JP7328307B2 - 細胞活性化反応器および細胞活性化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞活性化反応器および細胞活性化方法に関するものであり、特に、細胞の増殖を増進させる細胞活性化反応器および細胞活性化方法に関するものである。
細胞培養は、バイオメディカルテクノロジー分野における重要な技術の一つである。近年の熱心な研究および最適化された免疫治療技術では、患者の生物検体からＴ細胞を分離した後、Ｔ細胞に対して培養増幅を行い、Ｔ細胞を十分な濃度にした上で免疫治療方法を実施することによって、特定の癌細胞を特異的に攻撃することができ、且つ副作用が少ない。
細胞培養過程において（特に、Ｔ細胞）、一般的な条件（例えば、安定した細胞培養器に入れる、培養液を添加する）の他に、ノビー（knobby）磁気ビーズにより細胞と接触する表面積をさらに増やして、細胞の活性化を刺激することによって、より良い品質および数量の増幅効果を達成することができる。この技術過程では、磁気ビーズに密着した細胞を互いに分離しなければならず、分離してから細胞を精製することによって、次の段階の増幅培養周期を実行することができる。既存の技術では、一般的に、手動操作で細胞の分離を行うため、作業員は、マイクロピペット（micropipette）とプラスチック容器を使用して、これらの液体を各機器の間に移動させなければならない。しかしながら、手動操作方法によって、細胞のクロスコンタミネーション（交叉汚染）、生物廃棄物感染の懸念、長い操作時間、および高い人件費等の問題が生じる可能性が高いため、細胞培養の研究場所が実験室モードのみに制限される。免疫療法に応用する場合は、価格が高いため、現在の癌治療方法においては普及しない。
したがって、細胞を手動で分離する実験方法を改善するとともに、細胞培養プロセスを最適化して細胞培養時間を短縮し、且つ細胞培養品質を向上させることによってコストを下げることが、ますます重要になっている。
本発明は、細胞を手動で分離する実験方法を改善して、細胞培養プロセスを最適化し、手動操作ミスを減らし、実験再現性を高めるのに適した細胞活性化反応器および細胞活性化方法を提供する。
本発明の細胞活性化反応器は、本体と、回転部と、上カバーと、微多孔膜（microporous film）と、複数のバッフルとを含む。本体は、閉鎖端、側部、および開放端により形成され、複数の細胞と複数の磁気ビーズを含有する細胞培養液を収容するのに適した収容空間を有する。回転部は、収容空間に設置され、軸芯および複数のインペラを含み、回転部は、ドライバと連接して回転するよう駆動されるのに適している。上カバーは、本体の上方に取り外し可能に設置され、収容空間の開放端を覆い、上カバーは、開口部を有し、開口部は、回転部の位置に対応して設置され、回転部の軸芯を開口部内に穿設するとともに、回転部の軸芯の端部を露出し、ドライバは、端部を介して回転部と連接する。微多孔膜は、収容空間の閉鎖端に設置され、閉鎖端は、貫通する複数の貫通孔を有し、微多孔膜は、複数の貫通孔を覆う。複数のバッフルは、収容空間の側部に設置され、回転部が回転するよう駆動された時、複数のバッフルと回転部の複数のインペラの相互作用により、細胞と磁気ビーズを分離する。
本発明の細胞活性化方法は、上述した細胞活性化反応器を使用して、細胞活性化を行う。そのステップは、ドライバをプログラム可能に起動し、間欠的に回転部を駆動して回転させることにより、複数の細胞と複数の磁気ビーズを分散させるステップと、静置して活性化させた後、複数の細胞を除去して収集するステップとを含む。
