉｌＣＰ色素タンパク質の発現が紫色のｅ ｃｏｌｉを生じさせることを示す（白矢尻）。ウイルス末端を含有するドナー配列のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みは、ａｍｉｌＣＰの発現（オレンジ色の矢尻）（カナマイシンプレート上での増殖）を妨害する。Ｂは、哺乳動物細胞における、平滑末端（ＳｃａＩ切断）または３’プロセシング模倣（ＦａｕＩ切断）末端のいずれかを有するＩｎｓｒｔ ＩＧＲ－ＣＡＴドナー鋳型のｐＣＲＩＩ－ａｍｉｌＣＰレポーターへの組み込みを示す。興味深いことに、ｄＣａｓ９への融合体としてのＣ末端非特異的ＤＮＡ結合ドメインの欠失は、インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みを阻害しない。３’プロセシングを模倣する末端を使用すると、ＣＡＴ耐性クローンの約２倍の増加が示される。Ｃは、プラスミドＤＮＡにおけるインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みに対するインテグラーゼ突然変異の評価を示す。二量体化阻害突然変異（Ｅ８５Ｇ及びＥ８５Ｆ）は、ＩＧＲ－ＣＡＴドナー鋳型のａｍｉｌＣＰへの二重ガイドＲＮＡ標的化組み込みを使用したインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みを妨害しない。しかしながら、ＩＮ Ｅ８７Ｇ突然変異を、対形成した標的化ｓｇＲＮＡによって回復させることはできない。興味深いことに、ｄＣａｓ９へのタンデムＩＮΔＣ融合体（ｔｄＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９）は、約２倍向上した組み込みを示す。
本発明は、遺伝物質を編集するための融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸、系及び方法に関する。一実施形態では、本発明は、レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）融合タンパク質、及びレトロウイルスＩＮ－Ｃａｓ融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ融合タンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。
本発明の融合タンパク質、核酸分子、系及び方法は、ドナーＤＮＡ配列を標的ゲノム位置に送達する能力を有する。さらに、本発明は、相同性アームを不要にしてガイドＲＮＡによる標的化に依存し、遺伝物質の編集を大幅に簡素化する。
一態様では、本発明は、ＩＮ－Ｃａｓ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、融合タンパク質は、第１のアミノ酸配列を有するレトロウイルスＩＮまたはその断片、第２のアミノ酸配列を有するＣａｓタンパク質、及び第３のアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。
一態様では、本発明は、ＩＮ－Ｃａｓ融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸分子は、レトロウイルスＩＮまたはその断片をコードする第１の核酸配列、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列、及びＮＬＳをコードする第３の核酸配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮであり得る。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１ ＮＬＳなどのレトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、レトロトランスポゾンＮＬＳは、核局在化を増加させる。
一態様では、本発明は、遺伝物質を編集するための系を提供する。一実施形態では、この系は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、この融合タンパク質がレトロウイルスＩＮまたはその断片、Ｃａｓタンパク質及びＮＬＳを含む核酸配列；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；ならびにドナー鋳型核酸をコードする核酸配列であって、このドナー鋳型核酸がＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含む核酸配列を、１つ以上のベクターに含む。
一態様では、本発明は、遺伝物質を編集するための方法を提供する。一実施形態では、本発明の核酸分子；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；Ｕ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を投与することを含む方法。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。
概して、本明細書で使用される命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、及び核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。
核酸及びペプチド合成には、標準的技術が使用される。技術及び手順は、概して、当該技術分野における従来の方法及び本明細書全体にわたり提供される様々な一般的な参照文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に従って実施される。
本明細書で使用される命名法ならびに以下に記載される分析化学及び有機合成で使用される実験手順は、当該技術分野で周知であり、一般的に用いられるものである。標準的技術またはその改変は、化学合成及び化学分析に使用される。
本発明の文脈中で（特に特許請求の範囲の文脈中で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語及び類似の用語は、本明細書中に別段の定めなき限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むと解釈されるべきである。
量、時間の持続期間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」は、指定の値から±２０％、または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を、そのような変動が開示された方法を実施するために適切である場合に包含することを意味する。
「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、または非コード鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書で定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列が、ＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上に指定された調節配列に相補的であり得、この調節配列は、コード配列の発現を制御する。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合は動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態がその障害が存在しないときよりも好ましくない、健康状態である。障害は、治療せずに放置しても必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、そのような徴候もしくは症状が患者によって経験される頻度、またはその両方が低減される場合、疾患または障害は「軽減」される。
「コードする」とは、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれか、及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能するための、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の性質を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を生じさせる場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書において互換的に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏであるかｉｎ ｖｉｖｏであるかを問わず、本明細書に記載の方法に適用可能な任意の動物またはその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか、またはそれらに結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種に由来する抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つ以上の種に由来するその抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間の反応性それ自体が、特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なる対立遺伝子形態にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性それ自体が、特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。
場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して、この相互作用が、化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するのに使用され得る。例えば、抗体はタンパク質全体にではなく、特定のタンパク質構造を認識してそれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」及び抗体を含む反応物中にエピトープＡ（または遊離の非標識のＡ）を含む分子が存在すると、抗体に結合する標識されたＡの量が減少する。
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子のコード領域とそれぞれ相同または相補的である、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と一致するかまたは停止コドンをコードする、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。したがって、コード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基のコドンを含むヌクレオチド残基（例えば、タンパク質輸送シグナル配列中のアミノ酸残基）を含み得る。
核酸に言及するために本明細書で使用される「相補的」は、２つの核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域に対して逆平行である第２の核酸領域の残基と、この残基がチミンまたはウラシルである場合に特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）できることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第１の鎖に対して逆平行である第２の核酸鎖の残基と、この残基がグアニンである場合に塩基対形成できることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行の形で配置され、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対形成できる場合、同一または異なる核酸の第２の領域と相補的である。一実施形態では、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１及び第２の部分が逆平行の形で配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。一実施形態では、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できる。
本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸と定義される。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列のそのプロモーターによって駆動される転写及び／または翻訳として定義される。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は続いて、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合では、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の転写及び場合により翻訳に必要な核酸配列を指す、様々な制御配列を含み得る。転写及び翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能も同様に果たす核酸配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体形態または変異体形態とは区別される、自然界に存在するような生物、株、遺伝子または特徴の典型的な形態を意味する。
「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）があってもよい。相同性は、多くの場合、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ．１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ． Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５の Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、挿入、及び他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、類似配列を合致させる。保存的置換は、通常、以下の群、すなわち、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。
「単離された」とは、天然状態から変化または除去されたことを意味する。例えば、生存している動物においてその通常の状況で天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状況の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように核酸に関して使用されるとき、その供給源中で通常会合している少なくとも１つの混入物から同定され、分離される核酸配列を指す。したがって、単離された核酸は、それが自然界に見出されるものとは異なる形態または状況に存在する。対照的に、単離されていない核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それらが自然界に存在する状態で見出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多数のタンパク質をコードする複数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見出される。しかしながら、単離された核酸は、例として、その核酸を通常発現する細胞中のそのような核酸を含み、そこで核酸は、天然細胞のものと異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ自然界に見出されるものと異なる核酸配列に隣接している。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用されるとき、このオリゴヌクレオチドは、センス鎖またはコード鎖を最低限含む（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であってよい）が、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドは、二本鎖であってもよい）。
「単離された」という用語は、「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」のようにポリペプチドに関して使用されるとき、その供給源中で通常会合している少なくとも１つの混入物から同定され、分離されるポリペプチドを指す。したがって、単離された核酸は、それが自然界に見出されるものとは異なる形態または状況に存在する。対照的に、単離されていないポリペプチド（例えば、タンパク質及び酵素）は、それらが自然界に存在する状態で見出される。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドで構成されているかまたはリボヌクレオシドで構成されているかにかかわらず、かつホスホジエステル結合で構成されているかまたは修飾結合、例えば、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートもしくはスルホン結合、及びそのような結合の組み合わせで構成されているかにかかわらず、任意の核酸を意味する。核酸という用語はまた、生物学的に存在する５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基から構成される核酸も具体的に含む。「核酸」という用語は、通常、大型のポリヌクレオチドを指す。
本明細書では、ポリヌクレオチド配列を記述するために従来の表記法が使用される。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’方向と称される。
新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と称され、ＤＮＡ上の参照点に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と称され、ＤＮＡ鎖上の参照点に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と称される。
「発現カセット」とは、コード配列の転写及び場合により翻訳に必要なプロモーター／調節配列に作動可能に連結されたコード配列を含む核酸分子を意味する。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、所与の遺伝子の転写及び／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が産生されるような方法での核酸配列の連結を指す。この用語はまた、機能的（例えば、酵素的に活性、結合パートナーに結合することが可能、阻害することが可能など）タンパク質またはポリペプチドが産生されるような方法でアミノ酸をコードする配列の連結を指す。
本明細書で使用される場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の例では、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列及び他の調節エレメントを含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を誘導可能な方法で発現させるものであり得る。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションに関する「ストリンジェントな条件」は、標的配列に対して相補性を有する核酸が標的配列と主にハイブリダイズし、非標的配列に実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に配列依存的であり、いくつかの要因によって変動する。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ １，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳細が記載されている。
「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対形成、フーグスティーン結合、または他の任意の配列特異的な方法により生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断などの、より広範なプロセスのステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所与の配列の「相補体」と称される。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、プロモーターに対応するインデューサーが存在する場合にのみ遺伝子産物を実質的に産生させるヌクレオチド配列である。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合、細胞中で細胞の大部分またはすべての生理学的条件下において遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸及びポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これを単量体の「ヌクレオチド」に加水分解することができるという一般的知識を有する。単量体ヌクレオチドを、ヌクレオシドに加水分解することができる。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定されないが、当該技術分野で利用可能な任意の手段によって得られるすべての核酸配列が含まれ、これら手段には、限定されないが、通常のクローニング技術及びＰＣＲなどを使用した、ならびに合成的手段による、組換え手段すなわち組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングが含まれる。
本発明との関係において、一般に存在する核酸塩基に関する以下の略称が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに連結した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当該技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短い鎖と、当該技術分野で一般にタンパク質と称され、多くのタイプが存在するより長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で使用される「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸と定義される。
「組換えポリヌクレオチド」は、天然に互いに連結していない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅またはアセンブルした組換えポリヌクレオチドを適切なベクターに含めることができ、このベクターを、適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
組換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）も同様に果たすことができる。
本明細書で使用される「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ法を使用することによって産生されるポリペプチドとして定義される。
本明細書で使用される場合、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）」は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって作製される人工制限酵素である。これらの反応物質は、効率的でプログラム可能な特異的ＤＮＡ切断を可能にし、遺伝物質をｉｎ ｓｉｔｕで編集するための強力なツールを代表する。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を、ほぼ任意のＤＮＡ配列に結合するように迅速に操作することができる。本明細書で使用されるＴＡＬＥＮという用語は広義であり、別のＴＡＬＥＮの補助なしに二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語は、同じ部位でＤＮＡを切断するために共に機能するように操作された、ＴＡＬＥＮ対の一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。共に機能するＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの掌性を参照して左ＴＡＬＥＮ及び右ＴＡＬＥＮと称される場合がある。米国シリアル番号第１２／９６５，５９０号、米国シリアル番号第１３／４２６，９９１号（米国特許番号第８，４５０，４７１号）、米国シリアル番号第１３／４２７，０４０号（米国特許番号第８，４４０，４３１号）、米国シリアル番号第１３／４２７，１３７号（米国特許番号第８，４４０，４３２号）、及び米国シリアル番号第１３／７３８，３８１号（これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
「変異体」とは、この用語が本明細書で使用される場合、それぞれ参照核酸配列または参照ペプチド配列とは配列が異なるが、参照分子の本質的な生物学的特性を保持する、核酸配列またはペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変化させない場合もあれば、またはアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及びトランケーションを生じさせる場合もある。ペプチド変異体の配列の変化は、通常、限定的または保存的であるため、参照ペプチド及び変異体の配列は全体的に極めて類似しており、多くの領域では同一である。変異体及び参照ペプチドは、任意の組み合わせでの１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。核酸またはペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在するものであり得るか、または天然に存在することが知られていない変異体であり得る。核酸及びペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術または直接合成によって作製することができる。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが、当該技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で表すことができる。範囲形式での記載は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する不可変の制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値に加えて、すべての考えられる副次的範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６などに加えて、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの副次的範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
融合タンパク質
一態様では、本発明は、核に効果的に送達される編集タンパク質の新規融合体の開発に基づく。一態様では、本発明は、編集タンパク質と第２のアミノ酸配列を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）とを含む融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置での、核酸分子の一方または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１塩基対以内、約２塩基対以内、約３塩基対以内、約４塩基対以内、約５塩基対以内、約６塩基対以内、約７塩基対以内、約８塩基対以内、約９塩基対以内、約１０塩基対以内、約１５塩基対以内、約２０塩基対以内、約２５塩基対以内、約５０塩基対以内、約１００塩基対以内、約２００塩基対以内、約５００塩基対以内、またはそれを超える塩基対以内の一方または両方の鎖の切断を誘導する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３またはＣｐｆ１である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９、またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０ ＶＰ１もしくはＳＶ４０ ＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６及び配列番号２５４～２５７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳタンパク質は、配列番号４７～５６及び配列番号２５４～２５７のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態では、Ｔｙ様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸ、及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、配列番号２７５～８８７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳタンパク質は、配列番号２７５～８８７のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２４９～２５０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２４９～２５０のうちの１つの配列を含む。
