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JP7376208B2 - 抗原特異的製剤の投与による免疫疾患の治療 - Google Patents

抗原特異的製剤の投与による免疫疾患の治療 Download PDF

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Description

本発明は医学及び免疫学の分野に関する。本発明はそれぞれの免疫疾患適応症のために最適化された抗原、寛容化剤(tolerizing agent)、及び粘膜接着性担体の組み合わせからなる製剤の投与による免疫介在性障害、たとえば自己免疫疾患及びアレルギー疾患の治療に関する。
免疫系は自己と非自己とを識別する任務を有している。呼吸器、胃腸管、尿生殖器官に沿って存在する粘膜免疫系には、食物、空気伝播性抗原、又は共生細菌叢等の多数の細菌及び無害の抗原と共存するというさらなる負荷が強いられる。粘膜免疫系の重要な特徴は、病原体を効果的に排除する能力を保ちながら、これらの抗原に対して寛容であることができるという点にある。注射によるものでも傷害によるものでも、全身的に抗原が導入されると、炎症細胞が局所的に浸潤し、特異的免疫グロブリンが産生される。これとは対照的に、口腔、胃腸管、及び尿生殖器官等の粘膜表面に導入された抗原は、これらの抗原に対する免疫応答の能動的阻害を全身的に誘起する。口腔及び胃腸管の粘膜表面を通る抗原の投与によるこれらの制御された応答の特異的誘導は、経口寛容として知られている。抗原の経口投与によって全身的な非応答性をもたらすことができ、これは望ましくない副作用を有する免疫抑制性の医学的発明(ステロイド等)に対する魅力的な代替策である。粘膜を介する寛容誘導は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患に対する疾患改変治療戦略として提案されてきた。
本発明の背景に関する以下の考察は単に読者が本発明を理解することを助けるために提供され、本発明の先行技術を記載し又は構成することを認めるものではない。
自己免疫疾患及びアレルギー疾患又は抗薬剤抗体(ADA)等の免疫介在障害は患者及び社会に対して極めて大きな負荷を与えるものであり、生活の質を低下させ、甚大なコストをもたらす。さらに、許容できる副作用がないか社会的に妥当な適切な治療は存在しない。自己免疫疾患に対する現在の治療は主として一時的なものであり、一般には免疫抑制又は抗炎症である。ステロイド又はNSAIDによる治療により、多くの自己免疫疾患の炎症症状が抑えられる。静脈内免疫グロブリン治療はいくつかの自己免疫疾患に用いられている。TNFαアンタゴニストであるエタネルセプト等のより特異的な免疫調節療法がリウマチ性関節炎(RA)の治療に有用であることが示されてきた。それにも関わらず、これらの免疫療法には感染に対する感受性の増大等の有害作用の危険の増大が伴っている。グルテン(グルテニン及びグリアジン)によって誘発される慢性小腸炎症という特徴を有する自己免疫様免疫介在障害であるセリアック病は、コムギ、ライムギ、又はオオムギを含む食物を生涯にわたって摂取できないという社会的に制限された食事によってしか、効果的に治療することができない。厳密にグルテンを含まない食事によって腸は治癒するが、グルテンに対する不寛容は永久的である。
したがって、抗原特異的な経口寛容療法の誘導は、魅力的な治療アプローチである。経口寛容は1911年に初めて記述されたが、関連する機構に研究者が対処し始めたのは1970年代の後半以降であった(Mayer、Shao、Nat Rev Immunol.2004,4:407-419)。経口寛容の発達については抗原特異的T細胞の欠失から免疫の逸脱及びアネルギーの誘導、またTregによる抑制に至るいくつかの機構が提案されてきた(Mucidaら、J Clin Invest.2005,115:1923-1933)。治療及び予防への適用のための、標的を有しより効率的な分子の送達が、医薬産業においては優先される。効果的な戦略によれば、所望の作用部位に分子を集中させることによって、必要な用量が減少し、安全性が増大し、効率が改善される。薬剤及びワクチンの送達に粘膜経路を用いることによって、注射に比べて運搬上の及び生物学的ないくつかの利点が提供される。舌下腺又は頬の経路等の口腔粘膜送達は、投与が容易であるという効果により、小児のように錠剤を飲み込むことが困難な個人に対して極めて適切になるので、特に魅力的である。さらに、免疫療法に関しては、小児の発達中の免疫系を標的とすることの予防効果には強い科学的論拠があり、口腔粘膜経路を介する免疫療法はこれを可能にすると考えられる。
