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JP7479051B2 - Method for detecting plastic particles and kit for detecting plastic particles - Google Patents

Method for detecting plastic particles and kit for detecting plastic particles Download PDF

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JP7479051B2
JP7479051B2 JP2020148398A JP2020148398A JP7479051B2 JP 7479051 B2 JP7479051 B2 JP 7479051B2 JP 2020148398 A JP2020148398 A JP 2020148398A JP 2020148398 A JP2020148398 A JP 2020148398A JP 7479051 B2 JP7479051 B2 JP 7479051B2
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Description

本発明は、プラスチック粒子の検出方法およびプラスチック粒子の検出キットに関する。 The present invention relates to a method for detecting plastic particles and a kit for detecting plastic particles.

廃棄されたプラスチックごみは、紫外線または摩擦等で分解されることにより、小さなプラスチック粒子となる。該プラスチック粒子の中でも、長径が5mm以下のプラスチック粒子は、マイクロプラスチック粒子と呼ばれる。マイクロプラスチック粒子は、世界中の海中に存在することが知られている。海洋生物がマイクロプラスチック粒子を摂取することで、該マイクロプラスチック粒子に含まれている化学物質が、海洋生物の生体内にとりこまれる虞がある。 Discarded plastic waste breaks down into small plastic particles due to ultraviolet light or friction. Among these plastic particles, those with a long diameter of 5 mm or less are called microplastic particles. Microplastic particles are known to exist in oceans around the world. When marine organisms ingest microplastic particles, there is a risk that the chemicals contained in the microplastic particles will be taken up into the organisms of the marine organisms.

プラスチックの中には、性能改善のために添加剤として種々の化学物質が含まれている。例えば、耐候性を向上するための紫外線防止剤、酸化防止剤、着色のための顔料または可塑性を調整するための可塑剤等である。これらの化学物質の中には、過去に有害性が認められたため使用が禁止になった化学物質が含まれている。しかし現在でも、このような有害な化学物質を使用して生産されたプラスチックが、長い年月を経て海洋中を漂っている。実際、魚や貝にマイクロプラスチック粒子を摂食させると、生物的・物理的な様々な影響が見られることが明らかになった。近年、海洋生物の生体への、マイクロプラスチック粒子が与える影響が懸念されている。また、海洋のみでなく、ペットボトル飲料水からもマイクロプラスチック粒子が検出されており、問題が世界レベルで深刻化している。 Plastics contain various chemicals as additives to improve their performance. For example, UV inhibitors to improve weather resistance, antioxidants, pigments for coloring, and plasticizers to adjust plasticity. Some of these chemicals have been banned in the past because of their harmfulness. However, even today, plastics produced using such harmful chemicals have been floating around in the ocean for many years. In fact, it has become clear that feeding microplastic particles to fish and shellfish has various biological and physical effects. In recent years, there has been concern about the impact of microplastic particles on the living organisms of marine organisms. Microplastic particles have also been detected not only in the ocean but also in bottled drinking water, and the problem is becoming more serious on a global level.

さらに、マイクロプラスチック粒子に比べて、より微細な長径を有するナノプラスチック粒子もまた、海洋中に存在する。ナノプラスチック粒子は、長径が極めて小さい。そのため、ナノプラスチック粒子は、食物連鎖の下位に位置するプランクトンに摂取されやすい。ナノプラスチック粒子を摂取したプランクトンを魚等が食べることによって、ナノプラスチック粒子に含まれる化学物質、およびナノプラスチック粒子の表面に吸着した化学物質等の濃縮が食物連鎖の過程で生じる。それ故、食物連鎖において、魚よりも上位に位置する人類の生体への影響が懸念されている。 Furthermore, nanoplastic particles, which have a smaller long diameter than microplastic particles, are also present in the ocean. Nanoplastic particles have an extremely small long diameter. As a result, they are easily ingested by plankton, which is lower in the food chain. When fish and other creatures eat plankton that have ingested nanoplastic particles, the chemicals contained in the nanoplastic particles and the chemicals adsorbed to the surface of the nanoplastic particles become concentrated in the food chain. For this reason, there are concerns about the impact on the human body, which is higher in the food chain than fish.

マイクロプラスチック粒子およびナノプラスチック粒子により生じる、上述の懸念を解消するために、マイクロプラスチック粒子およびナノプラスチック粒子の検出・分析技術の向上が求められている。マイクロプラスチック粒子を検出する方法として、非特許文献1、2および3に記載されているように、顕微鏡を用いての、フーリエ変換赤外分光法またはラマン分光法が広く用いられている。 To resolve the above-mentioned concerns caused by microplastic particles and nanoplastic particles, there is a demand for improved detection and analysis techniques for microplastic particles and nanoplastic particles. As described in Non-Patent Documents 1, 2, and 3, Fourier transform infrared spectroscopy or Raman spectroscopy using a microscope is widely used as a method for detecting microplastic particles.

Brigitte Voit et. al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408, p.8377-8391, 2016Brigitte Voit et. al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408, p.8377-8391, 2016 Jesus J Ojeda et. al., Analytical Chemistry, 87, p.6032-6040, 2015Jesus J Ojeda et. al., Analytical Chemistry, 87, p.6032-6040, 2015 Torkel Gissel Nielsen et. al., Marine Pollution Bulletin, 100, p.82-91, 2015Torkel Gissel Nielsen et. al., Marine Pollution Bulletin, 100, p.82-91, 2015

しかしながら、上述の方法を用いたとしても、各顕微鏡の分解能以下の長径を有するプラスチック粒子は検出できず、例えば、長径が500nmより小さなプラスチック粒子は検出が困難である。それ故、例えば、可視光の波長360nm以下の長径を有するナノプラスチック粒子の検出には、上述の方法を用いることができない。 However, even if the above-mentioned method is used, plastic particles with a long diameter below the resolution of each microscope cannot be detected, and for example, plastic particles with a long diameter smaller than 500 nm are difficult to detect. Therefore, for example, the above-mentioned method cannot be used to detect nanoplastic particles with a long diameter of 360 nm or less, which is the wavelength of visible light.

本発明の目的は、微小なプラスチック粒子の高感度な検出方法を提供することにある。 The object of the present invention is to provide a highly sensitive method for detecting tiny plastic particles.

本発明者らは、前記方法を実現するために鋭意検討を重ねた結果、プラスチック粒子を暗視野で観察することにより、例えば可視光の波長以下の長径を有するプラスチック粒子の存在を検出・可視化することに成功した。すなわち、本発明の本発明の一実施形態は、以下の構成を包含する。 As a result of extensive research into the realization of the above-mentioned method, the inventors have succeeded in detecting and visualizing the presence of plastic particles, for example, having a major axis equal to or less than the wavelength of visible light, by observing the plastic particles in a dark field. That is, one embodiment of the present invention includes the following configuration.

<1>下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子と、前記プラスチック粒子に結合するペプチドと、前記ペプチドと結合する蛍光色素と、を混合する混合工程と、前記プラスチック粒子と、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第1の複合体を検出する検出工程と、を含むプラスチック粒子の検出方法; <1> A method for detecting plastic particles, comprising: a mixing step of mixing plastic particles having a structure represented by the following formula (1), a peptide that binds to the plastic particles, and a fluorescent dye that binds to the peptide; and a detection step of detecting a first complex of the plastic particles, the peptide, and the fluorescent dye;

Figure 0007479051000001
Figure 0007479051000001

なお、前記式(1)中、Rは、水素、塩素または炭素数6以下の有機基のいずれかであり、nは、2以上の整数である。 In the formula (1), R is either hydrogen, chlorine, or an organic group having 6 or less carbon atoms, and n is an integer of 2 or more.

<2>前記プラスチック粒子は、長径が360nm以下である、〔1〕に記載のプラスチック粒子の検出方法。 <2> The method for detecting plastic particles described in [1], wherein the plastic particles have a major axis of 360 nm or less.

<3>前記混合工程では、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第2の複合体を含む標識用組成物を、前記プラスチック粒子と混合する、<1>または<2>に記載のプラスチック粒子の検出方法。 <3> The method for detecting plastic particles described in <1> or <2>, in which in the mixing step, a labeling composition containing the peptide and a second complex with the fluorescent dye is mixed with the plastic particles.

<4>前記ペプチドは、ビオチンが結合しており、前記蛍光色素は、ストレプトアビジンが結合している、<1>から<3>の何れかに記載のプラスチック粒子の検出方法。 <4> The method for detecting plastic particles according to any one of <1> to <3>, wherein the peptide is bound to biotin and the fluorescent dye is bound to streptavidin.

<5>前記蛍光色素としてCy3を用いる、<1>から<4>の何れかに記載のプラスチック粒子の検出方法。 <5> A method for detecting plastic particles according to any one of <1> to <4>, in which Cy3 is used as the fluorescent dye.

<6>前記ペプチドは、以下の(a)または(b)の何れかに示すペプチドであり、前記プラスチック粒子は、ポリスチレン粒子である、<1>から<5>の何れかに記載のプラスチック粒子の検出方法;
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリスチレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
<6> The method for detecting plastic particles according to any one of <1> to <5>, wherein the peptide is a peptide shown in any one of the following (a) or (b), and the plastic particle is a polystyrene particle;
(a) a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1;
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, and having the activity of binding to the polystyrene particles.