一態様では、本発明は、核に効果的に送達される、編集タンパク質とレトロウイルスインテグラーゼタンパク質との新規融合体の開発に基づく。これらの融合タンパク質は、ウイルスインテグラーゼのＤＮＡ組み込み活性と、触媒的に死んだＣａｓのプログラム可能なＤＮＡ標的化能力とを組み合わせる。したがって、この融合タンパク質はＤＮＡ挿入について細胞経路に依存しないか、またはＡＴＰなどの細胞エネルギー源を必要としないため、この酵素は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏから原核細胞、分裂真核細胞または非分裂真核細胞に至るまで、多くの状況で機能することができる。さらに、インテグラーゼは挿入に相同性領域を必要とせず、各インテグラーゼファミリーに特異的な小さな末端モチーフ配列のみを必要とするため、これらの融合タンパク質の編集は、複数のガイドＲＮＡによって誘導される場合、多重ゲノム組み込みのための単一ＤＮＡドナー鋳型を利用することができる。
したがって、一態様では、本発明は、第１のアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、第２のアミノ酸配列を有する核局在化シグナル（ＮＬＳ）、及び第３のアミノ酸配列を有するレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片もしくは変異体を含む融合タンパク質を提供する。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮである。
一実施形態では、インテグラーゼは、レトロトランスポゾンインテグラーゼである。一実施形態では、レトロトランスポゾンインテグラーゼは、Ｔｙ１またはＴｙ２である。一実施形態では、インテグラーゼは、細菌インテグラーゼである。一実施形態では、細菌インテグラーゼは、ｉｎｓＦである。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ＨＩＶ ＩＮである。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、この置換は、触媒活性を改善するか、溶解性を改善するか、または１つ以上の宿主細胞補因子との相互作用を増加させる。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、Ｅ８５Ｇ、Ｅ８５Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｆ１８５Ｋ、Ｃ２８０Ｓ、Ｔ９７Ａ、Ｙ１３４Ｒ、Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈからなる群から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上または９つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｆ１８５Ｋ及びＣ２８０Ｓを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｔ９７Ａ及びＹ１３４Ｒを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈを含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＩＮ触媒コアドメイン（ＣＣＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤ及びＩＮ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＮＴＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＴＤを含む。一実施形態では、インテグラーゼの断片は、完全長インテグラーゼの少なくとも１つの活性を保持している。レトロウイルスインテグラーゼの機能及び断片は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１１：１９４－２０５、及びＭａｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ ４６８：３２６－２９に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、配列番号１～４０のうちの１つの配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓドメインは、Ｃａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置での、核酸分子の一方または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１塩基対以内、約２塩基対以内、約３塩基対以内、約４塩基対以内、約５塩基対以内、約６塩基対以内、約７塩基対以内、約８塩基対以内、約９塩基対以内、約１０塩基対以内、約１５塩基対以内、約２０塩基対以内、約２５塩基対以内、約５０塩基対以内、約１００塩基対以内、約２００塩基対以内、約５００塩基対以内、またはそれを超える塩基対以内の一方または両方の鎖の切断を誘導する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３またはＣｐｆ１である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９、またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０ ＶＰ１もしくはＳＶ４０ ＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６及び配列番号２５４～２５７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳタンパク質は、配列番号４７～５６及び配列番号２５４～２５７のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態では、Ｔｙ様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸ、及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、配列番号２７５～８８７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳタンパク質は、配列番号２７５～８８７のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２４９～２５０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２４９～２５０のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、２つの異なるＮＬＳの組み合わせを含む。例えば、一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１由来のＮＬＳ及びＳＶ４０由来のＮＬＳを含む。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、同じＮＬＳの２つのコピーを含む。例えば、一実施形態では、ＮＬＳは、第１のＴｙ１由来のＮＬＳと第２のＴｙ１由来のＮＬＳの多量体を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である第１の配列、ならびに配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である第２の配列を含む。一実施形態では、第１の配列及び第２の配列は同じである。一実施形態では、第１の配列及び第２の配列は異なる。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７～９８のうちの１つに対して７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７～９８のうちの１つの配列を含む。
本発明のペプチドは、化学的な方法を使用して作製することができる。例えば、ペプチドを、固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２－２０４）によって合成し、樹脂から切断して、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。自動合成は、例えば、製造業者より提供された指示に従って、ＡＢＩ ４３１ Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して行うことができる。
本発明はまた、本明細書に開示される融合タンパク質に対して実質的な相同性を有する任意の形態のペプチドを含むと解釈されるべきである。一実施形態では、「実質的に相同」であるペプチドは、本明細書に開示される融合タンパク質のアミノ酸配列に対して約５０％相同、約７０％相同、約８０％相同、約９０％相同、約９５％相同、または約９９％相同である。
あるいは、ペプチドを、組換え手段によって、またはより長いポリペプチドからの切断によって作製することができる。ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することができる。
本発明によるペプチドの変異体は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされていてもコードされていなくてもよいもの、（ｉｉ）１つ以上の修飾アミノ酸残基、例えば、置換基の付加によって修飾される残基が存在するもの、（ｉｉｉ）ペプチドが本発明のペプチドの代替のスプライス変異体であるもの、（ｉｖ）ペプチドの断片、及び／または（ｖ）ペプチドが別のペプチド、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または精製に使用される配列（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出に使用される配列（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）に融合しているものであり得る。断片には、元の配列のタンパク質分解切断（多部位タンパク質分解を含む）を介して生成されたペプチドが含まれる。変異体は、翻訳後修飾または化学的修飾されていてもよい。そのような変異体は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると見なされる。
当該技術分野において公知のように、２つのペプチド間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸代替物を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。変異体は、元の配列とは異なるペプチド配列を含むと定義される。一実施形態では、変異体は、対象のセグメントあたりの残基の４０％未満で元の配列と異なるか、対象のセグメントあたりの残基の２５％未満で元の配列と異なるか、対象のセグメントあたりの残基の１０％未満で異なるか、または対象のセグメントあたりわずか数残基で元のタンパク質配列とは異なり、同時に、元の配列の機能性及び／または幹細胞の骨芽細胞系統への分化を刺激する能力を維持するために、元の配列と十分に相同である。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似しているかまたは同一であるアミノ酸配列を含む。２つのペプチド間の同一性の程度は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズム及び方法を使用して決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）］を使用することにより決定することができる。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾され得る。例えば、本発明の範囲内にある翻訳後修飾には、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディング及びタンパク質分解プロセシングなどが含まれる。いくつかの修飾またはプロセシング事象は、さらなる生物学的機構の導入を必要とする。例えば、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化などのプロセシング事象は、イヌミクロソーム膜またはＸｅｎｏｐｕｓ卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を標準的な翻訳反応に加えることによって検査される。
本発明のペプチドは、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成される非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するための様々なアプローチが利用可能である。
本発明のペプチドまたはタンパク質は、Ｒｅｅｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（４）：１３６５，１９９２）に記載されている方法などの従来の方法を使用してリン酸化することができる。
本発明のペプチドの環状誘導体もまた、本発明の一部である。環化により、ペプチドは他の分子との会合により好ましい立体構造をとることができる。環化は、当該技術分野で公知の技術を使用して行うことができる。例えば、ジスルフィド結合を、遊離スルフヒドリル基を有する適切に離間した２つの成分の間に形成することができ、またはアミド結合を、一方の成分のアミノ基と別の成分のカルボキシル基との間に形成することができる。環化はまた、Ｕｌｙｓｓｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，８４６６－８４６７に記載されているアゾベンゼン含有アミノ酸を使用して行うことができる。結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、またはその２つの組み合わせであり得る。本発明の一実施形態では、環状ペプチドは、右位置にベータターンを含み得る。アミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを右位置に付加することにより、ベータターンを本発明のペプチドに導入することができる。
前述のようなペプチド結合連結を含む環状ペプチドよりも、より可撓性のある環状ペプチドを生成することが望ましい場合がある。より可撓性のあるペプチドは、ペプチドの左右の位置にシステインを導入し、２つのシステインの間にジスルフィドブリッジを形成することによって調製することができる。２つのシステインは、ベータシート及びターンを変形させないように配置される。このペプチドは、ジスルフィド結合の長さ、及びベータシート部分の水素結合数の減少の結果として、より可撓性が高い。環状ペプチドの相対的な可撓性は、分子動力学シミュレーションによって測定することができる。
本発明はまた、標的タンパク質に、及び／またはキメラタンパク質を所望の細胞成分もしくは細胞タイプもしくは組織へと誘導することができる標的化ドメインに、融合されたかまたは組み込まれたＩＮ－Ｃａｓ９ペプチドを含むペプチドに関する。キメラタンパク質はまた、追加のアミノ酸配列またはドメインを含み得る。キメラタンパク質は、様々な成分が異なる供給源に由来し、したがって自然界では一緒に見出されない（すなわち、異種である）という意味において組換えである。
一実施形態では、標的化ドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、または例えば小胞もしくは核と会合するようにタンパク質を誘導する配列であり得る。一実施形態では、標的化ドメインは、ペプチドを特定の細胞タイプまたは組織に標的化することができる。例えば、標的化ドメインは、細胞表面リガンドまたは標的組織の細胞表面抗原に対する抗体であり得る。標的化ドメインは、本発明のペプチドを細胞成分に標的化することができる。
本発明のペプチドを、従来技術により合成することができる。例えば、ペプチドまたはキメラタンパク質を、固相ペプチド合成を使用する化学合成によって合成することができる。これらの方法は、固相合成方法または液相合成方法のいずれかを用いる（例えば、固相合成技術については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．（１９８４）及びＧ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ Ｖｏｌ．２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．３－２５４、ならびに古典的な溶液合成については、Ｍ Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４、及びＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒｓ，Ｖｏｌ １を参照されたい）。例として、本発明のペプチドは、Ｎ－フルオレニルメトキシ－カルボニル－Ｏ－ベンジル－Ｌ－ホスホスレオニン誘導体としてホスホスレオニンを直接導入する、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相化学を使用して合成することができる。
他の分子とコンジュゲートされた本発明のペプチドまたはキメラタンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質は、ペプチドまたはキメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端と、所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質または選択マーカーの配列を組換え技術により融合することによって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載の選択されたタンパク質またはマーカータンパク質に融合されたＩＮ－Ｃａｓ９ペプチドを含有する。融合タンパク質を調製するために使用することができるタンパク質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）及び短縮型ｍｙｃが挙げられる。
本発明のペプチドは、生物学的発現系を使用して開発することができる。これらの系の使用により、ランダムペプチド配列の大型ライブラリーの作成、及び特定のタンパク質に結合するペプチド配列についてのこれらのライブラリーのスクリーニングが可能となる。ライブラリーは、ランダムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることにより作成することができる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ １９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ １９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８を参照されたい）。ライブラリーは、重複ペプチドの同時合成によっても構築することもできる（米国特許第４，７０８，８７１号を参照されたい）。
本発明のペプチド及びキメラタンパク質は、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸など、または有機酸、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸と反応させることにより、医薬塩へと変換することができる。
核酸
一実施形態では、本発明の方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸分子は、編集タンパク質をコードする第１の核酸配列、及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする第２の核酸配列を含む。
一実施形態では、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、編集タンパク質は、Ｃａｓタンパク質である。
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、ＳｐＣａｓ９、ＳｔＣａｓ９、ＮｍＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、ＡｓＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＦｎＣｐｆ１、ＶＲＥＲ ＳｐＣａｓ９、ＶＱＲ ＳｐＣａｓ９、ｘＣａｓ９ ３．７、それらのホモログ、それらのオルソログ、またはそれらの改変型が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列内及び／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置での、核酸分子の一方または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１塩基対以内、約２塩基対以内、約３塩基対以内、約４塩基対以内、約５塩基対以内、約６塩基対以内、約７塩基対以内、約８塩基対以内、約９塩基対以内、約１０塩基対以内、約１５塩基対以内、約２０塩基対以内、約２５塩基対以内、約５０塩基対以内、約１００塩基対以内、約２００塩基対以内、約５００塩基対以内、またはそれを超える塩基対以内の一方または両方の鎖の切断を誘導する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３またはＣｐｆ１である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、第２の核酸配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする。一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９、またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０ ＶＰ１もしくはＳＶ４０ ＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１様ＮＬＳである。例えば、一実施形態では、Ｔｙ様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｃ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、ＫＫＲＸモチーフ及びＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、Ｎ末端にＫＫＲＸ、及びＣ末端にＫＫＲモチーフを含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、少なくとも２０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、Ｔｙ１様ＮＬＳは、２０～４０個のアミノ酸を含む。
一実施形態では、レトロトランスポゾンＮＬＳは、核局在化を増加させる。一実施形態では、レトロトランスポゾンＮＬＳは、非レトロトランスポゾンＮＬＳと比較して、核局在化を著しく増加させる。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２４９～２５０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号２４９～２５０のうちの１つの配列を含む融合タンパク質をコードする。
一実施形態では、核酸分子は、編集タンパク質をコードする第１の核酸配列、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする第２の核酸配列、及びレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片をコードする第３の核酸配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮである。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ＨＩＶ ＩＮである。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、この置換は、触媒活性を改善するか、溶解性を改善するか、または１つ以上の宿主細胞補因子との相互作用を増加させる。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、Ｅ８５Ｇ、Ｅ８５Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｆ１８５Ｋ、Ｃ２８０Ｓ、Ｔ９７Ａ、Ｙ１３４Ｒ、Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈからなる群から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上または９つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｆ１８５Ｋ及びＣ２８０Ｓを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｔ９７Ａ及びＹ１３４Ｒを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈを含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＩＮ触媒コアドメイン（ＣＣＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤ及びＩＮ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＮＴＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＴＤを含む。一実施形態では、インテグラーゼの断片は、完全長インテグラーゼの少なくとも１つの活性を保持している。レトロウイルスインテグラーゼの機能及び断片は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４１１：１９４－２０５、及びＭａｅｒｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ ４６８：３２６－２９に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第３の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第３の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第３の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第３の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、編集タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）タンパク質、及びＤＮＡ結合タンパク質を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、編集タンパク質は、Ｃａｓタンパク質である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３またはＣｐｆ１である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。
