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JP7434742B2 - 核酸の検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription-polymerase chain reaction、ＲＴ－ＰＣＲ）による検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法および該方法を実行するためのキットに関する。より具体的には、検体と混合し、分析試料である遠心上清を得るための精製水、生理食塩水または緩衝液が、予め内部コントロールＤＮＡ、該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーから選ばれる少なくとも１つの要素を含み、一方、ＲＴ－ＰＣＲ反応液は、前記精製水、生理食塩水または緩衝液に含まれる前記要素を含まないことを特徴とする検査方法、および該方法を実行するためのキットに関する。
細菌またはウイルスによる感染の防止および感染の拡大を防止するためには、細菌またはウイルスの感染者または細菌またはウイルスによる汚染物を特定することが重要である。該汚染物としては、感染者の糞便または吐物およびこれらに直接的または間接的に汚染された物品類、ならびに細菌またはウイルスに汚染された食品類などが挙げられる。
細菌またはウイルスの検出法には様々な方法があるが、迅速に測定する方法としては、ＰＣＲ法による核酸検出法が普及している。例えば、ＲＮＡウイルスであるノロウイルスを迅速に高感度で測定する手段として、ノロウイルスのＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる（特許文献１および２、非特許文献１）。国内においては、厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課による通知（非特許文献２および３）に準拠して、ＲＴ－ＰＣＲ法によるノロウイルスの検出およびリアルタイムＰＣＲ法によるノロウイルスの定量的検出が広く行われており、ノロウイルス検出キットも市販されている。
微生物である細菌またはウイルスの汚染を検査する対象が糞便などの排泄物である場合、通常、糞便を精製水または生理食塩水などに懸濁した糞便乳剤を高速遠心分離し、得られた遠心上清を検体として、ＰＣＲまたはＲＴ－ＰＣＲにより、微生物に由来する遺伝子の分析が行われている。一般に、市販の核酸検査用キットには、内部コントロールＤＮＡが含まれており、ＰＣＲ反応系に添加することにより、核酸の検出が適切に行われているか否か、すなわちＰＣＲ反応が適切に進行したか否かを判断するための指標として用いられる。その結果、検体中の微生物由来の核酸に対する増幅曲線または増幅産物の融解曲線ピークが検出されない場合であっても、内部コントロールＤＮＡの増幅曲線または増幅産物の融解曲線ピークが検出される場合には、微生物汚染に対して真の陰性であると判定される。また、検体に由来する成分によってＰＣＲ反応が阻害されると、検体中の微生物由来の核酸は検出されないが、内部コントロールＤＮＡが共存すれば、内部コントロールＤＮＡも検出されないため、検体の微生物汚染が陰性であると誤判定される事態（偽陰性）を避けることができる。
ＷＯ２００２／０２９１１９ ＷＯ２００２／０２９１２０
Kageyama T, et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol. 2003 Apr;41(4):1548-57. 厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課 食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発０５１４００４号（平成１９年５月１４日） 厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課 食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発１０２２第１号（平成２５年１０月２２日）
通常、核酸検査用キットには、内部コントロールとしての鋳型ＤＮＡおよびプライマーなどのＰＣＲ反応が進行する要素のすべてが、ＰＣＲ反応液またはＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる。そのため、微生物汚染を検査すべき検体が、分析作業上の人為的エラーなどによりＰＣＲ反応液またはＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加されなかった場合であっても、内部コントロールＤＮＡの増幅曲線または増幅産物の融解曲線ピークが検出されるため、分析対象の検体に微生物由来の遺伝子が存在したとしても、検査結果は陰性となり、誤った判定（偽陰性）に至る。
本発明の目的は、検体が、人為的エラーによって、ＰＣＲ反応液またはＲＴ－ＰＣＲ反応液へ添加されず、その結果として、検体の微生物汚染が陰性と判定される偽陰性を防止する方法および該方法を実行するための検査用キットを提供することにある。
本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（１）検体を、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む精製水、生理食塩水または緩衝液に懸濁する工程；
（２）工程（１）で得られた懸濁液の遠心上清を抽出する行程、
（３）工程（２）で抽出した遠心上清と、検体処理液とを混合する工程、
（４）工程（３）で得られた混合液を、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液であって、工程（１）で選ばれた要素を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行う工程；および、
（５）前記ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程；
を含む方法。
〔２〕
前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、〔１〕に記載の方法。
〔５〕
前記ノロウイルスの遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕
前記工程（３）における検体処理液が、１種以上の界面活性剤を含む、〔１〕に記載の方法。
〔７〕