<7>前記ペプチドは、以下の(c)または(d)の何れかに示すペプチドであり、前記プラスチック粒子は、ポリプロピレン粒子である、<1>から<5>の何れかに記載のプラスチック粒子の検出方法;
(c)配列番号5に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(d)配列番号5のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリプロピレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
<7> The method for detecting plastic particles according to any one of <1> to <5>, wherein the peptide is a peptide shown in any one of the following (c) or (d), and the plastic particle is a polypropylene particle;
(c) a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5;
(d) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and having the activity of binding to the polypropylene particles.

<8><1>から<7>の何れかに記載の前記ペプチドおよび前記蛍光色素を含む、下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子の検出キット; <8> A kit for detecting plastic particles having a structure represented by the following formula (1), comprising the peptide described in any one of <1> to <7> and the fluorescent dye;

Figure 0007479051000002
Figure 0007479051000002

なお、前記式(1)中、Rは、水素、塩素または炭素数6以下の有機基のいずれかであり、nは、2以上の整数である。 In the formula (1), R is either hydrogen, chlorine, or an organic group having 6 or less carbon atoms, and n is an integer of 2 or more.

本発明の一態様によれば、微小なプラスチック粒子の高感度な検出方法を提供できる。 According to one aspect of the present invention, a highly sensitive method for detecting tiny plastic particles can be provided.

本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との第2の複合体の一例を示す概略図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a second complex between the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention. 実施例1における、ポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of microscopic observation of polystyrene particles in Example 1. 実施例1における、ポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of microscopic observation of polystyrene particles in Example 1. 実施例1における、ポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of microscopic observation of polystyrene particles in Example 1. 実施例1における、ポリプロピレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of microscopic observation of polypropylene particles in Example 1. 実施例2における、長径の異なるポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing the results of microscopic observation of polystyrene particles having different major diameters in Example 2. 実施例3における、ポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。FIG. 13 is a diagram showing the results of microscopic observation of polystyrene particles in Example 3.

以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。本発明はまた、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「A~B」は、「A以上(Aを含みかつAより大きい)B以下(Bを含みかつBより小さい)」を意図する。 One embodiment of the present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited to this. The present invention is not limited to each configuration described below, and various modifications are possible within the scope of the claims. The present invention also includes embodiments and examples obtained by appropriately combining the technical means disclosed in different embodiments and examples. All academic literature and patent documents described in this specification are incorporated herein by reference. Furthermore, unless otherwise specified in this specification, "A to B" representing a numerical range means "A or more (including A and greater than A) and B or less (including B and smaller than B)."

本明細書中では、用語「ペプチド」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用され、ペプチド結合によってアミノ酸2個以上が結合した化合物を意味する。本明細書中では、アミノ酸の表記は、適宜IUPACおよびIUBの定める1文字表記または3文字表記を使用する。 In this specification, the term "peptide" is used interchangeably with "polypeptide" and means a compound in which two or more amino acids are linked by peptide bonds. In this specification, amino acids are represented by the one-letter or three-letter symbols specified by IUPAC and IUB, as appropriate.

〔1.プラスチック粒子の検出方法〕
本発明の一実施形態に係るプラスチック粒子の検出方法(以降、「本発明の検出方法」と称する)は、長径が360nm以下であり、かつ下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子(以降、「本発明のプラスチック粒子」と称する)と、前記プラスチック粒子に結合するペプチド(以降、「本発明のペプチド」と称する)と、前記ペプチドと結合する蛍光色素(以降、「本発明の蛍光色素」と称する)と、を混合する混合工程と、前記プラスチック粒子と、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第1の複合体を検出する検出工程と、を含む。
1. Method for detecting plastic particles
A plastic particle detection method according to one embodiment of the present invention (hereinafter referred to as the "detection method of the present invention") includes a mixing step of mixing plastic particles having a long axis of 360 nm or less and a structure shown in the following formula (1) (hereinafter referred to as the "plastic particles of the present invention"), a peptide that binds to the plastic particles (hereinafter referred to as the "peptide of the present invention"), and a fluorescent dye that binds to the peptide (hereinafter referred to as the "fluorescent dye of the present invention"), and a detection step of detecting a first complex between the plastic particles, the peptide, and the fluorescent dye.

Figure 0007479051000003
Figure 0007479051000003

前記構成によれば、本発明のプラスチック粒子が、本発明のペプチドを介して本発明の蛍光色素と第1の複合体を形成することにより蛍光標識される。そのため、蛍光標識された本発明のプラスチック粒子を暗視野で観察することにより、本発明のプラスチック粒子の存在を検出・可視化できる。特に、蛍光標識により、可視光の波長以下の長径を有するプラスチック粒子であっても、一般的な蛍光顕微鏡を用いての検出・可視化が可能となる。それ故、可視光の波長以下の長径のプラスチック粒子の検出方法を提供できる。 According to the above configuration, the plastic particles of the present invention are fluorescently labeled by forming a first complex with the fluorescent dye of the present invention via the peptide of the present invention. Therefore, the presence of the plastic particles of the present invention can be detected and visualized by observing the fluorescently labeled plastic particles of the present invention in a dark field. In particular, the fluorescent labeling makes it possible to detect and visualize even plastic particles with a major axis equal to or less than the wavelength of visible light using a general fluorescent microscope. Therefore, a method for detecting plastic particles with a major axis equal to or less than the wavelength of visible light can be provided.

以下では、本発明の一実施形態に係るプラスチック粒子の検出方法に用いられる材料についてまずは説明し、続いて、プラスチック粒子の検出方法の各工程について説明する。 Below, we will first explain the materials used in the plastic particle detection method according to one embodiment of the present invention, and then explain each step of the plastic particle detection method.

<1-1.材料>
(プラスチック粒子)
本発明の検出方法により検出されるプラスチック粒子は、下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子である。
<1-1. Materials >
(Plastic particles)
The plastic particles detected by the detection method of the present invention are plastic particles having a structure represented by the following formula (1).

Figure 0007479051000004
Figure 0007479051000004

前記式(1)中、Rは、水素、塩素または炭素数6以下の有機基のいずれかであり、nは、2以上の整数である。前記有機基は、例えば、メチル基、フェニル基、ヒドロキシ基およびニトリル基等が挙げられる。 In the formula (1), R is either hydrogen, chlorine, or an organic group having 6 or less carbon atoms, and n is an integer of 2 or more. Examples of the organic group include a methyl group, a phenyl group, a hydroxyl group, and a nitrile group.

前記式(1)で示される構造を有する本発明のプラスチック粒子は、例えば、下記式(2)に示されるポリエチレン、下記式(3)に示されるポリプロピレン、下記式(4)に示されるポリスチレン、下記式(5)に示されるポリ塩化ビニルおよび下記式(6)に示されるポリビニルアルコール等が挙げられる。 Examples of the plastic particles of the present invention having the structure shown in formula (1) include polyethylene shown in formula (2) below, polypropylene shown in formula (3) below, polystyrene shown in formula (4) below, polyvinyl chloride shown in formula (5) below, and polyvinyl alcohol shown in formula (6) below.

Figure 0007479051000005
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Figure 0007479051000006
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Figure 0007479051000007
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Figure 0007479051000008
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Figure 0007479051000009
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また、本発明の検出方法により検出されるプラスチック粒子には、前記式(1)で示される構造が、構造式の一部として含まれるようなプラスチック粒子が含まれる。このようなプラスチック粒子として、例えば、ABS(Acrylonitrile Butadiene Styrene)樹脂等の粒子が挙げられる。 The plastic particles detected by the detection method of the present invention include plastic particles that contain the structure shown in formula (1) as part of their structural formula. Examples of such plastic particles include particles of ABS (Acrylonitrile Butadiene Styrene) resin.

本発明の検出方法は、可視光の波長(すなわち、360nm)以下の長径を有するプラスチック粒子を検出できる。このようなプラスチック粒子として、例えば、長径が50nm以上360nm以下のプラスチック粒子が挙げられる。 The detection method of the present invention can detect plastic particles with a major axis equal to or less than the wavelength of visible light (i.e., 360 nm). Examples of such plastic particles include plastic particles with a major axis of 50 nm or more and 360 nm or less.

本発明のプラスチック粒子は、例えば、海水、下水、海中または河川の堆積物、砂への混在、魚等の水中生物の消化器官およびプランクトン等の生体等に含まれる。それ故、海水、下水、海中または河川の堆積物、砂への混在、魚等の水中生物の消化器官およびプランクトン等の生体等を採取し、前記プラスチック粒子を検出するための試料とすることができる。 The plastic particles of the present invention are contained in, for example, seawater, sewage, marine or river sediments, mixed in sand, the digestive organs of aquatic organisms such as fish, and living organisms such as plankton. Therefore, seawater, sewage, marine or river sediments, mixed in sand, the digestive organs of aquatic organisms such as fish, and living organisms such as plankton can be collected and used as samples for detecting the plastic particles.

