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JP7320951B2 - ペーパーベースのイムノアッセイにおいて使用するためのバイオマーカー濃縮及びシグナル増幅、ならびにｄｎａを抽出、濃縮、及び増幅するための単一プラットフォーム - Google Patents

ペーパーベースのイムノアッセイにおいて使用するためのバイオマーカー濃縮及びシグナル増幅、ならびにｄｎａを抽出、濃縮、及び増幅するための単一プラットフォーム Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月９日出願のＵＳＳＮ６２／３４８，０３８の利益及び優先権を主張し、当該出願は、すべての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
政府による支援の記載
［該当なし］
アッセイは、生体液におけるさまざまな物質または病原体の存在または濃度を検出するために使用されている。固相イムノアッセイでは、受容体（典型的には、検出されることになるリガンドに特異的な抗体）が固相支持体に固定化される。検出すべき分析対象物を含み得る試験流体が固相支持体と接触し、標的分析対象物が存在すると、受容体と分析対象物との対が形成される。受容体とリガンドとの対を可視化するために、受容体とリガンドとの対に結合する標識抗体が使用され、その後、受容体とリガンドとの対に結合した標識抗体が視覚的に検出され得る。
最も商業化されたポイント・オブ・ケア診断デバイスは、ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）であり、これは、その低コスト性及び単純性によるものである。典型的な、いわゆるラテラルフローアッセイでは、検出すべき分析対象物を含む可能性のある流体が、多孔性膜層の一端に加えられ、毛細管力の作用下で膜を介して横方向に流れて、検出すべき分析対象物と結合することができる固定化「受容体」によって捕捉される。ＬＦＡには、いわゆるサンドイッチイムノアッセイが組み込まれていることが多く、サンドイッチイムノアッセイでは、分析対象物は、標識抗体と、固相支持体に固定化された抗体と、の間に挟み込まれる。
米国特許第５，６４４，０４８号
Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５
しかしながら、ＬＦＡは、実験室ベースのアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）と比較すると感度が劣るという問題を抱えている。ＬＦＡの感度改善に相当な労力が払われてきたが、こうした取り組みの多くは、高価な電子読み取り装置の使用に頼るものであるか、または使用者による複数段階の実行が必要なものであり、ＬＦＡのポイント・オブ・ケアという性質を損なうものである。
同様に、ポイント・オブ・ケアにふさわしい、ＤＮＡ検出のための核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）を設計することに労力が払われてきたが、こうしたものは、過度の単純化によって感度が不足するか、または検査精度を確保するために使いやすさを犠牲にするものであることが多い。さらに、現在のポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）ＮＡＡＴは、典型的には、試料を分析及び処理するに依然として機器が必要になるものである。したがって、完全に独立型または携帯型のＰＯＣ ＮＡＡＴで商業化されたものは存在しない。
本明細で企図されるさまざまな実施形態には、限定される必要はないが、下記のもののうちの１つまたは複数が含まれ得る：
実施形態１：
試料における分析対象物を検出及び／または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、
第１の相溶液と第２の相とに分離する混合相溶液を含む水性二相系（ＡＴＰＳ）であって、使用時に、前記第１の相溶液が先行相となり、前記第２の相溶液が遅行相となる、前記ＡＴＰＳと、
ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）またはフロースルーアッセイと、
プローブ及び／または増進試薬（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ）であって、使用時に、前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記先行相における前記第１の相溶液と結び付き、及び／または前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの前記遅行相における前記第２の相溶液と結び付く、前記プローブ及び／または増進試薬と、
を含む、前記デバイス。
実施形態２：
前記ＬＦＡが、前記ＡＴＰＳもしくはその構成成分、及び／または前記プローブ、及び／または前記増進試薬を、受け入れ、及び／または含むように構成された多孔性マトリックスを含む、実施形態１に記載のデバイス。
実施形態３：
前記ＬＦＡが、複合パッド、前記分析対象物と結合する抗体を含む試験ライン、任意選択で、二次抗体を含む対照ライン、任意選択で吸収パッド、及び任意選択で試料パッドを含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態４：
試料における分析対象物を検出及び／または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、フロースルー系を含み、
前記フロースルー系が、
混合相溶液を含む水性二相系（ＡＴＰＳ）を含む濃縮コンポーネントであって、使用時に、前記第１の相溶液が先行相となり、前記第２の相溶液が遅行相となる、前記濃縮コンポーネントと、
プローブ及び／または増進試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記先行相における前記第１の相溶液と結び付き、及び／または前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの前記遅行相における前記第２の相溶液と結び付く、前記プローブ及び／または増進試薬と、
前記濃縮コンポーネントの真下に配置された検出コンポーネントと、
を含む、
前記デバイス。
実施形態５：
前記濃縮コンポーネントが、１つまたは複数のペーパー層を含む、実施形態４に記載のデバイス。
実施形態６：
前記検出コンポーネントが、複合パッド、反応パッド、及び任意選択でシンクを含む、実施形態４～５のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態７：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳに含められる、実施形態１～６のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態８：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記第１の相溶液と結び付く、実施形態７に記載のデバイス。
実施形態９：
前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳに含められる、実施形態１～８のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１０：
前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの前記第２の相溶液と結び付く、実施形態９に記載のデバイス。
実施形態１１：
前記試料が前記デバイスに加えられる前に、前記ＡＴＰＳが前記試料と混合されるように、前記デバイスが構成される、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１２：
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記ＡＴＰＳが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１３：
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記プローブが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態１２に記載のデバイス。
実施形態１４：
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記増進試薬が脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態１２～１３のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１５：
前記デバイスが前記試料と接触した後に、前記ＡＴＰＳが、第１の相溶液と第２の相溶液とに分離する混合相溶液を含む、実施形態１２～１４のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１６：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１７：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１８：
前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１９：
前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態２０：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳ、ポリマー／ポリマーＡＴＰＳ、ミセル／ポリマーＡＴＰＳ、及びミセルＡＴＰＳからなる群から選択される、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態２１：
前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含む、実施形態２０に記載のデバイス。
実施形態２２：
前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、実施形態２０に記載のデバイス。
実施形態２３：
前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含み、前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、実施形態２０に記載のデバイス。
実施形態２４：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳである、実施形態２０に記載のデバイス。
実施形態２５：
前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳである、実施形態２４に記載のデバイス。
実施形態２６：
前記プローブが、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳのポリマー高含有相に分配される、実施形態２４～２５のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態２７：
前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳである、実施形態２０に記載のデバイス。
実施形態２８：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳのミセル高含有相に分配される、実施形態２７に記載のデバイス。
実施形態２９：
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態３０：
前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、実施形態２９に記載のデバイス。
実施形態３１：
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、実施形態３０に記載のデバイス。
実施形態３２：
前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態３０に記載のデバイス。
実施形態３３：
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態３２に記載のデバイス。
実施形態３４：
前記標的分析対象物が、病状に対するバイオマーカー、食品安全（もしくは危険）に対するバイオマーカー、またはバイオテロ物質に対するバイオマーカーを含む、実施形態３２に記載のデバイス。
実施形態３５：
前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、実施形態２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６：
前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、実施形態３５に記載のデバイス。
実施形態３７：
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態３８：
前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、実施形態３７に記載のデバイス。
実施形態３９：
前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、実施形態３７に記載のデバイス。
実施形態４０：
前記プローブが、ナノ粒子を含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態４１：
前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態４２：
前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、実施形態４１に記載のデバイス。
実施形態４３：
前記増進試薬が、前記基質を含む、実施形態４２に記載のデバイス。
実施形態４４：
前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、実施形態４２に記載のデバイス。
実施形態４５：
前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、実施形態４１に記載のデバイス。
実施形態４６：
前記増進試薬が、前記酵素を含む、実施形態４５に記載のデバイス。
実施形態４７：
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ（または他の）ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、実施形態４２及び実施形態４６のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態４８：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記第１の相溶液または前記第２の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、実施形態１～４７のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態４９：
前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、実施形態４８に記載のデバイス。
実施形態５０：
前記デバイスが、異なる分析対象物とそれぞれが相互作用する２つ以上のプローブを含む、実施形態１～４９のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態５１：
前記デバイスが、少なくとも２つの異なるプローブ、または少なくとも３つの異なるプローブ、または少なくとも４つの異なるプローブ、または少なくとも５つの異なるプローブ、または少なくとも７つの異なるプローブ、または少なくとも１０の異なるプローブ、または少なくとも１５の異なるプローブ、または少なくとも２０の異なるプローブを含む、実施形態５０に記載のデバイス。
実施形態５２：
前記デバイスが、サンドイッチアッセイを実施するために構成される、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態５３：
第１の相溶液と第２の相とに分離する混合相溶液であって、ＬＦＡまたは他の多孔性媒体における使用時に、前記第１の相溶液が先行相になり、前記第２の相溶液が遅行相になる、前記混合相溶液と、
プローブ及び／または増進試薬であって、前記プローブが、前記第１の相溶液と結び付き、前記増進試薬が、前記第２の相溶液と結び付く、前記プローブ及び／または増進試薬と、
を含む、水性二相系（ＡＴＰＳ）。
実施形態５４：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳ、ポリマー／ポリマーＡＴＰＳ、ミセル／ポリマーＡＴＰＳ、及びミセルＡＴＰＳからなる群から選択される、実施形態５３に記載の水性二相系。
実施形態５５：
前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含み、前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、実施形態５４に記載の水性二相系。
実施形態５６：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳである、実施形態５４に記載の水性二相系。
実施形態５７：
前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳである、実施形態５６に記載の水性二相系。
実施形態５８：
前記プローブが、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳのポリマー高含有相に分配される、実施形態５６～５７のいずれか１つに記載の水性二相系。
実施形態５９：
前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳである、実施形態５４に記載の水性二相系。
実施形態６０：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳのミセル高含有相に分配される、実施形態５９に記載の水性二相系。
実施形態６１：
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態１～６０のいずれか１つに記載の水性二相系。
実施形態６２：
前記ＡＴＰＳが、多孔性媒体に含められる、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の水性二相系。
実施形態６３：
前記ＡＴＰＳが、ペーパーに含められる、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の水性二相系。
実施形態６４：
前記ＡＴＰＳが、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）に含められる、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の水性二相系。
実施形態６５：
前記ＡＴＰＳが、フロースルー系に含められる、実施形態１～６１のいずれか１つに記載の水性二相系。
実施形態６６：
分析対象物の検出方法及び／または定量化方法であって、
前記方法が、
水性二相系（ＡＴＰＳ）へ試料を加えることであって、前記加えることによって、前記分析対象物が、前記試料に存在するのであれば、前記ＡＴＰＳの１つの相に濃縮されて分析対象物含有相が得られる、前記加えることと、
ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）またはフロースルーアッセイへ前記分析対象物含有相を加えることであって、前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイにおいて検出プローブが前記分析対象物に結合する、前記加えることと、
前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイへ増進試薬を加えることであって、前記加えることによって、前記検出プローブが生成するシグナルが増強される、前記加えることと、
前記試料における前記分析対象物の存在及び／または量を示すための、前記シグナルの検出及び／または定量化と、
を含む、前記方法。
実施形態６７：
前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、ラテラルフローアッセイである、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８：
前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、フロースルーアッセイである、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６９：
前記ＡＴＰＳがペーパーに加えられ、前記ＡＴＰＳが前記ペーパーを通過するにつれて相が分離することで、「流れながら濃縮する」ＡＴＰＳが得られる、実施形態６６～６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０：
前記ＡＴＰＳがペーパーに加えられると、より疎水的な相が先行し、より親水的な相が遅行する、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１：
前記ＡＴＰＳがペーパーに加えられると、より親水的な相が先行し、より疎水的な相が遅行する、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７２：
前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイが、結合部分が前記分析対象物を捕捉し、前記検出プローブが前記捕捉分析対象物に結合するものである、実施形態６６～７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３：
前記分析対象物含有相が、手動またはロボット制御で前記ＡＴＰＳから取り出された後、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、実施形態６６～７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４：
前記検出プローブが、前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイのコンポーネントとして提供される、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５：
次に、前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳとは別に、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、実施形態７３～７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７６：
前記プローブと前記増進試薬との両方が、前記ＡＴＰＳに加えられるか、または前記ＡＴＰＳに含めて提供され、前記ＡＴＰＳの前記構成成分が、前記プローブが前記ＡＴＰＳの第１の相に実質的に分配され、前記増進試薬が前記ＡＴＰＳの第２の相に実質的に分配されるように選択される、実施形態６６～７２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７：
前記ＡＴＰＳが、ペーパー基質に加えられると、先行相及び遅行相を形成し、前記先行相が、前記濃縮分析対象物及び前記プローブをＬＦＡ試験ストリップまたはフロースルーアッセイに送達した後、前記遅行相が、前記試験ストリップまたはフロースルーアッセイに前記増進試薬を遅れて送達する、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態７６～７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態７６～７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８０：
前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態７６～７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８１：
前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態７６～７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８２：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳ、ポリマー／ポリマーＡＴＰＳ、ミセル／ポリマーＡＴＰＳ、及びミセルＡＴＰＳからなる群から選択される、実施形態６６～８１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８３：
前記ＡＴＰＳの前記第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含み、前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳである、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８５：
前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳである、実施形態８４に記載の方法。
実施形態８６：
前記プローブが、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳのポリマー高含有相に分配される、実施形態８４～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７：
