JP7459045B2

JP7459045B2 - 標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キット

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Publication number: JP7459045B2
Application number: JP2021502397A
Authority: JP
Inventors: 親是鶴野; 拓也京藤; 規石本
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2024-04-01
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: EP3933405A4; US20210389312A1; JPWO2020175672A1; CN113474655A; WO2020175672A1; EP3933405A1

Description

本発明は、標的物質の検出方法、標的物質の検出のための試薬、及び標的物質の検出のための試薬キットに関する。

特許文献１には、標識化レクチンを用いて検体中の検出対象物質としての糖タンパク質を定量するためのサンドイッチ型アッセイであって、簡便な処理を導入することにより、夾雑物に由来する影響を抑制したサンドイッチ型アッセイ法が開示される。

米国特許出願公開第２０１７／０１２２９４０号明細書

特許文献１には、チオグリセロール等の還元剤を用いて、標識化レクチンの非特異結合を抑制する方法が記載されている。しかし、発明者らは、後述する実施例に示すように特許文献１に記載の方法では、検出精度の向上が十分ではないことを見出した。

本発明は、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチンを用いた標的物質の検出精度を向上させることを課題とする。

本発明のある実施形態は、担体に固定化されたウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質とを、炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみからなる炭素数が１から７のアルコールの存在下で混合することにより、前記担体上にＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成する工程及び前記複合体を検出することにより標的物質を検出する工程、を含む、標的物質の検出方法に関する。

本発明のある実施形態は、担体に固定化されたウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質とを、炭素数が１から７のアルコール（但し、チオグリセロールを除く）の存在下で混合することにより、前記担体上にＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成する工程、及び前記複合体を検出することにより標的物質を検出する工程、を含む、標的物質の検出方法に関する。

本発明のある実施形態は、担体に固定化されたウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質とを、炭素数が１から７のアルコール（但し、チオール基を含むアルコールを除く）の存在下で混合することにより、前記担体上にＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成する工程、及び前記複合体を検出することにより標的物質を検出する工程、を含む、標的物質の検出方法に関する。

本発明のある実施形態は、炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみからなる炭素数が１から７のアルコールを含む、標的物質を検出するための試薬に関する。ここで、前記標的物質は、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む。

本発明のある実施形態は、炭素数が１から７のアルコール（但し、チオグリセロールを除く）を含む標的物質を検出するための試薬に関する。ここで、前記標的物質は、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む。

本発明のある実施形態は、炭素数が１から７のアルコール（但し、チオール基を含むアルコールを除く）を含む、標的物質を検出するための試薬に関する。前記標的物質は、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む。

本発明のある実施形態は、標的物質の検出物質；ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）；及び炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみからなる炭素数が１から７のアルコールを含む、標的物質を検出するための試薬キットに関する。ここで、前記標的物質は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む。

本発明のある実施形態は、標的物質の検出物質；ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）；及び炭素数が１から７のアルコール（但し、チオグリセロールを除く）を含む、標的物質を検出するための試薬キットに関する。ここで、前記標的物質は、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む。

炭素原子、水素原子、及び酸素原子のみからなる、炭素数が１から７のアルコール、チオグリセロールを除く炭素数が１から７のアルコール、又はチオール基を含むアルコールを除く炭素数が１から７のアルコールの存在下で、ＷＦＡと標的物質とを混合することにより、標的物質の検出精度を向上させることができる。

標的物質の検出精度を向上させることができる。

（Ａ）は、試薬を含む容器の外観例を示す図である。（Ｂ）は試薬キットの概略を示す図である。検出系にグリセロールを添加した場合の希釈直線性を示す。検出系にアルコール以外の物質を添加した場合の希釈直線性を示す。検出系に様々な炭素数を有するアルコールを添加した場合の希釈直線性を示す。グリセロールを添加した場合のWFA-M2BP検出系の検体の希釈直線性を示す。グリセロールを添加した場合のWFA-MUC1検出系の希釈直線性を示す。グリセロールを添加した場合のLTL-haptoglobin検出系の希釈直線性を示す。検出系にグリセロール化合物を添加した場合の希釈直線性を示す。検出系に様々な濃度のグリセロールを添加した場合の希釈直線性を示す。