アレルゲンの舌下腺免疫療法(SLIT)に関しては、経口免疫系の生理学の我々の理解について最近の数年間にかなりの進歩が達成された。この強化された科学的背景によって、抗原特異的寛容を誘導する舌下腺経路の妥当性が確認され、さらに、樹状細胞(DC)及びランゲルハンス細胞(oCL)等の口腔抗原提示細胞を標的としてアレルゲン特異的制御免疫機構をよりよく動員することの利点が注目された。SLITがアレルギーの安全な口腔粘膜治療であることは現在立証され、これは皮下免疫療法(SCIT)の有効な代替手段であることが現在広く認められており、20年を超える臨床研究によって、長期のアレルゲン特異的寛容及び疾患改変効果を誘導する舌下腺経路の妥当性が確認された。SLITの優れた安全性プロファイルは、口腔組織が肥満細胞及び好酸球等の炎症促進性細胞並びにその他の危険なシグナルをほとんど含まず、抗原の捕捉、処理及び誘導されたペプチドの未処置T細胞及び口腔APCへの引き続く提示に関与する抗原提示細胞(APC)が寛容原性の表現型を呈示するという事実によって説明することができる。結果として、口腔APCによって開始される抗原への初期の応答は、たとえば静脈内、皮内、又は真皮内の経路を介して投与した際の状況とは異なり、全身性炎症応答を伴うことなく抗原全体をそのまま投与することが可能になる寛容となる。しかし、効率及び、3年にわたる治療で毎日の投与が必要で応諾率及び順守率が低くなるという課題がまだ残っている。3年の治療を必要とする低い効率については、口腔粘膜におけるドロップ又は錠剤として製剤化した場合の治療薬の保持時間が短いことで説明される。Allamら(J Allergy Clin Immunol.2010,126:638-645)は、ヒト口腔粘膜において、口腔粘膜ランゲルハンス細胞(oLC)による用量依存性且つ時間依存性のアレルゲンの結合を実証し、用量強度がAITの効率を決定することを示した。
発酵食品及び腸内有益菌(probiotics)に用いられる無害の細菌は抗原特異的寛容原特性を有することが示されており、したがって抗原特異的口腔粘膜免疫療法の効率を向上させる寛容化剤として用いることができる(Huibregtseら、Gastroenterolgy 2007,133:517-528;Huibregtseら、J.Immunology 2009,183:2390-2396;Takiishiら、J Clin Invest.2012,122:1717-1725;Hsiao,K-Cら、Lancet Child&Adolescent 2017,1:97-105)。その例としては、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)及びラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)等の食物乳酸菌、又は腸内有益菌である大腸菌ニスル(Escherichi coli Nissle)が挙げられる。しかし、現在のアプローチでは生きた細菌を用いており、これらは、ある場合には遺伝子改変されてインサイチュで目的の抗原を産生する。そのようなアプローチには、実際上本質的なこともあり、又は規制上の障害となることもある、いくつかの不利な点が伴っている。実際上の課題としては、粘膜組織中の標的細胞に到達するまで、製剤中及び投与の間に細菌の生存又は生存可能性を保つことの必要性、組み換え細菌による抗原の発現に対する制限、宿主である細菌のプロテアーゼによる抗原の分解、抗原特異的治療ごとの新規なマスター細胞バンクの必要性が挙げられる。規制上の課題としては、正確な抗原用量を定義することの困難さ、組み換えDNAの存在、組み換え細菌の封じ込めが挙げられる。たとえば単に生存している非組み換え細菌を抗原と混合するだけでこれらの実際上及び規制上の課題が克服されたとしても、そのような製剤の口腔内での保持時間が短いことは依然として治療の効率を制限し、長期の治療計画が必要となる。したがって、応諾率や順守率が低いことは依然として課題である。
したがって、一般に抗原の寛容を効果的に誘導し、特に口腔粘膜送達経路を通してこれを効果的に行うという問題が当技術に残っている。
驚くべきことに、たとえばアレルギー性鼻炎及びアレルギー性喘息、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、シェーグレン病、視神経脊髄炎、食物アレルギー、又はセリアック病に罹患した患者に免疫応答を惹起する抗原が、ヒドロゲル又は電気紡糸(electrospun)された繊維の粘膜接着性担体の中で食品グレードの乳酸菌又は腸内有益菌に由来する非生存細菌粒子と組み合わされ、口腔粘膜経路を介して送達されると、短期の治療で抗原特異的且つ継続する免疫寛容を誘導したことが見出された。前記粘膜接着性ヒドロゲル又は電気紡糸繊維の中に組み込まれた非生存細菌粒子を含む製剤を用いてそのような抗原を口腔粘膜投与することによって、薬理活性物質の放出を遅延させ、提示を良好にし、曝露時間を延長することが可能になり、前記抗原単独又は前記細菌粒子との組み合わせのみの口腔粘膜投与と比較して抗原特異的免疫応答の顕著に良好な抑制が得られることが観察された。結果として、単に非生存細菌粒子との製剤としてそのような抗原を口腔粘膜投与することにより、前記抗原単独での口腔粘膜投与と比較して抗原特異的免疫応答の顕著に良好な抑制が得られることが観察された。