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、〔６〕に記載の方法。
〔８〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、〔７〕に記載の方法。
〔１０〕
前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕
前記界面活性剤の濃度が、０．０２～０．５％（w/v）である、〔６〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕
前記工程（３）における検体処理液が、水酸化物を含む、〔１〕に記載の方法。
〔１３〕
前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕
前記水酸化物の濃度が、１０～１００ｍＭである、〔１２〕または〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕
前記工程（３）における遠心上清と検体処理液との混合比が、体積比として１：３～６である、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕
前記工程（３）における検体処理液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるSample Treatment Reagentである、〔１〕に記載の方法。
〔１７〕
前記工程（４）における１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物であって、前記工程（１）で選ばれた要素を含まない混合物である、〔１〕に記載の方法。
〔１８〕
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔１〕に記載の方法。
〔１９〕
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔１〕に記載の方法。
〔２０〕
前記工程（５）におけるＲＴ－ＰＣＲ産物の検出が、リアルタイム測定によりモニターされる、〔１〕に記載の方法。
〔２１〕
前記リアルタイム測定において、蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線または融解曲線におけるピークを測定することにより、検体におけるＲＮＡの存在が、陽性または陰性であることを判定する、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕
前記リアルタイム測定において、内部コントロールＤＮＡに対するＰＣＲ産物の増幅曲線または融解曲線におけるピークを測定することにより、検体に対する再検査が必要であるか否かを判定する、〔２０〕または〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕
検体中のＲＮＡウイルス検出用キットであって、
（１）内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む精製水、生理食塩水または緩衝液；
（２）検体処理液；および、
（３）逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液であって、（１）で選ばれた要素を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液；
を含む、キット。
〔２４〕
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔２３〕に記載のキット。
〔２５〕
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔２３〕に記載のキット。
〔２６〕
前記検体処理液が、１種以上の界面活性剤を含む、〔２３〕に記載のキット。
〔２７〕
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、〔２６〕に記載のキット。
〔２８〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる、〔２７〕に記載のキット。
〔２９〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、〔２７〕に記載のキット。
〔３０〕
前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、〔２９〕に記載のキット。
〔３１〕
前記検体処理液が、水酸化物を含む、〔２３〕に記載のキット。
〔３２〕
前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、〔３１〕に記載のキット。
〔３３〕
前記検体処理液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるSample Treatment Reagentである、〔２３〕に記載のキット。
〔３４〕
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物であって、前記（１）で選ばれた要素を含まない混合物である、〔２３〕に記載のキット。
本発明によれば、工程（１）において、検体を懸濁するために使用される精製水、生理食塩水または緩衝液は、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む。一方、工程（４）において使用されるＲＴ－ＰＣＲ反応液は、工程（１）で使用される精製水、生理食塩水または緩衝液に加えられる要素を含まない。したがって、内部コントロールＤＮＡの増幅は、検体と前記精製水、生理食塩水または緩衝液との懸濁液の遠心上清が、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加された場合にのみ生じる。内部コントロールＤＮＡの増幅が生じない場合は、ＲＴ－ＰＣＲ反応に検体が供されていないことを示す。このようにして、検体がＲＴ－ＰＣＲ反応液へ添加されないことにより、検体が正しく分析されないという人為的エラーが検知され、微生物汚染についての偽陰性の判定が防止される。
