JP7313619B2

JP7313619B2 - 化合物、蛍光標識導入剤、及び蛍光標識導入方法

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Publication number: JP7313619B2
Application number: JP2019078203A
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Inventors: 晶小野; 尚郎實吉
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特許法第３０条第２項適用平成２９年１１月１４日発行の第４４回国際核酸化学シンポジウム日本核酸化学会第１回年会講演要旨集の３９２～３９３頁で発表

本発明は、化合物、蛍光標識導入剤及び蛍光標識導入方法に関するものであり、より詳しくは、細胞の中に取り込まれたときに蛍光を示す蛍光標識が導入された化合物、及びそのような蛍光標識を化合物に導入するための蛍光標識導入剤及び蛍光標識導入方法に関するものである。

今日、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）やＲＮＡ（リボ核酸）といった核酸の合成法は確立されており、比較的短鎖の核酸であるオリゴヌクレオチドの自動合成機を用いた合成も行われている。こうして得られた合成オリゴヌクレオチドは、生命化学研究や医療診断等のために日常的に用いられつつある。合成オリゴヌクレオチドの有用な用途の一つに、核酸医薬がある。合成オリゴヌクレオチドは、例えば、疾患の原因となるタンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡと相補的な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することにより、このタンパク質の合成を阻害するアンチセンス法（非特許文献１を参照。）で用いられる。

ところで、こうしたＤＮＡやＲＮＡは、１ないし複数のリン酸基を持っており、それゆえ極性が高く細胞膜透過性が悪い。こうした点が核酸医薬の問題点の一つになっている。この問題に対応するために、リン酸基に含まれるＯＨ基を細胞内の酵素で脱離可能な置換基で保護し、脂溶性を向上させる手法が用いられることがある。このような置換基で修飾された化合物は、細胞膜を通過した後に、細胞内の酵素により脱保護を受けることにより、核酸医薬としての活性を発現するプロドラッグとなる（例えば、非特許文献２を参照）。

このように様々な工夫を施して、合成されたＤＮＡやＲＮＡ等の分子を細胞内に取り込ませ、核酸医薬として用いる試みがなされている。そのような試みの成果を評価する方法として、合成された分子がどの程度細胞に取り込まれるかを確認する手法も必要である。このための一般的な手法として、合成された分子に蛍光性基を結合して標識した後に細胞培養液に加え、蛍光顕微鏡で細胞を観察した際に蛍光が観察されるか否かを調べる手法を挙げることができる（例えば、非特許文献３を参照）。この手法では、細胞内に取り込まれた分子が蛍光を発するため、分子が細胞内に取り込まれたか否かを直接観察することができる。

しかし、この手法では、細胞内に取り込まれずに残った標識化合物がバックグラウンドとなり、蛍光顕微鏡での観察精度が低下する可能性もある。また、単に細胞膜に結合しただけの標識化合物と、細胞内に取り込まれた標識化合物とを区別することも容易でない。

Ａ．Ｍ．Ｂｅｌｉｋｏｖａ，Ｖ．Ｆ．Ｚａｒｙｔｏｖａ，Ｎ．Ｉ．Ｇｒｉｎｒｖａ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９６７，３５５７－３５６２Ｐ．Ｐ．Ｖｉｒｔａ，Ｈ．Ｌｏｎｎｂｅｒｇ，ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，１３，３４４１－３４６５Ｓａｎｅｙｏｓｈｉｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ，２０１６，２１４９

本発明は、以上の状況に鑑みてなされたものであり、細胞外では蛍光を示さない一方で、細胞に取り込まれると蛍光を発する蛍光標識をもつ化合物、及びそのような蛍光標識を導入するための蛍光標識導入剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、以上の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、蛍光発光を示しかつ窒素原子を有する環状骨格をもつ蛍光ユニットの窒素原子に特定の保護基を結合して消光させると、細胞外では消光している上記蛍光ユニットが、細胞内に取り込まれるとグルタチオンや酵素といった細胞内物質の働きにより脱保護されて発光することを見出した。このような作用を利用することにより、本発明者らは、細胞外では発光しない一方で、細胞内に取り込まれると発光を示す蛍光標識分子の創製に成功した。本発明は、以上の知見に基づいて完成されたものであり、以下のようなものを提供する。

（１）本発明は、下記一般式（１）で表す化合物である。

（上記一般式（１）中、Ａは、細胞膜を通して細胞内へ取り込まれ得る生体物質又はその誘導体の構造を含む１価の基であり、ＦＬは、下記化学式（２）又は（３）で示す骨格をもつ蛍光ユニットであり、Ｌは、ＡとＦＬとを結合する２価の基であり、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、波線で表す結合は、上記化学式（２）又は（３）に含まれる窒素原子への結合であり、Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環であり、Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１であり、Ｒ^１は、一価の基であり、ｎは、１～３の整数である。）

（上記化学式（２）における、アミノ基、イミノ基及びカルボキシル基の１つに上記Ｌが結合し、アミノ基及びイミノ基の少なくとも１つに上記Ｘが１つ又は２つ結合し、上記化学式（３）における、２つのアミノ基の１つに上記Ｌが結合し、残りのアミノ基に上記Ｘが１つ又は２つ結合する。）

（２）また本発明は、下記一般式（４）又は（５）で表す（１）項記載の化合物である。

（上記一般式（４）及び（５）中、Ａ、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、上記一般式（１）におけるものと同じである。）

（３）また本発明は、下記一般式（６）又は（７）で表す（１）項又は（２）項記載の化合物である。

（上記一般式（６）及び（７）中、Ａ、Ｌ、Ｘ及びＲは、上記一般式（１）におけるものと同じである。）

（４）また本発明は、下記一般式（８）～（１０）のいずれかで表す（１）項～（３）項のいずれか１項記載の化合物である。

（上記一般式（８）及び（９）中、Ａ、Ｌ及びＲ^１は、上記一般式（１）におけるものと同じである。上記一般式（１０）中、Ａ及びＬは、上記一般式（１）におけるものと同じである。）

（５）また本発明は、Ａがヌクレオチド鎖若しくはその類縁体又はペプチド鎖若しくはその類縁体である（１）項～（４）項のいずれか１項記載の化合物である。

（６）また本発明は、下記一般式（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）で表す化合物を含む蛍光標識導入剤でもある。

（上記一般式（１ａ）及び（１ｂ）中、ＦＬは、下記化学式（２）又は（３）で示す骨格をもつ蛍光ユニットであり、Ｌは、２価の基であり、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、波線で表す結合は、上記化学式（２）又は（３）に含まれる窒素原子への結合であり、Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環であり、Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１であり、Ｒ^１は、一価の基であり、ｎは、１～３の整数である。上記一般式（１ｃ）中、ＦＬは、下記化学式（２）又は（３）で示す骨格をもつ蛍光ユニットであり、Ａ環は単環でも複数の環が縮合した構造でもよい三重結合を備えた環構造であり、Ａ環が複数の環の縮合した構造の場合、ＬからＡ環への単結合は縮合しているどの環へ結合してもよく、Ｌは、２価の基であり、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、波線で表す結合は、前記化学式（２）又は（３）に含まれる窒素原子への結合であり、Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環であり、Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１であり、Ｒ^１は、一価の基であり、ｎは、１～３の整数である。）

（７）また本発明は、下記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（４ｃ）、（５ａ）、（５ｂ）又は（５ｃ）で表す（６）項記載の蛍光標識導入剤でもある。

（上記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（５ａ）及び（５ｂ）中、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、上記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（４ｃ）及び（５ｃ）中、Ａ環、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。）

（８）また本発明は、下記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）、（７ａ）、（７ｂ）又は（７ｃ）で表す（６）項又は（７）項記載の蛍光標識導入剤である。

（上記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（７ａ）及び（７ｂ）中、Ｌ、Ｘ及びＲは、上記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（６ｃ）及び（７ｃ）中、Ａ環、Ｌ、Ｘ及びＲは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。）

（９）また本発明は、下記一般式（８ａ）、（８ｂ）、（８ｃ）、（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（１０ａ）、（１０ｂ）又は（１０ｃ）で表す（６）項～（８）項のいずれか１項記載の蛍光標識導入剤である。