以上のように、本発明の細胞活性化反応器は、本体、回転部、上カバー、微多孔膜、および複数のバッフルを含む。複数のバッフルと回転部の相互作用により、細胞と磁気ビーズを自動的に分離することができる。また、本体の収容空間の閉鎖端にある微多孔膜は、複数の貫通孔を有し、貫通孔を介して気体が収容空間の内外において自律的に交換を行うため、本体の収容空間を酸素豊富環境にすることができる。このようにして、静的細胞培養を行い、細胞を手動で分離する実験方法を改善することができ、同時に、細胞培養プロセスを最適化して、手動操作ミスを減らし、実験再現性を高めることができる。この他、さらに自動化の可能性を高め、定量化プロセスによって細胞生産システムの開発を加速することにより、細胞培養時間を短縮して、細胞培養品質を向上させることができ、且つ周知の技術において比較的高い人件費を減らすことができる。
添付図面は、本発明の原理がさらに理解されるために含まれており、本明細書に組み込まれ、且つその一部を構成するものである。図面は、本発明の実施形態を例示しており、説明とともに、本発明の原理を説明する役割を果たしている。
下記の実施形態および添付の図面を組み合わせて、さらに詳細に説明するが、提供する実施形態は、本発明の範囲を制限するためのものではない。また、添付の図面は、単に説明することが目的であり、元の寸法に基づいて作図したものではない。理解しやすいよう、下記の説明において、同じ素子には同一の符号を表示して説明する。また、文中に使用する「含む（包含、包括）」、「有する（具有）」等の用語は、いずれも開放性の用語であり、つまり、「含むが、これに限定されない」を指す。さらに、文中に提示する「上」、「下」等の方向を示す用語は、単に添付の図面中の方向を参照するためのものであり、本発明を限定するためのものではない。また、明細書において提示する数量および形状は、単に本発明を具体的に説明してその内容を理解しやすくするためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
本文において、「ある数値から別の数値」で表示した範囲は、明細書で当該範囲内の全ての数値を１つ１つ挙げることを回避するための概要的表示方法である。したがって、ある特定数値範囲についての描写は、当該数値範囲内の任意の数値および当該数値範囲内の任意の数値により限定される比較的小さな数値範囲を含むことを意味し、明細書において当該任意の数値および当該比較的小さな数値範囲が明記されていることと同じである。
図１は、本発明の１つの実施形態に係る細胞活性化反応器の部分的構造概略図である。図２は、本発明の１つの実施形態に係る細胞活性化反応器の構造概略図である。図３は、本発明の１つの実施形態に係る細胞活性化反応器の本体と上カバーの接合点の断面概略図である。図４は、図３の切断線Ｌ－Ｌ’の断面概略図である。図５は、本発明の１つの実施形態に係る細胞活性化反応器の本体と下カバーの接合点の断面概略図である。
まず、図１を参照すると、細胞活性化反応器の主要構成は、本体１０、上カバー２０、および下カバー３０を含み、上カバー２０は、本体１０の上方に取り外し可能に設置され、下カバー３０は、本体１０の下方に設置される。本体１０、上カバー２０、および下カバー３０の材料は、ポリカーボネート（Polycarbonate, PC）を含むことができる。図１および図２を同時に参照すると、図１に示した主要構成の他に、細胞活性化反応器は、さらに、ドライバ４０、ホルダ４２、および基体５０を含むことができる。基体５０は、本体１０の下方に設置され、下カバー３０は、基体５０の溝の中に埋め込まれる。ドライバ４０は、上カバー２０の上方に設置され、ホルダ４２は、ドライバ４０と基体５０を連結して、ドライバ４０を上カバー２０の上方の位置に維持する。ドライバ４０は、モータを含むことができるが、本発明はこれに限定されない。
