JP7553619B2 - 低ｐＨウイルス不活化のための新しい連続フロー反応器 - Google Patents

Description

本開示は、一般に、新規の反応器のための装置及び方法に関する。より具体的には、本開示は、低ｐＨウイルス不活化のための連続流れ反応器のための装置及び方法に関する。

本発明は、タンパク質のような生物学的生成物の産生の分野にあり、これは通常、バイオ反応器（発酵槽）で行われ、そこでは、例えば、真核細胞が、目的のタンパク質を産生するために培養される。従って、例えば、流加回分（フェドバッチ）発酵又は連続発酵又は灌流発酵などの様々なテクノロジーが確立されている。使用する前に、生成物は精製される必要がある。精製工程の中で、特に生成物が人間での使用を目的としている場合、ウイルスの不活化は必須である。

現在、低ｐＨでのウイルス不活化は、バッチ反応器で実施されている。不活化されるべき材料（即ち、活性ウイルスを潜在的に含む液体）が、バッチ反応器に導入される。不活化されるべき材料は、酸性溶液によってｐＨ≦４にされ、必要とされる時間そのままにされる。ウイルスの不活化は、或る特定の製品及びプロセスに依存する時間の間、ウイルスが酸性溶液と接触することによって影響を受ける。バッチ反応器の全内容物は、実質的に同一の滞留時間で不活性化を経験する。さらに、各バッチで達成されるウイルスの削減は実質的に同じである。

１実施態様において、ウイルス不活化装置が提供される。上記ウイルス不活化装置は、入口、出口、及び上記入口と上記出口との間に蛇行パターンを形成する交互交代する曲がり部の組を備えた管状流路を含む、少なくとも１つの連続的ウイルス不活化反応器を含む。

１実施態様において、上記少なくとも１つの連続ウイルス不活化反応器は、インライン管状連続ウイルス不活化反応器である。

別の実施態様において、上記交互交代する曲がり部の組は、約２７０°～約２８０°の角度を有する少なくとも２つの交互交代する曲がり部を含む。

さらなる実施態様において、上記交互交代する曲がり部の組は、約２７０°～約２８０°の角度を有する約２～約３２５ターンの交互交代する曲がり部を含む。

さらに別の実施態様において、上記管状流路は、約０．６ｃｍ～約０．７ｃｍの直径を含む。

１実施態様において、上記交互交代する曲がり部の組は、少なくとも２つの積み重ねられた層に垂直に分割されている。

さらなる実施態様において、上記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、単一面内に１２．５の交互交代する曲がり部を含み、上記交互交代する曲がり部の各々は、約２７０°～約２８０°の角度を含む。

１実施態様において、上記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、約０．７ｃｍ～約１．２ｃｍの厚さを含む。

１実施態様において、上記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、上記管状流路の１つの１８０°曲がり部を介して互いに接続されている。

別の実施態様において、上記少なくとも２つの積み重ねられた層は、上記管状流路の２５の１８０°曲がり部を介して互いに接続された２６層である。

更なる態様において、上記少なくとも１つの連続的なウイルス不活化反応器は、直列に接続された約２～約６のウイルス不活化反応器を含む。

さらに別の実施態様において、上記交互交代する曲がり部の組は、渦を生成して、約１８７．７～約３７５．５のレイノルズ数を備える層流を有する生成物ストリームの混合を誘発する。

１実施態様において、上記管状流路は、生成物ストリームが少なくとも３０分間、上記連続ウイルス不活化反応器内にあるような寸法を取られている。

別の実施態様において、ウイルス不活化装置は、第１の静的混合器と流体連絡する入口と、第２の静的混合器と流体連絡する出口とを有する低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器を含む。ここで、上記低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器は、交互交代する曲がり部の組で形成された管を含む。

更なる実施態様において、上記管は、生成物ストリームが少なくとも３０分間、低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器内にあるように寸法を取られている。

更に別の実施態様において、上記交互交代する曲がり部の組における各曲がり部は、約２７０°～約２８０°までの角度を含む。

１実施態様において、上記交互交代する曲がり部の組は、約０．８５ｃｍ～約２ｃｍの曲率半径を含む。

別の実施態様において、上記管は３２５ターンの交互交代する曲がり部を含む。

更なる実施態様において、上記管は、２５個の管状流路であって、その各々が１つの１８０°曲がり部を有するものによって、互いに接続された２６個の垂直層に分割されている。

更に別の実施態様において、上記管は、少なくとも１２．５ターンの交互交代する曲がり部を単一の平面内に含んでいる。

１実施態様において、上記低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器は、直列に接続された約２～約６のウイルス不活化反応器を含んでいる。

別の実施態様において、生成物ストリームの連続低ｐＨウイルス不活化のための方法であって、上記生成物ストリームを、そのｐＨを所定のウイルス不活化ｐＨにまで下げるために、第１の静的混合器に導入すること；不活性化されるために上記第１の静的混合器を出る生成物ストリームを、単一面内に複数の曲がり部の組を有する管の入口に導入すること；上記生成物ストリームをウイルス不活化条件下で上記管を通して流すこと；及び、上記生成物のストリームを上記管の出口を通して上記管から出すこと；を包含している上記方法、ここで、上記生成物ストリームのｐＨを下げるために、低ｐＨ緩衝液が上記第１の静的混合器に導入される。

更なる実施態様において、単一面内の上記複数の曲がり部は、蛇行パターンを形成する。

１実施態様において、上記生成物ストリームは、プロテインＡ捕捉器から第１の静的混合器に導入される。

様々な実施形態の追加の特徴及び利点は、部分的には以下の説明に記載され、部分的には説明から明らかであるか、又は様々な実施形態の実施によって学ばれうる。様々な実施形態の目的及び他の利点は、本明細書の説明で特に指摘された要素及び組み合わせによって実現及び達成されるであろう。