（上記一般式（８ａ）、（８ｂ）、（９ａ）及び（９ｂ）中、Ｌ及びＲ^１は、上記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（１０ａ）及び（１０ｂ）中、Ｌは、上記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（８ｃ）及び（９ｃ）中、Ａ環、Ｌ及びＲ^１は、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。上記一般式（１０ｃ）中、Ａ環及びＬは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。）

（１０）また本発明は、標識化する分子にアルキニル基又はアルキニレン基を導入した後、その分子に（６）項～（９）項のいずれか１項記載の化合物のうちアジド基を有する化合物を含む蛍光標識導入剤を反応させることを特徴とする蛍光標識導入方法でもある。

（１１）また本発明は、標識化する分子にアジド基を導入した後、その分子に（６）項～（９）項のいずれか１項記載の化合物のうちアルキニル基又はＡ環を有する化合物を含む蛍光標識導入剤を反応させることを特徴とする蛍光標識導入方法でもある。

本発明によれば、細胞外では蛍光を示さない一方で、細胞に取り込まれると蛍光を発する蛍光標識をもつ化合物、及びそのような蛍光標識を導入するための蛍光標識導入剤が提供される。

図１は、化合物１３についてのＧＳＨなし、ＧＳＨ１０ｍＭ及びＧＳＨ１０μＭにおける蛍光スペクトルである。図２は、化合物２０についてのＧＳＨなし、ＧＳＨ１０ｍＭ及びＧＳＨ１０μＭにおける蛍光スペクトルである。図３は、化合物２１についてのニトロレダクターゼ及びＮＡＤＨあり、並びに無しの場合における経時の蛍光スペクトル変化である。図４は、蛍光標識化ＯＤＮ１を１０ｍＭのＧＳＨと反応させたときの蛍光スペクトル変化である。図５は、蛍光標識化ＯＤＮ２が細胞内に取り込まれたときの様子を示す蛍光顕微鏡画像である。図６は、蛍光標識化ＯＤＮ２の脱保護前後の紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトル変化を示すチャートであり、図６（ａ）が紫外可視吸収スペクトル変化を示すチャートであり、図６（ｂ）が蛍光スペクトル変化を示すチャートである。図７は、蛍光標識化ＯＤＮ２のＧＳＨ存在下における時間経過に対する蛍光変化を示すチャートである。

以下、本発明の化合物の一実施形態、本発明の蛍光標識導入剤の一実施形態、及び本発明の蛍光標識導入方法の一実施態様について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態又は実施態様に限定されるものではなく、本発明の範囲において適宜変更を加えて実施することができる。

［化合物］
本発明の化合物は、下記一般式（１）で表す化合物である。この化合物は、細胞膜を通して細胞内へとり込まれ得る生体物質又はその構造を含むＡと、蛍光発光を示す蛍光ユニットＦＬと、ＦＬに結合する保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒとを備える。後述するが、Ａはヌクレオチド鎖やペプチド鎖等の生体分子であり、それが蛍光ユニットＦＬで標識されている。しかし、ＦＬは、保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒの存在により蛍光が消失又は弱められている。このような構造を備えた化合物が細胞内に取り込まれると、細胞内に存在するグルタチオンや各種の酵素による作用により、保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－ＲがＦＬから取り除かれ、ＦＬが蛍光を示すようになる。本発明の化合物は、このようなメカニズムにより、細胞外に存在するときは蛍光を示さないか微弱な蛍光を示すに留まる一方で、細胞内に取り込まれると強い蛍光を示すようになる。このため、背景技術に記載したようなバックグラウンド蛍光による妨害をほぼ受けることなく、ヌクレオチド鎖やペプチド鎖であるＡが細胞内にどの程度取り込まれるのかを蛍光顕微鏡で直接観察できるようになる。典型的には、Ａはいわゆる核酸医薬となるユニットであり、この場合、核酸医薬がどの程度細胞内に取り込まれるかを評価することが可能になる。これにより、例えばオリゴヌクレオチドの配列や保護基を変えて、細胞に取り込まれやすい構造を見出すことが容易になる。また、そうしたオリゴヌクレオチドの細胞に取り込まれる速度、細胞内の移動を経時的に観察することも可能になると考えられる。

上記一般式（１）において、Ａは、細胞膜を通して細胞内に取り込まれ得る生体物質又はその誘導体の構造を含む一価の基である。典型的には、Ａは、ヌクレオチド鎖やペプチド鎖であることを挙げられる。ヌクレオチド鎖は、複数のヌクレオチドが連続して結合したものであり、核酸医薬等として用いられる。ヌクレオチド鎖は、オリゴヌクレオチドとも呼ばれ、１～３０程度のヌクレオチドが結合したものを挙げることができる。このヌクレオチドは、デオキシリボ核酸でもリボ核酸でもよく、天然に存在するもののみならず、天然型のヌクレオチドに化学的な修飾を加えた核酸アナログであってもよい。ペプチド鎖も、単にアミノ酸のオリゴマーであるだけでなく、化学的な修飾を加えたペプチド鎖類縁体であってもよい。

Ｌは、ＡとＦＬとを結合する２価の基である。生体物質又はその誘導体であるＡは、例えば、ヌクレオチド鎖末端のリン酸基や、ペプチド鎖末端のアミノ基やカルボキシル基等といった官能基や、各種アミノ酸残基に由来する様々な官能基を含むので、Ｌは、例えばそのような官能基に対して結合したり、そのような官能基に導入されたアルキニル基やアジド基に対してクリック反応により結合したりする。Ｌは、ＡとＦＬを結合するものであり、その長さは短いものであっても長いものであっても構わない。Ｌは、Ａとの結合反応で形成された残基とアルキル鎖又は（ポリ）オキシエチレン鎖のような鎖状基とを含む。例えば、クリック反応を用いてＡとＬとを結合させた場合、上記残基はトリアゾール環構造となる。上記アルキル基又は（ポリ）オキシエチレン鎖としては、炭素数が２～２０程度のものを挙げることができる。

ＦＬは、蛍光発光を示しかつ窒素原子を有する環状骨格をもつ蛍光ユニットである。ＦＬは、それに含まれる窒素原子に保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが結合したときに、蛍光が消光し又は微弱な蛍光しか示さない一方で、こうした保護基が取り除かれると本来の蛍光を示すようになる。このようなＦＬの好ましい例として、下記化学式（２）又は（３）で示すローダミン１１０又はその誘導体からなる骨格を持つものを挙げることができる。この場合、下記化学式（２）又は（３）で示すローダミン１１０又はその誘導体は、本発明の効果を損なわない範囲で各種の修飾を受けてもよい。

ＦＬが上記化学式（２）で表す骨格を有する場合、上記Ｌは、化学式（２）に含まれるアミノ基、イミノ基及びカルボキシル基の少なくとも１つに結合し、保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒは、化学式（２）に含まれるアミノ基及びイミノ基の少なくとも１つに結合する。また、ＦＬが上記化学式（３）で表す骨格を有する場合、上記Ｌは、化学式（３）に含まれる２つのアミノ基の１つに結合し、保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒは、残りのアミノ基に結合する。なお、化学式（２）で表されるローダミン１１０骨格は、そのアミノ基又はイミノ基に電子求引性の置換基が結合すると、カルボキシル基が閉環した化学式（３）の構造をとることが知られている。

上記一般式（１）中、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。ＸとＦＬとを結合する波線は、ＦＬに含まれる窒素原子への単結合を意味する。Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環である。パラ位に結合を有する２価の、とは、２本の結合子がそれぞれ結合する２個の炭素原子の間に２個の炭素原子が含まれているという意味であり、オルト位に結合を有する２価の、とは、２本の結合子がそれぞれ結合する２個の炭素原子が互いに隣り合っているという意味である。Ａｒとしては、ｐ－フェニレン基やｏ－フェニレン基が好ましく例示される。なお、このフェニレン基は、本発明の効果を阻害しない範囲でさらに他の置換基を有していてもよい。

Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１である。本発明の保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒは、細胞内に存在するグルタチオンやニトロレダクターゼといった酵素によってこのＲが作用を受けることにより脱離する。その機構を次の化学反応式で説明する。なお、下記の化学反応式に示す化合物は、説明のために示した本発明の一例である。

上記化学反応式中、ＧＳＨは、細胞内に存在するグルタチオンである。グルタチオンにより、Ｒに含まれるジスルフィド結合が切断されると、ローダミン１１０骨格から保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが脱離し、化合物は蛍光を発する状態になる。また、Ｒがニトロ基の場合には下記のような化学反応式になる。

Ｒがニトロ基の場合には、細胞内に存在するニトロレダクターゼ及びＮＡＤＨによりニトロ基がアミノ基に還元され、これに伴って保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが脱離し、化合物は蛍光を発する状態になる。

なお、上記の例では、細胞内に存在するグルタチオンやニトロレダクターゼにより保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが脱離する態様を示したが、エステル結合により保護基を蛍光ユニットへ結合し、これを細胞内に存在するエステラーゼにより取り除く方法を採用してもよい。

Ｒ^１は、一価の基である。このような一価の基としては、炭素数１～１０のアルキル基が好ましく例示される。これらのアルキル基の中でも、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基が好ましく挙げられる。

上記一般式（１）において、ｎは、１～３の整数である。ｎは、本発明の化合物に導入される保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒの数であり、１、２及び３のいずれの数であってもよい。これらの中でも、ｎは、１又は２であることが好ましい。

本発明の化合物として、より具体的には下記一般式（４）又は（５）で表すものを好ましく挙げることができる。

上記一般式（４）及び（５）において、Ａ、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、上記一般式（１）におけるものと同様である。

より具体的には、本発明の化合物として下記一般式（６）及び（７）で表すものを好ましく挙げることができる。

上記一般式（６）及び（７）は、上記一般式（４）及び（５）においてＡｒをｐ－フェニレン基に特定したものである。上記一般式（６）及び（７）において、Ａ、Ｌ、Ｘ及びＲは、上記一般式（１）におけるものと同様である。

より具体的には、本発明の化合物として下記一般式（８）～（１０）で表すものを好ましく挙げることができる。

上記一般式（８）及び（９）において、Ａ、Ｌ、Ｒ^１は、上記一般式（１）におけるものと同様である。また、上記一般式（１０）において、Ａ及びＬは、上記一般式（１）におけるものと同様である。

さらに具体的に本発明の化合物を説明するための一例として、ヌクレオチド鎖の５’末端を蛍光標識した化合物を下記化学式（１１）及び（１２）に示す。なお、下記化学式（１１）及び（１２）の化合物は本発明の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。

上記化学式（１１）及び（１２）において、一般式（１）における－Ｌ－ＦＬ－（Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ）_ｎに相当する部分が、５’末端のリン酸基の酸素原子に結合したアルキレン鎖から左側の部分になる。そして、５’末端のリン酸基に結合した波線は、それ以降がヌクレオチド鎖であることを示す。この５’末端のリン酸基からヌクレオチド鎖に至る部分が、上記一般式（１）におけるＡに相当する。こうした分子は、例えば、下記化学反応式のように、アルキニル基を有するホスホロアミダイト（１４）を合成した後に、ＤＮＡ自動合成機を使用してヌクレオチド鎖の末端にアルキニル基を導入し、その後、これを下記化学式（１３）に示すアジド化合物とクリック反応により結合することで得られる。なお、下記化学反応式で示すＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。また、クリック反応は、アジド化合物とアルキニル化合物とをＣｕ（Ｉ）化合物の存在下でカップリングさせる反応である。この反応によれば、上記化学式（１２）に示す化合物のように、カップリング箇所にトリアゾール環が形成される。

また、上記化合物（１４）に代えて下記化学式（１４ｃ）で表す、環内に三重結合を持ち歪んだ環構造を有するホスホロアミダイトを用いて上記化学式（１３）で表すアジド化合物とクリック反応を行ってもよい。下記化学式（１４ｃ）で表す化合物のように歪んだ環構造を有する化合物とアジド基を有する化合物とをクリック反応によりカップリングさせる場合、触媒であるＣｕ（Ｉ）化合物が存在しなくてもカップリングを進行させることができる。なお、下記化学式（１４ｃ）で表す化合物としては、例えばＧＬＥＮＲＥＳＥＲＣＨ社から市販されているものを用いることができる。また、こうした歪んだ環構造としては、他に例えば下記化学式（Ａ）で表すものを挙げることができる。

次に、化合物（１３）のようなアジド化合物を得るための合成スキームの一例を下記に示す。

［蛍光標識導入剤］
下記一般式（１ａ）又は（１ｂ）で表す化合物を含む蛍光標識導入剤もまた本発明の一つである。この蛍光標識導入剤は、アジド基又はアルキニル基を持ち、それぞれアルキニル基又はアジド基を持つ化合物とＣｕ（Ｉ）化合物の存在下でクリック反応を生じてカップリングする。このため、例えばアルキニル基やアジド基を持つヌクレオチド鎖やペプチド鎖に対して、上記本発明の化合物における蛍光標識を導入するのに用いることができる。すなわち、本発明の蛍光標識導入剤は、上記本発明の化合物を合成するのに用いることができる。なお、下記一般式（１ａ）で表す蛍光標識導入剤は、アルキニル基を有する化合物に蛍光標識を導入するのに用いられ、下記一般式（１ｂ）又は（１ｃ）で表す蛍光標識導入剤は、アジド基を有する化合物に蛍光標識を導入するのに用いられる。特に、化学式（１ｃ）で示すものは、三重結合の存在によりＡ環が歪んでおり、Ｃｕ（Ｉ）化合物の存在がなくともアジド基を有する化合物とクリック反応を生じてこれに蛍光標識を導入させる。この蛍光標識を導入された化合物が、細胞外の例えば培養液中等で蛍光を示さないか、微弱な蛍光しか示さない一方で、細胞内に入ると保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが脱離して蛍光を示すようになる点は、上記本発明の化合物で既に説明した通りである。

上記一般式（１ａ）、（１ｂ）及び（１ｃ）中、ＦＬは、蛍光発光を示しかつ窒素原子を有する環状骨格をもつ蛍光ユニットである。ＦＬは、それに含まれる窒素原子に保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが結合したときに、蛍光が消光し又は微弱な蛍光しか示さない一方で、こうした保護基が取り除かれると本来の蛍光を示すようになる。このようなＦＬの好ましい例として、下記化学式（２）又は（３）で示すローダミン１１０又はその誘導体からなる骨格を持つものを挙げることができる。この場合、下記化学式（２）又は（３）で示すローダミン１１０又はその誘導体は、本発明の効果を損なわない範囲で各種の修飾を受けてもよい。

ＦＬが上記化学式（２）で表す骨格を有する場合、上記Ｌは、化学式（２）に含まれるアミノ基、イミノ基及びカルボキシル基の少なくとも１つに結合し、保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒは、化学式（２）に含まれるアミノ基及びイミノ基の少なくとも１つに結合する。また、ＦＬが上記化学式（３）で表す骨格を有する場合、上記Ｌは、化学式（３）に含まれる２つのアミノ基の１つに結合し、保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒは、残りのアミノ基に結合する。

上記一般式（１ａ）、（１ｂ）及び（１ｃ）中、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－である。ＸとＦＬとを結合する波線は、ＦＬに含まれる窒素原子への単結合を意味する。Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環である。「パラ位又はオルト位に結合を有する２価の」の用語については、上記本発明の化合物にて既に説明した通りである。Ａｒとしては、ｐ－フェニレン基やｏ－フェニレン基が好ましく例示される。なお、このフェニレン基は、本発明の効果を阻害しない範囲でさらに他の置換基を有していてもよい。

Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１である。本発明の保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒは、細胞内に存在するグルタチオンやニトロレダクターゼといった酵素によってこのＲが作用を受けることにより脱離する。その反応機構については、上記本発明の化合物にて既に説明した通りである。また、本発明の蛍光標識導入剤において、エステル結合により保護基を蛍光ユニットへ結合してもよい。この場合、蛍光標識を導入された化合物は、細胞内に存在するエステラーゼにより保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒが脱離することになる。