本発明の実施形態によって、抗原又は細菌粒子又は粘膜接着性ヒドロゲル/電気紡糸繊維単独による単一療法よりも高い効率を有する経口寛容が誘導できることを実証する。本発明による抗原組成物を投与すると、抗原特異的制御性T細胞のインビボ及びエクスビボにおける活性化が強く促進された。具体的には、DQ2及び/又はDQ8介在T細胞応答において免疫優勢であるグリアジン又はグリアジン由来ペプチドを、ヒドロゲル/電気紡糸繊維の粘膜接着性担体と細菌粒子との組み合わせで口腔粘膜投与することによって、局所及び全身におけるDQ2及びDQ8拘束性T細胞応答の抑制が誘導される。治療によって脾細胞及びリンパ節細胞の増殖能力が抗原特異的に低減し、これはIL-10及びTGF-βの産生に強く依存し、Foxp3+制御性T細胞の顕著な誘導と関連していた。粘膜接着性ヒドロゲル/電気紡糸繊維担体中の抗原製剤細菌粒子というこのアプローチは、過敏性が成立しているという設定においてさえも経口寛容を増強する能力を有しているので、これはセリアック病及びその他の自己免疫疾患並びに/又はアレルギー疾患の治療に応用することができる。本発明の有効性は自己免疫疾患及びアレルギー疾患のモデル、並びに生物学的治療の免疫不活化に関しても実証された。
本開示を通して、種々の出版物、特許、及び特許公開明細書が、確認引用によって参照される。これらの出版物、特許、及び特許公開明細書の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
一般的手法
本発明の実施は他に示さない限り、有機化学、薬学、分子生物学(組み換え手法を含む)、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来手法を採用しており、これらは当技術の技能に含まれる。これらの手法は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版(Sambrookら,1989);「Oligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait編、1984);「Animal Cell Culture」 (R.I.Freshney編,1987);シリーズ「Methods in Enzymology」(Academic Press,Inc.);「Handbook of Experimental Immunology」(D.M.Weir、C.C.Blackwell編);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M. Miller、M.P.Calos編、1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら編,1987,及び定期出版物)「Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994);及び「Current Protocols in Immunology」(J.E.Coliganら編、1991)等の文献に詳しく解説されている。
定義
本明細書で用いる場合、ある用語は以下に定義する意味を有し得る。本明細書及び特許請求の範囲で用いる場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈によって明白に他が指示されない限り、複数の参照を含む。たとえば、用語「細胞」は複数の細胞及びその混合物を含む。同様に、本明細書に記載する治療又は医薬の調製のための「化合物」の使用は、文脈によって明白に他が指示されない限り、そのような治療又は調製のための本発明の1つ又は複数の化合物を用いることを意図している。
本明細書で用いる場合、用語「含む」は、組成物又は方法が言及した要素を含むが、他を除外しないことを意味することを意図している。組成物及び方法を定義するために用いる場合、「本質的に~からなる」は、その組み合わせに本質的な意義を与える他の要素を除外することを意味する。したがって、本明細書に定義した要素から本質的になる組成物は、単離及び精製の方法に由来する微量の夾雑物及びリン酸緩衝食塩液、保存剤、その他の薬学的に許容される担体を除外しない。「~からなる」は、他の成分及び本発明の組成物を投与するための実質的な方法ステップの微量を超える要素を除外することを意味している。これらの接続用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
