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JP7555827B2 - アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤との組み合わせ医薬 - Google Patents

アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤との組み合わせ医薬 Download PDF

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Description

本発明は、アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤との組み合わせ医薬、及び、がんを治療又は予防のための当該ミセル剤の使用であって、免疫賦活剤と組み合わせる、ミセル剤の使用等に関する。
アントラサイクリン系化合物は、細菌由来の抗生物質であり、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成の阻害、ＩＩ型トポイソメラーゼの阻害等を介して細胞増殖を阻害し、これにより、抗腫瘍活性を発揮する。代表的なアントラサイクリン系化合物としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アムルビシン等が挙げられ、これらは、急性白血病、悪性リンパ腫、肺がん、消化器がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、骨肉種、尿路上皮がん等の種々のがんに適用されている。
また、がんに対する代表的な治療方法としては、抗がん剤等の薬物を用いた薬物療法に加えて、手術等の外科療法及び放射線療法が挙げられるが、近年は、新たなアプローチとして、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）等の免疫賦活剤を用いた免疫療法にも関心が向けられている。例えば、特許文献１には、ドキソルビシン又はそのポリエチレングリコール被覆リポソーム封入形態と免疫調節薬とを併用投与することが提案されている。
特表２０１８－５００３８４号公報
本発明者らがアントラサイクリン系化合物と免疫賦活剤との併用投与に関して研究を進めたところ、脳腫瘍の一種であり、悪性度が高い膠芽腫に関しては、特許文献１の方法では抗腫瘍効果が十分ではない場合があることを見出した。
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、従来の治療方法では治療が困難ながん（例えば、膠芽腫等の神経膠腫）に対しても優れた抗腫瘍効果を発揮できる医薬組成物を提供することにある。
本発明の１つの局面によれば、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーと、アントラサイクリン系化合物とが結合した薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤を含有し、免疫賦活剤と組み合わせてがんの治療又は予防に用いられる、医薬組成物が提供される。
本発明の別の局面によれば、アントラサイクリン系化合物に対する難治性がんの治療又は予防のためのミセル剤の使用であって、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーと、該アントラサイクリン系化合物とが結合した薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤を、免疫賦活剤と組み合わせて使用する、ミセル剤の使用が提供される。
本発明によれば、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーと、アントラサイクリン系化合物とが結合した薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤を、免疫賦活剤と組み合わせて用いる（併用投与する）ことにより、従来の治療方法では治療が困難ながん（例えば、膠芽腫等の神経膠腫）に対しても優れた抗腫瘍効果を発揮することができる。
本発明の１つの実施形態によるアントラサイクリン系化合物を含むミセル剤を説明する概略図である。 ミセル剤の粒子径分布を示すグラフである。 種々の被験薬の細胞傷害活性を示すグラフである。 種々の被験薬のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示すグラフである。 種々の被験薬を投与した際のマウスの生存曲線である。 マウスの脳のＭＲＩ観察画像である。 ＤＯＸＩＬ投与群とエピルビシンミセル投与群における副作用を説明する図である。 Ａは、臨床腫瘍におけるＰＴＥＮ異常の割合を示す図であり、Ｂは、ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞におけるＰＴＥＮの発現レベルを示す図であり、Ｃ及びＤは、種々の細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す図であり、Ｅ及びＦはそれぞれ、ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞に対する種々の被験薬のＩＣ５０を示す図であり、Ｇ及びＨはそれぞれ、ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞におけるＩＣＤマーカーの発現レベルを示す図である。 ＧＬ２６１細胞に対するエピルビシンミセルと免疫チェックポイント阻害剤との併用投与の効果を示す図である。 ＣＴ２Ａ細胞に対するエピルビシンミセルと免疫チェックポイント阻害剤との併用投与の効果を示す図である。 ＣＴ２Ａ細胞に対するエピルビシンミセルと免疫チェックポイント阻害剤との併用投与（高用量）の効果を示す図である。 静脈投与されたエピルビシンミセルの体内分布を示す図である。 ＧＬ２６１腫瘍の免疫組織学的観察結果である。 ＣＴ２Ａ腫瘍の免疫組織学的観察結果である。 Ｄａｙ４及びＤａｙ８におけるＣＴ２Ａ腫瘍の免疫組織学的観察画像である。 種々の被験薬を投与したマウスから摘出したＣＴ２Ａ腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の発現を示す図である。 種々の被験薬の細胞傷害活性を示すグラフである。 中皮腫モデルマウスに種々の被験薬を投与した際の抗腫瘍効果を示す図及びマウスの生存曲線である。 種々の被験薬の細胞傷害活性を示すグラフである。 線維肉腫モデルマウスに種々の被験薬を投与した際の抗腫瘍効果を示す図及び生存曲線である。 ＫＰＣ細胞におけるＩＣＤマーカーの発現レベルを示す図である。 種々の被験薬を投与したすい臓がんモデルマウスから摘出した腫瘍の写真である。 すい臓がんモデルマウスに種々の被験薬を投与した際の生存曲線である。
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明は該実施形態には限定されない。また、各実施形態は、適宜組み合わせることができる。なお、本発明に用いられるブロックコポリマーにおいて、親水性ブロック及び疎水性ブロックはそれぞれ、ある程度の多分散性を示し得る。
Ａ．医薬組成物
本発明の実施形態による医薬組成物は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーと、アントラサイクリン系化合物とが結合した薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤を含有し、免疫賦活剤と組み合わせてがんの治療又は予防に用いられる。処置対象の個体に対して、当該ミセル剤を含有する医薬組成物を、免疫賦活剤と組み合わせて投与（併用投与）することにより、神経膠腫等の従来の治療方法では治療が困難ながんに対しても優れた抗腫瘍効果が得られ得る。なお、本明細書において、用語「ミセル剤」と「ミセル」とは、実質的に同義に用いられ得る。
Ａ－１．アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤
図１は、本発明の１つの実施形態によるアントラサイクリン系化合物を含むミセル剤を説明する概略図である。ミセル剤１００は、親水性ブロック１２と親水性ブロック１２の一方の端部に連結された疎水性ブロック１４とを有するブロックコポリマー１０と、ブロックコポリマー１０に結合したアントラサイクリン系化合物２０と、を有する薬物－ポリマー複合体３０を含む。好ましくは、アントラサイクリン系化合物２０は、ブロックコポリマー１０に導入されたヒドラジド基を介してブロックコポリマー１０と結合している。また、ミセル剤１００において、薬物－ポリマー複合体３０は、代表的には、親水性ブロック１２を外側に向け、疎水性ブロック１４を内側に向けた状態で放射状に配列しており、これにより、ミセルの形態を形成している。
図示しないが、薬物－ポリマー複合体３０は、親水性ブロック１２側の末端に標的結合部位を有していてもよい。また、ミセル剤１００は、必要に応じて、薬物－ポリマー複合体３０に加えて、親水性ブロックと、親水性ブロックの一方の端部に連結された疎水性ブロックとを有する一方で、薬物を有さないブロックコポリマー（図示せず）をさらに含んでいてもよい。この場合、当該薬物非含有ブロックコポリマーもまた、代表的には、親水性ブロックを外側に向け、疎水性ブロックを内側に向けた状態で放射状に配列している。また、薬物非含有ブロックコポリマーの親水性ブロック側の末端に標的結合部位が導入されていてもよい。薬物非含有ブロックコポリマーの具体例としては、例えば、ＷＯ２００８／０４７９４８において式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表されるブロックコポリマーが例示できる。
本明細書において、薬物－ポリマー複合体又はブロックコポリマーが「放射状に配列している」とは、これらが親水性ブロックを外側に向け、疎水性ブロックを内側に向けて凝集した状態にあればよく、各ブロックコポリマーの配列の起点が一点に集中していない、やや崩れた放射状の配列構造であっても構わない。
本明細書において、標的結合部位とは、生体及びウイルスに由来する物質に対し特異的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成し得る、生物学的な認識機能を有する部位を意味する。生体及びウイルスに由来する物質としては、生体細胞、細菌、真菌及びウイルスに存在する分子が例示できる。生体細胞としては、腫瘍細胞及び新生血管細胞ならびにそれらの周辺細胞、免疫担当細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞）、炎症細胞（例えば白血球）、血管内皮細胞、各種臓器を構成する細胞が例示できる。また、標的結合部位を有する化合物としては、生体及びウイルスに由来する物質に対し特異的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成するタンパク質（抗体等）、ペプチド又は糖鎖を例示できる。１つの実施形態において、標的結合部位は抗体に由来する基であり、環状－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ｃＲＧＤ）を含まない。
上記ミセル剤の粒子径は、例えば１５ｎｍ～１５０ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ～１００ｎｍ、より好ましくは２５ｎｍ～６０ｎｍであり得る。このような粒子径であることにより、腫瘍組織内に良好に集積することができる。
Ａ－１－１．アントラサイクリン系化合物
アントラサイクリン系化合物としては、抗腫瘍活性を有する任意のアントラサイクリン類（７，８，９，１０－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，１２－ｎａｐｈｔｈａｃｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅのグリコシド）及びその誘導体又はそれらの薬学的に許容され得る塩が用いられ得る。