いくつかの実施態様及び実施形態における本開示は、以下の詳細な説明及び添付の図面からより完全に理解することができる。

本開示の１実施例による、全体的な連続低ｐＨウイルス不活化スキームを示す図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器の管状流路の上面図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器の部分的斜視図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器の側面図及び等角図である。 本開示の１実施例による、互いに接続された複数の連続管状反応器を示す図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器の層を示す図である。 本開示の１実施例による、交互交代する２７０°曲がり部を有する連続管状反応器の曲率半径に対する、弧長、必要な二次流れ進展曲がり長さ（ＬＤＴ）、及び或る流量での特性ディーン数との夫々の相関関係を示す図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器の中心面速度分布図の計算流体力学の結果を示す図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器の中心面速度プロファイルの計算流体力学の結果を示す図である。 本開示の１実施例による、連続管状反応器に関する２つの流量での断面速度分布図及び二次流れパターンの計算流体力学解析を示す図である。 本開示の１実施例による、連続ウイルス不活化反応器に関するＣＦＤモデル及びトレーサー実験での無次元Ｅ（θ）滞留時間分布（ＲＴＤ）曲線の２つの流量での比較である。 図７Ａは、本開示の１実施例による、所定の流量での連続管状反応器のＣＦＤモデルによる長さ対ＲＴＤ分散の線形関係を示す。 図７Ｂは、本開示の１実施例による、所定の流量での連続管状反応器の実験による長さ対ＲＴＤ分散の線形関係を示す。 図７Ｃは、本開示の１実施例による、所定の流量での連続管状反応器の無次元ＲＴＤ曲線を示す。

本明細書及び図面において、類似の参照符号は、一貫して類似の要素を識別する。

前述の一般的な記載と以下の詳細な記載の両方とも、ただ例示的且つ説明的であり、本教示の様々な実施形態の説明を与えることを意図していることを理解されたい。

ウイルスの安全性は、哺乳動物細胞内で産生されたタンパク質治療薬に対して義務付けられており、ウイルス除去手順は高度に規制されている。低ｐＨウイルス不活化（ＶＩ:Viral Inactivation）は、モノクローナル抗体精製プロセスで用いれる非常に効果的な方法であり、４ｌｏｇ（１０）を超える大きなエンベロープウイルス（内在性レトロウイルスを含む）を一貫して除去する。米国材料試験協会（ＡＳＴＭ）の「Standard Practice for Process for Inactivation of Retrovirus by pH（ｐＨによるレトロウイルスの不活化プロセスの標準的な手順）」では、低ｐＨウイルス不活化に関して次の条件が規定されている。指定のｐＨでのシステム特定緩衝材内において、ｐＨ≦３．６、１５℃以上、３０分以上で、５以上の対数減少値（ＬＲＶ:log reduction value）を提供する。

本発明による連続フロー反応器は、任意の適切な不活性材料（例えば、ガラス、合成材料、又は金属）で製作されうる。図１は、１の例示的な連続ウイルス不活化（ＣＶＩ:continuous viral inactivation）プロセスシステム１０を示している。ＣＶＩプロセスシステム１０は、定常状態動作、プロセス柔軟性、生産能力に対する装置サイズの比率の減少、効率化されたプロセス制御、改善された製品品質管理、及び資本コストの削減を包含しうるので有利である。この目的のために、上記プロセスシステム１０は、捕捉器（例えば、プロテインＡ捕捉器２０）、第１の静的混合器（／スタティックミキサー）４０、第２の静的混合器６０、及び連続フロー反応器（例えば、上記第１の静的混合器４０と上記第２の静的混合器６０との間に配置されたインライン管状ＣＶＩ反応器（箱の中の治具（jig in a box:ＪＩＢ）とも呼ばれる）１００を含むことができる。プロテインＡ捕捉溶出物から不活性化されるべき生成物ストリームの連続フローは、第１の静的混合器４０を通過して、プロテインＡ捕捉溶出物のｐＨを所定のウイルス不活化ｐＨに調整することができる。これは、プロテインＡ捕捉溶出液を低ｐＨ緩衝材と混合することによって実現されうる。調整されたｐＨを有するプロテインＡ捕捉溶出物は、インライン管状ＣＶＩ反応器１００に導入され、最後に、更なる下流の処理工程に移る前に、ｐＨ調整のために第２の静的混合器６０に導入されうる。

図１は、プロテインＡ捕捉器がインライン管状ＣＶＩ反応器１００への入力プロセス流として用いられるＣＶＩプロセスシステムを示しているが、任意のプロセス流が、インライン管状ＣＶＩ反応器１００への入力プロセス流として用いられうる。そのようなプロセス流は、バイオリアクター流出物、陰イオン交換クロマトグラフィー流出物、陽イオン交換クロマトグラフィー流出物、水性二相抽出からの流出物、沈殿反応からの流出物、膜濾過工程からの流出物、及び限外濾過工程からの流出物を包含しうるが、これらに限定するものではない。

１実施例において、インライン管状ＣＶＩ反応器１００は、圧力降下及び軸方向分散を最小化、及び／又は、低減するように構成又は設計されうる。従って、インライン管状ＣＶＩ反応器１００は、低レイノルズ（Ｒｅ）数（それは、２０００未満のＲｅ数を有する流れとして規定される）で動作できる。ここで、Ｒｅ＝ρｖｄ／μとして定義され、ρは密度、ｖは平均速度、dは管径、μは動粘度である。例えば、Ｒｅ数の計算は、２５℃の温度、ρ＝１０００ｋｇｍ^－３、及びμ＝８．９Ｅ－４Ｐａ・ｓの生成物ストリームに基づきうる。しかし、層流は、放物線状の速度プロファイルによって特徴付けられるように、軸方向の分散を引き起こしうる。管の中心での流体要素が壁に近い要素よりも速く移動し、幅広い滞留時間分布（ＲＴＤ:Residence Time Distribution）をもたらす。図２Ｂに示されるように、軸方向分散を低減、及び／又は少なくとも部分的に除去するために、インライン管状ＣＶＩ反応器１００は、半径方向の混合を強化し且つ軸方向の分散を減らす二次の流れを生成するように、少なくとも１つの曲がり部又は湾曲部１１０を有する流路（例えば、管状流路１１２）を含みうる。