前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳである、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８８：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ＡＴＰＳのミセル高含有相に分配される、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９：
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態６６～８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０：
前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、実施形態８９に記載の方法。
実施形態９１：
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２：
前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９３：
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４：
前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５：
前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９６：
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、実施形態６６～９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７：
前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、実施形態９６に記載の方法。
実施形態９８：
前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、実施形態９６に記載の方法。
実施形態９９：
前記プローブが、ナノ粒子を含む、実施形態６６～９８のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１００：
前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、実施形態６６～９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１：
前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、実施形態１００に記載の方法。
実施形態１０２：
前記増進試薬が、前記基質を含む、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０３：
前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０４：
前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、実施形態１００に記載の方法。
実施形態１０５：
前記増進試薬が、前記酵素を含む、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６：
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ（または他の）ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、実施形態１０１及び実施形態１０５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０７：
前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記第１の相溶液または前記第２の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、実施形態６６～１０６のいずれか１つに記載のデバイス。
実施形態１０８：
前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、実施形態１０７に記載のデバイス。
実施形態１０９：
前記方法が、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のデバイスを使用して実施される、実施形態６６～１０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０：
分析対象物を検出及び／または定量化するためのキットであって、前記キットが、実施形態１～５２のいずれか１つに記載のデバイスと、試料を採取するための採取デバイスと、を含む、前記キット。
実施形態１１１：
前記採取デバイスが、口腔液を採取するためのデバイスを含む、実施形態１１０に記載のキット。
実施形態１１２：
前記採取デバイスが、血液を採取するためのデバイスを含む、実施形態１１０に記載のキット。
実施形態１１３：
前記採取デバイスが、尿採取デバイスを含む、実施形態１１０に記載のキット。
実施形態１１４：
前記採取デバイスが、膣液を採取するためのデバイス、または子宮頸管内スワブから採取するためのデバイスを含む、実施形態１１０に記載のキット。
実施形態１１５：
前記採取デバイスが、環境試料のためのデバイスを含む、実施形態１１０に記載のキット。
実施形態１１６：
核酸を精製及び増幅する方法であって、前記方法が、第１の相溶液及び第２の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系（ＡＴＰＳ）を提供することであって、前記ＡＴＰＳが、核酸が前記第１の相溶液もしくは前記第２の相溶液のいずれかに分配されることになるものであるか、または前記ＡＴＰＳが、核酸が前記第１の相溶液と前記第２の相溶液との間の界面に局在化することになるものである、前記提供することと、前記ＡＴＰＳへ核酸を含む試料を導入することであって、前記核酸が、前記第１の相溶液もしくは前記第２の相溶液、または前記第１の相溶液と前記第２の相溶液との間の前記界面に分配されることで濃縮核酸が得られる、前記導入することと、増幅核酸を得るために核酸増幅反応において前記濃縮核酸を増幅することと、を含む、前記方法。
実施形態１１７：
前記核酸が、ＤＮＡである、実施形態１１６に記載の方法。
実施形態１１８：
前記核酸が、ＲＮＡである、実施形態１１６に記載の方法。
実施形態１１９：
前記核酸が、ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡである、実施形態１１６に記載の方法。
実施形態１２０：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳ、ポリマー／ポリマーＡＴＰＳ、ミセル／ポリマーＡＴＰＳ、及びミセルＡＴＰＳからなる群から選択される、実施形態１１６～１１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２１：
前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含み、前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、実施形態１２０に記載の方法。
実施形態１２２：
前記増幅することが、前記第１の相から前記濃縮核酸を回収することであって、その方法が、回収濃縮核酸を得るために、前記第１の相溶液もしくは前記第２の溶液、または前記第１の相溶液と前記第２の相溶液との前記界面から前記核酸を回収することを含む、前記回収することと、前記核酸を増幅するために核酸増幅反応へ前記回収濃縮核酸を導入することと、を含む、実施形態１１６～１２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２３：
前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応系を含む、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２４：
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２５：
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応（３ＳＲ）、核酸ベースの転写アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ステムループ増幅、シグナル介在ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）からなる群から選択される増幅系を含む、実施形態１２４に記載の方法。
実施形態１２６：
前記増幅することが、等温核酸増幅のために試薬と前記ＡＴＰＳを混合することを含む、実施形態１１６～１２１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２７：
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１２８：
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応（３ＳＲ）、核酸ベースの転写アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ステムループ増幅、シグナル介在ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）からなる群から選択される増幅系を含む、実施形態１２７に記載の方法。
実施形態１２９：
前記方法が、室温または室温未満の温度で前記等温増幅を実施することを含む、実施形態１２７～１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０：
前記方法が、等温増幅のための試薬を含む前記ＡＴＰＳを実質的に一定な温度まで加熱することを含む、実施形態１２７～１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１：
前記増幅が、ヘリカーゼ依存性増幅を含み、約６５℃の一定温度で実施される、実施形態１２７～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２：
前記方法が、単一の容器で実施される、実施形態１２６～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３：
前記方法が、マルチウェルプレートのウェルに異なる試料をそれぞれ含めて複数の核酸試料で実施される、実施形態１２６～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３４：
前記複数の試料が、少なくとも２つの試料、または少なくとも４つの試料、または少なくとも８つの試料、または少なくとも１６の試料、または少なくとも３２の試料、または少なくとも６４の試料、または少なくとも１２８の試料を含む、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３５：
前記方法が、マイクロ流体系（例えば、ラボ・オン・チップ）のチャンバーまたはチャネルにおいて実施される、実施形態１２６～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３６：
前記試料が、細胞溶解物である、実施形態１１６～１３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３７：
前記試料が、核酸である、実施形態１１６～１３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３８：
前記試料が、インタクトな細胞を含み、前記ＡＴＰＳが、細胞を溶解するＡＴＰＳである、実施形態１１６～１３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３９：
前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳである、実施形態１１６～１３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４０：
前記試料が、血液または濾紙血を含み、前記ＡＴＰＳが、濾紙血を再溶解するものである、実施形態１１６～１３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４１：
前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳを含む、実施形態１４０に記載の方法。
実施形態１４２：
前記ＡＴＰＳが、ＵＣＯＮ／デキストランＡＴＰＳを含む、実施形態１４０に記載の方法。
実施形態１４３：
核酸を精製及び増幅するためのキットであって、
前記キットが、
水性二相系（ＡＴＰＳ）の構成成分を含む容器と、
等温核酸増幅系の１つまたは複数の構成成分を含む容器と、
を含む、前記キット。
実施形態１４４：
ＡＴＰＳの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が同一の容器である、実施形態１４３に記載のキット。
実施形態１４５：
ＡＴＰＳの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が異なる容器である、実施形態１４３に記載のキット。
実施形態１４６：
等温核酸増幅系の１つまたは複数の構成成分を含む前記容器が、自己持続性シーケンス反応（３ＳＲ）、核酸ベースの転写アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ステムループ増幅、シグナル介在ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）からなる群から選択される反応系の１つまたは複数の構成成分を含む、実施形態１４３～１４５のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１４７：
前記１つまたは複数の構成成分が、前記核酸増幅反応を実行する酵素を含む、実施形態１４６に記載のキット。
実施形態１４８：
前記１つまたは複数の構成成分が、ヘリカーゼを含む、実施形態１４６に記載のキット。
実施形態１４９：
前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳ、ポリマー／ポリマーＡＴＰＳ、ミセル／ポリマーＡＴＰＳ、及びミセルＡＴＰＳからなる群から選択される、実施形態１４３～１４８のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１５０：
前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含み、前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、実施形態１４９に記載のキット。
実施形態１５１：
前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳを含む、実施形態１４３～１４９のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１５２：
前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳを含む、実施形態１４３～１４９のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１５３：
前記ＡＴＰＳが、ＵＣＯＮ／デキストランＡＴＰＳを含む、実施形態１４３～１４９のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１５４：
前記キットが、実施形態１２６～１４２のいずれか１つに記載の方法を実施するためのプロトコールを提供する説明資料を含む、実施形態１４３～１５３のいずれか１つに記載のキット。
定義
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、天然起源のアミノ酸ポリマーだけでなく、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
本明細書の「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」という用語または文法的同等形態は、共に共有結合で連結された少なくとも２つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好ましくは、一本鎖または二本鎖であり、一般に、ホスホジエステル結合を含むことになるが、場合によっては、以下に概要が示されるように、代替骨格を有し得る核酸類似体が含まれ、こうした核酸類似体は、例えば、ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５）及びそこに含まれる参考文献、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００、Ｓｐｒｉｎｚｌ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７、Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０、ならびにＰａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７、及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ－メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、ならびにペプチド核酸の骨格及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５、Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８、Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７を参照のこと）を含む。他の類似核酸には、陽性骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７）、非イオン性骨格を有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号、及び第４，４６９，８６３号、Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７、Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２ ａｎｄ ３，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５、Ｊｅｆｆｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））、ならびに非リボース骨格を有するもの（米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７，ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋに記載のものを含む）が含まれる。１つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ１６９－１７６を参照のこと）。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ，Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ ２，１９９７ ｐａｇｅ３５に記載されている。リボース－ホスフェート骨格のこうした改変は、標識などの追加の部分の付加が容易になるように実施されるか、または生理学的環境下でのそのような分子の安定性及び半減期が向上するように実施され得る。さらに、本発明の核酸は、代替的に、三本鎖であり得ることが可能である。
本明細書で使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認知されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミューという定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは、次に、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥという免疫グロブリンクラスを定義するものである。
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一対から構成され、それぞれの対が、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。それぞれの鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこうした軽鎖及び重鎖を指す。
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして存在するか、またはさまざまなペプチダーゼで消化することによって生成する多くのよく特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化することで、Ｆａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成し、Ｆａｂ自体は、ジスルフィド結合によって軽鎖がＶＨ－ＣＨ１に連結されたものである。Ｆ（ａｂ）’２は、穏和な条件下での還元によってヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、それによって（Ｆａｂ’）２二量体がＦａｂ’単量体に変換され得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、Ｆａｂにヒンジ領域部分が加わったものである（他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。さまざまな抗体断片が、インタクトな抗体の消化という観点から定義される一方で、そのようなＦａｂ’断片は、化学的にデノボ合成されるか、または組換えＤＮＡ手法を利用することによってデノボ合成され得ることを当業者であれば理解するであろう。したがって、本明細書で使用される抗体という用語は、全抗体の改変によって生成する抗体断片、または組換えＤＮＡ手法を使用してデノボ合成される抗体断片も含む。好ましい抗体には、一本鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、可変重鎖と可変軽鎖とが共に連結（直接的なもの、またはペプチドリンカーを介するもの）されることで連続ポリペプチドが形成される一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）が含まれる。一本鎖Ｆｖ抗体は、共有結合で連結されたＶＨ－ＶＬヘテロ二量体であり、この二量体は、ＶＨをコードする配列と、ＶＬをコードする配列と、が直接的に連結されるか、またはペプチドをコードするリンカーによって連結されて含まれる核酸から発現し得る。Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３。ＶＨとＶＬとは、単一のポリペプチド鎖として互いに連結される一方で、ＶＨドメインとＶＬドメインとは、非共有結合で結合する。繊維状ファージの表面に発現される最初の機能性抗体分子は一本鎖Ｆｖ’ｓ（ｓｃＦｖ）であったが、代替の発現方針も達成されている。例えば、Ｆａｂ分子は、鎖（重鎖または軽鎖）の１つがｇ３カプシドタンパク質に融合され、相補鎖が可溶性分子としてペリプラズムに輸送されるのであれば、ファージにディスプレイされ得る。２つの鎖は、同一または異なるレプリコンにコードされ得る。重要な点は、それぞれのＦａｂ分子における２つの抗体鎖が翻訳後に会合し、この二量体が、例えばｇ３ｐに鎖の１つが結合されることを介してファージ粒子に組み込まれるということである（例えば、米国特許第５７３３７４３号を参照のこと）。ｓｃＦｖ抗体に加えて、抗体のＶ領域に由来し、天然には集合するものだが、化学的には別々の軽ポリペプチド鎖及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造に折り畳まれる分子へと変換する他の構造が当業者には多く知られている（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号、及び第４，９５６，７７８号を参照のこと）。特に好ましい抗体となれば、ファージにディスプレイされるもののすべてが含まれることになる（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びジスルフィドで連結されたＦｖ（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１３２３－１３３１）。
アプタマーは、核酸から形成される抗体類似体である。アプタザイムは、核酸から形成される酵素類似体である。具体的には、アプタザイムは、第２の特定の分析対象物が存在するときにのみ、立体配置が変わることで特定の分子を捕捉するように機能することができる。アプタマーは、いくつかのアッセイ（ナノ－ＣＨＥＭ－ＦＥＴなど）では、検出されることになる一次標識の結合さえ必要としない場合があり、立体配置の再配置が直接的に検出されることになる。
「結合部分」という用語、または「結合対」のメンバーは、他の分子、細胞、微生物、及び同様のものに特異的に結合することで、抗体－抗原、レクチン－糖質、核酸－核酸、ビオチン－アビジンなどの結合複合体を形成する分子を指す。そのような結合部分には、限定はされないが、単量体または多量体の核酸、アプタマー、アプタザイム、タンパク質、多糖、糖、レクチン、及び同様のもの（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ”（Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）、ならびに上記の結合対を形成することができる分子のすべてが含まれる。