１．検出方法
本明細書に開示される検出方法の実施形態の一例を示す。本開示のある実施形態は、レクチンと、前記レクチンと結合する糖鎖を含む標的物質とを、アルコールの存在下で混合することにより、前記担体上にＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成する工程（形成工程）、及び前記複合体を検出することにより、標的物質を検出する工程（検出工程）を含む、標的物質の検出方法に関する。好ましくは、前記検出は定量でありうる。

標的物質は、検出の対象となる物質である。好ましくは糖タンパク質であり、より好ましくはウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を有する。標的物質として、好ましくはＭａｃ－２－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ２ＢＰ）、Ｍｕｃｉｎ１、ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＭＵＣ１）、α１酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、神経細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＫＬ－６抗原等を挙げることができる。

標的物質は、生体から採取された試料に含まれる物質であることが好ましい。試料は、尿、血液を用いることができる。血液は、末梢血であってもよく、該末梢血から調製した血漿又は血清であってもよい。これらの中でも血漿又は血清が好ましい。本実施形態では、必要に応じて、試料を適切な水性媒体で希釈してもよい。そのような水性媒体は、標的物質の検出を妨げないかぎり特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は特に限定されず、中性付近のｐＨ（例えば６以上８以下のｐＨ）の緩衝液を用いることができる。例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。

レクチンは、好ましくはＷＦＡを挙げることができる。ＷＦＡとして、例えば、天然に存在するＷＦＡまたはリコンビナントＷＦＡを挙げることができる。天然に存在するＷＦＡは、４つのサブユニットから構成される４量体タンパク質である。ＷＦＡは、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）の種子に含まれるレクチンとして知られている。この４量体のＷＦＡからは、還元剤などを用いた所定の処理によって、単量体又は２量体のＷＦＡを得ることができる。本明細書では、特に断りのないかぎり、「ＷＦＡ」との表記は、単量体のＷＦＡ及び多量体のＷＦＡの両方を意図する。また、本明細書において、所定の数のサブユニットから構成されるＷＦＡを表す場合は、例えば「単量体ＷＦＡ」、「２量体ＷＦＡ」、「４量体ＷＦＡ」のように、サブユニットの数を明示して表記する。

本実施形態では、ＷＦＡは、４量体ＷＦＡであってもよく、単量体ＷＦＡ又は２量体ＷＦＡであってもよい。それらの中でも、反応性の高さから、２量体ＷＦＡが好ましい。

アルコールとして、例えば、炭素数が１から７、好ましくは炭素数が２から７のアルコールを挙げることができる。アルコールの炭素数の下限値は、１、２又は３から選択することができる。一実施形態では、炭素原子、水素原子及び酸素原子のみからなるアルコールが用いられる。好ましくは、前記炭素数が１から７のアルコールにはチオグリセロールは含まない。より好ましくは、前記炭素数が１から７のアルコールにはチオール基を含むアルコールは含まない。ここで、「炭素数が１から７のアルコールにはチオグリセロールは含まない」とは、後述する検出系、試薬、及び試薬キットにおいて、少なくともチオグリセロール以外の炭素数が１から７のアルコールを含んでいればよいことを意味し、チオグリセロールを添加する検出系、試薬、及び試薬キットを完全に排除するものではない。「炭素数が１から７のアルコールにはチオール基を含むアルコールは含まない」との表現についても、後述する検出系、試薬、及び試薬キットにおいて、少なくともチオール基を含むアルコール以外の炭素数が１から７のアルコールを含んでいればよいことを意味し、チオール基を含むアルコールを添加する検出系、試薬、及び試薬キットを完全に排除するものではない。すなわち、標的物質の検出を妨げない程度にチオグリセロールを含んでいてもよい。

アルコールは、一価であっても多価であってもよい。価数は、水酸基の数を意図する。多価アルコールとして、例えば二価、三価、四価のアルコールを挙げることができる。

アルコールに含まれる炭素鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよいが、好ましくは直鎖である。

アルコールは、一種のみを用いてもよいし、複数種類を用いてもよい。

アルコールとして、好ましくはメタノール、エタノール、グリセロール、ペンタノール、ヘプタノール、ジグリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、及びこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも一種のアルコールを挙げることができる。グリセロール、ジグリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、及びこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも一種のアルコールがより好ましく、グリセロールが最も好ましい。