一実施形態では、第１の核酸配列は、Ｃａｓタンパク質をコードする。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第１の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、第２の核酸配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする。一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９、またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０ ＶＰ１もしくはＳＶ４０ ＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ２）、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、レトロトランスポゾンＮＬＳは、核局在化を増加させる。一実施形態では、レトロトランスポゾンＮＬＳは、非レトロトランスポゾンＮＬＳと比較して、核局在化を著しく増加させる。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５７及び配列番号２７５～８８７のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第２の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つの配列を含む融合タンパク質をコードする。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つの核酸配列を含む。
融合タンパク質をコードする単離された核酸配列は、当該技術分野において公知の多数の組換え方法のいずれかを使用して、例えば、標準的技術を使用して、その遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、その遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、またはその遺伝子を含む細胞及び組織から直接単離することなどによって得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローニングするのではなく合成的に生成することができる。
単離された核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意のタイプの核酸を含み得る。例えば、一実施形態では、組成物は例えば、本発明の融合タンパク質をコードする、単離されたｃＤＮＡ分子を含む単離されたＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、組成物は、本発明の融合タンパク質をコードする単離されたＲＮＡ分子、またはその機能的断片を含む。
本発明の核酸分子は、血清中または細胞培養用の増殖培地中の安定性を改善するように修飾することができる。本発明の核酸分子の安定性、機能性及び／または特異性を向上させ、免疫刺激特性を最小化するために、修飾を加えることができる。例えば、安定性を向上させるために、３’残基を分解に対して安定化させることができ、例えば、それらを、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択することができる。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換は許容され、分子の機能に影響を及ぼさない。
本発明の一実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含み得る。例えば、末端は、修飾ヌクレオチド類似体を導入することによって安定化され得る。
ヌクレオチド類似体の非限定的な例には、糖修飾及び／または骨格修飾リボヌクレオチドが含まれる（すなわち、リン酸－糖骨格への修飾が含まれる）。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに連結するリン酸エステル基は、修飾基、例えば、ホスホチオエート基の修飾基によって置換されている。例示的な糖修飾リボヌクレオチドでは、２’－ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ2、ＮＨＲ、ＮＲ2またはＯＮから選択される基（式中、ＲはＣ1～Ｃ6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）によって置換されている。
修飾の他の例は、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有するリボヌクレオチドである。アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように塩基を修飾することができる。例示的な修飾核酸塩基には、限定されないが、５位で修飾されたウリジン及び／またはシチジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシン及び／またはグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－アルキル化及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンが含まれ、好適である。前述の修飾を組み合わせてもよいことに留意されたい。
場合によっては、核酸分子は、以下の化学修飾のうちの１つ以上、すなわち、１つ以上のヌクレオチドの２’－Ｈ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、または２’－ＯＨ修飾を含む。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼに対する向上した耐性を有し得る。ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、核酸分子は、例えば、２’－修飾リボース単位及び／またはホスホロチオエート結合を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。ヌクレアーゼ耐性を増加させるために、本発明の核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－フッ素、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－アミノ、及び／またはホスホロチオエート結合を含み得る。ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば２’－４’－エチレン架橋核酸の包含、及び２－アミノ－Ａ修飾、２－チオ（例えば、２－チオ－Ｕ）修飾、Ｇ－クランプ修飾などの特定の核酸塩基修飾もまた、標的に対する結合親和性を増加させることができる。
一実施形態では、核酸分子は、２’－修飾ヌクレオチド、例えば、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。一実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、核酸分子のすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、以下の特性のうちの１つ以上を有する。
本明細書で論じられる核酸剤は、特に修飾されていないＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびに例えば有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびにヌクレオシド代替物のポリマーを含む。非修飾ＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち糖、塩基及びリン酸部分が自然界に存在するもの、または人体に天然に存在するものと同じかまたは本質的に同じである分子を指す。当該技術分野では、稀または特殊であるが天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称しており、例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２：２１８３－２１９６）を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと称されるこのような稀または特殊なＲＮＡは、通常、転写後修飾の結果であり、本明細書で使用される非修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書で使用される修飾ＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち糖、塩基及びリン酸部分の１つ以上が、自然界に存在するものと異なるか、または人体に存在するものと異なる分子を指す。それらは「修飾ＲＮＡ」と称されるが、修飾に起因して、厳密に言えばＲＮＡではない分子も当然ながら含まれることになる。ヌクレオシド代替物とは、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格で見られるものと実質的に類似するように、塩基を正しい空間関係で提示することが可能となる非リボリン酸構築物、例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣物で、リボリン酸骨格が置換されている分子である。
本発明の核酸の修飾は、リン酸基、糖基、骨格、Ｎ末端、Ｃ末端、または核酸塩基のうちの１つ以上に存在し得る。
本発明はまた、本発明の単離された核酸が挿入されたベクターを含む。当該技術分野には、本発明において有用である適切なベクターが豊富に存在する。
簡単に要約すると、本発明の融合タンパク質をコードする天然または合成核酸の発現は、通常、本発明の融合タンパク質またはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに導入することにより行われる。使用するベクターは、真核細胞における複製、及び場合により組み込みに適している。典型的なベクターには、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターが含まれる。
本発明のベクターはまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用する核酸免疫化及び遺伝子治療に使用することができる。遺伝子送達の方法は当該技術分野で公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
本発明の単離された核酸は、多数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に対象となるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及び配列決定ベクターが含まれる。
さらに、ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に供給することができる。ウイルスベクター技術は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１種の生物において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
送達系及び方法
一態様では、本発明は、新規のレンチウイルスパッケージング及び送達系の開発に関する。レンチウイルス粒子は、ウイルス酵素をタンパク質として送達する。このような方法では、レンチウイルス酵素が短命であることから、細胞の生涯にわたる長期間の発現に起因するオフターゲット編集の可能性が制限される。編集成分、または従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ編集成分をタンパク質としてレンチウイルス粒子に導入することは、それらの必要な活性が短期間のみ必要とされることを考慮すると有利である。したがって、一実施形態では、本発明は、レンチウイルス送達系、ならびにレンチウイルス送達系を使用した本発明の組成物の送達、遺伝物質の編集、及び核酸送達の方法を提供する。
例えば、一態様では、送達系は、（１）パッケージングプラスミド、（２）導入プラスミド、及び（３）エンベローププラスミドを含む。一実施形態では、パッケージングプラスミドは、修飾ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、修飾ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、編集タンパク質に融合されたインテグラーゼを含む。一実施形態では、修飾ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、Ｃａｓタンパク質に融合されたインテグラーゼを含む。一実施形態では、修飾ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、触媒的に死んだＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）に融合されたインテグラーゼを含む。一実施形態では、パッケージングプラスミドは、ｓｇＲＮＡ配列をコードする配列をさらに含む。
一実施形態では、導入プラスミドは、ドナー配列を含む。ドナー配列は、ゲノムに送達される任意の核酸配列であり得る。一実施形態では、導入プラスミドは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列及び３’ＬＴＲ配列を含む。一実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。したがって、一実施形態では、５’ＬＴＲは、Ｕ３配列、Ｒ配列及びＵ５配列を含み、３’ＬＴＲは、Ｒ配列及びＵ５配列を含むが、Ｕ３配列を含まない。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、Ｉｎｓｃｔｒｉｐｔｒパッケージングプラスミド中のインテグラーゼに特異的である。
一実施形態では、エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、水疱性口内炎ウイルスｇタンパク質エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、所望の細胞タイプに基づいて選択され得る。
一実施形態では、パッケージングプラスミド、導入プラスミド及びエンベローププラスミドは、細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、修飾ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、修飾ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列を転写する。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、インテグラーゼ－Ｃａｓ融合タンパク質に結合する。一実施形態では、細胞は、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ドナー配列を転写して、ドナー配列ＲＮＡ分子をもたらす。一実施形態では、ｓｇＲＮＡに結合する修飾ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質、エンベロープポリタンパク質及びドナー配列ＲＮＡは、ウイルス粒子にパッケージングされる。一実施形態では、ウイルス粒子は細胞培地から採取される。一実施形態では、ウイルス粒子は標的細胞を形質導入し、ここで、ｓｇＲＮＡは細胞ＤＮＡの標的領域に結合し、これによりＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質を標的化し、インテグラーゼはドナー配列の細胞ＤＮＡへの組み込みを触媒する。
一態様では、送達系は、（１）パッケージングプラスミド、（２）導入プラスミド、（３）エンベローププラスミド、及び（４）ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドを含む。一実施形態では、パッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、触媒的に死んだインテグラーゼを含む。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、Ｄ１１６Ｎインテグラーゼ突然変異を含む。
一実施形態では、導入プラスミドは、ドナー配列を含む。ドナー配列は、ゲノムに送達される任意の核酸配列であり得る。一実施形態では、導入プラスミドは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列及び３’ＬＴＲ配列を含む。一実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。したがって、一実施形態では、５’ＬＴＲは、Ｕ３配列、Ｒ配列及びＵ５配列を含み、３’ＬＴＲは、Ｒ配列及びＵ５配列を含むが、Ｕ３配列を含まない。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓパッケージングプラスミド中のインテグラーゼに特異的である。
一実施形態では、エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、水疱性口内炎ウイルスｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、所望の細胞タイプに基づいて選択され得る。
一実施形態では、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドは、ＶＰＲ、インテグラーゼ及び編集タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドは、ＶＰＲ、インテグラーゼ及びＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドは、ＶＰＲ、インテグラーゼ及びｄＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＶＰＲとインテグラーゼとの間にプロテアーゼ切断部位を含む。一実施形態では、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドパッケージングプラスミドは、ｓｇＲＮＡ配列をコードする配列をさらに含む。
一実施形態では、パッケージングプラスミド、導入プラスミド、エンベローププラスミド及びＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドは、細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ドナー配列を転写して、ドナー配列ＲＮＡ分子をもたらす。一実施形態では、細胞は、融合タンパク質を転写及び翻訳して、ＶＰＲ－インテグラーゼ－編集タンパク質融合タンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、融合タンパク質を転写及び翻訳して、ＶＰＲ－インテグラーゼ－ｄＣａｓ融合タンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列を転写する。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＶＰＲ－インテグラーゼ－ｄＣａｓ融合タンパク質に結合する。
一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質、エンベロープポリタンパク質、ドナー配列ＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡに結合するＶＰＲ－インテグラーゼ－ｄＣａｓ９タンパク質は、ウイルス粒子にパッケージングされる。一実施形態では、ウイルス粒子は細胞培地から採取される。一実施形態では、ＶＰＲは、プロテアーゼ部位を介してウイルス粒子内の融合タンパク質から切断され、ＩＮ－ｄＣａｓ融合タンパク質をもたらす。一実施形態では、ウイルス粒子は標的細胞を形質導入し、ここで、ｓｇＲＮＡは細胞ＤＮＡの標的領域に結合し、これによりＩＮ－ｄＣａｓ融合タンパク質を標的化し、インテグラーゼはドナー配列の細胞ＤＮＡへの組み込みを触媒する。
一態様では、送達系は、（１）導入プラスミド、（２）パッケージングプラスミド、及び（３）エンベローププラスミドを含む。一実施形態では、パッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、触媒的に死んだインテグラーゼを含む。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、Ｄ１１６Ｎインテグラーゼ突然変異を含む。
一実施形態では、導入プラスミドは、ｓｇＲＮＡをコードする核酸、ならびにインテグラーゼ及び編集タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、導入プラスミドは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列及び３’ＬＴＲ配列を含む。一実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。したがって、一実施形態では、５’ＬＴＲは、Ｕ３配列、Ｒ配列及びＵ５配列を含み、３’ＬＴＲは、Ｒ配列及びＵ５配列を含むが、Ｕ３配列を含まない。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、融合タンパク質のインテグラーゼに特異的である。一実施形態では、融合タンパク質は、インテグラーゼ及びＣａｓタンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、インテグラーゼ及びｄＣａｓタンパク質を含む。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、融合タンパク質をコードする配列及びｓｇＲＮＡをコードする配列に隣接する。
一実施形態では、エンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、水疱性口内炎ウイルスｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、所望の細胞タイプに基づいて選択され得る。
一実施形態では、パッケージングプラスミド、導入プラスミド及びエンベローププラスミドは、細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列を転写する。一実施形態では、細胞は、融合タンパク質をコードする核酸配列を転写する。
一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質、エンベロープポリタンパク質、ドナー配列ＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡに結合するＶＰＲ－インテグラーゼ－ｄＣａｓ９タンパク質は、ウイルス粒子にパッケージングされる。一実施形態では、ウイルス粒子は細胞培地から採取される。一実施形態では、ウイルス粒子は標的細胞を形質導入し、ここで、ウイルスは逆翻訳し、細胞は融合タンパク質及びｓｇＲＮＡを発現する。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、融合タンパク質のＣａｓタンパク質及び別のウイルスＤＮＡ転写物に結合し、ここで、インテグラーゼは自己組み込みを触媒する。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、融合タンパク質のＣａｓタンパク質及び細胞ＤＮＡの標的領域に結合し、これにより標的遺伝子を破壊する。
一態様では、送達系は、（１）導入プラスミド、（２）第１のパッケージングプラスミド、（３）第１のエンベローププラスミド、（４）第２のパッケージングプラスミド、（５）第２のエンベローププラスミド、及び（６）導入プラスミドを含む。一実施形態では、第１のパッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、第２のパッケージングプラスミドは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、触媒的に死んだインテグラーゼを含む。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質は、Ｄ１１６ＮまたはＤ６４Ｖインテグラーゼ突然変異を含む。
一実施形態では、第１のエンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、第２のエンベローププラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、ＨＩＶエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベローププラスミドは、水疱性口内炎ウイルスｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、エンベロープタンパク質は、所望の細胞タイプに基づいて選択され得る。
一実施形態では、導入プラスミドは、ｓｇＲＮＡをコードする核酸、ならびにインテグラーゼ及び編集タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、インテグラーゼ及びＣａｓタンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、インテグラーゼ及びｄＣａｓタンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質のインテグラーゼは、第１及び第２のパッケージングプラスミドのｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質と比較して、異なる種のレンチウイルスに由来する。例えば、一実施形態では、導入プラスミドは、ＦＩＶインテグラーゼ及びＣａｓを含む融合タンパク質をコードする核酸を含み、第１及び第２のパッケージングプラスミドは、ＨＩＶ ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、異なるレンチウイルス種の使用は、自己組み込みを防止する。
一実施形態では、導入プラスミドは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列及び３’ＬＴＲ配列を含む。一実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。したがって、一実施形態では、５’ＬＴＲは、Ｕ３配列、Ｒ配列及びＵ５配列を含み、３’ＬＴＲは、Ｒ配列及びＵ５配列を含むが、Ｕ３配列を含まない。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質のインテグラーゼに特異的である。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、融合タンパク質をコードする配列及びｓｇＲＮＡをコードする配列に隣接する。
一実施形態では、導入プラスミドは、ドナー配列を含む。ドナー配列は、ゲノムに送達される任意の核酸配列であり得る。一実施形態では、導入プラスミドは、５’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列及び３’ＬＴＲ配列を含む。一実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。したがって、一実施形態では、５’ＬＴＲは、Ｕ３配列、Ｒ配列及びＵ５配列を含み、３’ＬＴＲは、Ｒ配列及びＵ５配列を含むが、Ｕ３配列を含まない。一実施形態では、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲは、Ｉｎｓｃｒｔｉｐｔｅｒ導入プラスミド中のインテグラーゼに特異的である。
一実施形態では、第１のパッケージングプラスミド、導入プラスミド及び第１のエンベローププラスミドは、細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ｓｇＲＮＡをコードする核酸配列を転写する。一実施形態では、細胞は、融合タンパク質をコードする核酸配列を転写する。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質、エンベロープポリタンパク質、ｇＲＮＡ及び融合タンパク質ＲＮＡは、第１のウイルス粒子にパッケージングされる。一実施形態では、第１のウイルス粒子は細胞培地から採取される。
一実施形態では、第２のパッケージングプラスミド、導入プラスミド及び第２のエンベローププラスミドは、細胞に導入される。一実施形態では、細胞は、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を転写及び翻訳して、エンベロープタンパク質を産生する。一実施形態では、細胞は、ドナー配列を転写して、ドナー配列ＲＮＡ分子をもたらす。一実施形態では、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質、エンベロープポリタンパク質及びドナー配列ＲＮＡは、第２のウイルス粒子にパッケージングされる。一実施形態では、第２のウイルス粒子は細胞培地から採取される。