曲がり部又は湾曲部１１０の曲率半径（ＲＯＣ）は、ディーン（Dean）数（Ｄ）と円環形状の長さ（Ｌ_ＤＴ）に対する曲がり部の長さの比との関数として決定することができる。ここで、Ｄ＝Ｒe√(ｄ/２Ｒ)であり、ｄは管内径、Ｒは流路の曲率半径であり、Ｌ_ＤＴ＝０．３２２ｘｄ_ｃ ^０．３１x Ｒe^０．５９xｄ_ｉ ^０．７６であり、ここでｄ_ｉは内径であり、ｄ_ｃは、コイルの直径（メートル単位）である。

図２Ａ～２Ｄは、低Ｒeで動作することができる例示的なインライン管状ＣＶＩ反応器１００を示している。インライン管状ＣＶＩ反応器１００は、曲がり部又は湾曲部１１０を備える管状流路１１２を含みうる。曲がり部又は湾曲部１１０は、１つの曲がり部から次の曲がり部への曲率の方向が変化し、及び／又はシフトして、半径方向の混合を強化し且つ軸方向の分散を減らすように、配置される。更に、１実施例において、管状流路１１２は、寸法（即ち、直径、長さ、及び圧力の間の関係）を含むことができ、その結果、生成物ストリームは少なくとも３０分間ＣＶＩ反応器内にある。

図２Ａ～２Ｅを参照すると、管状流路１１２の内径Ｄは、約０．５ｃｍ～約１ｃｍ、又は更に、例えば、約０．６ｃｍ～約０．７ｃｍ（例えば、約０．６３５ｃｍの内径）でありうる。このサイズの管は、体積流量（Ｑ）で約１０ｍｌ／分（Ｒｅは３７．５）～２００ｍｌ／分（Ｒeは７５０．９）、又は更に、例えば、約５０ｍｌ／分～約１００ｍｌ／分（Ｒｅ数は、約１８７～約３８０、例えば、約１８７．７～約３７５．５を有する）を可能にしうる。１実施例において、インライン管状ＣＶＩ反応器１００内の流路１１２は、蛇行パターンを含むことができる。この蛇行パターンは、交互交代する曲がり部の約２曲がり部～約２０００ターンの曲がり部、又は更に、例えば、約１００～約５００ターンの曲がり部、又は２００～約４００ターンの曲がり部（例えば、約３２５ターンの曲がり部）を有する管状流路１１２によって作成され得て、これは、約２６０°～約２８０°、例えば、約２７０°の角度を有しうる。１実施例において、第１の曲がり部は約２７０°の角度を含み得、第２の曲がり部は約２７８．３°の角度を含みうる。例えば、図３に示されるように、インライン管状ＣＶＩ反応器１００は、約３２５ターンの交互交代する曲がり部を含むことができ、その曲がり部の曲率半径（ＲＯＣ）は約０．８５ｃｍ～約２ｃｍ、又は更に、例えば、約０．８５ｃｍ～約０．９９ｃｍであり、これは、約４ｃｍ～約９．５ｃｍ、又は更に、例えば、約４．７１ｃｍの曲がり部長をもたらしうる。インライン管状ＣＶＩ反応器１００のパラメータは、約２４０から約１４５のディーン数（例えば、約２１０以上のディーン数）又は更に、及び約４．５ｃｍ～約１１ｃｍのＬ_ＤＴ、例えば、約６．４ｃｍから約８．５ｃｍ、例えば、約６．７６ｃｍのＬ_ＤＴに対応しうる。

図２Ａを参照すると、管状流路１１２の各湾曲部１１０は、凡そ１．５ｃｍ（例えば、約１．４７９ｃｍ）の２つの曲がり部間の各中心間の垂直距離（Ｌ１）を含みうる。さらに、各湾曲部１１０は、約１．３７５ｃｍの２つ曲がり部間の中心間の水平距離（Ｌ２）を含みうる。さらに、管状流路１１２内の各湾曲部１１０の半径は、実質的に一定であり得る。１実施例において、ＲＯＣが約０．８５ｃｍ～約０．９９ｃｍである場合、各湾曲部１１０の曲率の角度は約２７０°でありうる。別の実施例において、ＲＯＣが約０．９９ｃｍ以上である場合、各湾曲部の曲率角は同じでありうるか、又は第１の湾曲部１１０の曲率角は約２７０°であり得、第１の湾曲部に隣接する第２の湾曲部１１０の曲率角は、約２７０°以上でありうる。上記の各例示的なシナリオにおいて、Ｒ１及びＲ２は、交互交代する曲がり部間のディーン数の実質的な差異を防ぐために、互いに０．０５ｃｍ以内にありうる。