上記一般式（１ａ）、（１ｂ）及び（１ｃ）において、ｎは、１～３の整数である。ｎは、本発明の化合物に導入される保護基－Ｘ－ＣＨ_２－Ａｒ－Ｒの数であり、１、２及び３のいずれの数であってもよい。これらの中でも、ｎは、１又は２であることが好ましい。

上記一般式（１ｃ）において、Ａ環は、単環でも複数の環が縮合した構造でもよい三重結合を備えた環構造であり、Ａ環が複数の環の縮合した構造の場合、ＬからＡ環への単結合は縮合しているどの環へ結合してもよい。三重結合の存在によりＡ環は歪んでおり、アジド基を持つ化合物に対するクリック反応の活性が高い。このため、化合物（１ｃ）を用いた場合、通常のクリック反応で触媒として必要なＣｕ（Ｉ）化合物が不要になる。Ａ環の構造としては、下記化学式に例示するような、８員環構造又はそれが他の環と縮合した構造を好ましく挙げることができる。

本発明の蛍光標識導入剤として、より具体的には下記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（４ｃ）、（５ａ）、（５ｂ）又は（５ｃ）で表すものを好ましく挙げることができる。なお、一般式（４ａ）で表す蛍光標識導入剤は、アルキニル基を有する化合物に蛍光標識を行って、上記一般式（４）で表す化合物を与える。また、一般式（４ｂ）又は（４ｃ）で表す蛍光標識導入剤は、アジド基を有する化合物に蛍光標識を行って、上記一般式（４）で表す化合物を与える。このような法則は、他の一般式番号（５ａ、５ｂ、５ｃ、６ａ、６ｂ、６ｃ等）の付された蛍光標識導入剤についても同様である。

上記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（５ａ）及び（５ｂ）中、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、前記一般式（１ａ）におけるものと同様である。上記一般式（４ｃ）及び（５ｃ）中、Ａ環、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、上記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。

より具体的には、本発明の蛍光標識導入剤として下記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）、（７ａ）、（７ｂ）又は（７ｃ）で表すものを好ましく挙げることができる。

上記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）、（７ａ）、（７ｂ）及び（７ｃ）は、上記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（４ｃ）、（５ａ）、（５ｂ）及び（５ｃ）においてＡｒをｐ－フェニレン基に特定したものである。上記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（７ａ）及び（７ｂ）において、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、上記一般式（１ａ）におけるものと同様である。上記一般式（６ｃ）及び（７ｃ）中、Ａ環、Ｌ、Ｘ及びＲは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同様である。

より具体的には、本発明の蛍光標識導入剤として下記一般式（８ａ）、（８ｂ）、（８ｃ）、（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（１０ａ）、（１０ｂ）又は（１０ｃ）で表すものを好ましく挙げることができる。

上記一般式（８ａ）、（８ｂ）、（９ａ）及び（９ｂ）において、Ｌ及びＲ^１は、上記一般式（１ａ）におけるものと同様である。上記一般式（１０ａ）及び（１０ｂ）において、Ｌは、上記一般式（１ａ）におけるものと同様である。上記一般式（８ｃ）及び（９ｃ）において、Ａ環、Ｌ及びＲ^１は、上記一般式（１ｃ）におけるものと同様である。上記一般式（１０ｃ）において、Ａ環及びＬは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同様である。

本発明の蛍光標識導入剤を得るための合成スキームは、上記本発明の化合物の説明にて既に例示したとおりである。なお、上記例示は、アジド基を有するものだが、アルキニル基を有するものについても通常の有機合成手法にて合成することが可能である。

［蛍光標識導入方法］
標識化する分子にアルキニル基又はアルキニレン基を導入した後、その分子に上記アジド基を有する蛍光標識導入剤を反応させることを特徴とする蛍光標識導入方法、及び標識化する分子にアジド基を導入した後、その分子に上記アルキニル基又はＡ環を有する蛍光標識導入剤を反応させることを特徴とする蛍光標識導入方法もまた本発明の一つである。これについては既に説明した通りなので、ここでの説明を省略する。なお、ヌクレオチド鎖にアルキニレン基を導入する場合、ＤＮＡ自動合成機でヌクレオチド鎖を合成する際に、既に説明した下記化学式（１４ｃ）等で表される市販のホスホロアミダイトを用いてオリゴヌクレオチド鎖の５’末端部等にアルキニレン基を導入すればよい。化学式（１４ｃ）においてアルキニレン基を有する環状構造は、下記化学式（Ａ）で表すものに置き換えることもできる。これらアルキニレン基を有する環状構造は歪んでおり、アジド基を有する化合物に対してＣｕ（Ｉ）化合物からなる触媒無しにクリック反応を生じることができる。こうしたアルキニレン基を有する環状構造としては、８員環を好ましく例示できる。

以下、実施例を示すことにより本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。なお、下記の合成例における化合物番号は、上記合成スキームにて化学式に付した番号に対応する。

・（４－メルカプトフェニル）メタノールの合成

乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１７０ｍＬ）にＬｉＡｌＨ_４（５．５１ｇ、１４５ｍｍｏｌ）を加えた後、氷冷下で少し撹拌し、反応容器内をアルゴンで置換した。その後、４－メルカプト安息香酸（７．５７ｇ、４９．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１３０ｍＬ）を加え、４日間撹拌した。塩化アンモニウム飽和水溶液を加えて反応を停止し、メタノールを添加した後、超音波振動を加えることで鼠色の油状物質を溶解させ、セライトで溶かした。減圧下濃縮を行い、酢酸エチルを加え、水で２回、塩化ナトリウム飽和水溶液で１回洗浄を行った。有機相を回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１で展開、クロロホルム：メタノール＝１００：０で溶出）で精製し、白色固体の（４－メルカプトフェニル）メタノール（３．０５ｇ、２１．８ｍｍｏｌ、収率４４％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ（ｐｐｍ）：７．２３－７．１７（４Ｈ，ｍ，Ｈ－ａｒｏｍ），５．２９（１Ｈ，ｓ，ＳＨ），５．１２－５．１１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，ＯＨ），４．４１－４．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，ＣＨ_２）

・２－（イソプロピルジスルファニル）ピリジンの合成

エタノール（２０ｍＬ）に２，２’－ジピリジルジスルフィド（１１．８ｇ、５３．６ｍｍｏｌ）を加え、さらに酢酸（１．５３ｍＬ、２６．８ｍｍｏｌ）及び２－プロパンチオール（５．０ｍＬ、５３．６ｍｍｏｌ）を加えて室温で撹拌した。２日後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で反応の進行を確認し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、淡黄色液体の２－（イソプロピルジスルファニル）ピリジン（８．０４ｇ、４３．３ｍｍｏｌ、収率８１％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ（ｐｐｍ）：８．４５－８．４４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－ａ），７．７７－７．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－ｃ），７．６５－７．６１（１Ｈ，ｍ，Ｈ－ｄ），７．０８－７．０５（１Ｈ，ｍ，Ｈ－ｂ），３．１８－３．１０（１Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．３４－１．３２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）

・（４－（イソプロピルジスルファニル）フェニル）メタノールの合成

エタノール（２ｍＬ）に（４－メルカプトフェニル）メタノール（９４５ｍｇ、６．７４ｍｍｏｌ）を加え、撹拌しながら２－（イソプロピルジスルファニル）ピリジン（２．５６ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）及び酢酸（１００μＬ、６．１２ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０で溶出）で精製し、透明液体の（４－（イソプロピルジスルファニル）フェニル）メタノール（１．１９ｇ、５．５４ｍｍｏｌ、収率８３％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：７．５４－７．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ－ｃ），７．３２－７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ－ｂ），４．６７（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ａ），３．０８－３．０４（１Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．３０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５，ｉＰｒ－ＣＨ_３）