一実施形態では、第１のパッケージングプラスミド、導入プラスミド、第１のエンベローププラスミド、第２のパッケージングプラスミド、導入プラスミド及び第２のエンベローププラスミドは、同じ細胞に導入される。一実施形態では、第１のパッケージングプラスミド、導入プラスミド、第１のエンベローププラスミドは、第２のパッケージングプラスミド、導入プラスミド及び第２のエンベローププラスミドと異なる細胞に導入される。
一実施形態では、第１のウイルス粒子及び第２のウイルス粒子は、標的細胞を形質導入する。一実施形態では、ウイルスは逆翻訳し、細胞は融合タンパク質及びｓｇＲＮＡを発現し、ここで、ｓｇＲＮＡは、融合タンパク質のｄＣａｓに結合する。一実施形態では、ウイルスは、ドナー配列ＲＮＡを、融合タンパク質のインテグラーゼに結合するドナーＤＮＡ配列に逆翻訳する。一実施形態では、ｓｇＲＮＡは細胞ＤＮＡの標的領域に結合し、これによりＩＮ－ｄＣａｓ融合タンパク質を標的化し、インテグラーゼはドナーＤＮＡ配列の細胞ＤＮＡへの組み込みを触媒する。
さらに、哺乳動物細胞への遺伝子導入のための、さらなるウイルスベースの系が数多く開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に好都合なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当該技術分野で公知の技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。
例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組み込み及び娘細胞中のその増殖を可能とすることから、長期間の遺伝子導入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターと比べてさらなる利点を有する。これらはまた、免疫原性が低いというさらなる利点を有する。
一実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。「ＡＡＶベクター」という用語は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８及びＡＡＶ－９を含むがこれらに限定されない、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、様々な障害の治療のための強力な遺伝子送達ツールとなっている。ＡＡＶベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、及び安定かつ効率的な方法で有糸分裂後細胞を形質導入する能力を含む、遺伝子治療に最適なベクターとなるいくつかの特徴を有する。ＡＡＶベクター内に含まれる特定の遺伝子の発現は、ＡＡＶ血清型、プロモーター及び送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、１つ以上のタイプの細胞を特異的に標的とすることができる。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、好ましくはｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子の全体または一部の欠失を有し得るが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持し得る。高い相同性にもかかわらず、異なる血清型は異なる組織に対する指向性を有する。ＡＡＶ１の受容体は明らかではないが、ＡＡＶ１はＡＡＶ２よりも効率的に骨格筋及び平滑筋を形質導入することが知られている。ほとんどの研究が、ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接したベクターＤＮＡが別の血清型のカプシドにパッケージングされる偽型ベクターを用いて行われたため、生物学的相違がゲノムよりもカプシドに関連することは明らかである。最近のエビデンスは、ＡＡＶ１カプシドにパッケージングされたＤＮＡ発現カセットが、心筋細胞の形質導入において、ＡＡＶ２カプシドにパッケージングされたものよりも少なくとも１ｌｏｇ１０効率的であることを示している。一実施形態では、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルス送達系である。アデノ随伴ウイルスは、血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、または血清型９（ＡＡＶ９）のものであり得る。
ベクターへのアセンブルに望ましいＡＡＶ断片としては、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞で容易に利用することができる。このような断片を、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用することができる。本明細書で使用される場合、人工ＡＡＶ血清型は、限定されないが、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶを含む。そのような人工カプシドは、選択したＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、選択した異なるＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非隣接部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得ることができる異種配列と組み合わせて使用して、任意の適切な技術により作製することができる。人工ＡＡＶ血清型は、限定されないが、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。したがって、１つ以上のタンパク質の発現に適した例示的なＡＡＶ、または人工ＡＡＶには、とりわけ、ＡＡＶ２／８（米国特許第７，２８２，１９９号を参照されたい）、ＡＡＶ２／５（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手可能）、ＡＡＶ２／９（国際特許公開第ＷＯ２００５／０３３３２１号）、ＡＡＶ２／６（米国特許第６，１５６，３０３号）、及びＡＡＶｒｈ８（国際特許公開第ＷＯ２００３／０４２３９７号）が含まれる。
特定の実施形態では、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞、または本発明によって産生されたウイルスに感染した細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にする形で導入遺伝子に作動可能に連結された従来の調節エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列は、目的遺伝子と隣接する発現制御配列と、目的遺伝子を制御するためにトランスでまたは一定の距離で作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列には、適切な転写開始配列、転写終結配列、転写プロモーター配列、及び転写エンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに必要に応じて、コードされた産物の分泌を向上させる配列が含まれる。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が当該技術分野で公知であり、利用可能である。
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは転写開始の頻度を調節する。通常、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、近年、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は柔軟であることが多く、そのためエレメントが互いに対して反転または移動する際にプロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、５０ｂｐの間隔まで長くすることができ、それ以降は活性が低下し始める。プロモーターによっては、転写を活性化するために、個々のエレメントを協働的に機能させることも、または独立して機能させることもできると思われる。
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、他の構成的プロモーター配列も使用することができ、これらとしては、限定されないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バールウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターが挙げられる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用により、それが作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましい場合はオンにし、または発現が望ましくない場合はその発現をオフにすることが可能な分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクター上に見られるエンハンサー配列もまた、その中に含まれる遺伝子の発現を調節する。通常、エンハンサーはタンパク質因子と結合して遺伝子の転写を増強させる。エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流または下流に位置し得る。エンハンサーはまた、特定の細胞タイプまたは組織タイプにおける転写を増強するために組織特異的であり得る。一実施形態では、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を高めるための１つ以上のエンハンサーを含む。
本発明の融合タンパク質の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含み得る。他の態様では、選択マーカーを個々のＤＮＡ片上に保有させ、コトランスフェクション手順に使用することができる。選択マーカーとレポーター遺伝子はいずれも、宿主細胞での発現を可能とする適切な調節配列と隣接させることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
レポーター遺伝子は、潜在的なトランスフェクト細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、またはそれらによって発現されない遺伝子であり、かついくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によってその発現が明らかとなるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が含まれ得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現系は周知であり、公知の技術を用いて調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、最小の５’隣接領域がレポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す構築物は、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させて、プロモーター駆動型転写を調節する能力について薬剤を評価するのに使用することができる。
遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当該技術分野で公知である。発現ベクターに関連して、ベクターを、当該技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的、または生物学的手段により宿主細胞に導入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／または外来核酸を含む細胞の産生方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための例示的な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散系が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達系を利用する場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸の宿主細胞への導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）に脂質製剤の使用が企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合され得る。脂質と会合される核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され得るか、リポソームの脂質二重層内に散在され得るか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームに結合され得るか、リポソーム中に封入され得るか、リポソームと複合体を形成され得るか、脂質を含有する溶液中に分散され得るか、脂質と混合され得るか、脂質と組み合わされ得るか、脂質中に懸濁液として含有され得るか、ミセルに含有され得るかもしくはそれと複合体を形成され得るか、または他の方法で脂質と会合され得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中で何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液中に散在していてもよく、あるいは、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然に存在する脂質または合成の脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素ならびにそれらの誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、単独の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単層及び多層脂質ビヒクルを包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とし得る。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水溶液中で懸濁させた場合に自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を起こし、脂質二重層間に水及び溶解された溶質を取り込む（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることも、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することもできる。また、リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
外来核酸の宿主細胞への導入に使用する方法を問わず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。そのようなアッセイとしては、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、ならびにＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、または本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって、特定のペプチドの存在または不在を検出するなどの「生化学的」アッセイが挙げられる。
系
一態様では、本発明は、核酸分子、ゲノムまたは遺伝子などの遺伝物質を編集するための系を提供する。一実施形態では、この系は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、この融合タンパク質がレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む核酸配列；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；ならびにドナー鋳型核酸をコードする核酸配列であって、このドナー鋳型核酸がＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含む核酸配列を、１つ以上のベクターに含む。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは、遺伝子の標的ＤＮＡ配列に実質的にハイブリダイズする。
一実施形態では、この系は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、この融合タンパク質がレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む核酸配列；第１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；第２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；ならびにドナー鋳型核酸をコードする核酸配列であって、このドナー鋳型核酸がＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含む核酸配列を、１つ以上のベクターに含む。一実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは第１のＤＮＡ配列に実質的にハイブリダイズし、第２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは第２のＤＮＡ配列に実質的にハイブリダイズする。一実施形態では、第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列は、標的挿入領域に隣接する。一実施形態では、この系は、ドナー鋳型核酸の標的挿入領域への挿入を触媒する。
一実施形態では、この系は、第１の融合タンパク質をコードする核酸配列であって、第１の融合タンパク質がレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む核酸配列；第１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；第２の融合タンパク質をコードする核酸配列であって、第２の融合タンパク質が、レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む核酸配列；第１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；第２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列；ならびにドナー鋳型核酸をコードする核酸配列であって、このドナー鋳型核酸がＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含む核酸配列を、１つ以上のベクターに含む。
一実施形態では、第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、同じであるか、または異なっている。例えば、一実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＨＩＶ ＩＮまたはその断片、ｄＣａｓ９タンパク質及びＮＬＳを含み、第２の融合タンパク質は、ＢＩＶ ＩＮまたはその断片、Ｃｐｆ１ Ｃａｓタンパク質及びＮＬＳを含む。
一実施形態では、Ｕ３は、第１の融合タンパク質のレトロウイルスＩＮに特異的であり、Ｕ５は、第２の融合タンパク質のレトロウイルスＩＮに特異的である。例えば、一実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＨＩＶ ＩＮまたはその断片、ｄＣａｓ９タンパク質及びＮＬＳを含み、第２の融合タンパク質は、ＢＩＶ ＩＮまたはその断片、Ｃｐｆ１ Ｃａｓタンパク質及びＮＬＳを含み、Ｕ３配列はＨＩＶ ＩＮに特異的であり、Ｕ５配列はＢＩＶ ＩＮに特異的である。
一実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは第１のＤＮＡ配列に実質的にハイブリダイズし、第２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡは第２のＤＮＡ配列に実質的にハイブリダイズする。一実施形態では、第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列は、標的挿入領域に隣接する。一実施形態では、この系は、ドナー鋳型核酸の標的挿入領域への挿入を触媒する。
一実施形態では、この系は、融合タンパク質をコードする核酸配列であって、この融合タンパク質が、レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む核酸配列；ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を含む。
一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列、及びドナー鋳型核酸をコードする核酸配列は、同じかまたは異なるベクター上に存在する。
一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号５７～９８のうちの１つの配列を含む融合タンパク質をコードする。
一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１５５～１９６のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｕ３配列及びＵ５配列は、レトロウイルスＩＮに特異的である。例えば、一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＨＩＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号１９７と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号１９８と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＲＳＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号１９９と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２００と９５％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＨＦＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２０１と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２０２と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＥＩＡＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２０３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２０４と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＭｏＬＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２０５と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２０６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＭＭＴＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２０７と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２０８と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＷＤＳＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２０９と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２１０と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＢＬＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２１１と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２１２と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＳＩＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２１３と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２１４と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＦＩＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２１５と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２１６と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮはＢＩＶ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２１７と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２１８と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、ＩＮはＴｙ１であり、Ｕ３配列は、配列番号２１９と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２２０と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
一実施形態では、ＩＮはＩｎｓＦ ＩＮであり、Ｕ３配列はＩＳ３ ＩＲＬ配列であり、Ｕ５配列はＩＳ３ ＩＲＲ配列である。一実施形態では、ＩＮはＩｎｓＦ ＩＮであり、Ｕ３配列は、配列番号２２１と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含み、Ｕ５配列は、配列番号２２２と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。
系及びベクターは、原核細胞または真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞内で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに論じられている。あるいは、組換え発現ベクター系を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して転写及び翻訳することができる。