「特異的に結合する」という語句は、分子が、目的の標的に優先的に結合するか、または他の分子と比較して高い親和性で標的（分析対象物）に結合することを示す。例えば、抗体は、抗原を標的として産生し、その抗原に選択的に結合することになる。ＤＮＡ分子は、実質的に相補的な配列に結合することになり、厳密条件下では、無関係の配列には結合しない。特異的な結合は、分子（例えば、タンパク質及び他の生物製剤）の異種性集団に標的が存在することを決定付ける結合反応を指し得る。したがって、指定条件下（例えば、抗体の場合は、イムノアッセイ条件、または核酸の場合は、厳密なハイブリダイゼーション条件）では、特定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」分子に結合し、試料に存在する他の分子には顕著な量で結合しない。
小有機分子という用語は、医薬品において一般に使用される有機分子と同等サイズの分子を指す。生体巨大分子（例えば、タンパク質、核酸など）は、この用語から除外される。小有機分子の好ましいサイズ範囲は、最大で約５０００Ｄａであり、より好ましくは、最大で２０００Ｄａであり、最も好ましくは、最大で約１０００Ｄａである。
分析対象物という用語は、検出すべき任意の部分を指す。分析対象物には、限定はされないが、特定の生体分子（タンパク質、抗体、核酸）、細菌またはその構成成分、ウイルスまたはその構成成分（例えば、コートタンパク質）、真菌またはその構成成分、原生動物またはその構成成分、薬物、毒素、食品病原体、及び同様のものが含まれる。
本明細書で使用される「ペーパー」という用語は、木材のパルプまたは他の線維性植物物質に由来する薄いシートに限定されるものではなく、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスにおいてそのようなペーパーを使用することが企図される。ペーパーは、より一般には、多孔性材料を指し、こうした多孔性材料は、シート形状であることが多いが、それに限定はされず、流体が通過可能なものである。
いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、水性二相系（ＡＴＰＳ）の混合相溶液、第１の相溶液、及び／または第２の相溶液、及び／または標的分析対象物がＬＦＡを通過可能なほど十分に多孔性である。いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、混合相溶液、第１の相溶液、及び／または第２の相溶液、及び／または標的分析対象物がＬＦＡまたはスポットアッセイデバイスを垂直方向及び／または水平方向に通過するのに十分なほど十分な長さ及び／または深さを有する。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、第１の速度で多孔性マトリックスを通過し、第２の相溶液は、第２の速度で多孔性マトリックスを通過し、第１の速度と第２の速度とは異なる。ＬＦＡまたはスポットアッセイの実施形態のいくつかでは、多孔性マトリックスは、数ある中でも特に、焼結ガラスセラミック、ミネラル、セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン、ナイロン、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン、それらの組み合わせ、及び同様のものなどの材料を含む。
典型的なラテラルフローイムノアッセイ試験ストリップの模式図（上）及びラテラルフローイムノアッセイのサンドイッチ形式（下）示す。 ペーパーでの水性二相系（ＡＴＰＳ）分離をラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）と併用する実施形態の１つを模式的に示すものであり、これによって標的分析対象物（例えば、バイオマーカー）が濃縮され、増進試薬が送達されることでシグナルが増強される。示されるように、ＬＦＡストリップがＡＴＰＳ溶液（１）に浸漬され、このＡＴＰＳ溶液は、標的分析対象物（例えば、バイオマーカー）、プローブ（例えば、比色プローブ）、及び１つまたは複数の増進試薬を含む。ＡＴＰＳは、先行相と遅行相とに相分離することになる。最初に、先行相（２）が、濃縮された標的分析対象物（複数可）（例えば、バイオマーカー）及び比色プローブを検出領域に送達する。この次に、遅行相（３）が流れて検出ゾーンを横断通過し、これによって増進試薬が送達されることでＬＦＡシグナルが増強される。ピンク色は比色プローブに相当し、黄色は増進試薬に相当する。 ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳの塩高含有相である下相にＡＬＰ－ＧＮＰが極度に分配され（左）、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳのＰＥＧ高含有相である上相にＮＢＴ／ＢＣＩＰが極度に分配される（右）ことを示す。 ＬＦＡのみ（左）と、ＬＦＡ＋ＡＴＰＳ＋ＮＢＴ／ＢＣＩＰという新たな設計と、で低濃度のモデルタンパク質（トランスフェリン）を検出して比較したものを示し、使用者による追加の段階を全く伴うことなく、シグナルが良好に増強されたことが示される。 ＰＥＧ－デキストランＡＴＰＳにおける血液の分配を視覚的に実証したものを示す。 ＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳにおいて乾燥濾紙血から溶出したＤＮＡの濃度を示す。Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）蛍光アッセイを使用してＤＮＡ濃度を測定したところ、ＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳの上相と比較して下相のＤＮＡ濃度が有意に高いことが示された（ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。こうした結果は、トレハロース及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理したガラス繊維ペーパー上で調製された乾燥濾紙血（ＤＢＳ）からＤＮＡが溶出することを示している。 ＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳのデキストラン高含有相である下相、及びＵＣＯＮ／デキストランＡＴＰＳの両方の相におけるＤＮＡ濃度を増幅前後で比較したものを示す。試験した相組成のすべてにおいて増幅が達成された。９：１及び１：９の比は、上相と下相との体積比を示す。 ＡＴＰＳポリマーの存在下及び非存在下でのＤＮＡの平均ｑＰＣＲ増幅サイクル数を示す。水におけるＤＮＡ、及びＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳのデキストラン高含有相である下相におけるＤＮＡについて、レポーター色素の蛍光強度から増幅プロット（紫色で示される）を作成した。プロット上の緑色線は、レポーター色素の閾値蛍光強度を示す。紫色の増幅曲線と蛍光閾値とが交わる点におけるサイクル数は、閾値サイクルとしても知られており、ｑＰＣＲ反応における標的ＤＮＡの濃度を示す。水におけるＤＮＡの増幅、及びＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳのデキストラン高含有相におけるＤＮＡの増幅に要する平均閾値サイクル数は、それぞれ３２及び３１である。サイクル数は、スチューデントｔ検定を使用して比較し（ｐ＜０．０１、ｎ＝３）、２つ方法の間に統計学的差異が存在しないことが示された。 ＡＴＰＳ及びｔＨＤＡを含めたワンポット反応を使用するＤＮＡ増幅の実施形態の１つの模式図を示す。 ＡＴＰＳ及びｔＨＤＡを含めたワンポット反応とｔＨＤＡのみの反応とを比較したものを示す。レーン１は、ｔＨＤＡのみでは７．７ｘ１０４個の細胞から増幅が生じなかったことを示す。レーン２～４は、それぞれ７．７ｘ１０４個の細胞、１．６ｘ１０４個の細胞、及び１．７ｘ１０３個の細胞を含む試料で当該ワンポット反応を実施することで、１００ｂｐの標的産物が良好に増幅されたことを示す。レーン５及びレーン６では、１０２個の細胞で当該ワンポット反応が実施され、レーン６が１００ｂｐの標的バンドの存在を正確に示している。レーン５及びレーン６に見える第２のバンドは、閾値を下回る細胞数で増幅を実施すると生じる非特異的なアーティファクト副産物である。 標的分析対象物（例えば、生体分子）を検出するためのオールインワンスポット試験の実施形態の１つの模式図を示す。ＡＴＰＳ構成成分及び比色（または他の）指示薬は、それぞれ濃縮コンポーネント及び複合パッドに脱水吸着される。使用者は、単に試料溶液をデバイスに加えるだけでよく、その後、構成成分は再水和し、標的生体分子は濃縮コンポーネント内で濃縮される。その後、分析対象物は、複合パッド上の比色指示薬に結合することになると共に、得られる指示薬－標的複合体が反応パッドで捕捉されることになり、このことが可視スポットによって示される。 ワンポット系における３つのＤＮＡ型の分配係数を示す。ゲノムＤＮＡ及び１００ｂｐのＤＮＡ断片は、上相に優先的に分配された一方で、より小さな２５ｂｐのＤＮＡ断片は、２つの相に均等に分配された。 ｔＨＤＡのみでのＤＮＡ増幅の結果（左）、及びワンポットプラットフォームでのＤＮＡ増幅の結果（右）を示す。ｔＨＤＡのみの反応では、１０６ｃｆｕ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉを含む試料からＤＮＡが良好に増幅された一方で、ワンポットプラットフォームでは、１０６ｃｆｕ／ｍＬ及び１０５ｃｆｕ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉを含む試料からＤＮＡが良好に増幅された。「Ｌ」は、ＤＮＡラダーを含むレーンを示す。 自動化され、かつシグナルが増強されたＬＦＡを３．２ｎｇ／μＬのＣＴで実施したときの画像を時系列で示すものである。バックグラウンドシグナルが最小限に抑制されつつ、試験ライン及び対照ラインが経時的に黒くなっており、このことは、ＡＴＰＳがシグナル増強反応の自動化に使用可能なことができることを示している。 ＡＴＰＳ及びシグナル増強を含めたＬＦＡにおいて、ＣＴの検出限界が３０倍改善したことを示す。従来のＬＦＡでは、１０ｎｇ／μＬのＣＴが検出された一方で、増強ＬＦＡでは、０．３２ｎｇ／μＬのＣＴが検出された。
ある特定の実施形態では、ラテラルフローアッセイの感度を顕著に向上させる方法及びデバイスが提供される。さまざまな実施形態において、水性二相系（ＡＴＰＳ）とシグナル増強反応とを統合することによってＬＦＡ（またはフロースルーアッセイ）の感度が顕著に向上する。ある特定の実施形態では、ＡＴＰＳは、標的バイオマーカーを濃縮し、これに加えて、ＬＦＡ（またはフロースルーアッセイ）の検出ゾーンを横断してシグナル増強試薬を連続的に送達するという２つの役割を担う。この新規の技術統合によって、使用者によって加える段階を１つにとどめ、デバイスのコストを低く維持しつつＬＦＡ（またはフロースルーアッセイ）の感度を改善することが可能になる。
ある特定の実施形態では、単純かつ有効な核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）のための方法及びデバイスも提供される。ある特定の実施形態では、方法によって、水性二相系（ＡＴＰＳ）がＤＮＡ増幅と組み合わさることで段階が顕著に減少し、その結果、携帯型のＮＡＡＴが実現する。最終製品は、試料の調製とＤＮＡ増幅とが組み合わさって１段階にまとまる単一プラットフォームである。こうした試験は、単純化されているものの、複数の複雑な段階、機器、同一の結果を達成するための熟練人員を必要とする現在のＮＡＡＴと比較すると、その感度及び精度が向上している。さらに、この１段階プラットフォームを用いると、パラメーターを調整することでさまざまな感染性疾患の検出にその用途を広げることが容易にでき、このことによって、この１段階プラットフォームが開発途上国において使用するための真に独立型のＮＡＡＴ診断提供物となっている。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及びデバイスは、臨床用途のための、分析対象物の採取、抽出、濃縮、及び検出向けに提供され得る。ある特定の実施形態では、方法及びデバイスによって、生体試料（例えば、口腔液または組織試料、尿、血液または血液分画物、脳脊髄液、リンパ液、組織生検物、膣試料、及び同様のもの）、食品試料、環境試料、ならびに同様のものにおける細菌、真菌、及びウイルスを迅速に検出及び／または定量化することが可能になる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるアッセイ及びデバイスは、フィールド環境試験、フィールド食品試験、及び同様のものを行う上で、正確、高感度、携帯型、使い捨て、かつポイント・オブ・ケアでの使用に十分に適したものであり、伴う訓練または機器は最小限のものである。
ＬＦＡ（またはフロースルーアッセイ）の感度を向上させる方法及びデバイス
さまざまな実施形態において、ＡＴＰＳの濃縮能力をＬＦＡ（またはフロースルーアッセイ）と併用し、これによってＬＦＡ（またはフロースルーアッセイ）の検出限界を顕著に（例えば、１０～１００倍以上）改善することで、実験室ベースのアッセイの感度に近づけることができる。こうした実験室ベースのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１５／１３４９３８号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２９７）、及び２０１５年９月４日出願の同時係属出願ＵＳＳＮ６２／２１４，８０１を参照のこと）（これらの文献は両方共、そこに開示される方法及びデバイスを対象として参照によって本明細書に組み込まれる）などである。分析対象物の濃縮にＡＴＰＳを使用するために、目的の試料は、典型的には、ＡＴＰＳに加えられ、添加された分析対象物は、そこでサイズ及び親水性などのさまざまな物理的特性及び化学的特性に基づいて２つの水性相に分布または分配される。２つの相のうちの１つに極度に分配される分析対象物は、その相の体積を著しく減らすことによってその相に濃縮することができる。系の水性性質は、生体分子にとって穏和な環境を提供することにもなり得、これによってその構造及び生物学的活性が安定する。
多くのタンパク質は、むしろＡＴＰＳの２つの相に均等に分配されることが通常であり、結果的に得られる濃縮能力は不十分なものとなる。ＡＴＰＳがタンパク質（または他の分析対象物）を濃縮する能力を増強するために、標的タンパク質（または他の分析対象物）を捕捉し、それを濃縮するために所望の相に誘導することができ、任意選択で、ＬＦＡのための比色指示薬として働くことができるさまざまなプローブ（例えば、目的の標的に特異的な抗体でコートされた金ナノプローブ（ＧＮＰ））を利用することができる。さらに、ペーパーでのＡＴＰＳ分離は、相分離プロセスを大いに強化及び促進し得る方法を提供するものである。よく混合されたＡＴＰＳ溶液が多孔性ペーパーに加えられると、それがペーパーを通過するにつれてそのそれぞれの相へと分離し、粘性が低い相が先行相となり、粘性が高い相が遅行相となり得る。これは、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳ系については、塩高含有相が先行し、ＰＥＧ高含有相が遅行するということである。さらに、３－Ｄペーパー芯を使用することで、ペーパーでのＡＴＰＳ分離がさらに強化される。３－Ｄ芯の下流にＬＦＡストリップを配置することによって、我々は、濃縮段階と検出段階とを途切れることなく１つのデバイスに統合した。
典型的なＬＦＡは、試料が試験ストリップに加えられる場所である試料パッド、結合が生じ、結果が観測され得る場所である検出ゾーン、及び過剰な試料のシンクとして働く場所である吸収パッド（図１、上）という少なくとも３つのコンポーネントからなる。サンドイッチアッセイ形式では、結合分子（抗体、アプタマー、一本鎖ＤＮＡなどであることが多い）で修飾されたＬＦＡ指示薬（比色性、蛍光性、及び放射性などであり得る）が最初に試料に添加される。標的分析対象物が存在するのであれば、抗体で修飾された指示薬にその標的分析対象物が結合することになる。こうした複合体は、例えば試料パッドを介して、ＬＦＡ試験ストリップに加えられ、そのストリップを通過して吸収パッドに向かう。標的分析対象物が存在するのであれば、試験ラインに固定化された結合分子にその分析対象物が結合し、指示薬と膜との間に挟まれた状態となる。指示薬が比色性であるならば、その比色指示薬が強い色を示すことになり、分析対象物－指示薬複合体が試験ラインに蓄積するにつれて可視バンドが形成されることで、結果が陽性であることが示される。あるいは、分析対象物が存在しないのであれば、指示薬は試験ラインに付着せず、試験ラインが存在しないことで、結果が陰性であることが示される。分析対象物の存在の有無にかかわらず、指示薬に存在する修飾結合分子は、対照ライン（存在する場合）に結合及び蓄積し得る。対照ラインのバンドは、試料がストリップを通過したことを知らせており、これによって、試験が妥当であることが示される。したがって、結果が陽性であることは、バンドが２つ（１つは試験ラインのものであり、１つは対照ラインのものである）生じることによって示され、一方、結果が陰性であることは、対照ラインの単一のバンドによって示される。
本明細書に記載されるように、ＬＦＡ及びＡＴＰＳが統合された我々の前述のデバイスの検出限界は、使用者による追加の段階を全く必要としないシグナル増強方策を加えることで改良されている。ＬＦＡシグナルを増強するための典型的なプロトコールでは、試料溶液を比色プローブと共にＬＦＡストリップに加えることが最初に必要であり、これに１０～２０分を要する。次に、プローブによって生成するシグナルを増強するためにＬＦＡ試験ストリップに増進試薬が加えられる。ある特定の実施形態では、この増強によって、ＬＦＡのみの場合の検出限界と比較して検出限界が１０～５０倍改善され得る。
ある特定の実施形態では、手動のＡＴＰＳ抽出を多段階のシグナル増強と組み合わせるための方法及びデバイスが本明細書で提供される。ＡＴＰＳのバルク相の１つに分析対象物を添加及び濃縮すると、その相を手動（またはロボット制御）で抽出し、検出のためにＬＦＡに加えることができる。例えば、１０～２０分後に、使用者（またはロボット）が増進試薬を加えることでＬＦＡシグナルが増強され得る。ＡＴＰＳによる濃縮及びシグナル増強に起因して検出限界が複合的に改善するため、この多段階手法では、ＬＦＡの検出限界が１００～１０００倍改善し得る。比色プローブと増進試薬溶液とは、互いに別々のままであることが重要であり、混合すると、増進が早発する結果としてバックグラウンドシグナルが高くなり得る。上記の手法は、試薬を別々の状態で良好に保つ一方で、複数の時限段階が必要であることから、試験のばらつきが増加し、使用者にとっての使いやすさは低下する。
比色プローブと増進試薬とを依然として別々の状態に保ちつつ、使用者が複数段階を実行する手間をなくすために、ある特定の実施形態では、さまざまなＡＴＰＳにおいてプローブと増進試薬とが逆に分配される挙動が利用され、これに加えて、ある特定の実施形態では、ペーパーでＡＴＰＳが分離する現象が利用される。この手法では、プローブ（例えば、比色プローブ）は、そのサイズ及び／または親水性を増加させることによって、ＡＴＰＳにおいて、より親水性であり、混雑度の低い相に極度に分配されるように操作することができる。これは、ポリマー－塩ＡＴＰＳでは塩高含有相に相当し、またはミセルＡＴＰＳではミセル低含有相に相当する。逆に、サイズ小さく、相対的に疎水性の増進試薬（複数）は、ＡＴＰＳにおいて、より疎水性であり、より混雑した相に分配される。これは、ポリマー－塩ＡＴＰＳのポリマー高含有相に相当し、またはミセルＡＴＰＳのミセル高含有相に相当する。ペーパー基質にＡＴＰＳが加えられると、相分離が促進され、より親水性の先行相及びより疎水の遅行相が形成されることになる。これは、ポリマー－塩ＡＴＰＳについては、塩高含有相が先行し、ポリマー高含有相が遅行するということであり、ミセルＡＴＰＳについては、ミセル低含有相が先行し、ミセル高含有相が遅行する。先行相は、濃縮されたバイオマーカー及び比色プローブをＬＦＡの検出ゾーンに送達することになる。この後に、遅行相が増進試薬を送達することでシグナル増強が始まることになる（図２）。
我々は、この手法の実現可能性を、モデルタンパク質であるトランスフェリン（Ｔｆ）を検出するために、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素によるニトロ－ブルーテトラゾリウム／５－ブロモ－４－クロロ－３－イノジルインドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）の発色に基づく酵素系を使用して実証した。ＡＬＰ及び抗Ｔｆ抗体を金ナノ粒子に複合化することでアルカリホスファターゼ－金ナノプローブ（ＡＬＰ－ＧＮＰ）を形成した。こうしたＡＬＰ－ＧＮＰは、溶液中のＴｆを捕捉し、濃縮するために所望のＡＴＰＳ相にＴｆを誘導することができる。ＡＬＰ－ＧＮＰは、ＬＦＡのための比色指示薬として働くだけでなく、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質溶液と反応して紫色の沈殿物を生成できるという能力を追加で有する。ＡＬＰ－ＧＮＰは、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳに添加されると、塩高含有相である下相に分配される一方で、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質は、ＰＥＧ高含有相である上相に分配される（図３）。ＡＴＰＳは、ＬＦＡ試験ストリップを下流に有する我々の３－Ｄペーパーウェルに加えられると、ＡＬＰ－ＧＮＰが、目的のバイオマーカーを伴って、先行する塩高含有相に濃縮され、検出ゾーンに送達されることになる。この後に、ＰＥＧ高含有相が検出ゾーンを横断して流れることで、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質が送達されることになる。基質は、検出ゾーンに結合したすべてのＡＬＰ－ＧＮＰによって紫色の沈殿物へと変換されることになり、それによってシグナルが増強される（図４）。我々は、この手法の実現可能性を、ＡＬＰによるＮＢＴ／ＢＣＩＰとの酵素反応と組み合わせてＰＥＧ－塩ＡＴＰＳを使用することで実証してきたが、この技術は、他のＡＴＰＳ系（例えば、ＰＰＧ－塩、ＰＥＧ－デキストラン、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、Ｃ１０Ｅ４など）ならびにシグナル増強系（セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ様ナノ粒子とＴＭＢまたはＤＡＢとの組み合わせ、金及び銀による増強など）に適用することができる。この手法は、使用者によって加える段階が１回のみであり、伝統的なＬＦＡを上回って検出限界を１００～１０００倍改善することができると考えられる。
前述の方法は、ＬＦＡに関して記載されているが、こうした方法は、フロースルーアッセイ（例えば、図１１に示されるものなどのアッセイ）にも容易に適用できることを認識されよう。
ある特定の実施形態では、ＡＴＰＳ、プローブ、及び増進試薬（複数可）は、プローブが先行相に含まれ、増進試薬（複数可）が遅行相に含まれて提供されるように選択されるが、２つの相の間の界面にプローブ（複数可）が局在化し、増進試薬（複数可）が遅行相に含まれて提供される実施形態もまた企図される。
核酸の増幅と、核酸の濃縮及び予備濃縮との組み合わせ
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ増幅技術と、ＤＮＡの抽出段階及び予備濃縮段階と、を組み合わせて、すべてを１つの統合プラットフォームに組み込む方法及びデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、このプラットフォームは、水性二相系（ＡＴＰＳ）からなり、これによって、所与の構成成分濃度及び温度で、ＡＴＰＳ混合物が２つの異なる相に分離することが可能となる。両方の相が水性であり、生体分子にとって安定な環境を提供する。
ＡＴＰＳは、さまざまな特性を有し、さまざまな生物学的目的に適合するものであり、こうした目的は、試料の精製及び細胞の溶解、ならびに生体分子の分離、選別、及び濃縮などである。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤を含めて調製されたミセルＡＴＰＳでは、ＤＮＡのような生体分子が１つの相に極度に分配され得る。さらに、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤は、固有の細胞溶解ことができることも知られている。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びデキストランから調製されたＡＴＰＳは、乾燥濾紙血を再溶解し、１つの相に血液細胞を分配させるために使用することができる（例えば、図５を参照のこと）。その後、再溶解した血液細胞に由来するＤＮＡは、デキストラン高含有相である下相に濃縮され得る（図６）。増幅するための複雑な生体試料からのＤＮＡの調製及び抽出では、こうした細胞溶解段階、ＤＮＡ精製段階、及び濃縮段階が必要になることが多い。ＡＴＰＳを用いればこうした結果を達成することが可能であるため、このことによって、ＡＴＰＳがＤＮＡ増幅及び／または他のプロトコールを統合するための適切な生体試料操作プラットフォームとなっている。
ＡＴＰＳによるＤＮＡ抽出／予備濃縮と、核酸（例えば、ＤＮＡ）増幅と、を統合するための例示的な手法の１つでは、濃縮された核酸を含む、ＡＴＰＳの相の１つまたは界面を抽出し、緩衝試薬、塩溶液、ヌクレオチド塩基、酵素、及び標的核酸（例えば、ＤＮＡテンプレート）を特異的に増幅するプライマーを含む核酸増幅反応に直接的に供すことができる。１つの例では、血液適合性のポリメラーゼを使用することで、デキストラン高含有相及びＵＣＯＮ高含有相から直接的にＤＮＡが良好に増幅された。増幅に際して、ＤＮＡ濃度を２～７倍に増加させることが可能であり、このことは、試験したＡＴＰＳ系にポリメラーゼが適合することを示している（図７）。デキストラン高含有相に含まれるＤＮＡに対して従来の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）も直接的に実施し、純水に含まれるＤＮＡからの増幅と同じくらい良好に当該反応を進行させることが可能であった（図８）。