ＷＦＡと、標的物質との複合体の形成は、例えば標的物質を含む試料（または試料を水性媒体で希釈した希釈液等）と、ＷＦＡとを混合し、必要に応じて一定時間インキュベーションすることにより達成される。この場合、ＷＦＡは、担体に固定化されていることが好ましい。

ＷＦＡの担体への固定の態様は、特に限定されない。例えば、ＷＦＡと担体とを直接結合させてもよく、あるいはＷＦＡと担体との間を別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、ビオチンと、アビジン又はストレプトアビジン（以下、「アビジン類」ともいう）との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、ＷＦＡをあらかじめビオチンで修飾し、担体にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、ＷＦＡと担体とを間接的に結合させることができる。

担体の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体（酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど）、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。担体の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。磁性粒子を用いることで、ＷＦＡと標的物質の反応性を向上することができる。

磁性粒子に固定させるＷＦＡは、２量体ＷＦＡが好ましい。２量体ＷＦＡは、例えば、スルフヒドリル試薬や還元剤を用いて、４量体ＷＦＡのサブユニットを解離させて得ることができる。また、架橋剤と４量体ＷＦＡとを接触させることによっても、４量体ＷＦＡを２量体化させることができる。そのような架橋剤としては、４量体ＷＦＡ中のアミノ基と架橋を形成する架橋剤が好ましい。例えば、アミノ基に対する反応基を有する架橋剤として、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアノ基、クロロスルホン基、クロロカルボニル基、オキシエチレン基、炭素数１から４のクロロアルキル基、アルデヒド基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を有する架橋剤が挙げられる。そのような架橋剤を用いれば、４量体ＷＦＡを効率よく２量体化させることができる。

４量体ＷＦＡと架橋剤とを混合する際のモル比（ＷＦＡ／架橋剤）は、好ましくは１／１０以下、より好ましくは１／２０以下である。一方、モル比（ＷＦＡ／架橋剤）の下限は、架橋剤の使用量及び生成する２量体ＷＦＡの収率とのバランスを考慮して、１／１００以上とすることができる。

ビオチンとアビジン類との結合を介してＷＦＡを磁性粒子に固定させる場合は、ビオチン化２量体ＷＦＡを用いてもよい。ビオチン化２量体ＷＦＡは、例えば、ビオチンを含む架橋剤を用いて４量体ＷＦＡを２量体化することにより得ることができる。ビオチンを含む架橋剤は、例えば、ビオチンと、架橋剤の上記反応基とをスペーサーを介して結合させることにより得られる。そのようなスペーサーは、特に限定されないが、例えば、アミノヘキサノイル基（アミノカプロイル基）を有する化合物などが挙げられる。

標的物質とＷＦＡの複合体の形成時に、前記アルコールが２から２０ｗ／ｗ％、好ましくは４から１０ｗ／ｗ％含まれることが好ましい。本開示において単位「ｗ／ｗ％」は、重量／重量換算の百分率を意図する（以下、同じ）。

アルコール存在下で、標的物質とＷＦＡの複合体を形成させる場合、アルコールを含む試薬と、担体に固定化されたＷＦＡを含む試薬とを個別の試薬として試料（またはその希釈液）と混合してもよく、アルコールと担体に固定化されたＷＦＡの混合液を試料と混合してもよい。試薬と試料（またはその希釈液）を混合する順序は特に限定されず、これらを実質的に同時に混合してもよいし、逐次混合してもよい。アルコールを含む試薬の例としては、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｒ１試薬にアルコールを添加した試薬を挙げることができる。この場合、担体に固定化されたＷＦＡを含む試薬として、例えば、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｍ２ＢＰＧｉ（商標）Ｒ２試薬を挙げることができる。

複合体の検出は、例えばＷＦＡと標的物質との複合体にさらに検出物質を含ませ、検出物質からのシグナルを検出することにより可能となる。ＷＦＡと標的物質と検出物質との複合体は、ＷＦＡと標的物質との複合体と、検出物質とを混合して必要に応じて一定時間反応させることにより形成することができる。また、ＷＦＡと標的物質との複合体を形成する際に検出物質を共存させることにより、ＷＦＡと標的物質と検出物質との複合体を形成してもよい。