・１－（４－（クロロメチル）フェニル）－２－イソプロピルジスルファンの合成

塩化メチレン（２ｍＬ）にトリホスゲン（２１９ｍｇ、７３８μｍｏｌ）を加え、０℃で撹拌しながら、（４－（イソプロピルジスルファニル）フェニル）メタノール（５０３ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）及びピリジン（１８７μＬ、２．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で９時間撹拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認し、酢酸エチルを加え、水で３回洗浄した。有機相を回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０で溶出）で精製し、透明液体の１－（４－（クロロメチル）フェニル）－２－イソプロピルジスルファン（３２０ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ、収率５９％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：７．５２－７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｈ－ｃ），７．３２－７．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，Ｈ－ｂ），４．５５（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ａ），３．０９－３．０２（１Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．２９（６Ｈ，ｄ，Ｊ－６．５Ｈｚ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）

・化合物１５の合成

ローダミン１１０塩酸塩（３９４ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を反応容器に加え、内部をアルゴンで置換した。これをＤＭＦに溶解させ、ＮａＨ（３２ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。その後、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカーボネート（２２１μＬ、９６２μｍｏｌ）を加え、１日間撹拌した。ＴＬＣにより原料が薄くなっていることを確認し、ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１の混合溶媒（６６ｍＬ）中へ反応溶液を少しずつ滴下し、得られた溶液をヘキサン：酢酸エチル＝２０：１の混合溶媒（６３ｍＬ）へ少しずつ滴下し、さらに得られた溶液をヘキサン：酢酸エチル＝２０：１の混合溶媒（６３ｍＬ）へ少しずつ滴下した。溶媒を留去して残渣を回収し、ヘキサン：酢酸エチル：メタノール＝１：１：１の混合溶媒（９０ｍＬ）に溶解させた。析出した赤い固体を濾別し、溶液の方を回収した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９０：１０で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０～４０：６０で溶出）で精製し、燈色固体の化合物１５（１８８ｍｇ、４３４μｍｏｌ、収率４５％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．２３－８．２１（２Ｈ，ｍ，Ｈ－ａｒｏｍ），８．０２－８．００（１Ｈ，ｍ，Ｈ－ｂ），７．６７－６．６６（１１Ｈ，ｍ，Ｈ－ａｒｏｍ，Ｈ－ａ），１．５２（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ－ＣＨ_３）

・化合物１６の合成

ＴＨＦ（１．５ｍＬ）に化合物１５（５８ｍｇ、１３４μｍｏｌ）を溶解させ、トリホスゲン（３２ｍｇ、１０８μｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６８．４μＬ、４０２μｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。その後、反応溶液に塩化アンモニウム飽和水溶液（１５ｍＬ）を加えて反応を停止させた。これに塩化メチレンを加え、塩化アンモニウム飽和水溶液で３回洗浄した。有機相を集めて減圧下で濃縮し、クロマトグラフィーで精製することで、淡黄色液体の化合物１６（１６ｍｇ、２３．９μｍｏｌ、収率１８％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｈ－ｃ），７．６６－６．６６（１５Ｈ，ｍ，Ｒｈ－Ｂｎ，Ｈ－ｂ），５．１７（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ａ），３．０９－３．０２（１Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．５２（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ－ＣＨ_３），１．２９（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）

・化合物１７の合成

化合物１６（２．５ｍｇ、３．７３μｍｏｌ）に４Ｍ塩酸水溶液（５００μＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣで原料の消失を確認し、減圧下で濃縮し、酢酸エチルで３回、クロロホルムで３回共沸除去を行って、未精製のままの化合物１７を赤色固体（２．０ｍｇ、３．５μｍｏｌ、収率９４％）として得た。これを未精製のまま次の反応に用いた。

・化合物１３の合成

ＤＭＦ（１０ｍＬ）に化合物１７（１８９ｍｇ、３３１μｍｏｌ）を溶解させ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、６３４ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ）及び１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン酸（３９４μＬ、１．９９ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で２日間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認した後、酢酸エチルを加え、塩化ナトリウム飽和水溶液で２回洗浄した。有機相を集めて共沸脱水（ピリジン５回、トルエン３回）を行った。クロマトグラフィーで精製し、白色固体の化合物１３（１５．８ｍｇ、１２．４μｍｏｌ、収率６．１％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．９３（１Ｈ，ｓ，Ｈ－ｉ），８．０３－６．７２（１５Ｈ，ｓ，Ｈ－ｈ，Ｒｈ－Ｂｎ，Ｂｎ’），５．１８（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ｊ），４．１３（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ｇ），３．７８－３．６３（１０Ｈ，ｍ，Ｈ－ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ），３．３３（２Ｈ，ｍ，Ｈ－ａ），３．０８－３．０４（１Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．３０（６Ｈ，ｄ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）

・化合物１８の合成

ＤＭＦ（１ｍＬ）に化合物１５（５３ｍｇ、１２３μｍｏｌ）を溶解させ、ＥＤＣ（６１ｍｇ、３１８μｍｏｌ）及び１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン酸（７８．２μＬ、３６９μｍｏｌ）を順次加え、室温で８時間撹拌した。ＴＬＣにより原料が薄くなったことを確認し、酢酸エチルを加え、塩化ナトリウム飽和水溶液で２回洗浄した。有機相を集めて、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１で展開、ヘキサン：酢酸エチル６５：３５～５５：４５で溶出）で精製し、燈色固体の化合物１８（４５ｍｇ、６９．７μｍｏｌ、収率５７％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．９３（１Ｈ，ｓ，Ｈ－ｉ），８．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈ－ｊ），７．６９－６．６５（１０Ｈ，ｍ，Ｈ－ａｒｏｍ），４．１３（２Ｈ，ｍ，Ｈ－ｇ），３．６９（８Ｈ，ｍ，Ｈ－ｃ～ｆ）、３．３４（２Ｈ，ｔ、Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｈ－ｂ）、１．５２（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ－ＣＨ_３）、１．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，Ｈ－ａ）

・化合物１９の合成

塩化メチレン（７５０μＬ）にトリフルオロ酢酸２５０μＬを添加した溶液に化合物１８（３０ｍｇ、４６．５ｍｍｏｌ）を溶解させ、室温で９０分間撹拌した。ＴＬＣにより原料が薄くなったことを確認した後、反応溶液にクロロホルムを加え、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で１回、塩化ナトリウム飽和水溶液で１回洗浄を行った。有機相を集めて、減圧下で濃縮した。その後、共沸脱水（ピリジン３回、トルエン２回）を行い、酢酸エチルで共沸除去を行った。減圧下で濃縮を行い、真空乾燥を行うことで、ピンク色固体の化合物１９（４５ｍｇ、６９．７μｍｏｌ、収率５７％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．４０－６．５６（１０Ｈ，ｍ，Ｒｈ－Ｂｎ），４．１１（２Ｈ，ｄ，Ｈ－ｇ），３．７５－３．６２（１０Ｈ，ｍ，Ｈ－ａ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ），３．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｈ－ｂ）

・化合物２０の合成

アセトニトリル（１ｍＬ）に化合物１９（３９．４ｍｇ、７２．４μｍｏｌ）を溶解させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１００μＬ、７２．１μｍｏｌ）及び１－（４－（クロロメチル）フェニル）－２－イソプロピルジスルファン（１５５ｍｇ、５６０μｍｏｌ）を加えて７０℃で１日間撹拌した。ＴＬＣにより反応が進行していることを確認した後、クロマトグラフィーで精製し、燈色固体の化合物２０（１０．８ｍｇ、１１．５μｍｏｌ、収率１６％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．８７（１Ｈ，ｓ，Ｈ－ｈ），７．９８－６．４０（６Ｈ，ｍ，Ｈ－ａｒｏｍ），４．６１（４Ｈ，ｓ，Ｈ－ｉ），４．１１（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ｇ），３．６５（１２Ｈ，ｍ，Ｈ－ａ，ｃ～ｆ），３．２６（２Ｈ，ｓ，Ｈ－ｂ），３．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．２９（１２Ｈ，ｓ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）