例示的であるが非限定的な別の手法では、ＡＴＰＳと核酸（例えば、ＤＮＡ）増幅とに必要な構成成分のすべてが１つの混合物に統合される。注目すべきは、この方法では、典型的には、核酸（例えば、ＤＮＡ増幅）を等温で利用できるということである。一般に使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅方法は、ＤＮＡ増幅プロセスのそれぞれの段階について異なる温度を周期的に繰り返すものであるが、等温増幅では、ＤＮＡ増幅プロセス全体を１つの設定温度で実施することが可能である。この一例は、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（ｔＨＤＡ）であり、これは、二本鎖ＤＮＡを分離するために熱サイクリングではなくヘリカーゼを使用するものであり、これによって、等温的（例えば、６５℃）に増幅を実施することが可能になる。この温度でも相分離が生じるミセルＡＴＰＳが存在するため、こうしたミセルＡＴＰＳをｔＨＤＡ反応の構成成分と組み合わせることでＤＮＡの濃縮及び増幅を同時に促進することができる。
これを実施するために、全細胞試料を統合溶液に添加することができ、その際、次に全溶液を混合することでミセルＡＴＰＳを形成することができる。その後、この混合物を例えば、６５℃で１時間加熱することで、相分離とＤＮＡ増幅とを両方生じさせることが可能である（図９）。核酸（例えば、ＤＮＡ）は、２つの相のうちの１つに分配され、その後、そこから増幅ＤＮＡを抽出することができる。このワンポットプラットフォームには、核酸の濃縮と増幅とを両方同時に行う能力が存在し、この能力によって、現在のｔＨＤＡ技術単独で可能なものと比較して、細胞数が少ない試料から増幅を行うことが可能になる。現在のｔＨＤＡ技術では、試料に含まれる細胞数が１０，０００個超であれば、試料からＤＮＡが良好に増幅される。対照的に、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００ＡＴＰＳとｔＨＤＡとが統合されたワンポット系を使用すると、僅か１００個の細胞しか含まない試料からＤＮＡを良好に増幅できることが我々の予備結果によって示されている（図１０）。一方、細胞試料が別に溶解され、商用のキット及び他の実験機器を介してＤＮＡが精製及び濃縮されると、ｔＨＤＡ系自体は、単に、この同一の低い検出限界を達成し得るにすぎない。したがって、我々のワンポットプラットフォームが感度及び単純性を改善したことが、このプラットフォームをポイント・オブ・ケア核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）に基づく疾患検出のための、競争力のある候補としている。我々の発明は、使用することができる可能なＡＴＰＳ及び等温増幅試薬が多く存在するため、非常に汎用的でもある。
標的生体分子の濃縮
本明細書に記載のアッセイのさまざまな実施形態において、分析対象物（例えば、標的生体分子）は、水性二相系（ＡＴＰＳ）を使用して濃縮することができる。さまざまな実施形態において、ＡＴＰＳは、バルクの液体形態（例えば、容器）において実施するか、またはラテラルフローアッセイもしくはフロースルーアッセイ（例えば、ペーパー膜）において試料溶液を流しながら実施することができる。
液体ＡＴＰＳにおける濃縮
採取した試料（例えば、組織試料、生体液（尿、唾液、及び血液、痰、膣液、精液、脳脊髄液、リンパ液など）、子宮頸管内スワブ、歯に由来するプラーク、食品試料、ならびに環境試料、ならびに同様のもの）は、任意選択で、懸濁液（例えば、緩衝液）と混合されるか、もしくはＡＴＰＳ溶液と直接的に混合されるか、もしくはペーパーに直接的に加えられるか、または試料を含む懸濁液がペーパーに加えられることで、事前にペーパーに乾燥吸着したＡＴＰＳ構成成分が再水和し得る。場合によっては、よく混合された均一溶液を得るために、使用者による混合が必要であり得る。例示的であるが非限定的なさまざまな実施形態において、ポリマー／塩、ポリマー／ポリマー、ミセル／ポリマー、またはミセルＡＴＰＳが使用され得る。
ペーパーでの流体が流れながらの濃縮
さまざまな実施形態において、濃縮段階は、ペーパーを用いても促進され得る。例えば、採取した検体をＡＴＰＳ構成成分と混合し、相分離を推進、強化、及び促進することができるペーパーデバイスに導入にすることができる。標的生体分子は、ペーパー膜での流れの先行前部において濃縮することができ、次の検出コンポーネントへと途切れることなく導入することができる。
あるいは、ＡＴＰＳ構成成分は、ペーパー膜に事前に脱水吸着させることができる。この場合、採取した検体は、ＡＴＰＳ構成成分と事前に混合することなく、ペーパー膜に直接的に加えることができる。
水性二相系（ＡＴＰＳ）
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスは、例えば、シリンジまたは他の容器における水性二相系（ＡＴＰＳ）と併せて働くように構成されるか、または水性二相系（ＡＴＰＳ）を支持するように構成される。いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳは、相溶液を含む。「相溶液」という用語は、一般に、ＡＴＰＳの第１の相溶液または第２の相溶液を指す。いくつかの実施形態では、相溶液は、混合溶液（例えば、第１の相溶液／第２の相溶液との混合溶液）に存在する。いくつかの実施形態では、相溶液は、ＡＴＰＳの混合溶液からそれが分配された後の第１の相溶液／第２の相溶液である。いくつかの実施形態では、相溶液は、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイにおいて混合溶液からそれが分配された後の第１の相溶液／第２の相溶液である。ある特定の実施形態では、相溶液は、それが混合状態（例えば、第１の相溶液との混合状態）にある間、第２の相溶液と称され得る。いくつかの実施形態では、相溶液は、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイにおける先行流体である。いくつかの実施形態では、相溶液は、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイにおける遅行流体である。
いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳは、第１の相溶液と第２の相溶液とが最初は混ざった状態のもの（例えば、混合相溶液）である２つの水性溶液を含む。いくつかの実施形態では、混合相溶液は、均一溶液であるが、ある特定の他の実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液とは、非混和性である。いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液とは、非混和性であるが、第１の相溶液のドメインは、第２の相溶液のドメインと混ざる。いくつかの実施形態では、非混和性は、温度変化及び／または塩などの異なる構成成分の濃度変化によって促進される。いくつかの実施形態では、第１の相溶液／第２の相溶液は、ミセル、塩、及び／またはポリマーなどの構成成分を含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳと接触する標的分析対象物（例えば、生体分子、細菌（もしくはその断片）、真菌（もしくはその断片）、またはウイルス、及び同様のもの）は、その物理的特性及び化学的特性（サイズ、形、疎水性、及び電荷など）に基づいて、第２の相溶液を上回って第１の相溶液に（またはその逆に）優先的に分布、分配、及び／または濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物（例えば、細菌、真菌、ウイルスなど）は、ＡＴＰＳの第１の相溶液または第２の相溶液に主に（または極度に）分配され、それ故に、ＡＴＰＳにおいて濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、第１の相溶液と第２の相溶液との体積比を調整することによって濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、分析対象物が分配される相の体積を減らすことによって濃縮される。例として、いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、例えば、第１の相溶液と第２の相溶液との体積比を１：９にすることによって第１の相溶液に１０倍濃縮され、この濃縮は、分析対象物が極度に分配される相の体積が総体積の１／１０であるために生じる。
いくつかの実施形態では、他の濃縮が、他の比を使用することによって得られる。したがって、いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液との比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０の比を含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液との比は、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００の比を含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液と第２の相溶液との比は、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：９００、または約１：１０００の比を含む。
いくつかの実施形態では、第２の相溶液と第１の相溶液との比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、または約１：１０の比を含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液と第１の相溶液との比は、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０、または約１：１００の比を含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液と第１の相溶液との比は、約１：２００、約１：３００、約１：４００、約１：５００、約１：６００、約１：７００、約１：８００、約１：９００、または約１：１０００の比を含む。
いくつかの実施形態では、分析対象物は、第１の相溶液と第２の相溶液とに実質的に均等に分配されることで、分析対象物の濃縮が阻止される。そのような系では、標的分析対象物の濃縮は、標的分析対象物を捕捉するプローブなどの、追加の構成成分を導入することによって達成され、プローブは、１つの相に主に分配され、それによって、標的分析対象物の濃縮を可能にする分配挙動が強化される。いくつかの実施形態では、濃縮された分析対象物を含む第１の相溶液／第２の相溶液が採取され、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイデバイスに加えられる。
いくつかの実施形態では、第１の相溶液／第２の相溶液は、ミセル溶液を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘと同様のポリマー（例えば、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０及びＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０、ならびに同様のものなどであるが、これらに限定はされない）を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘから本質的になる。
いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、室温（約２５℃）で、約０．０１センチポアズ～約５０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約４５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約４０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約３５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約３０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約２５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約２０００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約１５００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約１０００センチポアズ、または約０．０１センチポアズ～約５００センチポアズの粘度を有する。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、室温で、約０．０１センチポアズ～約４５０センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約４００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約３５０センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約３００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約２５０センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約２００センチポアズ、約０．０１センチポアズ～約１５０センチポアズ、または約０．０１センチポアズ～約１００センチポアズの粘度を有する。
いくつかの実施形態では、再水和した第１の相溶液／第２の相溶液は、ポリマー（例えば、ポリマー溶液）を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレン／プロピレンコポリマー（例えば、ＵＣＯＮ（商標）ポリマー）、プロピレングリコール（ＰＰＧ）、メトキシポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及び同様のものからなる群から選択される１つまたは複数のポリマーを含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。さまざまな実施形態において、ＰＥＧは、１０００～１００，０００の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ－４６００、ＰＥＧ－８０００、またはＰＥＧ－２０，０００を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）である。さまざまな実施形態において、ＰＰＧは、１００～１０，０００の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、ＰＰＧは、ＰＰＧ４２５を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、デキストランである。さまざまな実施形態において、デキストランは、１０００～１，０００，０００の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、デキストランは、デキストラン６０００、デキストラン９０００、デキストラン－３５，０００、またはデキストラン－２００，０００を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、エチレン／プロピレンコポリマー（例えば、ＵＣＯＮ（商標）ポリマー）を含む。例示的であるが非限定的なエチレン／プロピレンコポリマーには、限定はされないが、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－５１００、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－３５２０、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－２０００、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－６６０、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－４００、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－２６０、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－１７０、ＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢ－１００、ＵＣＯＮ（商標）６０－Ｈ－５３００、ＵＣＯＮ（商標）６０－Ｈ２３００、ＵＣＯＮ（商標）６０－Ｈ－１６００、ＵＣＯＮ（商標）６０－Ｈ－１１００、ＵＣＯＮ（商標）６０－Ｈ－７６０、ＵＣＯＮ（商標）６０－Ｈ－３４０、ＵＣＯＮ（商標）７５－Ｈ－９５００、ＵＣＯＮ（商標）７５－Ｈ－１４００、ＵＣＯＮ（商標）７５－Ｈ－４５０、及び同様のものが含まれる。
いくつかの実施形態では、再水和したポリマー溶液は、ポリマー含量が約０．０１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．０５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．１５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．２％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．２５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．３％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．３５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．４％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．４５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．５５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．６％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．６５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．７％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．７５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．８％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．８５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．９％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約０．９５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１％ｗ／ｗのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー含量が約１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約６％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約７％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約８％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約９％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１２％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１３％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１４％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１６％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１７％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１８％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約１９％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２２％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２３％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２４％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２６％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２７％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２８％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２９％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３２％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３３％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３４％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３６％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３７％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３８％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３９％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４１％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４２％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４３％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４４％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４５％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４６％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４７％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４８％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４９％ｗ／ｗのポリマー溶液、または及びポリマー含量が約５０％ｗ／ｗのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー含量が約１０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約２０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約３０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約４０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約５０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約６０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約７０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約８０％ｗ／ｗのポリマー溶液、またはポリマー含量が約９０％ｗ／ｗのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー含量が約１０％ｗ／ｗ～約８０％ｗ／ｗのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和したポリマー溶液は、ポリマー含量が約１％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、または約５％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、または約１０％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、または約１０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗのポリマー溶液を含む。