検出物質は、標的物質と特異的に結合する物質であって、標識物質を含む物質であるかぎり制限されない。標的物質が糖タンパク質である場合、標的物質と特異的に結合する物質は、標的物質のタンパク質部分に結合することが好ましい。標的物質と特異的に結合する物質として、例えば抗体を挙げることができる。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）のいずれであってもよい。また、市販の抗体を用いてもよい。

検出物質に用いられる標識物質は、免疫学的測定において当業界で通常用いられる物質を用いることができる。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質（以下、「シグナル発生物質」ともいう）であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（商標）などの蛍光色素、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、^１２５Ｉ、^１４Ｃ、^３２Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、アルカリホスファターゼが特に好ましい。標識物質としてジニトロフェニル（ＤＮＰ）基やビオチンなどのハプテンを用いることもできる。ハプテンに結合し且つシグナル発生物質や酵素などを有する物質を検出物質に結合することにより、複合体からのシグナルを取得することができる。

標識物質は、当該技術において公知の標識方法により、標的物質と特異的に結合する物質に結合させることができる。また、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。

本実施形態では、複合体は、複合体に含まれる検出物質の標識物質に基づいて検出される。具体的には、複合体に含まれる検出物質の標識物質により生じるシグナルを検出することにより、試料に含まれる標識物質の量又は濃度を反映する測定値を取得できる。ここで、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。

シグナルを検出する方法自体は、当該技術分野において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。

酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（商標）（４－クロロ－３－（メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２’－（５’－クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標）（３－（４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２－（５’－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］－４－イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５－ブロモ－６－クロロ－インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ－ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。

標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。

検出物質を含む試薬の例として、例えば標的物質がＭ２ＢＰである場合には、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｍ２ＢＰＧｉ（商標）Ｒ３試薬を挙げることができる。また、他の標的物質を検出する場合には、ＨＩＳＣＬ（商標）Ｍ２ＢＰＧｉ（商標）Ｒ３試薬に含まれる抗Ｍ２ＢＰ抗体を標的物質と特異的に結合する物質に合わせて変更することができる。

本実施形態において、標識物質が酵素である場合には、基質を標識物質と接触させる工程及びシグナルを検出する工程を「検出工程」と呼ぶ。また標識物質が蛍光物質又は放射性同位元素である場合には、シグナルを検出する工程を「検出工程」と呼ぶ。

本実施形態においては、上記複合体の形成と検出工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するＢｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ（Ｂ／Ｆ）分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、未反応の試料成分、ＷＦＡ、検出物質等を挙げることができる。Ｂ／Ｆ分離の手段は特に限定されないが、担体が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した担体だけを回収することによりＢ／Ｆ分離ができる。担体がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりＢ／Ｆ分離ができる。また、担体が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりＢ／Ｆ分離ができ、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した担体をＰＢＳなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。

シグナルの検出結果は、標的物質の測定値として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該測定値から算出される値を、標的物質の測定値として用いることができる。シグナル強度の測定値から算出される値としては、例えば、該測定値から陰性対照試料の測定値を差し引いた値、該測定値を陽性対照試料の測定値で除した値、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。

ここで、標的物質の検出は、シスメックス株式会社製の全自動免疫測定装置ＨＩＳＣＬ（商標）シリーズを使用して行ってもよい。

２．試薬及び試薬キット
（１）試薬
本開示のある実施形態は、標的物質の検出に使用する試薬に関する。好ましくは、本実施形態は、上記１で述べた方法の一部の工程で使用される炭素数１から７のアルコールを含む試薬を含む。図１（Ａ）に試薬の容器５１の外観を示す。

試薬は、炭素数１から７のアルコールを３から３０ｗ／ｗ％、好ましくは４から１５ｗ／ｗ％で含むことが好ましい。また試薬５１は、例えば水性溶媒を含むことが好ましい。水性溶媒は、上記１で述べた検出を妨げないかぎり特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のｐＨ（例えば６以上８以下のｐＨ）で緩衝作用を有するかぎり、特に限定されない。緩衝液として、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。好ましくはＨＥＰＥＳである。このような緩衝液として、例えば、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｒ１試薬を挙げることができる。