ベクターを原核生物に導入し、原核生物中で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、原核生物を、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するために使用するか、または真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクターとして使用する（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてのプラスミドを増幅する）。いくつかの実施形態では、宿主細胞または宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するように、原核生物を使用してベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させる。原核生物中のタンパク質の発現は、ほとんどの場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて行われる。融合ベクターは、そこにコードされているタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため、（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増加させるため、及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助するために役立ち得る。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分から分離することができるように、融合部分と組換えタンパク質との接合部にタンパク質分解切断部位が導入される。そのような酵素、及びそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例としては、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質にそれぞれ融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞におけるタンパク質発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞における１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、通常、１つ以上の調節エレメントによってもたらされる。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、及び本明細書に開示され、当該技術分野で公知の他のものに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に適した他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のＣｈａｐｔｅｒ１６及び１７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的な調節エレメントは、当該技術分野において公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されたプロモーター、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も含まれる。
いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動するように、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに作動可能に連結されている。一般に、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔ））としても知られるＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）は、特定の細菌種に対して通常特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で認識された異なるクラスの散在する短い配列リピート（ＳＳＲ）（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９－５４３３［１９８７］、及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３－３５５６［１９８９］）ならびに関連する遺伝子を含む。同様の散在するＳＳＲが、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓで同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７－１０６５［１９９３］、Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４－２６３［１９９９］、Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６－３０［１９９６］、及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５－９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は通常、リピートの構造によって他のＳＳＲとは異なり、短く規則的に間隔が空いたリピート（ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と称される（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ． Ｂｉｏｌ．，６：２３－３３［２００２］、及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４－２４６［２０００］）。一般に、リピートは、実質的に一定の長さであるユニークな介在配列によって規則的に間隔が空いた、クラスターで存在する短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］，上掲）。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在するリピートの数とスペーサー領域の配列は通常、株ごとに異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３－２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０種を超える原核生物で同定されており（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５－１５７５［２００２］、及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）、それらとしては、例えば、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｒｘ、Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚａｒｃｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ガイドＲＮＡが相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、必ずしも完全な相補性は必要ない。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。いくつかの実施形態では、標的配列は、真核細胞の細胞小器官、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体内に存在し得る。標的配列を含む標的遺伝子座への組換えに使用することができる配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様では、外来鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と称されることもある。本発明の一態様では、組換えは、相同組換えである。
ガイド配列を、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列には、標的ゲノムにおいてユニークなものが含まれる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意でよい）はそのゲノム中に１回出現する。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意でよい）はそのゲノム中に１回出現する。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号１）のＣａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号２）（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意でよく、ＷはＡまたはＴである）はそのゲノム中に１回出現する。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号３）のＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（配列番号４）（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意でよく、ＷはＡまたはＴである）はそのゲノム中に１回出現する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の場合、ゲノム中のユニークな標的配列は、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意でよい）はそのゲノム中に１回出現する。ゲノム中のユニークな標的配列は、形態ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９標的部位を含み得、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり、Ｘは任意でよい）はそのゲノム中に１回出現する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」はＡ、Ｇ、ＴまたはＣであり得、配列をユニークであると同定する際にこれを考慮する必要はない。
いくつかの実施形態では、ガイド配列を、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択する。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの計算に基づく。そのようなアルゴリズムの一例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって説明されているｍＦｏｌｄである。別のフォールディングアルゴリズムの例は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＶｉｅｎｎａのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにてセントロイド構造予測アルゴリズムを使用して開発された、オンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ１０６（１）：２３－２４、及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７（１２）：１１５１－６２を参照されたい）。
一般に、ｔｒａｃｒメイト配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のｔｒａｃｒメイト配列に隣接するガイド配列の切除、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒメイト配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列での形成、の１つ以上を促進するのに十分なｔｒａｃｒ配列との相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列の、２つの配列のうちの短い方の長さに沿った最適なアラインメントを参照している。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、さらに、ｔｒａｃｒ配列内またはｔｒａｃｒメイト配列内のいずれかの自己相補性などの二次構造を説明することができる。いくつかの実施形態では、最適にアラインメントした場合、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列間の２つのうちの短い方の長さに沿った相補性の程度は、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上であるか、またはそれより高い。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５ヌクレオチド長以上、約６ヌクレオチド長以上、約７ヌクレオチド長以上、約８ヌクレオチド長以上、約９ヌクレオチド長以上、約１０ヌクレオチド長以上、約１１ヌクレオチド長以上、約１２ヌクレオチド長以上、約１３ヌクレオチド長以上、約１４ヌクレオチド長以上、約１５ヌクレオチド長以上、約１６ヌクレオチド長以上、約１７ヌクレオチド長以上、約１８ヌクレオチド長以上、約１９ヌクレオチド長以上、約２０ヌクレオチド長以上、約２５ヌクレオチド長以上、約３０ヌクレオチド長以上、約４０ヌクレオチド長以上、約５０ヌクレオチド長以上であるか、またはそれより長い。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列は、単一の転写物内に含まれ、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションは、ヘアピンなどの二次構造を有する転写物を生成する。一実施形態では、ヘアピン構造で使用するためのループ形成配列は、４ヌクレオチド長である。一実施形態では、ヘアピン構造で使用するためのループ形成配列は、配列ＧＡＡＡを有する。但し、代替配列と同様に、より長いまたはより短いループ配列を使用することもできる。配列は、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）、及び別のヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含み得る。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。本発明の一実施形態では、転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。いくつかの実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つ、または５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最大で５つのヘアピンを有する。いくつかの実施形態では、単一の転写物は、転写終結配列をさらに含み、いくつかの実施形態では、転写終結配列は、ポリＴ配列、例えば、６つのＴヌクレオチドである。
核酸の編集及び送達方法
一実施形態では、本発明は、核酸分子、ゲノムまたは遺伝子などの遺伝物質を編集する方法を提供する。例えば、一実施形態では、編集は組み込みである。一実施形態では、編集はＣＲＩＳＰＲ媒介性編集である。
一実施形態では、本方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子；遺伝物質内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を遺伝物質に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質；遺伝物質内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を遺伝物質に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であるか、またはｉｎ ｖｉｖｏ法である。
一実施形態では、本発明は、遺伝物質に核酸配列を送達する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を遺伝子に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質；遺伝物質内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を遺伝物質に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であるか、またはｉｎ ｖｉｖｏ法である。
一実施形態では、本方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を細胞に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を細胞に投与することを含む。
一実施形態では、遺伝物質の編集方法は、遺伝子の編集方法である。一実施形態では、遺伝子は細胞のゲノムに位置している。一実施形態では、遺伝物質の編集方法は、核酸の編集方法である。
一実施形態では、本発明は、ドナー鋳型配列を標的配列に挿入する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ドナー鋳型配列を細胞内の標的配列に挿入する。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子；標的配列内の領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を細胞に投与することを含む。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質；標的配列内の領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を細胞に投与することを含む。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性ＨＤＲを使用したゲノム編集用の大型ＤＮＡ配列の標的化送達は、依然として非効率的である。しかしながら、本方法は、大型のドナー鋳型配列を細胞内の標的配列に挿入するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ドナー鋳型配列を、少なくとも１ｋｂ以上、少なくとも２ｋｂ以上、少なくとも３ｋｂ以上、少なくとも４ｋｂ以上、少なくとも５ｋｂ以上、少なくとも６ｋｂ以上、少なくとも７ｋｂ以上、少なくとも８ｋｂ以上、少なくとも９ｋｂ以上、少なくとも１０ｋｂ以上、少なくとも１１ｋｂ以上、少なくとも１２ｋｂ以上、少なくとも１３ｋｂ以上、少なくとも１４ｋｂ以上、少なくとも１５ｋｂ以上、少なくとも１６ｋｂ以上、少なくとも１７ｋｂ以上、または少なくとも１８ｋｂ以上挿入する。一実施形態では、本方法は、融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子；標的配列内の領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を細胞に投与することを含む。
一実施形態では、標的配列は遺伝子内に位置する。一実施形態では、ドナー鋳型配列は、遺伝子配列を破壊し、それにより遺伝子の発現を阻害するかまたは低減させる。一実施形態では、標的配列は突然変異を有し、ドナー鋳型配列は、修復された配列を標的配列に挿入して、それにより遺伝子突然変異を修復する。一実施形態では、ドナー鋳型配列は遺伝子配列であり、ドナー鋳型配列を細胞内の標的配列に挿入することにより、遺伝子の発現が可能となる。
一実施形態では、ドナー鋳型配列は、セーフハーバー部位に挿入される。したがって、一実施形態では、ガイド核酸は、遺伝子内のセーフハーバー領域に相補的なヌクレオチド配列を含む。セーフハーバー領域は、隣接遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく、治療遺伝子の発現を可能にする。セーフハーバー領域には、隣接遺伝子から離れた遺伝子間領域、例えば、Ｈ１１、または「非必須」遺伝子、例えば、ＣＣＲ５、ｈＲＯＳＡ２６もしくはＡＡＶＳ１内が含まれ得る。例示的なセーフハーバー領域及びこれらの配列に相補的なガイド核酸配列は、例えば、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ “Ｓａｆｅ Ｈａｒｂｏｒ” Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ，２０１９，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０（７）：８１４－２８に見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ドナー鋳型配列を３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入することにより、ドナー鋳型配列の発現を他の遺伝子のプロモーターによって制御することが可能となる。
一実施形態では、核酸分子は、レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片をコードする第１の核酸配列、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする第２の核酸配列、及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする第３の核酸配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮである。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ＨＩＶ ＩＮである。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、この置換は、触媒活性を改善するか、溶解性を改善するか、または１つ以上の宿主細胞補因子との相互作用を増加させる。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、Ｅ８５Ｇ、Ｅ８５Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｆ１８５Ｋ、Ｃ２８０Ｓ、Ｔ９７Ａ、Ｙ１３４Ｒ、Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｆ１８５Ｋ及びＣ２８０Ｓを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｔ９７Ａ及びＹ１３４Ｒを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈを含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＩＮ触媒コアドメイン（ＣＣＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤ及びＩＮ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＮＴＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＴＤを含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも９６％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも９７％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも９８％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも９９％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号１～４０のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも９６％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする第１の核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３またはＣｐｆ１である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９６％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９７％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９８％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９９％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号４１～４６のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも９６％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする第２の核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９、またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０ ＶＰ１もしくはＳＶ４０ ＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号４７～５６のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号４７～５６のうちの１つと少なくとも９６％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号４７～５６のうちの１つと少なくとも９７％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号４７～５６のうちの１つと少なくとも９８％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号４７～５６のうちの１つと少なくとも９９％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号４７～５６のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも９６％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする第３の核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９６％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９７％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９８％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９９％同一である配列を含む融合タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、配列番号５７～９８のうちの１つの配列を含む融合タンパク質をコードする。
一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも９６％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも９７％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも９８％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１５５～１９６のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｕ３配列及びＵ５配列は、レトロウイルスＩＮに特異的である。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、任意の目的標的遺伝子である。例えば、一実施形態では、遺伝子は、疾患を有するかまたは発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。いくつかの実施形態では、本方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を導入することを含む。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合し遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらす。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ドナー鋳型核酸をコードする核酸配列と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列及びドナー鋳型核酸をコードする核酸配列と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド核酸及びドナー鋳型核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ドナー鋳型核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸及びドナー鋳型核酸と複合体を形成している。
いくつかの実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９は、ドナー鋳型の遺伝子への組み込みを触媒する。一実施形態では、組み込みは、１つ以上の突然変異を遺伝子に導入する。いくつかの実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現において１つ以上のアミノ酸変化を生じさせる。