いくつかの実施形態では、再水和した第１の相溶液及び／または第２の相溶液は、塩を含み、それによって塩溶液を形成する。いくつかの実施形態では、標的分析対象物（例えば、細菌、真菌、ウイルスなど）及び／またはプローブ－分析対象物複合体は、塩溶液に分配される。ある特定の実施形態では、塩溶液は、コスモトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、塩溶液は、カオトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、マグネシウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、セシウム塩、亜鉛塩、及びアルミニウム塩のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、塩は、臭化物塩、ヨウ化物塩、フッ化物塩、炭酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、カルボン酸塩、ホウ酸塩、またはリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、リン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、塩は、硫酸アンモニウムである。
いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、約０．０１％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．０５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、約０．１％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．１５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．２％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．２５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．３％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．３５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．４％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．４５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．５５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．６％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．６５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．７％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．７５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．８％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．８５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．９％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約０．９５％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液、または約もしくは約１％ｗ／ｗの塩を含む塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、塩含量が約１％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約５％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約６％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約７％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約８％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約９％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１０％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１１％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１２％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１３％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１４％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１５％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１６％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１７％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１８％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約１９％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２０％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２１％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２２％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２３％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２４％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２５％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２６％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２７％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２８％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約２９％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３０％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３１％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３２％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３３％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３４％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３５％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３６％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３７％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３８％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約３９％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４０％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４１％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４２％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４３％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４４％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４５％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４６％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４７％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４８％ｗ／ｗの塩溶液、または塩含量が約４９％ｗ／ｗの塩溶液、または及び塩含量が約５０％ｗ／ｗの塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、約０．１％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、または約１％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、または約５％ｗ／ｗ～約２５％ｗ／ｗ、または約１０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗの範囲の塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、約０．１％ｗ／ｗ～約１０％の塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、塩溶液は、約１％ｗ／ｗ～約１０％である。
いくつかの実施形態では、第１の相溶液／第２の相溶液は、水と非混和性の溶媒を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、非極性の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、油を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、ペンタン、シクロペンタン、ベンゼン、１，４－ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、またはヘキサンを含む。
いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、ミセル溶液を含み、第２の相溶液は、ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液は、ミセル溶液を含み、第１の相溶液は、ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、ミセル溶液を含み、第２の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液は、ミセル溶液を含み、第１の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ溶液である。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、第１のポリマーを含み、第２の相溶液は、第２のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマー／第２のポリマーは、ポリエチレングリコール及び／またはデキストランを含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、ポリマーを含み、第２の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液は、ポリマーを含み、第１の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、ポリエチレングリコールを含み、第２の相溶液は、リン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液は、ポリエチレングリコールを含み、第１の相溶液は、リン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、塩を含み、第２の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、コスモトロピック塩を含み、第２の相溶液は、カオトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液は、コスモトロピック塩を含み、第１の相溶液は、カオトロピック塩を含む。
いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、表１に記載の構成成分１を含み、第２の相溶液は、表１に記載の構成成分２を含む。いくつかの実施形態では、第２の相溶液は、表１に記載の構成成分１を含み、第２の相溶液は、表１に記載の構成成分２を含む。
いくつかの実施形態では、表１に記載の構成成分は、緩衝液に懸濁または溶解される。いくつかの実施形態では、表１に記載の構成成分は、試料の起源である生体系に適合する緩衝液に懸濁／溶解される。いくつかの実施形態では、表１に記載の構成成分は、生理食塩水に懸濁／溶解される。いくつかの実施形態では、表１に記載の構成成分は、ＰＢＳに懸濁／溶解される。いくつかの実施形態では、表１に記載の構成成分は、水に懸濁／溶解される。いくつかの実施形態では、表１に記載の構成成分は、生体液に懸濁／溶解される。
Figure 0007320951000001
Figure 0007320951000002
Figure 0007320951000003
ＵＣＯＮ（商標）ポリマーは、約１００℃～約１５０℃の温度で、アルカリ触媒を使用し、等重量のエチレンオキシド及びプロピレンオキシドをブチルアルコールと反応させることによって生成するエチレン／プロピレンコポリマーを含むことに留意されたい。得られるＵＣＯＮ（商標）５０－ＨＢは、以下の一般構造を有するランダムコポリマーである：
Figure 0007320951000004
上記のＡＴＰＳ系及び構成成分は、例示的かつ非限定的であることを認識されよう。本明細書で提供される教示内容を使用することで、当業者であれば多数の他のＡＴＰＳ系及び構成成分を利用可能であろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデバイス（例えば、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイデバイス）は、ＡＴＰＳと接触するように配置構成されるコレクターをさらに含み得、標的分析対象物は、コレクターと第１の相溶液及び／または第２の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態では、コレクターは、プラスチック、メソ多孔性材料、シリカ、ポリプロピレン、磁石、磁性粒子、常磁性粒子、孔を有する材料、溝を有する材料、及び／またはそれらの任意の組み合わせである材料を含む。いくつかの実施形態では、コレクターは、ポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態では、コレクターは、標的分析対象物の採取量が増えるように最適化される。いくつかの実施形態では、コレクターは、表面積を最大化するための孔を含む。いくつかの実施形態では、孔の幅は、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、または約１００μｍである。いくつかの実施形態では、孔の幅は、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、または約１ｍｍである。いくつかの実施形態では、孔の深さは、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約５５μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約７５μｍ、約８０μｍ、約８５μｍ、約９０μｍ、約９５μｍ、または約１００μｍである。いくつかの実施形態では、孔の深さは、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、または約１ｍｍである。
標的分析対象物（例えば、生体分子）の検出
さまざまな実施形態において、ペーパーベースの検出コンポーネントは、ラテラルフロー試験ストリップ（例えば、図１を参照のこと）またはフロースルーデバイス（スポット試験）（例えば、図１１を参照のこと）の形態であり得る。さまざまな実施形態において、両方の形態要素は、下記のコンポーネントのうちの１つまたは複数を含み得る：
試料パッド
ある特定の実施形態では、試料パッドは、存在するとき、濃縮コンポーネントを検出コンポーネントに連結することができる。試料パッドは、採取した流体に由来するデブリ、混入物、及び粘液を除去することができるフィルターとして働くことができる。試料パッドは、乾燥試薬を保持することもでき、再水和時に、こうした試薬は、（ｉ）検出条件（ｐＨ、イオン強度など）が最適となるように溶液を調整し、（ｉｉ）採取した検体に含まれ、検出に影響し得る粘液、糖タンパク質、及び他の粘性材料を分解することができる。試料パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。パッドに加える試薬には、限定はされないが、界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、Ｔｗｅｅｎ２０、またはドデシル硫酸ナトリウムなど）、ポリマー（ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）、緩衝剤（リン酸緩衝生理食塩水、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、ホウ酸ナトリウム、ＴＲＩＣＩＮＥなど）、タンパク質（アルブミンなど）、酵素（プロテアーゼなど）、塩（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、リン酸カリウムなど）が含まれ得る。さまざまな実施形態において、こうした試薬は、（ｉ）試薬溶液へのペーパー材料の浸漬、または（ｉｉ）毛細管流動を介する膜の浸潤によって試料パッドに加えることができる。処理した試料パッドは、（ｉ）風乾（室温に放置）、（ｉｉ）ベーキング（オーブンもしくは加温デバイス使用し、高温下に置く）、（ｉｉｉ）減圧、または（ｉｖ）凍結乾燥によって乾燥させることができる。
複合パッド
さまざまな実施形態において、複合パッドは、存在するとき、標的分析対象物（複数可）と結合する結合部分で修飾され、かつ脱水された比色指示薬を含み得る。ある特定の実施形態では、結合部分は、標的分析対象物（複数可）（例えば、細菌、真菌、ウイルス、タンパク質、ＤＮＡなど）に対して高親和性を有する特異的な結合部分である。試料溶液が複合パッドに到達すると、比色指示薬は再水和する。その後、比色指示薬に存在する結合部分は、標的分析対象物（複数可）に結合することができ、得られる複合体は、反応パッドへと流れることができる。ある特定の実施形態では、比色指示薬は、金属粒子（金粒子、銀粒子など）、多量体粒子（ラテックスビーズなど）、及び可視色素または蛍光色素を封入するポリスチレン粒子を含み得る。複合パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。ある特定の実施形態では、比色指示薬は、上記のパッドに加え、脱水吸着させることができる。
反応パッド
ある特定の実施形態では、反応パッドは、存在するとき、固定化された試薬を含み得、固定化された試薬は、試料溶液と反応すると、シグナル（例えば、視覚的シグナル）を生成することで標的分析対象物（複数可）の存在の有無またはその量を示し得る。反応パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。
ラテラルフロー形式
ある特定の実施形態では、ラテラルフロー試験ストリップについては、反応パッドに加える試薬は、流れの方向に対して垂直のラインの形態で固定化されることで、すべての試料が固定化試薬と確実に相互作用し得ることになる。試薬の濃度は、シグナル強度を制御し、したがって、アッセイの感度を制御するために最適化することができる。例えば、半定量的アッセイを、さまざまな濃度で同一の試薬を複数のラインとして固定化することによって設計できる。したがって、それぞれのラインは、特定濃度の標的生体分子が到達したときにのみ、シグナルを生成することになる。その後、視認可能なラインの数を数えることによって標的生体分子の濃度を解釈することができる（例えば、図２を参照のこと）。
さらに、同一のストリップに異なる試薬を複数のラインとして固定化することで、複数の標的分析対象物（複数可）を検出することができる。これによって、マルチプレックスアッセイを開発することが可能になる。
フロースルー形式
ある特定の実施形態では、フロースルー試験ついては、試薬は、ラインの代わりに、反応パッド全体に固定化することができる。標的分析対象物は、存在するのであれば、複合パッドに存在する比色指示薬に結合し、指示薬－標的複合体が固定化試薬に結合するにつれて反応パッドに捕捉されることになる。したがって、標的生体分子が存在するのであれば、可視スポットが出現することになる。この試験は、ラテラルフロー試験ストリップで吸い上げるには試料体積が小さすぎる場合に使用することができる。可視スポットの色の強度は、標的生体分子の濃度と相関し、スポットのサイズは、試料体積と相関する。ある特定の実施形態では、フロースルー試験の真上に濃縮コンポーネントを配置することで、抽出し、濃縮した試料を検出コンポーネントに加えるという手間を省くことができる。
さまざまな実施形態において、固定化された試薬は、標的分析対象物に対する特異的な抗体（一次抗体）、一次抗体に対する抗体（二次抗体）、抗原、タンパク質、または抗原－タンパク質複合体を含み得る。反応パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、及び不織紙などが含まれる。さまざまな実施形態において、試薬を上記のパッドに加え、脱水吸着させることができる。
シンク
ある特定の実施形態では、シンクは、存在するとき、過剰な流体を回収し、試験性能に影響し得る逆流を防ぐ吸収パッドを含み得る。シンクのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、及び不織紙などが含まれる。
シグナル増強
上記のように、さまざまな実施形態において、可視シグナル強度を増強することによって検出アッセイの感度及び／または精度を改善することができる。これは、最初の検出アッセイ（分析対象物の結合）の後に、追加の増進（シグナル増強）試薬を反応パッドに導入することによって実施できる。上に説明されるように、プローブ及びＡＴＰＳは、プローブが検出ゾーンに最初に送達され（例えば、ＡＴＰＳの先行相または界面に含まれて送達される）、その後、増進試薬が遅れて送達される（例えば、ＡＴＰＳの遅行相に含まれて送達される）ように設計することができる。
ある特定の実施形態では、シグナル増強試薬は、例えば、比色指示薬の表面に修飾された酵素と反応する基質を含めることで強力な可視生成物を形成することができる。例として、比色指示薬が金プローブを含むのであれば、シグナル増強は、銀による増強標識化によって達成することができ、この場合、金プローブが固定化ライン／スポットに結合する場所である反応パッドに銀イオン含有増強試薬を加えることができる。このシナリオでは、金プローブは核形成部位として働くことができ、その結果、当該粒子に銀が沈着することでシグナル強度を増加させることができる。こうした例では、シグナル増強試薬は、最初の検出アッセイの後に別に添加するか、またはペーパーデバイスに保持／脱水吸着させることで自動／手動で放出させることができる。
例示的であるが非限定的な他の実施形態では、増進試薬は、プローブ（複数可）と結合またはそれに付加された対応する酵素と反応することで検出可能なシグナルを増強する酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ（または他の）ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど）の基質であり得る。あるいは、増進試薬が酵素を含み得、基質はプローブ（複数可）に付加または結合される。
前述のコンポーネント及びアッセイ形式は、例示的かつ非限定的である。本明細書で提供される教示内容及び例を使用することで、当業者であれば多数の他のアッセイデバイス及び構成が利用可能であろう。設計考慮事項及びコンポーネントのいくつかが以下にさらに記載される。
ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）またはフロースルー（スポット）アッセイ
上に説明されるように、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイス及び系は、試料における標的分析対象物を検出するためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）またはフロースルー（スポット）アッセイを提供するように構成され、ＬＦＡまたはスポットアッセイは、単独で使用されるか、または水性二相系（ＡＴＰＳ）と併せて使用される。いくつかの実施形態では、ＬＦＡまたはスポットアッセイは、ＡＴＰＳまたはその構成成分が流れ込む多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは、ＡＴＰＳまたはその構成成分が流体相に含まれるとき、ＡＴＰＳまたはその構成成分が多孔性マトリックスを通過することが可能なように構成されると共に、それを可能にする十分な多孔度を有する。そのような多孔性のＬＦＡまたはスポットアッセイデバイスは、本明細書でペーパーデバイスまたはペーパー流動性デバイスと称され、これらの用語は、互換的に使用される。