１実施例において、管状流路１１２内の各湾曲部１１０は、同じ半径（例えば、１ｃｍの半径）を含むことができる。別の実施例において、管状流路１１２内の各湾曲部１１０は、異なる半径を含むことができる。例えば、第１の湾曲部１１０は、半径Ｒ１（それは１ｃｍでありうる）を含むことができ、第２の湾曲部１１０は、半径Ｒ２（それは１．０２ｃｍでありうる）を含むことができる。この実施例において、半径Ｒ１に対応する曲率の角度は約２７０°であり得、半径Ｒ２に対応する曲率の角度は約２７８．２７°でありうる。別の実施例において、各管状流路１１２内の湾曲部１１０の第１の半分は、第１の半径Ｒ１（それは１ｃｍでありうる）を含むことができ、各管状流路１１２内の湾曲部１１０の第２の半分は、第２の半径Ｒ２（それは１．０２ｃｍでありうる）を含むことができる。

図２Ｂ及び２Ｃを参照すると、約３２５ターンの交互交代する２７０°曲がり部をコンパクトな設計に収容するために、インライン管状ＣＶＩ反応器１００における管状流路１１２は、複数の積み重ねられた層１１４、例えば、約２層１１４から約５０層１１４まで、又は更に、例えば、図１及び図２Ｃに示されたように、２６層１１４に垂直に分割されうる。１実施例において、積み重ねられた層１１４における各層１１４（ａ）～１１４（ｚ）は、単一の平面内に約１０．５ターンの曲がり部～約１５．５ターンの曲がり部を含みうる。例えば、積み重ねられた層１１４における各層１１４（ａ）～１１４（ｚ）は、１２．５の曲がり部を含みうる。１実施例において、各層１１４は、１つの１８０°垂直曲がり部１１６によって隣接下側層１１４に接続されうる。代わりに、各層１１４における流路１１２の最後の曲がり部１１０の後半部は、次の層の管状流路１１２を接続するために（例えば、層１１４（ａ）を第２の層１１４（ｂ）における管状流路１１２へ接続するために）垂直に１８０°だけ曲げられうる。１実施例において、インライン管状ＣＶＩ反応器１００が２６層１１４を含む場合、２６層１１４は、２５個の１８０°垂直曲がり部１１６によって互いに接続されうる。

図２Ｅを参照すると、１実施例において、インライン管状ＣＶＩ反応器１００における各層１１４は、深さＬ３を含みうる。深さＬ３は、第１の層１１４における管状流路１１２の中心から、第１の層１１４の真下の第２の層１１４における管状流路１１２の中心までの距離でありうる。深さＬ３は、約０．７ｃｍ～約１．２ｃｍ、又は更に、例えば、約０．８ｃｍ～約０．９ｃｍ（例えば、約０．８３５ｃｍの深さ）でありうる。１実施例において、第１の層における管状流路１１２の底部から第１の層の真下の第２の層における管状流路１１２の上部までの距離（Ｌ４）は、約０．１５ｃｍ（１．５ｍｍ）～約０．４ｃｍ（４ｍｍ）、例えば、約０．１７ｃｍ（１．７ｍｍ）～約０．２５５ｃｍ（２．５５ｍｍ）、例えば、約０．２ｃｍ（２ｍｍ）でありうる。

図２Ｄに示されるような１実施例において、経路長及びインキュベーション時間の変更を可能にするために、複数の層１１４を有するインライン管状ＣＶＩ反応器１００に加えて、複数のインライン管状ＣＶＩ反応器１００が、互いに直列に接続されうる。これは、１つ又は複数のフランジ付きコネクタ１１８によって達成されうる。１実施例において、少なくとも２つのインライン管状ＣＶＩ反応器１００、例えば少なくとも６つのインライン管状ＣＶＩ反応器１００が、互いに接続されうる。この特定の実施例において、インライン管状ＣＶＩ反応器１００の各端部の管状流路１１２は、インライン管状ＣＶＩ反応器１００から部分的に延びることができる（拡張セクション１１５）。拡張セクション１１５はまた、図２Ｂに示されるようにフランジ１２０を含みうる。１のコネクタ１１８は、水平方向の１の１８０°の曲がり部を含むことができ、及び／又は、「Ｕ」字の形状でありうる。コネクタ１１８の一つの端部は、第１のインライン管状ＣＶＩ反応器１００の管状流路１１２又はフランジ１２０に接続され得、コネクタ１１８の第２の端部は、隣接するインライン管状ＣＶＩ反応器１００の管状流路１１２又はフランジ１２０に接続されうる。

コネクタ１１８は、図２Ｄに示されるように、クランプ１２２によって、又は他の固定デバイス（例えば、ねじ、接着剤など）によって、各管状流路１１２又はフランジ１２０に接続されうる。１実施例において、ガスケットは、管状流路１１２の端部又はフランジ１２０とコネクタ１１８の各端部との間に配置されうる。

１実施例において、インライン管状ＣＶＩ反応器１００は、２０×４．９×２３ｃｍの本体又は設置面積を含むことができ、約１６．４３ｍの長さの流路１１２を含むことができ、その結果、約５２０ｍｌの流量が得られる。インライン管状ＣＶＩ反応器１００の本体は、図２Ｃに示されるように、第１側面１２４及び第２側面１２６を含みうる。１実施例において、第１側面１２４は、少なくとも１つの溝又は窪み１２４Ａを含むことができ、第２側面１２６は、少なくとも１つの突起１２６Ａを含むことができる。少なくとも１つの窪み１２４Ａ及び少なくとも１つの突起１２６Ａは、２つのインライン管状ＣＶＩ反応器１００が互いに向き合っている場合に、それら窪み１２４Ａ及び突起１２６Ａは整列され且つ１つのインライン管状ＣＶＩ反応器１００を隣接するインライン管状ＣＶＩ反応器１００に取外し可能に固定しうるように、配置されうる。
実施例