(ペプチド)
本発明のペプチドは、本発明のプラスチック粒子が有する、上述の各構造に対して結合するアミノ酸配列を含む。本発明のペプチドのアミノ酸配列は、検出対象のプラスチック粒子を構成するプラスチックの種類に応じて、適宜決定される。
(peptide)
The peptide of the present invention contains an amino acid sequence that binds to each of the above-mentioned structures possessed by the plastic particles of the present invention. The amino acid sequence of the peptide of the present invention is appropriately determined depending on the type of plastic constituting the plastic particles to be detected.

例えば、検出対象のプラスチック粒子がポリスチレン粒子である場合、本発明のペプチドは、以下の(a)または(b)の何れかに示すペプチドである;
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリスチレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
For example, when the plastic particles to be detected are polystyrene particles, the peptide of the present invention is a peptide shown in either (a) or (b) below:
(a) a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1;
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and having the activity of binding to the polystyrene particles.

前記(a)に示すペプチドは、文献(Michimasa Kishimoto et al., Biotechnology Journal. 2009, 4, 1178-1189)に開示されている通り、ポリスチレンに結合することが証明されている。また、前記(a)に示すペプチドは、該文献に開示の方法によって得られる。また、該文献に開示されている通り、配列番号2、配列番号3、および配列番号4に示すアミノ酸配列を含むペプチドもまた、ポリスチレンに結合する。配列番号2に示すアミノ酸配列は、配列番号1に示すアミノ酸配列の、2番目および4番目の残基をアラニンに置換したものである。配列番号3に示すアミノ酸配列は、配列番号1に示すアミノ酸配列の、2番目および4番目の残基をアラニンに置換し、2番目の残基と3番目の残基との間にフェニルアラニンを挿入し、4番目の残基と5番目の残基との間にセリンを挿入し、さらに末尾にプロリンを付加したものである。配列番号4に示すアミノ酸配列は、配列番号1に示すアミノ酸配列の、2番目および4番目の残基をアラニンに置換し、8番目の残基をリジンに置換し、2番目の残基と3番目の残基との間にフェニルアラニンを挿入し、4番目の残基と5番目の残基との間にセリンを挿入し、さらに末尾にプロリンを付加したものである。 The peptide shown in (a) above has been shown to bind to polystyrene, as disclosed in the literature (Michimasa Kishimoto et al., Biotechnology Journal. 2009, 4, 1178-1189). The peptide shown in (a) above can be obtained by the method disclosed in the literature. As disclosed in the literature, peptides containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, and SEQ ID NO:4 also bind to polystyrene. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 with the second and fourth residues replaced with alanine. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 with the second and fourth residues replaced with alanine, with phenylalanine inserted between the second and third residues, with serine inserted between the fourth and fifth residues, and with proline added to the end. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4 is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, with the second and fourth residues substituted with alanine, the eighth residue substituted with lysine, a phenylalanine inserted between the second and third residues, a serine inserted between the fourth and fifth residues, and a proline added to the end.

このように、配列番号1に示すアミノ酸配列の2番目、4番目、または8番目の残基を置換したアミノ酸配列を含むペプチドは、ポリスチレンに結合するといえる。また、配列番号1に示すアミノ酸配列の、2番目の残基と3番目の残基との間にアミノ酸を挿入したアミノ酸配列を含むペプチドまたは4番目の残基と5番目の残基との間にアミノ酸を挿入したアミノ酸配列を含むペプチドについても、ポリスチレンに結合するといえる。また、配列番号1に示すアミノ酸配列の末尾にアミノ酸を付加したアミノ酸配列を含むペプチドについても、ポリスチレンに結合するといえる。 In this way, a peptide containing an amino acid sequence in which the second, fourth, or eighth residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 has been substituted can be said to bind to polystyrene. A peptide containing an amino acid sequence in which an amino acid has been inserted between the second and third residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, or a peptide containing an amino acid sequence in which an amino acid has been inserted between the fourth and fifth residues can also be said to bind to polystyrene. A peptide containing an amino acid sequence in which an amino acid has been added to the end of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 can also be said to bind to polystyrene.

したがって、前記(b)に示すペプチドも、ポリスチレンに結合することが証明されている。それ故、前記(b)に示すペプチドも、本発明の一実施形態に係るペプチドとして採用できる。 Therefore, it has been proven that the peptide shown in (b) above also binds to polystyrene. Therefore, the peptide shown in (b) above can also be used as a peptide according to one embodiment of the present invention.

また、検出対象のプラスチック粒子が、ポリプロピレン粒子である場合、本発明のペプチドは、以下の(c)または(d)の何れかに示すペプチドである;
(c)配列番号5に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(d)配列番号5のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリプロピレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
When the plastic particles to be detected are polypropylene particles, the peptide of the present invention is a peptide shown in either (c) or (d) below:
(c) a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5;
(d) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and having the activity of binding to the polypropylene particles.

前記(c)に示すペプチドは、文献(米国特許公報US7928076号公報)に開示されている通り、ポリプロピレンに結合することが証明されている。また、該文献に開示されている通り、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むペプチドもまた、ポリプロピレンに結合する。配列番号6に示すアミノ酸配列は、配列番号5に示すアミノ酸配列と同様に、配列番号11に示すアミノ酸配列を含んでいる。すなわち、配列番号5に示すアミノ酸配列の1番目、5番目および7番目のセリン以外の残基を置換したアミノ酸配列を含むペプチドについても、ポリプロピレンに結合するといえる。したがって、前記(d)に示すペプチドも、ポリプロピレンに結合することが証明されている。それ故、前記(d)に示すペプチドも、本発明の一実施形態に係るペプチドとして採用できる。 The peptide shown in (c) has been proven to bind to polypropylene, as disclosed in the literature (US Patent Publication US7928076). Also, as disclosed in the literature, a peptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 also binds to polypropylene. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6 contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:11, as well as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5. In other words, it can be said that a peptide containing an amino acid sequence in which residues other than the 1st, 5th, and 7th serines in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5 are substituted also binds to polypropylene. Therefore, the peptide shown in (d) has also been proven to bind to polypropylene. Therefore, the peptide shown in (d) can also be adopted as a peptide according to one embodiment of the present invention.

前記構成によれば、ポリスチレンまたはポリプロピレンに結合するペプチドを用いることにより、可視光の波長以下の長径の、ポリスチレン粒子またはポリプロピレン粒子を検出する検出方法を提供できる。 According to the above configuration, by using a peptide that binds to polystyrene or polypropylene, a detection method can be provided for detecting polystyrene particles or polypropylene particles with a major axis equal to or smaller than the wavelength of visible light.

なお、前記「1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数(例えば10個以下であってもよく、9個以下であってもよく、8個以下であってもよく、7個以下であってもよく、6個以下であってもよく、5個以下であってもよく、4個以下であってもよく、3個以下であってもよく、2個以下であってもよく、1個であってもよい)のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されていることを意味する。また本発明のペプチドは、糖鎖またはイソプレノイド基等のペプチド以外の構造をさらに含む複合ペプチドであってもよい。本発明のペプチドに含まれるアミノ酸は修飾されていてもよい。また本発明のペプチドに含まれるアミノ酸はL型であっても、D型であってもよい。 The phrase "one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added" means that the number of amino acids that can be substituted, deleted, inserted, or added by a known method for producing mutant peptides, such as site-directed mutagenesis (for example, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1) has been substituted, deleted, inserted, and/or added. The peptide of the present invention may also be a complex peptide further including a structure other than a peptide, such as a sugar chain or an isoprenoid group. The amino acids contained in the peptide of the present invention may be modified. The amino acids contained in the peptide of the present invention may be L-type or D-type.

本発明のペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、ペプチドの発現ベクターが導入された形質転換体によって発現されても、化学合成されてもよい。すなわち、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。化学合成法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置(Model MultiPep RS(Intavis AG)等)を利用することができる。 The peptides of the present invention can be easily produced according to any method known in the art, for example, they can be expressed by a transformant into which an expression vector for the peptide has been introduced, or they can be chemically synthesized. That is, polynucleotides encoding the peptides of the present invention are also within the scope of the present invention. Examples of chemical synthesis methods include solid-phase and liquid-phase methods. In the solid-phase method, for example, various commercially available peptide synthesizers (Model MultiPep RS (Intavis AG), etc.) can be used.