アントラサイクリン系化合物の具体例としては、ダウノルビシン、エピルビシン、ドキソルビシン、アムルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アクラルビシン、ピラルビシン、ミトキサントロン及びそれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩）が挙げられる。なかでも、エピルビシン、ドキソルビシン及びその誘導体あるいはそれらの薬学的に許容され得る塩が好ましく、エピルビシン及びその誘導体又はそれらの塩酸塩がより好ましい。エピルビシン及びその誘導体又はそれらの塩酸塩を含む薬物－ブロックコポリマーを用いて構成されたミセル剤を用いることにより、副作用を抑制しつつ、非常に優れた抗腫瘍効果が得られ得る。なお、アントラサイクリン系化合物は、単独で、又は、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
Ａ－１－２．ブロックコポリマー
ブロックコポリマーは、親水性ブロックと該親水性ブロックの一方の端部に連結された疎水性ブロックとを有する。親水性ブロック及び疎水性ブロックはそれぞれ、極性溶媒中で、薬物－ポリマー複合体が、親水性ブロックを外側に向け、疎水性ブロックを内側に向けた状態で放射状に配列し得る程度の親水性度及び疎水性度を有するものであればよい。
親水性ブロックは、代表的には、親水性ポリマーを含む。親水性ブロックを構成する親水性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリサッカライド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、ポリアミノ酸、ポリリンゴ酸、又はこれらの誘導体が挙げられる。ポリサッカライドの具体例としては、デンプン、デキストラン、フルクタン、ガラクタン等が挙げられる。これらのなかでも、ポリエチレングリコールは、末端に種々の官能基を有する末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、また、種々の分子量のものが市販されており、容易に入手できることから、好ましく用いられ得る。
親水性ブロックを構成する親水性ポリマーの重合度は、例えば５～２０００、５～１０００、４０～６００又は１００～４００であり得る。また、当該親水性ポリマーの分子量は、例えば２００Ｄａ以上、１，０００Ｄａ以上又は５，０００Ｄａ以上であり得、また例えば５０，０００Ｄａ以下、３０，０００Ｄａ以下又は２０，０００Ｄａ以下であり得る。
疎水性ブロックとしては、ポリアミノ酸ブロックが好ましく例示される。ポリアミノ酸ブロックは、代表的には、繰り返し単位（アミノ酸残基）として、官能基を側鎖に有する官能基含有アミノ酸残基を含む。ポリアミノ酸ブロックがこのような官能基含有アミノ酸残基を含むことにより、ブロックコポリマーとアントラサイクリン系化合物との結合が好適に行われ、結果として、薬物－ポリマー複合体が好適に得られ得る。また、比較的高い親水性度を有する官能基と後述する疎水性基とを適切な割合で側鎖に導入することにより、ポリアミノ酸ブロック全体としての疎水性度を所望の範囲に調整することができ、結果として、安定性の高いミセル剤を形成可能な薬物－ポリマー複合体が得られ得る。
上記官能基としては、ヒドラジド基（－ＮＨ－ＮＨ２）、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられる。なかでも、ヒドラジド基及びカルボキシル基が好ましい。官能基は、単独で、又は、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
ポリアミノ酸ブロックがヒドラジド基を側鎖に有するアミノ酸残基を含む実施形態（換言すれば、ポリアミノ酸ブロックの側鎖にヒドラジド基が導入されている実施形態）においては、当該ヒドラジド基とアントラサイクリン系化合物が有するケトン基（例えば、アントラサイクリン類の１３位のケトン基）とを反応させてヒドラゾン結合を形成させることによって、ブロックコポリマーとアントラサイクリン系化合物とが結合した薬物－ポリマー複合体が好適に得られ得る。また、当該薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤は、エンドサイトーシスを介して標的細胞内に取り込まれた際に、エンドソーム内の低ｐＨ環境に起因するヒドラゾン結合の開裂によって、薬物を好適に放出することができる。
ポリアミノ酸ブロックは、必要に応じて、任意の適切な繰り返し単位をさらに含むことができる。このような繰り返し単位としては、側鎖に疎水性基を有する疎水性基含有アミノ酸残基が挙げられる。疎水性基としては、例えば、Ｃ４～Ｃ１６の直鎖、分岐鎖又は環状構造を有するアルキル基、Ｃ６～Ｃ２０のアリール基、及びＣ７～Ｃ２０のアラルキル基又はステロール残基等の疎水性有機基が挙げられる。上記Ｃ６～Ｃ２０のアリール基及びＣ７～Ｃ２０のアラルキル基としては、好ましくはフェニル基、ナフチル基、トリル基、キシリル基、ベンジル基及びフェネチル基、より好ましくはフェニル基及びベンジル基、さらに好ましくはベンジル基が挙げられる。また、上記ステロール残基が由来するステロールは、好ましくはコレステロール、コレスタノール及びジヒドロキシコレステロールであり、より好ましくはコレステロールである。
ポリアミノ酸ブロックの具体例としては、ポリグルタミン酸誘導体、ポリアスパラギン酸誘導体又はポリ（グルタミン酸－コ－アスパラギン酸）誘導体を例示できる。
ポリアミノ酸ブロックの重合度は、例えば１０～１０００、好ましくは１５～２００、より好ましくは２０～１５０、さらに好ましくは２５～１００であり得る。
ポリアミノ酸ブロックにおけるヒドラジド基含有アミノ酸残基数は、例えば１～１０００、好ましくは１～１００、より好ましくは５～５０であり得る。また、ポリアミノ酸ブロックを構成する全アミノ酸残基数に対するヒドラジド基含有アミノ酸残基数の割合は、例えば１０％～９７％、好ましくは２５％～９０％、より好ましくは４０％～８０％であり得る。
ポリアミノ酸ブロックにおける疎水性基含有アミノ酸残基数は、例えば０～１０００、１～１００又は２～５０であり得る。また、ポリアミノ酸ブロックを構成する全アミノ酸残基数に対する疎水性基含有アミノ酸残基数の割合は、例えば０％以上、３％以上、４％以上、５％以上、２０％以上又は２５％以上であり得、また、９０％未満、７５％以下又は５０％以下であり得る。
ポリアミノ酸ブロックにおけるヒドラジド基以外の官能基含有アミノ酸残基数は、例えば０～１０００、好ましくは１～１００、より好ましくは２～５０であり得る。ポリアミノ酸ブロックを構成する全アミノ酸残基数に対するヒドラジド基以外の官能基含有アミノ酸残基数の割合は、例えば０％～８０％、好ましくは５％～７０％、より好ましくは１０％～６０％であり得る。
１つの実施形態において、上記ブロックコポリマーは、下記式（ｉ）によって表されるアミノ酸残基を含み、必要に応じて、下記式（ｉｉ）によって表されるアミノ酸残基及び／又は（ｉｉｉ）によって表されるアミノ酸残基をさらに含む。式（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で表されるアミノ酸残基はそれぞれ、上記ヒドラジド基含有アミノ酸残基、疎水性基含有アミノ酸残基及びヒドラジド基以外の官能基含有アミノ酸残基に対応し得る。
（式（ｉ）～（ｉｉｉ）中、ｘは、１又は２を表し、Ｒａは、－Ｏ－又はＮＨ－を表し、Ｒｂは、疎水性基を表す。）
１つの実施形態において、上記ブロックコポリマーのポリアミノ酸ブロックを構成する全アミノ酸残基に対して、上記式（ｉ）～（ｉｉｉ）で表されるアミノ酸残基の合計が占める割合は、代表的には８０％～１００％、好ましくは９０％～１００％、より好ましくは９５％～１００％であり、例えば、１００％であってもよい。なお、ブロックコポリマーは、式（ｉｉ）で表されるアミノ酸残基として、Ｒａ及び／又はＲｂが異なる２種以上のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
上記ブロックコポリマーは、任意の適切な合成方法を用いて合成され得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブロックと側鎖にヒドラジド基が導入されたポリアミノ酸ブロックとを有するブロックコポリマーは、末端が保護されていてもよいＰＥＧ－ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート）又はＰＥＧ－ポリ（γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート）にヒドラジンあるいはヒドラジン水和物を反応させて、そのべンジルエステル部分をヒドラジド基に変換することで合成することができる。
上記反応は、通常、脱水溶媒中で行われる。溶媒としては、脂肪族又は芳香族の有機溶媒が用いられ、その具体例としては、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム又はそれらの混合溶媒が挙げられる。また、使用する溶媒は極力水を含まないことが好ましい。
上記反応におけるヒドラジンの添加量は、反応がほぼ定量的に進行することから、通常、ブロックコポリマーのべンジルエステル部分に対して導入予定の量を添加すればよい。例えば、ヒドラジド基をベンジルエステル部分に対して５０％導入する場合、０．５倍当量のヒドラジンを添加し、７５％導入する場合は、０．７５当量のヒドラジンを添加することができる。
上記反応における反応温度は、例えば０℃～１００℃、好ましくは２０℃～８０℃、より好ましくは２５℃～５０℃であり得る。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、反応が十分に進行する時間であればとくに制限はされないが、通常は、１時間～２日間である。
上記合成方法の詳細は、例えば、ＷＯ２００８／０４７９４８に記載されており、その全体が本明細書中で参考として援用される。
Ａ－１－３．薬物－ポリマー複合体
薬物－ポリマー複合体は、上記親水性ブロックと疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーと上記アントラサイクリン系化合物とを結合させることによって得られる。１分子のブロックコポリマーに結合するアントラサイクリン系化合物の分子数は、実用的な血中滞留性を有するミセル剤を形成可能である限りにおいて制限されない。ブロックコポリマー１分子に対する上記化合物の結合数は、疎水性ブロックの繰り返し単位数（重合度）に対して、例えば５％～６５％、好ましくは１０％～５０％、１０％～４０％又は１５％～３５％の数であり得る。
上記薬物－ポリマー複合体において、アントラサイクリン系化合物は、代表的には、前記ポリアミノ酸ブロックに導入されたヒドラジド基を介してブロックコポリマーと結合しており、好ましくはポリアミノ酸ブロックの側鎖に導入されたヒドラジド基を介してブロックコポリマーと結合している。よって、薬物－ポリマー複合体は、好ましくは下記式（ｉｖ）で表される薬物含有アミノ酸残基を含み得る。
（式中、ｘは、１又は２を表し、Ａｎは、カルボニル基を有するアントラサイクリン系化合物からカルボニル酸素を除いた残基を表す。）
上記薬物－ポリマー複合体は、上記式（ｉｖ）で表される薬物含有アミノ酸残基に加えて、上記式（ｉ）～（ｉｉｉ）で表されるアミノ酸残基の少なくとも１種をさらに含み得る。
上記薬物－ポリマー複合体のポリアミノ酸ブロックにおける式（ｉｖ）で表される薬物含有アミノ酸残基数は、例えば１～５０、好ましくは２～４０、より好ましくは３～３０、さらに好ましくは４～２０の整数であり得る。
上記薬物－ポリマー複合体のポリアミノ酸ブロックにおける式（ｉ）で表されるヒドラジド基含有アミノ酸残基数は、例えば０～３０、好ましくは１～２５、より好ましくは２～２０の整数であり得る。
上記薬物－ポリマー複合体のポリアミノ酸ブロックにおける式（ｉｉ）で表される疎水性基含有アミノ酸残基数は、例えば０～１００、好ましくは１～８０の整数又は２～５０の整数であり得る。
上記薬物－ポリマー複合体のポリアミノ酸ブロックにおける式（ｉｉｉ）で表されるカルボキシル基含有アミノ酸残基数は、例えば０～１００、好ましくは１～８０、より好ましくは２～５０の整数であり得る。
１つの実施形態において、薬物－ポリマー複合体は、下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で表され得る。
（式中、