一実施形態では、ＤＮＡ配列のＩＮ媒介性組み込みは、標的ＤＮＡ配列のいずれの方向にも生じ得る。一実施形態では、Ｃａｓ及びＩＮレトロウイルスクラスのタンパク質の様々な組み合わせを使用して指向性編集を容易にする。例えば、一実施形態では、レトロウイルスクラスに由来するＩＮの融合体は、Ｃａｓ特異的ガイドＲＮＡを利用した特定の標的配列への結合を可能とする、第１の触媒的に死んだＣａｓに結合する。一実施形態では、ドナー配列は、ＨＩＶ ＬＴＲ及びＢＩＶ ＬＴＲ配列の両方を含む。したがって、一実施形態では、この配列は、標的ＤＮＡに単一の方向で組み込まれる。
一実施形態では、ＬｏｘＰに隣接する（Ｆｌｏｘｅｄ）配列は、目的遺伝子周囲に導入される。ｆｌｏｘｅｄ配列を含めることにより、Ｃｒｅ媒介性組換え及び条件付き突然変異誘発が可能となる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してＦｌｏｘｅｄ対立遺伝子を作製する現行の方法は、非効率的である。最も広く利用されているアプローチは、隣接する標的配列でのＤＮＡ切断を誘導するための２本のガイドＲＮＡ、及びＬｏｘＰ配列を含有するｓｓＤＮＡ鋳型を挿入するための相同組換え修復を使用することである。しかしながら、二重ｓｇＲＮＡを使用して切断を誘導する場合、最も好ましい反応は、介在配列が欠失し、その結果全体的な遺伝子欠失が生じることである。したがって、一実施形態では、インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性遺伝子挿入の使用により、ＤＮＡ配列のタンデム挿入の効率が上昇する。一実施形態では、ＩＮ媒介性組み込みがいずれの方向にも生じ得るため、反転したＬｏｘＰ配列を含有する配列の組み込みにより、ＬｏｘＰに隣接する配列の組換えが可能となる。
治療方法及び使用方法
本発明は、疾患または障害及び／または遺伝子改変を治療し、それらの症状を低減させ、及び／またはそれらが生じるリスクを低減させて、所望の表現型の結果をもたらす方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明の方法は、哺乳動物における疾患または障害を治療し、それらの症状を低減させ、及び／またはそれらが生じるリスクを低減させる。一実施形態では、本発明の方法は、植物における疾患または障害を治療し、それらの症状を低減させ、及び／またはそれらが生じるリスクを低減させる。一実施形態では、本発明の方法は、酵母生物における疾患または障害を治療し、それらの症状を低減させ、及び／またはそれらが生じるリスクを低減させる。
一実施形態では、疾患または障害は、ゲノム遺伝子座における１つ以上の突然変異によって引き起こされる。したがって、一実施形態では、疾患または障害を、１つ以上の突然変異を有する領域の野生型配列に対応する核酸配列の導入、及び／または１つ以上の突然変異を有するゲノム配列の発現を防止もしくは低減させるエレメントの導入を介して治療するか、低減させるか、またはリスクを低減させることができる。したがって、一実施形態では、本方法は、標的配列内のゲノム遺伝子座のコーディングエレメント、非コーディングエレメント、または調節エレメント内の標的配列の操作を含む。
例えば、一実施形態では、疾患は単一遺伝子性疾患である。一実施形態では、疾患には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィンに発生する突然変異）、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ型（ＬＧＭＤ２Ｂ）及び三好型ミオパチー（ジスフェルリンに発生する突然変異）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲに発生する突然変異）、ウィルソン病（ＡＴＰ７Ｂに発生する突然変異）ならびにシュタルガルト黄斑変性（ＡＢＣＡ４に発生する突然変異）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明はまた、遺伝子または遺伝物質の発現を調節する方法を提供する。例えば、一実施形態では、本発明の方法は、細胞または生物に表現型を付与するための遺伝物質の送達を提供する。例えば、一実施形態では、本方法は、病原体に対する耐性をもたらす。一実施形態では、本方法は、代謝経路の調節をもたらす。一実施形態では、本方法は、生物における物質の産生及び使用をもたらす。例えば、一実施形態では、本方法は、真核生物、酵母、細菌または植物などの生物において、生物学的物質、薬学的物質及びバイオ燃料などの物質を生成する。
一実施形態では、本方法は、融合タンパク質または融合タンパク質をコードする核酸分子；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列を含むドナー鋳型核酸を投与することを含む。一実施形態では、本方法は、ドナー鋳型配列を投与することをさらに含む。
一実施形態では、標的配列は遺伝子内に位置する。一実施形態では、ドナー鋳型配列は、遺伝子配列を破壊し、それにより遺伝子の発現を阻害するかまたは低減させる。一実施形態では、標的配列は突然変異を有し、ドナー鋳型配列は、修復された配列を標的配列に挿入して、それにより遺伝子突然変異を修復する。一実施形態では、ドナー鋳型配列は遺伝子配列であり、ドナー鋳型配列を細胞内の標的配列に挿入することにより、遺伝子の発現が可能となる。
一実施形態では、融合タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質、ＮＬＳ及びレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、またはウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮである。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、ＨＩＶ ＩＮである。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、この置換は、触媒活性を改善するか、溶解性を改善するか、または１つ以上の宿主細胞補因子との相互作用を増加させる。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、Ｅ８５Ｇ、Ｅ８５Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｆ１８５Ｋ、Ｃ２８０Ｓ、Ｔ９７Ａ、Ｙ１３４Ｒ、Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｆ１８５Ｋ及びＣ２８０Ｓを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｔ９７Ａ及びＹ１３４Ｒを含む。一実施形態では、ＨＩＶ ＩＮは、アミノ酸置換Ｇ１４０Ｓ及びＱ１４８Ｈを含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＩＮ触媒コアドメイン（ＣＣＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤ及びＩＮ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＮＴＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＣＤを含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮ断片は、ＩＮ ＣＴＤを含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮは、配列番号１～４０のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、レトロウイルスＩＮをコードする核酸配列は、配列番号９９～１３８のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３またはＣｐｆ１である。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４１～４６のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１３９～１４４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、レトロトランスポゾンＮＬＳである。一実施形態では、ＮＬＳは、酵母ＧＡＬ４、ＳＫＩ３、Ｌ２９、またはヒストンＨ２Ｂタンパク質、ポリオーマウイルス大型Ｔタンパク質、ＶＰ１もしくはＶＰ２カプシドタンパク質、ＳＶ４０ ＶＰ１もしくはＳＶ４０ ＶＰ２カプシドタンパク質、アデノウイルスＥ１ａまたはＤＢＰタンパク質、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質、肝炎ウイルスコア抗原または哺乳動物ラミン、ｃ－ｍｙｃ、ｍａｘ、ｃ－ｍｙｂ、ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＡ、ｊｕｎ、Ｔａｘ、ステロイド受容体またはＭｘタンパク質、またはサルウイルス４０（「ＳＶ４０」）Ｔ抗原に由来する。一実施形態では、ＮＬＳは、Ｔｙ１もしくはＴｙ１由来のＮＬＳ、Ｔｙ２もしくはＴｙ２由来のＮＬＳ、またはＭＡＫ１１もしくはＭＡＫ１１由来のＮＬＳである。一実施形態では、Ｔｙ１ ＮＬＳは、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｔｙ２ ＮＬＳは、配列番号２５４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＡＫ１１ ＮＬＳは、配列番号２５６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５６及び配列番号２７５～８８７のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳは、配列番号４７～５６、配列番号２５４～２５６及び配列番号２７５～８８７のうちの１つをコードする核酸配列を含む。
一実施形態では、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。一実施形態では、ＮＬＳをコードする核酸配列は、配列番号１４５～１５４のうちの１つの核酸配列を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である配列を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５７～９８のうちの１つの配列を含む。
一実施形態では、Ｕ３配列及びＵ５配列は、レトロウイルスＩＮに特異的である。
いくつかの実施形態では、遺伝子は、任意の目的標的遺伝子である。例えば、一実施形態では、遺伝子は、疾患を有するかまたは発症するリスクの増加に関連する任意の遺伝子である。いくつかの実施形態では、本方法は、融合タンパク質をコードする核酸分子；遺伝子内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸；ならびにＵ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸を導入することを含む。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合し遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらす。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ドナー鋳型核酸をコードする核酸配列と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列及びドナー鋳型核酸をコードする核酸配列と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド核酸及びドナー鋳型核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ドナー鋳型核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸と複合体を形成している。一実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９融合タンパク質は、ガイド核酸及びドナー鋳型核酸と複合体を形成している。
いくつかの実施形態では、ＩＮ－Ｃａｓ９は、ドナー鋳型の遺伝子への組み込みを触媒する。一実施形態では、組み込みは、１つ以上の突然変異を遺伝子に導入する。いくつかの実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現において１つ以上のアミノ酸変化を生じさせる。
以下の実験的実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は例示目的のためのみに提供され、別段の定めがない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかとなるあらゆるすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製及び利用し、特許請求された方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を具体的に示すものであり、いかなる意味においても本開示の残りの部分を制限するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：哺乳動物のゲノムＤＮＡを編集するためのレトロウイルスインテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化の向上
哺乳動物のゲノムＤＮＡを効率的にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で編集するには、核膜を欠く原核細胞で通常機能する、大型の細菌ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであるＣａｓ９の核局在化が必要である。哺乳動物細胞におけるＣａｓ９の効率的な核局在化には、１つはＮ末端に、もう１つはＣ末端に位置する少なくとも２つの哺乳動物核局在化シグナルの付加が必要であることが示されている（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－２３）。
編集のためのレトロウイルスインテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化を促進するために、ｄＣａｓ９上のＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳに加えて、Ｎ末端ＳＶ４０ ＮＬＳをインテグラーゼに含めた（図１Ａ）。意外にも、哺乳動物細胞で発現させた場合、ｄＣａｓ９上のＣ末端３ｘＦＬＡＧエピトープを認識するＦＬＡＧ抗体を使用して検出されたように、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質のごく一部のみが核に局在した（図１Ｂ）。興味深いことに、完全長ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質は細胞質凝集体を生じさせたが、インテグラーゼのＣ末端ドメインの欠失（ＩＮΔＣ）により、溶解性が高まり、核局在化が増加した（図１Ｂ）。
レトロウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、核に局在するその能力を劇的に減少させるように思われる。インテグラーゼｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化をさらに向上させるために、ＩＮ－ｄＣａｓ９の核内輸送を誘導する能力について、いくつかの異なる哺乳動物の核局在化配列を試験した（図１Ｂ）。ＳＶ４０ ＮＬＳの３つのコピーの多量体化（３ｘＳＶ４０）は、ＩＮ－ｄＣａｓ９またはＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９の核局在化の程度に明らかな効果を示さなかった。しかしながら、ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ）由来の双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳの付加により、ＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化が増加したが、完全長ＩＮ融合タンパク質の核局在化は増加しなかった。３ｘＳＶ４０とＮＰＭ ＮＬＳの組み合わせは、ＮＰＭ単独と同様であるように思われた。
興味深いことに、酵母ＬＴＲレトロトランスポゾン（例えば、Ｔｙ１）はレトロウイルスの進化上の祖先であり、細胞質内のＲＮＡ中間体の逆転写を通じてそれらのゲノムを複製する（Ｃｕｒｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ ３：ＭＤＮＡ３－００５３－２０１４）。ＬＴＲレトロトランスポゾンは、レトロトランスポゾンゲノムの挿入に必要なインテグラーゼ酵素を含有する。細胞分裂中に開放型有糸分裂を経る高等真核生物とは対照的に、酵母は閉鎖型有糸分裂を経るため、核膜はそのまま維持される。したがって、Ｔｙ１新生の場合、インテグラーゼ／レトロトランスポゾンゲノム複合体の核内輸送には、能動的な核内輸送が必要である。そのため、哺乳動物のインテグラーゼ酵素とは対照的に、Ｔｙ１インテグラーゼはレトロ転位に必要な大型のＣ末端双節型ＮＬＳを含有する（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８：１１０５－１４）。興味深いことに、本明細書に示された結果は、両方のＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質のＣ末端へのＴｙ１ ＮＬＳの融合が、哺乳動物細胞中で強力な核局在化をもたらしたことを実証している（図１Ｂ）。
ＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化の増加は、培養中の分裂哺乳動物細胞における編集を大幅に向上させた。Ｔｙ１ ＮＬＳの付加により、ＨＥＫ２９３細胞中のＥＦ１－アルファの３’ＵＴＲＥを標的とするＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型を組み込むための、ＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の活性が増強された（図１Ｃ）。強力なＴｙ１ ＮＬＳを利用することにより、核膜を常に維持する非分裂細胞での編集（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療適用）がさらに可能となり得る。
実施例２：筋ジストロフィーの修復のための統合的遺伝子編集アプローチ
本明細書の他の箇所に示されているように、レンチウイルスインテグラーゼのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９への融合により、ゲノムＤＮＡへの大型ＤＮＡ配列の配列特異的な組み込みが可能となる。このアプローチは、ヒトの遺伝性疾患を永続的に修復するために、非病原性のゲノム位置（セーフハーバー）に治療上有益な遺伝子を送達するために利用することができる（図２）。この技術により、短いウイルス末端モチーフを含有する大型ＤＮＡドナー配列の配列特異的な組み込みが可能となる。
本発明の遺伝子治療アプローチの主な利点は、ドナーＤＮＡ配列を標的ゲノム位置に送達する能力である。さらに、このアプローチは、相同性アームを不要にしてガイドＲＮＡによる標的化に依存し、ゲノム編集を大幅に簡素化する。したがって、特定のレポータードナー配列を一旦作製すると、多種多様な適用のために、それを任意の場所（または複数の場所）に誘導することができる。
レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、哺乳動物細胞中でＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを使用して、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列を標的配列に挿入するのに十分である（図３）。哺乳動物細胞中のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みをモニタリングするために、ＩＧＲ ＩＲＥＳ配列とそれに続くｍＣｈｅｒｒｙ－２ａ－ピューロマイシン遺伝子及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有するドナーベクターを作製した（図３）。次に、ＣＯＳ－７細胞中の安定したヒトＣＭＶ－ｅＧＦＰ安定細胞株を標的とするｓｇＲＮＡを設計した。ｈＣＭＶ－ｅＧＦＰの安定した導入遺伝子は、強力に発現しているが必須ではない発現遺伝子座での編集を判定するために使用することができる異種標的配列をもたらした。ドナーｍＣｈｅｒｒｙ－２ａ－ｐｕｒｏ鋳型を精製し、ｓｇＲＮＡ及びＩＮ－ｄＣａｓ９とともにＧＦＰ安定細胞にコトランスフェクトし、４８時間培養した。４８時間後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が培養液中に見られ、ＧＦＰ陽性シグナルに取って代わった（図３）。
ヒトジストロフィンの哺乳動物ゲノムへのインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みの有効性及び忠実度。
インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性遺伝子送達は、哺乳動物のゲノムＤＮＡへの大型ＤＮＡ配列の配列特異的な組み込みを誘導する。インテグラーゼ－Ｃａｓは、培養細胞中のヒトＡＡＶＳ１及びマウスＲＯＳＡ２６ゲノムＤＮＡに特異的なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを使用して、ヒトα－骨格アクチン（ＨＳＡ）プロモーターの制御下で、ヒトジストロフィン遺伝子をセーフハーバー位置に送達するために使用される。ジストロフィンの正確な標的化を、ＰＣＲベースの遺伝子型同定を使用して評価する。
インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性ジストロフィン遺伝子治療は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルの筋機能を回復させる。
ヒトジストロフィンのＩｎｓｃｒｉｔｐｒ媒介性送達の有効性を、筋ジストロフィーに最も一般的に使用されているマウスモデルであるＭＤＸマウス系統で判定する。全身送達後、ジストロフィン発現のレベルを、２ヶ月、４ヶ月、及び６ヶ月の時間経過にわたり、抗ジストロフィン抗体を使用して、四肢骨格筋、心臓及び横隔膜で定量化及び測定する。ＤＭＤ疾患の病因の軽減を、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）（骨格筋損傷のマーカー及びＤＭＤ患者の診断マーカー）のレベル、握力、ならびに四肢骨格筋、心臓及び横隔膜の組織学的分析を定量化することにより評価する。
遺伝子発現の組織学的分析。
８週齢で、左後肢四頭筋、心臓、及び横隔膜を回収し、重量を測定し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定して、パラフィン組織学的検査用の日常的な方法を使用して処理する。ＨＳＡ－ジストロフィン／ＧＦＰ融合タンパク質を発現する筋線維のパーセンテージをＤＭＤMdx/y及びＷＴマウスの両方で抗ＧＦＰ抗体を使用して実施する。右後肢筋を、後続のＰＣＲベースの遺伝子型同定、ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現、及びウエスタンブロットによるタンパク質発現解析のために、液体窒素で急速冷凍する。
インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性送達は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおける疾患の病因を軽減する。
横断組織切片のヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、フォン・コッサ染色及びマッソントリクローム染色を使用して、中心核、石灰化及び筋内膜線維症を含有する筋線維をそれぞれ同定する。定量的比較と統計分析を使用して、中心核を伴う筋線維の比率を比較するか、または四頭筋肢筋（ｑｕａｄｒｉｃｅｐｓ ｌｉｍｂ ｍｕｓｃｌｅ）中で染色された石灰化または線維症の領域を比較する。各遺伝子型の３匹の異なるマウスから、各筋肉について少なくとも３つの異なる平面断面を比較する。マウスが重症度が低い表現型を示すインテグラーゼ－Ｃａｓで処置したＤｍｄmdx/yは、中心核を伴う筋線維の比率が低下し、線維症及び石灰化の総面積が減少している。
血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）測定。
血清ＣＫは、骨格筋損傷の相関マーカーであり、ＤＭＤ患者の診断マーカーである。ＣＫ測定を、非致死性手順を使用して、前述の動物コホートで２週間、４週間、６週間及び８週間で実施する。簡潔に述べると、血液を眼窩周囲の血管叢から直接マイクロヘマトクリットチューブに回収し、室温で３０分間凝固させた後、１，７００×ｇで１０分間遠心分離する。Ｄｍｄmdx/yＫＯよりも重症度が低い表現型を示す処置マウスは、血清ＣＫレベルが大幅に低下している。
実施例３：ゲノム編集－指向性非相同ＤＮＡ組み込み
ここに示されるデータは、哺乳動物ゲノムの効率的な編集を可能にするために最適化されたインテグラーゼ－Ｃａｓを示している。
最適化された編集
ＩＮ媒介性組み込みを最適化するために、インテグラーゼの触媒活性、溶解性、または宿主細胞の補因子との相互作用を増強させるアミノ酸突然変異が、編集を向上させるかどうかを判定する。さらに、レトロウイルスの７つのユニークなクラスから単離されたＩＮタンパク質の効率及び忠実度を評価する。
哺乳動物細胞中のＩＮ－ｄＣａｓ９媒介性組み込みを定量化及び特性決定するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現すると濃青色のコロニーを生成するサンゴＡｃｒｏｐｏｒａ ｍｉｌｌｅｐｏｒａ（ａｍｉｌＣＰ）由来の青色色素タンパク質を利用する、プラスミドベースのレポーター系を使用する。ａｍｉｌＣＰオープンリーディングフレームの破壊により青色タンパク質の発現が消失し、これを、標的化忠実度の直接的な読み取り値として使用することができる。さらに、ＨＩＶ由来のＵ３及びＵ５レトロウイルス末端配列に隣接する、クロラムフェニコール抗生物質耐性遺伝子をコードするドナー鋳型を作製した。このドナー鋳型の組み込みはクロラムフェニコールに対する耐性を付与し、これを利用して、インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性のＤＮＡ組み込みをモニタリングすることができる。このレポーターアッセイでは、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質、ａｍｉｌＣＰを標的とするｓｇＲＮＡ及びドナー鋳型を含有する発現プラスミドを、細菌ａｍｉｌＣＰレポーターとともに哺乳動物のＣＯＳ－７細胞にコトランスフェクトする。４８時間後、カラム精製を使用して全プラスミドＤＮＡを回収し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させる。ＩＮ－ｄＣａｓ９は、クロラムフェニコールをコードする鋳型ＤＮＡをａｍｉｌＣＰレポータープラスミドに組み込むのに十分であり、それにより、ａｍｉｌＣＰの発現を妨害し、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。個々の組み込み事象の定量化及びクローン配列解析を可能とするこの迅速なアッセイを、編集を最適化するために使用する。
インテグラーゼ活性の増強：ＩＮ内の大部分の突然変異はその活性を消失させるが、過去数十年の研究により、ＩＮ触媒活性（Ｄ１１６Ｎ）、二量体化（Ｅ８５Ｆ）、溶解性（Ｆ１８５Ｋ／Ｃ２８０Ｓ）、及び宿主細胞タンパク質との相互作用（Ｋ７１Ｒ）を増加させることによりＩＮの組み込みを向上させる、いくつかの突然変異が同定されている。活性化ＩＮ突然変異を含有するＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質を、プラスミドベースのレポーターアッセイを使用して、この融合タンパク質が活性を増強させるかどうかを判定するために使用する。
宿主細胞タンパク質によるインテグラーゼ活性の修飾：ＩＮはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロウイルスＤＮＡを組み込むために必要かつ十分な唯一のタンパク質であるが、宿主細胞タンパク質との相互作用は、ＩＮ媒介性のＤＮＡ組み込み１８を大幅に変化させ得る。特に、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５、ＶＢＰ１及びＳＮＦ５は、ＩＮ媒介性組み込みを促進することができる、特性が十分に明らかにされているＨＩＶ ＩＮ相互作用タンパク質である。これらの因子をプラスミドレポーターアッセイを使用して発現させ、これらがドナー鋳型の組み込みを促進するかどうかを判定する。