ＣＶＩ反応器を用いたパルストレーサー実験は、最初にＪＩＢをMilli-Q（商標）水（Barnstead Nanopure Water Purification System、Thermo Scientific会社、マサチューセッツ州ウォルサム）で洗い流し、続いて５０ｍｇ／ｍｌリボフラビンの１３ｍｌパルス注入、そして最後に蠕動ポンプ（520 IP31、Watson-Marlow Flow Technology Group会社、カリフォルニア州レイクフォレスト）を介してMilli-Q水で追跡することから成る。出口でのトレーサーの吸光度は、Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer(分光光度計)（Agilent Technologies会社、カリフォルニア州サンタクララ）と統合されたFlowVPE（C Technologies.会社、ニューヨーク州、ニュージャージー）流れセルユニットを用いて、波長３７２ｎｍで測定された。シリコーンチューブ０．２５インチID（Masterflex 96410-24、Cole-Parmer会社、イリノイ州、ヴァーノンヒルズ）が、ポンプを反応器に接続し、且つ反応器を分光光度計に接続するのに用いられた。
実施例１－計算流体力学

ＡＮＳＹＳFluent Workbench（ＡＮＳＹＳ流体力学ワークベンチ） v. 17.2の種輸送モデルが、ＪＩＢトレーサー実験をシミュレートするために用いられた。この作業では、ＣＶＩ反応器のＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ ＣＡＤの幾何形状が、ＡＮＳＹＳに直接インポートされた。ＣＦＤ（計算流体力学）の形状は、真直ぐな配管を入口と測定点の前に追加することによって、実験の設定と合致させられた。３Ｄ流れ領域は、ＡＮＳＹＳ ＭＥＳＨＩＮＧを用いて壁近傍の流れの物理を捕捉するために、管壁で用いられる高解像度のメッシュ要素を備えた六面体卓越の有限体積に分割された。具体的には、エッジに沿うインフレーションを有する非構造格子が出口面に適用され、分割のスイープ数によって規定される全てのクワッド自由面メッシュを用いて、ボディの残りの部分をスイープした。グリッドの独立性の検討は、セルボリュームの最大変化の２．５の比率に基づいて、１５０～６５０万要素の範囲で、グローバルメッシュ・リファインメントアルゴリズムを用いて実行された。圧力降下と出口速度を監視する定常状態シミュレーションは、グリッド細分化の各レベルで実行された。メッシュ独立性検討の結果は、更なる実験のために２５０万の要素で十分であることを示した。

計算モデルは、先ず定常状態について、速度場に関して１ｅ^－８の残差の収束基準を用いて解かれた。次に、上記定常状態の速度場は、０．８×１０^－９ｍ^２ｓ^－１の質量拡散係数を持つ１３ｍｌの体積パルストレーサーが反応器に注入される過渡モデルを初期化するために用いられた。実験の設定と一致させるために、上記トレーサーは、シミュレーションの開始時、即ち、ｔ＝０で、１３ｍｌの直管に含まれており、次にモデルはパルストレーサー体積が反応器を通過するのをシミュレートする。反応器の出口での表面モニターは、各時間ステップで出口でのトレーサーの質量加重モル濃度を記録した。ＡＮＳＹＳ Fluentは、以下の対流拡散方程式を用いて、i番目の種に対する対流拡散方程式の解を通して、各種の局所質量分率Ｙiを予測する。

上記の式において、Ｊ_ｉは、濃度の勾配による種ｉの拡散流束であり、ｖは、定常状態の速度場である。層流における質量拡散の濃度勾配による拡散を近似するために、ＡＮＳＹＳ Fluentは、次のように記述されるフィックの法則（Fick’s law）の希薄近似を解く。

ここで、Ｄi,mは、混合物中の種ｉの質量拡散係数である。
結果の例
流れ動力学の結果

ＪＩＢの定常状態の流れ場は、ＡＮＳＹＳソルバーを使用して計算され、システムの流れの動力学は、中心面の速度プロファイル、断面速度プロファイル、及び二次流れパターンを介して特徴付けられた。ＪＩＢの流れ力学の特性が、流路における曲率の追加が、層流レジームに特有の均一で高度に秩序化された運動を乱す程度を決定するために用いられた。ＪＩＢ中心線速度プロファイルは、図４Ａに示されように、入口に垂直な流路の中心面で測定された。図４Ａは、１００ｍｌ／分の体積流量でのＪＩＢの中心面速度分布を示している（線速度は０.０５２６ｍ／秒、Ｒeは３７５.５である）。図４Ａに示されたように、中心面の速度は、或る振動パターンを有しており、そこでは、最大速度の領域が、二次流れの生成に起因して、交互交代する２７０°曲がり部の外側に向かって連続的にシフトさせられている。速度分布は、中心線での最大速度の位置と大きさが、特有な放物線状の層流速度プロファイルから逸脱する流路の交互の曲率に応じて絶えず変化していることを示している。

図４Ｂにおいて、速度プロファイルの大きさは、２７０°曲がり部の０．７５８ｃｍ間隔でプロットされている。入口で（ここでは、流路が直線である）、速度プロファイルは、特有の層流放物線プロファイルであり、そこでは、中心線速度は０．１０５２ｍ／ｓ、又は平均０．０５２６ｍ／ｓの２倍である（図４Ｂの位置１）。以前に図４Ａ及び４Ｂの速度分布において示されたように、中心面での最大速度の位置が左から右にシフトし、曲がり部の外壁に向かって移動することをグラフで示している。図４Ｂにプロットされた間隔は、中心面での最大速度の大きさが、図４Ａの位置９に示されたように、特性値０．１０５２ｍ／ｓと比較された場合に減少し、且つ０．０７６ｍ／ｓ、即ち２７．８％低いことを更にグラフで示している。従って、層流レジーム（Ｒeは３７５．５）で動作しているにもかかわらず、ＲＯＣが１ｃｍの交互交代する２７０°曲がり部は、特有の放物線状の層流速度プロファイルを破壊し、最大中心線速度の大きさを減少させた。