・化合物２１の合成

化合物１５（８８ｍｇ、２０３μｍｏｌ）を無水ピリジンで共沸脱水し、ピリジン（３ｍＬ）及び４－ニトロクロロギ酸ベンジル（９４ｍｇ、４３６μｍｏｌ）を加え、１５０分間撹拌した。ＴＬＣにより原料が薄くなったことを確認し、酢酸エチルに溶解し、水で１回、炭酸水素ナトリウム水溶液で１回洗浄を行った。有機相を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５～６０：４０で溶出）で精製し、白色固体の化合物２１（５６ｍｇ、９１．６μｍｏｌ、収率４５％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，Ｈ－ａ，ｂ），８．０２－６．６６（１４Ｈ，ｍ，Ｒｈ－Ｂｎ，Ｂｎ’），５．２９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ_２），１．５２（９Ｈ，ｓ，Ｂｏｃ－ＣＨ_３）

・化合物１４の合成

５－ヘキシン－１－オール（３２．３μＬ、３００μｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解させた後、反応溶液内をアルゴン置換し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１０２μＬ、６００μｍｏｌ）及びシアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１００μＬ、４５０μｍｏｌ）を順次加え、室温で１５分間撹拌した。原料の消失をＴＬＣにより確認した後、反応溶液に塩化メチレンを追加して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。有機相を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０～５０：５０で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０～９０：１０で溶出）で精製し、透明液体の化合物１４（７７ｍｇ、２５８μｍｏｌ、収率８６％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：４．０５（１Ｈ，ｍ，－Ｃ≡ＣＨ），３．８２－３．７０（２Ｈ，ｍ，Ｈ－ｆ），３．６６－３．４９（４Ｈ，ｍ，Ｈ－ｄ，ｅ），２．５８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ｉＰｒ－ＣＨ），２．１６（２Ｈ，ｍ，Ｈ－ａ），１．７７－１．５２（４Ｈ，ｍ，Ｈ－ｂ，ｃ），１．１８（２Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ），１．１２（１２Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）
^３１Ｐ－ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：１４８．０１

・化合物２２の合成

チミジン（３．３５ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、反応容器をアルゴン置換してピリジン（２０ｍＬ）に溶解させた。４，４－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）クロリド（６．０９ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で９時間撹拌した。ＴＬＣにより原料消失を確認し、エタノールを少量加え、溶液を減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルムに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。有機相を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１で展開、クロロホルム：メタノール＝９８：２で溶出）で精製し、淡黄色固体の化合物２２（４２７ｍｇ、７８４μｍｏｌ、収率６％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ（ｐｐｍ）：１１．３２（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），７．４９１－７．４９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，Ｈ－６），７．３８－６．８６（１３Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ－ａｒｏｍ），６．２０－６．１８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－１’），５．３１－５．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＯＨ－３’），４．３２－４．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４’），３．８７－３．８６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ－３’），３．７２（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３－ＤＭＴｒ），３．２１－３．１４（２Ｈ，ｍ，Ｈ－５’），２．２５－２．１１（２Ｈ，ｍ，Ｈ－２’），１．４２９－１．４２８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，ＣＨ_３－５）

・化合物２３の合成

化合物２２（４．１９ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸脱水し、無水トルエンで３回共沸除去した後、反応容器をアルゴン置換して塩化メチレン（２６ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．６ｍＬ、１４，９ｍｍｏｌ）及びビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（３．１３ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で２時間撹拌した。原料の消失をＴＬＣにより確認した後、反応溶液に塩化メチレンを追加して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。有機相を集めて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０～２０：８０で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０～５０：５０で溶出）で精製し、白色泡状固体の化合物２３（３．９７ｇ、５．１２ｍｍｏｌ、収率６７％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：８．２３（１Ｈ、ｓ、ＮＨ），７．６６（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝１．１Ｈｚ，Ｈ－６），７．４１－６．８１（１３Ｈ，ｍ、ＤＭＴｒ－ａｒｏｍ）、６．４４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－１’），４．５３（１Ｈ，ｍ，ＯＨ－３’），４．２４（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４’），３．７９（６Ｈ，ｓ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｈ－５’，５”，Ｎ－ＣＨ（ｉ－Ｐｒ）_２），３．５９－３．４２（６Ｈ，ｍ，ＯＣＨ_３－ＤＭＴｒ），２．５３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５’），２．３２－２．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２’），１．２９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，５－ＣＨ_３），１．１１（２４Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）
^３１Ｐ－ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：１１６．６０

・化合物２４の合成

化合物２３を反応容器に加えてアルゴン置換し、１Ｈ－テトラゾール（１４４ｍｇ、２．０６ｍｍｏｌ）、３－フェニル－１－プロパノール（３３１μＬ、２．４３ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルアミン（２７９μＬ、１．９９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１０ｍＬ）を加えた。２時間撹拌し、原料消失をＴＬＣにより確認した後、反応溶液に塩化メチレンを追加して、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回、飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。有機相を集めて、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過にて溶液を得た後これを減圧下で濃縮した。残渣を少量の酢酸エチルに溶解させ、多量のヘキサンを加えて懸濁液にした。濾過を行って得た白色固体を酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０～６０：４０で展開、ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０～６０：４０溶出）で精製し、白色泡状固体の化合物２４（２６０ｍｇ、３２１μｍｏｌ、収率１５％）を得た。
^１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：７．６４（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），７．４０（１Ｈ，ｓ，Ｈ－６），７．２９－７．１１（１８Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒ－ａｒｏｍ，Ｐｈ－Ｈ），６．４３（１Ｈ．ｍ，Ｈ－１’），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｈ－４’），３．７８－３．７５（６Ｈ，ｄ，ＤＭＴｒ－ＯＭｅ），３．６０－３．４７（６Ｈ，ｍ，Ｈ－５’，５”，Ｎ－ＣＨ（ｉ－Ｐｒ）_２），２．７１－２．５８（２Ｈ，ｍ，Ｐｈ－［ＣＨ_２］－ＣＨ_２），２．３０（２Ｈ，ｍ，Ｐｈ－ＣＨ_２－［ＣＨ_２］），１．９２－１．７９（２Ｈ，ｍ，Ｈ－２’，２”），１．４０（３Ｈ，ｓ，５－ＣＨ_３），１．１７－１．１４（１２Ｈ，ｍ，ｉＰｒ－ＣＨ_３）
^３１Ｐ－ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ（ｐｐｍ）：１４７．６７

［脱保護に伴う蛍光変化の評価］
本発明の化合物における蛍光標識部分にて保護基が脱離することに伴う蛍光の変化を評価した。評価に用いた化合物は、化合物１３、化合物２０及び化合物２１である。いずれの化合物も一般式（１）におけるＡを持たず蛍光標識部分のみとなるが、保護基の脱離に伴う蛍光変化を評価することは可能である。化合物１３は、ジスルフィド結合を有し、グルタチオンにより脱離するカルバメート構造を有する保護基をもつ。化合物２０は、ジスルフィド結合を有し、グルタチオンにより脱離する非カルバメート構造の保護基をもつ。化合物２１は、ニトロフェニル基をもち、ニトロレダクターゼにより脱離する保護基をもつ。

化合物１３の２００μＭ水溶液３０μＬに１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）４００μＬ及び純水１０００μＬを加え、７１０μＬずつ２つの容器に分けた。一方の容器に５０ｍＭグルタチオン溶液（ＧＳＨ）４００μＬ及び純水８９０μＬを加え、ＧＳＨ濃度が１０ｍＭになるように調節した。もう一方の容器には、１２９０μＬの純水を加え、ＧＳＨ未添加溶液とした。同様の手順で、ＧＳＨ濃度が１０μｍとなる化合物１３の溶液を調製した。これらＧＳＨ未添加、ＧＳＨ１０ｍＭ及びＧＳＨ１０μＭの３つの溶液について、３７℃恒温槽に静置し、ｐＨ＝７．４（ＰＢＳ緩衝液）で反応させた。反応時間４８０分で蛍光測定を行い、各蛍光スペクトルを調べた。その結果を図１に示す。図１は、化合物１３についてのＧＳＨ未添加、ＧＳＨ１０ｍＭ及びＧＳＨ１０μＭにおける蛍光スペクトルである。