本明細書で使用される「ペーパー」という用語は、木材のパルプまたは他の線維性植物物質に由来する薄いシートに限定されるものではないが、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスにおいてそのようなペーパーを使用することが企図される。ペーパーは、より一般には、多孔性材料を指し、こうした多孔性材料は、シート形状であることが多いが、それに限定はされず、流体が通過可能なものである。
いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、ＡＴＰＳの混合相溶液、第１の相溶液、及び／または第２の相溶液、及び／または標的分析対象物がＬＦＡを通過可能なほど十分に多孔性である。いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、混合相溶液、第１の相溶液、及び／または第２の相溶液、及び／または標的分析対象物がＬＦＡまたはスポットアッセイデバイスを垂直方向及び／または水平方向に通過するのに十分なほど十分な長さ及び／または深さを有する。いくつかの実施形態では、第１の相溶液は、第１の速度で多孔性マトリックスを通過し、第２の相溶液は、第２の速度で多孔性マトリックスを通過し、第１の速度と第２の速度とは異なる。ＬＦＡまたはスポットアッセイの実施形態のいくつかでは、多孔性マトリックスは、数ある中でも特に、焼結ガラスセラミック、ミネラル、セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン、ナイロン、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン、それらの組み合わせ、及び同様のものなどの材料を含む。
流れながら濃縮
ＡＴＰＳは、当該溶液が多孔性基質（例えば、ペーパー）を通過するにつれて相分離し得ることが発見され、このことを我々は「流れながら濃縮」と命名した。さらに、ペーパーを通過することによって濃縮プロセスが顕著に迅速化することも発見された。この現象に基づくと、本明細書に記載のラテラルフローアッセイデバイス及びフロースルーアッセイデバイスは、ＡＴＰＳによる濃縮をＬＦＡまたはフロースルーによる検出と組み合わせるために必要なコンポーネントを完全に統合するペーパー流動性コンポーネントを含み得る。混合されたＡＴＰＳ溶液が、ある特定のペーパー材料に加えられると、当該溶液が流れるにつれて、相分離及び分析対象物の濃縮が生じることが発見された。我々は、ＡＴＰＳにさまざまな体積比（例えば、上相の体積を下相の体積で割ったもの）を持たせたときでさえ、この現象が維持されることも実証した。
いくつかの実施形態では、ＬＦＡまたはスポットアッセイ（例えば、スポットアッセイの濃縮コンポーネント）は、ペーパーを含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、流体がそれを通過することが可能な多孔性材料のシートを含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、流体がそれらを通過することが可能な多孔性材料の複数のシートを含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン、及び同様のものなどの、１つまたは複数の材料を含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、ＨＩ－ＦＬＯＷ ＰＬＵＳ（登録商標）膜である。
いくつかの実施形態では、ペーパーは、織紙である。いくつかの実施形態では、ペーパーは、Ｗｈａｔｍａｎペーパーである。いくつかの実施形態では、Ｗｈａｔｍａｎペーパーは、Ｗｈａｔｍａｎ Ｓ１７、Ｗｈａｔｍａｎ ＭＦ１、Ｗｈａｔｍａｎ ＶＦ１、Ｗｈａｔｍａｎ Ｆｕｓｉｏｎ ５、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／ＤＶＡ、Ｗｈａｔｍａｎ ＬＦ１、Ｗｈａｔｍａｎ ＣＦ１、及び／またはＷｈａｔｍａｎ ＣＦ４を含む。
いくつかの実施形態では、標的分析対象物が、ＬＦＡを通過するか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネント（例えば、「流れながら濃縮」ベースのデバイス）を通過するにつれて、ペーパーにおいて標的分析対象物が濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物がＬＦＡを水平方向に通過するにつれて、ペーパーにおいて標的分析対象物が濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物がＬＦＡまたはフロースルーアッセイを垂直方向に通過するにつれて、ペーパーにおいて標的分析対象物が濃縮される。
いくつかの実施形態では、ペーパーは、どちらの相溶液が「先行流体」になるかということに影響を与える特性を有する。非限定的な例として、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳが使用されるとき、ガラス繊維ペーパーに当該溶液を添加すると、塩相が先行溶液となる一方で、セルロースペーパーを使用すると、ＰＥＧ相が先行溶液となる。いくつかの実施形態では、ペーパー内で相分離すると、相分離が促進される。追加の非限定的な例として、ミセルＡＴＰＳは、典型的には、流れの無いＡＴＰＳでは相分離に数時間を要するが、ペーパーストリップに加えられると、この相分離は数分で生じる。このことによって、従来はこのプロセスにおける律速段階であったＡＴＰＳが、我々の迅速ペーパー診断アッセイのための選択肢として、より実行可能なものになり、これによって診断プロセスが迅速化する。いくつかの実施形態では、「その流れながら濃縮」デバイスは、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳ（例えば、実施例に示されるもの）を含む。いくつかの実施形態では、「流れながら濃縮」デバイスは、ミセルＡＴＰＳを含む。いくつかの実施形態では、ＬＦＡデバイスまたはフロースルーアッセイデバイスは、ガラス繊維ペーパーまたはニトロセルロースペーパーを含む。
ある特定の実施形態では、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイデバイスは、デブリ（例えば、血液細胞または他の粒子）を除去するフィルター、標的分析対象物を含む試料がデバイスに加えられる場所である試料パッド、標的分析対象物が結合し、検出される場所である検出ゾーン（例えば、試験ライン及び対照ライン）、ならびにＬＦＡまたはフロースルーデバイスに加えられる過剰な試料及び／または溶液を吸収することができる吸収パッド（例えば、乾燥した受入ペーパー）を含む（例えば、図１及び図１１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、対照ライン及び／または試験ラインは、本質的にはラインではなく、領域またはスポットである。
いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、ＬＦＡストリップを含む。「ＬＦＡ」及び「ＬＦＡストリップ」という用語は、本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ＬＦＡストリップの長さは、その幅及び深さと比較して長い。いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、矩形である。いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、円形、卵形、方形、多角形、または不規則形の形状を有する。いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、複数の経路及び／または接合部を含む。いくつかの実施形態では、ＬＦＡストリップは、試料パッド、検出ゾーン、及び吸収パッドを含む。いくつかの実施形態では、検出ゾーンは、試料パッドと吸収パッドとの間に位置し、吸収パッドは、標的分析対象物を含む試料を吸って試料パッドから引き出し、検出ゾーンに向かわせる。
サンドイッチアッセイ
いくつかの実施形態では、ＬＦＡまたはフロースルー（スポット）アッセイデバイスは、サンドイッチアッセイが提供または実施されるように構成される（例えば、本明細書の図１、及び２０１５年３月６日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２９７号（当該文献は、そこに記載のＬＦＡ構成を対象として参照によって本明細書に組み込まれる）の図１の左下を参照のこと）。いくつかの実施形態では、サンドイッチアッセイは、標的分析対象物と結合する捕捉部分を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、プローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な特性（比色性、蛍光性、放射性など）を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的分析対象物と相互作用する結合部分（例えば、抗体）を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料に添加され、標的分析対象物と結合することでプローブ－分析対象物複合体を形成する。
競合アッセイ
いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、競合アッセイを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料に添加され、標的分析対象物と結合することでプローブ－分析対象物複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、試験ラインに固定化された標的分析対象物を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料における標的分析対象物によって飽和し、そのプローブは、試験ラインに固定化された標的分析対象物に結合しないことになる。いくつかの実施形態では、試験ラインに検出可能なシグナルが存在しないことによって結果が陽性であることが示される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物が試料に存在せず、試験ラインに存在する標的分析対象物にプローブが結合することによって結果が陰性であることが示される。いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、対照ラインにプローブ捕捉部分を含み、このプローブ捕捉部分は、プローブと直接的に相互作用するものであり、標的分析対象物が試料に存在するか否かを問わず、プローブは、プローブ捕捉部分に結合し、対照ラインに蓄積することができる。いくつかの実施形態では、プローブが対照ラインで捕捉固定化及び検出されることによって、試験が有効であることが示される。いくつかの実施形態では、結果が陽性であること（例えば、試料に標的分析対象物が存在すること）は、試験ライン及び対照ラインにおける検出可能なシグナルによって示される。いくつかの実施形態では、結果が陰性であることは、対照ラインにおける検出可能なシグナルによって示される。
いくつかの実施形態では、プローブ－分析対象物複合体が試料パッドに加えられ、ＬＦＡまたはフロースルーデバイスを通過し、吸収パッドに向かう。いくつかの実施形態では、プローブ－分析対象物複合体に含まれる標的分析対象物が捕捉部分に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、試験ラインまたは試験領域（例えば、フロースルーデバイスにおける試験層）に固定化され、プローブ－分析対象物複合体は、試験ラインまたは試験領域に捕捉固定化される。いくつかの実施形態では、プローブは、比色性であり、プローブ－分析対象物複合体が試験ラインまたは試験領域に蓄積するにつれて、試験ラインまたは試験領域が強い色（例えば、検出可能なシグナル）を呈することになり、これによって結果が陽性であることが示される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物が試料に存在せず、プローブ－分析対象物複合体に含まれるプローブは捕捉部分と相互作用せず、試験ラインが存在しないか、または試験領域にシグナルが存在しないことによって結果が陰性であることが示される。いくつかの実施形態では、ＬＦＡは、対照ライン（または例えば、フロースルーアッセイデバイスの対照領域）にプローブ捕捉部分を含み、このプローブ捕捉部分は、プローブ及び／または結合部分と直接的に相互作用するものであり、したがって、標的分析対象物が試料に存在するか否かを問わず、プローブ／結合部分は、プローブ捕捉部分に結合し、対照ラインまたは対照領域に蓄積する。いくつかの実施形態では、プローブ捕捉部分は、結合部分に結合する二次抗体であり、結合部分は、標的分析対象物に結合する一次抗体である。いくつかの実施形態では、プローブが対照ラインまたは対照領域で捕捉固定化及び検出されることによって、試験が有効であることが示される。いくつかの実施形態では、結果が陽性であること（例えば、試料に標的分析対象物が存在すること）は、試験ライン（または試験領域）及び対照ライン（または対照領域）における検出可能なシグナルによって示される。いくつかの実施形態では、結果が陰性であることは、対照ラインまたは対照領域における検出可能なシグナルによって示される。
ＬＦＡまたはフロースルー（スポット）アッセイデバイス中の脱水ＡＴＰＳ
いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳもしくはその構成成分及び／またはプローブ及び／または増進試薬は脱水されて、ＬＦＡを構成する多孔性マトリックスの少なくとも第１の部分に加えられ、及び／または含められるか、あるいはフロースルーアッセイデバイスの濃縮コンポーネントに含められる。いくつかの実施形態では、デバイスに試料が加えられると、ＡＴＰＳ、及び／またはプローブ及び／または増進試薬（複数可）が水和し、それによってＡＴＰＳもしくはその構成成分及び／またはプローブ及び／または増進試薬（複数可）が流体相に変換される。使用者に必要なことは、デバイスに試料（例えば、唾液、血液、尿、膣液、精液、痰、脳脊髄液、リンパ液、または同様の流体）を添加することのみになるため、脱水しておくことは、使用者にとってのデバイスの使い勝手を向上させることになり得る。いくつかの実施形態では、使用者に必要なことは、標的分析対象物の存在／非存在を検出ために、または分析対象物を定量化するために、ストリップに試料の溶液を加えることのみである。いくつかの実施形態では、試料の溶液がＬＦＡまたはフロースルーデバイスを通過し、ＡＴＰＳが再溶解することで、ＬＦＡまたはフロースルーデバイスの中で相分離が誘発され、その結果、標的分析対象物が濃縮される。
いくつかの実施形態では、所与のＡＴＰＳに必要な構成成分はすべて、混合されることで混合溶液を形成し、デバイス（例えば、ＬＦＡまたはフロースルー（スポット）アッセイ）を構成するペーパーに加えられ、その後に脱水される。試料溶液が脱水ペーパーに添加されると、試料が流れるにつれてＡＴＰＳ構成成分が再水和し、その結果、相分離が生じる。濃縮された分析対象物を含む相の粘性が低いＡＴＰＳのいくつかでは、その相は、より速く流れることになり、濃縮分析対象物は、先行流体に生じることになり、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイの検出ゾーンに到達することで検出が始まることになる。さらに、脱水されたＡＴＰＳ構成成分のセグメント長（または厚さ）及び濃度は、異なる用途ごとに調整することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳの構成成分は両方共（すべて）脱水されて、ＬＦＡに加えられるか、またはフロースルーアッセイ（例えば、分離コンポーネント）に含められる。いくつかの実施形態では、第１のＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、ＬＦＡに加えられるか（もしくは含められるか）、またはフロースルーアッセイに含められる。いくつかの実施形態では、第２のＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイに加えられるか、または含められる。いくつかの実施形態では、第１の相溶液構成成分及び／または第１のＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、ＬＦＡの第１の部分に加えられるか、またはフロースルーアッセイの第１の層（分離コンポーネント）に含められる。いくつかの実施形態では、第２の相溶液構成成分及び／または第２のＡＴＰＳ構成成分が、脱水されて、ＬＦＡの第２の部分に加えられるか上、またはフロースルーアッセイ（分離コンポーネント）の第２の層に含められる内にで脱水されて含められる脱水される。いくつかの実施形態では、第１の部分と第２の部分とは同一である。いくつかの実施形態では、第１の部分と第２の部分とは異なる。非限定的な例として、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳでは、ＰＥＧ溶液と塩溶液とを別々に脱水し、異なるペーパー部分もしくはセグメントに含めるか（例えば、２０１５年３月６日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１９２９７号（当該文献は、そこに記載のＬＦＡ構成を対象として参照によって本明細書に組み込まれる）の図１６を参照のこと）、または例えば、フロースルーアッセイの分離コンポーネントを構成する別々の層に含めることができる（例えば、図１１を参照のこと）。いくつかの実施形態では、第１の相溶液／第２の相溶液及び／またはＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、ＬＦＡの異なる部分に加えられるか、またはフロースルーアッセイの異なる層に含められると、第１の相溶液／第２の相溶液の構成成分またはＡＴＰＳ構成成分の濃度の均一性が向上する。いくつかの実施形態では、第１の相溶液／第２の相溶液の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分を、脱水して異なる部分に加えることで、第１の相溶液またはＡＴＰＳ構成成分が水和後に第１の方向に流れ、第２の相溶液及び／またはＡＴＰＳ構成成分が水和後に第２の方向に流れるようになり、第１の方向と第２の方向とは、異なるものである。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、第１の方向に濃縮されるが、第２の方向には濃縮されない。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、第２の方向に濃縮されるが、第１の方向には濃縮されない。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、第１の方向／第２の方向に試料を流す必要がなくなり、第１の方向／第２の方向に標的分析対象物が流れるようになる。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、標的分析対象物がより速く流れるようになることで、検出が早まる。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、結果の信頼性が向上する。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、第１の相溶液／第２の相溶液の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分（例えば、ＰＥＧ－塩ＡＴＰＳ）の凝集が阻止される。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分は脱水されて、複数のセグメントに含められる。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分は脱水されて、複数のセグメントに含められ、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分は、塩溶液を構成する。いくつかの実施形態では、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分は脱水されて、複数のセグメントに含められ、第１の相／第２の相の構成成分及び／またはＡＴＰＳ構成成分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を含まない。いくつかの実施形態では、脱水されたＰＥＧは、検出ゾーン付近には位置せず、この理由は、ＰＥＧ高含有相が検出膜内の流れを遅延させ得るためである。いくつかの実施形態では、ＬＦＡストリップまたはフロースルーアッセイは、ＰＥＧまたは塩を含まないブランクのスペーサーを検出ゾーン付近に含み得る。
いくつかの実施形態では、プローブ（例えば、分析対象物結合部分であり、検出試薬／材料と結合される）は、プローブ緩衝液に含めて提供される。いくつかの実施形態では、プローブ緩衝液は脱水されて、ＬＦＡに加えられるか、またはフロースルーアッセイに含められる。
いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳ構成成分が脱水されると、ＡＴＰＳ構成成分が液体形態で添加されるデバイスと比較して、検出限界が改善する。いくつかの実施形態では、液体形態のＡＴＰＳ構成成分が添加されると、対象に由来する試料溶液が希釈される。いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳ構成成分が脱水されると、流れの過程で、異なる第１の相溶液及び／または異なる第２の相溶液が生じるようになることで、試験ラインもしくは対照ラインまたはフロースルーアッセイの検出コンポーネントに到達することになる先行流体の前部に位置する小さな体積部に標的分析対象物またはプローブ－分析対象物複合体が濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物及びまたはプローブ－分析対象物複合体が先行流体の前部に濃縮されると、検出に必要な時間が短縮されることになる。
プローブ
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の系及び／またはデバイス、及び／または本明細書に記載の方法では、プローブが利用され、プローブは、標的分析対象物に結合することでプローブ－分析対象物複合体を形成する結合部分を含む。
いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に優先的に分配される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に極度に分配される。
いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に優先的に分配されない。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に極度に分配されない。
いくつかの実施形態では、プローブ－分析対象物複合体は、第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に優先的に分配され、それによって（プローブ－分析対象物複合体に含まれる）標的分析対象物が、第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に優先的に分配されるようになる。
いくつかの実施形態では、プローブ－分析対象物複合体は、第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に極度に分配され、それによって（プローブ－分析対象物複合体に含まれる）標的分析対象物が、第１の相溶液もしくは第２の相溶液、または第１の相溶液と第２の相溶液との界面に極度に分配されるようになる。
いくつかの実施形態では、「優先的に分配される」という語句は、ＡＴＰＳの第１の相溶液／第２の相溶液への標的分析対象物（またはプローブ－分析対象物複合体）の分配に関して使用されるとき、ＡＴＰＳの別の相溶液と比較して、優先する相溶液により多くの量の標的分析対象物が含まれるようになることを示す。
いくつかの実施形態では、「極度に分配される」という語句は、ＡＴＰＳの第１の相溶液／第２の相溶液への標的分析対象物（またはプローブ－分析対象物複合体）の分配に関して使用されるとき、ＡＴＰＳの別の相溶液と比較して、優先する相溶液に約９０％以上の標的分析対象物が含まれるようになることを示す。
いくつかの実施形態では、より多くの量の標的分析対象物が第１の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約５０％超、または約５５％超、または約６０％超、または約６５％超、または約７０％超、または約７５％超、または約８０％超、または約８５％超、または約９０％超、または約９５％超、または約９８％超、または約９９％超の標的分析対象物が第１の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約９９％超、または約９９．１％超、または約９９．２％超、または約９９．３％超、または約９９．４％超、または約９９．５％超、または約９９．６％超、または約９９．７％超、または約９９．８％超、または約９９．９％超の標的分析対象物が第１の相溶液に分配される。
