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JP7411575B2 - Ｏｘ４０に対する完全ヒト抗体、それを調製する方法、およびその使用 - Google Patents

Ｏｘ４０に対する完全ヒト抗体、それを調製する方法、およびその使用 Download PDF

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JP7411575B2 JP2020564430A JP2020564430A JP7411575B2 JP 7411575 B2 JP7411575 B2 JP 7411575B2 JP 2020564430 A JP2020564430 A JP 2020564430A JP 2020564430 A JP2020564430 A JP 2020564430A JP 7411575 B2 JP7411575 B2 JP 7411575B2
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Description

優先権の主張
本出願は、２０１８年５月１１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０８６５７４号および２０１８年５月２９日に出願された中国出願第２０１８１０５２９８４０．５号に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、配列表を含み、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本出願は、概して、抗体に関する。より具体的には、本出願は、ＯＸ４０に対する完全ヒトモノクローナル抗体、それを調製する方法、およびその使用に関する。
発明の背景
免疫チェックポイントを標的とすることが、がんを有する患者を処置するのにもっとも有望なアプローチとなっていることを示している、前臨床および臨床結果による根拠が増加している。免疫チェックポイントタンパク質の１つである腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４、およびＡＣＴ３５としても知られている）は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を増強させ、それらの活性化をもたらすことにより、Ｔ細胞機能において主要な役割を果たす。
ＯＸ４０は、主として、活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって発現される。活性化されたＴ細胞上に発現されるＯＸ４０と、抗原提示細胞上に発現されるそのリガンド（ＯＸ４０Ｌ）との相互作用は、Ｔ細胞の活性化、増殖、および遊走を劇的に促進し、エフェクターＴ細胞の生存を増加させ、胚中心形成および樹状細胞の成熟を増強させる。加えて、ＯＸ４０シグナル伝達は、Ｔｒｅｇの分化および増殖を阻害し、誘導性Ｔｒｅｇの生成をアンタゴナイズし、Ｔｒｅｇ抑制機能を遮断することができる。様々な前臨床マウス腫瘍モデルおよび臨床試験において、ＯＸ４０のアゴニストが、がんおよび感染性疾患の処置に非常に有望な戦略であることが証明されている。ＯＸ４０を標的とする複数のアゴニスト剤が、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ）、Ｐｆｉｚｅｒ、およびＩｎｃｙｔｅなどの製薬企業によって開発されている。ＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって開発されたＯＸ４０を標的とするアゴニストマウス抗体（９Ｂ１２、ＡｇｏｎＯＸ）は、進行がんを有する患者における第Ｉ相臨床試験において使用された。１期間の抗体「９Ｂ１２」で処置した患者は、３０人の患者のうち１２人において、許容可能な毒性プロファイルおよび少なくとも１つの転移病変の退縮を示した。機構的には、この処置により、レポーター抗原免疫付与（例えば、ＫＬＨ）に対するＴ細胞およびＢ細胞応答が増加し、腫瘍浸潤リンパ球においてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ細胞上のＯＸ４０の優先的な上方制御がもたらされ、黒色腫を有する患者においてＴ細胞およびＢ細胞の抗腫瘍反応性が増加した。ＧＳＫは、固形腫瘍および造血悪性腫瘍を含むがんの有望な処置のための、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒとの協力を通じて特定されたＴ細胞の表面上のＯＸ－４０を活性化するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＧＳＫ－３１７４９９８も開発している。ＯＸ４０を標的とする臨床開発中の他の薬剤としては、有望ながん処置のための、広範な悪性腫瘍において現在臨床開発中であるＰｆｉｚｅｒの完全ヒトＩｇＧ２アゴニスト抗体ＰＦ－０４５１８６００、ならびに最適なアゴニストプロファイルおよび腫瘍内制御性Ｔ細胞を選択的に枯渇させる能力を有する抗ＯＸ４０ヒトＩｇＧ１抗体であるＩｎｃｙｔｅのＩＮＣＡＧＮ－１９４９が挙げられる。
治療剤としてのＯＸ４０に対する抗体の改善には、いくらかの余地がある。共刺激性受容体に対するアゴニストとして、サイトカインストームなどの毒性がもっとも懸念される問題であり得、これが、臨床適用を制限する。さらに、現在臨床試験において試験されている抗ＯＸ４０抗体は、ヒト－マウスキメラ抗体またはヒト化抗体であり、高い免疫原性により、マウス由来のタンパク質配列に起因して有効性が減少する。完全ヒト抗体は、これらの欠点を克服し、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより高い効率およびより低い毒性を示した。
本発明において、本発明者らの専売特許のハイブリドーマ技術を利用して、ＯＸ４０に対する完全ヒト抗体を生成した。本発明の抗体は、高い結合親和性を有し、ヒトおよびサルの両方のＯＸ４０タンパク質に結合し、Ｔ細胞増殖の増強、ならびにサイトカインＩＦＮ－γおよびインターロイキン－２の産生の増加、ならびにＴｒｅｇ細胞の抑制機能の損傷を含む、強力な免疫応答調節能を有する。
概要
これらおよび他の目的が、本発明により提供されるが、本発明は、広義において、改善された有効性を有する抗体を提供する化合物、方法、組成物、および製品を対象とする。本発明によって提供される利点は、抗体治療薬および診断薬の分野において広く適用可能であり、様々な標的と反応する抗体と併せて使用することができる。本発明は、ヒトＯＸ４０に結合する抗体、好ましくは、完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、ヒト化ラットを使用したハイブリドーマの生成方法、抗ＯＸ４０抗体をコードする核酸分子、抗ＯＸ４０抗体の発現に使用されるベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗体の機能を検証するための方法を提供する。本発明の抗体は、ヒト免疫機能の調節を通じたがんを含む複数の疾患の処置のための強力な薬剤を提供する。
一部の態様では、本発明は、単離された抗体、またはその抗原結合性部分を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、以下の特性：
（ａ）ヒトＯＸ４０に、１×１０－８Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合すること、
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞においてサイトカイン（例えば、ＩＬ－２もしくはＩＦＮ－γ）の産生を誘導すること、
（ｃ）初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を増強させること、
（ｄ）Ｔｒｅｇ細胞の存在下において、初代ヒトＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞の増殖を増強させること、
（ｅ）ヒトＯＸ４０もしくはアカゲザルＯＸ４０のそれぞれに結合すること、または
（ｆ）ヒトＣＤ４０、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７１に対して交差反応性を有さないこと
のうちの１つまたは複数を有する。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ＯＸ４０のＣＲＤ２および／またはＣＲＤ３ドメインに結合する。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
Ａ）１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって、
（ｉ）配列番号１、７、１３、１５、２１、および２７からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３、９、１７、２３、および２９からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号５、１１、１９、２５、および３１からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＨ、
Ｂ）１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって、
（ｉ）配列番号２、８、１４、１６、２２、および２８からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＬ１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号４、１０、１８、２４、および３０からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＬ２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６、１２、２０、２６、および３２からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＬ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３、
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＬ、または
Ｃ）Ａ）のうちの１つもしくは複数のＣＤＲＨおよびＢ）のうちの１つもしくは複数のＣＤＲＬ
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
Ａ）１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって、
（ｉ）配列番号１、７、１３、１５、２１、および２７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＨ１とは異なるＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３、９、１７、２３、および２９からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＨ２とは異なるＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号５、１１、１９、２５、および３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＨ３とは異なるＣＤＲＨ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＨ、
Ｂ）１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって、
（ｉ）配列番号２、８、１４、１６、２２、および２８からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＬ１とは異なるＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号４、１０、１８、２４、および３０からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＬ２とは異なるＣＤＲＬ２、
（ｉｉｉ）配列番号６、１２、２０、２６、および３２からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＬ３とは異なるＣＤＲＬ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＬ、または
Ｃ）Ａ）のうちの１つまたは複数のＣＤＲＨおよびＢ）のうちの１つまたは複数のＣＤＲＬ
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
Ａ）配列番号５、１１、１９、２５、もしくは３１を含むＣＤＲＨ３、または
Ｂ）配列番号５、１１、１９、２５、および３１からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３、または
Ｃ）２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列が（Ａ）のＣＤＲＨ３とは異なるＣＤＲＨ３
を含み、
単離された抗体またはその抗原結合性部分は、ヒトＯＸ４０に、１×１０－８Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合する。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号３を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号５を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号４を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号６を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号７を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号８を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１３を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号１４を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１５を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号１７を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号１６を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１８を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号２０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号２１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号２３を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号２５を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号２４を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号２６を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号２７を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号２９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号３１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２８を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号３０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号３２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（Ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数の（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個、３個、４個、もしくは５個などの）アミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに／または
（Ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数の（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個、３個、４個、もしくは５個などの）アミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、本発明は、上記に定義される単離された抗体またはその抗原結合性部分と、同じエピトープへの結合について競合する、単離された抗体またはその抗原結合性部分を含む。
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される単離された抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子を対象とする。
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸分子を含む、ベクターを対象とする。
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される発現ベクターを含む、宿主細胞を対象とする。
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性部分と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を対象とする。
一部の態様では、本発明は、抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分を調製するための方法であって、抗体またはその抗原結合性部分を宿主細胞において発現させるステップと、宿主細胞から抗体またはその抗原結合性部分を単離するステップとを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法であって、対象における免疫応答が調節されるように、対象に、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分を投与するステップを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、対象における異常な細胞成長を処置するための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性部分または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、対象における腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性部分または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、対象における腫瘍細胞転移を低減させるための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性部分または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、対象におけるＴｒｅｇ細胞の抑制機能を損傷させるための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性部分または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、対象における増殖性障害（例えば、がんなど）、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む疾患を処置または予防するための方法であって、対象に、有効量の、本明細書に開示される抗体もしくはその抗原結合性部分または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を対象とする。
一部の態様では、本発明は、増殖性障害（例えば、がんなど）、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む疾患を処置または予防するための医薬の製造における、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分の使用を対象とする。
一部の態様では、本発明は、増殖性障害（例えば、がんなど）、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む増殖性疾患を診断するための診断剤の製造における、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分の使用を対象とする。
一部の態様では、本発明は、増殖性障害（例えば、がんなど）、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む疾患の処置または予防における使用のための、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分を対象とする。
一部の態様では、本発明は、増殖性障害（例えば、がんなど）、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む疾患の処置に有用である、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分および本明細書に開示される医薬組成物を利用する、キットまたはデバイスならびに関連する方法を対象とする。この目的で、本発明は、好ましくは、そのような障害を処置するのに有用な製品であって、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分を含む容器、ならびに本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分を増殖性障害またはその進行もしくは再発の処置、緩和、または予防に使用するための指示材料を含む、製品を提供する。
上記は、概要であり、したがって、必然的に、詳細の単純化、一般化、および省略を含み、結果として、当業者であれば、この概要が、例示にすぎず、決して制限することを意図するものではないことが理解される。本明細書に記載される方法、組成物、および／もしくはデバイス、ならびに／または他の主題の他の態様、特徴、および利点は、本明細書に記載される教示において明らかとなろう。この概要は、単純化された形式で概念の抜粋を紹介するために提供されており、この概念は、以下の詳細な説明においてさらに記載されている。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴または必須の特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求される主題の範囲の決定を支援するものとして使用されることを意図するものでもない。さらに、本出願全体を通じて引用されるすべての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
図１は、ＰＴＭ突然変異後の抗ＯＸ４０抗体１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋの変異体間の比較を示すグラフである。 図２は、ヒトＯＸ４０をトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合する抗体を示すグラフである。 図３は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する抗体を示すグラフである。 図４は、ＯＸ４０Ｌと競合的にＯＸ４０に結合する抗体を示すグラフである。 図５は、アカゲザルＯＸ４０をトランスフェクトした２９３Ｆ細胞に結合する抗体を示すグラフである。 図６は、ＥＬＩＳＡによる、ヒトＣＤ４０、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７１を含む他のＴＮＦＲファミリーメンバーに対する抗ＯＸ４０抗体のファミリー間結合試験の結果を示すグラフである。 図７Ａは、基準抗体ＢＭＫ１に対する抗体のエピトープビニングを示すグラフである。 図７Ｂは、基準抗体ＢＭＫ７に対する抗体のエピトープビニングを示すグラフである。 図７Ｃは、基準抗体ＢＭＫ１０に対する抗体のエピトープビニングを示すグラフである。 図８Ａは、遊離抗体を使用した、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＯＸ４０刺激ＮＦκＢルシフェラーゼ活性に対する抗体の効果を示すグラフである。遊離抗体のレポーター活性が示される。 図８Ｂは、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ試薬によるＦｃγＲ架橋抗体を使用した、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＯＸ４０刺激ＮＦκＢルシフェラーゼ活性に対する抗体の効果を示すグラフである。Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧによって架橋された抗体のレポーター活性が示される。 図８Ｃは、ＣＤ３２ｂ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞によるＦｃγＲ架橋抗体を使用した、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＯＸ４０刺激ＮＦκＢルシフェラーゼ活性に対する抗体の効果を示すグラフである。ＣＤ３２ｂ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞によって架橋された抗体のレポーター活性が示される。 図９は、抗ＣＤ３によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌に対する抗体の効果を示すグラフである。 図１０は、抗ＣＤ３によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌に対する抗体の効果を示すグラフである。 図１１は、抗ＣＤ３によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する抗体の効果を示すグラフである。 図１２は、Ｔｒｅｇ細胞の存在下における、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓによって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞の増殖に対する抗体の効果を示すグラフである。 図１３Ａは、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０発現を示すグラフである。 図１３Ｂは、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＯＸ４０発現を示すグラフである。 図１４Ａは、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ作用を示すグラフである。 図１４Ｂは、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ作用を示すグラフである。 図１５Ａは、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するＯＸ４０抗体のＣＤＣ作用を示すグラフである。 図１５Ｂは、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＯＸ４０抗体のＣＤＣ作用を示すグラフである。 図１６Ａは、抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌの投与後のＭＣ３８腫瘍保有マウスの腫瘍成長を示すグラフである。 図１６Ｂは、抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌの投与後のＭＣ３８腫瘍保有マウスの腫瘍成長を示すグラフである。 図１７は、抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌの投与後のＭＣ３８腫瘍保有マウスの体重変化を示すグラフである。