ノロウイルスを含む糞便を、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーの各要素を含む蒸留水に懸濁し、得られた懸濁液の遠心上清を検体処理液と混合した。本図は、得られた混合液を、前記要素を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加して行ったリアルタイムＰＣＲにおける増幅曲線を示す図である。 ノロウイルスを含まない糞便を、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーの各要素を含む蒸留水に懸濁し、得られた懸濁液の遠心上清を検体処理液と混合した。本図は、得られた混合液を、前記要素を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加して行ったリアルタイムＰＣＲにおける増幅曲線を示す図である。 蒸留水を、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーを含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加して行ったリアルタイムＰＣＲにおける増幅曲線を示す図である。
本発明は、検体中のＲＮＡウイルスの存在を、検体中のＲＮＡウイルスから抽出したＲＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲにより増幅することにより検出する検査方法であって、測定系に検体が加えられないまま検査され、誤った検査結果を与えるという人為的エラーを防止する方法である。
本発明において、検出対象となるＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持つコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスなど、またエンベロープを持たないノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明における検体としては、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料などが挙げられる。生物試料としては、貝類の中腸腺などを含む動植物組織および血液、唾液、鼻汁、組織分泌液などの体液が含まれる。例えば貝類は、ノロウイルスよる食中毒の原因食品として最も重要視されている。生物由来試料としては、前記生体試料またはその懸濁液に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。環境試料としては、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が挙げられる。環境由来試料としては、前記環境試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。
本発明の別の実施態様として、検体としては、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物試料、嘔吐物由来試料、唾液などの体液試料および体液試料由来試料などが挙げられる。排泄物由来試料および嘔吐物由来試料には、拭き取り試料が含まれる。拭き取り試料とは、細菌またはウイルス汚染の確認を目的として、手指、食器、まな板、包丁、調理設備、トイレ設備、住宅設備などを綿棒、カット綿などで拭き取ったものをリン酸緩衝液などに溶出させたものである。得られた溶出液は超遠心分離し、遠心沈渣としたものを検体として使用することができる（宗村佳子ら、食品衛生学雑誌、2017 年 58 巻 4 号 p.201-204）。
本発明の方法における工程（１）において、排泄物試料、嘔吐物試料および体液試料などの検体は、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む精製水、生理食塩水または緩衝液に、５～１０％（ｗ／ｖ）で懸濁して乳剤または懸濁液とする。前記精製水は、イオン交換、蒸留、逆浸透または限外ろ過などを単独または組み合わせたシステムにより、常水より製造したものである。前記緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられる。前記乳剤または懸濁液は、前記工程（２）において、例えば10000～12000 rpmで２～２０分間遠心分離を行い、得られた遠心上清を、前記工程（３）において使用する。
本発明の工程（３）において、検体処理液を使用することにより、検体に含まれるＲＮＡウイルスからＲＮＡを抽出することができる。本発明の一実施態様において、工程（２）において使用される検体処理液は、１種以上の界面活性剤を含む。本明細書において「界面活性剤」とは、物質の境界面に作用し、性質を変化させる物質の総称である。界面活性剤は、分子内に親水性部分と疎水性部分の両方を持つ構造を有するである。界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤および非イオン界面活性剤に分類される。陰イオン界面活性剤としては、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルサルフェートとしては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）およびドデシル硫酸アンモニウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウムがより好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、ラウリル硫酸ナトリウム（Sodium Lauryl Sulfate、ＳＬＳ）とも称される。陽イオン界面活性剤としては、エチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性界面活性剤としては、例えば、ベタインおよびアルキルアミノ脂肪酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン界面活性剤としては、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ－４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（登録商標））などが挙げられるが、これらに限定されない。