発明
粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲル中に細菌粒子とともに提示され製剤化された免疫優勢抗原の口腔粘膜投与によって局所及び全身のT細胞の応答の優れた抑制が誘導されることを実証する。治療によって脾細胞及びリンパ節細胞の増殖能力が抗原特異的に低減し、これはIL-10及びTGF-βの産生に強く依存し、Foxp3+制御性T細胞の顕著な誘導と関連していた。この抗原製剤細菌粒子というこのアプローチは、過敏性が成立しているという設定においてさえも経口寛容を増強する能力を有している。したがって、これはセリアック病及びその他の自己免疫疾患並びに/又はアレルギー疾患の治療に応用することができる。本発明の有効性は自己免疫疾患及びアレルギー疾患の動物モデル、並びにヒト免疫障害由来のエクスビボモデルに関しても実証された。
本発明の目的は、粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲルの中に組み込まれた「抗原含有物質」と以下に称する、細菌粒子と組み合わせた、又は組み合わせていない、少なくとも1つの抗原、好ましくは精製された抗原、又は1つ又は複数の抗原を含む生物学的物質の投与のための調製物によって達成される。このようにして、そのような抗原含有物質の全体の溶解性及び溶解速度は、その生体利用性を増大させるための当技術で公知の手法によって最適化される。その効果は、それによって抗原含有物質が、たとえば国際公開第2014/131376号に開示されているナノ繊維又はたとえば国際公開第2015/189212号に開示されている電気水力学的に得られる繊維の材料中に直接組み込まれ、及び国際公開第2012/097763号及び国際公開第2016/051159号に開示されている粘膜接着性パッチを含むがそれに限定されない粘膜接着性パッチに製剤化されるバリアントにおいて最も顕著である。好ましい実施形態では、粘膜接着性パッチは国際公開第2016/051159号に開示されているパッチである。本発明の別の実施形態では、抗原含有物質は、たとえば米国特許出願公開第2015/125495号及び国際公開第2016/079246号等の生体接着フィルムに製剤化される。本発明のさらなる実施形態では、抗原含有物質は、たとえば「Advances in Physicochemical Properties of Biopolymers」Part 2(Mansuelli、Renard編,2017,eISBN:978-1-68108-544-9)に開示されているヒドロゲルマトリックス及び好ましくは生分解性粘膜接着性ヒドロゲルに製剤化される。
粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲルの層を製造するための最も好適な生物学的親和性材料は、生物学的に親和性のポリマー、特にポリビニルアルコール(PVA)、ポリラクチド(PLA)、ポリラクチド-co-グリコリド(PLGA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリウレタン(PUR)、ポリアクリル酸(PAA)、それらのコポリマー、たとえばヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)等のセルロース誘導体、ポリエチレンオキシド(PEO)、ポリエチレングリコール/ポリビニルカプロラクタム/ポリビニルアセテートコポリマー、絹フィブロイン、キトサン、アルギネート、及びヒアルロン酸の誘導体の群からのポリマー、それらの混合物、並びに多数の重合可能なモノマー、これらのうち少なくとも2つの混合物である。層からの抗原含有物質の放出を促進するため、生分解性材料から層を作り出すことが可能である。このバリアントの利点は、抗原含有物質の放出の後又はその間にレシピエントの体内で層が分解し、そのため層をさらに除去する必要がないということである。
一実施形態では、ポリマー層は層の可塑性を向上させるためのポリオール、フタレート、又はシトレート等の可塑剤、及び/又はアセチルシステイン等の吸収促進剤、粒子の浸透を促進するための界面活性物質、キレート化物質、脂肪酸、ポリオール、デキストランサルフェート、スルホキシド、Azone(登録商標)、(リソ)ホスファチジルコリン、メトキシサリシレート、メントール、アプロトニン、デキストランサルフェート、シクロデキストリン、23-ラウリルエーテルを含んでもよい。