詳細な説明
本発明は、多数の異なる形態で実施され得るが、本明細書では、本発明の原理を例示する、その特定の例示的な実施形態が開示される。本発明は、例示される特定の実施形態に限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
本明細書に別途定義されない限り、本発明と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形の参照物を含む。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への参照は、複数のタンパク質を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への参照は、細胞の混合物を含むなどである。本出願において、「または」の使用は、別途示されない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの使用は、制限するものではない。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、両端点および端点間のすべての点を含む。
一般に、本明細書において記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法ならびにこれらの技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。本発明の方法および技法は、一般に、別途示されない限り、当該技術分野において周知であり、また様々な一般文書ならびに本明細書を通じて列挙および考察されるより具体的な参考文献に記載されている、従来的な方法に従って行われる。例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（２０１０年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２年）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３年）を参照されたい。本明細書において記載される解析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および医薬化学と関連して使用される命名法ならびにこれらの実験室手順および技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
定義
本発明をより理解するために、関連する用語の定義および説明を、以下に提供する。
「抗体」または「Ａｂ」という用語は、本明細書において使用される場合、一般に、共有結合的ジスルフィド結合および非共有結合的相互作用によって一緒に保持される２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖を含む、Ｙ字型の四量体タンパク質を指す。抗体の軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類することができる。重鎖は、μ、δ、γ、α、およびεに分類することができ、これらは、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。軽鎖および重鎖において、可変領域は、約１２個またはそれより多くのアミノ酸の「Ｊ」領域を介して定常領域に連結され、重鎖は、約３個またはそれより多くのアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）に分割することができ、超可変領域には、比較的保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在している。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序の３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる：Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。それぞれの重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ、抗原結合部位を形成する。様々な領域またはドメインにおけるアミノ酸の分布は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１～９１７ページ；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７８～８８３ページにおける定義に従う。抗体は、異なる抗体アイソタイプのものであってもよく、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。
抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用語は、本出願の文脈において互換可能に使用することができ、全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、このポリペプチドは、全長抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合する能力を保持する、かつ／または同じ抗原への結合について全長抗体と競合する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）を参照されたく、これは、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。抗体の抗原結合性断片は、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。一部の条件下において、抗原結合性断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、ならびにポリペプチドに特異的抗原結合能力を付与するのに十分である抗体の少なくとも一部を含むようなポリペプチドが挙げられる。抗体の抗原結合性断片は、当業者に公知の従来的な技法（例えば、組換えＤＮＡ技法または酵素的もしくは化学的切断方法）によって所与の抗体（例えば、本出願において提供されるモノクローナル抗ヒトＯＸ４０抗体）から得ることができるか、またはインタクトな抗体をスクリーニングするのと同じ手法で、特異性に関してスクリーニングすることができる。
「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」という用語は、本明細書において使用される場合、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を呈する。
「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異生成によって、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むよう意図されない。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一の結合特異性を呈する抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を指すことを意図する。追加のフレームワーク領域改変が、ヒトフレームワーク配列内に行われてもよい。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。
「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体、例えば、別の種の免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物から単離された抗体、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、または免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離された抗体を指す。
「抗ＯＸ４０抗体」または「ＯＸ４０抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、本明細書に定義されるように、ＯＸ４０受容体、例えば、ヒトＯＸ４０受容体に結合することができる抗体を指す。
本明細書において互換可能に使用される「ＯＸ４０」、「ＯＸ４０受容体」、「ＯＸ４０タンパク質」、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）」、または「ＣＤ１３４」という用語は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーである。「ＯＸ４０」という用語は、ヒトＯＸ４０受容体、ならびにそのバリアント、アイソフォーム、および種ホモログを含み得る。したがって、本明細書に定義および開示される抗体またはその抗原結合性部分は、ヒト以外の種に由来するＯＸ４０、例えば、カニクイザルＯＸ４０にも結合し得る。
「ヒトＯＸ４０」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト配列ＯＸ４０、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＥ１１７５７．１を有するヒトＯＸ４０の完全なアミノ酸配列を指す。ヒトＯＸ４０配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＥ１１７５７．１のヒトＯＸ４０とは、例えば、保存的突然変異または非保存的領域における突然変異が異なり得、ＯＸ４０は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＥ１１７５７．１のヒトＯＸ４０と実質的に同じ生物学的機能を有する。
「マウスＯＸ４０」という用語は、本明細書において使用される場合、マウス配列ＯＸ４０、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ５９４７６．１を有するマウスＯＸ４０の完全なアミノ酸配列を指す。
「カニクイザルＯＸ４０」という用語は、本明細書において使用される場合、カニクイザル配列ＯＸ４０、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１０９０８７０．１を有するアカゲザルＯＸ４０の完全なアミノ酸配列を指す。
「Ｋａ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことを意図し、一方で、「Ｋｄ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。抗体のＫｄ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を使用して判定することができる。「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことを意図し、これは、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫｄを判定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
ＩｇＧ抗体に関する「高親和性」という用語は、本明細書において使用される場合、標的抗原、例えば、ＯＸ４０受容体に対して、１×１０－７Ｍまたはそれよりも低い、より好ましくは５×１０－８Ｍまたはそれよりも低い、さらにより好ましくは１×１０－８Ｍまたはそれよりも低い、さらにより好ましくは５×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、さらにより好ましくは１×１０－９Ｍまたはそれよりも低いＫＤを有する抗体を指す。
「半数効果濃度」とも称される「ＥＣ５０」という用語は、本明細書において使用される場合、指定された曝露時間の後に、ベースラインと最大値との中間の応答を誘導する、薬物、抗体、または毒物の濃度を指す。本出願の文脈において、ＥＣ５０は、「ｎＭ」単位で表される。
「結合に関して競合する」という用語は、本明細書において使用される場合、結合標的に結合する２つの抗体の相互作用を指す。第１の抗体は、第１の抗体とその同種エピトープとの結合が、第２の抗体の存在下において、第２の抗体の不在下における第１の抗体の結合と比較して、検出可能に減少する場合、結合に関して第２の抗体と競合する。代替として、第２の抗体のそのエピトープへの結合もまた、第１の抗体の存在下において検出可能に減少する場合もあるが、必ずしもそうでない場合もある。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体がそのそれぞれのエピトープに結合するのを阻害することなく、第２の抗体がそのエピトープに結合するのを阻害することができる。しかしながら、それぞれの抗体が、他方の抗体とその同種エピトープとの結合を検出可能に阻害する場合、程度が同じか、より多いか、または少ないかに関係なく、それらの抗体は、それらのそれぞれのエピトープの結合に関して、互いに「交差競合」すると称される。
「結合を阻害する」能力は、本明細書において使用される場合、抗体またはその抗原結合性断片が、２つの分子（例えば、ヒトＯＸ４０とヒト抗ＯＸ４０抗体と）の結合を任意の検出可能なレベルで阻害する能力を指す。ある特定の実施形態では、２つの分子の結合は、抗体またはその抗原結合性断片によって、少なくとも５０％阻害され得る。ある特定の実施形態では、そのような阻害作用は、６０％より大きくてもよいし、７０％より大きくてもよいし、８０％より大きくてもよいし、または９０％より大きくてもよい。
「エピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部分を指す。「エピトープ」は、「抗原決定基」としても知られている。エピトープまたは抗原決定基は、一般に、アミノ酸、炭水化物、または糖側鎖など、分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に、特定の３次元構造および特定の電荷特徴を有する。例えば、エピトープは、一般に、「線形」であっても「立体構造」であってもよい固有の空間構成に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の保存的または非保存的アミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）を参照されたい。線形エピトープの場合、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間のすべての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線形で存在する。立体構造エピトープの場合、相互作用部位は、タンパク質において互いに離れているアミノ酸残基にわたる。抗体は、当業者に公知の従来的な技法によって、同じエピトープへの結合の競合性に応じて、スクリーニングすることができる。例えば、競合または交差競合に関する研究を行って、抗原への結合に関して互いに競合または交差競合する抗体を得ることができる（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）。交差競合に基づいた、同じエピトープに結合する抗体を得るためのハイスループット方法は、国際特許出願第０３／４８７３１号に記載されている。
「単離された」という用語は、本明細書において使用される場合、人工的な手段によって天然の状態から得られた状態を指す。ある特定の「単離された」物質または成分が天然に存在するとすれば、それは、その天然の環境が変化することに起因して可能であるか、またはその物質は天然の環境から単離されているか、またはその両方である。例えば、ある特定の単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある特定の生きた動物の体内に天然に存在しており、そのような天然の状態から高い純度で単離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと称される。「単離された」という用語は、混合された人工もしくは合成の物質も、単離された物質の活性に影響を及ぼさない他の不純物質も、排除するものではない。
「単離された抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＯＸ４０タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、ＯＸ４０タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＯＸ４０タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば、他の種に由来するＯＸ４０タンパク質との交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
「ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドが中に挿入され得る核酸ビヒクルを指す。ベクターが、中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは、発現ベクターと称される。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって、保持する遺伝子材料エレメントを宿主細胞において発現させることができる。ベクターは、当業者には周知であり、ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）など、ファージ、例えば、λファージまたはＭ１３ファージなど、ならびに動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０など）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を制御するための複数のエレメントを含み得る。加えて、ベクターは、複製起点を含み得る。
「宿主細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、目的のタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを生成するように操作することができる細胞系を指す。宿主細胞としては、限定されないが、培養細胞、例えば、げっ歯動物（ラット、マウス、モルモット、もしくはハムスター）に由来する哺乳動物培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０など、またはヒト組織もしくはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、および昆虫細胞、ならびにトランスジェニック動物もしくは培養組織内に含まれる細胞が挙げられる。この用語は、特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も包含する。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、ある特定の改変が後続の世代において生じ得るため、そのような子孫は、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として、「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
「同一性」という用語は、本明細書において使用される場合、２つもしくはそれより多くのポリペプチド分子または２つもしくはそれより多くの核酸分子の配列間の、配列をアライメントし、比較することによって判定される、関係性を指す。「同一性パーセント」とは、比較される複数の分子のアミノ酸またはヌクレオチド間における同一な残基のパーセントを意味し、比較されている複数の分子のうちの最も小さい方のサイズに基づいて計算される。これらの計算について、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。アライメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、１９８８年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、１９９３年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、１９９４年、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、１９９１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８年、ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８巻：１０７３ページに記載されるものが挙げられる。
「免疫原性」という用語は、本明細書において使用される場合、生物において特定の抗体の形成または感作されたリンパ球を刺激する能力を指す。これは、最終的に抗体および感作されたリンパ球などの免疫学的エフェクター物質を生成するように、抗原が特定の免疫細胞を活性化、増殖、および分化するように刺激する特性を指すだけでなく、生物を抗原で刺激した後に、抗体または感作されたＴリンパ球が生物の免疫系において形成され得る、特定の免疫応答も指す。免疫原性は、抗原のもっとも重要な特性である。抗原が、宿主において免疫応答の生成を誘導するのに成功し得るかどうかは、抗原の特性、宿主の反応性、および免疫付与手段という３つの因子に依存する。
「トランスフェクション」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸が真核生物細胞、特に哺乳動物細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクションのプロトコールおよび技法としては、脂質トランスフェクション、ならびに化学的および物理的方法、例えば、エレクトロポレーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのトランスフェクション技法が、当該技術分野において周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻：４５６ページ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上記）；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ １３巻：１９７ページを参照されたい。本発明の特定の実施形態では、ヒトＯＸ４０遺伝子を、２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。
「ハイブリドーマ」という用語および「ハイブリドーマ細胞株」という用語は、本明細書において使用される場合、互換可能に使用され得る。「ハイブリドーマ」という用語および「ハイブリドーマ細胞株」という用語に言及する場合、これらは、ハイブリドーマのサブクローンおよび子孫細胞も含む。
「ＳＰＲ」または「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムでの生体特異的相互作用の分析を可能にする、光学的現象を指し、それを含む。さらなる説明については、実施例５、ならびにＪｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１巻：１９～２６ページ、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１巻：６２０～６２７ページ、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８巻：１２５～１３１ページ、およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８巻：２６８～２７７ページを参照されたい。
「蛍光活性化細胞分取」または「ＦＡＣＳ」という用語は、本明細書において使用される場合、特化した種類のフローサイトメトリーを指す。これは、生物学的細胞の不均質混合物を、それぞれの細胞の特異的光分散および蛍光特徴に基づいて、一度に１つの細胞ずつ、２つまたはそれより多くの容器へと分取するための方法を提供する（ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｃ．「Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｏｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ」．２０１７年１１月０９日に取得）。ＦＡＣＳを実行するための機器は、当業者に公知であり、市販されている。そのような機器の例としては、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ、およびＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＤｉｖｉｓｉｏｎからのＥｐｉｃｓ Ｃ（Ｈｉａｌｅａｈ、Ｆｌａ．）、ならびにＣｙｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｏＦｌｏ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ｃｏｌｏ．）が挙げられる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、分泌されたＩｇが、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより、これらの細胞毒性エフェクター細胞が、抗原を保持する標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒素により標的細胞を殺滅させることを可能にする、細胞毒性の形態を指す。抗体は、細胞毒性細胞を「武装」させ、そのような殺滅に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞におけるＦｃＲの発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：４５７～９２ページ（１９９１年）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号に記載されているものを、行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替として、または追加として、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、９５巻：６５２～６５６ページ（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて、評価することができる。
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」という用語は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同種抗原に結合した抗体（適切なサブクラスのもの）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３ページ（１９９６年）に記載されているものを、行うことができる。
「対象」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物、好ましくは、ヒトが含まれる。
「がん」という用語は、本明細書において使用される場合、任意のまたは腫瘍もしくは悪性細胞の成長、増殖、または転移に媒介される固形腫瘍および非固形腫瘍、例えば、白血病などを指し、医学的状態を開始する。