化合物２０の２００μＭ水溶液３０μＬに１０×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）６００μＬ及び純水１２００μＬを加え、６１０μＬずつ２つの容器に分けた。一方の容器に５０ｍＭグルタチオン溶液（ＧＳＨ）４００μＬ及び純水８９０μＬを加え、ＧＳＨ濃度が１０ｍＭになるように調節した。もう一方の容器には、１３９０μＬの純水を加え、ＧＳＨ未添加溶液とした。同様の手順で、ＧＳＨ濃度が１０μｍとなる化合物２０の溶液を調製した。これらＧＳＨ未添加、ＧＳＨ１０ｍＭ及びＧＳＨ１０μＭの３つの溶液について、３７℃恒温槽に静置し、ｐＨ＝７．４（ＰＢＳ緩衝液）で反応させた。反応時間４８０分で蛍光測定を行い、各蛍光スペクトルを調べた。その結果を図２に示す。図２は、化合物２０についてのＧＳＨ未添加、ＧＳＨ１０ｍＭ及びＧＳＨ１０μＭにおける蛍光スペクトルである。

図１及び図２に示すように、化合物１３及び化合物２０のいずれについても、細胞内ＧＳＨ濃度に相当する１０ｍＭにてローダミン１１０由来の蛍光の増加が確認された。このことは、保護基により消光していた蛍光ユニットの保護基がＧＳＨにより脱離することで、再び蛍光を示すようになったことを示している。一方、細胞外に微量に存在するＧＳＨ濃度（１０μＭ）やＧＳＨ未添加の場合には、蛍光の増加はごく僅かであるか、消光したままだった。

リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）中、化合物２１の濃度を１０μＭとし、ニトロレダクターゼ５０μｇ／ｍＬ及びＮＡＤＨを１ｍＭ含む試料Ａと、ニトロレダクターゼ及びＮＡＤＨを含まない試料Ｂとを調製した。これらの試料を３７℃にて２時間反応させ、蛍光スペクトルの変化を観察した。なお、試料Ａについては、ニトロレダクターゼ及びＮＡＤＨ添加直後（すなわち反応時間０時間）の蛍光スペクトルの変化も観察した。その結果を図３に示す。図３は、化合物２１についてのニトロレダクターゼ及びＮＡＤＨあり、並びに無しの場合における経時の蛍光スペクトル変化である。

図３に示すように、化合物２１は、細胞内酵素であるニトロレダクターゼ存在下でローダミン１１０由来の蛍光の増加が観察された。このことは、保護基により消光していた蛍光ユニットの保護基がニトロレダクターゼの還元作用により脱離することで、再び蛍光を示すようになったことを示している。

［オリゴヌクレオチド（Ｔ_２０）への蛍光標識化］
次に、オリゴヌクレオチドに対する蛍光標識を行った。この蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、本発明の化合物に相当する。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成機上でホスホロアミダイド法に従って固相合成法により合成した。オリゴヌクレオチドの合成に際しては、化合物２３（チミン塩基のホスホロアミダイド）を用いて、チミジンが２０個連続するオリゴヌクレオチド（これをＴ_２０と呼ぶ。）を合成し、最後に化合物１４（エチニル基を有するホスホロアミダイド）を結合させた。これにより、Ｔ_２０の５’末端にエチニル基が導入されたことになる。得られたオリゴヌクレオチドをＯＤＮ１と呼ぶ。

ＯＤＮ１に対して、クリック反応により蛍光標識化を行った。ＯＤＮ１（５０ｎｍｏｌ）の溶液（３８μＬ）に、５０ｍＭのＣｕＳＯ_４と１００ｍＭのトリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）を含むメタノール溶液（２５μＬ）、及び１５０ｍＭのＬ－アスコルビン酸ナトリウム水溶液（２５μＬ）を加え、さらに化合物１３（１０００ｎｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０μＬ）、メタノール（５０μＬ）、ＴＨＦ（２５μＬ）及び純水（１５μＬ）を加え、撹拌した後、２４時間室温にて静置した。この反応溶液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）飽和水溶液（３００μＬ）及びアセトニトリル（１５０μＬ）を加え、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）によりＣｕ（Ｉ）を沈殿させ、上澄み液を回収した。ＨＰＬＣ分取カラムを使用し、目的物のピークを単離及び精製し、蛍光標識化ＯＤＮ１を得た。

得られた蛍光標識化ＯＤＮ１に対して、ＧＳＨと反応させた。反応条件は、蛍光標識化ＯＤＮ１を１．０μＭに対してＧＳＨを１０ｍＭとし、３７℃のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中にて、反応時間を４８０分間とした。その結果を図４に示す。図４は、蛍光標識化ＯＤＮ１を１０ｍＭのＧＳＨと反応させたときの蛍光スペクトル変化である。

図４に示すように、蛍光標識化ＯＤＮ１は、１０ｍＭのＧＳＨと反応することで消光していた蛍光が回復することが確認された。このことから、オリゴヌクレオチド鎖に結合された蛍光標識においても、ＧＳＨの作用により保護基が脱離して蛍光が回復することが理解される。

［オリゴヌクレオチド類縁体（Ｔ’_２０）への蛍光標識化、及びその細胞内導入実験］
化合物２３（チミン塩基のホスホロアミダイト）に加えて、化合物２４（チミン塩基のホスホロアミダイトであり、リン酸のＯＨにフェニルプロピル基が結合したものである。これをＸで表す。）を用いて、上記ＯＤＮ１と同様の手順により、（５’末端）ＸＸＸＴＴＸＸＸＴＴＸＸＸＴＴＴＸＸＸＴ（３’末端）のヌクレオチド鎖（これをＴ’_２０と呼ぶ。）を合成し、最後に化合物１４（エチニル基を有するホスホロアミダイド）を結合させた。これにより、Ｔ’_２０の５’末端にエチニル基が導入されたことになる。得られたオリゴヌクレオチドをＯＤＮ２と呼ぶ。ＯＤＮ２は、ＯＤＮ１よりも脂溶性が向上しており、細胞内への導入効率が向上すると考えられる。

ＯＤＮ２に対して、クリック反応により蛍光標識化を行った。ＯＤＮ２（１００ｎｍｏｌ）の溶液（５０μＬ）に、５０ｍＭのＣｕＳＯ_４と１００ｍＭのＴＢＴＡを含むメタノール溶液（２５μＬ）、及び１５０ｍＭのＬ－アスコルビン酸ナトリウム水溶液（２５μＬ）を加え、減圧留去することで一度溶液の液量を減らした。これに化合物１３（１０００ｎｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（２０μＬ）、メタノール（１６０μＬ）、ＴＨＦ（６０μＬ）及び純水（８０μＬ）を加え、撹拌した後、４８時間３７℃にて静置した。この反応溶液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）飽和水溶液（４００μＬ）及びアセトニトリル（１０００μＬ）を加え、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）によりＣｕ（Ｉ）を沈殿させ、上澄み液を回収した。ＨＰＬＣ分取カラムを使用し、目的物のピークを単離及び精製し、蛍光標識化ＯＤＮ２を得た。

ＣＯ_２インキュベーター内にて培養していたＨｅｌａ細胞を２４マルウェアプレートの２穴へと移し、カバーガラスの上で継代を行った。カバーガラスにＨｅｌａ細胞を接着させてインキュベートし、２日後、蛍光標識化ＯＤＮ２を用いた細胞内への輸送実験を行った。培地を吸出し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標、以下同様である。）で洗浄を行い、２穴のうち、片方は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを２００μＬ加え、もう片方には１０％ＰＢＳ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（２００μＬ）で溶解させたＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を加えた。ＮＥＭは、細胞内のＧＳＨをブロッキングし、本発明の保護基に含まれるＳ－Ｓ結合への反応性を弱める作用をもつ。すなわち、上記２穴のうち、片方は細胞内ＧＳＨが作用する状態にあり、もう片方はＧＳＨが作用しない状態にあることになる。３７℃インキュベーターで３０分間静置した後、溶液を吸い出し、それぞれの穴に蛍光標識化ＯＤＮ２（１０％ＰＢＳ／Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ溶液）を２００μＬずつ加えた。そのマルウェアプレートをＣＯ_２インキュベーターで１時間静置した後で、蛍光顕微鏡で観察し画像を得た。得られた画像を図５に示す。図５は、蛍光標識化ＯＤＮ２が細胞内に取り込まれたときの様子を示す蛍光顕微鏡画像である。