また、炭素数１から７のアルコールを含む試薬は、上記１で述べた担体に固定化されたＷＦＡを含んでいてもよい。この場合にも、試薬は、例えば水性溶媒を含むことが好ましい。水性溶媒は、上記１で述べた検出を妨げないかぎり特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のｐＨ（例えば６以上８以下のｐＨ）で緩衝作用を有するかぎり、特に限定されない。緩衝液として、例えば、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。好ましくはＨＥＰＥＳである。このような緩衝液として、例えば、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｍ２ＢＰＧｉ（商標）Ｒ２試薬を挙げることができる。

さらに、試薬は、上記１で述べた検出物質を含んでいてもよい。

試薬は、β－メルカプトエタノール、ＤＴＴ等の安定化剤；アルブミン等の保護剤；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤；及びアジ化ナトリウム、ウシ血清アルブミン等の安定化剤から選択される少なくとも一種の添加剤を含んでいてもよい。試薬は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マンガン等の金属塩（好ましくは塩化物）を含んでいてもよい。

（２）試薬キット
本開示のある実施形態は、標的物質の検出に使用する試薬キットに関する。試薬キットは、少なくとも炭素数１から７のアルコールと、ＷＦＡと、検出物質とを含む。図１（Ｂ）に試薬キットの概要の例を示す。図１（Ｂ）に示す、試薬キット５０は、外装箱５５と、上記２．（１）で述べた炭素数１から７のアルコールを含む試薬を格納した第１の容器５１のと、上記１で述べた担体に固定化されたＷＦＡを含む試薬を格納した第２の容器５２と、上記１で述べた標的物質に結合可能な検出物質を含む試薬を格納した第３の容器５３と、試薬キットの添付文書５４とを含む。添付文書５４には、試薬キットの取り扱い方法、保管条件、使用期限などを記載しておくことができる。

炭素数が１から７のアルコールが、第２の容器５２に含まれる担体に固定化されたＷＦＡを含む試薬に含まれる場合には、第１の容器５１には、上記２．（１）で述べた水性溶媒と、必要に応じて添加物及び金属塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含む試薬が含まれる。

炭素数が１から７のアルコールが、第１の容器５１に含まれる試薬に含まれる場合には、第２の容器５２に含まれる担体に固定化されたＷＦＡは、乾燥形態であってもよい。また、試薬キットに含まれるＷＦＡは、流通時には担体に固定化されていない場合には、使用する前にＷＦＡを担体に固定化するための試薬とＷＦＡと担体が各々個別に梱包されていてもよい。

第３の容器５３に含まれる試薬の例として、例えば標的物質がＭ２ＢＰである場合には、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｍ２ＢＰＧｉ（商標）Ｒ３試薬を挙げることができる。また、他の標的物質を検出する場合には、ＨＩＳＣＬ（商標）Ｍ２ＢＰＧｉ（商標）Ｒ３試薬に含まれる抗Ｍ２ＢＰ抗体を標的物質と特異的に結合する物質に合わせて変更することができる。

さらに、試薬キットには、試料を希釈するための希釈液を含む容器（例えば、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）Ｒ４試薬）、基質試薬（例えば、シスメックス株式会社製ＨＩＳＣＬ（商標）用Ｒ５試薬）を含む容器、洗浄用の水性媒体を含む容器などを外装箱５５に同梱してもよい。
なお、上記１で記述の用語の説明は、本項に援用する。

１．試薬・検体・測定
(1-1) 試料希釈用緩衝液(第１試薬)
シスメックス株式会社製のHISCL（商標） M2BPGi R1試薬を用いた。

(1-2) WFAレクチンを固定した磁性粒子(第２試薬)
標的物質として、M2BP及びMUC1を使用する系にはシスメックス株式会社製のHISCL（商標） M2BPGi R2試薬を用いた。