図１、図２、および図３を同時に参照すると、本体１０は、収容空間１２を有し、本体１０の収容空間１２は、閉鎖端１２Ａ、側部１２Ｂ、および開放端１２Ｃにより形成され、収容空間１２は、複数の細胞および複数の磁気ビーズを含む細胞培養液を収容するのに適している。１つの実施形態において、収容空間１２のキャビティ体積は、例えば、２０ｍＬである。別の実施形態において、収容空間１２のキャビティ体積は、１０ｍＬ～１０００ｍＬであってもよい。回転部７０は、収容空間１２内に設置され、軸芯Ａおよび複数のインペラ７２を含み、回転部７０は、ドライバ４０と連接して回転するよう駆動されるのに適している。本実施形態において、上カバー２０は、収容空間１２の開放端１２Ｃを覆い、上カバー２０は、開口部２２により回転部７０の位置を限定し、且つ回転部７０において駆動されて回転した時に、細胞培養液が漏れるのを防ぐことができる。詳しく説明すると、上カバー２０は、開口部２２を有し、開口部２２は、回転部７０の位置に対応して設置され、回転部７０の軸芯Ａは、本体１０の外に突出して、開口部２２内に穿設されるとともに、回転部７０の軸芯Ａの端部Ｍを露出し、それにより、ドライバ４０は、端部Ｍを介して回転部７０と連接するため、回転部７０をドライバ４０により駆動して回転させることができ、回転部７０の回転速度は、例えば、０～１００ｒｐｍであり、且つプログラム可能な回転を行うことができる。複数のバッフル６０は、収容空間１２の側部１２Ｂに設置され、複数のインペラ７２の数量は、複数のバッフル６０に対応することができるが、本発明はこれに限定されない。回転部７０が回転するよう駆動された時、複数のバッフル６０と回転部７０の複数のインペラ７２の間に比較的狭い間隙があるため、複数のバッフル６０と回転部７０の複数のインペラ７２の相互作用により、細胞と磁気ビーズを分離することができ、且つバッフル６０とインペラ７２は、流体のせん断力を強化することができる。細胞と磁気ビーズの分離の詳細な操作フローについて、以下、詳しく説明する。
図１、図２、および図３を同時に参照すると、インペラ７２とバッフル６０の間の最小距離ｄは、例えば、１ｍｍである。別の実施形態において、インペラ７２とバッフル６０の間の最小距離ｄは、１ｍｍ～８ｍｍであってもよい。本実施形態において、本体１０は、例えば、円柱状であり、本体１０の軸芯と回転部７０の軸芯Ａは、重なり合ってもよく、各インペラ７２は、回転部７０の軸芯Ａにより収容空間１２の側部１２Ｂに向かって延伸して、厚さが漸減し、各バッフル６０は、収容空間１２の側部１２Ｂにより回転部７０の軸芯Ａに向かって延伸して、厚さが漸減し、細胞の破裂を減らす。複数のバッフル６０の数量は、例えば、４個以上であり、複数のインペラ７２の数量は、例えば、４個以上である。図３に示したバッフル６０およびインペラ７２の数量は、それぞれ６個であるが、本発明はこれに限定されず、また、バッフル６０およびインペラ７２の数量は、奇数であっても、偶数であってもよい。
図１、図２、図３、および図４を同時に参照すると、回転部７０と収容空間１２の閉鎖端１２Ａの間の距離ｈは、例えば、０．０５ｍｍ～１ｍｍであり、層流を強化して、流体（すなわち、細胞培養液）に均等なストレスを加えることができる。本実施形態において、インペラ７２の断面形状は、例えば、長方形である。
図１、図２、図３、図４、および図５を同時に参照すると、注意すべきこととして、図４では、解説の必要に応じて、一部の構成要素のみを示し、且つ各構成要素は、意図として、主に、下記構成要素間の配置関係を表示するが、実際の構成要素の大きさの比率関係を表すものではない。本実施形態において、微多孔膜８０は、収容空間１２の閉鎖端１２Ａに設置され、通気性・透水性の薄膜材料（例えば、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroethylene, PTFE）の材料を含む）を使用して製造される。詳しく説明すると、収容空間１２の閉鎖端１２Ａは、上下に貫通する複数の貫通孔１４を有し、微多孔膜８０は、収容空間１２の閉鎖端１２Ａに設置されるとともに、これらの貫通孔１４を覆う。微多孔膜８０の厚さは非常に薄いため、収容空間１２の閉鎖端１２Ａは、支持性を有する材料（例えば、ＰＣまたはナイロン（nylon）を含む）を使用して製造することにより、微多孔膜８０が収容空間１２の細胞培養液を収容することによって陥没するのを防ぐことができる。微多孔膜８０とこれらの貫通孔１４を設置することにより、気体は、収容空間１２の内外において自律的に交換を行うことができるため、細胞培養液を酸素豊富環境に維持することができる。１つの実施形態において、複数の貫通孔１４の孔径は、例えば、１．２ｍｍであり、微多孔膜８０の面積は、例えば、４９０．８７ｍｍ2である。別の実施形態において、貫通孔１４の孔径は、０．６ｍｍ～１．５ｍｍであってもよく、微多孔膜８０の面積は、３２４ｍｍ2～１４４００ｍｍ2であってもよい。