図５の左上画像は、細胞の位置を示す明視野の画像である。左下画像は、その蛍光画像である。細胞の位置に蛍光が観察されることがわかる。右下画像は、ＮＥＭで処理した細胞における蛍光画像である。ＮＥＭで処理された細胞では明確な蛍光が観察されなかったことから、細胞内のチオール（ＧＳＨ）によって保護基が除去され蛍光が発生していることが示された。

［蛍光標識化ＯＤＮ２の脱保護前後の紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトル変化］
上記手順で得た蛍光標識化ＯＤＮ２について、脱保護前の紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトル、並びに脱保護後の紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの観察を行った。紫外可視吸収スペクトル測定は、液温２３℃の２０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中で蛍光標識化ＯＤＮ２の濃度を１０μＭとして実施し、蛍光スペクトル測定は、液温３７℃の１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中で蛍光標識化ＯＤＮ２の濃度を５００ｎＭとし、励起光の波長を４９５ｎｍとして実施した。その結果を図６に示す。図６は、蛍光標識化ＯＤＮ２の脱保護前後の紫外可視吸収スペクトル及び蛍光スペクトル変化を示すチャートであり、図６（ａ）が紫外可視吸収スペクトル変化を示すチャートであり、図６（ｂ）が蛍光スペクトル変化を示すチャートである。なお、蛍光標識化ＯＤＮ２の脱保護前後の構造は、下記化学式に示す通りである。

図６（ａ）及び（ｂ）に示す通り、脱保護に伴い、５００ｎｍ付近に強い吸収が現れるとともに、５３０ｎｍ付近に強い蛍光が観察された。

［蛍光標識化ＯＤＮ２のＧＳＨ存在下における時間経過に対する蛍光変化］
上記手順で得た蛍光標識化ＯＤＮ２について、ＧＳＨの存在下で、時間経過に対する蛍光変化を観察した。蛍光スペクトル変化は、液温３７℃の１００ｍＭリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．４）中で蛍光標識化ＯＤＮ２の濃度を５００ｎＭとし、励起波長を４９５ｎｍ、蛍光の検出波長を５２０ｎｍとして、水溶液中のＧＳＨ濃度を０μＭ、１０μＭ、１．０ｍＭｍ及び１０ｍＭとしてそれぞれ測定した。その結果を図７に示す。図７は、蛍光標識化ＯＤＮ２のＧＳＨ存在下における時間経過に対する蛍光変化を示すチャートである。

図７に示す通り、ＧＳＨが添加された溶液では時間の経過とともに蛍光強度の増加が観察され、蛍光標識化ＯＤＮ２が細胞内物質であるＧＳＨの存在下で脱保護され、蛍光を発するようになることが理解できる。

Claims

下記一般式（１）で表す化合物。

（上記一般式（１）中、Ａは、細胞膜を通して細胞内へ取り込まれ得る生体物質又はその誘導体の構造を含む１価の基であり、ＦＬは、下記化学式（２）又は（３）で示す骨格をもつ蛍光ユニットであり、Ｌは、ＡとＦＬとを結合する２価の基であり、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、波線で表す結合は、前記化学式（２）又は（３）に含まれる窒素原子への結合であり、Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環であり、Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１であり、Ｒ^１は、一価の基であり、ｎは、１～３の整数である。）

（上記化学式（２）における、アミノ基、イミノ基及びカルボキシル基の１つに前記Ｌが結合し、アミノ基及びイミノ基の少なくとも１つに前記Ｘが１つ又は２つ結合し、上記化学式（３）における、２つのアミノ基の１つに前記Ｌが結合し、残りのアミノ基に前記Ｘが１つ又は２つ結合する。）
下記一般式（４）又は（５）で表す請求項１記載の化合物。

（上記一般式（４）及び（５）中、Ａ、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、前記一般式（１）におけるものと同じである。）
下記一般式（６）又は（７）で表す請求項１又は２記載の化合物。

（上記一般式（６）及び（７）中、Ａ、Ｌ、Ｘ及びＲは、前記一般式（１）におけるものと同じである。）
下記一般式（８）～（１０）のいずれかで表す請求項１～３のいずれか１項記載の化合物。

（上記一般式（８）及び（９）中、Ａ、Ｌ及びＲ^１は、前記一般式（１）におけるものと同じである。上記一般式（１０）中、Ａ及びＬは、前記一般式（１）におけるものと同じである。）
Ａがヌクレオチド鎖若しくはその類縁体又はペプチド鎖若しくはその類縁体である請求項１～４のいずれか１項記載の化合物。
下記一般式（１ａ）、（１ｂ）又は（１ｃ）で表す化合物を含む蛍光標識導入剤。

（上記一般式（１ａ）及び（１ｂ）中、ＦＬは、下記化学式（２）又は（３）で示す骨格をもつ蛍光ユニットであり、Ｌは、２価の基であり、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、波線で表す結合は、前記化学式（２）又は（３）に含まれる窒素原子への結合であり、Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環であり、Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１であり、Ｒ^１は、一価の基であり、ｎは、１～３の整数である。上記一般式（１ｃ）中、ＦＬは、下記化学式（２）又は（３）で示す骨格をもつ蛍光ユニットであり、Ａ環は単環でも複数の環が縮合した構造でもよい三重結合を備えた環構造であり、Ａ環が複数の環の縮合した構造の場合、ＬからＡ環への単結合は縮合しているどの環へ結合してもよく、Ｌは、２価の基であり、Ｘは、単結合又は－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、波線で表す結合は、前記化学式（２）又は（３）に含まれる窒素原子への結合であり、Ａｒは、パラ位又はオルト位に結合を有する２価の芳香環であり、Ｒは、ニトロ基又は－Ｓ－Ｓ－Ｒ^１であり、Ｒ^１は、一価の基であり、ｎは、１～３の整数である。）

（上記化学式（２）における、アミノ基、イミノ基及びカルボキシル基の１つに前記Ｌが結合し、アミノ基及びイミノ基の少なくとも１つに前記Ｘが１つ又は２つ結合し、上記化学式（３）における、２つのアミノ基の１つに前記Ｌが結合し、残りのアミノ基に前記Ｘが１つ又は２つ結合する。）
下記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（４ｃ）、（５ａ）、（５ｂ）又は（５ｃ）で表す請求項６記載の蛍光標識導入剤。

（上記一般式（４ａ）、（４ｂ）、（５ａ）及び（５ｂ）中、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、前記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（４ｃ）及び（５ｃ）中、Ａ環、Ｌ、Ｘ、Ａｒ及びＲは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。）
下記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（６ｃ）、（７ａ）、（７ｂ）又は（７ｃ）で表す請求項６又は７記載の蛍光標識導入剤。

（上記一般式（６ａ）、（６ｂ）、（７ａ）及び（７ｂ）中、Ｌ、Ｘ及びＲは、前記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（６ｃ）及び（７ｃ）中、Ａ環、Ｌ、Ｘ及びＲは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。）
下記一般式（８ａ）、（８ｂ）、（８ｃ）、（９ａ）、（９ｂ）、（９ｃ）、（１０ａ）、（１０ｂ）又は（１０ｃ）で表す請求項６～８のいずれか１項記載の蛍光標識導入剤。

（上記一般式（８ａ）、（８ｂ）、（９ａ）及び（９ｂ）中、Ｌ及びＲ^１は、前記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（１０ａ）及び（１０ｂ）中、Ｌは、前記一般式（１ａ）におけるものと同じである。上記一般式（８ｃ）及び（９ｃ）中、Ａ環、Ｌ及びＲ^１は、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。上記一般式（１０ｃ）中、Ａ環及びＬは、前記一般式（１ｃ）におけるものと同じである。）
標識化する分子にアルキニル基又はアルキニレン基を導入した後、その分子に請求項６～９のいずれか１項記載の化合物のうちアジド基を有する化合物を含む蛍光標識導入剤を反応させることを特徴とする蛍光標識導入方法。
標識化する分子にアジド基を導入した後、その分子に請求項６～９のいずれか１項記載の化合物のうちアルキニル基又はＡ環を有する化合物を含む蛍光標識導入剤を反応させることを特徴とする蛍光標識導入方法。