Ｒ１は、同一または異なって、水素原子、メトキシ基、メチル基、置換された直鎖若しくは分枝又は環状の炭素数１～１２のアルキル基であり、その置換基が、保護されていてもよいマレイミド基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基及び活性エステル基からなる群より選択される官能基、を表し、
Ｒ２は、水素原子、飽和もしくは不飽和の炭素数１～３０の脂肪族カルボニル基またはアリールカルボニル基を表し、
Ｒ３は、－Ｏ－又は－ＮＨ－を表し、
Ｒ４は、疎水性基を表し、
Ｒ５は、水酸基、飽和もしくは不飽和の炭素数１～３０の脂肪族オキシ基またはアリール－低級アルキルオキシ基を表し、
Ｌ１及びＬ２は、各々独立してリンカーを表し、
ａは、５～１０００の整数を表し、
ｂは、１～１０００の整数を表し、
ｃは、０～１０００の整数を表し、
ｄは、０～１０００の整数を表し、
ｅは、０～１０００の整数を表し、
ｙは、１又は２を表し、
Ａｎは、カルボニル基を有するアントラサイクリン系化合物からカルボニル酸素を除いた残基を表し、
ただし、ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは１０～１０００の整数である。）
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ１の基で定義する炭素数１～１２のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等を挙げることができる。
Ｒ２の基で定義する炭素数１～３０の脂肪族カルボニル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、トリメチルアセチル基、ヘキサノイル基、ｔ－ブチルアセチル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基、２－エチルヘキサノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、ウンデカノイル基、ラウロイル基等を挙げることができる。また、アリールカルボニル基としては、例えば、ベンゾイル基、メチルベンゾイル基、エチルベンゾイル基、ジメチルベンゾイル基、トリメチルベンゾイル基、イソプロピルベンゾイル基、ｎ－ブチルベンゾイル基、ｎ－ペンチルベンゾイル基、イソペンチルベンゾイル基、ネオペンチルベンゾイル基、イソヘキシルベンゾイル基等を挙げることができる。
Ｒ４の基で定義する疎水性基としては、上記疎水性基含有アミノ酸残基に関して例示した疎水性基が挙げられる。なかでも、フェニル基及びベンジル基が好ましい。
Ｒ５の基で定義する炭素数１～３０の脂肪族オキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｎ－ブチルオキシ基、ｔ－ブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基、ヘキシルオキシ基等を挙げることができる。また、アリール－低級アルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、（メチルフェニル）メトキシ基、（ジメチルフェニル）メトキシ基、（トリメチルフェニル）メトキシ基、（テトラメチルフェニル）メトキシ基、（ペンタメチルフェニル）メトキシ基、（エチルフェニル）メトキシ基、（ｎ－プロピルフェニル）メトキシ基、（イソプロピルフェニル）メトキシ基、ナフチルメトキシ基等を挙げることができる。
Ｌ１及びＬ２が表すリンカーとしては、ブロックコポリマーの製造方法、原料等により変化し得ることから、特に限定されるものではない。Ｌ１としては、例えば、－Ｚ－ＮＨ－、－ＣＯ－Ｚ－ＮＨ－および－ＣＯ－ＮＨ－Ｚ－ＮＨ－（ここで、Ｚは独立して炭素数１～８のアルキル基である）等の２価のリンカーを挙げることができる。また、Ｌ２としては、－Ｚ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｚ－、－ＣＯ－Ｚ－ＣＯ－、－Ｚ－ＣＯ－Ｚ－および－Ｚ－ＣＯ－Ｏ－Ｚ－（ここで、Ｚは独立して炭素数１～８のアルキル基である）を挙げることができる。１つの実施形態において、Ｌ１は、－Ｚ１－ＮＨ－（ここで、Ｚ１は、炭素数１～５のアルキレン基、例えば、－ＣＨ２ＣＨ２－または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である）であり得る。
ａは、ポリエチレングリコールの繰り返し数を表す。ａは、例えば５～２０００、５～１０００、４０～６００、１００～４００又は２００～４００の整数であり得る。
ｂは、側鎖にアントラサイクリン系化合物が結合したアミノ酸残基数を表す。ｂは、例えば１～５０、好ましくは２～４０、より好ましくは３～３０、さらに好ましくは４～２０の整数であり得る。
ｃは、ヒドラジド基を有するブロックコポリマーにおいて、アントラサイクリン系化合物と反応しなかったヒドラジド基含有アミノ酸残基数を表す。ｃは、例えば０～３０、好ましくは１～２５、より好ましくは２～２０の整数であり得る。
ｄは、疎水性基含有アミノ酸残基数を表す。ｄは、例えば０～１００、好ましくは０～８０、より好ましくは０～５０の整数であり得る。１つの実施形態において、ｄは、（ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）×０．２≦ｄ＜（ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）×０．９の関係を満たし、好ましくは（ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）×０．２５≦ｄ＜（ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）×０．５の関係を満たす。
ｅは、アスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基数を表す。ｅは、例えば０～１００、好ましくは１～１００、より好ましくは２～５０の整数であり得る。
ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは、ポリアミノ酸ブロックの重合度を表す。ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは、好ましくは１５～２００、より好ましくは２０～１５０、さらに好ましくは２５～１００の整数であり得る。
１つの実施形態において、ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅが３０～５０の整数であり得、ｂが１～２０の整数であり得、ｃが０～２０の整数であり得、ｄが０～３０の整数であり得、ｅが０～３０の整数であり得る。
別の実施形態において、ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅが３０～５０の整数であり得、ｂが４～１４の整数であり得、ｃが１～４の整数であり得、ｄが６～４０、１０～３５又は１２～３０の整数であり得、ｅが５～１５の整数であり得る。
上記薬物－ポリマー複合体は、任意の適切な合成方法を用いて合成され得る。例えば、上記薬物－ポリマー複合体は、アントラサイクリン系化合物のケトン基とブロックコポリマーのヒドラジド基と反応させることによって得られ得る。当該反応は、好ましくは極力無水な条件下で行われる。具体的には、上記ブロックコポリマーを脱水した溶媒、例えばＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセ卜アミド、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム又はそれらの混合溶媒に溶解し、所望量の薬物（例えばヒドラジド基に対して０．１当量～１０当量、好ましくは０．１～３当量）を添加して、反応させる。反応は、例えば０℃～５０℃、好ましくは２０℃～４０℃、より好ましくは２５℃～３７℃の範囲で行われる。圧力は、常圧であることが好ましい。反応時間は、通常、２時間～５日間とすることができる。上記合成方法の詳細は、例えば、ＷＯ２００８／０４７９４８に記載されている。
Ａ－２．ミセル剤の作製
上記薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤（ポリマーミセル）は、任意の適切な方法によって形成され得る。例えば、薬物－ポリマー複合体を水性媒体中に溶解又は分散後、撹拌することによってミセル剤を調製することができる。その際、超音波、圧力、剪断力又はそれらを組合せた物理的エネルギーを与えてもよい。あるいは、薬物－ポリマー複合体を揮発性の有機溶媒に溶解後、有機溶媒を揮発させて乾固し、そこに水性媒体を加えて撹拌後、上記物理的エネルギーを与えることによって調製することができる。
上記水性媒体としては、水、生理食塩水、緩衝液等を挙げることができ、ミセル剤の形成に影響を及ぼさない限りにおいて、少量の有機溶媒を含有してもよい。緩衝液のｐＨは、例えば６～８であり得る。また、揮発性の有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、テ卜ラヒドロフラン、ジクロロメタン等を挙げることができる。
上述のとおり、上記ミセル剤は、必要に応じて、薬物－ポリマー複合体に加えて、親水性ブロックと該親水性ブロックの一方の端部に連結された疎水性ブロックとを有する一方で、薬物を有さないブロックコポリマーをさらに含んでいてもよい。
Ｂ．免疫賦活剤
免疫賦活剤としては、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤が用いられる。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに結合することによって免疫抑制シグナルの伝達を阻害し得る任意の抗体又は化合物であり得る。免疫チェックポイント阻害剤が、免疫抑制シグナルの伝達を阻害する結果、がん細胞に対する免疫応答が活性化される。
免疫チェックポイント分子としては、Ｔ細胞を介した免疫反応を負に制御するＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４が好ましく例示できる。また、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－１のリガンドの１つ）とが結合することにより、シグナル伝達経路を介してＴ細胞の免疫活性が強く抑制される。よって、免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくは抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗Ｔｉｍ－３抗体から選択される１種以上の抗体であり得る。
抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＴＬＡ４抗体としては、公知の抗体を用いてもよい。例えば、抗ＰＤ－１抗体として、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、スパルタリズマブ、セミプリマブ等を用いることができ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体として、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ等を用いることができ、抗ＣＴＬＡ－４抗体として、イピリムマブ、トレメリムマブ等を用いることができる。
Ｃ．組み合わせ形態
上記ミセル剤を含む医薬組成物（以下、ミセル製剤とも称する）は、免疫賦活剤と組み合わせて用いられる。具体的には、ミセル製剤と免疫賦活剤とは、処置対象の個体に併用投与される。
１つの実施形態において、ミセル製剤は、免疫賦活剤と同時に処置対象の個体に投与される。本実施形態においては、ミセル製剤と免疫賦活剤を含む製剤（以下、免疫賦活製剤とも称する）とを同時に投与してもよく、ミセル剤と免疫賦活剤とを含む配合剤である医薬組成物を投与してもよい。
別の実施形態において、ミセル製剤は、免疫賦活剤と異時に処置対象の個体に投与される。本実施形態においては、ミセル製剤が、免疫賦活製剤の投与前又は投与後に、処置対象の個体に投与される。