１つの実施形態において、下カバー３０は、複数のスタンド３２を有し、本体１０を持ち上げて、これらの貫通孔１４を露出することができるため、細胞活性化反応器を静置した時に、十分な空間を保持し、貫通孔１４を介して気体が収容空間１２に出入りできるようになるため、自律的な酸素豊富環境を収容空間１２に提供し、細胞を活性化させることができる。別の実施形態において、細胞活性化反応器は、さらに、本体１０の下方に設置された基体５０を含むことができ、下カバー３０を基体５０の溝の中に埋め込むことによって、細胞活性化反応器を静置した時に、さらに安定させることができ、同時に、気体を出入りさせるのに十分な空間を提供することができる。
図６Ａ～図６Ｃは、本発明の１つの実施形態に係る細胞活性化反応器の操作断面図である。
本発明は、上述した細胞活性反応器を使用して細胞活性化を行う細胞活性化方法も提供する。詳しい操作フローは、図６Ａ～図６Ｃに示した通りである。図６Ａを参照すると、細胞培養液１００には、複数の細胞１０２および複数の磁気ビーズ１０４が含まれる。この時、細胞１０２と磁気ビーズ１０４は、緊密に結合され、細胞培養液１００中の細胞１０２の初期量は、例えば、５×１０5～１０×１０5である。図６Ｂを参照すると、回転部７０がドライバ４０と連接して回転するよう駆動された時、複数の回転部７０の複数のインペラ７２の相互作用により、細胞１０２と磁気ビーズ１０４を分離することができる。回転部７０がドライバ４０により駆動されて回転すると、バッフル６０とインペラ７２は、せん断力を提供して、細胞１０２と磁気ビーズ１０４を分離することができるため、手動ピペットで吸吐を繰り返して細胞分離のプロセスを行う周知の技術と置き換えることができる。１つの実施形態において、ドライバ４０は、プログラム可能に起動することができ、例えば、間欠的に回転部７０を駆動して回転させることにより、磁気ビーズと細胞の分散を行うことができる。
このようにして、図６Ｃを参照すると、細胞１０２を磁気ビーズ１０４と分離することができる。図６Ａ～図６Ｃを参照すると、各インペラ７２と各バッフル６０の断面形状は、例えば、長方形であり、且つ各インペラ７２と各バッフル６０の高さは同じであり、細胞培養液１００の液面高さは、例えば、各インペラ７２の高さよりも高い。
以下、実験例により上述した本発明の細胞活性化反応器および細胞活性化方法について詳しく説明する。しかしながら、下記の実験例は、本発明を限定するものではない。
実験例
本発明の細胞活性化反応器および細胞活性化方法が細胞と磁気ビーズを有効に分離できることを証明するため、以下、この実験例を特別に行う。
本発明の細胞活性化反応器および細胞活性化方法が細胞と磁気ビーズを有効に分離できることを証明するため、以下、この実験例を特別に行う。
実験例１：異なる数のバッフルとインペラの磁気ビーズ細胞分散試験
図７は、本願の１つの実施形態の細胞活性化反応器を使用して磁気ビーズ細胞分散試験を行った時の顕微鏡図である。異なる数のバッフルとインペラを有する細胞活性化反応器をそれぞれ使用して、磁気ビーズ細胞分散試験を行った。細胞の初期量が５×１０5の状況で、回転部の回転速度を１００ｒｐｍとして、３０秒の回転と３０秒の停止を交互に行う条件で、５回行った。その後、顕微鏡を使用して視野の一部を取り、撮影を行った。図７を参照すると、バッフルの数が４個以上で、且つインペラの数が４個以上の時、いずれも磁気ビーズの細胞分散効果が良好で、磁気ビーズと細胞を十分に分離できることがわかった。本実施形態において、６個のバッフルと６個のインペラを使用した時、効果が良好であった。