界面活性剤は、水溶液中で一定濃度以上を添加すると、界面活性剤モノマーが集合してミセルを形成する。界面活性剤がミセルを形成するようになる濃度は、臨界ミセル濃度と呼ばれる。水溶液中で、界面活性剤ミセル内部の疎水性領域に、タンパク質や脂質の疎水性領域が取り込まれ、タンパク質や脂質は可溶化される。ＲＮＡウイルス粒子において、タンパク質の殻であるカプシドや脂質からなるエンベロープは、臨界ミセル濃度以上の界面活性化剤の存在下で可溶化され、変性され、または破壊される。その結果、カプシドに封入されたＲＮＡが、水溶液中で露出した状態になりやすくなる。界面活性剤の臨界ミセル濃度は界面活性剤の種類によって異なるが、ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、検体処理液中での界面活性剤の濃度が０．０２～０．５％（w/v）であることが好ましく、０．０５～０．２％（w/v）がより好ましく、０．１％（w/v）がさらに好ましい。
本発明の工程（３）において、工程（２）で得られた遠心上清と検体処理液との混合比は、好ましくは体積比として１：３～６であり、より好ましくは１：４である。遠心上清と界面活性化剤を含む検体処理液とを混合することにより、混合液中の界面活性剤の濃度が低下するが、界面活性剤の上記濃度は、臨界ミセル濃度を維持するものである。
本発明の一実施態様において、前記検体処理液は水酸化物を含む。本明細書において「水酸化物」とは、陽イオンとして金属イオンと、陰イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ－）とがイオン結合した物質を指す。金属は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属である。水酸化物としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムおよび水酸化バリウムが例示されるが、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムが好ましい。水酸化物は強塩基性を示し、水に溶解すると水酸化物イオンを生じるため、アルカリとも呼ばれる。水酸化物は、水溶液中でタンパク質分子中の、アスパラギン酸、グルタミン酸などの解離性アミノ酸の荷電状況を変化させ、タンパク質を変性させる。この作用により、ＲＮＡウイルス粒子をアルカリ処理するとカプシドの破壊が生じる。その結果、カプシドに封入されたＲＮＡが、水溶液中で露出した状態になりやすくなる。ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、検体処理液中での水酸化物濃度は、好ましくは１０～１００ｍＭであり、より好ましくは４０～６０ｍＭであり、５０ｍＭがさらに好ましい。
カプシドや脂質からなるエンベロープを可溶化させ、変性させ、または破壊し、ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、前記検体処理液において界面活性剤と水酸化物とが共存することが好ましい。
カプシドよりウイルスＲＮＡを効率よく露出させるための本発明の工程（３）は、１～６０℃の温度下で行うことが好ましく、１～５０℃で行うことがより好ましく、１～４０℃で行うことがさらに好ましく、１～３０℃の室温で行うことが最も好ましい。工程（２）で得られた遠心上清と検体処理液とを混合した後は、３分間以上放置することが好ましい。
ＲＮＡウイルスからのＲＮＡ抽出には、市販されるノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ、241-09325-91または241-09325-92）に含まれる試薬Sample Treatment Reagentを用いることができる。この場合、本キット取扱説明書にしたがってＲＮＡを抽出することができる。
ＲＮＡウイルスからＲＮＡを抽出するための検体処理液は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合した場合であっても、ＲＴ－ＰＣＲ反応を阻害しない、またはほとんど阻害しないものであって、ＲＮＡの抽出を可能にするものであれば、特に限定されない。
前記工程（３）において、前記工程（２）で抽出した遠心上清と検体処理液との混合液は、ＲＮＡウイルスからのＲＮＡ抽出効率を上げるため熱処理することができる。熱処理としては、例えば、９０℃で５分間の加熱処理が挙げられるが、加熱温度および加熱時間は、ＲＮＡ抽出効率を向上させるために変化させることができる。
本発明の一実施態様において、検体は、試料から分離し、精製したＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、フェノール抽出／水溶性有機溶媒沈殿による方法（特許5572578）、カオトロピック塩溶液からの沈殿、シリカへの吸着による方法などにより精製することができる。カオトロピック塩溶液としては、フェノール-グアニジン法に基づくTRIzol（登録商標、Invitrogen社）およびISOGEN（ニッポン・ジーン社）などを使用してもよい。シリカへの吸着による方法としては、市販されるスピンカラムを使用することができる。例えば、NucleoSpin RNA（登録商標、タカラバイオ社）およびPureLink（登録商標、ThermoFisher社）が挙げられる。このようにＲＮＡを抽出し、精製するための様々な方法があるが、これらは当業者には周知である。
本発明の一実施態様において、検体中のＲＮＡが、試料から分離し、精製したＲＮＡである場合、本発明の工程（２）および（３）を実行することなく、工程（１）で得られる溶液を、直ちに工程（４）のＲＴ－ＰＣＲに供してもよい。
検体中のＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ法により検出するために、前記工程（４）において使用される１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液の組成は、当業者であれば周知技術に基づいて構築することができる。本発明の一実施態様において、市販されるノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ、241-09325-91または241-09325-92）に含まれる試薬を使用することができる。１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、本キットに含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物を用いることができる。NoV Reagent Aは、マグネシウムイオン、カリウムイオンおよびトリスを含有する。NoV Reagent Bは、逆転写反応プライマー、逆転写反応により生成したｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマー、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーを含むが、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーから選ばれる要素であって、工程（１）において使用する精製水、生理食塩水または緩衝液に添加された要素が除去される。