「処置」、「処置すること」、または「処置される」という用語は、本明細書において状態を処置する文脈で使用される場合、概して、ヒトのものか動物のものかにかかわらず、何らかの所望される治療効果、例えば、状態の進行の阻害が達成される、処置および治療法に関し、これには、進行速度の低減、進行速度の停止、状態の退縮、状態の緩和、および状態の治癒が挙げられる。予防的措置（すなわち、予防、防止）としての処置もまた含まれる。がんに関して、「処置すること」とは、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、もしくは転移、またはこれらの何らかの組合せを減衰または減速させることを指し得る。腫瘍に関して、「処置」には、腫瘍の全体もしくは一部の除去、腫瘍の成長および転移を阻害もしくは減速させること、腫瘍の発達を予防もしくは遅延すること、またはこれらの何らかの組合せが含まれる。
「有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、所望される処置レジメンに従って投与したときに、何らかの所望される治療効果をもたらすのに有効であり、妥当な利益／危険性比に見合った、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは投薬形態の量に関する。例えば、「有効量」は、ＯＸ４０関連疾患または状態の処置と併せて使用される場合、前記疾患または状態を処置するのに有効な量または濃度の抗体またはその抗原結合性部分を指す。
「予防する」、「予防」、または「予防すること」という用語は、本明細書において哺乳動物におけるある特定の疾患状態に関連して使用される場合、疾患の発症を予防もしくは遅延すること、またはその臨床もしくは亜臨床的な症状の顕在化を予防することを指す。
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書において使用される場合、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／またはそれらの塩が、製剤中の他の成分と化学的および／または物理的に適合性であり、レシピエントと生理学的に適合性であることを意味する。
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、対象および活性剤と薬理学的および／または生理学的に適合性の担体および／または賦形剤であり、これは、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年を参照されたい）、これには、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調節剤としては、リン酸緩衝液が挙げられるがこれに限定されず、界面活性剤としては、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０が挙げられるがこれらに限定されず、イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムが挙げられるがこれに限定されない。
本明細書において使用される場合、「アジュバント」という用語は、非特異的免疫強化剤を指し、これは、抗原と一緒に生物に送達されるか、または生物に事前に送達された場合に、抗原に対する免疫応答を増強させることができるか、または生物における免疫応答の種類を変化させることができる。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカインなどが挙げられるがこれらに限定されない、様々なアジュバントがある。フロイントアジュバントは、現在、動物実験においてもっとも一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより一般的に使用されている。
抗ＯＸ４０抗体
一部の態様では、本発明は、単離された抗体、またはその抗原結合性部分を含む。
本出願の文脈において、「抗体」は、ＯＸ４０タンパク質との優先的な会合または結合を呈する限り、ポリクローナル抗体、多クローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化および霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト抗体、組換えにより産生された抗体、イントラボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインおよびそれらの変異形を含む合成抗体、ならびにＦｃ融合体および他の改変形を含むそれらの誘導体、ならびに任意の他の免疫反応性分子を含み得る。さらに、文脈上の制約によりそうでないことが示されない限り、この用語は、抗体のすべてのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）、ならびにすべてのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）をさらに含む。好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。より好ましい実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を使用して産生することができる。１つの技法は、抗体（好ましくはヒト抗体）のライブラリーをファージにおいて合成し、このライブラリーを目的の抗原またはその抗体結合性部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、そこから免疫反応性断片を得ることができる、ファージディスプレイである。このようなライブラリーを調製し、スクリーニングする方法は、当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットが、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７－９４００－０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするのに使用することができる他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：７９７８～７９８２ページ（１９９１年）を参照されたい）。
ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することによって、作製することもできる。感作を受けると、ヒト抗体の産生が観察され、このヒト抗体産生は、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むすべての点で、ヒトにおいて見られるものに近似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術については米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３巻：６５～９３ページ（１９９５年）に記載されている。代替的に、ヒト抗体は、標的抗原に指向される抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によって調製してもよい（そのようなＢリンパ球は、新生物障害を患う個体から回収されたものであってもよく、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫付与が行われていてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ（１９８５年）、Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７巻（ｌ）：８６～９５ページ（１９９１年）、および米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、組換え技法、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））、またはこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野において公知の広範な技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法、ならびにＡｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第１版、２００９年；Ｓｈｉｒｅら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ ＬＬＣ、第１版、２０１０年；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３～６８１ページ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８１年）により詳細に記載されているものなど、当該技術分野において認識されている生化学技法および遺伝子操作技法を使用して、産生することができ、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。選択された結合配列を、例えば、標的に対する親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養におけるその産生の改善、ｉｎ ｖｉｖｏでのその免疫原性の低減、多重特異性抗体の作製などを行うようにさらに改変してもよいこと、ならびに改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本発明の抗体であることを理解されたい。好ましい実施形態では、抗ヒトＯＸ４０モノクローナル抗体は、ハイブリドーマを使用することによって調製される。
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本発明の抗体、例えば、本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫付与したマウスに由来する脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、適切に不死化した細胞株、例えば、マウス骨髄腫細胞株と融合させることができる。結果として得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。ハイブリドーマの生成は、当該技術分野において周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本発明の抗体はまた、当該技術分野において周知なように、例えば、組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション法の組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて、産生することもできる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９巻：１２０２ページ）。一実施形態では、標準的な分子生物学技法によって得られた部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、１つまたは複数の発現ベクターに挿入する。この文脈において、「作動可能に連結された」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図される機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することを意図する。
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０年））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための例示的な制御配列としては、哺乳動物細胞における高いレベルのタンパク質発現を指向させるウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、ならびにポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどが挙げられる。代替的に、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス制御配列を使用してもよい。なおもさらに、制御エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含む、ＳＲαプロモーター系など、異なる供給源に由来する配列から構成されていた（Ｔａｋｅｂｅら（１９８８年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８巻：４６６～４７２ページ）。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するよう選択される。
抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じかまたは別個の発現ベクターに挿入され得る。一部の実施形態では、可変領域を使用して、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、可変領域を、すでに所望されるアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードしている発現ベクターに挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製する。追加または代替として、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端とインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、追加の配列、例えば、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子などを有してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどに対する耐性を付与する。選択可能なマーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ－宿主細胞において使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を挙げることができる。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターが、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核生物または真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に使用される広範な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。本発明の抗体を、原核生物または真核生物宿主細胞のいずれか、例えば、哺乳動物宿主細胞において発現させることが可能であり、この宿主細胞は、正確にフォールディングされた免疫学的に活性な抗体をアセンブルし、分泌することができる。
本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５９巻：６０１～６２１ページに記載されるＤＨＦＲ選択可能なマーカーとともに使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ７７巻：４２１６～４２２０ページに記載されるｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ならびにＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに使用するには、別の発現系として、国際公開第８７／０４４６２号、同第８９／０１０３６号、および欧州特許第３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞を、宿主細胞における抗体の発現、または宿主細胞が成長した培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して、培養培地から回収することができる。
ある特定の特性を有する抗ＯＸ４０抗体
本発明の抗体は、抗体の具体的な機能特長または特性によって特徴付けられる。一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、以下の特性：
（ａ）ヒトＯＸ４０に、１×１０－８Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合すること、
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞においてサイトカイン（例えば、ＩＬ－２もしくはＩＦＮ－γ）の産生を誘導すること、
（ｃ）初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を増強させること、
（ｄ）Ｔｒｅｇ細胞の存在下において、初代ヒトＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞の増殖を増強させること、
（ｅ）ヒトＯＸ４０もしくはアカゲザルＯＸ４０のそれぞれに結合すること、または
（ｆ）ヒトＣＤ４０、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７１に対して交差反応性を有さないこと
のうちの１つまたは複数を有する。
本発明の抗体は、ヒトＯＸ４０に、高い親和性で結合する。本発明の抗体のＯＸ４０への結合は、当該技術分野において十分に確立されている１つまたは複数の技法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、評価することができる。本発明の抗体の結合特異性はまた、抗体の、ＯＸ４０タンパク質を発現する細胞への結合を、例えば、フローサイトメトリーによってモニタリングすることによって、判定することもできる。例えば、抗体は、ヒトＯＸ４０を発現する細胞株、例えば、ＯＸ４０をその細胞表面上に発現するようにトランスフェクトされているＣＨＯ細胞と抗体を反応させる、フローサイトメトリーアッセイによって試験することができる。フローサイトメトリーアッセイにおいて使用するための他の好適な細胞は、ナイーブＯＸ４０を発現する抗ＣＤ３刺激ＣＤ４＋活性化Ｔ細胞が挙げられる。追加または代替として、結合動態（例えば、Ｋｄ値）を含む、抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて試験することができる。なおも他の好適な結合アッセイとしては、例えば、組換えＯＸ４０タンパク質を使用した、ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。例えば、本発明の抗体は、ヒトＯＸ４０に、１×１０－８Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、ヒトＯＸ４０に、１×１０－９Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、ヒトＯＸ４０に、５×１０－１０Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、ヒトＯＸ４０に、２×１０－１０Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、ヒトＯＸ４０タンパク質に、１×１０－１０Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、ヒトＯＸ４０タンパク質に、５×１０－１１Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、ヒトＯＸ４０タンパク質に、３×１０－１１Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合するか、またはヒトＯＸ４０タンパク質に、２×１０－１１Ｍもしくはそれよりも低いＫＤで結合する。
特定の配列に対する配列同一性を有するＣＤＲを含む抗ＯＸ４０抗体
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
Ａ）１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって、
（ｉ）配列番号１、７、１３、１５、２１、および２７からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３、９、１７、２３、および２９からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号５、１１、１９、２５、および３１からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＨ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＨ、
Ｂ）１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって、
（ｉ）配列番号２、８、１４、１６、２２、および２８からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＬ１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号４、１０、１８、２４、および３０からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＬ２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号６、１２、２０、２６、および３２からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＬ３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤＲＬ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＬ、または
Ｃ）Ａ）のうちの１つもしくは複数のＣＤＲＨおよびＢ）のうちの１つもしくは複数のＣＤＲＬ
を含む。
それぞれのＣＤＲに対するアミノ酸の割り当ては、別途示されない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０、またはＤｕｂｅｌ編（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏによって提供される番号付けスキームのうちのいずれかによるものであり得る。
抗体配列の可変領域およびＣＤＲは、当該技術分野において開発された（上述のように、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムなどの）一般則に従って、または配列を公知の可変領域のデータベースにアライメントすることによって、特定することができる。これらの領域を特定する方法は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１年、およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００年に記載されている。例示的な抗体配列データベースは、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３巻（データベース版）：Ｄ６７１～Ｄ６７４（２００５年）に記載されるように、「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄにより維持されている）およびＶＢＡＳＥ２ウェブサイトｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇに記載されており、これらを通じてアクセスすることができる。好ましくは、配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースを通じて分析され、このデータベースは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合するものである。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎの著書、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ ＭａｎｕａｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．の章（編：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ－１３巻：９７８－３５４０４１３５４７、ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも入手可能）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用することができるＣＤＲを特定するために開発された一般則もさらに含む。別途示されない限り、本明細書に記載されるすべてのＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトにより得られる。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１～１７ページ、１９８８年）を使用して、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、判定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４～４５３ページ（１９７０年））によって、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して判定することができる。
追加または代替として、本発明のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連する配列を特定するために公的データベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～１０ページのＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９～３４０２ページに記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
他の実施形態では、ＣＤＲアミノ酸配列は、上述のそれぞれの配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。例示的な例として、抗体は、配列番号１、７、１３、１５、２１、および２７からなる群から選択される配列のうちの１つに記載されるＣＤＲＨ１に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＣＤＲＨ１を含み得る。
アミノ酸付加、欠失、および／または置換を有するＣＤＲを含む抗ＯＸ４０抗体
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
Ａ）１つまたは複数の重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）であって、
（ｉ）配列番号１、７、１３、１５、２１、および２７からなる群から選択されるＣＤＲＨ１、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＨ１とは異なるＣＤＲＨ１、
（ｉｉ）配列番号３、９、１７、２３、および２９からなる群から選択されるＣＤＲＨ２、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＨ２とは異なるＣＤＲＨ２、
（ｉｉｉ）配列番号５、１１、１９、２５、および３１からなる群から選択されるＣＤＲＨ３、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＨ３とは異なるＣＤＲＨ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＨ、
Ｂ）１つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）であって、