(蛍光色素)
本発明の蛍光色素は、本発明のペプチドと結合して複合体を形成することにより、本発明のペプチドを標識する。当該複合体の形成については後述する。本発明の蛍光色素としては特に限定されず、適宜、公知の蛍光色素を用いることが可能である。本発明の蛍光色素としては、例えば、Cy3、Cy5、PE(phycoerythrin)、FITC(fluorescein isothiocyanete)、フルオロセイン、DyLight(登録商標)488、AlexaFluor(登録商標)488、ATTO(登録商標)488、CF(登録商標)488、CF(登録商標)488A、DyLight(登録商標)550、CF(登録商標)555、Cy2、ローダミングリーン、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)546、Alexa Fluor(登録商標)555、Alexa Fluor(登録商標) 568、Alexa Fluor(登録商標)594、CF(登録商標)568、CF(登録商標)594、DY547等を挙げることができる。また、ストークシフトの大きい蛍光色素であるDY480XL、DY485XLおよびDyLight(登録商標)510-LS等は、自然界には殆ど存在しない特徴的な蛍光波長を有する。そのためこれらの蛍光色素は、自然界の物質が有する自家蛍光と識別が容易である。したがって、本発明のプラスチック粒子を検出するための試料に自家蛍光を発する粒子が多く含まれている場合に、これらのストークシフトの大きい蛍光色素が、本発明の蛍光色素として好ましい。なお、本発明の蛍光色素はこれらに限定されない。
(Fluorescent dye)
The fluorescent dye of the present invention binds to the peptide of the present invention to form a complex, thereby labeling the peptide of the present invention. The formation of the complex will be described later. The fluorescent dye of the present invention is not particularly limited, and any known fluorescent dye can be used as appropriate. Examples of the fluorescent dye of the present invention include Cy3, Cy5, PE (phycoerythrin), FITC (fluorescein isothiocyanete), fluorescein, DyLight (registered trademark) 488, AlexaFluor (registered trademark) 488, ATTO (registered trademark) 488, CF (registered trademark) 488A, DyLight (registered trademark) 550, CF (registered trademark) 555, Cy2, rhodamine green, rhodamine, Alexa Fluor (registered trademark) 546, Alexa Fluor (registered trademark) 555, Alexa Fluor (registered trademark) 568, Alexa Fluor (registered trademark) 594, CF (registered trademark) 568, CF (registered trademark) 594, DY547, and the like. In addition, fluorescent dyes with large Stokes shifts, such as DY480XL, DY485XL, and DyLight (registered trademark) 510-LS, have characteristic fluorescent wavelengths that are rarely found in nature. Therefore, these fluorescent dyes are easily distinguished from the autofluorescence of natural substances. Therefore, when a sample for detecting plastic particles of the present invention contains a large number of particles that emit autofluorescence, these fluorescent dyes with large Stokes shifts are preferred as the fluorescent dyes of the present invention. Note that the fluorescent dyes of the present invention are not limited to these.

これらの蛍光色素は、1種を単独で用いてもよく、複数種を組み合わせて用いてもよい。蛍光顕微鏡を用いて目視により前記プラスチック粒子を検出する場合、検出対象を見易くするという観点から、本発明の蛍光色素は、可視光領域の蛍光を発することが好ましい。このような蛍光色素として、特にCy3またはCF(登録商標)488を用いることが好ましい。前記構成によれば、フィルターを介してCy3またはCF(登録商標)488の蛍光発色を目視により観察し易く、かつ蛍光発色の強度も十分強い。そのため、長径が360nm以下の微小なプラスチック粒子であっても、検出が容易となる。 These fluorescent dyes may be used alone or in combination. When detecting the plastic particles visually using a fluorescence microscope, it is preferable that the fluorescent dye of the present invention emits fluorescence in the visible light range in order to make the detection target easier to see. It is particularly preferable to use Cy3 or CF (registered trademark) 488 as such a fluorescent dye. According to the above configuration, the fluorescent color of Cy3 or CF (registered trademark) 488 can be easily observed visually through a filter, and the intensity of the fluorescent color is also sufficiently strong. Therefore, even minute plastic particles with a major axis of 360 nm or less can be easily detected.

(ペプチドおよび蛍光色素の複合体)
ここで、図1を用いて、本発明のペプチドおよび本発明の蛍光色素の一例を簡潔に説明する。図1は、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との第2の複合体の一例を示す概略図である。図1に示すように、例えば、ビオチンを結合させた本発明のペプチド(プラスチック結合ペプチド)と、ストレプトアビジンとを結合させた本発明の蛍光色素を用いることで、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との第2の複合体を形成することが可能である。ストレプトアビジンは4量体を形成する性質を有しているため、1つの「蛍光色素と結合したストレプトアビジン」に対して4つの「ペプチドに結合したビオチン」が結合して第2の複合体を形成する。1つの第2の複合体は、4つのペプチドを介してプラスチック粒子に結合することができるので、第2の複合体とプラスチック粒子との間の結合力が極めて高くなる。したがって、第2の複合体を用いれば、極めて高感度にてプラスチック粒子を検出することができる。
(Peptide and fluorescent dye complex)
Here, an example of the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention will be briefly described with reference to FIG. 1. FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a second complex of the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention. As shown in FIG. 1, for example, by using the peptide of the present invention (plastic binding peptide) bound to biotin and the fluorescent dye of the present invention bound to streptavidin, it is possible to form a second complex of the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention through the binding of biotin and streptavidin. Since streptavidin has the property of forming a tetramer, four "biotins bound to peptides" are bound to one "streptavidin bound to a fluorescent dye" to form a second complex. Since one second complex can bind to a plastic particle via four peptides, the binding strength between the second complex and the plastic particle is extremely high. Therefore, by using the second complex, plastic particles can be detected with extremely high sensitivity.

ペプチドにビオチンを結合する方法は特に限定されない。例えば、ビオチンとペプチドとを直接結合させても間接的に結合させてもよい。ペプチドの構造をできるだけ正常に維持するという観点からは、ビオチンとペプチドとを間接的に結合させることが好ましいといえる。ビオチンとペプチドとを間接的に結合させる場合には、例えば、本発明のペプチドに任意のリンカーを連結した後に、ペプチドと連結したリンカーに対してビオチンを結合させればよい。 There is no particular limitation on the method of binding biotin to the peptide. For example, biotin and the peptide may be directly or indirectly bound. From the viewpoint of maintaining the peptide structure as normally as possible, it is preferable to indirectly bind biotin to the peptide. When indirectly binding biotin to the peptide, for example, an arbitrary linker may be linked to the peptide of the present invention, and then biotin may be bound to the linker linked to the peptide.

リンカーは、ポリペプチドからなるリンカー(本明細書中では、「ペプチドリンカー」ともいう。)であってもよいし、ビオチンとペプチドとを連結することが可能な周知の架橋剤またはスペーサーアーム等であってもよい。 The linker may be a linker made of a polypeptide (also referred to as a "peptide linker" in this specification), or may be a well-known cross-linking agent or spacer arm capable of linking biotin to a peptide.

ペプチドリンカーの場合、リンカーの長さおよびそれを構成するアミノ酸の種類は、当業者により適宜設定され得る。ペプチドリンカーの長さは、別段限定されるものではなく、通常、1~20個、好ましくは、1~10個(例えば、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個または1個)のアミノ酸からなるリンカーが使用される。また、ペプチドリンカーに用いられるアミノ酸の種類も、別段限定されるものではないが、例えば、グリシン(G)、セリン(S)、スレオニン(T)等が使用され得る。とりわけ、GGS、GGGS(配列番号7)、GGGGS(配列番号8)等のペプチドリンカー、および、これらが複数回繰り返されたペプチドリンカー(例えば、GGGSGGGS(配列番号9)、GGGSGGGSGGGS(配列番号10)等)が好ましく用いられる。なお、上述の配列番号10に示すペプチドリンカーは、文献(WO2019/039179)に開示される配列である。 In the case of a peptide linker, the length of the linker and the type of amino acid that constitutes it can be appropriately set by a person skilled in the art. The length of the peptide linker is not particularly limited, and a linker consisting of 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids (e.g., 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1) is usually used. The type of amino acid used in the peptide linker is also not particularly limited, and for example, glycine (G), serine (S), threonine (T), etc. can be used. In particular, peptide linkers such as GGS, GGGS (SEQ ID NO: 7), GGGGS (SEQ ID NO: 8), and peptide linkers in which these are repeated multiple times (e.g., GGGSGGGS (SEQ ID NO: 9), GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 10), etc.) are preferably used. The peptide linker shown in SEQ ID NO: 10 above is a sequence disclosed in the literature (WO2019/039179).

リンカーにビオチンを結合する方法は特に限定されず、例えば、ペプチドリンカーのC末端側に、ポリエチレングリコール基を介して、リンカーにビオチンを結合させてもよい。 The method for binding biotin to the linker is not particularly limited. For example, biotin may be bound to the linker via a polyethylene glycol group on the C-terminus side of the peptide linker.

前記「蛍光色素と結合したストレプトアビジン」は、例えば、市販品を用いることができる。市販品としては、例えば、Streptavidin Cy3 Conjugate(Thermo Fisher Scientific社)等が挙げられる。また、ストレプトアビジンに、公知の蛍光標識試薬(例えば、ラベル化剤等)を添加することにより、ストレプトアビジンに本発明の蛍光色素を結合させてもよい。 The "streptavidin bound to a fluorescent dye" may be, for example, a commercially available product. Examples of commercially available products include Streptavidin Cy3 Conjugate (Thermo Fisher Scientific). In addition, the fluorescent dye of the present invention may be bound to streptavidin by adding a known fluorescent labeling reagent (for example, a labeling agent, etc.) to streptavidin.