いくつかの実施形態では、より多くの量の分析対象物が第２の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約５０％超、または約５５％超、または約６０％超、または約６５％超、または約７０％超、または約７５％超、または約８０％超、または約８５％超、または約９０％超、または約９５％超、または約９８％超、または約９９％超の標的分析対象物が第２の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約９９％超、または約９９．１％超、または約９９．２％超、または約９９．３％超、または約９９．４％超、または約９９．５％超、または約９９．６％超、または約９９．７％超、または約９９．８％超、または約９９．９％超の標的分析対象物が第２の相溶液に分配される。
いくつかの実施形態では、より多くの量の分析対象物が、第１の相溶液と第２の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態では、約５０％超、または約５５％超、または約６０％超、または約６５％超、または約７０％超、または約７５％超、または約８０％超、または約８５％超、または約９０％超、または約９５％超、または約９８％超、または約９９％超の標的分析対象物が界面に分配される。いくつかの実施形態では、約９９％超、または約９９．１％超、または約９９．２％超、または約９９．３％超、または約９９．４％超、または約９９．５％超、または約９９．６％超、または約９９．７％超、または約９９．８％超、または約９９．９％超の標的分析対象物が界面に分配される。
いくつかの実施形態では、デバイスは、１つのプローブ（単一の分析対象物を対象とするプローブ）を含むか、もしくは利用するように構成され、及び／またはデバイスで実施されるアッセイでは、１つのプローブ（単一の分析対象物を対象とするプローブ）が利用される。いくつかの実施形態では、デバイスは、少なくとも２つの異なるプローブ（異なる分析対象物をそれぞれが対象とする）、もしくは少なくとも３つの異なるプローブ、もしくは少なくとも４つの異なるプローブ、もしくは少なくとも５つの異なるプローブ、もしくは少なくとも７つの異なるプローブ、もしくは少なくとも１０の異なるプローブ、もしくは少なくとも１５の異なるプローブ、もしくは少なくとも２０の異なるプローブを含むか、もしくは利用するように構成され、及び／またはデバイスで実施されるアッセイでは、少なくとも２つの異なるプローブ（異なる分析対象物をそれぞれが対象とする）、もしくは少なくとも３つの異なるプローブ、もしくは少なくとも４つの異なるプローブ、もしくは少なくとも５つの異なるプローブ、もしくは少なくとも７つの異なるプローブ、もしくは少なくとも１０の異なるプローブ、もしくは少なくとも１５の異なるプローブ、もしくは少なくとも２０の異なるプローブが利用される。
いくつかの実施形態では、プローブは、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、プラスチック、及び／またはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン（ＤＥＬＲＩＮ（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））、デキストラン、及びポリ塩化ビニルを含むポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレンは、ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリプロピレンは、ポリプロピレングリコールである。いくつかの実施形態では、プローブは、コラーゲン、セルロース、及び／またはキチンのうちの１つまたは複数を含む生体ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、金属（例えば、金、銀、白金、パラジウム、セリウム、チタン、ステンレススチール、アルミニウム、またはそれらの合金のうちの１つまたは複数を含むもの）を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子など）を含む。
いくつかの実施形態では、プローブは、コーティングをさらに含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、ポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、ポリプロピレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、デキストランを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、親水性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、第１の相溶液または第２の相溶液に対する親和性を有する。
いくつかの実施形態では、試料に含まれる標的分析対象物の量は非常に少なく、その結果、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイによる検出が可能なように分析対象物を十分に濃縮する必要がある。ある特定の実施形態では、十分な濃縮は、界面で達成されるものであり、この理由は、分析対象物の濃縮度は、その分析対象物が分配または濃縮される相の体積に依存し、界面の「体積」は、バルク相と比較して非常に小さいためである。
いくつかの実施形態では、プローブは、標的分析対象物が界面に向かって誘導されるように、界面に優先的に（または極度に）分配される。いくつかの実施形態では、プローブは、その界面化学に起因して界面に優先的に（または極度に）分配され、界面化学は、プローブが界面に誘導されるように最適化される。非限定的な例として、ポリエチレングリコール－リン酸カリウム（ＰＥＧ／塩）系などのポリマー－塩ＡＴＰＳ系の界面にプローブ－分析対象物複合体を誘導するために、プローブは、ＰＥＧに複合化（すなわちＰＥＧ化される）されることでＰＥＧ高含有相とのＰＥＧ間相互作用を促進し、及び／または親水性タンパク質で修飾されることでＰＥＧ低含有相との親水性相互作用を促進する。特異的な抗体、または標的に結合する他の分子で修飾されたそのような最適化プローブを使用すると、標的分析対象物が捕捉され、界面に収集される。界面の体積は非常に小さいため、分析対象物は高度に濃縮され、その後のＬＦＡ、またはフロースルーアッセイの検出領域に加えられる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳの界面に分配されることができる金ナノプローブ（ＧＮＰ）が調製され、操作条件は、相分離時間が短縮され、ＧＮＰ／分析対象物が非常に高度に回収されるように最適化される。
いくつかの実施形態では、プローブ－分析対象物複合体は、ＡＴＰＳにおける固体と液体との界面に分配される。いくつかの実施形態では、固体は、ＡＴＰＳを含むチャンバーの壁である。いくつかの実施形態では、固体は、アッセイデバイスのコレクターである。いくつかの実施形態では、固体は、固体ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、固体ポリマーは、ポリエチレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン（ＤＥＬＲＩＮ（登録商標））、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））、ポリ塩化ビニル、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、固体ポリマーは、ポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態では、プローブ－分析対象物複合体は、固体に付着し、高度に濃縮されるものであり、この理由は、プローブ－分析対象物複合体が固体と液体との界面に位置する小さな体積部に存在し、バルク相の体積によって希釈されないためである。いくつかの実施形態では、バルク相は、濃縮された分析対象物を乱すことなく除去され、これは、洗浄によって収集された後、ＬＦＡまたはフロースルーアッセイデバイスに加えられる。いくつかの実施形態では、この手法によって分析対象物が十分に濃縮され、外力（例えば、磁石）を使用することなく収集することが可能になる。あるいは、プローブは、磁性材料を含み、この手法では、磁石が併用される。いくつかの実施形態では、こうしたプローブは、分析対象物を極度に濃縮するために、界面に濃縮されるように改変される。上述のように、この手法では、磁石が使用されることで、ＡＴＰＳによって非特異的に濃縮される他の混入物から標的分析対象物をさらに分離することが可能になる。いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳによる濃縮によって、磁性プローブがより効率的に働くことを可能になり、この理由は、磁性プローブが特定の位置（界面）に位置する非常に小さな体積部に最初に濃縮されることになるためである。したがって、濃縮された分析対象物の収集に必要な磁石は小型化し、またはそれに必要な磁場は弱まることになる。いくつかの実施形態では、ＡＴＰＳによる界面濃縮を磁性プローブと組み合わせると、現在の最新式のものと比較して、より効率的、迅速、かつ安価なデバイスを開発することが可能になる。
結合部分
いくつかの実施形態では、結合部分は、標的分析対象物（例えば、細菌、真菌、ウイルス、レクチン、糖、タンパク質、ＤＮＡなど）と結合する分子である。いくつかの実施形態では、結合部分は、標的分析対象物と特異的に結合する分子である。いくつかの実施形態では、「特異的に結合する」は、分子が、標的分析対象物に優先的に結合するか、または他の分子と比較して高い親和性で標的分析対象物に結合することを示す。非限定的な例として、抗体は、抗原を標的として産生し、その抗原に選択的に結合することになる。また、非限定的な例として、ＤＮＡ分子は、実質的に相補的な配列に結合することになり、厳密条件下では、無関係の配列には結合しない。いくつかの実施形態では、「特異的な結合」は、分子（例えば、タンパク質及び他の生物製剤）の異種性集団に標的分析対象物が存在することを決定付ける結合反応を指し得る。いくつかの実施形態では、結合部分は、その特定の標的分析対象物に結合し、試料に存在する他の分子に顕著な量で結合しない。
いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体、レクチン、タンパク質、糖タンパク質、核酸、単量体の核酸、多量体の核酸、アプタマー、アプタザイム、小分子、ポリマー、レクチン、糖質、多糖、糖、脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、標的分析対象物との結合対を形成することができる分子である。
いくつかの実施形態では、結合部分は、抗体または抗体断片である。抗体断片には、限定はされないが、前述のＦａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆａｂ‘－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｖ’、Ｆｄ、Ｆｄ’、ｓｃＦｖ、ｈｓＦｖ断片、ラクダ抗体、二重特異性抗体、及び他の断片が含まれる。
ある特定の実施形態では、結合部分は、アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、核酸から形成される抗体類似体を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、いくつかのアッセイ（ナノ－ＣＨＥＭ－ＦＥＴなど）では、検出するべき標識の結合が必要なく、立体配置の再配置が直接的に検出されることになる。いくつかの実施形態では、結合部分は、アプタザイムを含む。いくつかの実施形態では、アプタザイムは、核酸から形成される酵素類似体を含む。いくつかの実施形態では、アプタザイムは、第２の特定の分析対象物が存在するときにのみ、立体配置を変えて特定の分子を捕捉するように機能する。
いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な任意の組成を有する。有用な標識の例には、限定はされないが、蛍光ナノ粒子（例えば、量子ドット（Ｑｄｏｔ））、金属ナノ粒子（限定はされないが、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子を含む）、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、及び同様のもの（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡを参照のこと））、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４ｌＣｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、及び同様のもの）、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びＥＬＩＳＡで一般に使用される他のもの）、さまざまな比色標識、磁性または常磁性の標識（例えば、磁性及び／または常磁性ナノ粒子）、スピン標識、放射線不透過性標識、ならびに同様のものが含まれる。
あるいは、またはさらに、プローブは、検出可能な標識を含む別の粒子に結合することができる。いくつかの実施形態では、プローブは、検出ゾーン（例えば、試験ライン、対照ライン、試験領域、対照領域）で検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、検出可能な標識／特性は、比色標識／特性、蛍光標識／特性、酵素標識／特性、発色標識／特性、及び／または放射標識／特性のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、金ナノ粒子であり、検出可能な特性は、色である。いくつかの実施形態では、色は、オレンジ色、赤色、または紫色である。
等温増幅．
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び／またはデバイスは、熱サイクリングを伴わずに標的核酸を増幅する（例えば、等温増幅）。等温核酸増幅方法は、二本鎖ＤＮＡに適用され得る。しかしながら、標的核酸分子を二本鎖ＤＮＡ標的に限定する必要はない。例えば、本明細書に記載の等温増幅方法において使用するための二本鎖ＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ、またはｍＲＮＡ、または他の一本鎖ＲＮＡ標的源から逆転写酵素によって調製され得る。別の例では、本明細書に記載の非サイクリング増幅方法において使用するための二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ標的からＤＮＡポリメラーゼによって調製され得る。さまざまな実施形態において、そのような方法は、以下に議論される等温増幅方法を適用する前に、最初の段階として適用され得る。
等温増幅方法は、当業者によく知られている。そのような方法には、限定はされないが、自己持続性シーケンス反応（３ＳＲ）、核酸ベースの転写アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ステムループ増幅、シグナル介在ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ならびに環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）（例えば、Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：ｅ６３、米国特許第６，７４３，６０５号、Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｇｈａｅｍｉ（２００８）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２７：２２４－２４３、及び同様のものを参照のこと）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（例えば、Ｒｏｈｒｍａｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ－Ｋｏｒｔｕｍ（２０１２）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，１２：３０８２－３０８８、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２（１）：ｅ０１６６９０３、及び同様のものを参照のこと）が含まれる。
等温核酸増幅ための構成成分（例えば、酵素）及びキットは、商業的に利用可能である。キットの例には、限定はされないが、ＩＳＯＡＭＰ（登録商標）ＩＩＩ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｔＨＤＡキット（ＢＩＯＨＥＬＩＸ（登録商標）から提供される）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、及びＴＷＩＳＴＡＭＰ（登録商標）リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（ＴｗｉｓｔＤｘから提供される）が含まれる。
試料採取
さまざまな実施形態において、本明細書に記載のデバイス及び方法を使用してアッセイされる試料は、生体試料、環境試料、食品試料などを含む。生体試料の例には、限定はされないが、生体液（血液または血液分画物、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、口腔液、膣液、及び同様のものなど）、組織試料、プラーク試料、子宮頸管内スワブ試料、細胞試料、組織または臓器の生検物または吸引物、組織学的検体、ならびに同様のものが含まれる。
生体試料が組織を含む場合、ある特定の実施形態では、その組織は、溶解、ホモジナイズ、及び／または破砕され、任意選択で試料溶液に懸濁され得る。生体試料が生体液を含む場合、当該液は、直接的にアッセイされるか、またはアッセイの前に試料溶液に懸濁され得る。ある特定の実施形態では、試料溶液は、生体試料もしくはその構成成分を保存もしくは安定化するために働き得、及び／または生体試料もしくはその構成成分を抽出もしくは濃縮するために働き得る。ある特定の実施形態では、試料溶液は、保存剤を任意選択で含む緩衝剤、及び／または酵素（プロテアーゼ、ヌクレアーゼなど）、及び／または界面活性剤、及び／またはＡＴＰＳ構成成分を含み得る。
ある特定の実施形態では、特定のポイント・オブ・ケアの実施形態では、試料は、直ちに、または適度な時間間隔を置いた後、アッセイデバイスに加えられ得る。ある特定の実施形態では、試料は、アッセイが実施される離れた試験施設に届けられ得る。
生体試料を採取するための方法及びデバイスは、当業者によく知られており、例えば、以下に示されるものである。
口腔液の採取
口腔液は、空のバイアルによだれを垂らすことによって採取した後、アッセイの濃縮コンポーネントに当該液を移すことができる。
口腔液は、スワブ及び／または採取パッドを使用しても採取することができる。例えば、スワブまたは採取パッドを使用者の口に置くことで口腔液を吸い上げることができる。スワブまたは採取パッドは、口腔液の産生を刺激するための化合物（ペパーミント抽出物または酸味抽出物など）を含み得る。スワブまたは採取パッドは、下流の濃縮段階及び検出段階に影響し得る食品デブリ、混入物、または粘液を除去するためのフィルターとしても働くことができる。ある特定の実施形態では、スワブまたは採取パッドにおける口腔液は、濃縮のための水性二相コンポーネント（ＡＴＰＳ）構成成分で抽出及び混合することができる。採取デバイスからの口腔液の抽出は、例えば、スワブ／パッドに物理的圧力をかけて当該液を押し出すか、または毛細管作用で当該液を濃縮コンポーネントに導入することによって達成できる。別の構成は、スワブまたは採取パッドの下流にＡＴＰＳ構成成分が脱水されて存在するものであり、その結果、使用者による追加行為は必要なくなる。
プラークの採取
プラークは、歯の表面、歯茎、または歯間に対してブラシ、スワブ、またはピックを適用することによって採取できる。ある特定の実施形態では、その後、採取したプラークは、緩衝液またはその後の濃縮のためにＡＴＰＳ溶液に混合して含めることができる。
尿の採取
さまざまな実施形態において、尿は、採取カップを用いて取得することができる。その後、採取した尿は、その後の濃縮のためのＡＴＰＳ溶液に混合して含めるか、またはＡＴＰＳ構成成分が脱水されて濃縮コンポーネントに含められているのであれば、デバイスに直接的に加えることができる。カテーテルが挿入された対象では、カテーテルまたはカテーテル受入バッグから尿を取得することができる。
膣／子宮頸管内スワブ
膣表面もしくは子宮頸部表面上及び／または膣液内の標的分析対象物は、商業的に利用可能なスワブによって採取することができる。採取したスワブは、標的を遊離させるために緩衝液に含めるか、または標的生体分子を直接的に濃縮するためにＡＴＰＳ溶液に含めることができる。
血液の採取
血液は、ピン（ランセット）穿刺、及び毛細管に採取するもの、シリンジによるもの、ならびに同様のものによって採取することができる。
分析対象物の例．
本明細書に記載のアッセイデバイス及び方法を使用すると、基本的にどのような分析対象物でも検出及び／または定量化することができるが、ある特定の実施形態では、分析対象物は、臨床的に意義を有する分析対象物（例えば、細菌、真菌、原生動物、アメーバ、ウイルス、及び同様のもの）である。
臨床的に意義を有する標的は、当業者によく知られている。
膣液における臨床的に重要な細菌
膣液または組織試料、パップスメアにおいてＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、細菌性膣疾患、及びアクチノマイセス感染症が発見されることは、他の診断試験を実施せずとも、治療を要するという指標であると考えられ得る。選択患者では無症候性感染症を治療することで合併症を予防することができる。カンジダは、膣における共生細菌であり得、それ故に、無症候性患者の治療は必要ないこともあり得る。ＩＵＤ使用者においてｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ及びカンジダによる感染症が検出される割合がより高いことは、ＩＵＤが膣感染症及び関連合併症のリスクを増加させ得ることを示している。
淋病は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅという生物によって引き起こされる細菌性感染症であり、これは、臨床的に重要な病原体である。同様に、クラミジアは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓによって引き起こされ、梅毒は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍによって引き起こされるものであり、これらは重要な性感染疾患であり、その診断は迅速であることが望ましい。
尿における臨床的に重要な細菌
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＰｒｏｔｅｕｓ属の１種は細菌病原体であり、この病原体が尿に見られると、典型的には、尿路感染症であることを意味する。
口腔における臨床的に重要な細菌
グラム陰性口腔内嫌気性生物は、歯周病と関連する頻度が高く、種によっては、他と比較して高い頻度で関連する。そのような嫌気性生物には、限定はされないが、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属の種（例えば、Ｐｒ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｐｒ．Ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｒ．Ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ、Ｐｒ．Ｖｅｒｏｒａｌｉｓ、及び同様のもの）、ならびにＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属の種（例えば、Ｐｏｒｐｈ．Ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が含まれる。
さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓは、う蝕の形成に関係するとされている。本開示の追加の臨床的に重要な細菌には、限定はされないが、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、またはＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｏｒｔｓｙｔｈｕｓが含まれる。
こうした病原体は、例示的かつ非限定的であることを認識されよう。本明細書に記載のアッセイデバイス及び方法は、多数の他の分析対象物（限定はされないが、食品の毒素及び／または病原体、環境の毒素及び／または病原体、ならびに同様のものを含む）の検出及び／または定量化に使用できることを当業者であれば認識されよう。したがって、例えば、本明細書に記載の方法及びデバイスは、野菜もしくは他の食品へのＥ．ｃｏｌｉの混入の検出、及び／または任意の他の食品病原体（限定はされないが、表２に示されるものを含む）の検出に使用することができる。
Figure 0007320951000005
下記の実施例は、例示のために提供されており、請求される発明を限定するものではない。
実施例１
ＤＮＡ増幅の結果
材料及び方法
ｔＨＤＡのみの反応及びワンポットプラットフォームの調製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７を検出するために、ｔＨＤＡのみの反応とワンポット系との両方を設計した。製造者のプロトコールに従い、緩衝剤、塩、ヌクレオチド塩基、遺伝子特異的プライマー、及びヘリカーゼとポリメラーゼとの酵素混合物を含むｔＨＤＡのみの従来反応を５０μＬの反応液として調製した。全Ｅ．ｃｏｌｉ細胞もこの反応液に直接的に添加した。この懸濁液を６５℃で１時間加熱した後、試料を抽出し、ゲル電気泳動を介して解析した。ワンポットプラットフォームについては、単一のチューブにおいてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤をｔＨＤＡ反応の構成成分と混合した。全Ｅ．ｃｏｌｉ細胞も添加し、この懸濁液を混合することで混合ミセル水性二相系（ＡＴＰＳ）を形成させた。この懸濁液を６５℃で１時間加熱し、これによって相分離とＤＮＡ増幅との両方を生じさせた。その後、ミセル低含有相である上相を抽出し、ゲル電気泳動を介して解析することで増幅が良好に生じたことを確認した。