（ｉ）配列番号２、８、１４、１６、２２、および２８からなる群から選択されるＣＤＲＬ１、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＬ１とは異なるＣＤＲＬ１、
（ｉｉ）配列番号４、１０、１８、２４、および３０からなる群から選択されるＣＤＲＬ２、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＬ２とは異なるＣＤＲＬ２、
（ｉｉｉ）配列番号６、１２、２０、２６、および３２からなる群から選択されるＣＤＲＬ３、または２つ以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失、もしくは置換によりアミノ酸配列がそのＣＤＲＬ３とは異なるＣＤＲＬ３
からなる群のうちの少なくとも１つから選択される、ＣＤＲＬ、または
Ｃ）Ａ）のうちの１つまたは複数のＣＤＲＨおよびＢ）のうちの１つまたは複数のＣＤＲＬ
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分のＣＤＲは、１つ以下のアミノ酸の保存的置換を含む。「保存的置換」という用語は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に悪影響を及ぼすこともそれを変化させることもない、アミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当該技術分野において公知の標準的な技法、例えば、部位特異的突然変異生成およびＰＣＲに媒介される突然変異生成などによって、導入され得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的または機能的に類似（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有するなど）の残基で置換される、置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシンなど）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を特定するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：１１８０～１１８７ページ（１９９３年）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２巻（１０号）：８７９～８８４ページ（１９９９年）、およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４巻：４１２～４１７ページ（１９９７年）を参照されたく、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＣＤＲを含む抗ＯＸ４０抗体
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号３を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号５を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号４を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号６を含むＣＤＲＬ３
を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１からなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号３からなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号５からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２からなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号４からなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号６からなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号７を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１１を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号８を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１０を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１２を含むＣＤＲＬ３
を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号７からなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９からなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１１からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号８からなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１０からなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１２からなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１３を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１１を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号１４を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１０を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１２を含むＣＤＲＬ３
を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１３からなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９からなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１１からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号１４からなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１０からなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１２からなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１５を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号１７を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１９を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号１６を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１８を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号２０を含むＣＤＲＬ３
を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号１５からなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号１７からなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１９からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号１６からなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号１８からなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号２０からなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号２１を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号２３を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号２５を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２２を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号２４を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号２６を含むＣＤＲＬ３
を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号２１からなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号２３からなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号２５からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２２からなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号２４からなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号２６からなるＣＤＲＬ３
を含む。
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号２７を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号２９を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号３１を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２８を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号３０を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号３２を含むＣＤＲＬ３
を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（ａ）配列番号２７からなるＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号２９からなるＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号３１からなるＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号２８からなるＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号３０からなるＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号３２からなるＣＤＲＬ３
を含む。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＯＸ４０抗体
一部の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、
（Ａ）重鎖可変領域であって、
（ｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、もしくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉｉ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１、および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、ならびに／または
（Ｂ）軽鎖可変領域であって、
（ｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、
（ｉｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉｉ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２、および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／もしくは置換を有するアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３５のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号３８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号３９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号４３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。
他の実施形態では、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、上述のそれぞれの配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。例示的な例として、抗体は、配列番号３３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。
一部のさらなる実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合性部分は、重鎖および／または軽鎖の可変領域におけるアミノ酸の保存的置換または改変を含み得る。抗原結合を除去しないある特定の保存的配列改変が行われてもよいことが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２巻：１１８０～８ページ、ｄｅ Ｗｉｌｄｔら（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０巻：８３５～４１ページ、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：２６８６４～２６８７０ページ、Ｈａｌｌら（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９巻：１６０５～１２ページ、ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’ Ｃｏｎｎｅｌｌ （１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：６８６２～３５ページ、Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０巻：３４１～６ページ、ならびにＢｅｅｒｓら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６巻：２８３５～４３ページを参照されたい。
上述のように、「保存的置換」という用語は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に悪影響を及ぼすこともそれを変化させることもない、アミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当該技術分野において公知の標準的な技法、例えば、部位特異的突然変異生成およびＰＣＲに媒介される突然変異生成などによって、導入され得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的または機能的に類似（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有するなど）の残基で置換される、置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシンなど）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を特定するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：１１８０～１１８７ページ（１９９３年）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２巻（１０号）：８７９～８８４ページ（１９９９年）、およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４巻：４１２～４１７ページ（１９９７年）を参照されたく、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。
ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）およびエピトープマッピング
開示される抗体が、選択された標的またはその断片によって提示される分離したエピトープまたは免疫原決定基（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と会合する、またはそれに結合することはさらに理解される。一部の実施形態では、エピトープまたは免疫原決定基として、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面の分子グループが挙げられる。一部の実施形態では、エピトープは、特定の三次元的構造特徴および／または特定の電荷特徴を有する場合がある。したがって、本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合できるまたは、そうでなければ分子と相互作用できる任意のタンパク質決定基を含む。一部の実施形態では、タンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を選択的に認識する場合に、抗体は抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合もしくは反応する）と称される。一部の実施形態では、平衡解離定数（ＫＤ）が１０－６Ｍ以下または１０－７Ｍ以下である場合、より好ましくはＫＤが１０－８Ｍ以下である場合、およびさらにより好ましくはＫＤが１０－９Ｍ以下である場合に、抗体は抗原に特異的に結合すると称される。
近接アミノ酸から形成されたエピトープ（「直鎖状」または「連続的」エピトープと称される場合もある）は、タンパク質変性の際に典型的には保持される一方で、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、タンパク質変性の際に典型的には失われる。いずれにしても抗体エピトープは、典型的には、固有の空間的コンホメーションにある少なくとも３個、通常は少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。
この点において、一部の実施形態では、エピトープは、例えばＰＤ－１タンパク質の１つまたは複数の領域、ドメインまたはモチーフに会合できるまたはそこに存在し得ることは理解される。同様に、当技術分野において認められている用語「モチーフ」は、その一般的意味に従って使用され、典型的には１０から２０個の近接アミノ酸残基であるタンパク質の短い、保存された領域を一般に指す。
いずれにしても、抗原上の望ましいエピトープが決定され、例えば、本発明に記載の技術を使用してエピトープを含むペプチドを用いて免疫化することによって、そのエピトープに対する抗体を生成することができる。代替的に、発見プロセスの際に抗体の生成および特徴付けは、特定のドメインまたはモチーフに位置付けられた望ましいエピトープについての情報を明らかにすることができる。次にこの情報から、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する、すなわち抗体が抗原への結合について競合する、抗体を見出すための競合研究を行うことである。抗体をそれらの交差競合に基づいてビニングするためのハイスループットプロセスは、ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。抗体競合または酵母での抗原断片発現を含む、ビニングまたはドメインレベルまたはエピトープマッピングの他の方法は、当技術分野において十分周知である。
本明細書において使用される場合、用語「ビニング」は、抗体をそれらの抗原結合特徴および競合に基づいてグループ化または分類するために使用される方法を指す。本技術は、本発明の抗体を定義し、カテゴリー化するために有用である一方でビンは、エピトープと必ずしも直接関連せず、エピトープ結合のそのような仮決定は、当技術分野においておよび本明細書に記載される当技術分野において認められた他の方法によってさらに改良および確認され得る。しかし、個々のビンへの抗体の経験的割り当てが本開示の抗体の治療可能性を示し得る情報を提供することは、理解される。
さらに具体的には、当技術分野において周知および本明細書の実施例に記載される方法を使用することによって、選択された参照抗体（またはその断片）が同じエピトープに結合するかどうか、または第２の検査抗体との結合について競合する（すなわち、同じビンにある）かどうかを決定できる。
他の適合可能なエピトープマッピング技術として、アラニンスキャンニング突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８巻：４４３～６３ページ）（その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる）またはペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープの切り出し、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法も使用され得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９巻：４８７～４９６ページ）（その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる）。
本発明の抗体をコードする核酸分子
一部の態様では、本発明は、本明細書において開示される単離された抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
本発明の核酸は、標準的分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）抗体について、かかる抗体をコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。
ＶＨ領域をコードする単離された核酸は、ＶＨコード核酸を重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に転換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）、上記を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得るが、より好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。
ＶＬ領域をコードする単離された核酸は、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に転換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、上記を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であってよい。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によって、例えば可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子にまたはｓｃＦｖ遺伝子に転換するようにさらに操作され得る。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡ断片は、抗体定常領域またはフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。このコンテクストにおいて使用される場合、用語「作動可能に連結される」は、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように接続されることを意味すると意図される。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される単離された抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
一部の具体的な実施形態では、単離された核酸分子は、単離された抗体の重鎖可変領域をコードし：
（Ａ）配列番号３３、３５、３７、３９、４１および４３に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｂ）配列番号４５、４７、４９、５１、５３もしくは５５に記載の核酸配列；または
（Ｃ）高いストリンジェンシー条件下で、（Ａ）もしくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む。
例えば核酸分子は、配列番号４５、４７、４９、５１、５３または５５からなる。代替的に核酸分子は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）配列同一性を配列番号４５、４７、４９、５１、５３または５５と共有する。一部の具体的な実施形態では、同一性の百分率は、遺伝コードの縮重に由来し、コードされたタンパク質配列は未変化のままである。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される単離された抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
一部の具体的な実施形態では、単離された核酸分子は、単離された抗体の軽鎖可変領域をコードし：
（Ａ）配列番号３４、３６、３８、４０、４２もしくは４４に記載の重鎖可変領域をコードする核酸配列；
（Ｂ）配列番号４６、４８、５０、５２、５４もしくは５６に記載の核酸配列；または
（Ｃ）高いストリンジェンシー条件下で、（Ａ）もしくは（Ｂ）の核酸配列の相補鎖にハイブリダイズした核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む。
例えば、核酸分子は、配列番号４６、４８、５０、５２、５４または５６からなる。代替的に核酸分子は、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）配列同一性を配列番号４６、４８、５０、５２、５４または５６と共有する。一部の具体的な実施形態では、同一性の百分率は、遺伝コードの縮重に由来し、コードされたタンパク質配列は未変化のままである。
例示的な高いストリンジェンシー条件として、４５℃、５×ＳＳＰＥおよび４５％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションならびに６５℃、０．１×ＳＳＣでの最終洗浄が挙げられる。同等のストリンジェンシー条件が、Ａｕｓｕｂｅｌら、（Ｅｄｓ．），Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９４），６．０．３から６．４．１０ページに記載のとおり、温度および緩衝液または塩濃度の変更を通じて達成され得ることは当技術分野において理解される。ハイブリダイゼーション条件の修正は、経験的に決定され得る、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対合の長さおよび百分率に基づいて正確に算出され得る。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９），９．４７から９．５１ページに記載のとおり算出され得る。