また、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との結合は、ビオチンおよびストレプトアビジンを介した結合に限られない。例えば、本発明のペプチドへ、公知の蛍光標識試薬(例えば、ラベル化剤等)を添加することにより、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素とを直接結び付けるような結合等であってもよい。 The binding between the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention is not limited to binding via biotin and streptavidin. For example, the peptide of the present invention may be directly bound to the fluorescent dye of the present invention by adding a known fluorescent labeling reagent (e.g., a labeling agent, etc.) to the peptide of the present invention.

なお、上述の通り、極めて高感度にてプラスチック粒子を検出するという観点からは、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との結合は、4量体を形成する性質を有するストレプトアビジンと、ビオチンとを介した結合であることが好ましい。 As mentioned above, from the viewpoint of detecting plastic particles with extremely high sensitivity, it is preferable that the peptide of the present invention is bound to the fluorescent dye of the present invention via streptavidin, which has the property of forming a tetramer, and biotin.

<1-2.工程>
(混合工程)
混合工程では、本発明のプラスチック粒子と、該プラスチック粒子に結合するペプチドと、前記ペプチドと結合する蛍光色素と、を混合し、前記プラスチック粒子と、前記ペプチドと、前記蛍光色素との、第1の複合体を形成させる。
<1-2. Process>
(Mixing process)
In the mixing step, the plastic particles of the present invention, a peptide that binds to the plastic particles, and a fluorescent dye that binds to the peptide are mixed to form a first mixture of the plastic particles, the peptide, and the fluorescent dye. A complex is formed.

本工程において、本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素とをそれぞれ添加して混合してよい。この場合、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素との第2の複合体は、本発明のプラスチック粒子の存在下で形成される。そして、本発明のプラスチック粒子と第2の複合体とが接触し、第1の複合体が形成される。または、本発明のプラスチック粒子と本発明のペプチドとが接触し、さらに本発明の蛍光色素が接触して、第2の複合体を経ずに第1の複合体が直接形成されてもよい。 In this process, the plastic particles of the present invention, the peptide of the present invention, and the fluorescent dye of the present invention may be added and mixed separately. In this case, a second complex of the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention is formed in the presence of the plastic particles of the present invention. The plastic particles of the present invention and the second complex are then contacted to form a first complex. Alternatively, the plastic particles of the present invention may be contacted with the peptide of the present invention, and then with the fluorescent dye of the present invention, to directly form the first complex without passing through the second complex.

また、本工程において、まず本発明のペプチドと本発明の蛍光色素とを混合し、本発明のペプチドと本発明の蛍光色素との第2の複合体を含む標識用組成物を調製してもよい。その後、第2の複合体を含む標識用組成物と、本発明のプラスチック粒子とを混合する。この場合、本発明のプラスチック粒子と、第2の複合体とが接触して第1の複合体が形成される。 In addition, in this process, the peptide of the present invention may be mixed with the fluorescent dye of the present invention to prepare a labeling composition containing a second complex of the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention. Then, the labeling composition containing the second complex is mixed with the plastic particles of the present invention. In this case, the plastic particles of the present invention come into contact with the second complex to form a first complex.

本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素とを混合する方法は特に限定されるものではないが、両者を効率よく接触させることができることから、液体中で、本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素とを混合することが好ましい。 The method for mixing the plastic particles of the present invention, the peptide of the present invention, and the fluorescent dye of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to mix the plastic particles of the present invention, the peptide of the present invention, and the fluorescent dye of the present invention in a liquid, since this allows efficient contact between the two.

前記「液体」としては、本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素との結合を阻害または低下させたり、結合の特異性を低下させたりするものでない限り、特に限定されない。このような液体としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液およびトリス緩衝液等を挙げることができる。なお、検出対象が本発明のプラスチック粒子を含む海水等の液体であった場合、当該検出対象中に直接、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素とを添加して混合してもよい。 The "liquid" is not particularly limited as long as it does not inhibit or reduce the binding between the plastic particles of the present invention, the peptide of the present invention, and the fluorescent dye of the present invention, or reduce the specificity of the binding. Examples of such liquids include phosphate buffer, carbonate buffer, and Tris buffer. When the detection target is a liquid such as seawater containing the plastic particles of the present invention, the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention may be added directly to the detection target and mixed.

本発明のプラスチック粒子と混合する本発明のペプチドの量は特に限定されるものではないが、本発明のプラスチック粒子以外の物質と非特異的な結合を生じ難く、かつ本発明のプラスチック粒子に対して十分に結合し得る量の本発明のペプチドを、本発明のプラスチック粒子に対して接触させることが好ましい。本発明のペプチドの量は、例えば、該ペプチドが含有された溶液の終濃度が、1μM以上となるような量であることが好ましく、5μMとなるような量であることがより好ましく、10μMとなるような量であることがより好ましく、15μMとなるような量であることがより好ましく、20μMとなるような量であることがより好ましい。また、プラスチック粒子以外の物質との非特異的な結合を防止するため、本発明のペプチドの量は、該ペプチドが含有された溶液の終濃度が、300μM以下となるような量であることが好ましく、290μM以下となるような量であることがより好ましく、280μM以下となるような量であることがより好ましく、270μM以下となるような量であることがより好ましく、260μM以下となるような量であることがより好ましく、250μM以下となるような量であることがより好ましく、240μM以下となるような量であることがより好ましく、230μM以下となるような量であることがより好ましく、220μM以下となるような量であることがより好ましく、210μM以下となるような量であることがより好ましく、200μM以下となるような量であることがより好ましく、190μM以下となるような量であることがより好ましく、180μM以下となるような量であることがより好ましく、170μM以下となるような量であることがより好ましく、160μM以下となるような量であることがより好ましく、150μM以下となるような量であることがより好ましく、140μM以下となるような量であることがより好ましく、130μM以下となるような量であることがより好ましく、120μM以下となるような量であることがより好ましく、110μM以下となるような量であることがより好ましく、100μM以下となるような量であることがより好ましい。 The amount of the peptide of the present invention to be mixed with the plastic particles of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to contact the plastic particles of the present invention with an amount of the peptide of the present invention that is unlikely to nonspecifically bind to substances other than the plastic particles of the present invention and can sufficiently bind to the plastic particles of the present invention. The amount of the peptide of the present invention is, for example, preferably an amount such that the final concentration of the solution containing the peptide is 1 μM or more, more preferably an amount such that the final concentration is 5 μM, more preferably an amount such that the final concentration is 10 μM, more preferably an amount such that the final concentration is 15 μM, and more preferably an amount such that the final concentration is 20 μM. In addition, in order to prevent non-specific binding with substances other than plastic particles, the amount of the peptide of the present invention is preferably such that the final concentration of a solution containing the peptide is 300 μM or less, more preferably 290 μM or less, more preferably 280 μM or less, more preferably 270 μM or less, more preferably 260 μM or less, more preferably 250 μM or less, more preferably 240 μM or less, more preferably 230 μM or less, more preferably 220 μM or less, and more preferably 210 μM or less. More preferably, the amount is 200 μM or less, more preferably 190 μM or less, more preferably 180 μM or less, more preferably 170 μM or less, more preferably 160 μM or less, more preferably 150 μM or less, more preferably 140 μM or less, more preferably 130 μM or less, more preferably 120 μM or less, more preferably 110 μM or less, and more preferably 100 μM or less.

また、本発明のプラスチック粒子および本発明のペプチドと混合する本発明の蛍光色素の量は特に限定されるものではないが、本発明のペプチド以外の物質と非特異的な結合を生じ難く、かつ本発明のペプチドに対して十分に結合し得る量の本発明の蛍光色素を、本発明のペプチドに対して接触させることが好ましい。そのため、本発明の蛍光色素の量は、本発明のペプチドの量に対して適切な量が、適宜決定されればよい。 Although there are no particular limitations on the amount of the fluorescent dye of the present invention mixed with the plastic particles of the present invention and the peptide of the present invention, it is preferable to contact the peptide of the present invention with an amount of the fluorescent dye of the present invention that is unlikely to form non-specific bonds with substances other than the peptide of the present invention and that can sufficiently bind to the peptide of the present invention. Therefore, the amount of the fluorescent dye of the present invention may be appropriately determined to be an appropriate amount relative to the amount of the peptide of the present invention.

本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素とを混合させる条件(例えば、温度、時間等)については、両者が充分に混合し第1の複合体を形成できる条件であれば特に限定されるものではなく、適宜検討の上、好ましい条件を採用すればよい。 The conditions (e.g., temperature, time, etc.) for mixing the plastic particles of the present invention, the peptide of the present invention, and the fluorescent dye of the present invention are not particularly limited as long as they allow sufficient mixing of the two to form the first complex, and preferred conditions may be adopted after appropriate consideration.

(検出工程)
検出工程では、前記混合工程において形成された、本発明のプラスチック粒子と、本発明のペプチドと、本発明の蛍光色素との第1の複合体を検出する。本工程において、蛍光顕微鏡等を用いて、第1の複合体を検出することができる。
(Detection step)
In the detection step, the first complex of the plastic particle of the present invention, the peptide of the present invention, and the fluorescent dye of the present invention formed in the mixing step is detected. In this step, the first complex can be detected using a fluorescent microscope or the like.