ワンポット系におけるＤＮＡの分配係数の決定
ＡＴＰＳの両方の相におけるＤＮＡの濃度を比較するために、定量的ＤＮＡ分配試験を実施した。この試験については、ワンポット系に関係するＤＮＡを模倣するモデルとして、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に由来するゲノムＤＮＡ、１００ｂｐのＤＮＡ断片、及び２５ｂｐのＤＮＡ断片を選択した。混合ミセルＡＴＰＳは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００界面活性剤、ｔＨＤＡ反応に関係する塩、及び二本鎖ＤＮＡを混合することによって調製した。混合ＡＴＰＳは、３つのＤＮＡ型のそれぞれについて個別に調整した。これらの懸濁液を６５℃で１時間加熱することで相分離を誘導した。相が分離したところで、ミセル含量の低い上相とミセル含量の高い下相との両方を抽出し、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ｄｓＤＮＡ蛍光結合色素を添加した。その後、プレートリーダーで蛍光強度を測定した。濃度が既知のＤＮＡで作成した標準曲線を使用し、上相及び下相のＤＮＡ濃度を推定した。
結果及び考察
ワンポットプラットフォームにおけるＤＮＡの分配
ＤＮＡ分配試験を実施することで、我々は、ワンポット系におけるそれぞれのＤＮＡ型の分配係数を決定した。分配係数は、上相のＤＮＡ濃度を下相のＤＮＡ濃度で割ることによって計算した。試験した３つのＤＮＡ型の中で、より大きなゲノムＤＮＡ及び１００ｂｐのＤＮＡ断片が同様の分配係数を有しており、これらの分配係数が１を超えることが明らかとなった（図１１）。このことは、ミセル低含有相である上相にＤＮＡが優先的に分配され、それによってその相にＤＮＡが濃縮されたことを示すものであった。一方、より小さな２５ｂｐのＤＮＡ断片は、より小さな分配係数を有しており、その値は１に近く、このことは、２つの相に２５ｂｐのＤＮＡ断片がより均等に分配されたことを示している。
ワンポットプラットフォームにおけるＥ．ｃｏｌｉの増幅及び検出の改善
ｔＨＤＡ反応は、ミセルＡＴＰＳに適合することが明らかとなり、その結果、ワンポットプラットフォームの実証に成功した。ゲル電気泳動の実施に基づいて増幅が良好であることが決定され、このことは、増幅ＤＮＡ領域の予測サイズに相当する１００ｂｐのバンドが存在することによって示された。ワンポット系を使用すると増幅及び検出が改善することを実証するために、ｔＨＤＡのみの従来反応での増幅を、ワンポットプラットフォームにおいて実施した増幅と比較した。図１２に可視化されるように、ｔＨＤＡのみの従来反応では、１０６ｃｆｕ／ｍＬを含む細胞試料からはＤＮＡが良好に増幅されたが、細胞濃度が低くなると増幅は達成されなかった。代わりに、ワンポットプラットフォームでは、１０５ｃｆｕ／ｍＬを含む細胞試料からＤＮＡが良好に増幅され、これによって、検出限界が１０倍改善することが実証された。
実施例２
酵素的なシグナル増強の結果
材料及び方法
アッセイ構成成分の調製
水性二相系（ＡＴＰＳ）を、０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９）においてポリ（エチレングリコール－ｒａｎ－プロピレングリコール）及び硫酸ナトリウム塩から調製した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）と、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）に特異的な抗体と、を金ナノ粒子に複合化することで、アルカリホスファターゼ－金ナノプローブ（ＡＬＰ－ＧＮＰ）を創出した。ニトロセルロース膜に対して、試験ラインとして抗ＣＴ抗体をプリントし、対照ラインとしてプロテインＡをプリントすることによって、サンドイッチアッセイ形式のＬＦＡ試験ストリップを構築した。３ｘ１０ｍｍのガラス繊維パッドにＡＬＰ－ＧＮＰを脱水吸着させることで複合パッドを創出し、これを膜の直ぐ上流に配置した。ニトロセルロース膜の下流に綿繊維吸収パッドを配置した。従来のＬＦＡでは、３ｘ１０ｍｍのガラス繊維の単一試料パッドを複合パッドの上流に配置した。増強ＬＦＡでは、ガラス繊維パッドの４つの（７ｘ１５ｍｍ）層からなる３－Ｄペーパー芯を複合パッドの上流に配置した。
ＡＴＰＳ自動化シグナル増強の実証
シグナル増強アッセイを実施するために、ＣＴ（全体濃度が３．２ｎｇ／μＬとなるようにした）、及びＡＬＰ基質であるニトロブルーテトラゾリウム／５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を添加したＡＴＰＳに、３－Ｄペーパー芯を備えたＬＦＡ試験ストリップを浸漬した。１０分、３０分、及び５０分の時点で写真を撮った。
ＡＴＰＳ及びシグナル増強を使用した、ＣＴの検出改善
従来のＬＦＡを実施するために、さまざまな濃度の不活化ＣＴを含むＰＢＳ溶液に試験ストリップを浸漬した。シグナル増強アッセイを実施するために、さまざまな濃度の不活化ＣＴ、及びＡＬＰ基質であるニトロブルーテトラゾリウム／５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）を添加したＡＴＰＳに、３－Ｄペーパー芯を備えたＬＦＡ試験ストリップを浸漬した。３０分の時点で写真を撮った。
結果及び考察
自動化シグナル増強の実証
３－Ｄペーパー芯を備えたＬＦＡ試験ストリップを、ＣＴ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質を含むＡＴＰＳに浸漬すると、ＡＴＰＳは、それが試験ストリップを通過するにつれて分離し、その２つの巨視的な相となった。最初に、濃縮されたＣＴ細菌を含む塩高含有相が先行し、ＡＬＰ－ＧＮＰを可溶化すると共に、試験ライン及び対照ラインにＡＬＰ－ＧＮＰが結合し得る場所であるＬＦＡ試験ゾーンにＡＬＰ－ＧＮＰを送達し、このことは、１０分後に２つのラインが出現することによって可視化された。その後、ポリマー高含有相が遅行し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質を送達することでシグナル増強反応が始まり、その結果、３０分及び５０分の時点で、試験ラインと対照ラインとの両方が黒くなった（図１４）。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質は、ポリマー高含有相に好都合に分配されたため、シグナル増強の早発が回避された。
自動化シグナル増強を使用した、ＬＦＡによるＣＴ検出の改善
バックグラウンドの増進を最小化しながらＬＦＡでのシグナル増強反応を自動化するというＡＴＰＳの能力を実証した後、我々は、このアッセイの検出限界が従来のＬＦＡを上回って改善したかどうかを決定したいと考えた。最初に、我々は、バイオマーカーの予備濃縮段階及びシグナル増強段階を行うことなく、ＰＢＳにおいて希釈した不活化ＣＴを試験することによって従来のＬＦＡの検出限界を同定した。サンドイッチアッセイ形式では２つのラインが存在することによって試験が陽性であることが示されるため、我々の従来のＬＦＡでは１０ｎｇ／μＬのＣＴを良好に検出することが可能であった。従来のＬＦＡの検出限界を改善するために、次に我々は、バイオマーカーの予備濃縮段階及びシグナル増強段階をＡＴＰＳによって自動化してＬＦＡと組み合わせた。ＣＴのさまざまな希釈物で試験をすると、増強ＬＦＡでは、０．３２ｎｇ／μＬのＣＴを検出することが可能であり、これによって、従来のＬＦＡを上回って３０倍の改善が生じたことが実証された（図１５）。こうして検出限界が３０倍改善したことは、バイオマーカーの予備濃縮とシグナル増強との両方に起因して複合的な改善が生じた結果である。バイオマーカーの予備濃縮とシグナル増強の構成成分との両方をさらに最適化することで、３０倍を超える改善が可能である。
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示のみを目的としており、それらの観点から当業者であればさまざまな改変または変更を思いつくであろうし、こうした改変または変更は、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることになると理解される。本明細書に引用される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、すべての目的のために参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (20)

  1. 試料における分析対象物を検出及び／または定量化するためのデバイスであって、
    前記デバイスが、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）デバイスであり、
    前記デバイスは、第１の相溶液と第２の相溶液とに分離する混合相溶液を含む水性二相溶液（ＡＴＰＳ）であって、使用時に、前記第１の相溶液が先行相となり、前記第２の相溶液が遅行相となる、前記ＡＴＰＳと、
    検出試薬としてのプローブ及びシグナル増強試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記先行相における前記第１の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳの前記遅行相における前記第２の相溶液に分配される、前記プローブ及びシグナル増強試薬と、
    を含む、あるいは、
    前記デバイスが、
    フロースルーアッセイのための濃縮コンポーネントであって、使用時に、前記第１の相溶液が先行相となり、前記第２の相溶液が遅行相となる混合相溶液を含む水性二相溶液（ＡＴＰＳ）を含む前記濃縮コンポーネントであり、
    前記濃縮コンポーネントの下に検出コンポーネントが配置され、
    前記濃縮コンポーネントが、検出試薬としてのプローブ及びシグナル増強試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記先行相における前記第１の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳの前記遅行相における前記第２の相溶液に分配される、前記プローブ及びシグナル増強試薬を含む、
    前記デバイス。
  2. 前記ＬＦＡが、前記ＡＴＰＳもしくはその構成成分、及び前記プローブ、及び前記シグナル増強試薬を、受け入れ、及び／または含むように構成された多孔性マトリックスを含む、並びに／または
    前記濃縮コンポーネントが、１つもしくは複数のペーパー層を含む、
    請求項１に記載のデバイス。
  3. 前記ＬＦＡが、複合パッド、前記分析対象物と結合する抗体を含む試験ライン、任意選択で、二次抗体を含む対照ライン、任意選択で吸収パッド、及び任意選択で試料パッドを含むか、あるいは、
    前記検出コンポーネントが、複合パッド、反応パッド、及び任意選択でシンクを含む、
    請求項１～２のいずれか１項に記載のデバイス。
  4. 前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記ＡＴＰＳが、前記ラテラルフローアッセイ上で、またはフロースルーアッセイの前記濃縮コンポーネント中で脱水される、あるいは
    前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記プローブが、前記ラテラルフローアッセイ上で、またはフロースルーアッセイの前記濃縮コンポーネント中で脱水される、あるいは
    前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記シグナル増強試薬が、前記ラテラルフローアッセイ上で、またはフロースルーアッセイの前記濃縮コンポーネント中で脱水される、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のデバイス。
  5. 前記ＡＴＰＳが、前記デバイスが前記試料と接触した後に、第１の相溶液と第２の相溶液とに分離する、及び／または
    前記プローブが、前記ＡＴＰＳの親水相に極度に分配されるように選択される、もしくは、前記プローブが、前記ＡＴＰＳの疎水相に極度に分配されるように選択される、及び／または
    前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳの疎水相に極度に分配されるように選択される、もしくは、前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳの親水相に極度に分配されるように選択される、
    請求項４に記載のデバイス。
  6. 前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳ、ポリマー／ポリマーＡＴＰＳ、ミセル／ポリマーＡＴＰＳ、及びミセルＡＴＰＳからなる群から選択される、あるいは
    前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含む、あるいは
    前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、あるいは
    前記ＡＴＰＳの第１の相溶液が、表１に記載の構成成分１を含み、前記ＡＴＰＳの第２の相溶液が、表１に記載の構成成分２を含む、あるいは
    前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳである、あるいは
    前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／塩ＡＴＰＳである、
    請求項１～５のいずれか１項に記載のデバイス。
  7. 前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳであり、前記プローブが、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳの塩高含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳのポリマー高含有相に分配される、あるいは
    前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳであり、前記プローブが、前記ＡＴＰＳのミセル低含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳのミセル高含有相に分配される、
    請求項６に記載のデバイス。
  8. 前記プローブが、前記分析対象物に結合する結合部分を含む、あるいは
    前記プローブが、前記分析対象物に結合する結合部分を含み、前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、あるいは
    前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、あるいは
    前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、あるいは
    前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、あるいは
    前記プローブが、ナノ粒子を含む、
    請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス。
  9. 前記プローブが、前記シグナル増強試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、または
    前記プローブが、前記シグナル増強試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含み、前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、もしくは、前記物質が、酵素と反応して強力な可視シグナルを形成する基質を含む、または
    前記プローブが、前記シグナル増強試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含み、前記シグナル増強試薬が、酵素基質を含む、または
    前記シグナル増強試薬が、酵素と結合する抗体を含む、並びに／または
    前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記第１の相溶液もしくは前記第２の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、並びに／または
    前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記第１の相溶液もしくは前記第２の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含み、前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、
    請求項１～８のいずれか一項に記載のデバイス。
  10. 前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖もしくはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、並びに／または
    前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、並びに／または
    前記分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、並びに／または
    前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、並びに／または
    前記分析対象物が、病状に対するバイオマーカー、食品安全（もしくは危険）に対するバイオマーカー、またはバイオテロ物質に対するバイオマーカーを含む、
    請求項８または９に記載のデバイス。
  11. 第１の相溶液と第２の相溶液とに分離する混合相溶液であって、ＬＦＡまたは多孔性膜層における使用時に、前記第１の相溶液が先行相になり、前記第２の相溶液が遅行相になる、前記混合相溶液と、
    プローブ及びシグナル増強試薬であって、前記プローブが、前記第１の相溶液に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記第２の相溶液に分配される、前記プローブ及びシグナル増強試薬と、
    を含む、水性二相溶液（ＡＴＰＳ）。
  12. 前記ＡＴＰＳが、ポリマー／塩ＡＴＰＳであり、前記プローブが、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳの塩高含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ポリマー／塩ＡＴＰＳのポリマー高含有相に分配される、または
    前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳであり、前記プローブが、前記ＡＴＰＳのミセル低含有相に分配され、前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳのミセル高含有相に分配される、
    請求項１１に記載の水性二相溶液。
  13. 分析対象物の検出方法及び／または定量化方法であって、
    前記方法が、
    水性二相溶液（ＡＴＰＳ）へ試料を適用する加える工程であって、前記適用によって、前記分析対象物が、前記試料に存在するのであれば、前記ＡＴＰＳの１つの相に濃縮されて分析対象物含有相が得られる、工程と、
    ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）またはフロースルーアッセイへ前記分析対象物含有相を適用する工程であって、前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイにおいて検出プローブが前記分析対象物に結合する、工程と、
    前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイへシグナル増強試薬を適用する工程であって、前記適用によって、前記検出プローブが生成するシグナルが増強される、工程と、
    前記試料における前記分析対象物の存在及び／または量を示すための、前記シグナルの検出及び／または定量化工程と、
    を含み、
    前記ＡＴＰＳが、第１の相溶液と第２の相溶液を含み、前記ＬＦＡまたはフロースルーアッセイにおいて、前記第１の相溶液が先行相となり、前記第２の相溶液が遅行相となり、
    前記ＡＴＰＳが、プローブ及びシグナル増強試薬であって、前記プローブが、前記ＡＴＰＳの前記先行相における前記第１の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記ＡＴＰＳの前記遅行相における前記第２の相溶液に分配される、プローブ及びシグナル増強試薬を含む、前記方法。
  14. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のデバイスを使用して実施される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、あるいは
    前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、あるいは
    前記分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、あるいは
    前記分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、
    請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記試料が、核酸を含み、
    前記水性二相溶液が、第１の相溶液及び第２の相溶液に分離する混合相溶液を含み、前記ＡＴＰＳが、核酸が前記第１の相溶液もしくは前記第２の相溶液のいずれかに分配されることになるものであるか、または前記ＡＴＰＳが、核酸が前記第１の相溶液と前記第２の相溶液との間の界面に局在化することになるものであり、それにより、前記核酸が、前記第１の相溶液もしくは前記第２の相溶液、または前記第１の相溶液と前記第２の相溶液との間の前記界面に分配されることで濃縮核酸が得られ、且つ
    前記方法が、前記第１の相溶液もしくは前記第２の溶液、または前記第１の相溶液と前記第２の相溶液との前記界面から前記濃縮核酸を回収し、回収濃縮核酸を得ることを含み、及び、核酸増幅反応へ前記回収濃縮核酸を導入して、前記回収された濃縮核酸を増幅することを含む、
    請求項１３に記載の方法。
  17. 前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応系を含む、あるいは
    前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、あるいは
    前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応（３ＳＲ）、核酸ベースの転写アッセイ（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ステムループ増幅、シグナル介在ＲＮＡ増幅技術（ＳＭＡＲＴ）、等温多置換増幅（ＩＭＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）からなる群から選択される増幅系を含む、あるいは
    前記増幅することが、等温核酸増幅のために試薬と前記ＡＴＰＳを混合することを含む、あるいは
    前記増幅する方法が、室温または室温未満の温度で前記等温増幅を実施することを含む、あるいは
    前記方法が、等温増幅のための試薬を含む前記ＡＴＰＳを実質的に一定な温度まで加熱することを含む、あるいは
    前記増幅が、ヘリカーゼ依存性増幅を含み、約６５℃の一定温度で実施される、
    請求項１６に記載の方法。
  18. 前記方法が、単一の容器で実施される、あるいは
    前記方法が、マルチウェルプレートのウェルに異なる試料をそれぞれ含めて複数の核酸試料で実施される、あるいは
    前記方法が、マイクロ流体系のチャンバーまたはチャネルにおいて実施される、
    請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記試料が、細胞溶解物である、または
    前記試料が、核酸である、または
    前記試料が、インタクトな細胞を含み、前記ＡＴＰＳが、細胞を溶解するＡＴＰＳである、及び／または
    前記ＡＴＰＳが、ミセルＡＴＰＳである、及び／または
    前記試料が、血液もしくは血液のスポットを含み、前記ＡＴＰＳが、血液のスポットを再溶解するものである、または
    前記試料が、血液もしくは血液のスポットを含み、前記ＡＴＰＳが、血液のスポットを再溶解するものであり、前記ＡＴＰＳが、ＰＥＧ／デキストランＡＴＰＳもしくはＵＣＯＮ／デキストランＡＴＰＳを含む、
    請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 核酸を精製及び増幅するためのキットであって、
    前記キットが、
    水性二相溶液（ＡＴＰＳ）の構成成分を含む容器と、
    等温核酸増幅系の１つまたは複数の構成成分を含む容器と、
    を含み、
    前記ＡＴＰＳが、第１の相溶液と第２の相溶液を含み、ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）またはフロースルーアッセイにおいて、前記第１の相溶液が先行相となり、前記第２の相溶液が遅行相となり、
    前記ＡＴＰＳが、プローブ及びシグナル増強試薬であって、前記プローブが、前記第１の相溶液に分配され、及び前記シグナル増強試薬が、前記第２の相溶液に分配される、プローブ及びシグナル増強試薬を含む、前記キット。
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