医薬組成物
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性部分および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。
組成物の構成成分
医薬組成物は、別の抗体または薬物などの１つまたは複数の追加的な薬学的活性成分を任意選択で含有し得る。本発明の医薬組成物は、抗ＯＸ４０抗体がワクチンに対する免疫応答を増強するように、例えば別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤またはワクチンを用いた併用治療で投与されてよい。薬学的に許容される担体として、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または無毒性補助物質、構成成分の当技術分野において周知の他の種々の組合せなどが少なくとも挙げられる。
好適な構成成分として、例えば、抗酸化剤、注入剤、結合剤、崩壊剤、緩衝液、保存剤、潤滑剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキストリンなどの安定剤が挙げられる。好適な抗酸化剤として、例えば、メチオニン、アルコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセリン、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／またはプロピルガラクテ（ｐｒｏｐｙｌｇａｌａｃｔｅ）が挙げられる。本発明において開示されるとおり、本発明が開示する抗体または抗原結合性断片を含有する溶媒において、組成物はメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤を含み、抗体またはその抗原結合性断片を還元すると酸化される。酸化還元は、結合親和性の減少を妨げるまたは低減することができ、それにより抗体安定性を増強し、保存期間を延長する。したがって一部の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の抗体またはその抗原結合性断片およびメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤を含む組成物を提供する。本発明は、抗体またはその抗原結合性断片がメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤と混合されており、それにより抗体またはその抗原結合性断片が、保存期間を延長するおよび／または活性の増加のために、酸化を妨げられる種々の方法をさらに提供する。
さらに例示するために、薬学的に許容される担体として、例えば、水性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、等張ブドウ糖注射剤、滅菌注射用水もしくはブドウ糖および乳酸リンゲル注射剤など、非水性ビヒクル、例えば植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油もしくはピーナッツ油など、静菌もしくは静真菌濃度での抗菌剤、等張剤、例えば塩化ナトリウムもしくはブドウ糖など、緩衝液、例えばリン酸もしくはクエン酸緩衝液など、抗酸化剤、例えば硫酸水素ナトリウムなど、局所麻酔、例えばプロカイン塩酸塩など、懸濁および分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒロドキシプロピルメチルセルロースもしくはポリビニルピロリドンなど、乳化剤、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）など、封鎖もしくはキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）など、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。担体として利用される抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムならびにベンゼトニウム塩化物を含む複数用量容器中で医薬組成物に加えられてよい。好適な賦形剤として、例えば水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリンまたはエタノールが挙げられる。好適な無毒補助物質として、例えば、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）または薬剤、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンまたはシクロデキストリンなどが挙げられる。
投与、製剤および投与量
本発明の医薬組成物は、これだけに限らないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸内、腹腔内、皮内、局所、経皮的およびくも膜下腔内が挙げられる種々の経路によって、または他にインプラントまたは吸入によってそれを必要とする対象にｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。対象組成物は、これだけに限らないが、錠剤、カプセル、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、座薬、浣腸、注射、吸入薬およびアエロゾルが挙げられる；固体、流動体、液体またはガス形態にある調製物に製剤化され得る。適切な製剤および投与の経路は、目的の適用および治療レジメンにより選択され得る。
経腸的投与のために好適な製剤として、ハードおよびソフトゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（コートされた錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤ならびにこれらの放出制御形態が挙げられる。
非経口投与（例えば、注射による）のために好適な製剤として、活性成分が溶解、懸濁または他に（例えば、リポソームもしくは他の微粒子中に）提供される、水性または非水性、等張、発熱物質不含有、滅菌液（例えば、溶液、懸濁物）が挙げられる。かかる液体は、抗酸化剤、緩衝液、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤および、製剤を目的のレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質などの他の薬学的に許容される成分を追加的に含有できる。賦形剤の例として、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油などが挙げられる。かかる製剤における使用のための好適な等張性担体の例として、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液または乳酸リンゲル注射液が挙げられる。同様に、用量、時期および反復を含む具体的な投与量レジメンは具体的な個体および個々の病歴ならびに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的考察に依存する。
投与の頻度は、治療経過を通じて決定および調整されてよく、増殖性または腫瘍原性細胞の数を低減すること、かかる新生物細胞の低減を維持すること、新生物細胞の増殖を低減することまたは転移の発生を遅延することに基づく。一部の実施形態では、投与される投与量は、潜在的な副作用および／または毒性を管理するために調整または減じられてよい。代替的に、対象治療組成物の持続的連続的な放出製剤（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、好適である場合がある。
好適な投与量が患者によって変動する場合があることは、当業者によって理解される。最適投与量を決定することは、治療有効性のレベルに対する任意のリスクまたは有害な副作用のバランスに一般に関与する。選択された投与量レベルは、これだけに限らないが、具体的な化合物の活性、投与の経路、投与の時期、化合物の排出速度、処置の継続期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、状態の重症度ならびに患者の人種、性別、年齢、体重、状態、全体的な健康状態および病歴が挙げられる種々の要因に依存する。一般に投与量は、作用部位で局所濃度を達成し、実質的に害があるまたは有害な副作用を生じることなく望ましい効果を達成するように選択されるが、化合物の量および投与の経路は、最終的には医師、獣医師または臨床医の裁量である。
一般に、本発明の抗体またはその抗原結合性部分は、種々の範囲で投与され得る。これらとして、用量あたり約５μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重；用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重；用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲として、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重および用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。ある特定の実施形態では投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
いずれにしても、本発明の抗体またはその抗原結合性部分は、好ましくはそれを必要とする対象に必要に応じて投与される。投与の頻度の決定は、主治医などの当業者によって、処置される状態、処置される対象の年齢、処置される状態の重症度、処置される対象の全身の健康状態などを考慮して行われ得る。
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性部分を含む処置経過は、数週間または数カ月にわたる選択された薬物製品の複数用量を含む。さらに具体的には、本発明の抗体またはその抗原結合性部分は、毎日、２日ごと、４日ごと、毎週、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、毎月、６週間ごと、２カ月ごと、１０週間ごとまたは３カ月ごとに１回投与されてよい。これに関して、患者の応答および臨床診療に基づいて投与量が変更され得る、または間隔が調整され得ることは理解される。
投与量およびレジメンは、開示される治療用組成物について、１回または複数回の投与（複数可）を与えられた個体において経験的に決定され得る。例えば、個体は、本明細書に記載のとおり産生された治療組成物を投与量を漸増させて与えられてよい。選択された実施形態では、投与量は、経験的に決定されたまたは観察された副作用もしくは毒性にそれぞれに基づいて徐々に増加または低減または減じられてよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害または状態のマーカーは、以前記載のとおり追跡されてよい。がんについて、これらは、触診または目視を介した腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接測定；直接腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡的検査によって評価された改善；間接腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）または明細書に記載の方法により同定された腫瘍原性抗原の測定、疼痛または麻痺の減少；発声、視覚、呼吸または腫瘍に関連する他の身体障害の改善；食欲の増加；または認められた検査によって測定される生活の質の向上または生存期間の延長を含む。投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態のステージ、新生物状態が個体の他所に転移を始めたか否か、ならびに過去に使用されたおよび同時に使用される処置に応じて変動することは、当業者に明らかである。
非経口投与（例えば、静脈内注射）のために適合性の製剤は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分を約１０μｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。ある特定の選択された実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌを含む。他の好ましい実施形態では、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌを含む。
本発明の応用
本発明の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＯＸ４０の検出または免疫応答の増強を含む多数のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ有用性を有する。例えばこれらの分子は、培養中、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏの細胞に、またはヒト対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、種々の状況において免疫を増強するために投与され得る。免疫応答は、調節、例えば増大、刺激または上方制御され得る。
好ましい対象として、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が挙げられる。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞性免疫応答）を増大させることによって処置され得る障害を有するヒト患者を処置するために特に好適である。具体的な実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのがんの処置のために特に好適である。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＯＸ４０抗体は目的の抗原と共に投与されてよい、または抗原は処置される対象に既に存在する場合もある（例えば、担腫瘍またはウイルス保有対象）。ＯＸ４０に対する抗体が別の薬剤と共に投与される場合、２つはいずれの順でまたは同時に投与されてよい。
本発明は、抗体またはその一部とヒトＯＸ４０との間の複合体形成を可能にする条件下で試料および対照試料をヒトＯＸ４０に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分と接触させることを含む、試料中のヒトＯＸ４０抗原の存在を検出する、またはヒトＯＸ４０抗原の量を測定するための方法をさらに提供する。次いで複合体の形成は、検出され、対照試料と比較した試料間の異なる複合体形成は、試料中のヒトＯＸ４０抗原の存在を示す。さらに、本発明の抗ＯＸ４０抗体は、免疫親和性精製を介してヒトＯＸ４０を精製するために使用され得る。
がんを含む障害の処置
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性部分の治療有効量を処置を必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することを含む、哺乳動物において障害を処置する方法を提供する。例えば、障害はがんである。
ＯＸ４０が関連する種々のがんは、悪性または良性に関わらずおよび原発または二次に関わらず、本開示によって提供される方法によって処置または予防され得る。がんは、固形がんまたは血液悪性腫瘍であってよい。かかるがんの例として、肺がん、例えば気管支原性癌（例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞癌、大細胞癌および腺癌）、肺胞細胞癌、気管支腺腫、軟骨性過誤腫（非がん性）および肉腫（がん性）など；心臓がん、例えば粘液腫、線維腫および横紋筋腫など；骨がん、例えば骨軟骨腫、軟骨腫（ｃｏｎｄｒｏｍａｓ）、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、巨細胞腫瘍、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）および細網肉腫など；脳がん、例えば神経膠腫（例えば、多形神経膠芽腫）、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、脊索腫、シュワン腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果体腫、骨腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、胚細胞腫、テラトーマ、類皮嚢胞および血管腫など；消化器系におけるがん、例えば結腸がん、平滑筋腫、類表皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、胃腺癌、腸脂肪腫、腸神経線維腫、腸線維腫、大腸ポリープおよび結腸直腸がんなど；肝臓がん、例えば肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞癌、線維層板型癌、胆管細胞癌、肝芽腫および血管肉腫など；腎臓がん、例えば腎臓腺癌、腎臓細胞癌、グラヴィッツ腫瘍および腎盂の移行上皮癌など；膀胱がん；血液がん、例えば急性リンパ球性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性（骨髄球性、骨髄性、骨髄芽球、骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、セザリー症候群およびヘアリーセル白血病）、慢性骨髄球性（骨髄性、骨髄性、顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、菌状息肉症および骨髄増殖性障害（骨髄増殖性障害、例えば真性多血症、骨髄線維症、血小板血症および慢性骨髄球性白血病などを含む）など；皮膚がん、例えば基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、メラノーマ、カポジ肉腫およびパジェット病など；頭頸部がん；眼関連がん、例えば網膜芽細胞腫および眼内（ｉｎｔｒａｏｃｃｕｌａｒ）黒色癌など；男性生殖器系がん、例えば良性前立腺肥大症、前立腺がんおよび精巣がん（例えば、セミノーマ、テラトーマ、胚性癌腫および絨毛癌）など；乳がん；女性生殖器系がん、例えば子宮がん（子宮内膜癌）、子宮頸がん（子宮頸癌）、卵巣のがん（卵巣癌）、外陰癌、腟癌、卵管がんおよび胞状奇胎など；甲状腺がん（乳頭状、濾胞性、未分化または髄質性がんを含む）；褐色細胞腫（副腎）；副甲状腺の非がん性成長；膵臓がん；ならびに血液がん、例えば白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫など、が挙げられる。具体的な実施形態では、がんは結腸がんである。
一部の実施形態では、がんの例は、これだけに限らないが、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｉｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、Ｂ細胞増殖性障害およびメグズ症候群、が挙げられる。さらに具体的な例として、これだけに限らないが、再発または抵抗性ＮＨＬ、前線（ｆｒｏｎｔ ｌｉｎｅ）低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶ ＮＨＬ、化学療法抵抗性ＮＨＬ、前駆体Ｂリンパ芽球性白血病および／またはリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病および／または前リンパ性白血病および／または小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫および／またはリンパ形質細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、節外辺縁帯ＭＡＬＴリンパ腫、結節性辺縁帯リンパ腫、ヘアリーセル白血病、形質細胞腫および／または形質細胞性骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｃｅｎｔｅｒ）リンパ腫（濾胞性）、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、侵襲性ＮＨＬ（侵襲性前線ＮＨＬおよび侵襲性再発ＮＨＬを含む）、自己幹細胞移植後の再発または抵抗性ＮＨＬ、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆体（末梢）大型顆粒リンパ性白血病、菌状息肉症および／またはセザリー症候群、皮膚（皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ））リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、が挙げられる。
一部の実施形態では、がんの例として、これだけに限らないが、Ｂ細胞増殖性障害がさらに挙げられ、それは、これだけに限らないが、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））およびリンパ性白血病をさらに含む。かかるリンパ腫およびリンパ性白血病として、例えばａ）濾胞性リンパ腫、ｂ）小型非切れ込み核細胞性リンパ腫／バーキットリンパ腫（風土性バーキットリンパ腫、孤発性バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫を含む）、ｃ）辺縁帯リンパ腫（節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（粘膜内リンパ組織リンパ腫、ＭＡＬＴ）、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫および脾臓辺縁帯リンパ腫を含む）、ｄ）マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｅ）大細胞リンパ腫（Ｂ細胞びまん性大細胞型細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、血管中心性リンパ腫肺性Ｂ細胞リンパ腫を含む）、ｆ）ヘアリーセル白血病、ｇ）リンパ球性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、ｈ）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、ｉ）形質細胞腫瘍、形質細胞性骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫および／またはｊ）ホジキン病が挙げられる。
一部の他の実施形態では、障害は、自己免疫性疾患である。抗体またはその抗原結合性部分を用いて処置され得る自己免疫疾患の例として、自己免疫性脳脊髄炎、エリテマトーデスおよび関節リウマチが挙げられる。抗体またはその抗原結合性部分は、感染性疾患、炎症性疾患（アレルギー性喘息など）および慢性移植片対宿主病を処置または予防するためにも使用され得る。
免疫応答の刺激
一部の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合性部分を対象に、対象において免疫応答が増強されるように投与することを含む、対象において免疫応答を増強する（例えば、刺激する）方法も提供する。例えば、対象は哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象はヒトである。
用語「免疫応答を増強する」またはその文法的変化形は、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激する、誘発する、増加させる、改善するまたは増大させることを意味する。免疫応答は、細胞性応答（すなわち細胞媒介性、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介性など）または液性応答（すなわち抗体媒介性応答）であってよく、一次または二次免疫応答であってよい。免疫応答の増強の例として、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞活性および細胞溶解性Ｔ細胞の生成の増加が挙げられる。免疫応答の増強は、これだけに限らないが、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカインの放出（例えばＩＬ－２産生もしくはＩＦＮ－γ産生）、腫瘍の退縮、担腫瘍動物の生存期間、抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現および細胞傷害性が挙げられる、当業者に周知の多数のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ測定法を使用して評価され得る。典型的には、本開示の方法は、未処置哺乳動物または本明細書において開示される方法を使用して処置されていない哺乳動物による免疫応答と比較して、哺乳動物による免疫応答を増強する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、病原性微生物（ウイルスなど）に対するヒトの免疫応答を増強するために使用される。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合性部分は、ワクチンに対するヒトの免疫応答を増強するために使用される。一実施形態では、方法は、細胞性免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞応答を増強する。別の実施形態では、細胞性免疫応答は、ヘルパーＴ細胞応答である。さらに別の実施形態では、免疫応答は、サイトカイン産生、特にＩＦＮ－γ産生またはＩＬ－２産生である。抗体またはその抗原結合性部分は、病原性微生物（ウイルスなど）に対する、またはワクチンに対するヒトの免疫応答を増強するために使用され得る。
抗体またはその抗原結合性部分は、単独で単剤療法として、または化学療法もしくは放射線療法との組み合わせで使用され得る。
化学療法との併用
抗体またはその抗原結合性部分は、抗がん剤、細胞傷害剤または化学療法剤との組み合わせで使用され得る。
用語「抗がん剤」または「抗増殖剤」は、がんなどの細胞増殖性障害を処置するために使用され得る任意の薬剤を意味し、これだけに限らないが、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、血管新生阻害剤、減量剤、化学療法薬、放射線療法および放射線治療剤、標的化抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線治療および抗転移剤および免疫療法剤が挙げられる。選択された実施形態では、上に考察したとおり、かかる抗がん剤はコンジュゲートを含んでよく、開示される部位特異的抗体と投与前に会合されてよいことは理解される。さらに具体的には、ある特定の実施形態では、選択された抗がん剤は、操作された抗体の不対システインに本明細書に記載される操作されたコンジュゲートを提供するように連結される。したがって、かかる操作されたコンジュゲートは、本発明の範囲内であることが明確に期待される。他の実施形態では、開示される抗がん剤は、上に記載される異なる治療剤を含む部位特異的コンジュゲートと組み合わせて与えられる。
本明細書において使用される場合、用語「細胞傷害剤」は、細胞に毒性を有し、細胞の機能を減少させるもしくは阻害する、および／または細胞の破壊を生じる物質を意味する。ある特定の実施形態では、物質は、生体由来の天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例として、これだけに限らないが、小分子毒素または細菌の（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の（例えば、α－サルシン、レストリクトシン）、植物の（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ネオマイシンおよびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ））または動物の（例えば、細胞傷害性ＲＮａｓｅｓ、例えば細胞外膵臓ＲＮａｓｅｓなど；ＤＮａｓｅＩ、その断片および／または変種を含む）酵素的に活性な毒素が挙げられる。