上記ミセル製剤及び免疫賦活製剤（又は配合剤）の投与量及び投与スケジュールは、がんの種類や病期、処置対象の個体の状態等に応じて適宜選択され得る。例えば、ミセル製剤と免疫賦活製剤とを異時に投与する場合、ミセル製剤の投与回数と免疫賦活製剤の投与回数とは、同じであってもよく、異なっていてもよい。また、ミセル製剤と免疫賦活製剤とを異時に投与する場合、ミセル製剤の投与と免疫賦活製剤の投与との間隔は、本発明の効果を奏する範囲において特に制限されない。
上記ミセル製剤及び免疫賦活製剤（又は配合剤）の投与形態はそれぞれ、特に制限されず、治療目的等に応じて適宜選択され得る。これらの製剤は、代表的には注射剤であり、静脈内、筋肉内、髄腔内、皮下組織内等に投与される。なかでも、静脈内投与用注射剤が好ましく例示される。
上記ミセル製剤及び免疫賦活製剤（又は配合剤）はそれぞれ、投与形態等に応じて、任意の適切な担体を用いて当該技術分野において公知の方法により調製することができる。担体は、薬学的に許容され得るものであればよく、例えば賦形剤、結合剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を例示できる。
上記ミセル製剤及び免疫賦活製剤は、各有効成分（アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤）が有効投与量投与される限りにおいて、併用投与に適した１つのパッケージにまとめて製造販売されてもよく、また別個のパッケージで製造販売されてもよい。１つの実施形態において、ミセル製剤は、容器に充填され、がんを治療又は予防するために免疫賦活剤と組み合わせて個体に投与することを示す指示書又はラベルを含む製品として製造販売され得る。
Ｄ．用途
上記ミセル剤を含む医薬組成物は、代表的には、がんを治療又は予防するために用いられる。治療又は予防の対象となるがんとしては、アントラサイクリン系化合物に対する難治性がんが好ましく挙げられ、その具体例としては、脳腫瘍（膠芽腫等の神経膠腫）、すい臓がん、悪性中皮腫、線維肉腫、卵巣がん、乳がん、Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、軟部肉腫、膀胱がん、甲状腺がん、胃がん、子宮体がん、骨肉腫、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、神経芽細胞腫、急性リンパ腫等が挙げられる。なかでも、上記医薬組成物は、脳腫瘍（膠芽腫等の神経膠腫）、すい臓がん、悪性中皮腫、線維肉腫、乳がん、軟部肉腫、卵巣がんに対して優れた抗腫瘍効果を発揮し得る。なお、上記治療又は予防の対象となるがんには、原発巣のみならず、他の臓器に転移したがんも含まれる。
Ｅ．がんを治療又は予防する方法
上記ミセル剤を含む医薬組成物（実質的には、有効成分としてのミセル剤）は、がんの治療又は予防のために、免疫賦活剤と組み合わせて使用される。よって、本発明の別の局面によれば、上記ミセル剤を含む医薬組成物（実質的には、有効成分としてのミセル剤）を、処置対象の個体に免疫賦活剤と併用投与することを含む、がんを治療又は予防する方法が提供される。治療又は予防の対象となるがんについては、Ｄ項に記載したとおりである。
上記処置が必要な個体は、代表的には、ヒト又は非ヒト哺乳類である。
１つの実施形態において、上記処置が必要な個体は、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ Ｔｅｎｓｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｄｅｌｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １０）の発現に異常（例えば、欠失、置換、挿入等のＰＴＥＮ遺伝子の塩基配列の変異又はＰＴＥＮ遺伝子のヘテロ欠損等のＰＴＥＮ遺伝子の異常）を有する。ＰＴＥＮは、ホスファチジルイノシトール３，４，５－三リン酸の脱リン酸化反応を触媒する酵素であり、ＰＩ３キナーゼ－Ａｋｔ経路を抑制することで細胞の増殖や生存を抑制する。ＰＴＥＮは、多くのヒト悪性腫瘍において高頻度に変異が見られ、また、ＰＴＥＮヘテロ欠損マウスはがんを発症する確率が高いこと等から、がん抑制遺伝子として知られている。上記医薬組成物は、ＰＴＥＮの発現に異常を有する個体に対して、優れた抗腫瘍効果を発揮することができることを一つの特徴とする。ＰＴＥＮの発現に異常のあるがん患者は、ＰＤ－Ｌ１の発現が高くなり、免疫チェックポイント阻害剤に対する抵抗性を示す傾向にあるが、アントラサイクリン系化合物は、そのＰＤ－Ｌ１の発現を抑制し得る。
１つの実施形態において、上記医薬組成物は、免疫賦活剤を含まないミセル製剤であり、免疫賦活製剤と同時あるいは免疫賦活製剤の投与前又は投与後に投与される。例えば、別途に調製されたミセル製剤と免疫賦活製剤とを混合して投与することによって、２つの製剤を容易に同時投与することができる。また、ミセル製剤と免疫賦活製剤とを時間を空けて投与する場合、投与間隔は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に制限されない。ミセル製剤及び免疫賦活製剤の投与回数もまた、本発明の効果が得られる限りにおいて制限されず、これらの回数は互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。
別の実施形態において、上記医薬組成物は、アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤とを含む配合剤である。
上記いずれの実施形態においても、ミセル剤の用量及び投与間隔並びに免疫賦活剤の用量及び投与間隔は、がんの種類や病期、処置対象の個体の状態等に応じて適切に設定され得る。また、ミセル製剤（配合剤）および免疫賦活製剤はそれぞれ、代表的には注射剤として調製され、静脈内、筋肉内、髄腔内、皮下組織内等に投与される。なかでも、静脈内投与用注射剤が好ましく例示される。
上記ミセル剤と免疫賦活剤とを併用投与する実施形態によれば、各々を単独で投与する実施形態に比べて顕著に優れた抗腫瘍効果が得られ得る。
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。また、実施例において、統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行い、全てのデータは平均＋標準偏差（ＳＤ）として示し、０．０５未満のＰ値は、統計的に有意な差であるとみなした。２群間の差はスチューデントのｔ検定又はマン・ホイットニーのＵ検定を用いて評価し、カプランマイヤー生存曲線における有意差は、ログランク検定によって確認した。
［実験例１ エピルビシン－ポリマー複合体を含むミセルの調製１］
＜ヒドラジド基含有ブロックコポリマーの調製＞
常法にしたがって、ＰＥＧ末端にメトキシ基が導入され、ポリアミノ酸末端にアセチル基が導入されたポリエチレングリコール－ポリ（β－ベンジル－Ｌ－アスパルテート）ブロックコポリマー（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＢＬＡ－Ａｃ）を得た。得られたブロックコポリマーのＰＥＧブロックの分子量は１２ｋＤａであり、1Ｈ－ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＡブロックの重合度は４０であった。
穏やかに加熱しながら、上記ブロックコポリマーを無水ＤＭＳＯ（ポリマー５０ｍｇ毎に１ｍＬ）に溶解した。室温まで冷却後、無水ヒドラジン（ポリマーに対して２０モル当量）を添加して反応混合物を得た。該反応混合物を室温で３時間撹拌した。ジエチルエーテルを用いた沈殿及び真空乾燥を経て、反応混合物からヒドラジド基含有ブロックコポリマーを回収した。各ポリマーに導入されたヒドラジド基の数を、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１７ Ｊｕｌ ２８；２５８：５６－６６．に記載されるアセチル化によって定量したところ、１５であった。
＜エピルビシン－ポリマー複合体の調製＞
上記ヒドラジド基含有ブロックコポリマーとエピルビシン（ポリマーに対して１０モル当量）とをＤＭＳＯ（ポリマーとエピルビシン混合物１５ｍｇ毎に１ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を４０℃で７２時間撹拌して両者を反応させ、これにより、以下に示す構造を有するエピルビシン－ポリマー複合体を得た。以下に示す構造を有するエピルビシン－ポリマー複合体を得た。なお、式中の「Ｅｐｉ」は、エピルビシンの１３位のケトンがヒドラジド基とヒドラゾン結合を形成した際のエピルビシン残基を表し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝４０であり、ｐは０～３の範囲内の整数であり、ｑは３～５の範囲内の整数であり、ｒは１０～１５の範囲内の整数であり、ｓは１７～２２の範囲内の整数であった。また、ポリアミノ酸ブロックにおいて、各アミノ酸残基は、ランダムに存在している。なお、各ポリマーに導入されたエピルビシンの導入数は、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１７ Ｊｕｌ ２８；２５８：５６－６６．に記載の方法に従って定量した。
＜ミセルの調製＞
上記ＤＭＳＯ中のエピルビシン－ポリマー複合体をメタノールに対して２４時間透析した。この間、透析液を４回交換し、透析処理の終了時において、透析液は無色であった。透析バッグ内のエピルビシン－ポリマー複合体のメタノール溶液を回収し、５００ｍＬ容丸底フラスコ内で蒸発させることにより、薄いフィルムを得た。次いで、ＰＢＳ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、混合液を１０分間超音波処理に供し、これにより、エピルビシン－ポリマー複合体を含むミセル溶液を調製した。溶液中に残存する遊離の薬物及びポリマーは、遠心限外ろ過（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ）で除いた。
入射ビームとしてグリーンレーザー（５３２ｎｍ）を用い、１７３°の検出角度で、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて行った動的光散乱法（ＤＬＳ）によって、上記エピルビシン－ポリマー複合体を含むミセル（以下、エピビルシンミセル又はＥｐｉ／ｍと称する場合がある）の粒子径及び多分散指数を測定した。結果を図２に示す。
図２に示されるとおり、得られたエピルビシンミセルは単分散性が高く、その平均粒子径は３１ｎｍであり、多分散性指数は０．０７であった。
［実験例２ エピルビシン－ポリマー複合体を含むミセルの調製２］
無水ヒドラジンとの反応時間を１時間３０分にしたこと以外は実験例１と同様にして、以下に示す構造を有するエピルビシン－ポリマー複合体を得た。なお、式中の「Ｅｐｉ」は、エピルビシンの１３位のケトンがヒドラジド基とヒドラゾン結合を形成した際のエピルビシン残基を表し、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝４０であり、ｐは１２～３０の範囲内の整数であり、ｑは４～１４の範囲内の整数であり、ｒは１～４の範囲内の整数であり、ｓは５～１５の範囲内の整数であった。また、ポリアミノ酸ブロックにおいて、各アミノ酸残基は、ランダムに存在している。
上記で得られたエピルビシン－ポリマー複合体を用いたこと以外は実験例１と同様にしてエピルビシンミセルを得た。得られたエピルビシンミセル（Ｅｐｉ／ｍ）の粒子径及び多分散指数を、実験例１と同様にして測定したところ、粒子径は５４ｎｍ、多分散指数は０．１００であった。
［実験例３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ］