NoV Reagent Cは、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む。１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応においては、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ混合されていることより、逆転写反応（１本鎖ｃＤＮＡ合成）およびＰＣＲを同一容器内で行うことができる。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡを鋳型として、１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する酵素であり、逆転写反応を触媒する限り特に限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体を使用することができるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるため、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、例えば抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲにおいて、最初の変性ステップ（９０℃以上）を経た後にＤＮＡポリメラーゼが活性化される酵素である。
前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、逆転写反応およびＰＣＲが適切な条件で遂行されるためのすべての成分が含まれる。該成分として、少なくとも前記逆転写酵素、逆転写反応プライマー、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰミックス（deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）および緩衝液が含まれる。前記反応液には、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することもできる。逆転写反応プライマーとしては、標的ＲＮＡの配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを使用することができる。ＰＣＲプライマーとしては、逆転写反応により生成したｃＤＮＡの配列に特異的なプライマー対（フォワードおよびリバース）が使用される。ＰＣＲプライマーは、標的ＲＮＡの配列に特異的な前記逆転写反応プライマーと同一であってもよい。また、前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、増幅するＤＮＡ領域、すなわち標的配列の数に応じて２種類以上のＰＣＲプライマーを添加してもよい。検査対象がノロウイルスである場合、前記成分を含んだ組成物として、市販のノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ、241-09325-91または241-09325-92）に含まれるNoV Reagent A、BおよびCを、キット取扱説明書にしたがって混合した混合物を、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液として使用することができる。なお、前記した通り、内部コントロールＤＮＡまたは該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードもしくはリバースプライマーであって、工程（１）において使用する精製水、生理食塩水または緩衝液に添加された要素は除去される。
ノロウイルスＲＮＡを検出する場合、例えば、特許文献１および２、非特許文献３ならびに特開２０１８－７８８０６に記載のＰＣＲプライマーを使用することにより、ノロウイルス遺伝子型におけるジェノグループＩ（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）を検出することができるが、これらに限定されない。前記ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）には、非特許文献３に記載のＰＣＲプライマーが含まれる。
本発明の一実施態様において、前記工程（３）における検体処理液が界面活性剤としてＳＤＳを含む場合、タンパク質に対する変性効果が強いＳＤＳが、前記工程（４）に高い濃度で持ち込まれると、前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害し、ＲＴ－ＰＣＲが進行しない可能性がある。同様に、本発明の一実施態様において、工程（３）における検体処理液が水酸化物を含む場合、前記工程（４）に持ち込まれる水酸化物濃度が高いと、高ｐＨによる前記酵素活性の低下を招く。このため、前記工程（４）において、工程（３）で得られる混合液と前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液との混合比は、好ましくは体積比として１：２～６であり、より好ましくは１：４である。
ＲＴ－ＰＣＲにおける逆転写反応の反応温度条件、およびＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。
本発明の一実施態様において、前記工程（５）におけるＲＴ－ＰＣＲ反応により生成されるＲＴ－ＰＣＲ産物は、リアルタイム測定によりモニターされる。該リアルタイム測定を行う場合、ＲＴ－ＰＣＲおよび該ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程は同一容器内で行われる。
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲでは、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用されるが、これに限定されるわけではない。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。また温度解離曲線解析を行い、ピーク検出温度（核酸のＴｍ値）を測定してもよい。