本工程では、第1の複合体が有している本発明の蛍光色素が発する蛍光を、蛍光顕微鏡等を用いて検出することによって、混合工程において本発明のペプチドに結合したプラスチック粒子を容易に検出することができる。すなわち、本工程において、蛍光顕微鏡下で蛍光発色が認められた物質は、該物質がプラスチック粒子であると判断できる。一方、蛍光顕微鏡下で蛍光発色が認められなかった物質は、該物質がプラスチック粒子でない(すなわち、プラスチック粒子でない)と判断できる。 In this process, the plastic particles bound to the peptide of the present invention in the mixing process can be easily detected by detecting the fluorescence emitted by the fluorescent dye of the present invention possessed by the first complex using a fluorescence microscope or the like. That is, in this process, if a substance is observed to emit fluorescence under a fluorescence microscope, it can be determined that the substance is a plastic particle. On the other hand, if a substance is not observed to emit fluorescence under a fluorescence microscope, it can be determined that the substance is not a plastic particle (i.e., it is not a plastic particle).

蛍光顕微鏡を用いた蛍光色素の検出方法については、特に限定されるものではなく、用いる蛍光色素に応じた検出方法(励起波長等)を適宜検討の上、好ましい条件を採用すればよい。本工程を行なうために用いられる蛍光顕微鏡の構成は特に制限されず、用いる蛍光色素に応じた検出方法(励起波長等)に応じて適宜決定される。 The method of detecting a fluorescent dye using a fluorescence microscope is not particularly limited, and the detection method (excitation wavelength, etc.) according to the fluorescent dye used may be appropriately considered and preferred conditions may be adopted. The configuration of the fluorescence microscope used to perform this process is not particularly limited, and is appropriately determined according to the detection method (excitation wavelength, etc.) according to the fluorescent dye used.

また、本工程において用いられる、蛍光を検出するための方法は、蛍光顕微鏡に限られず、蛍光を検出できる公知の方法(蛍光マイクロプレートリーダー等)が用いられてよい。 The method for detecting fluorescence used in this process is not limited to a fluorescence microscope, and any known method capable of detecting fluorescence (such as a fluorescent microplate reader) may be used.

〔2.ナノプラスチック粒子の判別方法〕
本発明の一実施形態に係る、長径が360nm以下のプラスチック粒子の判別方法(以降、適宜「本発明の判別方法」という)は、上述した本発明の検出方法により検出されたプラスチック粒子が明視野の光学顕微鏡下で観察可能か否かにより、検出されたプラスチック粒子の長径が360nm以下であるか否かを判別する判別工程を含んでいてもよい。なお、本発明の判別方法は、該判別工程に加え、上述した本発明の検出方法に含まれる混合工程および検出工程を含む。判別工程は、該検出工程により検出されたプラスチック粒子に対して行われる。混合工程および検出工程については、〔1.プラスチック粒子の検出方法〕で説明しているため、説明を繰り返さない。
2. Method for identifying nanoplastic particles
The method for discriminating plastic particles having a major axis of 360 nm or less according to one embodiment of the present invention (hereinafter, appropriately referred to as the "discrimination method of the present invention") may include a discrimination step of discriminating whether the major axis of the detected plastic particles is 360 nm or less based on whether the plastic particles detected by the above-mentioned detection method of the present invention can be observed under a bright-field optical microscope. In addition to the discrimination step, the discrimination method of the present invention includes a mixing step and a detection step included in the above-mentioned detection method of the present invention. The discrimination step is performed on the plastic particles detected by the detection step. The mixing step and the detection step are described in [1. Plastic particle detection method], so the description will not be repeated.

例えば長径が360nm以下のプラスチック粒子のようなナノプラスチック粒子は、それよりも大きなマイクロプラスチック粒子等に比べ、粒子の長径が小さいために生体の細胞内に取り込まれやすい。それ故、生体内へナノプラスチック粒子が取り込まれた場合、該生体の各臓器へナノプラスチック粒子が入り込むことによる、生体への影響が懸念される。この点は、マイクロプラスチック粒子に比べて、ナノプラスチック粒子に対して特に懸念されている。前記構成によれば、マイクロプラスチック粒子に比べて、生体への影響がより大きなナノプラスチック粒子と、マイクロプラスチック粒子等の可視光においても視認できる長径を有するプラスチック粒子とを判別できる。判別工程により、検出対象中にナノプラスチック粒子が含まれているか否かを容易に判別できる。 Nanoplastic particles, such as plastic particles with a major axis of 360 nm or less, are more easily taken up into the cells of a living body than larger microplastic particles, because the major axis of the particles is smaller. Therefore, if nanoplastic particles are taken up into a living body, there is concern that the nanoplastic particles may enter each organ of the living body and have an impact on the living body. This is of particular concern for nanoplastic particles compared to microplastic particles. According to the above configuration, it is possible to distinguish between nanoplastic particles, which have a greater impact on the living body than microplastic particles, and plastic particles such as microplastic particles that have a major axis that can be seen even with visible light. The discrimination process makes it easy to determine whether or not nanoplastic particles are contained in the detection target.

(判別工程)
判別工程の一例を、以下に簡潔に説明する。まず、上述の検出工程において、蛍光装置を備えた光学顕微鏡により、第1の複合体を検出する。このような顕微鏡として、明視野での分解能を最大限に確保する観点から、例えば位相差顕微鏡用コンデンサおよび蛍光装置を備えた光学顕微鏡(位相差蛍光顕微鏡)または両者を備えた偏光顕微鏡等を用いることが好ましい。暗視野での蛍光検出による第1の複合体の検出後、蛍光から明視野観察用の透過光へと、上述の顕微鏡の光路を切り換える。切り換え後、暗視野で蛍光発色が認められたが、明視野では視認できなかった物質は、長径360nm以下のプラスチック粒子であると判別できる。一方、暗視野で蛍光発色が認められ、かつ明視野でも視認された物質は、マイクロプラスチック粒子等の可視光においても視認できる長径を有するプラスチック粒子であると判別できる。
(Discrimination process)
An example of the discrimination process will be briefly described below. First, in the above-mentioned detection process, the first complex is detected by an optical microscope equipped with a fluorescent device. As such a microscope, from the viewpoint of ensuring the maximum resolution in the bright field, it is preferable to use, for example, an optical microscope (phase contrast fluorescent microscope) equipped with a condenser for a phase contrast microscope and a fluorescent device, or a polarizing microscope equipped with both. After the detection of the first complex by fluorescence detection in the dark field, the optical path of the above-mentioned microscope is switched from fluorescence to transmitted light for bright field observation. After the switching, a substance that exhibits fluorescent coloring in the dark field but cannot be seen in the bright field can be determined to be a plastic particle with a major axis of 360 nm or less. On the other hand, a substance that exhibits fluorescent coloring in the dark field and is also visible in the bright field can be determined to be a plastic particle having a major axis that can be seen in visible light, such as a microplastic particle.

判別工程は、上述の顕微鏡に限られず、明視野観察および蛍光観察が可能ないかなる光学顕微鏡を用いて行ってもよい。また、暗視野での蛍光発色および明視野での粒子の検出、並びに、暗視野および明視野での検出結果の比較は、目視に限られず、例えば一般的な画像解析プログラム等により行ってもよい。 The discrimination process is not limited to the above-mentioned microscope, but may be performed using any optical microscope capable of bright-field and fluorescent observation. Furthermore, the detection of fluorescent color in the dark field and particles in the bright field, as well as the comparison of the detection results in the dark field and the bright field, are not limited to visual inspection, but may be performed, for example, using a general image analysis program, etc.

〔3.プラスチック粒子を検出するためのキット〕
本発明の一実施形態に係る、プラスチック粒子の検出キット(以降、「本発明のキット」と称する)は、本発明のペプチドおよび本発明の蛍光色素を含む、長径が360nm以下であり、かつ前記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子を検出する。〔1.プラスチック粒子の検出方法〕で説明した事項については、本実施形態においてこれを援用する。
3. Kits for detecting plastic particles
A plastic particle detection kit according to one embodiment of the present invention (hereinafter referred to as the "kit of the present invention") detects plastic particles having a major axis of 360 nm or less and a structure represented by the formula (1), which contain the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention. The matters explained in [1. Method for detecting plastic particles] are incorporated by reference in this embodiment.

本発明のキットは、特定の材料を内包する容器(例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ、スライドグラス等)を備えた包装物が意図される。本発明のキットは、それに含まれる各材料が独立して存在している形態であってもよく、複数の材料が混在している形態(例えば、組成物の形態)であってもよい。すなわち、本発明のキットに含まれる本発明のペプチドおよび本発明の蛍光色素は、予め混合された標識用組成物の状態で本発明のキットに含まれていてもよいし、それぞれが別体として含まれていてもよい。 The kit of the present invention is intended to be a package having a container (e.g., a bottle, a plate, a tube, a dish, a slide glass, etc.) containing a specific material. The kit of the present invention may be in a form in which each material contained therein exists independently, or in a form in which a plurality of materials are mixed (e.g., in the form of a composition). That is, the peptide of the present invention and the fluorescent dye of the present invention contained in the kit of the present invention may be contained in the kit of the present invention in the form of a premixed labeling composition, or each may be contained separately.