２０００ｃｅｌｌｓ／μＬ又は３０００ｃｅｌｌｓ／μＬの濃度でマウス膠芽腫（ＧＢＭ）細胞「ＧＬ２６１」（ＤＳＭＺ社）を含む培養液を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり５０μＬずつ添加し、２４時間インキュベートした。次いで、１つの被験薬について、薬物濃度が４ｎ倍ずつ異なる１０種類の試料（ｎ＝０～９の整数）を準備し、該試料を１ウェルあたり５０μＬ添加して３時間インキュベートした（コントロールは、薬物濃度：０μｇ／ｍＬ）。次いで、各ウェルに関して、新鮮な培養液で細胞を洗浄し、新鮮な培養液１００μＬを添加して４８時間インキュベートした。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ）を各ウェルに１０μＬずつ添加し、１時間インキュベートした。次いで、マイクロプレートリーダーを用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定して、各被験薬の各薬物濃度における細胞生存率を測定した。上記細胞生存率の測定を３回繰り返し、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてＩＣ５０を算出した。結果を図３に示す。
なお、上記アッセイに用いた被験薬は以下のとおりである。
Ｋ２５２ａ－Ｈ：製品名「Ｋ－２５２ａ」（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋ２５２ａ－Ｈ／ｍ：Ｋ２５２ａ－Ｈを用いて、実験例１と同様にして調製したＫ２５２ａ－Ｈ－ポリマー複合体を含むミセル
ＪＱ－１－Ｈ：製品名「（＋）－ＪＱ－１」（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＪＱ－１－Ｈ／ｍ：ＪＱ－１－Ｈを用いて、実験例１と同様にして調製したＪＱ－１－Ｈ－ポリマー複合体を含むミセル
ＶＢＬ－Ｈ：製品名「ビンブラスチン」（ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＶＢＬ－Ｈ／ｍ：ＶＢＬ－Ｈを用いて、実験例１と同様にして調製したＶＢＬ－Ｈ－ポリマー複合体を含むミセル
Ｅｐｉ：製品名「エピルビシン塩酸塩」（ナノキャリア社）
Ｅｐｉ／ｍ：実験例１と同様にして調製したエピルビシンミセル
ＣＤＤＰ：製品名「シスプラチン」（ナカライ社）
ＣＤＤＰ／ｍ：Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２００１ Ｊｕｌ；１８（７）：１０３５－４１．に記載の方法と同様にして調製したシスプラチン内包ミセル
図３に示されるとおり、エピルビシン単体及びエピルビシンミセルは、マウスＧＢＭ細胞「ＧＬ２６１」に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで高い細胞傷害性を示した。
［実験例４ 脳同所移植によるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果アッセイ］
＜発光細胞株の準備＞
マウスＧＢＭ細胞「ＧＬ２６１」（ＤＳＭＺ社）を、Ｃｉｇｎａｌ ｌｅｎｔｉ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ （ｌｕｃ）（Ｑｉａｇｅｎ ｃｏｒｐ．）で形質転換し、限外希釈クローニングでＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現細胞「ＧＬ２６１－ｌｕｃ」を樹立した。
＜脳同所移植＞
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現細胞「ＧＬ２６１－ｌｕｃ」を、ＰＢＳで洗浄後、３７℃°、０．２５％トリプシン及び０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ １０ｍｌで５分間おくことによって培養容器から剥がし、１０％ＦＢＳ入り培養液によって懸濁した。該懸濁液を１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳ液で希釈し、頭蓋内注射するまで氷上で保存した。
マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、５～６週令）をイソフルランによって麻酔した。剃毛後、皮膚をヨウ素液消毒し、正中線と両耳ラインの前方の右側を小さく切開（２－３ｍｍ）した。頭蓋骨にツイストドリルで直径１ミリメートルの穴を開け、上記細胞懸濁液２μＬ（細胞数：２×１０５）を５分かけてゆっくり脳内に注入した。
下記の群分け及び投与スケジュールで各被験薬を投与し、経時的に腫瘍由来の発光強度を測定した。発光強度は、腹腔内にルシフェリンを注入してから１２分後に、ＩＶＩＳ ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。なお、発光強度と腫瘍体積との間には高い相関関係があることから、発光強度（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ）に基づいて腫瘍体積を定量評価することができる。結果を図４に示す。また、各群のマウスの生存曲線を図５に示す。なお、経過日数に関して、腫瘍体積（又は腫瘍由来の発光強度）については、被験薬の初回投与日をＤａｙ０としてカウントし、それ以外（生存日数、投与スケジュール等）については、がん細胞を移植した日をＤａｙ０としてカウントした（特段の記載がない限り、他の抗腫瘍効果アッセイについても同様である）。
＜群分け＞
＜投与スケジュール＞
Ｄａｙ０：ＧＬ２６１－ｌｕｃを脳に移植する。
Ｄａｙ６：被験薬を尾静脈投与する（１ｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
Ｄａｙ１０：被験薬を尾静脈投与する（２ｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
Ｄａｙ１４：被験薬を尾静脈投与する（３ｒｄ（ｌａｓｔ） ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）。
図４に示されるとおり、Ｅｐｉ投与群２及び抗ＰＤ－１抗体のみを投与した群５、６では、抗腫瘍効果が確認されなかった。ＤＯＸＩＬ投与群４ではＤａｙ１０において発光強度が低下する（腫瘍体積が減少する）傾向がみられたものの、Ｄａｙ１０において２匹のマウスが死亡したため、それ以降の発光強度の測定は行わなかった。一方、Ｅｐｉ／ｍ投与群３及びＥｐｉ／ｍと抗ＰＤ－１抗体との併用投与群７の両方において、抗腫瘍効果が確認されたが、群３では、腫瘍の再増殖が見られた。これに対し、群７では、全てのマウスにおいて腫瘍の再増殖は見られなかった。
また、図５に示されるとおり、ＰＢＳ投与群１、Ｅｐｉ投与群２及び抗ＰＤ－１抗体（１ｍｇ／ｋｇ）投与群５では、Ｄａｙ３０～Ｄａｙ４０の間に全てのマウスが死亡した。これに対し、抗ＰＤ－１抗体（５ｍｇ／ｋｇ）投与群６、ＤＯＸＩＬ投与群４、Ｅｐｉ／ｍ投与群３及びＥｐｉ／ｍと抗ＰＤ－１抗体との併用投与群７においてはそれぞれ、Ｄａｙ９０において、４０％、６２．５％、７５％及び１００％の生存率が確認された。さらに、併用投与群７においては、８匹全てのマウスが７カ月（Ｄａｙ２１０）を超えて生存した。このとき、図６に示す脳のＭＲＩ画像からわかるとおり、全てのマウスに関して、Ｄａｙ４８からＤａｙ２１０にかけて、腫瘍の再増殖は生じなかった。
上記試験期間中の副作用に関して、ＤＯＸＩＬ投与群４とＥｐｉ／ｍ投与群３との比較を図７に示す。
図７に示されるとおり、ＤＯＸＩＬ投与群４では、Ｄａｙ３０までに２匹のマウスが死亡したことに加えて、Ｄａｙ４２において、１匹のマウスが皮膚障害を呈していた。また、１匹のマウスにおいて、腫瘍内脳出血が確認された。これに対し、Ｅｐｉ／ｍ投与群３は、Ｄａｙ４０を超えても１００％の生存率を維持するとともに、皮膚障害及び腫瘍内脳出血のいずれも確認されなかった。以上より、エピルビシンミセルは、ＤＯＸＩＬよりも抗腫瘍効果が高く、また、副作用が少ないことがわかる。
［実験例５ 脳同所移植によるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果アッセイ２］
以下の実験条件を用いたこと以外は実験例４と同様にして、がん細胞を脳同所移植したマウスに対する抗腫瘍効果を調べた。
＜実験条件＞
マウス：Ｃ５７／ＢＬ６（６週令、雌）
腫瘍株：ＣＴ２Ａ－Ｌｕｃ Ｍｏｕｓｅ Ｇｌｉｏｍａ細胞株（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＳＣＣ１９５）
移植：ＣＴ２Ａ－Ｌｕｃを５×１０７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で２μＬ（最終：１×１０５ｃｅｌｌｓ／匹）同所に移植した。
群分け：がん細胞を移植した日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ６にＩＶＩＳで測定した発光強度に基づいて、実験例１のＥｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与群１（Ｎ＝５）、実験例２のＥｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与群２（Ｎ＝８）及びコントロール群３（Ｎ＝６）にマウスを群分けした。
投与：それぞれの群に対し、Ｄａｙ６、１０、１４、１８に尾静脈内投与した。
投与量：ａＰＤ－１（Ｃｌｏｎｅ ２９Ｆ．１Ａ１２， Ｂｉｏ ｃｅｌｌ社）の投与量は、５ｍｇ／ｋｇとし、Ｅｐｉ／ｍの投与量は、Ｅｐｉ換算で、初回１５ｍｇ／ｋｇ、２回目以降は１０ｍｇ／ｋｇとした。
その結果、群１は試験期間の全体に渡って腫瘍増殖をほぼ抑制した。一方、群２は、被験薬の投与日をＤａｙ０として、Ｄａｙ１０までは群１よりも腫瘍サイズが大きかったが、Ｄａｙ１０以降は群１とほぼ相違ないレベルにまで縮小しており、実験全体を通しての効果に差は無かった。また、がん細胞を移植した日をＤａｙ０として、群３（ＰＢＳ投与）はＤａｙ２８で全数が死亡したのに対し、群１及び群２ではいずれも、Ｄａｙ４０を経過時点で８匹中７匹が生存し、有意に長期延命効果を示した（群１：Ｐ＝０．０００４、群２：Ｐ＝０．０００５）。
以上より、実験例１のＥｐｉ／ｍと実験例２のＥｐｉ／ｍは、エピルビシンのＤＤＳとして同等の構造を有し、かつ、免疫チェックポイント阻害剤と併用投与した場合の相乗的な抗腫瘍効果に関して、ほぼ同程度の優れた効果を示すことがわかった。なお、後述の実験例では、Ｅｐｉ／ｍとして、実験例１のＥｐｉ／ｍを用いた。
［実験例６ エピルビシンミセルによるＰＴＥＮ陽性及び陰性ＧＢＭ細胞における免疫原性細胞死の誘導］
文献（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃ．７（２０１７）８１８）に記載されるデータベースから臨床腫瘍におけるＰＴＥＮ異常の割合（％）を調べた。図８Ａに示す調査結果から、ＰＴＥＮの異常は、臨床ＧＢＭの指標であることがわかる。
次いで、今回の実験例で使用するＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞におけるＰＴＥＮの発現レベルをウエスタンブロッティング解析によって評価した。具体的には、一晩培養した細胞（５×１０６個）からタンパク質を抽出及び精製し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、フッ化ポリビニリデンメンブレンに転写した。当該メンブレンを一次抗体との反応に供し、次いで、ＨＲＰ－コンジュゲート二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と反応させ、ＥＬＣ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて発色させて、６００ＵＶ Ａｍｅｒｓｈａｍ ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ）を用いてバンドを検出した。結果を図８Ｂに示す。
図８Ｂに示されるとおり、一般的に用いられるＧＬ２６１細胞は、アストロサイトに匹敵する高いＰＴＥＮレベルを示した。一方、Ｃ５７／ＢＬ６バックグラウンドにおける２０－メチルコラントレンを用いた薬剤誘発性の腫瘍に由来するＣＴ２Ａ細胞は、ＧＬ２６１細胞よりもＰＴＥＮの発現が顕著に低かった。よって、ＧＬ２６１細胞は、ＰＴＥＮ－陽性ＧＢＭ細胞であり、ＣＴ２Ａ細胞は、ＰＴＥＮ－陰性ＧＢＭ細胞とみなすことができる。
ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞に加えて、他のマウスがん細胞及びＰＴＥＮをノックアウトしたＧＬ２６１細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルについても、上記と同様にウエスタンブロッティング解析によって評価した。なお、ＰＴＥＮのノックアウトは、ＰＴＥＮ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９ ＫＯ ｐｌａｓｍｉｄ及びＰＴＥＮ ＨＤＲ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて行った。結果を図８Ｃ及び図８Ｄに示す。
図８Ｃに示されるとおり、ＧＬ２６１細胞は、マウスルイス肺がん細胞ＬＬ２及びマウス乳がん細胞４Ｔ１細胞の２倍を超えるＰＤ－Ｌ１の発現を示した。また、図８Ｄに示されるとおり、ＣＴ２Ａ細胞におけるＰＤ－Ｌ１レベルはより高く、ＬＬ２細胞及び４Ｔ１細胞の約５倍、ＧＬ２６１細胞の２倍超のＰＤ－Ｌ１を発現していた。さらに、ＧＬ２６１細胞においてＰＤ－Ｌ１をノックアウトすることによって、ＰＴＥＮレベルが低下することから、ＰＤ－Ｌ１の発現が、ＰＴＥＮ発現と負の相関があることもわかる。
次に、Ｅｐｉ／ｍを含む種々の薬物に関して、ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞に対するＩＣ５０を測定することにより、細胞傷害活性を評価した。具体的には、３０００又は５０００個の細胞を、１００μＬの培地と共に９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２４時間後に被験薬（Ｅｐｉ、Ｅｐｉ／ｍ、ＤＯＸ（ドキソルビシン塩酸塩）、ＤＯＸＩＬ、ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ／ｍ、オキサリプラチン、ＤａｃｈＰｔ／ｍ（ダハプラチンミセル））を各ウェルに添加し、４８時間インキュベートした。次いで、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（富士フィルム社）の試薬１０μＬを添加し、波長４５０ｎｍにおける吸光をプレートリーダー（製品名「インフィニットＭ１０００ ＰＲＯ」、Ｔｅｃａｎ社）を用いて測定した。Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて、得られたデータを非処置の細胞のデータに正規化し、シグモイド型用量反応曲線にフィットさせてＩＣ５０を求めた。ＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞に対する結果をそれぞれ、図８Ｅ及び図８Ｆに示す。
図８Ｅ及びＦに示されるとおり、ＰＴＥＮ－陽性であるＧＬ２６１細胞において、Ｅｐｉ／ｍ、Ｅｐｉ及びＤＯＸＩＬは、ＩＣ５０が１μｇ／ｍＬより低く、高い細胞傷害活性を示した。これらの薬物は、ＰＴＥＮ－陰性であるＣＴ２Ａ細胞に対しても、ＧＬ２６１細胞に対する活性に匹敵する高い活性を示した。このことから、ＰＴＥＮ－陽性及びＰＴＥＮ－陰性のいずれのＧＢＭ細胞に対しても高い効力を有することが示唆された。
Ｅｐｉ／ｍのＩＣ５０はまた、プラチナ剤であるシスプラチン及びオキサリプラチン、並びに、臨床評価段階にあるこれらの薬剤を搭載したポリマーミセル、すなわちシスプラチン搭載ミセル（ＣＤＤＰ／ｍ）及び（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）搭載ミセル（ＤＡＣＨｐＴ／ｍ）のＩＣ５０よりも低かった。
次に、種々の被験薬を含む培養液中で２４時間インキュベートした際の、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）のマーカーである、熱ショックプロテイン（ＨＳＰ）７０、ＨＳＰ９０及びカルレチクリンのＧＢＭ細胞表面における発現量を、蛍光抗体染色後のフローサイトメトリー解析（フローサイトメーター：ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）によって測定し、これにより、エピルビシンミセルがＩＣＤを誘導する能力を評価した。ＧＬ２６１細胞での結果を図８Ｇに、ＣＴ２Ａ細胞における結果を図８Ｈに示す。
図８Ｇに示されるとおり、ＰＴＥＮ－陽性であるＧＬ２６１細胞において、Ｅｐｉ／ｍは、ＨＳＰ９０及びカルレチクリンのレベルを、真正のＩＣＤ誘導因子であるＥｐｉに匹敵するレベルまで有意に増大させた。一方、ネガティブコントロールとして用いたシスプラチン（ＣＤＤＰ）は、マーカーを有意に増大させなかった。また、図８Ｈに示されるとおり、ＰＴＥＮ－陰性であるＣＴ２Ａ細胞において、Ｅｐｉ／ｍは、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０の発現レベルを増大させたが、増大の程度はＧＬ２６１細胞よりも小さかった。以上の結果から、Ｅｐｉ／ｍには、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍免疫効果を促進する可能性があることがわかる。
［実験例７ 膠芽腫に対する免疫チェックポイント阻害剤の効果のエピルビシンミセルによる増強］
［実験例７－１］
ルシフェラーゼを発現するＧＬ２６１細胞及びＣＴ２Ａ細胞、すなわち、ＧＬ２６１－ｌｕｃ及びＣＴ２Ａ－ｌｕｃを脳内に移植することにより、同所性のＰＴＥＮ－陽性ＧＢＭモデル及びＰＴＥＮ－陰性ＧＢＭモデルを調製して、Ｅｐｉ／ｍが免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）と相乗作用を発揮できるかを評価した。まず、Ｅｐｉ／ｍの効果に宿主免疫システムが関与しているか否かを確認するために、野生型のマウス（Ｃ５７／ＢＬ６）とヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ Ｎｕｄｅ）に移植された同所性のＧＬ２６１－ｌｕｃ腫瘍に対してＥｐｉ換算で５ｍｇ／ｋｇの用量でＥｐｉ又はＥｐｉ／ｍを投与し、その活性を評価した。
その結果、腫瘍を移植された野生型マウス及びヌードマウスのいずれにおいても、Ｅｐｉ投与によっては、腫瘍増殖率が抑制されなかった。一方、Ｅｐｉ／ｍは、野生型マウスにおいて腫瘍由来の発光シグナルを有意に抑制し、マウス生存率を有効に延長した。しかしながら、ヌードマウスにおいては、Ｅｐｉ／ｍによっても腫瘍増殖率が抑制されず、また、生存率の延長も認められなかった。これらの結果から、宿主免疫システムが存在することによってミセルの効力が得られることが示唆される。
［実験例７－２］
次いで、ＩＣＩとの組み合わせにおけるＥｐｉ／ｍの治療効果を調べた。具体的には、脳同所移植によってＧＬ２６１－ｌｕｃ腫瘍を移植したマウスに、下記の群分け及び投与スケジュールで各被験薬を投与し、実験例４と同様にして経時的に発光強度を測定した。結果を、各群のマウスの生存曲線及びマウスの脳のＭＲＩ画像と併せて図９に示す。
＜群分け＞
＜投与スケジュール＞
Ｄａｙ０：脳にＧＬ２６１－ｌｕｃを１×１０５個移植する。
Ｄａｙ６：マウスをランダムに群分けし、被験薬を尾静脈投与する。
Ｄａｙ１０、１４、２１、２８、３５、４２：被験薬を尾静脈投与する。
図９に示されるとおり、ａＰＤ－１又はＥｐｉ／ｍ単独投与では、腫瘍由来の発光が部分的に抑制されるのみであるが、これらを組み合わせて投与することにより、Ｄａｙ６０を超えても腫瘍由来の発光が効果的に抑制され続けた（左図）。また、Ｄａｙ１８における脳腫瘍のＭＲＩ画像から、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与によって腫瘍サイズが制御されていることがわかる（右図）。このような抗腫瘍効果の増強の結果、全てのＧＬ２６１－ｌｕｃ腫瘍が消滅し、全てのマウスが実験終了まで生存した（中央図）。
また、上記実験で生存したマウスにＧＬ２６１－ｌｕｃ細胞を再移植したところ、ａＰＤ－１又はＥｐｉ／ｍを単独投与あるいはこれらを併用投与されたマウスの全匹において、再移植された腫瘍が消滅した。このことから、効果的な免疫記憶が生じることがわかる。
以上の結果から、ＰＴＥＮ－陽性腫瘍に対して、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを組み合わせて用いる（併用投与する）ことにより、強力な相乗効果が得られることがわかる。
［実験例７－３］
次いで、ＰＴＥＮ－陰性であるＣＴ２Ａ－ｌｕｃ腫瘍におけるＩＣＩ効果をＥｐｉ／ｍが促進し得るかを評価した。なお、ＣＴ２Ａ－ｌｕｃ腫瘍は、ａＰＤ－１を用いた治療に抵抗性である。具体的には、脳同所移植によってＣＴ２Ａ－ｌｕｃ腫瘍を移植したマウスに下記の群分け及び投与スケジュールで各被験薬を投与し、実験例４と同様にして経時的に発光強度を測定した。結果を、各群のマウスの生存曲線及びマウスの脳のＭＲＩ画像と併せて図１０に示す。
＜群分け＞
＜投与スケジュール＞
Ｄａｙ０：脳にＣＴ２Ａ－ｌｕｃを１×１０５個移植する。
Ｄａｙ６：マウスをランダムに群分けし、被験薬を尾静脈投与する。
Ｄａｙ１０、１４、２１、２８、３５、４２：被験薬を尾静脈投与する。
図１０に示されるとおり、ＣＴ２Ａ－ｌｕｃに対するａＰＤ－１の効果は低く、生存率の向上はあまり見られなかった（中央図）。一方、腫瘍由来の発光シグナルをみると、ＤＯＸＩＬの単独投与によって発光シグナルの増大が抑制され、ＤＯＸＩＬとａＰＤ－１との併用投与によって腫瘍由来の発光強度が低下していた（左図）。しかしながら、ＤＯＸＩＬの単独投与及びＤＯＸＩＬとａＰＤ－１との併用投与による延命効果は、Ｅｐｉ／ｍ投与と同程度であった（中央図）。Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与による延命効果は、ＥｐｉとａＰＤ－１との併用（Ｐ＝０．０００４）やＤＯＸＩＬとａＰＤ－１との併用（Ｐ＝０．００６２）よりも有意に高かった（中央図）。また、ＭＲＩ画像では、ＤＯＸＩＬとａＰＤ－１との併用投与マウス及びＤＯＸＩＬ単独投与マウスにおいて、腫瘍サイズの目立った減少が確認できないことから、ＤＯＸＩＬが投与されたマウスでは、ルシフェリンの脳関門の通過が妨害された等の理由により、腫瘍由来の発光が本来よりも低減したと推測される（右図）。また、ＭＲＩ画像によれば、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与マウスにおいて腫瘍サイズが効果的に制御されていることが確認でき、このことが、生存率の有意な増大につながったと考えられる（中央図、右図）。
［実験例７－４］
用量を３倍にして（すなわち、薬物換算で１５ｍｇ／ｋｇの用量で）Ｅｐｉ／ｍ又はａＰＤ－１を単独投与あるいはＥｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与したこと以外は実験例７－３と同様にしてＣＴ２Ａ－ｌｕｃ腫瘍に対する抗腫瘍効果を調べた（Ｅｐｉ又はＤＯＸＩＬの１５ｍｇ／ｋｇの用量での投与は毒性であることから実施していない）。発光強度、各群のマウスの生存曲線及びマウスの脳のＭＲＩ画像を図１１に示す。
図１１に示されるとおり、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与することによって、ＣＴ２Ａ－ｌｕｃ腫瘍の発光レベルが抑制されるとともに（左図）、Ｄａｙ５０まで全てのマウスが生存し、生存率が有意に向上した（中央図）。Ｄａｙ２２における脳腫瘍のＭＲＩ画像によれば、これらの併用投与によって強力な抗腫瘍効果が奏されることがわかる。
また、上記実験で生存したマウスにＣＴ２Ａ－ｌｕｃ細胞を再移植したところ、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とが併用投与されたマウスにおいては、再移植された腫瘍が消滅した。このことから、効果的な免疫記憶が生じることがわかる。
以上の結果から、ＰＴＥＮ－陰性腫瘍に対しても、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを組み合わせて用いる（併用投与する）ことにより、強力な相乗効果が得られることがわかる。
［実験例８ エピルビシンミセルのＣＴ２Ａ腫瘍内への蓄積］