蛍光標識プローブとしては、TaqManプローブ、Molecular Beacon、サイクリングプローブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。TaqManプローブは、5’末端が蛍光色素で、また3’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。TaqManプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたTaqManプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、TAMRA（登録商標）およびMGBが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上のＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばTaqManプローブ）を用いてＰＣＲを行う。
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定において、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターする。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における分析対象の遺伝子の存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。温度解離曲線解析においては、所定の温度ピークが観察される場合は、分析対象の遺伝子の存在が陽性であると判定され、所定の温度ピークが観察されない場合には、分析対象の遺伝子の存在が陰性であると判定される。
本発明の一実施態様において、ＲＴ－ＰＣＲ法によるＲＮＡウイルス検出用キットが提供される。該キットに含まれ、検体を懸濁するために使用される精製水、生理食塩水または緩衝液は、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む。一方、前記キットに含まれる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素であって、前記精製水、生理食塩水または緩衝液に含まれる要素が含まれない。このため、検体を含む検体処理液と１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とが混合されなければ、内部コントロールＤＮＡの増幅が観察されず、それと同時に、検体に由来する核酸の増幅も観察されない。このような結果が得られた検査は、ＲＴ－ＰＣＲ反応が進行しなかった検査または人為的エラーによってＲＴ－ＰＣＲ反応に検体が供されなかった検査と判定されるので、検体に対する再検査が必要であることが示される。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらよって限定されない。
（１）検体
検体であるノロウイルス感染患者の糞便を１００ｍｇ採取し、１ｍＬの蒸留水に懸濁して、約１０％（ｗ／ｖ）の糞便乳剤とした。使用した蒸留水には、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）のNoV Reagent Bに含まれる内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーを予め添加した。得られた糞便乳剤を、微量遠心分離機により１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遠心上清を得た。
（２）検体処理
下記の成分を蒸留水に添加し、検体処理液を調製した。
５０ｍＭ 水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、
０．１％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および
６２５μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）
検体処理は、蓋なしＰＣＲ反応チューブに上記検体処理液４μＬを取り、そこへ、（１）で得られた糞便乳剤の遠心上清１μＬを加えた後、室温で３分間放置することにより行った。
（３）１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応
（２）で得られた、糞便乳剤の遠心上清と検体処理液との混合液５μLを含むＰＣＲ反応チューブに、下記反応液組成になるように調製した１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液であって、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーを含まないＲＴ－ＰＣＲ反応液２０μＬを添加し、撹拌混合した後、小型遠心分離器によりスピンダウンした。この後、リアルタイムＰＣＲ装置（GVP-9600、島津製作所）を用いて、直ちにＲＴ－ＰＣＲ反応をモニターした。反応は、４５℃／５分間の逆転写反応後、９５℃／３分間の初期変性を行い、次いで９５℃／1秒間－５６℃／1０秒間のＰＣＲを４５サイクル行い、増幅曲線を測定した。ＰＣＲにおける測光は、５６℃／１０秒間のステップで行った。
（反応液組成）
４０ｍＭ トリス
０．０２５ユニット／μＬ Ｔａｑポリメラーゼ
１ユニット／μＬ 逆転写酵素
３．７５ｍＭ 塩化マグネシウム
４００ｎＭ ＰＣＲプライマーセット（ＣＯＧ１Ｆ／ＣＯＧ１ＲおよびＣＯＧ２Ｆ／ＣＯＧ２Ｒ）（非特許文献３、表１１を参照）
２００ｎＭ 蛍光標識プローブ（TaqManプローブ：Ｇ１Ａ、Ｇ１ＢおよびＧ２）
（４）結果
測定結果を図１に示した。内部コントロールＤＮＡに帰属される増幅曲線が検出されることから、ＰＣＲ反応が進行していることが示された。その上で、ノロウイルス遺伝子に帰属される増幅曲線が検出されることから、検査に供した検体はノロウイルス陽性と判定される。
ノロウイルスに感染していない健常人の糞便を使用した以外は、実施例１と同様にして検査を行った。測定結果を図２に示した。図２より、内部コントロールＤＮＡに帰属される増幅曲線が検出されることから、ＰＣＲ反応が進行していることが示された。一方、ノロウイルス遺伝子に帰属される増幅曲線は検出されなかったことから、検査に供した検体はノロウイルス陰性と判定される。