第1の態様では、本発明は対象における抗原に対する免疫寛容を誘導する使用のための非生存細菌粒子及び抗原を含む粘膜接着性担体に関し、粘膜接着性担体は対象に経粘膜投与される。粘膜接着性担体の経粘膜投与は、粘膜接着性担体を対象の粘液膜(mucous membrane)又は粘膜(mucosa)に接触させるステップを含むと理解される。免疫寛容の誘導は、既に存在する(弱すぎる)寛容を増大させ又は強化するステップを含むと理解されることが本明細書でさらに理解される。
好ましくは、本発明は細菌粒子-粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲル製剤による抗原の口腔粘膜投与を含む、前記抗原に対する免疫寛容を誘導する方法に関する。
用語「免疫寛容」、「免疫学的寛容」、「寛容」、又は「脱感作」は、本明細書では抗原に対する対象の免疫学的反応性を低減することによって、感作された又は過敏な対象を、対象がそれに対して寛容化される所与の抗原に対して低感受性に、非感受性に、又は非反応性にすることと定義される。免疫寛容は、たとえば粘膜表面を本明細書に定義する寛容誘導性抗原-BLP含有粘膜接着性担体組成物に曝露することによって生じ得る。高用量及び低用量の抗原の経粘膜投与によって免疫寛容がもたらされ、続いて抗原を全身投与した際の免疫応答が低減される。免疫寛容には少なくとも2つの機構が存在すると考えられる。高用量の抗原に対する寛容はTh1及びTh2細胞の不活化又はクローナルな欠失によって起こるようである。対照的に、低用量の抗原に対する寛容は、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-10(IL-10)、及びTGF-β等の抑制性サイトカインを産生するTreg細胞の刺激によって介在されるバイスタンダー免疫抑制をもたらす。Anderson、Jabri(Current Opinion in Immunology 2013,25:410-417)及びRayner、Isaacs(Seminars in Arthritis&Rheumatism(2018),doi:https://doi.org/10.1016/j.semarthrit.2018.09.008)を参照されたい。
好ましくは、本発明は患者の免疫応答関連疾患を治療する経口粘膜投与のための医薬、医療用食品、又は栄養食品の調製のための抗原の細菌粒子-粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲル製剤の使用に関し、前記抗原は前記患者の口腔粘膜組織で放出される。
好ましくは、前記抗原は細菌粒子-粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲルの中に製剤化された抗原によって送達される。
好ましくは、本発明は免疫寛容を誘導する口腔粘膜投与のための医薬の調製のために細菌粒子とともに製剤化された抗原の使用に関する。
好ましくは、前記免疫寛容は患者において誘導される。前記患者は好ましくはヒト又は動物である。前記動物は好ましくは哺乳類であり、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びウマからなる群から選択される。好ましくは、前記哺乳類はヒトである。好ましくは、前記免疫寛容は粘膜寛容である。
粘膜
本明細書において用いる粘膜は口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、肺粘膜、及び鼻粘膜等の任意の粘膜であってもよい。
本出願を通して用いる口腔粘膜投与は、口腔粘膜への標的送達を包含する。口腔粘膜投与には頬側、舌下腺、及び歯茎の送達経路が含まれる。好ましくは、前記口腔粘膜送達は頬側又は歯茎投与であり、前記寛容は経口寛容である。
本出願を通して本明細書で用いる口腔粘膜寛容は、動物が口腔粘膜経路を介して抗原に曝露された後での、前記動物(ヒトを含む)の前記抗原に対する特異的免疫応答の阻害である。好ましくは、前記粘膜寛容は全身的寛容である。
本発明は本明細書に記載した方法又は使用に関し、前記免疫寛容の誘導は前記誘導の前と比較して少なくとも1.5倍、好ましくは2倍、より好ましくは3倍又はそれ以上有効である。或いは、前記抗原は前記誘導の前と比較して少なくとも1.5倍、2倍、3倍又はそれ以上許容される。免疫寛容の誘導は当技術で公知の方法によって測定することができる。好ましくは、前記免疫寛容の誘導は前記動物におけるサイトカインレベルの調節によって測定することができる。したがって、調節はサイトカインレベルの増大であってもよく、たとえば前記サイトカインレベル、たとえばIL-10又はTGF-βの増大は前記誘導の前と比較して少なくとも1.5倍、2倍、3倍又はそれ以上である。或いは、前記調節は特定のサイトカインレベル、たとえばIL-12、IL-17、及びIFN-γの減少であり、たとえば前記サイトカインレベルの減少は前記誘導の前と比較して少なくとも1.5倍、2倍、3倍又はそれ以上である。調節されるサイトカインは任意の関連するサイトカインから選択してもよく、好ましくは前記サイトカインはIL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、MCP-1、TGF-β、RANK-L、及びFlt3Lからなる群から選択される。