図７は、本願の１つの実施形態の細胞活性化反応器を使用して磁気ビーズ細胞分散試験を行った時の顕微鏡図である。異なる数のバッフルとインペラを有する細胞活性化反応器をそれぞれ使用して、磁気ビーズ細胞分散試験を行った。細胞の初期量が５×１０5の状況で、回転部の回転速度を１００ｒｐｍとして、３０秒の回転と３０秒の停止を交互に行う条件で、５回行った。その後、顕微鏡を使用して視野の一部を取り、撮影を行った。図７を参照すると、バッフルの数が４個以上で、且つインペラの数が４個以上の時、いずれも磁気ビーズの細胞分散効果が良好で、磁気ビーズと細胞を十分に分離できることがわかった。本実施形態において、６個のバッフルと６個のインペラを使用した時、効果が良好であった。
実験例２：磁気ビーズ細胞分散試験の比較
図８は、本発明の１つの実施形態の細胞活性化反応器を使用して磁気ビーズ細胞分散試験を行った時の細胞活性と数量の測定図である。本実施形態において、数量が５×１０5のＴ細胞とｉＫＮＯＢＥＡＤ磁気ビーズにより、Ｔ細胞と磁気ビーズを緊密に結合した状況で、それぞれ手動ピペット（pipette）と本発明の細胞活性化反応器を使用して、Ｔ細胞と磁気ビーズの分離を行った。静置して３日間活性化させた後、磁気ビーズを除去して、Ｔ細胞を収集した。その後、実験群において収集したＴ細胞を細胞活性化反応器の中から取り除き、対照群のＴ細胞とそれぞれ細胞培養装置の中に静置して４日間培養した後、細胞活性と数量を測定した。図８を参照すると、手動ピペット（図８のピペットに対応する）と比較して、本発明の細胞活性化反応器は、Ｔ細胞と磁気ビーズの分散性を良好にし、手動ミスを減らし、再現性を高めることがわかった。
図８は、本発明の１つの実施形態の細胞活性化反応器を使用して磁気ビーズ細胞分散試験を行った時の細胞活性と数量の測定図である。本実施形態において、数量が５×１０5のＴ細胞とｉＫＮＯＢＥＡＤ磁気ビーズにより、Ｔ細胞と磁気ビーズを緊密に結合した状況で、それぞれ手動ピペット（pipette）と本発明の細胞活性化反応器を使用して、Ｔ細胞と磁気ビーズの分離を行った。静置して３日間活性化させた後、磁気ビーズを除去して、Ｔ細胞を収集した。その後、実験群において収集したＴ細胞を細胞活性化反応器の中から取り除き、対照群のＴ細胞とそれぞれ細胞培養装置の中に静置して４日間培養した後、細胞活性と数量を測定した。図８を参照すると、手動ピペット（図８のピペットに対応する）と比較して、本発明の細胞活性化反応器は、Ｔ細胞と磁気ビーズの分散性を良好にし、手動ミスを減らし、再現性を高めることがわかった。
以上のように、本発明の細胞活性化反応器は、本体、回転部、上カバー、微多孔膜、および複数のバッフルを含む。複数のバッフルと回転部の相互作用により、細胞と磁気ビーズを自動的に分離することができ、さらに、流体のせん断力と切断の粘性力を強化することができ、バッフルは、流体の対流をさらに加速することができる。また、本体の収容空間の閉鎖端にある微多孔膜は、複数の貫通孔を有し、貫通孔を介して気体が収容空間の内外において自律的に交換を行うため、本体の収容空間を酸素豊富にし、細胞を活性化することができる。このようにして、静的細胞培養を行い、細胞を手動で分離する実験方法を改善することができ、同時に、細胞培養プロセスを最適化して、手動操作ミスを減らし、実験再現性を高めることができる。この他、さらに自動化の可能性を高め、定量化プロセスによって細胞生産システムの開発を加速することにより、細胞培養時間を短縮して、細胞培養品質を向上させることができ、且つ周知の技術において比較的高い人件費を減らすことができる。
１０ 本体
１００ 細胞培養液
１０２ 細胞
１０４ 磁気ビーズ
１２ 収容空間
１２Ａ 閉鎖端
１２Ｂ 側部
１２Ｃ 開放端
１４ 貫通孔
２０ 上カバー
２２ 開口部
３０ 下カバー
３２ スタンド
４０ ドライバ
４２ ホルダ
５０ 基体
６０ バッフル
７０ 回転部
７２ インペラ
８０ 微多孔膜
Ａ 軸芯
ｄ、ｈ 距離
Ｍ 端部
１００ 細胞培養液
１０２ 細胞
１０４ 磁気ビーズ
１２ 収容空間
１２Ａ 閉鎖端
１２Ｂ 側部
１２Ｃ 開放端
１４ 貫通孔