ＪＩＢ流れ力学のより包括的な評価のために、断面軸方向速度分布及び二次流れの流線パターンが、Ｒｅが１８７．７及び３７５．５で計算的に評価された（図５）。図５において、曲がり部の中心と流れ反転点の前後の断面速度と二次流れ流線パターンの画像は、流路の曲率と流れの反転のために速度プロファイルと二次流れパターンが非常に不安定であることを示している。二次流れ線は、流体が入口の曲がり部の中心に到達すると対称であり、その後徐々に乱れ、流れが反応器を通過するときに渦巻きパターンの不均一な領域に分割される。この効果は、Ｒeが高いほど顕著になる。図５に示されたように、二次の通過線のこの非対称な挙動は、ディーン数の値が大きい場合（Ｄ＞１００）に予想される。この場合、屈曲部の外側で圧力差が大きくなり、二次流れが対流し、軸方向運動量のピークは、断面の中心からかなり離れる。

Ｒeが１８７．７及び３７５．５の両方について図５に見られるように、流れの反転は、二次流れの方向を変化させ、ひいては軸方向運動量ピーク又は最大速度の位置を変化させる。チャネルの一方の側から次の側への運動量ピークシフトの中間点は、図５の上部と下部の断面３と６に示されるように、交互交代する２７０°曲がり部の中心で発生する。図５における断面速度分布は、この中間点で最大速度の領域が垂直に分割されること、チャネルの上半分と下半分に２つのピーク速度領域を作り出すこと、半径方向の混合を示していることを表示している。

以前に図４においてプロットされた、位置３での速度プロファイルに示されたように、流れが曲がり部の変曲点に近づくと（図５の断面４）、最大速度は、Ｒeが１８７．７及び３７５．５について、それぞれ約０．０４１ｍ／秒及び０．０７９ｍ／秒に減少する。これらの値は、両方のＲe値で層流に特有な最大速度よりもそれぞれ２２％及び２４．９％低くなっている。このようにして、流路の曲率は、半径方向の混合を引き起こすだけでなく、断面の最大速度を低下させる。これらの要因の両方が、ＪＩＢのＲＴＤを狭めるために重要である。
滞留時間分布（ＲＴＤ）の結果

ＣＦＤトレーサーＲＴＤシミュレーションが、構築前のＪＩＢの特有な軸方向分散及び最小滞留時間（ＭＲＴ）を予測するために実施され、その後、実験的に検証された。これらのＣＦＤシミュレーションと実験データは、ＪＩＢの長さが１６．４３ｍで、交互交代する２７０°曲がり部が３２５回繰り返される場合について生成された。ＭＲＴは、最初のトレーサー流体要素が反応器を出る時間であり、

、この式で表されたＦ曲線（累積分布曲線）が０．００５に等しい（Ｆ_{０.００５}）時間として近似される。実験モデルとＣＦＤモデルとに関する無次元Ｅ曲線が、比較のために、図６（ａ）（ｂ）に示されるように、５０及び１００ｍｌ／分（Ｒeは１８７．７及び３７５．５）で夫々プロットされた。経験的データは、各流量に対して３回の実験の結果を平均することによって生成された。

ＣＦＤモデルの精度を定量的に決定するために、分散（σ２）、無次元分散、無次元最小滞留時間（θ_０.５％）、無次元最大滞留時間（θ_{９９.５％}）、相対幅、平均滞留時間、及びＭＲＴ値が計算され、表1に示すように２つの流量（５０及び１００ｍｌ／分）についての経験値と比較された。５０及び１００ｍｌ／分でのＣＦＤモデルによって生成された分散値は、表1に示されるように、それぞれ実験結果の１１％及び１５．８％以内である。５０及び１００ｍｌ／分でのＣＦＤモデルのＲwは、それぞれ実験データの８．６及び１０．１％以内であった。５０及び１００ｍｌ/分の場合に、ＣＦＤモデルは、９．１５分及び４．８３分のＭＲＴを予測したが、これは、それぞれ実験値（９．６２分及び５．０１分）の４．９％及び３．６％以内である（表１）。このようにして、ＣＦＤモデルは良好な精度で実行され、５０～１００ｍｌ／分の動作範囲に対して、ＪＩＢのＭＲＴ及びＲＴＤの分散は、４．９～１５．８％以内で予測する。

ＪＩＢにおける圧力損失の結果

湾曲したパイプにおいて、流れに対する抵抗は、流体に作用する外向きの力が半径方向の圧力勾配を引き起こすために、直線のパイプよりも大きい。したがって、例で使用されているＪＩＢの圧力降下は、同じ長さの直線状の管の圧力降下よりも大きかった。ここでの設計目標は、圧力降下値を最大５psiに制限することであった。ウイルス不活化工程における圧力損失は、連続的な下流プロセスでの全体的な圧力負荷に追加され、特に圧力に非常に敏感なインラインクロマトグラフィー工程に影響を与える。ＪＩＢ長さが１６．４３～１４８．５ｍの間で変化する場合（１～９個のＪＩＢ（５２０ｍｌ単位）に対応する）の圧力は、５０、１００、及び１５０ｍｌ／分での水で実験的に測定された。５０、１００、及び１５０ｍｌ／分での９個のＪＩＢの圧力値（レイノルズ数は１８７．７、３７５．５、及び５６３．２）は、それぞれ０．７４、１．９、及び３．４４ psiであった。これらは、ハーゲン・ポアズイユの法則によって計算された、同じ条件下での直線状の管の理論値である０．４５１、０．９０２、１．３５３ psiよりも６４％、１１０％、及び１５４％高くなっている。曲率はシステム内の混合を増加させる一方で、圧力降下の大幅な増加にも寄与し、この効果は、より高い流量でより顕著であることを示している。しかし、５０～１００ｍｌ／分の動作範囲内では、６０分のインキュベーション時間を提供する長さに関する圧力降下は、５ psi未満であり、これはそれぞれ約６６ｍ且つ０．４５psi～２１４．５ｍ且つ２．８psiに相当する。
スケーリング結果