寛容化化合物
本発明において、非生存細菌粒子は免疫系を刺激して抗原特異的寛容原性免疫応答を強化し、同時に意図した部位、たとえば口腔粘膜に抗原を送達することができる。
本発明による非生存細菌粒子を含む寛容原性組成物は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第02/101026号に開示された技術を採用して調製し、免疫原性、有効性、及び安全性について試験することができる。
好ましくは、本発明による使用のための非生存細菌粒子は、腸内有益菌に由来する。より好ましくは、非生存細菌粒子は(プロビオティック)ラクトバチルス、ラクトコッカス、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)又は大腸菌ニスルに由来する。本発明による使用のための非生存細菌粒子の大部分は、ラクトコッカス・ラクティスMG1363、ラクトバチルス・ラムノサスGG、及び大腸菌ニスル1917のうちの少なくとも1つに由来する。
抗原含有製剤は、たとえばチーズの製造等の食品工業で伝統的に用いられる安全な細菌である不活化されたラクトコッカス・ラクティス菌に由来する粒子に基づいてもよい(粒子は別の場所ではグラム陽性エンハンサーマトリックス又は細菌様粒子とも記され、本明細書では「BLP」と称する)。BLPはトール様受容体2(TLR2、Ramirezら、Mucosal Immunology 2010,3:159-171)を通して先天性の免疫系を活性化する。TLR2はmyd88に対する下流効果を発揮する。TLR2は微生物群に誘導されるmyd88の転写の下方制御に重要であることが最近示された(Kochら、Nature Comm 2018,9:4099)。myd88の転写は炎症性シグナル伝達の制御に関連している。したがって、乳酸菌、特にBLP等の片利共生細菌は一般に好適な寛容原性化合物を構成する可能性がある。BLPはL.ラクティス細菌又は他の任意のグラム陽性細菌の酸性熱処理によって得られ、その結果、主としてペプチドグリカン表面からなり、組み換えDNAを有しない非生存細菌粒子が生じる。BLPの調製は国際公開第02/101026号に開示されている。本発明の抗原性ポリペプチドは単純にBLPと混合してもよく、又はBLPの上に負荷してもよい。この方法は国際公開第02/101026号及び国際公開第2012/128628号に開示されたProtan技術と称される非共有カップリング技術を採用している。得られる抗原会合BLP(BLPと混合された、又はBLPに結合した抗原)は、注射の必要がなく口腔又は胃腸管の他の部分の粘膜層を介してヒトに送達される治療用製剤(たとえば粘膜接着性パッチ、粘膜接着性ゲル、カプセル、錠剤、又は液体)の一部を構成する。好ましくは、BLP及び抗原を含む治療用製剤は、粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲルを用いて口腔の粘膜層を介してヒトに送達される。さらにより好ましくは、BLP及び抗原を含む治療用製剤は、細胞毒性Tリンパ球抗原4-免疫グロブリンG(Maaziら、2013,Clin Exp Immunol 172:113-120)、ゼブラリン(国際公開第2008/147283号)、レチノイン酸(Coombesら、2007,J Exp Med 204:1757-1764)、ラパマイシン(Maldonado、von Adrian 2010,Adv Immunol 108:111-165)、ビタミンD3(Taherら、2008,J Immunol 180:5211-5221)、及び/又はD-マンノース(Zhangら、2017,Nature Med 23:1036-1047)等の当技術で公知の追加的な寛容化化合物を含む。