実施例１で調製された糞便乳剤の遠心上清が、ＲＴ－ＰＣＲ反応に供されない場合について検討した。内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーを含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、実施例１と同様にして調製した。実施例１に記載される検体処理液のみを含むＰＣＲ反応チューブに、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液のみを添加し、実施例１と同様にして反応を行った。
測定結果を図３に示した。ノロウイルス遺伝子に帰属される増幅曲線が検出されないという結果からは、ノロウイルス陰性と判定される。しかしながら、内部コントロールＤＮＡに帰属される増幅曲線も検出されないことから、ＲＴ－ＰＣＲ反応に対して、前記糞便乳剤の遠心上清が添加されていないことが示される。すなわち、検体が検査に供されていないことが示される。したがって、前記のノロウイルス陰性の判定は、偽陰性であり、検体に対する再検査が必要であることを示す。

Claims (30)

  1. 検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
    （１）検体を、内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む精製水、生理食塩水または緩衝液に懸濁する工程；
    （２）工程（１）で得られた懸濁液の遠心上清を抽出する工程；
    （３）工程（２）で抽出した遠心上清と、検体処理液とを混合する工程；
    （４）工程（３）で得られた混合液を、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液であって、工程（１）で選ばれた要素を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合し、ＲＴ－ＰＣＲを行う工程；および、
    （５）前記ＲＴ－ＰＣＲ産物を検出する工程；
    を含む方法。
  2. 前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ノロウイルスの遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記工程（３）における検体処理液が、１種以上の界面活性剤を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる、請求項７に記載の方法。
  9. 前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、請求項７に記載の方法。
  10. 前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記界面活性剤の濃度が、０．０２～０．５％（w/v）である、請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記工程（３）における検体処理液が、水酸化物を含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記水酸化物の濃度が、１０～１００ｍＭである、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記工程（３）における遠心上清と検体処理液との混合比が、体積比として１：３～６である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
  18. 前記工程（５）におけるＲＴ－ＰＣＲ産物の検出が、リアルタイム測定によりモニターされる、請求項１に記載の方法。
  19. 前記リアルタイム測定において、蛍光フィルターを用いてＲＴ－ＰＣＲ産物の増幅曲線または融解曲線におけるピークを測定することにより、検体におけるＲＮＡの存在が、陽性または陰性であることを判定する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記リアルタイム測定において、内部コントロールＤＮＡに対するＰＣＲ産物の増幅曲線または融解曲線におけるピークを測定することにより、検体に対する再検査が必要であるか否かを判定する、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 検体中のＲＮＡウイルス検出用キットであって、
    （１）内部コントロールＤＮＡならびに該ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするフォワードおよびリバースプライマーからなる群より選ばれる少なくとも１つの要素を含む精製水、生理食塩水または緩衝液；
    （２）検体処理液；および、
    （３）逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼと、逆転写反応プライマーおよびＰＣＲプライマーの少なくとも一方とを含む１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液であって、（１）で選ばれた要素を含まない１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液；
    を含む、キット。
  22. 前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項２１に記載のキット。
  23. 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項２１に記載のキット。
  24. 前記検体処理液が、１種以上の界面活性剤を含む、請求項２１に記載のキット。
  25. 前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項２４に記載のキット。
  26. 前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる、請求項２５に記載のキット。
  27. 前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、請求項２５に記載のキット。
  28. 前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、請求項２７に記載のキット。
  29. 前記検体処理液が、水酸化物を含む、請求項２１に記載のキット。
  30. 前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項２９に記載のキット。
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