また本発明のキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。本発明のキットの説明において使用される用語「備えた(備えている)」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図され得る。 The kit of the present invention may also include containers containing diluents, solvents, cleaning solutions, or other reagents. The term "included" used in describing the kit of the present invention may refer to a state in which the reagents are contained within any of the individual containers that make up the kit.

また本発明のキットは、本発明の検出方法または本発明の判別方法を実施するための説明書を備えていてもよい。 The kit of the present invention may also include instructions for carrying out the detection method of the present invention or the discrimination method of the present invention.

以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

[実施例1]
(プラスチック粒子の検出方法)
<A:混合工程>
ポリスチレン粒子に結合するペプチドとして、アミノ酸配列RIIIRRIRR(配列番号1)を含むペプチドを採用した。また、ポリプロピレン粒子に結合するペプチドとして、アミノ酸配列SMKYSHSTAPAL(配列番号5)を含むペプチドを採用した。上述の各配列のC末端側に、リンカーとなるアミノ酸配列GGGSGGGSGGGS(配列番号10)を付加し、さらにそのC末端側にビオチンを付加したペプチドを化学合成により作製した。
[Example 1]
(Method for detecting plastic particles)
<A: Mixing step>
A peptide containing the amino acid sequence RIIIRRIRR (SEQ ID NO: 1) was used as a peptide that binds to polystyrene particles. A peptide containing the amino acid sequence SMKYSHSTAPAL (SEQ ID NO: 5) was used as a peptide that binds to polypropylene particles. The amino acid sequence GGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 10) that serves as a linker was added to the C-terminus of each of the above sequences, and a peptide in which biotin was further added to the C-terminus was prepared by chemical synthesis.

前記合成ペプチドと、Cy3により蛍光標識されたストレプトアビジン(Streptavidin Cy3 Conjugate; Thermo Fisher Scientific社)とを、それぞれ終濃度が20μMと1μMとになるように、前記合成ペプチドと前記ストレプトアビジンとを、10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中に添加した。添加後に得られた溶液を室温で20分間穏やかに混合し、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を促すことで、第2の複合体を含む標識用組成物を調製した。 The synthetic peptide and streptavidin fluorescently labeled with Cy3 (Streptavidin Cy3 Conjugate; Thermo Fisher Scientific) were added to 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to final concentrations of 20 μM and 1 μM, respectively. After the addition, the resulting solution was gently mixed at room temperature for 20 minutes to promote binding between biotin and streptavidin, thereby preparing a labeling composition containing a second complex.

該標識用組成物を含む溶液を、0.01%(v/v)のTween 20(ナカライテスク社)を含むリン酸緩衝生理食塩水(ナカライテスク社)を用いて20倍希釈した。希釈後の前記溶液を、プラスチック粒子(ポリスチレン粒子またはポリプロピレン粒子)と室温(約28℃)下で20分間混合することにより、第1の複合体を含む溶液を得た。 The solution containing the labeling composition was diluted 20-fold with phosphate buffered saline (Nacalai Tesque) containing 0.01% (v/v) Tween 20 (Nacalai Tesque). The diluted solution was mixed with plastic particles (polystyrene particles or polypropylene particles) at room temperature (about 28°C) for 20 minutes to obtain a solution containing the first complex.

<B:検出工程>
第1の複合体を含む溶液をスライドガラス上に滴下した後、カバーガラスをスライドガラス上に載せ、蛍光顕微鏡BZ-9000(Keyence社)を用いて、蛍光観察を行った。なおこの際、用いた蛍光色素に合わせて適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光観察を行った。
<B: Detection step>
After dropping the solution containing the first complex onto a slide glass, a cover glass was placed on the slide glass, and fluorescence observation was performed using a fluorescence microscope BZ-9000 (Keyence Corporation). Note that, at this time, the fluorescence observation was performed using a fluorescence filter appropriate for the fluorescent dye used.

<C:結果>
結果を図2から図5に示す。図2から図4は、ポリスチレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。図5は、ポリプロピレン粒子の、顕微鏡観察の結果を示す図である。なお、図2から図5の、符号1、3、5および7は明視野の像を示す。一方、図2から図5の、符号2、4、6および8は暗視野の像を示す。
<C: Results>
The results are shown in Figures 2 to 5. Figures 2 to 4 are diagrams showing the results of microscopic observation of polystyrene particles. Figure 5 is a diagram showing the results of microscopic observation of polypropylene particles. In Figures 2 to 5, symbols 1, 3, 5, and 7 indicate bright-field images. Meanwhile, symbols 2, 4, 6, and 8 in Figures 2 to 5 indicate dark-field images.

図2から図5に示す通り、暗視野では第1の複合体が蛍光発色により検出された。ここで、図2および図4に示されるポリスチレン粒子の長径は3000nm、図3に示されるポリスチレン粒子の長径は50nm、図5に示されるポリプロピレン粒子の長径は1000nm~3000nmであった。すなわち、明視野では可視光の波長360nmより短い長径のプラスチック粒子は検出できなかったが、暗視野では蛍光発色を検出することで、可視光の波長360nmよりも短い長径のプラスチック粒子を検出できた。 As shown in Figures 2 to 5, the first complex was detected by fluorescent coloring in the dark field. Here, the long diameter of the polystyrene particles shown in Figures 2 and 4 was 3000 nm, the long diameter of the polystyrene particles shown in Figure 3 was 50 nm, and the long diameter of the polypropylene particles shown in Figure 5 was 1000 nm to 3000 nm. In other words, plastic particles with long diameters shorter than the visible light wavelength of 360 nm could not be detected in the bright field, but plastic particles with long diameters shorter than the visible light wavelength of 360 nm could be detected in the dark field by detecting fluorescent coloring.

[実施例2]
(ナノプラスチック粒子の判別方法)
実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、第2の複合体を含む標識用組成物を調製した。続いて、実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、該標識用組成物を含む溶液を希釈し、希釈後の溶液と、長径が3μmのポリスチレン粒子および50nmのポリスチレン粒子とを混合し、第1の複合体を含む溶液を得た。同様に、希釈後の溶液と長径が3μmのポリスチレン粒子とを混合し、第1の複合体を含む溶液を得た。また、比較例として、ポリスチレン粒子を含まない溶液を作製した。そして、実施例1の<B:検出工程>と同様の手順で、それぞれ蛍光観察を行った。
[Example 2]
(Method for identifying nanoplastic particles)
A labeling composition containing the second complex was prepared in the same procedure as in <A: mixing step> of Example 1. Subsequently, the solution containing the labeling composition was diluted in the same procedure as in <A: mixing step> of Example 1, and the diluted solution was mixed with polystyrene particles having a major axis of 3 μm and polystyrene particles having a major axis of 50 nm to obtain a solution containing the first complex. Similarly, the diluted solution was mixed with polystyrene particles having a major axis of 3 μm to obtain a solution containing the first complex. In addition, as a comparative example, a solution not containing polystyrene particles was prepared. Then, fluorescence observation was performed in the same procedure as in <B: detection step> of Example 1.

結果を図6に示す。図6の符号13および14は、長径が3μmのポリスチレン粒子および50nmのポリスチレン粒子の顕微鏡観察の結果である。図6の符号9および10は、プラスチック粒子を含まない溶液の顕微鏡観察の結果であり、図6の符号11および12は、長径が3μmのポリスチレン粒子の顕微鏡観察の結果である。図6の符号9、11および13は、明視野の像を示し、図6の符号10、12および14は、暗視野の像を示す。 The results are shown in Figure 6. Numerals 13 and 14 in Figure 6 are the results of microscopic observation of polystyrene particles with a major axis of 3 μm and polystyrene particles with a major axis of 50 nm. Numerals 9 and 10 in Figure 6 are the results of microscopic observation of a solution that does not contain plastic particles, and numerals 11 and 12 in Figure 6 are the results of microscopic observation of polystyrene particles with a major axis of 3 μm. Numerals 9, 11, and 13 in Figure 6 show bright field images, and numerals 10, 12, and 14 in Figure 6 show dark field images.

図6の符号13および14に示す通り、明視野では3μmのポリスチレン粒子のみが検出されたが、暗視野では3μmのポリスチレン粒子および50nmのポリスチレン粒子の蛍光発色が検出された。図6の符号14で検出された50nmのポリスチレン粒子の蛍光発色は、図6の符号10および12では検出されなかったため、顕微鏡観察において検出されるノイズではないことが示された。したがって、明視野および暗視野での顕微鏡観察を行うことによって、マイクロプラスチック粒子とナノプラスチック粒子とを判別することができた。 As shown by reference numbers 13 and 14 in Figure 6, only 3 μm polystyrene particles were detected in the bright field, but the fluorescent color of 3 μm polystyrene particles and 50 nm polystyrene particles was detected in the dark field. The fluorescent color of the 50 nm polystyrene particles detected by reference number 14 in Figure 6 was not detected by reference numbers 10 and 12 in Figure 6, indicating that it is not noise detected in microscopic observation. Therefore, by performing microscopic observation in the bright field and dark field, it was possible to distinguish between microplastic particles and nanoplastic particles.