(1-2’) LTLレクチンを固定した磁性粒子(第２試薬)
(1-2’-1) LTLレクチンのビオチン化
LTL〔VECTOR Laboratories（ベクター・ラボラトリーズ）社製、商品名：Lotus tetragonolobus Lectin〕を当該LTLの濃度が2.5 mg/mLとなるように20 mMリン酸緩衝液（pH 7.5）に添加し、LTL含有溶液を得た。

得られたLTL含有溶液に、ビオチンを含む架橋剤である５－（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチルＤ－ビオチンアミド〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Biotin-AC5-Osu〕をLTL／架橋剤（モル比）が1/100となるように添加した。得られた溶液を25℃で90分間インキュベーションすることにより、前記LTLと前記ビオチンを含む架橋剤とを反応させ、反応産物を得た。

(1-2’-2)ビオチン化LTLの精製
(1-2’-1)で得られた反応産物を、高速液体クロマトグラフィーにより、以下の条件で精製し、精製ビオチン化LTLを得た。
・溶出溶媒：リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
・分離カラム：ゲル濾過カラム

(1-2’-3) ストレプトアビジン結合粒子含有液の調製
ストレプトアビジン(STA)が磁性粒子（平均粒子径２μｍ）の表面に固定化された複合体（磁性粒子１ｇあたりのストレプトアビジンの量：2.9～3.5mg；以下、「STA結合磁性粒子」ともいう）を0.01M HEPES緩衝液(pH7.5)で３回洗浄した。洗浄後のSTA結合磁性粒子をSTA濃度が18～22μg/mL（STA結合磁性粒子の濃度が0.48～0.52 mg/mL）となるように0.01M HEPES緩衝液(pH7.5)に添加し、STA結合粒子含有液を得た。

(1-2’-4)LTL固定化担体の調製
ビオチン化LTLを当該ビオチン化LTLの濃度が20 μg/mLとなるように得られたSTA結合粒子含有液に添加し、STA結合磁性粒子のストレプトアビジンとビオチンLTLのビオチンとを結合させた。得られた産物を0.1M MES緩衝液(pH6.5)で３回洗浄し、LTL固定化担体を得た。得られたLTL固定化担体をMES緩衝液に懸濁し、LTL固定化担体含有液を得た。

(1-3) 標識M2BP抗体を含む溶液(第３試薬)
標的物質として、M2BPを使用する系にはシスメックス株式会社製のHISCL（商標） M2BPGi（商標） R3試薬を用いた。

(1-3’) 標識MUC1抗体を含む溶液(第３試薬)
MUC1抗体としてMY.1E12（Journal of Immunological Methods Volume 270, Issue 2, 15 December 2002, Pages 199-209）を使用した。MUC1抗体をリン酸緩衝液に溶解し、得られた溶液のEDTA濃度を1 mMに調整した。抗体溶液に2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液を適量添加し、37℃で所定時間反応させた。その後、PD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)を用いて抗体溶液を脱塩し、所定濃度に調整した。

ALP標識剤としてのマレイミド架橋剤をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、マレイミド架橋剤溶液を調製した。ALP溶液に、上記のマレイミド架橋剤溶液を適量添加し、37℃で所定時間置き、マレイミド基を導入した。その後、PD-10カラム(GEヘルスケアジャパン)を用いて溶液を脱塩し、所定濃度に調整した。

上記の抗体溶液と、上記のALP溶液とを所定割合で混合し、冷蔵庫に入れ、カップリング反応をさせた。その後、2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液を添加し、反応を停止した。ALP抗体溶液をゲル濾過し、所望の画分を回収した。

得られた所望の画分はBSAを含む緩衝液で所定の濃度に溶解し、標識MUC1抗体の第３試薬として用いた。

(1-3’’) 標識haptoglobin抗体を含む溶液(第３試薬)
標識haptoglobin抗体をABCAM社（メーカーカタログ番号：AB13429）から入手し、1-3’と同様の方法で標識化して、標識haptoglobin抗体の第３試薬として使用した。

(1-4) 測定用緩衝液(第４試薬)
シスメックス株式会社製のHISCL（商標） R4試薬を用いた。

(1-5) 基質(第５試薬)
アルカリホスファターゼの化学発光基質としてCDP-Star(商標)(アプライドバイオシステムズ社)を用いたHISCL（商標） R5試薬(シスメックス株式会社製)を、第５試薬として使用した。