本発明の目的のために「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖、および／または生存を非特異的に減少させるまたは阻害する化学物質を含む（例えば、細胞傷害性または細胞分裂阻害剤）。かかる化学薬品は、細胞成長または分裂のために必要な細胞内プロセスをしばしば対象とし、そのため一般に急速に増殖および分裂するがん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは微小管を脱重合し、それにより細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法薬は、がん性細胞または、がん性になるもしくは腫瘍原性後代（例えば、ＴＩＣ）を生成する可能性がある細胞を阻害する、または阻害するように設計されている任意の化学薬品を含み得る。かかる薬剤はしばしば投与され、例えばＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンにおいて併用でしばしば最も有効である。
本発明の部位特異的構築物との組み合わせで（部位特異的コンジュゲートの構成成分としてまたは未コンジュゲート状態のいずれかで）使用され得る抗がん剤の例は、これだけに限らないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）、サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似物、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビスアントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、ガリウム硝酸塩、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジン、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベルラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。本定義に同様に含まれるのは、腫瘍でホルモン作用を制御するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーターなど、副腎でのエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤および抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似物）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤など；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペラミシンならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体である。
放射線療法との併用
本発明は、抗体またはその抗原結合性部分と、放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡの損傷を誘導するための任意の機構、例えばガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との併用も提供する。放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、開示されるコンジュゲートは、標的化抗がん剤または他の標的化手段に関連して使用され得る。典型的には、放射線治療は、約１から約２週間の期間にわたってパルスで投与される。放射線治療は、頭頸部がんを有する対象に約６から７週間投与され得る。任意選択で放射線治療は、単一用量として、または複数、逐次用量として投与され得る。
診断
本発明は、増殖性障害を検出する、診断するまたはモニタリングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法、および腫瘍原性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための患者由来の細胞のスクリーニング方法を提供する。かかる方法は、患者または患者から得た試料（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれか）を本明細書に記載の抗体と接触させること、試料中の標的分子に結合するまたはそれを遊離する抗体の存在もしくは不在または会合のレベルを検出することを含む、がんの処置またはその進行をモニタリングするためにがんを有する個体を同定することを含む。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載の検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
一部の実施形態では、試料中の特定の細胞との抗体の会合は、試料が腫瘍原性細胞を含有する可能性があることを意味し、そのためがんを有する個体が本明細書に記載の抗体を用いて有効に処置され得ることを意味する。
試料は、多数のアッセイ、例えば放射線イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、競合的結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウエスタンブロット分析およびフローサイトメトリーアッセイによって分析され得る。適合可能なｉｎ ｖｉｖｏセラグノスティック（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃ）または診断アッセイは、当技術分野において認められた画像化またはモニタリング技術、例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影（例えばＣＡＴスキャン）、陽電子トモグラフィー（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波などを当業者によって公知であるとおり含み得る。
医薬パック（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐａｃｋ）およびキット
１つまたは複数の容器を含み、抗体またはその抗原結合性部分の１または複数用量を含む医薬パックおよびキットも提供される。ある特定の実施形態では、例えば、１つまたは複数の追加的薬剤を含んでまたは含まずに、抗体またはその抗原結合性部分を含む組成物の所定量を含有する単位投与量は、提供される。他の実施形態について、かかる単位投与量は、注射用の使い捨ての予め充填されたシリンジで供給される。さらに他の実施形態では、単位投与量に含有される組成物は、生理食塩水、ショ糖など；リン酸などの緩衝液を含んでよく；および／または安定で有効なｐＨ範囲に製剤化されてよい。代替的に、ある特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、適切な液体、例えば滅菌水または生理食塩水の添加で再構成され得る凍結乾燥粉剤として提供されてよい。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、これだけに限らないがショ糖およびアルギニンが挙げられる、タンパク質凝集を阻害する１つまたは複数の物質を含む。容器（複数可）上のまたは関連する任意の表示は、封入されたコンジュゲート組成物が選択される新生物疾患状態を処置するために使用されることを示す。
本発明は、部位特異的コンジュゲートおよび任意選択で１つまたは複数の抗がん剤の単一用量または複数用量投与単位を産生するためのキットも提供する。キットは、容器および、容器上にまたは関連する表示または添付文書を含む。好適な容器として、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよく、開示されるコンジュゲートの薬学的有効量をコンジュゲートされたまたは未コンジュゲートの形態で含有する。他の好ましい実施形態では、容器（複数可）は、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通できるストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってよい）を含む。かかるキットは、好適な容器に、操作されたコンジュゲートの薬学的に許容される製剤および任意選択で１つまたは複数の抗がん剤を同じまたは異なる容器に一般に含有する。キットは、診断または併用療法のいずれかのために他の薬学的に許容される製剤も含有し得る。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合性部分に加えて、かかるキットは、化学療法剤もしくは放射線治療薬；抗血管新生剤；抗転移剤；標的化抗がん剤；細胞傷害剤；および／または他の抗がん剤などの広範な抗がん剤の任意の１つまたは複数を含み得る。
さらに具体的にはキットは、開示される抗体またはその抗原結合性部分を、追加的構成成分を含んでまたは含まずに含有する単一の容器を有してよく、またはそれらは、望ましい薬剤それぞれについて別の容器を有し得る。コンジュゲーションのために併用治療が提供される場合、単一の溶液は、モル当量の併用で、または１つの構成成分が他を過度に超えてのいずれかで予め混合されていてよい。代替的にコンジュゲートおよびキットの任意選択の抗がん剤は、患者への投与の前は別の容器内で別々に維持されてよい。キットは、滅菌、薬学的に許容される緩衝液または他の希釈剤、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液およびブドウ糖溶液などを含有するために第２の／第３の容器手段も含んでよい。
キットの構成成分が１つまたは複数の溶液中に提供される場合、溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液または生理食塩水は特に好ましい。しかし、キットの構成成分は、乾燥粉剤（複数可）として提供されてもよい。試薬または構成成分が乾燥粉剤として提供される場合、粉剤は好適な溶媒の付加によって再構成され得る。溶媒が別の容器でも提供され得ることは想定される。
上に簡潔に示したとおり、キットは、それにより抗体またはその抗原結合性部分および任意選択の構成成分を患者に投与する手段、例えば、それから製剤が動物に注射もしくは導入され得るまたは身体の患部に適用され得る１つもしくは複数の針、Ｉ．Ｖ．バッグまたはシリンジまたは点眼器、ピペットまたは他の同様の装置さえ含有できる。本発明のキットは、バイアルなどおよび他の構成成分を、商業的販売のために封じ込めて入れるための手段、例えば、望ましいバイアルおよび他の装置が置かれ、保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器なども典型的には含む。
配列表および概要
多数の核酸およびアミノ酸配列を含む配列表が本出願に添付されている。以下の表Ａ、ＢおよびＣは、含まれている配列の概要を提供する。
完全ヒト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体である本明細書において開示される６個の例示的抗体は、それぞれ「１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ」、「１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ」、「１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ」、「１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ」、「１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ」および「１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ」と表される。
Figure 0007411575000001
Figure 0007411575000002
Figure 0007411575000003
Figure 0007411575000004
Figure 0007411575000005
このように全般的に説明された本発明は、例として提供され、本発明の限定であることが意図されていない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるだろう。実施例は、以下の実験が実施された全てのまたは唯一の実験であるということを示すことを意図していない。
実施例１
材料の調製
１．１免疫原生成
ＯＸ４０タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ｒｅｆ ＣＡＢ９６５４３．１）は、Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成され、改変発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に挿入された。マキシプレッププラスミドＤＮＡおよび挿入したＤＮＡ配列を、配列決定することによって確かめた。ヒトＦｃまたはＨｉｓタグとコンジュゲートした融合タンパク質ＯＸ４０ ＥＣＤを、ヒトＯＸ４０ ＥＣＤ遺伝子のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＥｘｐｉ－２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へのトランスフェクションによって取得した。５日後、上清を、一過性にトランスフェクトした細胞の培養から採取した。融合タンパク質を、免疫化およびスクリーニングの使用のために精製および定量した。
１．２基準抗体の作製
４種の基準抗体、すなわち、ＢＭＫ１、ＢＭＫ５、ＢＭＫ７、およびＢＭＫ１０を実施例における陽性対照として適用する。ＢＭＫ１は、米国特許第ＵＳ８２３６９３０Ｂ２号（Ｐｆｉｚｅｒ）からの１１Ｄ４のクローンに基づいて合成した。ＢＭＫ５は、米国特許出願第ＵＳ２０１４０３０８２７６号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ）からの１０６－２２のクローンに基づいて合成した。ＢＭＫ７は、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１６０５７６６７号（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）からのＯＸ４０ｍＡｂ２４のクローンに基づいて合成した。ＢＭＫ１０は、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１５１５３５１３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）からの１Ａ７．ｇｒ１のクローンに基づいて合成した。
１．３安定細胞株の樹立
抗体スクリーニングおよび検証のための手段を取得するために、ＯＸ４０トランスフェクタント細胞株を生成した。簡潔に述べると、ＣＨＯ－Ｋ１または２９３Ｆ細胞に全長ＯＸ４０を含有する改変発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００またはＰｌａｓＦｅｃｔトランスフェクションキットを製造業者のプロトコールに従って使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの４８～７２時間後に、トランスフェクトした細胞を、ブラストサイジンを含有する培地において選択のために培養した。これは、発現プラスミドがゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた細胞を経時的に選択し得る。同時に、細胞をＯＸ４０発現に関して検査した。発現を確かめた後、目的の単一クローンを限界希釈によって選び取り、大容量にスケールアップした。次いで、樹立したモノクローナル細胞株を、ブラストサイジンを含有する培地に維持した。
実施例２
抗体ハイブリドーマ生成
２．１免疫化および細胞融合
ヒトイディオタイプを有する機能的免疫グロブリンの最適な産生に有用なキメラポリヌクレオチドを含む、ＯＸ４０に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、ＯＭＴラットを使用して調製した。ラット系統は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０９３９０８号に記載されているように、ヒト重および軽鎖導入遺伝子を保有する。ＯＸ４０に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、６～８週齢のＯＭＴラットを、足蹠にリン酸アルミニウム（Ａｌｕｍ－Ｐｈｏｓ）中２０μｇのヒトＯＸ４０ ＥＣＤタンパク質を用いて、および最初の追加免疫のために皮下にＴｉｔｅｒＭａｘ中２０μｇのヒトＯＸ４０ ＥＣＤタンパク質を用いて免疫化し、免疫化を、Ａｌｕｍ－ＰｈｏｓおよびＴｉｔｅｒＭａｘ中のヒトＯＸ４０ ＥＣＤタンパク質を用いて２週ごとに繰り返した。血清抗体力価を、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって１または２週ごとに測定した。血清抗体力価が十分に高かった場合、ラットに、アジュバントを含まないＤＰＢＳ中４０μｇのヒトＯＸ４０ ＥＣＤタンパク質を用いて最終追加免疫を与えた。細胞融合を以下のように実施した：骨髄腫細胞ＳＰ２／０を調製し、骨髄腫細胞を融合の前週に解凍し、融合の前日まで毎日１：２に継代して、細胞を対数増殖期に保った。免疫化したＯＭＴラットのリンパ節から単離したＢリンパ球を骨髄腫細胞と組み合わせた（１：１．１の比）。細胞混合物を洗浄し、２×１０６細胞／ｍＬでＥＣＦ溶液に再懸濁した。細胞はＥＣＦに対する準備が整う。電子細胞融合後、融合チャンバからの細胞懸濁液を、より多くの培地を含有する滅菌チューブに直ちに移し、３７℃のインキュベータにおいて少なくとも２４時間インキュベートした。細胞懸濁液を混合し、９６ウェルプレートに移した（１×１０４細胞／ウェル）。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２において培養し、定期的にモニタリングした。クローンが十分大きかった場合、１００ｕＬの上清を、抗体スクリーニングのために組織培養プレートから９６ウェルアッセイプレートに移した。
２．２ハイブリドーマ上清のハイスループットスクリーニング
ＥＬＩＳＡを第１のスクリーニング法として使用して、ハイブリドーマ上清のヒトおよびサルＯＸ４０タンパク質への結合を試験した。簡潔に述べると、プレート（Ｎｕｎｃ）を、１ｕｇ／ｍＬのヒトまたはアカゲザルＯＸ４０ ＥＣＤの可溶性タンパク質を用いて４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、ハイブリドーマ上清を、コーティングしたプレートに移し、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、その後、二次抗体、すなわちヤギ抗ラットＩｇＧ ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ ＨＣｌによって停止した。４５０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
細胞膜上に発現した立体構造のＯＸ４０分子に対する抗ＯＸ４０抗体の天然結合を確認するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を、ＯＸ４０をトランスフェクトした細胞株に対して実施した。ヒトＯＸ４０を発現する２９３Ｆ細胞を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１×１０５細胞／ウェルの密度で移した。次いで、ハイブリドーマ上清を細胞に負荷し、４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄した後、二次抗体のヤギ抗ラットＡｌｅｘａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を加え、細胞と共に４℃で暗所にて３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁するかまたは４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、フローサイトメトリー（ＢＤ）によって分析した。親２９３Ｆ細胞株に結合する抗体を陰性対照として使用した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＴ細胞を使用して抗体の生物活性を試験することを第２のスクリーニング法として使用した。簡潔に述べると、ヒトＯＸ４０／ＣＤ４０融合タンパク質過剰発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーター細胞を上に記載したように構築した。細胞を、１０％ＦＢＳ、および選択として０．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を収集し、９６ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルで添加した。架橋用抗体のＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）、およびＲＰＭＩ１６４０完全培地で希釈したハイブリドーマ上清を細胞に添加し、次いで細胞を３７℃、５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。２日目に、再構成したルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し（５０μＬ／ウェル）、十分に混合した。ルシフェラーゼ強度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
２．３ハイブリドーマサブクローニング：
特異的結合および生物活性を第１のスクリーニングおよび確認スクリーニングを介して確かめた後、陽性ハイブリドーマ細胞株をサブクローニングのために使用した。簡潔に述べると、各ハイブリドーマ細胞株に関して、細胞を計数および希釈して、２００μＬのクローニング培地当たり１個の細胞を得た。細胞懸濁液を２つの９６ウェルプレートに２００μＬ／ウェルでプレーティングした。プレートを、ＥＬＩＳＡアッセイによって検査される準備が整うまで、３７℃、５％ＣＯ２において培養した。選択した単一クローンの消耗した上清（ＥＳＮ：ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収集し、抗体をさらなる特徴付けのために精製した。
実施例３
完全ヒト抗体分子の構築および精製
３．１ハイブリドーマ配列決定
ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙプラスミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）をＴｒｉｚｏｌ試薬と共に使用して、モノクローナルハイブリドーマ細胞から単離した。ＯＸ４０キメラ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖可変領域（ＶＬ）を以下のように増幅した。簡潔に述べると、最初にＲＮＡを、ここに記載されるように、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡに逆転写する。
Figure 0007411575000007
結果として得たｃＤＮＡを、目的とする遺伝子に特異的なプライマーを使用するその後のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ反応を以下のように行った。
Figure 0007411575000009
ＰＣＲ産物（１０μＬ）をｐＭＤ１８－Ｔベクターに挿入し、１０μＬのライゲーション産物をＴｏｐ１０コンピテント細胞に形質転換した。形質転換した細胞を２－ＹＴ＋Ｃａｂプレートにプレーティングして、一晩インキュベートした。陽性クローンを、Ｍ１３－４８およびＭ１３－４７プライマーを使用するＰＣＲによって検査し、続いて配列決定した。
ハイブリドーマクローン１．７．１０、１．６２．３、１．１３４．９、１．１８６．１９、および１．２１４．２３を、配列最適化およびさらなる評価のために選択した。
３．２抗体配列最適化
抗体配列最適化を、抗体をコードするヌクレオチド配列に、特定の部位における適切な修飾を導入することによって実行した。突然変異を除去するＰＴＭ（翻訳後修飾）部位を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異生成キットを製造業者のプロトコールに従って使用して、部位特異的突然変異生成によって導入した。
ハイブリドーマクローン１．６２．３重鎖のＣＤＲ１におけるアミノ酸ＮＧＧが脱アミド化部位として同定されたため、アンチセンス突然変異生成ヌクレオチドを設計して、以下の突然変異を「１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ」重鎖に導入した：ＮからＱ（ＮＧＧ－ＱＧＧ）、ＮからＳ（ＮＧＧ－ＳＧＧ）、またはＧからＡ（ＮＧＧ－ＮＡＧ）。クローン１．６２．３軽鎖のＣＤＲ１におけるアミノ酸Ｃがシステイン残基として同定されたため、セリンをシステインで置換した（ＣからＳ）。全ての突然変異を配列決定によって確かめた。
ＰＴＭ突然変異後の変異体間の比較を図１に示す。変異体をそれぞれ、抗体「１．６２．３－ｕ１－１－ＩｇＧ１Ｋ」、「１．６２．３－ｕ１－２－ＩｇＧ１Ｋ」、および「１．６２．３－ｕ１－２－ＩｇＧ１Ｋ」と命名する。抗体「１．６２．３－ｕ１－１－ＩｇＧ１Ｋ」はＮからＱの突然変異を含有し、「１．６２．３－ｕ１－２－ＩｇＧ１Ｋ」はＮからＳの突然変異を含有し、「１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ」はＧからＡの突然変異を含有する。
３．３完全ヒト抗体分子の構築および精製
ＯＸ４０ハイブリドーマ抗体のＶＨおよびＶＬを、上に記載したように増幅した。合成遺伝子を改変ヒトＩｇＧ１発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再びクローニングして、完全ヒト抗体を発現させた。Ｅｘｐｉ－２９３Ｆ細胞にベクターを、抗体発現のために一過性にトランスフェクトした。抗体を含有する培養上清を採取し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。
完全ヒトモノクローナル抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ（「１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ」として命名された配列最適化クローン）、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋをそれぞれ、ハイブリドーマクローン１．７．１０、１．６２．３、１．１３４．９、１．１８６．１９、および１．２１４．２３ハイブリドーマから取得した。それらの配列を表Ａ、Ｂ、およびＣに要約する。
実施例４
抗体特徴付け
４．１表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による完全動的結合親和性試験
抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）を使用するＳＰＲアッセイによって、ＯＸ４０に対する親和性および結合動態に関して特徴付けた。抗ヒトＩｇＧ抗体を、センサーチップ（ＣＭ５）に前固定し、泳動用緩衝液（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋、ＧＥ）中の抗ＯＸ４０抗体を、チップに注射した場合に捕捉した。次いで、様々な濃度のヒトまたはサルＯＸ４０および泳動用緩衝液を、１８０秒の会合相の間３０μＬ／分の流量でセンサーチップに流し、続いて解離した。会合および解離曲線を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔ２００ソフトウェアを使用して、１：１ラングミュア結合モデルによって適合させた。
実験の結果を以下の表５に示す。