[実施例3]
(第2の複合体を用いたプラスチック粒子の検出方法の感度評価)
実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、アミノ酸配列RIIIRRIRR(配列番号1)を含むペプチドを用いた、第2の複合体を含む標識用組成物を調製した。さらに、実施例1の<A:混合工程>と同様の手順で、該標識用組成物を含む溶液を希釈し、ポリスチレン粒子と混合することにより、第1の複合体を含む溶液(標識用組成物サンプル)を得た。
[Example 3]
(Sensitivity evaluation of the method for detecting plastic particles using the second complex)
A labeling composition containing a second complex was prepared using a peptide containing the amino acid sequence RIIIRRIRR (SEQ ID NO: 1) in the same procedure as in <A: mixing step> of Example 1. Furthermore, a solution containing the labeling composition was diluted and mixed with polystyrene particles in the same procedure as in <A: mixing step> of Example 1 to obtain a solution containing a first complex (labeling composition sample).

つづいて、アミノ酸配列RIIIRRIRR(配列番号1)のC末端側に、リンカーとなるアミノ酸配列GGGS(配列番号7)を付加し、さらにそのC末端側にシステイン残基を付加したペプチドを化学合成により作製した。13nmolの前記合成ペプチドと、製品マニュアルに従った量(バイアル1本分)のCy3 Maleimide Mono-reactive Dye(GE Healthcare社)とを、2.6mMのTris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(ナカライテスク社)を含むリン酸緩衝生理食塩水500μLに添加した。これにより、前記合成ペプチドのシステイン残基側鎖のチオール基をCy3で標識し、蛍光標識ペプチドを調製した。 Next, a peptide was prepared by chemical synthesis in which the amino acid sequence GGGS (SEQ ID NO: 7) was added as a linker to the C-terminus of the amino acid sequence RIIIRRIRR (SEQ ID NO: 1), and a cysteine residue was further added to the C-terminus. 13 nmol of the synthetic peptide and an amount (one vial) of Cy3 Maleimide Mono-reactive Dye (GE Healthcare) according to the product manual were added to 500 μL of phosphate-buffered saline containing 2.6 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (Nacalai Tesque). In this way, the thiol group of the cysteine residue side chain of the synthetic peptide was labeled with Cy3, and a fluorescently labeled peptide was prepared.

該蛍光標識ペプチドを含む溶液を、0.01%(v/v)のTween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水を用いて20倍希釈した。希釈後の前記溶液を、ポリスチレン粒子と室温(約28℃)下で20分間混合し、第1の複合体(蛍光標識サンプル)を含む溶液を得た。そして、実施例1の<B:検出工程>と同様の手順で、標識用組成物サンプルおよび蛍光標識サンプルの蛍光観察を行った。 The solution containing the fluorescently labeled peptide was diluted 20-fold with phosphate buffered saline containing 0.01% (v/v) Tween 20. The diluted solution was mixed with polystyrene particles at room temperature (about 28°C) for 20 minutes to obtain a solution containing the first complex (fluorescently labeled sample). Then, the fluorescent observation of the labeling composition sample and the fluorescently labeled sample was performed in the same procedure as in <B: Detection step> of Example 1.

結果を図7に示す。図7の符号15および16は、標識用組成物サンプルの顕微鏡観察の結果である。図7の符号17および18は、蛍光標識サンプルの顕微鏡観察の結果である。図7の符号15および17は、明視野の像を示し、図7の符号16および18は、暗視野の像を示す。 The results are shown in Figure 7. References 15 and 16 in Figure 7 are the results of microscopic observation of the labeling composition sample. References 17 and 18 in Figure 7 are the results of microscopic observation of the fluorescently labeled sample. References 15 and 17 in Figure 7 show bright field images, and references 16 and 18 in Figure 7 show dark field images.

図7の符号16に示す通り、標識用組成物サンプルではポリスチレン粒子が明瞭な蛍光発色により検出された。一方、図7の符号18に示す通り、蛍光標識サンプルでは蛍光強度が、標識用組成物サンプルの蛍光強度よりも低いことが示された。これは、標識用組成物サンプルでは、第2の複合体が4つのペプチドを介してポリスチレン粒子に結合することができるため、第2の複合体はポリスチレン粒子に対する結合力が高くなり、高感度に検出できたと考えられる。 As shown by reference number 16 in FIG. 7, the polystyrene particles were detected by clear fluorescent coloring in the labeling composition sample. On the other hand, as shown by reference number 18 in FIG. 7, the fluorescence intensity in the fluorescently labeled sample was lower than that of the labeling composition sample. This is thought to be because, in the labeling composition sample, the second complex can bind to the polystyrene particles via the four peptides, so that the second complex has a stronger binding strength to the polystyrene particles and can be detected with high sensitivity.

このように、第2の複合体は、4量体を形成する性質を有するストレプトアビジンを含むことから、4つのペプチドを介してポリスチレン粒子に強固に結合できる。このような第2の複合体を用いることで、単に蛍光標識ペプチドを用いる場合と比較して、検出感度が極めて高くなることを実験的に確認したのは、本発明者らによる新規な知見である。 In this way, the second complex contains streptavidin, which has the property of forming a tetramer, and can therefore bind tightly to polystyrene particles via the four peptides. The inventors have experimentally confirmed that the use of such a second complex results in extremely high detection sensitivity compared to the use of a simple fluorescently labeled peptide, which is a novel finding.

本発明は、環境中に存在するナノプラスチック粒子の検出に利用することができる。また本発明は、プラスチック粒子の研究において広範囲に利用することができる。 The present invention can be used to detect nanoplastic particles present in the environment. The present invention can also be used widely in the study of plastic particles.

Claims (8)

下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子と、前記プラスチック粒子に結合するペプチドと、前記ペプチドと結合する蛍光色素と、を混合する混合工程と、
前記プラスチック粒子と、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第1の複合体を検出する検出工程と、を含むプラスチック粒子の検出方法;
Figure 0007479051000010
(前記式(1)中、Rは、水素、塩素または炭素数6以下の有機基のいずれかであり、nは、2以上の整数である)。
A mixing step of mixing plastic particles having a structure represented by the following formula (1), a peptide that binds to the plastic particles, and a fluorescent dye that binds to the peptide;
a detection step of detecting a first complex of the plastic particle, the peptide, and the fluorescent dye;
Figure 0007479051000010
(In the above formula (1), R is either hydrogen, chlorine or an organic group having 6 or less carbon atoms, and n is an integer of 2 or more).
前記プラスチック粒子は、長径が360nm以下である、請求項1に記載のプラスチック粒子の検出方法。 The method for detecting plastic particles according to claim 1, wherein the plastic particles have a major axis of 360 nm or less. 前記混合工程では、前記ペプチドと、前記蛍光色素との第2の複合体を含む標識用組成物を、前記プラスチック粒子と混合する、請求項1または2に記載のプラスチック粒子の検出方法。 The method for detecting plastic particles according to claim 1 or 2, wherein in the mixing step, a labeling composition containing the peptide and a second complex with the fluorescent dye is mixed with the plastic particles. 前記ペプチドは、ビオチンが結合しており、前記蛍光色素は、ストレプトアビジンが結合している、請求項1から3の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法。 The method for detecting plastic particles according to any one of claims 1 to 3, wherein the peptide is bound to biotin and the fluorescent dye is bound to streptavidin. 前記蛍光色素としてCy3を用いる、請求項1から4の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法。 The method for detecting plastic particles according to any one of claims 1 to 4, wherein Cy3 is used as the fluorescent dye. 前記ペプチドは、以下の(a)または(b)の何れかに示すペプチドであり、
前記プラスチック粒子は、ポリスチレン粒子である、請求項1から5の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法;
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(b)配列番号1のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリスチレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
The peptide is a peptide shown in either (a) or (b) below:
6. The method for detecting plastic particles according to claim 1 , wherein the plastic particles are polystyrene particles;
(a) a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1;
(b) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, and having the activity of binding to the polystyrene particles.
前記ペプチドは、以下の(c)または(d)の何れかに示すペプチドであり、
前記プラスチック粒子は、ポリプロピレン粒子である、請求項1から5の何れか1項に記載のプラスチック粒子の検出方法;
(c)配列番号5に示すアミノ酸配列を含むペプチド、
(d)配列番号5のアミノ酸配列において、1または複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ前記ポリプロピレン粒子と結合する活性を有するペプチド。
The peptide is a peptide shown in either (c) or (d) below,
6. The method for detecting plastic particles according to claim 1 , wherein the plastic particles are polypropylene particles;
(c) a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:5;
(d) A peptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, and having the activity of binding to the polypropylene particles.
請求項1から7の何れか1項に記載の前記ペプチドおよび前記蛍光色素を含む、下記式(1)で示される構造を有するプラスチック粒子の検出キット;
Figure 0007479051000011
(前記式(1)中、Rは、水素、塩素または炭素数6以下の有機基のいずれかであり、nは、2以上の整数である)。
A kit for detecting plastic particles having a structure represented by the following formula (1), comprising the peptide according to any one of claims 1 to 7 and the fluorescent dye:
Figure 0007479051000011
(In the above formula (1), R is either hydrogen, chlorine or an organic group having 6 or less carbon atoms, and n is an integer of 2 or more).
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