ＪＩＢのＲＴＤ及びＭＲＴが長さとともにどのように拡大縮小するかを決定するために、表面モニターが、５０ｍｌ／分でシミュレートされたＲＴＤを測定するために、ＣＦＤモデルのＪＩＢ流路に沿って間隔を置いて配置された。図７Ａに示されるように、ＣＦＤモデルは、勾配０．０４５２を有する、長さに対する分散の線形関係を予測した。ＣＦＤモデルの実験的検証のために、パルストレーサー実験が、図２Ｄに示されたように、直列に接続された複数のＪＩＢ（１～７ユニット、即ち１６．４３～１１５ｍであり、それは３２５～２２７５（２７０°）ターンの曲がり部で構成されている）に対して、５０ｍｌ／分又はＲeが１８７．７で実施された。実験結果は、図７Ｂに示されるように、勾配０．０４４７を有する、長さと分散との間の線形関係を示した。ＣＦＤモデルの勾配は実験値の１．１２％以内であった。これは、ＣＦＤモデルを使用して、様々な長さでのＪＩＢのＲＴＤとＭＲＴとを正確に予測できることを示している。

さらに、無次元ＲＴＤ曲線（図７Ｃにプロットされている）は、反応器の長さが増加するにつれて、そのプロファイルは平均滞留時間（θ＝１）に対してより対称的になり且つより狭まることを示し、ＪＩＢの長さの増加に伴うプラグフローからの偏差が小さいことを示している。長さの増加に伴いプラグフローに向かうこの収束は、トレーサー要素がより多くの半径方向位置を、従ってより多くの速度プロファイルを、サンプリングする可能性があり、各トレーサー要素を同じ平均速度に近づけさせる。これは、理想的なプラグフロー容積（ここで、ｔ_min＝ｔ_mean）を超えて必要とされる追加の容積が、長さが長くなるにつれて減少することを意味する。このようにして、最小容積のプラグフロー反応器は、課せられた圧力制限を考慮して許容される最大の長さを有するものであろう。最大許容圧力を達成するために、最小の容積を有するプラグフロー反応器を達成するために、異なる流量に関する、管の直径、曲率の直径、及び長さを最適化することを想像できる。それでも、現在の設計は、試験された流量について最適に十分近い。ｔ_minはｔ_meanよりもわずか１５％小さい（表１を参照）。このようにして、ＪＩＢ容積のさらなる削減は、必要ではない。さらに、図７の無次元形式で示されているような実験データから決定された、７ユニット又は１１５ｍのＪＩＢ反応器の長さに関するＭＲＴは、７０．４±０．４６分であり、同じ５０ｍｌ／分の流量での同じ容量（実験容量３，６４２ｍｌ）についてのプラグフロー値７２．８４分からわずか２．４４分であった。ここで、プラグフローはＶ／Ｑであり、Ｖは容量、Ｑは流量である。
実施例からの結論

連続的な低ｐＨウイルス不活化のための連続流管状反応器、即ちＪＩＢが設計され、計算流体力学を使用して評価され、実験的検証のために３Ｄ印刷された。ＪＩＢの設計要件は、反応器の圧力降下を制限すること、及び下流の精製プロセスへの効率的統合化することを目的として生成された。即ち、ｉ）管の長さに沿って５ psi以下の圧力降下、（ii）可動部品なしで軸方向の分散を最小かするために、半径方向の混合を実現する、及び（iii）層流レジームで動作する。さらに、最小滞留時間（ＭＲＴ）アプローチが、所望の製品保持時間が満たされることを保証するために使用された。

ＪＩＢの流路は、交互交代する２７０°曲がり部する蛇行パターンで設計された。 ＣＦＤモデルが、湾曲したＪＩＢ流路形状によって生成されたディーン渦がＲＴＤに及ぼす影響を調査し定量化するために、使用された。ＣＦＤモデルの結果は、流路の曲率がディーン渦の生成をもたらすことを示し、流れ方向の変化が速度プロファイルを乱すことを確認した。速度プロファイルにおけるこれらの二次流れ及び運動量シフトは、受動的混合を示し、その結果、同じ長さの直線状管内の層流と比較したとき、軸方向の分散が減少し、ＲＴＤが狭くなる。ＣＦＤモデルの精度は、分散（σ^２）、無次元ＭＲＴ（θ_０．５％）、及び無次元最大滞留時間（θ_{９９.５％}）についての実験値と計算値とを比較して定量的に示された。分散値は、モデルと実験のデータの間で１５．８％以内の精度であった。

ＣＶＩ反応器（即ちＪＩＢ）は、ある範囲の流量での流れ力学、圧力降下、及びＲＴＤに関して特徴づけられた。設計は、コンパクトで、柔軟性があり、モジュール式で、スケーラブルであり、容易にプロセスの統合を可能にする。ＲＴＤ曲線はプラグフローに近い挙動を示し、ＭＲＴは、Ｆ曲線応答を介して簡単に決定され、且つＣＦＤモデルを用いて予測されうる。

前述の説明から、当業者は、本教示が様々な形態において実施されうることを理解することができる。従って、これらの教示は特定の実施形態及びその例に関連して説明されてきたが、本教示の真の範囲は、そのように限定されるべきではない。本明細書の教示の範囲から逸脱しない限り、様々な変更及び修正が行なわれてよい。