２０ 上カバー
２２ 開口部
３０ 下カバー
３２ スタンド
４０ ドライバ
４２ ホルダ
５０ 基体
６０ バッフル
７０ 回転部
７２ インペラ
８０ 微多孔膜
Ａ 軸芯
ｄ、ｈ 距離
Ｍ 端部
Claims (12)
- 閉鎖端、側部、および開放端により形成され、複数の細胞と複数の磁気ビーズを含有する細胞培養液を収容するのに適した収容空間を有する本体と、
前記収容空間に設置され、軸芯および複数のインペラを含み、ドライバと連接して回転するよう駆動されるのに適した回転部と、
前記本体の上方に取り外し可能に設置され、前記収容空間の前記開放端を覆い、開口部を有し、前記開口部が前記回転部の位置に対応して設置され、前記回転部の軸芯を前記開口部内に穿設するとともに、前記回転部の軸芯の端部を露出し、前記ドライバが前記端部を介して前記回転部と連接する上カバーと、
前記収容空間の前記閉鎖端に設置され、前記閉鎖端が貫通する複数の貫通孔を有し、複数の前記貫通孔を覆う微多孔膜と、
前記収容空間の前記側部に設置され、前記回転部が回転するよう駆動された時、複数の前記インペラとの相互作用により、前記細胞と前記磁気ビーズを分離する複数のバッフルと、を含み、
前記本体が、円柱状であり、前記本体の軸芯と前記回転部の軸芯が、重なり合い、各前記インペラが、前記回転部の軸芯により前記収容空間の前記側部に向かって延伸して、厚さが漸減し、
各前記バッフルが、前記収容空間の前記側部により前記回転部の軸芯に向かって延伸して、厚さが漸減する細胞活性化反応器。 - 前記インペラと前記バッフルの間の最小距離が、１ｍｍ～８ｍｍである請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 複数の前記バッフルの数量が、４個以上であり、複数の前記インペラの数量が、４個以上である請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 各前記インペラと各前記バッフルの断面形状が、長方形である請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 前記回転部と前記収容空間の前記閉鎖端の間の距離が、０．０５ｍｍ～１ｍｍである請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 複数の前記貫通孔の孔径が、０．６ｍｍ～１．５ｍｍである請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 前記微多孔膜の面積が、３２４ｍｍ2～１４４００ｍｍ2である請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 前記本体の下方に設置され、前記本体を持ち上げる下カバーをさらに含み、前記本体が、前記微多孔膜により前記下カバーと連通した請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 前記本体の下方に設置された基体をさらに含み、前記下カバーが、前記基体の溝の中に埋め込まれた請求項８に記載の細胞活性化反応器。
- 各前記インペラと各前記バッフルの高さが、同じである請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 前記細胞培養液の液面高さが、各前記インペラの高さよりも高い請求項１に記載の細胞活性化反応器。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞活性化反応器を使用して、細胞活性化を行う細胞活性化方法であって、
ドライバをプログラム可能に起動し、間欠的に回転部を駆動して回転させることにより、複数の細胞と複数の磁気ビーズを分散させるステップと、
静置して活性化させた後、複数の前記細胞を除去して収集するステップと、
を含む細胞活性化方法。
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