Ｅｐｉ／ｍがＥｐｉを同所性ＣＴ２Ａ腫瘍に送達し得るかを調べた。具体的には、ＣＴ２Ａ－ｌｕｃ細胞を脳に移植してから３週間後のマウスに、６ｍｇ／ｋｇの用量（Ｅｐｉ換算）でＥｐｉ又はＥｐｉ／ｍを静脈投与した。試料の採取前にマウスをＰＢＳでかん流した。被験薬の投与から１、４、８及び２４時間後に、採血を行うとともに、正常な脳組織及び腫瘍組織を採取し、重量を測定した。採取した血漿及び組織中に含まれるＥｐｉの濃度をＪ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ． ２０１７ Ｊｕｌ ２８；２５８：５６－６６．に記載の方法に従って評価した。結果を図１２に示す。
図１２Ａに示されるとおり、単独で投与された遊離のＥｐｉは循環血液から速やかに除去されたのに対し、Ｅｐｉ／ｍは約１２時間の半減期を有し、アベイラビリティが向上していた。さらに、図１２Ｂ及びＣによれば、Ｅｐｉ／ｍは、正常な脳組織に薬物（Ｅｐｉ）を蓄積することなく、腫瘍へ効果的に薬物を送達できることがわかる。また、血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出したところ、同所性ＣＴ２Ａ腫瘍のＥｐｉ／ｍに対する曝露量は、遊離のＥｐｉに対する曝露量の１８０倍であった。
［実験例９ エピルビシンミセルによるコールドなＧＢＭのホットな腫瘍への変換］
ＰＴＥＮ－陽性ＧＬ２６１腫瘍及びＰＴＥＮ－陰性ＣＴ２Ａ腫瘍の免疫組織学的観察を行った。具体的には、実験例７－２と同様にして、マウスにＧＬ２６１又はＣＴ２Ａを移植した。投与から２週間後に、がんが生着したマウスに各被験薬を投与した。このとき、ＧＬ２６１移植マウスには、Ｅｐｉ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｅｐｉ／ｍ（Ｅｐｉ換算で５ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｅｐｉ／ｍ＋ＰＤ－１（薬物換算で各々５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、ＣＴ２Ａ移植マウスには、Ｅｐｉ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｅｐｉ／ｍ（Ｅｐｉ換算で１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。投与後Ｄａｙ４のＧＬ２６１移植マウス及び投与後Ｄａｙ４又はＤａｙ８のＣＴ２Ａ移植マウスの脳を、４％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒド溶液の静脈注射の逆流によって固定した。全脳を回収し、４％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒド溶液で２４時間固定した。次いで、１０％スクロースを含むＰＢＳ及び１５％スクロースを含むＰＢＳ中にそれぞれ６時間置き、その後、２０％スクロースを含むＰＢＳ中に一晩置いた。最後に、脳組織をＯＣＴコンパウンド中に包埋した。ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ ３（Ａｓｐ１７５）（５Ａ１Ｅ）、ＣＤ８（Ｄ４Ｗ２Ｚ）、ＣＤ４（Ｄ７Ｄ２Ｚ）、ＦｏｘＰ３（Ｄ６Ｏ８Ｒ）、Ｆ４／８０（Ｄ２Ｓ９Ｒ）、ＣＤ１９（Ｄ４Ｖ４Ｂ）、ＣＤ１１ｃ（Ｄ１Ｖ９Ｙ）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（Ｄ６Ｅ９Ｗ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に対する抗体を用いて免疫染色を行った。免疫蛍光に関しては、組織切片を一次抗体と共にインキュベートし、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ Ｂｏｏｓｔ ＩＨＣ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いて染色した。検出は、ＴＳＡ ｐｌｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて行った。得られた画像において、細胞分布を直接観察することによって、腫瘍周辺にＴ細胞を提示する「ｃｏｌｄ－ｅｘｃｌｕｄｅｄ腫瘍」とＴ細胞を一切示さない「ｃｏｌｄ－ｉｇｎｏｒｅｄ腫瘍」とを区別することができる。また、得られた画像を目視で観察することによって、各タンパクを発現する細胞数を計測した。ＧＬ２６１腫瘍の観察結果及びＣＴ２Ａ腫瘍の観察結果をそれぞれ、図１３及び図１４に示す。また、ＣＤ８に対する抗体で染色したＣＴ２Ａ腫瘍のＤａｙ４及びＤａｙ８の写真を図１５に示す。
図１３及び図１４における未処置のＧＬ２６１腫瘍及びＣＴ２Ａ腫瘍の観察画像から、これらの腫瘍はいずれも、Ｔ細胞を欠いていること、すなわち、ｃｏｌｄ－ｉｇｎｏｒｅｄであることがわかる。また、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与によって、単独投与の場合に比べてＣｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＣ３）の発現レベルがより高くなっており、このことは、実験例７等で示された強力な抗腫瘍効果を裏付けるものといえる。
また、図１３に示されるとおり、ＰＴＥＮ－陽性ＧＬ２６１腫瘍において、Ｅｐｉ／ｍ又はａＰＤ－１の単独投与によって浸潤性のＣＤ８＋Ｔ細胞が増加したが、これらの併用投与によれば、腫瘍内部に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞が顕著に増大した。また、これらの処置によって、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）の発現レベルも変化している。したがって、ａＰＤ－１で処置された腫瘍は、有意に高いＴｒｅｇの浸潤を示す。一方、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与は、腫瘍内部のＴｒｅｇレベルを低下させた。また、ａＰＤ－１で処置された腫瘍においては、マクロファージが増大していた。これに関しては、マクロファージの集簇及び当該マクロファージによるａＰＤ－１の取り込みが、ａＰＤ－１治療法に対する抵抗性メカニズムを媒介することが報告されている（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ９ （２０１７） ｅａａｌ３６０４）。注目すべきことには、Ｅｐｉ／ｍ処置によって、腫瘍内におけるマクロファージレベルが低下しており、ａＰＤ－１と併用した際には、ａＰＤ－１を単独で用いる場合に比べてマクロファージが減少している。これらの結果は、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与によって、マクロファージによるａＰＤ－１除去に起因する抵抗性が緩和され得ることを示す。
図１４及び図１５に示されるとおり、ＰＴＥＮ－陰性ＣＴ２Ａ腫瘍において、Ｅｐｉ／ｍ又はａＰＤ－１の単独投与によって、浸潤性のＣＤ８＋Ｔ細胞が増加したが、Ｅｐｉ／ｍで処置された腫瘍の方がＣＤ８＋Ｔ細胞レベルが高かった。また、これらを併用投与した場合、Ｅｐｉ／ｍの単独投与の場合と同程度まで腫瘍内部に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞が増大した。Ｔｒｅｇは、いずれの腫瘍においても検出されなかった。また、ａＰＤ－１で処置された腫瘍においては、マクロファージが増大しており、Ｅｐｉ／ｍと併用した際には、マクロファージの集簇がさらに促進された。
以上の結果から、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与によって、コールドな（免疫的に不活性な）ＧＢＭを、ホットな（免疫的に活性な）腫瘍に変換できることがわかる。Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用は、ＩＣＤ誘導に加えて、ＧＢＭ微少環境内における広範なリンパ球浸潤をもたらし、抗腫瘍免疫効果を押し上げることができ、結果として、相乗的な抗腫瘍効果を発揮し得ると考えられる。
［実験例１０ エピルビシンミセルによるＧＢＭにおけるＰＤ－Ｌ１発現の抑制］
ＧＢＭを含む多くのがんにおいて、ＰＤ－Ｌ１発現は予後の不良さと相関しており、ＰＤ－Ｌ１がリンパ球及び免疫細胞の浸潤に影響を及ぼすこと（Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ７ （２０１７） ４２３１； Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ９ （２０１８） １５０３）、及び、乳がんにおいて、アントラサイクリン類がＰＤ－Ｌ１の発現を低減すること（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １２ （２０１０） Ｒ４８； Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． １９ （２０１８） ５６３）が報告されている。よって、Ｅｐｉ／ｍを投与したＰＴＥＮ－陰性ＣＴ２Ａ腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１の発現をフローサイトメトリー解析によって調べた。
具体的には、マウスにＣＴ２Ａを１×１０５細胞移植してから２週間後に、ＰＢＳ、Ｅｐｉ（６ｍｇ／ｋｇ）、Ｅｐｉ／ｍ（Ｅｐｉ換算で６ｍｇ／ｋｇ）を１回尾静脈注射した。投与後８日目にＰＢＳによって還流した。その後、がんのみを摘出し、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｒｉ Ｔｕｍｏｒ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ キット（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のプロトコールに従って、細胞を乖離させた。それぞれの細胞数をカウントし、投与したマウスの細胞で処置した５×１０５ｃｅｌｌｓ／チューブの細胞を正常ＩｇＧと共に１５分インキュベートし、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合－抗マウスＰＤ－Ｌ１抗体（５６４７１５、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて染色した。細胞を、４℃で１時間インキュベートし、２回洗浄してから、２％ＦＢＳ含有ＰＢＳに再度懸濁した。各試料に関して、製造者マニュアルに基づいてアイソタイプコントロールを用いた。アイソタイプコントロールの蛍光に対するサンプルの蛍光として、相対蛍光を算出した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を用いて行った。結果を図１６に示す。
図１６に示されるとおり、Ｅｐｉ／ｍで処置した腫瘍細胞においては、ＰＤ－Ｌ１の発現レベルが低下していた。しかしながら、薬物単独（遊離のＥｐｉ）で処置した腫瘍細胞においては、このような発現レベルの低下は生じなかった。
［実験例１１ マウス中皮腫モデルに対するエピルビシンミセルと抗ＰＤ－１抗体との併用投与］
［実験例１１－１］
実験例６と同様の方法で、種々のがん細胞（ＭＣＡ２０５、ＡＢ１２、ＧＬ２６１、ＣＴ２Ａ、ＬＬ２、Ｃ２６）に対する各被験薬（Ｅｐｉ、Ｅｐｉ／ｍ、ＣＤＤＰ、ＣＤＤＰ／ｍ）のＩＣ５０を調べた。結果を図１７に示す。
図１７に示されるとおり、Ｅｐｉ及びＥｐｉ／ｍは、全てのがん細胞に対して１μｇ／ｍＬ以下の低いＩＣ５０を示し、このことから、広範ながん細胞に対して高い傷害活性を有することがわかる。
［実験例１１－２］
マウス中皮腫細胞「ＡＢ１２」を移植したマウスに、下記の群分け及び投与スケジュールで各被験薬を投与し、実験例４と同様にして経時的に発光強度（腫瘍体積）を測定した。結果を、各群のマウスの生存曲線と併せて図１８に示す。
＜群分け＞
＜投与スケジュール＞
Ｄａｙ０：胸腔内にＡＢ１２を５×１０６個移植する。
Ｄａｙ６：マウスをランダムに群分けし、被験薬を尾静脈投与する。
Ｄａｙ１０、１４：被験薬を尾静脈投与する（計３回）。