様々なレトロウイルスクラス由来のインテグラーゼを比較及び対比する：レトロウイルスクラス由来のすべてのＩＮ酵素には保存されたコア触媒Ｄ，Ｄ（３５）Ｅ残基が含まれているが、それらは、ゲノムサイズ、複雑性、Ｕ３及びＵ５末端配列、ならびにＤＮＡ結合効率について大幅に異なっている。様々なレトロウイルスＩＮの編集効率を判定するために、アルファ（ＲＳＶ）、ベータ（ＭＭＴＶ）、ガンマ（ＭｏＬＶ）、デルタ（ＢＬＶ）、イプシロン（ＷＤＳＶ）及びスプーマウイルス（ＨＦＶ）を含む各レトロウイルスクラスからのモデル例を、ｄＣａｓ９への融合体としてクローニングした。それぞれのＵ３及びＵ５末端モチーフを含有するドナープラスミドを作製する。タンパク質発現をウエスタンブロットによって検証し、核局在化を、ｄＣａｓ９のＣ末端に位置する３ｘＦＬＡＧエピトープを検出するためのＦＬＡＧ抗体を使用した免疫細胞化学を使用して検証する。
哺乳動物のゲノムＤＮＡの編集効率
哺乳動物のゲノムＤＮＡの編集の有効性及び忠実度を、安定ＣＭＶ駆動型ＧＦＰレポーター細胞株を使用して判定し、ＲＦＰ及びピューロマイシン選択カセットを含有するドナー鋳型を作製する。組み込み事象を定量化しクローン的に特性決定して、新規ゲノム編集技術としての本方法の有効性及び忠実度を判定する。
細胞ベースのレポーターアッセイの作製：この遺伝子座での組み込み事象を定量化するために、ＩＲＥＳ－ＲＦＰ－２Ａ－ピューロマイシンカセットとＧＦＰコード配列を標的とするガイドＲＮＡとを含有するドナー鋳型を使用する。ドナーカセットをＣＭＶ－ＧＦＰ遺伝子座に挿入すると、ＲＦＰ発現がＧＦＰ発現に取って代わり、抗生物質ピューロマイシンに対する耐性がもたらされる。ＦＡＣＳソーティングを使用してトランスフェクション及び４８時間の培養後にＲＦＰ＋／ＧＦＰ－（標的化組み込み）である細胞のパーセンテージを測定し、Ｉｎｓｃｒｉｐｒ編集の効率及び忠実度を定量化する。クローン組み込み事象を選択するためにピューロマイシンを使用する。これは、ＰＣＲプライマーを使用してＧＦＰ遺伝子座とドナーカセットとの間の配列を増幅することを特徴とする。
複数の内在性遺伝子座での編集：インテグラーゼ－Ｃａｓを、ＣＭＶ－ＧＦＰ遺伝子座及びＨＥＫ２９３ヒト細胞株中のヒトＥＦ１－アルファ遺伝子座の３’ＵＴＲに特異的なｓｇＲＮＡを使用して、ＲＦＰ－２Ａピューロマイシンカセットをノックインするために使用する。３’ＵＴＲを標的とすると、正常な遺伝子発現を妨害せずにＩＲＥＳ依存性ベクターを発現させることができる。ピューロマイシンを使用したクローン選択後、ＰＣＲ遺伝子型同定を使用して、両方の遺伝子座にドナー鋳型を組み込んだクローンのパーセンテージを測定する。
実施例４：Ｉｎｃｒｉｐｔｒの作製及び特性決定
機能的なＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の作製。
哺乳動物細胞中で使用するための機能的なＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質を作製するために、完全長レトロウイルスＩＮをＨＩＶ－１（ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質のアミノ酸１１４８～１４３５）から、可撓性のある１５アミノ酸のリンカー［（ＧＧＧＧＳ）３）］で分離させて、ヒトコドン最適化ｄＣａｓ９のＮ末端にクローニングした（図６）。ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）をＩＮのＮ末端に含め、これは、ｄＣａｓ９上のＣ末端ＳＶ４０ ＮＬＳとともに、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の核局在化をもたらした。Ｃ末端非特異的ＤＮＡ結合ドメインを欠くＩＮ－ｄＣａｓ９融合体を作製するために、ｄＣａｓ９へのＮ末端融合体としてＩＮのＮ末端及び触媒コアドメイン（ａ．ａ．１１４８～１３６９）のみを含有する追加の構築物を作製した（図６）。
プラスミドＤＮＡの編集をモニタリングするためのレポーターの作製。
哺乳動物細胞中のＩＮ－ｄＣａｓ９媒介性組み込みを定量化及び特性決定するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で発現すると濃青色のコロニーを生成するサンゴＡｃｒｏｐｏｒａ ｍｉｌｌｅｐｏｒａ（ａｍｉｌＣＰ）由来の青色色素タンパク質を利用する、プラスミドベースのレポーターアッセイを設計した（図６）。ａｍｉｌＣＰオープンリーディングフレームの破壊により青色タンパク質の発現が消失し、これを、標的化忠実度の直接的な読み取り値として、及びインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みの標的ＤＮＡとして使用することができる。標的ＤＮＡでのＮ末端ｄＣａｓ９融合タンパク質の効率的な二量体化を促進するために、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列を、１６ｂｐのスペーサー配列によって分離して「ＰＡＭ外部（ＰＡＭ－ｏｕｔ）」方向で設計した（図４）。
インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みのためのウイルス末端ドナー配列の作製。
インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込み用のドナー配列を作製するために使用することができる標的化ベクターを構築するために、Ｕ３ ＨＩＶ末端及びＵ５ ＨＩＶ末端を含む３０塩基対をｐＣＲＩＩにサブクローニングした（図６）。ドナー配列のサブクローニングを容易にするために、９つのユニークな制限酵素を含有するマルチクローニングサイトをＵ３とＵ５の間に含めた。Ｕ３及びＵ５がそれらの末端で同じ３ヌクレオチド（それぞれＡＣＴとＡＧＴ）を共有しているため、プラスミド骨格から平滑末端ドナー配列を作製するために使用できるＳｃａＩ制限部位を両端に作製するために、追加の半部位（ｈａｌｆ－ｓｉｔｅ）配列を含めた（図６）。さらに、隣接するＩＩＳ型制限酵素部位をＦａｕＩ用に含め、ＦａｕＩは、２つの５’ヌクレオチドオーバーハングを切断して残し、露出したＣＡジヌクレオチドを含むプレプロセシングされたウイルス３’末端を模倣する（図６）。ゲル精製及びプラスミド骨格からのＦａｕＩ消化鋳型の分離を補助するために、多部位指向性突然変異誘発を使用して、ｐＣＲ ＩＩプラスミド骨格に存在する６つのＦａｕＩ部位を除去した。
プロトコル：トランスフェクション用のＩＮｓｒｔドナー鋳型の調製
１）ＩＮｓｒｔプラスミドＤＮＡの制限消化を設定する
２）制限消化反応
３）骨格ＤＮＡからドナー鋳型をゲル精製する
４）トランスフェクション用にドナーＤＮＡを溶出させる
哺乳動物細胞におけるプラスミドＤＮＡへのドナー配列のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込み。
協調的ＩＮ－ｄＣａｓ９媒介性組み込みの陽性選択を可能にするために、発現プラスミドのレポーターには存在しないクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ）を保有するＩＮｓｒｔドナーベクターを設計した（図７）。Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ腸管ウイルス（ＰＳＩＶ）由来のＩＧＲ ＩＲＥＳをＣＡＴ遺伝子の前に含めた。このＩＧＲ ＩＲＥＳは、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方で翻訳を開始させて、複数の組み込み部位での翻訳を補助することができる。クロラムフェニコール耐性遺伝子とウイルス末端とを含有する鋳型を、ＳｃａＩ（平滑末端）またはＦａｕＩ（プロセシングされた末端）のいずれかを使用して消化し、プラスミド骨格ＤＮＡからゲル精製した。ＩＮｓｒｔ鋳型、ａｍｉｌＣＰ配列を標的とするＩＮ－ｄＣａｓ９ベクターのコトランスフェクションを、Ｃｏｓ７細胞にコトランスフェクトした（図７）。４８時間後、カラム精製を使用して全プラスミドＤＮＡを回収し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換させた。クロラムフェニコール耐性クローンは、全長ＩＮ及びＩＮＤＣ－ｄＣａｓ９融合タンパク質の両方で観察された。プラスミドの配列決定により、ＩＧ３－ＣＡＴプラスミド配列がａｍｉｌＣＰレポーターに組み込まれたことが明らかとなった。興味深いことに、ウイルスＤＮＡ末端の３’プレプロセシングを模倣するＦａｕＩ消化ドナー配列の使用により、ＳｃａＩ消化平滑末端鋳型と比較して２倍のクロラムフェニコール耐性クローンが生じた。インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みは、組み込み部位に隣接する宿主ＤＮＡの５塩基対のリピートを含む、ＨＩＶ ＩＮレンチウイルス組み込みの特徴を含んでいた。興味深いことに、組み込み部位は２つのｓｇＲＮＡ標的部位間には生じなかったが、ａｍｉｌＣＰ標的配列の両側で生じた。
哺乳動物細胞における、平滑末端（ＳｃａＩ切断）または３’プロセシング模倣（ＦａｕＩ切断）末端のいずれかを有するＩｎｓｒｔ ＩＧＲ－ＣＡＴドナー鋳型のｐＣＲＩＩ－ａｍｉｌＣＰレポーターへの組み込み。興味深いことに、ｄＣａｓ９への融合体としてのＣ末端非特異的ＤＮＡ結合ドメインの欠失は、インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みを阻害しない。３’プロセシングを模倣する末端を使用すると、ＣＡＴ耐性クローンの約２倍の増加が示される（図２９Ｂ）。二量体化阻害突然変異（Ｅ８５Ｇ及びＥ８５Ｆ）は、ＩＧＲ－ＣＡＴドナー鋳型のａｍｉｌＣＰへの二重ガイドＲＮＡ標的化組み込みを使用したインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みを妨害しない。しかしながら、ＩＮ Ｅ８７Ｇ突然変異を、対形成した標的化ｓｇＲＮＡによって回復させることはできない。興味深いことに、ｄＣａｓ９へのタンデムＩＮΔＣｄ融合体（ｔｄＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９）は、約２倍向上した組み込みを示す（図２９Ｃ）。
プロトコル：哺乳動物細胞におけるプラスミドＤＮＡへのドナー配列のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込み。
１）マルチシストロン性ｓｇＲＮＡ及びＩＮ－ｄＣａｓ９プラスミド、細菌ａｍｉｌＣＰレポータープラスミド及びＩＮｓｒｔドナー鋳型を、哺乳動物（例えば、Ｃｏｓ７）細胞にコトランスフェクトする。
ａ．細胞をプレーティングする直前にトランスフェクション反応を設定する。
ｂ．細胞を回収し、プレーティングし、トランスフェクトする。
２）トランスフェクトした細胞からプラスミドＤＮＡを回収する。
３）回収したプラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉに形質転換する。
ゲノムＤＮＡへのインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みのためのＣＭＶ－ＧＦＰ安定哺乳動物細胞株の作製。
哺乳動物細胞における個々の組み込み事象の忠実度を定量化及び特性決定するために使用可能な安定ＧＦＰレポーター細胞株を作製した（図３）。ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にあるＧＦＰをコードするプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＦＰ）を線状化し、Ｃｏｓ７細胞にトランスフェクトして、Ｇ４１８及び段階希釈を使用して安定クローンを選択した。この人工遺伝子座は、必須宿主遺伝子を標的とする場合にさもなければ起こり得る正常細胞の生存率を低下させずに、破壊の標的となり得る強力な遺伝子発現を可能とする。
哺乳動物のゲノムＤＮＡへのドナー配列のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込み。
ＣＭＶ－ＧＦＰ遺伝子座での組み込み事象を定量化するために、ＩＧＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－２Ａ－ピューロマイシン－ｐＡカセットとＧＦＰコード配列を標的とする対形成したガイドＲＮＡとを含有するドナー鋳型を構築した（図３）。ドナーカセットをＣＭＶ－ＧＦＰ遺伝子座へ組み込むと、ｍＣｈｅｒｒｙの発現が駆動され、ＧＦＰの発現が妨害されて、抗生物質ピューロマイシンに対する耐性がもたらされる。トランスフェクション及び４８時間の培養後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が観察され、その一部には、弱いが検出可能なレベルのＧＦＰ発現が依然として含まれていた（図３）。
内在性遺伝子座でのドナー配列のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込み。
標的化戦略を設計し、ヒトＥＦ１－アルファ遺伝子座の３’ＵＴＲに特異的なガイドＲＮＡを選択して、ＩＧＲ－ｍＣｈｅｒｒｙ－２Ａ－ピューロマイシン－ｐＡカセットをヒトＨＥＫ２９３細胞株にノックインした（図８）。ＥＦ１－アルファ発現のオープンリーディングフレームを破壊することなくＩＧＲ－ｍＣｈｅｒｒｙカセットを発現させるため、３’ＵＴＲを標的とした。トランスフェクション及び４８時間の培養後、培養液中にｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が観察された（図８）。
プロトコル：哺乳動物のゲノムＤＮＡへのドナー配列のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込み
１）Ｆｕｇｅｎｅ６またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ｓｇＲＮＡをコードするプラスミド、ＩＮ－ｄＣａｓ９をコードするプラスミド及びＩＮｓｒｔドナー鋳型をコードするプラスミドを、１：１：１で哺乳動物細胞（ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３など）にコトランスフェクトする。
ａ．細胞を回収し、プレーティングし、トランスフェクトする。
２）組み込まれた配列の抗生物質選択
ａ．抗生物質選択を含有する１０ｍｌの培地で細胞を洗浄し、この培地にプレーティングする。
ｂ．細胞を培養後、クローンを作製する。
指向性編集。
ＤＮＡ配列のＩＮ媒介性組み込みは、標的ＤＮＡ配列のいずれの方向にも生じ得る。Ｃａｓ及びＩＮレトロウイルスクラスのタンパク質の様々な組み合わせの利用により、指向性編集を促進する能力がもたらされる。例えば、触媒的に死んだＬｂＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）に融合したＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルスまたは他のＨＩＶ関連ウイルス）由来のＩＮの融合体は、Ｃｐｆ１特異的ガイドＲＮＡを利用した特定の標的配列への結合を可能にする。ＨＩＶとＢＩＶの両方の末端配列を含有するドナー配列の利用により、標的ＤＮＡとの単一方向への結合が固定される（図９）。
Ｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子の作製のための多重ゲノム編集。
目的遺伝子周囲のＬｏｘＰに隣接する（Ｆｌｏｘｅｄ）配列の導入により、Ｃｒｅ媒介性組換え及び条件付き突然変異誘発が可能となる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用してＦｌｏｘｅｄ対立遺伝子を作製する現行の方法は、非効率的である。最も広く利用されているアプローチは、隣接する標的配列でのＤＮＡ切断を誘導するための２本のガイドＲＮＡ、及びＬｏｘＰ配列を含有するｓｓＤＮＡ鋳型を挿入するための相同組換え修復を使用することである。しかしながら、二重ｓｇＲＮＡを使用して切断を誘導する場合、最も好ましい反応は、介在配列が欠失し、その結果全体的な遺伝子欠失が生じることである。宿主ＤＮＡとのＩＮ媒介性の鎖導入で介在配列の効率的な欠失が行えない場合、インテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性遺伝子挿入の使用は、ＤＮＡ配列のタンデム挿入に、より効率的な代替アプローチを提供する。ＩＮ媒介性組み込みはいずれの方向でも生じ得るため、反転したＬｏｘＰ配列を含有する配列の組み込みにより、ＬｏｘＰに隣接する配列の組換えが可能となる（図１０）。
実施例５：Ｔｙ１ ＮＬＳ様配列の同定及び活性
酵母Ｔｙ１レトロトランスポゾン由来のインテグラーゼ酵素は、比較的大型のリンカー配列によって分離されたタンデムＫＫＲモチーフで構成される非古典的な双節型核局在化シグナルを含有する。酵母における先行研究により、核局在化及びＴｙ１転位のためにこれらの基本的なモチーフが必要であることが実証されている（Ｋｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，１１１５－１１２４、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，１１０５－１１１４）。Ｔｙ１転位はＴｙ１ ＮＬＳの存在に完全に依存しており、興味深いことに、古典的なＮＬＳは、転位に必要なＴｙ１ ＮＬＳ活性を再現するには不十分である。興味深いことに、別の酵母タンパク質がこのタンデムＫＫＲモチーフを共有しており、これらのタンパク質の多くが核に局在していることを考慮すると、これらはＮＬＳとしての機能を果たす可能性がある（Ｋｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８，１１１５－１１２４）。
実施例１に示されるように、酵母Ｔｙ１ ＮＬＳは、哺乳動物細胞中でＣａｓタンパク質及びＣａｓ融合タンパク質の強力な核局在化をもたらす。この活性がＴｙ１ ＮＬＳの固有の特性であるかどうかを判断するために、Ｔｙ２インテグラーゼ及び他の酵母Ｔｙ１ ＮＬＳ様モチーフに由来する近縁のＮＬＳが、インテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質（ＩＮΔＣ－Ｃａｓ９）を哺乳動物細胞中の核に局在させるのに十分であるかどうかを試験した。興味深いことに、Ｔｙ１ ＮＬＳに高度に保存されているＴｙ２ ＮＬＳは、核局在化についてＴｙ１ ＮＬＳと同等に効率的であった（図１１）。Ｔｙ１／Ｔｙ２ ＮＬＳ配列とは異なる、酵母中で同定された３つの異なるＴｙ１ ＮＬＳ様配列の融合体（Ｋｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）は、強力なＮＬＳ活性を示したか（ＭＡＫ１１）、または明らかなＮＬＳ活性を示さなかったか（ＩＮＯ４及びＳＴＨ１）のいずれかであった。ＭＡＫ１１配列は酵母核タンパク質に由来し、またタンパク質のＣ末端に存在する。これをさらにスクリーニングしたところ、この配列が実際にＮＬＳとして機能していることが示唆された。モチーフＫＫＲN20-40ＫＫＲを使用するＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｎｋ内のすべてのタンパク質により、多種多様な種にわたり、多数の潜在的なＴｙ１ ＮＬＳ様配列が同定された（配列番号２７５～８８７）。これらのデータは、他のＴｙ１ ＮＬＳ様配列が強力なＮＬＳ活性を有する可能性があり、分裂真核細胞及び非分裂真核細胞におけるタンパク質（Ｃａｓ及びＣａｓ融合タンパク質を含む）の局在化に有用である可能性があることを示している。
実施例６：Ｔｙ１ ＮＬＳを用いた向上したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＤＮＡ編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切断系は細菌に由来し、Ｃａｓタンパク質は大型であり、かつ内在性の哺乳動物核局在化シグナル（ＮＬＳ）を欠いているため、哺乳動物細胞中でのそれらの効率的な核局在化が妨げられている。これまで、哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による効率的な核局在化及びＤＮＡの編集には、２つの古典的な核局在化シグナル（Ｎ末端ＳＶ４０及びＣ末端ヌクレオプラスミン（ＮＰＭ）双節型ＮＬＳ）の付加が必要であることが示されてきた（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３）。哺乳動物細胞中でＣａｓ融合タンパク質を局在化させるための、非古典的な酵母レトロトランスポゾンＴｙ１ ＮＬＳの強力な性質（実施例１）を理由として、Ｔｙ１ ＮＬＳが哺乳動物細胞中で従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の編集効率を向上させるようにも機能し得るかどうかを試験した。
Ｔｙ１がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集を向上させるかどうかを判断するために、既存のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐｘ３３０）を、Ｃ末端のＮＰＭ ＮＬＳを非古典的なＴｙ１ ＮＬＳ（ｐｘ３３０－Ｔｙ１）に置き換えることにより改変した（図１２Ａ）。次に、標的配列（ｔｓ）の下流でアウトオブフレームのルシフェラーゼコード配列をコードする、フレームシフト応答性ルシフェラーゼレポーターを作製した（図１２Ｂ）。このレポーターアッセイでは、標的配列付近の切断及び細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による不完全な修復により、ルシフェラーゼコード配列を再構成してルシフェラーゼ発現を生じさせる可能性のあるヌクレオチドの挿入または欠失が誘発され得る。
ＮＰＭ ＮＬＳを含有するＣａｓ９と２０ヌクレオチドの標的配列に特異的な単一ガイドＲＮＡとをコードするベクターとのルシフェラーゼレポーターの共発現は、非標的化ガイドＲＮＡと比較して、バックグラウンドに対する約２０倍のルシフェラーゼ活性の増加をもたらした（図１２Ｃ）。特に、Ｔｙ１ ＮＬＳを含有するＣａｓ９の発現は、ＮＰＭ ＮＬＳを含有するＣａｓ９と比較して、ＣＯＳ－７細胞中のレポーター活性を有意に（約４４％）増強させた（図１２Ｃ）。
実施例７：編集のためのゲノム標的化戦略
インテグラーゼ－ＤＮＡ結合融合タンパク質を使用したＤＮＡドナー配列の標的化組み込みは、所望の結果に応じて、ゲノム内の様々な場所を標的とすることができる。例えば、遺伝子発現カセット（例えば、プロモーター、遺伝子配列及び転写ターミネーター）からなる治療用ＤＮＡドナー配列は、隣接遺伝子の発現に影響を及ぼすことなく治療遺伝子を発現させることができる、「セーフハーバー」位置を標的とすることができる（ヒトゲノムにおけるセーフハーバー部位の概説及びリストについては、Ｐｅｌｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０，８１４－８２８を参照されたい）。これらには、隣接遺伝子から離れた遺伝子間領域、例えばＨ１１、または「非必須」遺伝子、例えばＣＣＲ５、ｈＲＯＳＡ２６もしくはＡＡＶＳ１内が含まれ得る（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
疾患を引き起こす遺伝子突然変異の発現を元に戻すために、治療遺伝子配列の内在性疾患遺伝子座への標的化組み込みが有利である可能性があり、その理由としては、この遺伝子座がすでに欠損しており、この遺伝子座の空間的及び時間的発現が内在性の調節制御下にあるためである。１回の反復で、スプライスアクセプターを含有する治療遺伝子をコードするＤＮＡドナー配列を内在性遺伝子座の第１イントロンに組み込むことができ、これにより、スプライシングは、１）導入された遺伝子配列を発現させ、かつ２）変異配列の下流の発現を阻止する（組み込まれたポリ（Ａ）配列またはＬＴＲ配列からの終止による）（図１３Ｃ）。これが下流のイントロンを標的とする場合、より小さなＤＮＡドナー配列を送達または発現させることができる（図１３Ｄ）。
遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）へのＩＲＥＳ配列を含有するＤＮＡドナー配列の標的化挿入は、このアプローチが標的遺伝子座と同じ空間的及び時間的発現での発現を可能にし、標的遺伝子座を破壊する可能性が低いという点で有益であり得る（図１３Ｅ）。
実施例８：ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳを使用した哺乳動物ゲノムへの標的化レンチウイルス組み込み
ここに示されるデータは、哺乳動物ゲノムへのレンチウイルスドナー配列の送達及び標的化組み込みのための異なる３つのアプローチを示している。
レンチウイルスの生活環
レンチウイルスは、それらのプロウイルスゲノムの永続的な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）コピーを宿主細胞ＤＮＡに組み込む、一本鎖ＲＮＡウイルスである（図１４）。レンチウイルスゲノムは、ウイルス遺伝子の転写を制御し、プロウイルスゲノムの組み込みに必要な短い（約２０塩基対）配列モチーフをＵ３末端及びＵ５末端に含有する、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）配列に隣接している。ウイルス感染に続いて、レンチウイルスＲＮＡゲノムは、ウイルスにコードされた逆転写酵素（ＲＴ）により平滑末端ｄｓＤＮＡとしてコピーされ、インテグラーゼ（ＩＮ）により宿主ゲノムに挿入される。ＩＮは、ＤＮＡに非特異的に結合するＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む、ＩＮ活性に不可欠な３つの機能ドメインからなる。レトロウイルスＤＮＡのＩＮ媒介性挿入は、ＤＮＡ標的配列特異性をほとんど伴わずに生じ、活性遺伝子座へ組み込むことができるが、これは、正常遺伝子機能を破壊する可能性があり、ヒトにおいて疾患を引き起こす可能性がある。このことにより、大きな配列搭載容量という利点にもかかわらず、遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターの有用性が制限されている。
ゲノム編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、短い単一ガイドＲＮＡを利用してＤＮＡを認識しそれに結合することにより、プログラム可能なＤＮＡ標的化を可能にする。触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、ＤＮＡを標的とする能力を保持しており、近年、ゲノムの照合及び調節用の多種多様な用途のためのプログラム可能なＤＮＡ結合プラットフォームとして再利用されている。実施例１に示したように、レンチウイルスインテグラーゼのｄＣａｓ９への融合は、哺乳動物細胞中でＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを使用して、短いウイルス末端を含有するドナーＤＮＡ配列を標的配列に挿入するのに十分である（図１５）。哺乳動物細胞中のインテグラーゼ－Ｃａｓ媒介性組み込みをモニタリングするために、ＩＧＲ ＩＲＥＳ配列とそれに続くｍＣｈｅｒｒｙ－２ａ－ピューロマイシン遺伝子及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を含有するドナーベクターを作製した（図１５）。ＣＯＳ－７細胞中の安定したヒトＣＭＶ－ｅＧＦＰ安定細胞株を標的とするｓｇＲＮＡを設計した（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。ｈＣＭＶ－ｅＧＦＰの安定した導入遺伝子は、強力に発現しているが必須ではない発現遺伝子座での編集を判定するために使用することができる異種標的配列をもたらした。ドナーｍＣｈｅｒｒｙ－２ａ－ｐｕｒｏ鋳型を精製し、ｓｇＲＮＡ及びＩＮ－ｄＣａｓ９とともにＧＦＰ安定細胞にコトランスフェクトし、４８時間培養した。４８時間後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞が培養液中に見られ、ＧＦＰ陽性シグナルに取って代わった（図１５Ｅ）。編集成分（インテグラーゼ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９融合体）をレンチウイルス粒子に導入することにより、標的化され容易にプログラム可能な宿主ＤＮＡへのレンチウイルスゲノムの組み込みが可能となり、これにより、レンチウイルス遺伝子治療の主要な制限（すなわち、非特異的なレンチウイルスの組み込み）が取り除かれる。このアプローチは、基礎研究及び治療用途の両方に有用である。
レンチウイルス遺伝子送達系