表５に示すように、１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋを含む本発明の例証的な抗体は、高い特異性でヒトＯＸ４０に結合し、ＫＤは１．７９×１０－１０Ｍ～２．０８×１０－９Ｍである。
４．２フローサイトメトリーによる結合親和性分析
ヒトＯＸ４０を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５×１０４細胞／ｍＬの密度で移した。試験用抗体を、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）に１：２に段階希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。二次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＦＩＴＣ（ＩｇＧ １モル当たり３．２モルのＦＩＴＣ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を添加し、細胞と共に４℃で暗所にて３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１回洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ）によって分析した。蛍光強度を、定量的ビーズＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＭＥＳＦキット（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に基づいて、結合分子／細胞に換算した。各抗体のＫＤ値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５を使用して算出した。
フローサイトメトリーによる、ヒトＯＸ４０を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への抗ヒトＯＸ４０抗体の結合に関するデータを表６および図２に示す。データは、例証的な抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１ＫがヒトＯＸ４０を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合効率を十分に示すことを実証する。
表６および図２において実証されるように、抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌおよび１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、ＢＭＫ７およびＢＭＫ１０に匹敵するかまたははるかに高い高親和性で細胞表面ヒトＯＸ４０に結合する。
４．３抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０への結合
細胞に基づくＦＡＣＳを、抗ＯＸ４０抗体のＯＸ４０への結合活性を試験するために使用した。簡潔に述べると、ヒトＯＸ４０発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞または活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１×１０５細胞／ウェルの密度で移した。試験用抗体を、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）に段階希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄した後、二次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を加え、細胞と共に４℃で暗所にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁するかまたは４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、次いでフローサイトメトリー（ＢＤ）によって分析した。
フローサイトメトリーによる、抗ＯＸ４０抗体の活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞への結合に関するデータを図３に示す。データは、例証的な抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋが細胞表面ヒトＯＸ４０に用量依存的に結合することを示す。
４．４ ＯＸ４０に結合するリガンドの競合
ＥＬＩＳＡに基づく競合アッセイを使用して、抗ＯＸ４０抗体がＯＸ４０のＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）への結合を競合的に遮断することができるか否かを試験した。簡潔に述べると、プレート（Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍＬのヒトＯＸ４０ ＥＣＤを用いて４℃で一晩コーティングした。抗体をブロッキング緩衝液に段階希釈し、一定濃度のＯＸ４０Ｌと共に混合した。ブロッキングおよび洗浄後、抗体／ＯＸ４０Ｌ混合物をプレートに添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、その後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に１時間インキュベートして、ＯＸ４０ＬのＯＸ４０ ＥＣＤへの結合を検出した。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ ＨＣｌによって停止した。４５０ｎｍおよび５４０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
図４に示すように、例証的な抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、ＯＸ４０Ｌと競合的にヒトＯＸ４０に結合する。
４．５オルソログ（種間）試験
抗ＯＸ４０抗体のアカゲザルＯＸ４０に対する交差反応性を、細胞に基づくＦＡＣＳによって測定した。簡潔に述べると、アカゲザルＯＸ４０発現２９３Ｆ細胞を、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２×１０５細胞／ウェルの密度で移した。試験用抗体を、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）に段階希釈し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄した後、二次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を加え、細胞と共に４℃で暗所にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁するかまたは４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、次いでフローサイトメトリー（ＢＤ）によって分析した。
図５において実証されるように、例証的な抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、アカゲザルＯＸ４０をトランスフェクトした２９３Ｆ細胞への交差反応性結合を有する。
４．６相同体（ファミリー間）結合
ヒトＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＣＤ２７１ ＥＣＤを、プレート（Ｎｕｎｃ）に４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、試験用抗体を、ブロッキング緩衝液に希釈し、プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、その後、二次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ ＨＣｌによって停止した。４５０ｎｍおよび５４０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
ＥＬＩＳＡによる、ヒトＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、およびＣＤ２７１ ＥＣＤに対する抗ＯＸ４０抗体のファミリー間結合試験に関する結果を図６に示す。結果は、ＯＸ４０抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋが、ＯＸ４０（すなわちＣＤ１３４）に特異的に結合し、ヒトＣＤ４０、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７１に結合しないことを実証する。
４．７ ＢＭＫ抗体に対するエピトープビニング試験
抗ＯＸ４０抗体の結合エピトープを、ＥＬＩＳＡによって基準抗体に対してビニングした。試験用抗体を、プレート（Ｎｕｎｃ）に４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、ブロッキング緩衝液に希釈した一定濃度のヒトＯＸ４０タンパク質をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ビオチン化標準を段階希釈し、各ウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、その後、二次抗体のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、相互作用を２Ｍ ＨＣｌによって停止した。４５０ｎｍおよび５４０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃはそれぞれ、抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋの、基準抗体ＢＭＫ１（図７Ａ）、ＢＭＫ７（図７Ｂ）、およびＢＭＫ１０（図７Ｃ）に対するエピトープビニングを示す。図７Ａに示すように、抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、ＢＭＫ１と異なるビンを共有する。図７Ｂおよび７Ｃに示すように、抗体１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋおよび１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌは、ＢＭＫ７およびＢＭＫ１０と異なるビンを共有するが、抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、ＢＭＫ７およびＢＭＫ１０と類似または近似するビンを共有する。
４．８ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーターＴ細胞を使用した生物活性アッセイ
抗ＯＸ４０抗体の、ヒトＯＸ４０を介してシグナル伝達する能力を、ＯＸ４０／ＣＤ４０融合タンパク質およびＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞株を使用して、評価した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ試薬またはヒトＦｃγ受容体補体を発現する細胞を使用することによって架橋された抗ＯＸ４０抗体の生物活性を測定した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦκＢ－ルシフェラーゼレポーター細胞を、１０％ＦＢＳ、および選択として０．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。
複合体化状態における抗ＯＸ４０抗体の生物活性を決定するために、ＣＤ３２ｂ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞またはＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を使用して、抗体架橋を媒介し、Ｊｕｒｋａｔレポーター（ｒｅｐｏｒｔ）細胞上のＯＸ４０をクラスター化および活性化させる。ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を収集し、９６ウェルプレートに添加した。完全培地に段階希釈したＯＸ４０抗体を、ＣＤ３２ｂ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞、または架橋抗体の存在下において細胞に添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２において６時間または一晩インキュベートした。再構成したルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、十分に混合した。ルシフェラーゼ強度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。抗ＯＸ４０抗体を、可溶化状態における生物活性に関してさらに試験した。
図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、遊離抗体、またはＣＤ３２ｂ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞もしくは抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ試薬によるＦｃγＲ架橋抗体を使用した、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＯＸ４０刺激ＮＦκＢルシフェラーゼ活性に対する試験用抗体の効果を示す。（図８Ａ）遊離抗体、または（図８Ｂ）Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧもしくは（図８Ｃ）ＣＤ３２ｂ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞によって架橋された抗体のレポーター活性がそれぞれ示される。
図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃに示すように、架橋された抗体はＯＸ４０シグナル伝達を効果的に活性化させることができる。
４．９ 細胞に基づくアッセイによって試験された抗ＯＸ４０抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける機能
本実施例において使用するヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ヒトＰＢＭＣから単離した。細胞を完全ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁した。
４．９．１ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるインターロイキン２（ＩＬ－２）産生に対する抗ＯＸ４０抗体の効果
本アッセイでは、未組織培養処理平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、抗ＣＤ３を用いて４℃で一晩プレコーティングした。アッセイの当日、プレートを、完全ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄して、未結合抗体を除去した。新鮮単離ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を各ウェルに１００μＬの容量中１×１０５細胞／ウェルの密度で添加した。次いで、一定濃度の架橋用抗体のＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧおよび段階希釈したＯＸ４０抗体を１００μＬで混合し、プレートの各ウェルにさらに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２において３日間インキュベートし、次いで上清を、ＥＬＩＳＡによるＩＬ－２測定のために採取した。
図９は、抗ＣＤ３によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌に対する抗体の効果を示す。例証的な抗体（１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋを含む）が初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌を増強させたことが実証される。
４．９．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるサイトカインＩＦＮγ分泌およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対する抗ＯＸ４０抗体の効果
ＩＦＮγ産生およびＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を増強させることに対する抗ＯＸ４０抗体の効果を直接評価するために、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体と組み合わせたＯＸ４０シグナルを介してヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を共刺激するアッセイを実施した。簡潔に述べると、未組織培養処理平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、一定濃度の抗ＣＤ３と、異なる濃度の抗ＯＸ４０抗体との混合物１００μＬを用いてプレコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いで完全ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄して、未結合抗体を除去した。新鮮単離ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を各ウェルに２００μＬの容量中１×１０５細胞／ウェルの密度で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２において３日間インキュベートし、次いで上清を、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ測定のために採取した。細胞ペレットを採取して、３Ｈ－チミジンによって以下のようにＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を測定した：３Ｈ－チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を細胞培養プレートに０．５μＣｉ／ウェルで添加した。プレートを、５％ＣＯ２において３７℃で１６～１８時間培養した後、３Ｈ－チミジンの増殖細胞への取込みを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ ＮＸＴシンチレーション計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して決定した。
図１０は、抗ＣＤ３によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌に対する抗体の効果を示す。例証的な抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋが初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ分泌を増強させたことが実証される。
図１１は、抗ＣＤ３によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する抗体の効果を示す。例証的な抗体１．７．１０－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、１．６２．３－ｕ１－３－ＩｇＧ１Ｋ、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ、１．１８６．１９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋ、および１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋが初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を増強させたことが実証される。
４．９．３ Ｔｒｅｇ抑制機能に対するヒト抗ＯＸ４０抗体の効果
Ｔ細胞の亜集団であるＴｒｅｇは、重要な免疫調節細胞であり、自己寛容を維持することにおいて不可欠な役割を果たす。増加した数のＴｒｅｇは、複数のがんを有する患者に見出され、予後不良と関連したため、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は腫瘍成長と関連することが示唆されている。免疫抑制応答に対するヒト抗ＯＸ４０抗体の効果を直接評価するために、Ｔｒｅｇの機能を抗ＯＸ４０抗体の存在下と非存在下とにおいて比較した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５－エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞を、特異的抗ＣＤ２５マイクロビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して分離した。Ｔｅｆｆ細胞を、１×１０５細胞／５０μＬ／ウェルで播種し、１×１０５Ｔｒｅｇ／５０μＬ／ウェルと共に９６ウェル丸底プレート（ＢＤ）において共培養した。次いで、細胞を、架橋用抗体および抗ＯＸ４０抗体の存在下において、単球から誘導したヒト同種異系樹状細胞（ＤＣ）を１ＤＣ／１０Ｔｅｆｆ細胞で用いて刺激した。抗体無しまたはアイソタイプ抗体のいずれかを陰性対照として使用した。共培養を３７℃、５％ＣＯ２において５日間インキュベートした。細胞ペレットを５日目に収集して、３Ｈ－チミジン取込みによって測定したＴｅｆｆ増殖を決定した。
図１２は、Ｔｒｅｇ細胞の存在下における、樹状細胞によって誘導される初代ヒトＣＤ４＋Ｔエフェクター細胞の増殖に対する抗体の効果を示す。抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌおよび１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、制御性Ｔ細胞の抑制機能を逆転させることによってＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞増殖を回復させることができる。
４．１０ ＡＤＣＣおよびＣＤＣ試験：
ＯＸ４０は、多様な細胞型に発現する。抗ＯＸ４０抗体の、Ｆｃエフェクター機能を惹起する能力を評価するために、抗ＯＸ４０抗体を、ＯＸ４０発現細胞に対してＡＤＣＣおよびＣＤＣ作用を誘導することができるか否かに関して評価した。
図１３Ａは、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０の発現を示し、図１３Ｂは、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＯＸ４０の発現を示す。
４．１０．１ ＡＤＣＣ試験：
標的としてのＯＸ４０を発現するＪｕｒｋａｔ細胞または活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、および様々な濃度の抗ＯＸ４０抗体を、９６ウェル丸底プレート（ＢＤ）において３０分間プレインキュベートし、次いでエフェクターとしての同種異系ＰＢＭＣを、５０：１のエフェクター／標的比で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２において４時間保持した。標的細胞溶解を、ＬＤＨに基づく細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）によって決定した。４９２ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
図１４Ａおよび１４Ｂはそれぞれ、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１４Ａ）または活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（図１４Ｂ）に対するＯＸ４０抗体のＡＤＣＣ作用を示す。図１４Ａおよび１４Ｂに示すように、本開示の例証的な抗体、すなわち１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌおよび１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞および活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対して低いＡＤＣＣ作用を有する。
４．１０．２ ＣＤＣ試験：
標的としてのＯＸ４０を発現するＪｕｒｋａｔ細胞または活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、および様々な濃度の抗ＯＸ４０抗体を、９６ウェル丸底プレート（ＢＤ）において混合した。ヒト補体を、１：５０の最終希釈度で添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２において２時間保持した。標的細胞溶解を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。発光を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。
図１５Ａおよび１５Ｂはそれぞれ、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１５Ａ）または活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｂ）に対するＯＸ４０抗体のＣＤＣ作用を示す。図１５Ａおよび１５Ｂに示すように、本開示の例証的な抗体、すなわち１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌおよび１．２１４．２３－ｕ１－ＩｇＧ１Ｋは、ＯＸ４０過剰発現Ｊｕｒｋａｔ細胞および活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対して低いＣＤＣ作用を有する。
４．１１ドメインマッピング
ＯＸ４０抗体の結合ドメインを調査するために、一連のヒト／マウスＯＸ４０キメラ変異体を使用した。ＯＸ４０抗体は、マウスＯＸ４０およびヒトＣＤ４０のアミノ酸（あるいは、本明細書では「ａａ」と称される）配列においてそれぞれ６０％および２３％の同一性を共有するにもかかわらず、それらに対する交差反応性を有することなく、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する。簡潔に述べると、２２種の変異体（変異体「ｘ１」、「ｘ２」・・・「ｘ２２」と命名）を、ヒトＯＸ４０（ｈＰｒｏ１）の細胞外ドメインの以下の残基を対応するマウスＯＸ４０（ｍＰｒｏ１）アミノ酸またはヒトＣＤ４０アミノ酸（ｈＰｒｏ４０）と置き換えることによって構築した。