本開示の範囲は、広く解釈されるべきである。本開示は、本明細書に開示された装置、動作、及び機械的作用を達成するための同等物、手段、システム、及び方法を開示することが意図されている。開示された各装置、物品、方法、手段、機械的要素、又は機構について、本開示はまた、その開示及び教示において、本明細書に開示された多くの実施態様、機構、及び装置を実施するための同等物、手段、システム、及び方法を包含することが意図されている。さらに、本開示は、コーティング及びその多くの側面、特徴、及び要素を考慮する。そのような装置は、その使用及び操作において動的でありうる。本開示は、同等物、手段、システム、及び製造装置及び／又は製造物品の使用の方法、並びに本明細書に開示された操作及び機能の記載及び精神と一致するその多くの側面を包含することが意図されている。本出願の請求項は同様に広く解釈されるべきである。

本明細書の多くの実施形態における本発明の説明は、本質的に単なる例示であり、したがって、本発明の要旨から逸脱しない変形は、本発明の範囲内にあることが意図されている。そのような変形は、本発明の精神及び範囲からの逸脱と見なされるべきではない。

Claims (19)

1. ウイルス不活性化装置であって、
   入口と出口との間に蛇行パターンを形成する交互交代する曲がり部の組を備えた管状流路を含む、少なくとも１つの連続ウイルス不活化反応器、
   を備え、
   前記管状流路は、０．６ｃｍ～０．７ｃｍの直径を含み、
   前記交互交代する曲がり部の組は、少なくとも２つの積み重ねられた層に垂直に分割されており、
   前記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、０．７ｃｍ～１．２ｃｍの厚さを含む、ウイルス不活性化装置。
2. 前記少なくとも１つの連続ウイルス不活化反応器は、インライン管状連続ウイルス不活化反応器である、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
3. 前記交互交代する曲がり部の組は、２７０°～２８０°の角度を有する少なくとも２つの交互交代する曲がり部を含む、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
4. 前記交互交代する曲がり部の組は、２７０°～２８０°の角度を有する２～３２５の交互交代する曲がり部を含む、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
5. 前記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、単一面内に１２．５の交互交代する曲がり部を含み、前記交互交代する曲がり部の各々は、２７０°～２８０°の角度を含む、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
6. 前記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、前記管状流路の１つの１８０°曲がり部を介して互いに接続されている、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
7. 前記少なくとも２つの積み重ねられた層は、前記管状流路の２５個の１８０°曲がり部を介して互いに接続された２６層である、請求項６に記載のウイルス不活性化装置。
8. 前記少なくとも１つの連続ウイルス不活化反応器は、直列に接続された２～６のウイルス不活化反応器を含む、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
9. 前記交互交代する曲がり部の組は、渦を生成して、１８７．７～３７５．５のレイノルズ数を備える層流を有する生成物ストリームの混合を誘発するように配置されている、請求項１に記載のウイルス不活性化装置。
10. ウイルス不活化装置であって、
    第１の静的混合器と流体連絡する入口と、第２の静的混合器と流体連絡する出口とを有する低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器、
    を含み、
    ここで、前記低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器は、交互交代する曲がり部の組で形成された管を含み、
    前記管は、０．６ｃｍ～０．７ｃｍの直径を含み、
    交互交代する前記曲がり部の組は、少なくとも２つの積み重ねられた層に垂直に分割されており、
    前記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、０．７ｃｍ～１．２ｃｍの厚さを含む、ウイルス不活性化装置。
11. 前記交互交代する曲がり部の組における各曲がり部が、２７０°～２８０°までの角度を含む、請求項１０に記載のウイルス不活性化装置。
12. 前記交互交代する曲がり部の組は、０．８５ｃｍ～２ｃｍの曲率半径を含む、請求項１０に記載のウイルス不活性化装置。
13. 前記管は、３２５の交互交代する曲がり部を含む、請求項１０に記載のウイルス不活性化装置。
14. 前記管は、２５個の管状流路であって、その各々が１つの１８０°曲がり部を有しているものによって、互いに接続された２６層の垂直層に分割されている、請求項１０に記載のウイルス不活性化装置。
15. 前記管は、少なくとも１２．５回の交互交代する曲がり部を単一の面内に含んでいる、請求項１０に記載のウイルス不活性化装置。
16. 前記低ｐＨ連続ウイルス不活化反応器は、直列に接続された２～６のウイルス不活化反応器を含んでいる、請求項１０に記載のウイルス不活性化装置。
17. 生成物ストリームの連続低ｐＨウイルス不活化のための方法であって、
    前記生成物ストリームを、そのｐＨを所定のウイルス不活化ｐＨにまで下げるために、第１の静的混合器に導入すること、
    不活性化されるために前記第１の静的混合器を出る前記生成物ストリームを、単一面内に複数の曲がり部の組を有する管の入口に導入すること、
    ここで、前記管は、０．６ｃｍ～０．７ｃｍの直径を含み、
    交互交代する前記曲がり部の組は、少なくとも２つの積み重ねられた層に垂直に分割されており、
    前記少なくとも２つの積み重ねられた層の各々は、０．７ｃｍ～１．２ｃｍの厚さを含み、
    前記生成物ストリームをウイルス不活化条件下で前記管を通して流すこと、及び
    前記生成物ストリームを前記管の出口を通して前記管から出すこと、
    を包含し、
    ここで、前記生成物ストリームの前記ｐＨを下げるために、低ｐＨ緩衝液が前記第１の静的混合器に導入される、方法。
18. 単一面内の前記複数の曲がり部は、蛇行パターンを形成している、請求項１７に記載の方法。
19. 前記生成物ストリームは、プロテインＡ捕捉器から前記第１の静的混合器に導入される、請求項１７に記載の方法。

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