図１８に示されるとおり、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与した群では、初回投与後速やかに発光強度が低下（腫瘍体積が減少）し、再増殖することなく継続的に腫瘍の増殖が制御された。また、全てのマウスがＤａｙ９０を超えて生存した。一方、他の被験薬を投与した群では、発光強度の低下（腫瘍体積の減少）が認められたものの、その程度は併用投与群に比べて小さく、また、経時的に再増殖する傾向にあった。また、コントロール群に比べて延命効果が認められるが、Ｄａｙ９０における生存率はいずれも５０％未満であった。
［実験例１２ マウス線維肉腫モデルに対するエピルビシンミセルと抗ＰＤ－１抗体との併用投与］
［実験例１２－１］
実験例６と同様の方法で、種々の線維肉腫細胞がん株（ＭＣＡ２０５、Ｓａｒｃｏｍａ１８０、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＴ１０８０）に対する各被験薬（Ｅｐｉ、Ｅｐｉ／ｍ、ＤＯＸ（ドキソルビシン塩酸塩）、ＤＯＸＩＬ、ＣＤＤＰ、ＰＴＸ（パクリタキセル））のＩＣ５０を調べた。結果を図１９に示す。
図１９に示されるとおり、Ｅｐｉ及びＥｐｉ／ｍは、全てのがん細胞に対して２μｇ／ｍＬ以下の低いＩＣ５０を示し、このことから、広範ながん細胞に対して高い傷害活性を有することがわかる。
［実験例１２－２］
マウス線維肉腫細胞「ＭＣＡ２０５」を皮下移植したマウスを移植から１０日後に群分け後、下記の投与スケジュールで各被験薬を投与し、表面にあるがんの長径ａ及び短径ｂをノギスで測定し、楕円形の体積をａｂ２／２で計測することによって経時的に腫瘍体積を測定した。結果を、各群のマウスの生存曲線と併せて図２０に示す。
＜群分け＞
＜投与スケジュール＞
Ｄａｙ０：皮下にＭＣＡ２０５を５×１０６個移植する。
Ｄａｙ１０：マウスをランダムに群分けし、被験薬を尾静脈投与する。
Ｄａｙ１４、１７、２０、２７、３４、４１：被験薬を尾静脈投与する。
図２０に示されるとおり、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与した群では、腫瘍の増殖が顕著に抑制され、全てのマウスがＤａｙ４０を超えて生存した。一方、他の被験薬を投与した群では、コントロール群に比べて腫瘍の増殖が抑制される傾向にあるものの、その程度は併用投与群に比べて小さく、また、Ｄａｙ４０における生存率はいずれも５０％未満であった。
［実験例１３ マウスすい臓がんモデルに対するエピルビシンミセルと抗ＰＤ－１抗体との併用投与］
［実験例１３－１］
実験例６と同様の方法で、マウスすい臓がん細胞「ＫＰＣ」に対するＥｐｉ、Ｅｐｉ／ｍ及びＤＯＸのＩＣ５０を調べたところ、いずれも２μｇ／ｍＬ以下の低い値、特に、ＤＯＸは約１μｇ／ｍＬ、Ｅｐｉは０．５μｇ／ｍＬ以下の値を示した。このことから、Ｅｐｉ、Ｅｐｉ／ｍ及びＤＯＸはいずれも、ＫＰＣ細胞に対して高い傷害活性を有することがわかる。
［実験例１３－２］
種々の濃度の被験薬を含む培養液中で２４時間インキュベートしたＫＰＣ細胞に関して、免疫原性細胞死（ＩＣＤ）のマーカーである、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０及びカルレチクリンの細胞表面における発現量を、蛍光抗体染色後のフローサイトメトリー解析（フローサイトメーター：ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０）によって測定した。結果を図２１に示す。
図２１に示されるとおり、ＫＰＣ細胞において、１μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬのＥｐｉ及びＤＯＸは、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０及びカルレチクリンのレベルを有意に増大させた。一方、イリノテカンはいずれの濃度においても、マーカーを有意に増大させなかった。以上の結果から、Ｅｐｉ及びＤｏｘは、ａＰＤ１抗体との併用投与の際にイリノテカンより高いＩＣＤ効果を発揮し、免疫による相乗効果が得られ得ると推測される。
［実験例１３－３］
マウスすい臓がん細胞「ＫＰＣ」を移植したＢ６マウスを群分け後、下記の投与スケジュールで各被験薬を投与し、初回投与日をＤａｙ０として、Ｄａｙ２４に安楽死処分し、腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍の写真を図２２に示す。
＜群分け＞
＜群１、２及び４の投与スケジュール＞
Ｄａｙ－６：膵臓内にＫＰＣ細胞を５×１０５個に移植する。
Ｄａｙ０、３、６、９：被験薬を尾静脈投与する。
＜群３の投与スケジュール＞
Ｄａｙ－６：膵臓内にＫＰＣ細胞を５×１０５個に移植する。
Ｄａｙ０、３、６、９：Ｅｐｉ／ｍを尾静脈投与する。
Ｄａｙ２、５、８、１１：ａＰＤ－１を尾静脈投与する。
図２２に示されるとおり、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与した群３及び群４では、Ｄａｙ２４において１００％の生存率を達成した。また、群３では、３匹中２匹のマウスにおいて、群４では全てのマウスにおいて、腫瘍が完全に消滅しており、摘出することができなかった。これに対し、コントロール群１及びＥｐｉ／ｍ単独投与群２では、Ｄａｙ２４において１匹のマウスが死亡しており、他の２匹においても増大した腫瘍が摘出された。このことから、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与は、Ｅｐｉ／ｍの単独投与に比べて、ＫＰＣ細胞に対しても顕著に優れた抗腫瘍効果を発揮することがわかる。また、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との投与間隔を短くすること（例えば、同時に投与すること）により、より高い抗腫瘍効果が得られ得ることがわかる。
［実験例１３－４ イリノテカンとの比較］
マウスすい臓がん細胞「ＫＰＣ」を移植したＢ６マウスを群分け後、下記の投与スケジュールで各被験薬を投与し、がん細胞の移植日をＤａｙ０として、マウスの生存を確認した。結果を図２３に示す。
＜群分け＞
＜投与スケジュール＞
Ｄａｙ０：マウス膵臓内にＫＰＣを５ｘ１０６個移植する。
Ｄａｙ７：マウスをランダムに群分けし、被験薬を尾静脈投与する。
Ｄａｙ１０、１３、１６：被験薬を尾静脈投与する。（計４回）
図２３に示されるとおり、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１とを併用投与した群のみで、有意に生存率が延長した（Ｅｐｉ／ｍ ｖｓ Ｅｐｉ／ｍ＋ａＰＤ１：Ｐ＝０．００４２）。また、エピルビシン又はイリノテカンとａＰＤ１抗体との併用は、効果がないことが示された。このことから、Ｅｐｉ／ｍとａＰＤ－１との併用投与は、イリノテカン又はエピルビシンの単独投与及びこれらとａＰＤ１抗体との併用投与に比べて、ＫＰＣ細胞に対しても顕著に優れた抗腫瘍効果を発揮することがわかる。
本発明の医薬組成物は、医療及び製薬の分野において好適に適用され得る。
１０ ブロックコポリマー
１２ 親水性ブロック
１４ 疎水性ブロック
２０ アントラサイクリン系化合物
３０ 薬物－ポリマー複合体
１００ ミセル

Claims (8)

  1. 親水性ブロックと疎水性ブロックとを有するブロックコポリマーと、アントラサイクリン系化合物とが結合した薬物－ポリマー複合体を含むミセル剤を含有し、免疫賦活剤と組み合わせてがんの治療又は予防に用いられる、医薬組成物であって、
    該アントラサイクリン系化合物が、エピルビシンを含み、
    該親水性ブロックが、重合度が２００から４００の範囲にある整数である、ポリエチレングリコールを含み、
    該疎水性ブロックが、重合度が３０から５０の範囲にある整数である、ポリアミノ酸ブロックを含み、
    該ポリアミノ酸ブロックは、下記式（ｉｖ）で表される薬物含有アミノ酸残基、下記式（ｉ）で表されるヒドラジド基含有アミノ酸残基、下記式（ｉｉ）で表される疎水性基含有アミノ酸残基、及び下記式（ｉｉｉ）で表されるカルボキシル基含有アミノ酸残基から構成され、
    （式（ｉ）～（ｉｖ）中、ｘは、１を表し、Ｒａは、－Ｏ－又はＮＨ－を表し、Ｒｂは、ベンジル基またはフェニル基を表し、Ａｎは、前記エピルビシンからカルボニル酸素を除いた残基を表し；）
    該ポリアミノ酸ブロックにおける該薬物含有アミノ酸残基（ｉｖ）の数が、４から１４の範囲にある整数であり、
    該ポリアミノ酸ブロックにおける該ヒドラジド基含有アミノ酸残基（ｉ）の数が、１から４の範囲にある整数であり、
    該ポリアミノ酸ブロックにおける該疎水性基含有アミノ酸残基（ｉｉ）の数が、１２から３０の範囲にある整数であり、
    該ポリアミノ酸ブロックにおける該カルボキシル基含有アミノ酸残基（ｉｉｉ）の数が、５から１５の範囲にある整数であり、
    該免疫賦活剤が、抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である免疫チェックポイント阻害剤を含む、医薬組成物。
  2. 前記薬物－ポリマー複合体が、下記式（Ｉｂ）で表される複合体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
    （式中
    Ｒ１は、メトキシ基であり、
    Ｒ２は、水素原子又はアセチル基であり、
    Ｒ３は、－Ｏ－であり、
    Ｒ４は、ベンジル基であり、
    Ｌ１は、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－であり、
    ａは、２００から４００の範囲にある整数であり、
    ｂは、４から１４の範囲にある整数であり、
    ｃは、１から４の範囲にある整数であり、
    ｄは、１２から３０の範囲にある整数であり、
    ｅは、５から１５の範囲にある整数であり、
    ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは３０から５０の範囲にある整数であり、
    ｙは、１であり、
    ここで、各アミノ酸残基はランダムに存在し、
    Ａｎは、１３位のカルボニル基のカルボニル酸素を除いたエピルビシン残基である。）
  3. 前記薬物－ポリマー複合体が、下記式（ＩＩ）で表される複合体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
    （式中
    Ｒ１は、メトキシ基であり、
    Ｒ３は、－Ｏ－又は－ＮＨ－であり、
    Ｒ４は、ベンジル基又はフェニル基であり、
    Ｒ５は、水酸基であり、
    Ｌ２は、－Ｚ－ＣＯ－であり、
    Ｚは、炭素数１～８のアルキレン基であり、
    ａは、２００から４００の範囲にある整数であり、
    ｂは、４から１４の範囲にある整数であり、
    ｃは、１から４の範囲にある整数であり、
    ｄは、１２から３０の範囲にある整数であり、
    ｅは、５から１５の範囲にある整数であり、
    ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは３０から５０の範囲にある整数であり、
    ｙは、１であり、
    ここで、各アミノ酸残基はランダムに存在し、
    Ａｎは、１３位のカルボニル基のカルボニル酸素を除いたエピルビシン残基である。）
  4. アントラサイクリン系化合物に対する難治性がんの治療又は予防に用いられる、請求項１から３のいずれかに記載の医薬組成物。
  5. 前記難治性がんが、脳腫瘍、すい臓がん、悪性中皮腫、線維肉腫、卵巣がん、乳がん、Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫、軟部肉腫、膀胱がん、甲状腺がん、胃がん、子宮体がん、骨肉腫、Ｗｉｌｍｓ腫瘍、神経芽細胞腫及び急性リンパ腫からなる群より選択される少なくとも１種のがんを含む、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 前記脳腫瘍が、神経膠腫を含む、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. ＰＴＥＮの発現に異常を有する個体に投与される、請求項１から６のいずれかに記載の医薬組成物。
  8. 個体への同時又は異時の投与によって、前記免疫賦活剤と組み合わせられる、請求項１から７のいずれかに記載の医薬組成物。
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