・ 変異体ｘ１：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１：ＣＲＤｍｏｘ４０＿１（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～６５はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ２：ｘＰｒｏ１．ＦＬ．ｘ２：ＣＲＤｍｏｘ４０＿２（ヒトＯＸ４０ ａａ６６～１０７はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ３：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ３：ＣＲＤｍｏｘ４０＿３（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８～１４６はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ４：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ４：ＣＲＤｍｏｘ４０＿４（ヒトＯＸ４０ ａａ１４７～２１４はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ５：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ５：ＣＲＤｍｏｘ４０＿１－２（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～１０７はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ６：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ６：ＣＲＤｍｏｘ４０＿２－３（ヒトＯＸ４０ ａａ６６～１４６はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ７：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ７：ＣＲＤｍｏｘ４０＿３－４（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８～２１４はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ８：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ８：ＣＲＤｍｏｘ４０＿１－３（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～１４６はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ９：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ９：ＣＲＤｍｏｘ４０＿２－４（ヒトＯＸ４０ ａａ６６～２１４はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１０：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１０：ＣＲＤｍｏｘ４０＿１，２，４（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～１０７および１４７～２１４はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１１：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１１：ＣＲＤｍｏｘ４０＿１，３，４（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～６５および１０８～２１４はマウス対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１２：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１２：ＣＲＤｈｃｄ４０＿１（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～６５はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１３：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１３：ＣＲＤｈｃｄ４０＿２（ヒトＯＸ４０ ａａ６６～１０７はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１４：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１４：ＣＲＤｈｃｄ４０＿３（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８～１４６はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１５：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１５：ＣＲＤｈｃｄ４０＿４（ヒトＯＸ４０ ａａ１４７～２１４はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１６：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１６：ＣＲＤｈｃｄ４０＿１－２（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～１０７はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１７：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１７：ＣＲＤｈｃｄ４０＿２－３（ヒトＯＸ４０ ａａ６６～１４６はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１８：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１８：ＣＲＤｈｃｄ４０＿３－４（ヒトＯＸ４０ ａａ１０８～２１４はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ１９：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ１９：ＣＲＤｈｃｄ４０＿１－３（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～１４６はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ２０：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ２０：ＣＲＤｈｃｄ４０＿２－４（ヒトＯＸ４０ ａａ６６～２１４はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ２１：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ２１：ＣＲＤｈｃｄ４０＿１，２，４（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～１０７および１４７～２１４はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
・ 変異体ｘ２２：ｘＰｒｏ１．ＦＬ－ｘ２２：ＣＲＤｈｃｄ４０＿１，３，４（ヒトＯＸ４０ ａａ２９～６５および１０８～２１４はヒトＣＤ４０ ａａ対応物と置き換える）
「ｘ１」～「ｘ２２」からの２２種の変異体をｐｃＤＮＡ３．０ベクターにクローニングし、２９３Ｆ細胞トランスフェクションのために使用した。簡潔に述べると、２９３Ｆ細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ培地を用いて１×１０６細胞／ｍＬの密度に希釈し、ウェル１つ当たり３ｍＬのアリコートを２４ウェルプレートに添加した。トランスフェクションを、２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。各トランスフェクションに関して、３μｇのＤＮＡを、１５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭＩ血清低減培地（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、次いで１５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭＩ血清低減培地に予め希釈した６μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ試薬と組み合わせた。ＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を２５℃で２０分間静置させた後、培養に添加した。トランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリーによって分析した。
抗体のキメラＯＸ４０変異体への結合をフローサイトメトリーによって分析した。簡潔に述べると、ＢＭＫ１０が２μｇ／ｍＬであることを除いては、１μｇ／ｍＬの抗体を、キメラＯＸ４０を発現した、トランスフェクトした２９３Ｆ細胞と共に４℃で１時間インキュベートし、次いで３μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｒ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）と共に４℃で４０分間インキュベートした。細胞を、フローサイトメーターを使用して分析した。
結果を以下の表７～９に示す。
Figure 0007411575000012
Figure 0007411575000013
Figure 0007411575000014
Figure 0007411575000015
表１０は、抗原結合に関与するＯＸ４０のドメイン（灰色で着色）を示す。
注：ＣＲＤはシステインリッチドメインを指し、「ＣＲＤ１」はヒトＯＸ４０のアミノ酸２９～６５を指し、「ＣＲＤ２」はヒトＯＸ４０のアミノ酸６６～１０７を指し、「ＣＲＤ３」はヒトＯＸ４０のアミノ酸１０８～１４６を指し、「ＣＲＤ４」はヒトＯＸ４０のアミノ酸１４７～２１４を指す。
４．１２ ＯＸ４０抗体はヒトＯＸ４０トランスジェニックモデルにおけるＭＣ３８結腸癌の成長を阻害する
本研究は、ＯＸ４０ヒト化Ｂ－ｈＴＮＦＲＳＦ４マウスのＭＣ３８結腸がんモデルにおける抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を評価した。
ＯＸ４０ヒト化Ｂ－ｈＴＮＦＲＳＦ４マウスを、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。マウスを一定の温度および湿度の個々の換気ケージにおいて、各ケージに５匹を収容して飼育した。
ＭＣ３８細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中に単層培養として、空気中５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃で維持した。腫瘍細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ処理によって週２回常法により継代培養した。指数増殖期に成長する細胞を、腫瘍接種のために採取および計数した。
各マウスに、０．１ｍＬのＰＢＳ中のＭＣ３８腫瘍細胞（３×１０５）を、腫瘍発生のために右腋窩（外側）の皮下に接種した。平均腫瘍体積が６５ｍｍ３に達したとき、動物を無作為にグループ化し、次いで有効性研究のために処置を開始した。全ての試験抗体および対照抗体は腹腔内（ＩＰ）注射によって週２回（ＢＩＷ）３週間（「ＢＩＷ×３」）投与された。詳細な情報を表１１に提供する。
Figure 0007411575000017
本研究における動物の取扱い、ケア、および処置に関する全ての手順は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の指針に従ったＷｕＸｉ Ａｐｐｔｅｃの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたガイドラインに従って実施した。規定のモニタリング時に、動物を、正常な行動、例えば移動性、食物および水の摂取（目視のみ）、体重増加／喪失（体重は毎日１回測定した）、眼／被毛の光沢の消失などに対する腫瘍成長および処置の任意の効果、ならびにプロトコールに記載されている任意の他の異常な効果に関して毎日検査した。死亡および観察された臨床徴候を、各サブセット内の動物の数に基づいて記録した。
腫瘍の大きさを、ノギスを使用して二次元的に週３回測定し、体積を式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径である）を使用してｍｍ３単位で測定した。次いで、腫瘍の大きさをＴ／Ｃ（％）値の算出のために使用する。相対腫瘍増殖率であるＴ／Ｃ（％）を、式：Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶは処置群相対腫瘍体積を意味し、ＣＲＴＶは陰性対照相対腫瘍体積を意味する）を使用して算出した。相対腫瘍体積を腫瘍測定に基づいて算出し、算出式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（Ｖ０は処置開始日の平均腫瘍体積であり、Ｖｔは１回の測定の平均腫瘍体積であり、ＴＲＴＶはＣＲＴＶと同じ日のデータを使用した）であった。
ＴＧＩを、式：ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００（Ｔｉは所与の日における処置群の平均腫瘍体積であり、Ｔ０は処置の１日目における処置群の平均腫瘍体積であり、ＶｉはＴｉと同じ日におけるビヒクル対照群の平均腫瘍体積であり、Ｖ０は処置の１日目におけるビヒクル群の平均腫瘍体積である）を使用して、各群に関して算出する。
平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を含む要約統計量を、各時点における各群の腫瘍体積に関して提供する。群間における腫瘍体積の差の統計分析および薬物相互作用の分析を、最良の治療時点において取得したデータに関して行った。一元配置分散分析を実施して、３つ以上の群間で腫瘍体積を比較した。有意なＦ統計量（処置分散の誤差分散に対する比）が取得された場合、群間の比較はゲイムス・ハウエル検定を用いて実行し、取得されなかった場合はダネットｔ（両側）を使用した。全てのデータを、ＳＰＳＳ１７．０を使用して分析した。０．０５未満のｐ値（ｐ＜０．０５）を統計的に有意であるとみなした。
実験のデータを表１２および１３、ならびに図１６および１７に示す。
Figure 0007411575000018
Figure 0007411575000019
ＯＸ４０抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１ＬはＭＣ３８結腸癌保有Ｂ－ｈＴＮＦＲＳＦ４マウスに対して有意な抗腫瘍活性をもたらし、抗体は腫瘍保有動物によって良好に忍容されたことがわかる。
４．１３エピトープマッピング
ＯＸ４０抗体の結合エピトープを調査するために、ヒトＯＸ４０に対するアラニンスキャニング実験を行い、抗体結合に対するそれらの効果を評価した。ヒトＯＸ４０のアラニン残基をグリシンコドンに突然変異させ、他の全ての残基（システイン残基と、ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｒ複合体（ＰＤＢ：２ＨＥＶ）に基づいて溶媒露出表面積が１０未満のＯＸ４０アミノ酸とを除く（ＳＡＳＡ＞１０を表面アミノ酸として設定））をアラニンコドンに突然変異させた。ヒトＯＸ４０細胞外ドメインの各残基に関して、点アミノ酸置換を、連続する２つのＰＣＲステップを使用して行った。ヒトＯＸ４０のＥＣＤとＣ末端ＨｉｓタグとをコードするｐｃＤＮＡ３．３－ＯＸ４０－ＥＣＤ．Ｈｉｓプラスミドを鋳型として使用し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ複数部位特異的突然変異生成キット（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用する第１のステップのＰＣＲのために１組の突然変異生成プライマーを使用した。Ｄｐｎ Ｉエンドヌクレアーゼを使用して、突然変異鎖合成反応後に親鋳型を消化した。第２のステップのＰＣＲにおいて、ＣＭＶプロモーター、ＯＸ４０の細胞外ドメイン、Ｈｉｓタグ、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリアデニル化から構成される直鎖状ＤＮＡ発現カセットを増幅し、２９３Ｆ細胞（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）において３７℃で一過性に発現させ、Ｈｉｓタグ定量ＥＬＩＳＡによって定量した。
モノクローナル抗体１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌ（２μｇ／ｍＬ）を、ＥＬＩＳＡ結合アッセイのためにプレートにコーティングした。定量したＯＸ４０突然変異体またはヒトＯＸ４０－ＥＣＤ．Ｈｉｓタンパク質を含有する上清と相互作用させた後、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（１：５０００、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ－Ａ００６１２、ＣＨＮ）を検出抗体として添加した。吸光度を対照突然変異体の平均に基づいて標準化した。結合倍率変化に対する追加のカットオフ（＜０．７５）を設定した後、最終決定エピトープ残基を、ドメインマッピング、エピトープマッピング、ならびに構造安定性に寄与するアミノ酸、例えばＣＲＤ３およびＣＲＤ４に属するａ．ａ．を含まない結晶構造を考慮することによって同定した。
抗体結合におけるＯＸ４０点突然変異の標準化倍率変化を表１４に示した。ホットスポットを、ドメインマッピング、アラニンスキャニング（カットオフ：結合倍率変化＜０．７５、ＳＡＳＡ＞１０）、ならびに構造安定性に寄与するアミノ酸、例えばＣＲＤ３およびＣＲＤ４に属するａ．ａ．を含まない結晶構造（ＰＤＢ：２ＨＥＶ）を考慮することによって同定した。表１５に示すように、１．１３４．９－ｕ１－ＩｇＧ１Ｌに対して８つのホットスポット位置が存在する。
Figure 0007411575000021
Figure 0007411575000022
Figure 0007411575000023
Figure 0007411575000024
当業者は、本発明がその趣旨または中心的性質から逸脱することなく他の具体的な形態において具現化され得ることをさらに理解するだろう。本発明の上述の説明はその例示的な実施形態のみを開示しているという点において、他の変形例が本発明の範囲内であると企図されていることが理解されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に詳細に記載された特定の実施形態に限定されない。むしろ、本発明の範囲および内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲に対する参照がなされるべきである。

Claims (14)

  1. 単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域、ならびに、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、
    （ａ）配列番号１５を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
    （ｂ）配列番号１７を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
    （ｃ）配列番号１９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
    （ｄ）配列番号１６を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
    （ｅ）配列番号１８を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
    （ｆ）配列番号２０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３、
    または、
    （ａ）配列番号２７を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
    （ｂ）配列番号２９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
    （ｃ）配列番号３１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
    （ｄ）配列番号２８を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
    （ｅ）配列番号３０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
    （ｆ）配列番号３２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３、
    または、
    （ａ）配列番号１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
    （ｂ）配列番号３を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
    （ｃ）配列番号５を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
    （ｄ）配列番号２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
    （ｅ）配列番号４を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
    （ｆ）配列番号６を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３、
    または、
    （ａ）配列番号７を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
    （ｂ）配列番号９を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
    （ｃ）配列番号１１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
    （ｄ）配列番号１４を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
    （ｅ）配列番号１０を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
    （ｆ）配列番号１２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３、
    または、
    （ａ）配列番号２１を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ１、
    （ｂ）配列番号２３を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ２、
    （ｃ）配列番号２５を含むかまたはそれからなるＣＤＲＨ３、
    （ｄ）配列番号２２を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ１、
    （ｅ）配列番号２４を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ２、および
    （ｆ）配列番号２６を含むかまたはそれからなるＣＤＲＬ３、
    を含む、単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  2. （ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
    （ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
    （ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３８のアミノ酸
    配列を含む軽鎖可変領域、または
    （ｄ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
    （ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
    （ｆ）配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１に記載の単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  3. 前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１に記載の単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  4. 前記抗体が、ＩｇＧの定常領域に融合されている、請求項１に記載の単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  5. 請求項１～４のいずれかに定義される単離された抗ＯＸ４０抗体の前記重鎖可変領域および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  6. 請求項５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  8. 請求項１～４のいずれかに定義される少なくとも１つの単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  9. 請求項１～４のいずれかに定義される抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分を調製するための方法であって、
    －核酸分子を含むベクターを含む宿主（ヒトを除く）細胞において前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分を発現させるステップであって、前記核酸分子は、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分の前記重鎖可変領域および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、ステップと
    －前記宿主（ヒトを除く）細胞から、前記抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分を単離するステップと
    を含む、方法。
  10. 対象における腫瘍細胞の転移を低減させる方法に用いられる、単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分であって、前記方法は、有効量の前記抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性部分を前記対象に投与するステップを含む、請求項１～４のいずれかに記載の単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  11. 対象における増殖性障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む疾患を処置または予防するための方法に用いられる、単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分であって、前記方法は、有効量の前記抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性部分を前記対象に投与するステップを含む、請求項１～４のいずれかに記載の単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  12. 前記増殖性障害ががんである、請求項１１に記載の単離された抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分。
  13. 増殖性障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を処置または診断するためのキットであって、請求項１～４のいずれかに定義される少なくとも１つの抗ＯＸ４０抗体またはその抗原結合性部分を含む容器を含む、キット。
  14. 前記増殖性障害ががんである、請求項１３に記載のキット。
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