本発明の別の実施形態では、非生存細菌粒子を含む寛容原性組成物は、空の細菌エンベロープ、即ちいわゆる細菌のゴースト(BG)から調製してもよい。抗原含有製剤は腸内有益菌の医薬製品Mutaflor(登録商標)に用いられる安全な細菌である大腸菌ニスル1917株又は他の任意の安全なグラム陰性細菌に由来するBGに基づいてもよい。BGは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第0053163号及び国際公開第2015/124717号に開示されている細胞膜の部分的溶解を惹起する遺伝子の制御された非相同発現によって産生される。そのような溶解性遺伝子の例にはバクテリオファージPhiX174の遺伝子Eがあり、これはグラム陰性細菌の細胞膜複合体に挿入され、オリゴマー化されると内膜と外膜を通る膜貫通トンネル構造の形成をもたらすポリペプチドをコードする。このトンネル構造の内径は溶解条件により40~200nm又は500~1000nmになり得る。細胞の細胞質性物質はこのトンネルを通って放出され、その後に元の形態を有する空の細胞エンベロープを残し、空の細胞エンベロープに抗原を負荷することができるので、これが送達ビヒクルとしても働くことができる(国際公開第0053163号、国際公開第0154672号、国際公開第2005/011713号)。本発明の抗原性ポリペプチドは単純にBGと混合してもよく、空の細胞エンベロープに負荷してもよく、又はバクテリオファージリシンと共発現して当技術で公知の手法によって細胞エンベロープに固定してもよい(国際公開第9906567号、国際公開第0044878号)。さらに、BGはキメラE-L溶解遺伝子を用いてグラム陽性細菌から調製することもできる(米国特許第5075223号)。
BGは、抗原又は抗原含有物質の担体又は標的ビヒクルとして極めて好適である。BGのみが所望の抗原を含んでいるので、高度の負荷及びしたがって高度の抗原の寛容化効率が達成され得る。BGには担体としての選択肢もあるが、抗原とBGを単純に混合するだけでも寛容化効果は達成することができる。全体として、細菌ゴーストは組み換えDNAをもはや含まない非生存細菌粒子であるので、安全な寛容化材料である(国際公開第03/006630号、国際公開第2009/090093号)。得られる抗原会合BG(BGと混合され、BGに負荷され、又はBGに結合した抗原)は、注射の必要がなく口腔又は胃腸管の他の部分の粘膜層を介してヒトに送達される治療用製剤(たとえば粘膜接着性パッチ、粘膜接着性ゲル、カプセル、錠剤、又は液体)の一部を構成する。好ましくは、BG及び抗原を含む治療用製剤は、粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲルを用いて口腔の粘膜層を介してヒトに送達される。さらにより好ましくは、BG及び抗原を含む治療用製剤は、細胞毒性Tリンパ球抗原4-免疫グロブリンG(Maaziら、2013,Clin Exp Immunol 172:113-120)、ゼブラリン(国際公開第2008/147283号)、レチノイン酸(Coombesら、2007,J Exp Med 204:1757-1764)、ラパマイシン(Maldonado、von Adrian 2010,Adv Immunol 108:111-165)、ビタミンD3(Taherら、2008,J Immunol 180:5211-5221)、及び/又はD-マンノース(Zhangら、2017,Nature Med 23:1036-1047)等の当技術で公知の追加的な寛容化化合物を含む。
本発明のさらなる実施形態では、非生存細菌粒子を含む寛容原性組成物は、化学滅菌された非組み換え食品グレードの乳酸菌又は腸内有益菌の培養から調製してもよい。抗原含有製剤は、それだけに限らないがラクトコッカス、ラクトバチルス、又は大腸菌等の化学滅菌された食品グレードのグラム陽性及びグラム陰性細菌に由来する非生存粒子に基づくものでもよい。本発明の好ましい実施形態では、化学滅菌されたラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ラムノサス、又は大腸菌ニスル1917が用いられる。細菌の化学滅菌は当技術で公知である。本発明の好ましい実施形態では、化学滅菌はアルコール溶液の使用によって達成される。アルコール溶液の例としてはエタノール及びイソプロピルアルコールがあり、特に60%~90%(v/v)のアルコールと10~40%(v/v)の精製水の溶液が細菌に対する急速抗微生物剤である。完全な滅菌を達成するためには、細菌とアルコール溶液との接触時間を12時間以上とすることが好ましい。
別の好ましい実施形態では、化学滅菌はβプロピオラクトンの使用によって達成される。用いられた方法では、βプロピオラクトンは好ましくは最終濃度0.01%~0.1%(v/v)、より好ましくは0.025%~0.5%(v/v)で添加される。βプロピオラクトンは1つ又は複数のステップ、たとえば2回の連続したステップで調製物に添加してもよく、2つの部分は好ましくは等量であり、第2の部分は約15~45分、たとえば約30分で添加される。βプロピオラクトンの添加は好ましくは液体で行う。蒸気若しくはエアロゾル又はその他の形態での添加も可能である。βプロピオラクトンによる細菌滅菌の好ましい態様は、国際公開第2009/090093号に記載されているようにインキュベーション時間10~60分、より好ましくは15~45分、さらにより好ましくは25~35分である。