(1-6) 検体
測定検体としてヒト血清の原液と、前記ヒト血清をHISCL（商標）検体希釈液を用いて2倍、4倍、8倍に希釈した希釈血清を用いた。

２．実施例１
グリセロールの添加が希釈直線性に及ぼす影響を検討した。
上記の第１から第５試薬を用いて全自動免疫測定装置HISCL（商標）5000(シスメックス株式会社製)によりM2BPを測定した。測定する際に、HISCL（商標） M2BPGi（商標）のR1試薬に、グリセロールを15 w/w%となるように添加した。R1試薬100μlとR2試薬30μlと測定検体10μlとを混合し、装置の設定にしたがってインキュベーションした後にB/F分離を行い、R3試薬を添加して測定値（発光強度）を取得した。

測定結果に基づいて、希釈倍数から得られる理論上の回帰直線と、実測結果との相関係数（R²値）を求めた。

図２に示すように、Reference（無添加）に比べ、グリセロールを添加した検出系は、良好なR²値を示し、検体希釈直線性の明らかな向上を示した。

３．実施例２
グリセロール及び他の物質の添加が希釈直線性に及ぼす影響を検討した。HISCL（商標） M2BPGi（商標）のR1試薬に、tween80、NaCl、ウシ血清アルブミン（BSA）又はグリセロールを15 w/w%となるように添加し、実施例１と同様にM2BP測定の希釈直線性を検討した。図３に示すように、Reference（無添加）に比べ、グリセロールのみが、他の物質を添加した場合と比較して、良好なR²値を示し検体希釈直線性の明らかな向上を示した。

４．実施例３
次に、炭素数の異なるメタノール(C1)、エタノール(C2)、グリセロール(C3)、ペンタノール(C5)、ヘプタノール(C7)、オクタノール(C8)をHISCL（商標） M2BPGi（商標）のR1試薬に15 w/w%となるように添加し、M2BP測定の検体希釈直線性への影響を確認した。測定は、実施例１と同様に行った。図４に示すように、炭素数が１から７、特に炭素数が２から７のアルコールにおいて、検体希釈直線性の向上が示された。一方で炭素数が８のオクタノールを添加しても検体希釈直線性の向上は認められなかった。

５．実施例４
レクチン及び標的物質を変えて検体の希釈直線性を確認した。レクチンとしてWFA又はLotus tetragonolobus Lectin（LTL）を使用した。標的物質として、M2BP、MUC1又はhaptoglobinを使用した。LTLを用いる系では、第２試薬として(1-2’)で述べた LTLレクチンを固定した磁性粒子を使用した。MUC1を測定する場合には、第３試薬として(1-3’)で述べた標識MUC1抗体を含む溶液を使用した。haptoglobinを測定する場合には第３試薬として(1-3’’)で述べた標識haptoglobin抗体を使用した。全ての検出系で第１試薬としてHISCL（商標） M2BPGi（商標）のR1試薬を用い、第１試薬にグリセロールを実施例１と同様に添加した。測定は、実施例１と同様に行った。

その結果を図５から図７に示す。レクチンとしてWFAを使用した検出系（図５及び図６）は、標的物質（M2BP及びMUC1）に関わらず、グリセロール添加により検体希釈直線性の向上を示した。一方、レクチンとしてLTLを使用したhaptoglobinの検出系（図７）は、グリセロールの添加により、検体希釈直線性が低下した。

したがって、アルコールの添加は、標的物質は選ばないものの、WFAを用いた検出系に有用であることが示された。

６．実施例５
他のアルコールの効果を確認するため、グリセロールの他、ジグリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、PEG6000を添加し、標的物質をM2BPとして検体希釈直線性を検討した。さらに、特許文献１で標識化レクチンの非特異結合を抑制する処理に使用されている還元剤（チオグリセロール）を添加し、グリセロールとの性能比較を行った。各添加剤は第１試薬に添加し、測定は、実施例１と同様に行った。図８に示すように、ジグリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコールでも、検体希釈直線性が向上した。一方で、高分子グリセロール類であるPEG6000を添加した場合、逆に検体希釈直線性は著しく低下した。また、チオグリセロールを添加した場合にも、検体希釈直線性の著しい性能低下が生じた。