レンチウイルスベクターは、研究用途のための強力な遺伝子送達ツールとして適合されている（図１６）。レンチウイルスの構造タンパク質及び酵素タンパク質は、大型ポリタンパク質（ｇａｇ－ｐｏｌ及びエンベロープ）として転写及び翻訳される（図１６Ａ）。出芽ウイルス粒子に導入されると、ポリタンパク質はウイルスプロテアーゼによって個々のタンパク質にプロセシングされる。レンチウイルスベクター遺伝子発現系では、これらのポリタンパク質はウイルスゲノムから取り除かれ、別々の哺乳動物発現プラスミドを使用して発現される（図１６Ｂ）。次に、目的のドナーＤＮＡ配列をウイルスポリタンパク質の代わりに、隣接するＬＴＲ配列の間にクローニングすることができる。哺乳動物細胞におけるこれらのベクターのコトランスフェクションにより、コードされたドナー配列を送達及び組み込むことができるレンチウイルス粒子が形成されるが、しかしながら、後続のウイルス増殖に必要なインテグラーゼ及び他のウイルスタンパク質についてのコード情報は必要とされない（図１６Ｂ）。レンチウイルス粒子は、ウイルスタンパク質（例えば、インテグラーゼ及び逆転写酵素）ならびにｄｓＤＮＡドナー配列の両方を送達するための天然のベクターであり、哺乳動物細胞へのインテグラーゼ媒介性の挿入に要する必要なウイルス末端配列を含有する（図１６Ｃ）。
インテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質のレンチウイルス粒子へのパッケージング。
既存のレンチウイルス送達系を改変して、哺乳動物細胞におけるゲノム編集のための、標的化レンチウイルスドナー鋳型の組み込みを目的とした編集成分を導入することができる（図１７～図２０）。ここでは、哺乳動物ゲノムへのレンチウイルスドナー配列の送達及び標的化組み込みのための異なる３つのアプローチを記載する。
第１のアプローチは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードするレンチウイルスパッケージングプラスミド（例えば、ｐｓＰａｘ２）内に、インテグラーゼ（またはそのＣ末端非特異的ＤＮＡ結合ドメインを欠くインテグラーゼ（ＩＮΔＣ））への融合体としてｄＣａｓ９を直接導入することである（図１７Ａ）。このアプローチでは、修飾ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質を他のウイルス成分とともにポリタンパク質として翻訳し、ガイドＲＮＡとともに搭載してレンチウイルス粒子にパッケージングする（図４Ｂ）。インテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質は、プロテアーゼ切断（ＰＲ）に必要な配列を保持しており、これにより、粒子成熟中にｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質から正常に切断される。哺乳動物細胞の形質導入により、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質、ｓｇＲＮＡ及びレンチウイルスドナー配列を含むウイルスタンパク質が送達される。逆転写酵素によるｓｓＲＮＡゲノムの逆転写によって正確なウイルス末端配列（Ｕ３及びＵ５）を含有するｄｓＤＮＡ配列が生成され、次いで、この配列はＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質により哺乳動物ゲノムに組み込まれる。
第２のアプローチは、インテグラーゼ－ｄＣａｓ９とＨＩＶウイルスタンパク質Ｒ（ＶＰＲ）のＮ末端及びＣ末端融合体を生成することである（図１８Ａ）。ＶＰＲは、アクセサリータンパク質としてレンチウイルス粒子に効率的にパッケージングされており、異種タンパク質（例えば、ＧＦＰ）のレンチウイルス粒子へのパッケージングに使用されている。ウイルスプロテアーゼ切断配列がＶＰＲとＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質との間に含まれており、これにより、成熟後にＩＮ－ｄＣａｓ９がＶＰＲから遊離する（図１８Ａ）。パッケージング細胞とレンチウイルス成分とのコトランスフェクションにより、ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡを含有するウイルス粒子が生成される。ウイルス粒子形成に必要なパッケージングプラスミド（例えば、ｐｓＰａｘ２）は、インテグラーゼ内にその触媒活性を阻害する突然変異を含んでおり、それにより非媒介性組み込みを阻害する（図１８Ｂ）。ウイルスの形質導入時に、インテグラーゼ－ｄＣａｓ９タンパク質が送達され、このタンパク質がレンチウイルスドナー配列の組み込みを媒介する（図１８Ｃ）。ＩＮ－ｄＣａｓ９融合体及びｓｇＲＮＡをリボタンパク質として送達する利点は、これが標的細胞中で一過性にのみ発現することである。
第３の方法は、インテグラーゼ－ｄＣａｓ９融合タンパク質及びｓｇＲＮＡ発現カセットをレンチウイルス導入プラスミドまたは他のウイルスベクター（ＡＡＶなど）に直接導入することである（図１９Ａ）。ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質とｓｇＲＮＡとを含有する導入プラスミドを、レンチウイルス粒子を生成するのに必要なパッケージングプラスミド及びエンベローププラスミドとともにコトランスフェクトする。レンチウイルスを使用する場合、パッケージングプラスミドには、非特異的組み込みを阻害するための触媒性突然変異をインテグラーゼ内に含める（図１９Ｂ）。哺乳動物細胞を形質導入すると、ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質及びｓｇＲＮＡの発現は、標的化組み込みのためにそれ自身のウイルスドナーベクターを標的とすること（自己組み込み）ができる成分を生成する（図１９Ｃ）。この方法は、標的遺伝子の破壊のために、または遺伝子ドライブとして使用される。あるいは、ドナー配列をコードする追加のレンチウイルス粒子との共形質導入は、組み込まれたドナー鋳型として機能する（図１９）。このアプローチにおいて、自身のウイルスをコードする配列の自己組み込みの防止は、異なるレトロウイルス科のメンバーに由来するインテグラーゼ酵素及びそれらの対応する導入プラスミドを使用することにより行われる。例えば、ＦＩＶ ＩＮ－ｄＣａｓ９融合タンパク質をコードするＨＩＶレンチウイルス粒子を利用して、ＦＩＶレンチウイルス粒子内にコードされたＦＩＶドナー鋳型を組み込む（図２０）。
単一遺伝子座であり、構成的に活性な遍在性ＲＯＳＡ２６mGFP/+レポーターマウス系統の作製
ＲＯＳＡ２６ｍＴ／ｍＧレポーターマウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、ストック番号００７５７６）には、ｆｌｏｘｅｄ膜局在ｔｄＴＯ（ｍＴ）蛍光レポーターカセットが含まれており、これをＣＲＥリコンビナーゼを用いて組換えると、ｍＴレポーターが除去され、膜局在ｅＧＦＰ（ｍＧ）レポーターが発現する。単一遺伝子座を生成するために、ｉｎ ｖｉｖｏ ＧＦＰレポーター系統であるＲＯＳＡ２６ｍＴ／ｍＧマウスを汎用ＣＡＧ－ＣＲＥリコンビナーゼマウスと交配させ、構成的かつ遍在的に発現するＲＯＳＡ２６ｍＧレポーターマウスを作製した。ヘテロ接合ＲＯＳＡ２６mG/+マウスからのマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）の単離により、培養中のすべての細胞における強力な膜ＧＦＰ発現が明らかとなった（図２１）。同様の戦略を利用して、ＲＯＳＡ２６ｎＴ／ｎＧマウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、ストック番号０２３０３５）の組換えにより、遍在的で構成的に活性な核ＧＦＰレポーターを作製する。
ＲＯＳＡ－ｍＧＦＰ遺伝子座への標的化組み込みのためのレンチウイルス粒子への成分のパッケージング。
ＲＯＳＡ２６mG/+ＭＥＦ中のＧＦＰコード配列へのＩＲＥＳ－ｔｄＴＯ配列の標的化組み込みのために、パッケージング細胞株（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でレンチウイルス粒子を作製した。レンチウイルス粒子を、第２世代ＳＩＮレンチウイルスＬＴＲ間のＩＲＥＳ－ｔｄＴＯ蛍光レポーターをコードするレンチウイルス導入プラスミド（Ｌｅｎｔｉ－ＩＲＥＳ－ｔｄＴＯ）、汎親和性エンベロープタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）をコードする発現ベクター、ＧＦＰを標的とするガイドＲＮＡの反転させた対をコードする発現プラスミド、及びｐｓＰａｘ２パッキングプラスミド中のＧａｇ－Ｐｏｌレンチウイルスポリタンパク質の状態でＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９融合体をコードするパッキングプラスミド（ＩＮΔＣ－ｄＣａｓ９－ｐｓＰａｘ２）のコトランスフェクションにより作製した。レンチウイルス粒子を上清から回収し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを使用して濾過した。
哺乳動物細胞における標的化レンチウイルス組み込み
Ｉｎｃｒｉｐｔｒ改変レンチウイルス粒子を使用して、培養液中のＲＯＳＡ２６mG/+ＭＥＦを形質導入した。２日後、ＩＲＥＳ－ｔｄＴＯレポーターをコードするレンチウイルスで形質導入したＭＥＦ中で、遍在性の赤色蛍光タンパク質の発現が検出可能であったが、ＧＦＰ蛍光が保持されていた。この最初の広範な発現はレンチウイルスＩＲＥＳ－ｔｄＴＯにコードされたウイルスＲＮＡの翻訳による可能性が高く、これは、レンチウイルスパッケージングがパッケージングプラスミドの改変によって阻害されなかったことを示している（図２１）。従来のレンチウイルス形質導入では、ウイルスの組み込みの非存在下では、レンチウイルス導入遺伝子の発現は維持されない。注目すべきことに、形質導入の７日後、ＲＯＳＡ２６mG/+一次細胞において（図２１）、または前述のＣＭＶ－ＧＦＰ ＣＯＳ－７安定細胞株を標的とした場合に（図２２）、培養液中で今回は緑色蛍光を欠くｔｄＴＯ赤色蛍光細胞が検出可能であった。これらのデータは、Ｇａｇ－Ｐｏｌレンチウイルスポリタンパク質の状態でインテグラーゼ（Ｃ末端ＤＮＡ結合ドメインを欠く）を触媒的に死んだＣａｓ９に融合させることにより、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスのパッケージング、送達及びレンチウイルスにコードされたドナー配列の標的化が可能となることを示す。さらに、これらのデータは、レンチウイルスパッケージング細胞中のガイドＲＮＡの発現がレンチウイルス粒子への導入に十分であり、これが、ｄＣａｓ９との強力な相互作用によって生じ得ることを示唆している。ガイドＲＮＡをレンチウイルス粒子に送達するための代替的アプローチは、例えば、導入プラスミドにおけるガイドＲＮＡ（複数可）の構成的発現などを通じて、標的化組み込みを向上させ得る。
レンチウイルス粒子の標的化組み込みのための代替的ＤＮＡ結合ドメイン。
このデータは、インテグラーゼの非特異的ＤＮＡ結合ドメインをｄＣａｓ９のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに置き換えることにより、レンチウイルスにコードされたドナー配列の送達のための、ｄｓＤＮＡドナー鋳型の標的化組み込み、またはレンチウイルス粒子での送達を介した標的化組み込みが可能となることを示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は２成分であり、標的化のためのＣａｓタンパク質及び小さなガイドＲＮＡの両方に依存する。場合によっては、レンチウイルス粒子を介した送達にＴＡＬＥＮなどの単一成分ＤＮＡ標的化タンパク質を利用することが有益であり得、それは、コードされたタンパク質によってのみそれらが標的化されるためである。同様のレンチウイルス産生アプローチを使用して、以前のパッケージング戦略におけるｄＣａｓ９を所与の配列（例えば、ｅＧＦＰ及びセーフハーバー遺伝子座）を標的とするＴＡＬＥＮに置き換えることで、ガイドＲＮＡの送達を必要とせずにレンチウイルスのパッケージング及び標的化が可能となる（図２３）。例えば、ＴＡＬＥＮは、ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質（図２３Ａ）、ＶＰＲなどのウイルスに導入されたタンパク質への融合体としてのＩＮ－ＴＡＬＥＮ（図２３Ｂ）、または導入プラスミド内に送達されたＩＮ－ＴＡＬＥＮ（図２３Ｃ）の状態のいずれかで、インテグラーゼへの融合体としてパッケージング及び送達される。
実施例９：Ｔｙ１ ＮＬＳを用いた向上したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＤＮＡ編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＤＮＡ切断系は細菌に由来し、Ｃａｓタンパク質は大型であり、かつ内在性の哺乳動物核局在化シグナル（ＮＬＳ）を欠いているため、哺乳動物細胞中でのそれらの効率的な核局在化が妨げられている。
Ｔｙ１がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集を向上させるかどうかを判断するために、既存のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐｘ３３０）を、Ｃ末端のＮＰＭ ＮＬＳを非古典的なＴｙ１ ＮＬＳ（ｐｘ３３０－Ｔｙ１）に置き換えることにより改変した（図２４Ａ）。次に、標的配列（ｔｓ）の下流でアウトオブフレームのルシフェラーゼコード配列をコードする、フレームシフト応答性ルシフェラーゼレポーターを作製した（図２４Ｂ）。このレポーターアッセイでは、標的配列付近の切断及び細胞の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による不完全な修復により、ルシフェラーゼコード配列を再構成してルシフェラーゼ発現を生じさせる可能性のあるヌクレオチドの挿入または欠失が誘発され得る。
ＮＰＭ ＮＬＳを含有するＣａｓ９と２０ヌクレオチドの標的配列に特異的な単一ガイドＲＮＡとをコードするベクターとのルシフェラーゼレポーターの共発現は、非標的化ガイドＲＮＡと比較して、バックグラウンドに対する約２０倍のルシフェラーゼ活性の増加をもたらした（図２４Ｃ）。特に、Ｔｙ１ ＮＬＳを含有するＣａｓ９の発現は、ＮＰＭ ＮＬＳを含有するＣａｓ９と比較して、ＣＯＳ－７細胞中のレポーター活性を有意に（約４４％）増強させた（図２４Ｃ）。
実施例１０：インテグラーゼ－ＴＡＬＥＮ融合タンパク質による非相同ＤＮＡ組み込み
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、個々のヌクレオチド標的化ドメインをタンデムに組み立てることによって構築される、十分に研究されたプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質である（Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。Ｉｎｓｃｒｉｐｔｒについて実証された同様のアプローチでは、ＴＡＬＥＮを利用して、ドナーＤＮＡ鋳型のレトロウイルスインテグラーゼ媒介性の組み込みを誘導することができる（図２５）。ＴＡＬＥＮ－インテグラーゼ融合タンパク質を作製するために、前述のＴＡＬＥＮ発現ベクターからＴＡＬＥＮ標的化リピートを得てＩＮ－ＴＡＬＥＮまたはＴＡＬＥＮ－ＩＮ融合体のいずれかが生成されるように、哺乳動物発現ベクターを構築した。各融合タンパク質には、３ｘＦＬＡＧエピトープ、Ｔｙ１ ＮＬＳ、及びＣ末端非特異的ＤＮＡ結合ドメインを欠くＨＩＶインテグラーゼ（ＩＮΔＣ）間のリンカー配列によって分離されたＴＡＬＥＮリピートが導入された。場合によっては、ＩＮ突然変異を導入して、ＩＮの活性、二量体化、細胞タンパク質との相互作用、二量体化阻害剤に対する耐性、またはＩＮΔＣのタンデムコピー（ｔｄＩＮΔＣ）を変化させることができる。例えば、Ｅ８５Ｇ突然変異を導入して、偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）二量体形成を阻害することができる。
ｅＧＦＰを標的とするＴＡＬＥＮ対は、標的化効率について以前に記載及び検証されている（Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ａｄｄｇｅｎｅより入手可能）。ＴＡＬＥＮ対（ＣｌａＩ／ＢａｍＨＩ断片）をサブクローニングして、１６ｂｐ長または２８ｂｐ長のスペーサーを有するｅＧＦＰを対象としたＴＡＬＥＮ－ＩＮ融合タンパク質を作製した。
プラスミドＤＮＡ組み込みアッセイ（図２６）を使用して、ｅＧＦＰを標的とするＴＡＬＥＮ－ＩＮ対、ＩＧＲ－ＣＡＴ耐性遺伝子をコードする直鎖状二本鎖ＤＮＡドナー配列、及びａｍｉｌＣＰ細菌発現レポーターのコトランスフェクションを哺乳動物のＣＯＳ－７細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、編集したプラスミドを哺乳動物細胞から回収し、ｅ．ｃｏｌｉに形質転換して、クロラムフェニコールプレートで選択した。興味深いことに、１６ｂｐ離したＴＡＬＥＮ対は約６倍多いクロラムフェニコール耐性コロニーを生じさせたが、その一方で、２８ｂｐ離したＴＡＬＥＮ対は非標的化インテグラーゼと同様であった（図２７）。これらのデータは、ＴＡＬＥＮペアの近接性が標的化及び組み込みに重要であることを示唆しており、これは、ＴＡＬＥＮ－ＦｏｋＩ媒介性のｄｓＤＮＡ切断について以前に報告された特徴である。
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本明細書で引用されるありとあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、具体的な実施形態を参照して開示されてきたが、当業者によって、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及び変形が考案されてもよいことは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることを意図している。

Claims (27)

  1. ａ）第１のアミノ酸配列を有するレトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、
    ｂ）第２のアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び
    ｃ）配列番号５１を含む第３のアミノ酸配列を有するＴｙ１レトロトランスポゾン核局在化シグナル（ＮＬＳ）
    を含む、融合タンパク質。
  2. 前記レトロウイルスＩＮが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩＮ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＩＮ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＩＮ、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＬＶ）ＩＮ、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＩＮ、ヒトＴリンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）ＩＮ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＩＮ、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）ＩＮ、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＬＶ）ＩＮ、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ＩＮ、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＩＮ、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ＩＮ、プロトタイプフォーミーウイルス（ＰＦＶ）ＩＮ、サルフォーミーウイルス（ＳＦＶ）ＩＮ、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）ＩＮ、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（ＷＤＳＶ）ＩＮ、及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ＩＮからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記レトロウイルスＩＮの断片が、ＩＮ Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＩＮ触媒コアドメイン（ＣＣＤ）を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  4. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３及びＣｐｆ１からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
  5. 前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に欠損している（ｄＣａｓ）、請求項１に記載の融合タンパク質。
  6. 前記レトロウイルスＩＮが、配列番号１～４０のうちの１つと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  7. 前記レトロウイルスＩＮが、配列番号１～４０から選択される配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  8. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４１～４６のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  9. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４１～４６から選択される配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  10. 前記融合タンパク質が、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  11. 前記融合タンパク質が、配列番号５７～９８から選択される配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
  13. 前記核酸が、配列番号１５５～１９６のうちの１つと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子。
  14. 前記核酸が、配列番号１５５～１９６から選択される配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子。
  15. 遺伝物質を編集する方法であって、
    ａ）請求項１～１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項１２～１４のいずれか１項に記載の核酸分子、
    ｂ）前記遺伝物質内の標的領域に相補的な標的化ヌクレオチド配列を含むガイド核酸、ならびに
    ｃ）Ｕ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含むドナー鋳型核酸
    を、前記遺伝物質に投与することを含む、前記方法。
  16. ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である、請求項１５に記載の方法。
  17. 遺伝物質を編集するための組成物であって、
    ａ）融合タンパク質をコードする核酸配列であって、前記融合タンパク質が、レトロウイルスインテグラーゼ（ＩＮ）またはその断片、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、及び配列番号５１を含むアミノ酸配列を有するＴｙ１レトロトランスポゾン核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、前記融合タンパク質をコードする核酸配列、
    ｂ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡをコードする核酸配列、ならびに
    ｃ）ドナー鋳型核酸をコードする核酸配列であって、前記ドナー鋳型核酸が、Ｕ３配列、Ｕ５配列及びドナー鋳型配列を含む、前記ドナー鋳型核酸をコードする核酸配列
    を、１つ以上のベクターに含む、前記組成物。
  18. ａ）、ｂ）及びｃ）の核酸が同じかまたは異なるベクター上に存在する、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記融合タンパク質が、配列番号５７～９８のうちの１つと少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
  20. 前記融合タンパク質が、配列番号５７～９８から選択される配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
  21. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡが、遺伝子の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする、請求項１７に記載の組成物。
  22. 前記Ｕ３配列及び前記Ｕ５配列が、前記レトロウイルスＩＮに特異的である、請求項１７に記載の組成物。
  23. ゲノム編集成分を送達するための組成物であって、
    ａ）触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質及び配列番号５１を含むアミノ酸配列を有するＴｙ１レトロトランスポゾン核局在化シグナル（ＮＬＳ）に融合されたインテグラーゼを含むｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする配列を含むパッケージングプラスミド、
    ｂ）ドナー配列、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲをコードする配列を含む導入プラスミド、ならびに
    ｃ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミド
    を含む、前記組成物。
  24. 前記パッケージングプラスミドが、ガイドＲＮＡ配列をコードする配列をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. ゲノム編集成分を送達するための組成物であって、
    ａ）ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする配列を含むパッケージングプラスミド、
    ｂ）ドナー配列、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲをコードする配列を含む導入プラスミド、
    ｃ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミド、ならびに
    ｄ）ＶＰＲ、インテグラーゼ及び触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）、及び配列番号５１を含むアミノ酸配列を有するＴｙ１レトロトランスポゾン核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含むＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミド
    を含む、前記組成物。
  26. 前記ＶＰＲ－ＩＮ－ｄＣａｓプラスミドが、ガイドＲＮＡ配列をコードする配列をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. ゲノム編集成分を送達するための組成物であって、
    ａ）ｇａｇ－ｐｏｌポリタンパク質をコードする核酸配列を含むパッケージングプラスミド、
    ｂ）ガイドＲＮＡ、インテグラーゼと触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）とを含む融合タンパク質、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ、及び配列番号５１を含むアミノ酸配列を有するＴｙ１レトロトランスポゾン核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列を含む導入プラスミド、ならびに
    ｃ）エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含むエンベローププラスミド
    を含む、前記組成物。
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