以上の結果から、炭素数３から６のアルコールとして他のグリセロール化合物を添加しても、検体希釈直線性の向上が認められることが明らかとなった。

７．実施例６
次にR1試薬に添加するグリセロール濃度を0 w/w%、5.0 w/w%、12.5 w/w%、15.0 w/w%、20.0 w/w%と変化させて、標的物質をM2BPとしたときの検体希釈直線性を検討した。各添加剤は第１試薬に添加し、測定は、実施例１と同様に行った。図９に示すように、5.0 w/w%、12.5 w/w%、15.0 w/w%、20.0 w/w%のいずれの濃度でも検体希釈直線性が向上した。

以上の結果から、WFAを使用する検出系への炭素数１から７のアルコールの添加は、検体の希釈直線性を向上させることが確認された。また、検体の希釈直線性を向上していることから検査精度の向上も期待できると考えられた。

Claims

担体に固定化されたウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質とを、炭素数１から７のアルコール（但し、チオグリセロールを除く）の存在下で混合することにより、前記担体上にＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成する工程、及び
前記複合体を検出することにより、標的物質を検出する工程
を含む、標的物質の検出方法。
前記形成工程において、前記ＷＦＡと、前記標的物質と、前記標的物質に結合し且つ標識物質を有する検出物質とが前記アルコールの存在下で混合され、前記ＷＦＡと前記標的物質と前記検出物質とを含む複合体が形成され、
前記検出工程において、前記複合体が前記複合体の標識物質に基づいて検出される、請求項１に記載の検出方法。
前記アルコールの炭素数が２から７である、請求項１又は２に記載の検出方法。
前記アルコールが、メタノール、エタノール、グリセロール、ペンタノール、ヘプタノール、ジグリセロール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、及びこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１のアルコールである、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出方法。
前記形成工程において、２から２０ｗ／ｗ％の濃度のアルコールの存在下で前記複合体が形成される、請求項１から４に記載の検出方法。
標的物質が、糖タンパク質である、請求項１から５に記載の検出方法。
標的物質が、Ｍａｃ－２－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ２ＢＰ）、Ｍｕｃｉｎ１，ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＭＵＣ１）、α１酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、神経細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ＣＡＭ）、またはＫＬ－６抗原である、請求項６に記載の検出方法。
前記検出物質が、前記標的物質に特異的に結合する抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の検出方法。
前記標識物質が、ハプテン、酵素および蛍光物質からなる群より選択される少なくとも１である、請求項１から８のいずれか一項に記載の検出方法。
前記担体が粒子である、請求項１から９のいずれか一項に記載の検出方法。
前記検出工程において、標的物質が定量される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の検出方法。
担体に固定化されたウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む標的物質とを、炭素数が１から７のアルコール（但し、チオール基を含むアルコールを除く）の存在下で混合することにより、前記担体上にＷＦＡと標的物質とを含む複合体を形成する工程、及び
前記複合体を検出することにより、標的物質を検出する工程
を含む、標的物質の検出方法。
標的物質を検出するための試薬であって、
炭素数が１から７のアルコール（但し、チオグリセロールを除く）を含み、
前記標的物質が、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む、
前記試薬。
標的物質を検出するための試薬であって、
炭素数が１から７のアルコール（但し、チオール基を含むアルコールを除く）を含み、
前記標的物質が、ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）と結合する糖鎖を含む、
前記試薬。
標的物質を検出するための試薬キットであって、前記試薬キットは、
標的物質の検出物質；
ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）；及び
炭素数が１から７のアルコール（但し、チオグリセロールを除く）；
を含み、
ここで、前記標的物質が、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む
前記試薬キット。
標的物質を検出するための試薬キットであって、前記試薬キットは、
標的物質の検出物質；
ウィステリア・フロリブンダ（Ｗｉｓｔｅｒｉａｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ）のレクチン（ＷＦＡ）；及び
炭素数が１から７のアルコール（但し、チオール基を含むアルコールを除く）；
を含み、
ここで、前記標的物質が、ＷＦＡと結合する糖鎖を含む
前記試薬キット。