さらに、化学滅菌プロセスの間の好適なインキュベーション温度は2℃~55℃、より好ましくは20℃~40℃である。アルコール又はβプロピオラクトンは、精製水又はpHが6~8、より好ましくはpHが6.5~7.5の薬学的に許容される中性の緩衝液によって徹底的に洗浄することにより、不活化された細菌粒子から無菌的に除去される。細菌粒子の洗浄は、滅菌剤を効率的に除去するため、インキュベーション体積の少なくとも10倍で行う。
得られる化学的に不活化された細菌粒子は食品グレード起源であり、生存していないので、安全な寛容化材料である。本発明によれば、抗原は化学的に不活化された細菌粒子と混合され、注射の必要がなく口腔又は胃腸管の他の部分の粘膜層を介してヒトに送達される治療用製剤(たとえば粘膜接着性パッチ、粘膜接着性ゲル、カプセル、錠剤、又は液体)の一部を構成する。好ましくは、化学的に不活化された細菌粒子及び抗原を含む治療用製剤は、粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲルを用いて口腔の粘膜層を介してヒトに送達される。さらにより好ましくは、化学的に不活化された細菌粒子及び抗原を含む治療用製剤は、細胞毒性Tリンパ球抗原4-免疫グロブリンG(Maaziら、2013,Clin Exp Immunol 172:113-120)、ゼブラリン(国際公開第2008/147283号)、レチノイン酸(Coombesら、2007,J Exp Med 204:1757-1764)、ラパマイシン(Maldonado、von Adrian 2010,Adv Immunol 108:111-165)、ビタミンD3(Taherら、2008,J Immunol 180:5211-5221)、及び/又はD-マンノース(Zhangら、2017,Nature Med 23:1036-1047)等の当技術で公知の追加的な寛容化化合物を含む。
抗原
抗原をコードする配列は任意の天然源から得ることができ、及び/又は公知のDNA合成手法を用いて合成で調製することができる。次いで抗原をコードする配列を(たとえば)好適な発現ベクターに組み込み、これを用いて意図した宿主にトランスフォーム又はトランスフェクトする。こうして得られた組み換え宿主細胞を次に培養し、単離された抗原をそこで用いて、任意選択でさらなる精製及び/又は凍結乾燥等の処理ステップの後で、治療用組成物を製剤化し、粉末を形成することができる。任意選択で、組み換え宿主細胞細菌を用いてBGを産生するが、その場合には抗原はBGの一部を構成し、タンパク質の精製ステップは必要ない。しかしその代わりに、目的の抗原を含むBGを用いて直接治療用組成物を製剤化する。抗原は公知のタンパク質化学手法を用いて産生することもできる。さらに、抗原は、花粉、グルテン、ハウスダストダニ、ネコの唾液、カバノキ、又はピーナツ等の抽出物から元の抗原全体又は部分抗原として得ることができる。
抗原は当業者には既知の任意の抗原であってよい。本出願を通して本明細書で用いる抗原は、好ましくは動物の体内に導入した際に免疫応答を誘発する任意の物質であり、前記免疫応答はT細胞介在応答及び/又はB細胞介在応答であってよい。抗原はT細胞エピトープ及び/又はB細胞エピトープを含んでよい。前記抗原が産生されるという条件で、抗原の長さは特に限定されない。本発明の好ましい実施形態では、抗原は元の抗原全体である。抗原はタンパク質又はその一部、たとえばポリペプチド又はペプチドであってよい。本発明の抗原には直線状の及び/又はコンフォメーショナルなエピトープが含まれる。T細胞介在応答にはTh1、Th2、及び/又はTh17応答が包含される。抗原は、それだけに限らないがアレルゲン(食物アレルゲンを含む)、同種抗原、自己抗原、及び免疫応答を誘導する治療用分子又は抗原等の任意の抗原であってよい。好ましくは、前記抗原は免疫応答関連疾患の誘導に関与している。さらにより好ましくは、前記抗原はアレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、食物アレルギー、セリアック病、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎、移植片対宿主疾患、又は抗薬剤抗体(ADA)の進行の誘導に関与している。本発明の一部としての抗原の例には、それだけに限らないが、グリアジン、ホルデイン、Der p1、Der p2、Der p2.1、Fel d1、pINS、GAD65、InsB9-23、MBP、Dsg3、アクアポリン4、又はIA2が含まれる。本発明の一部としてのより広範囲の抗原のリストが表8にある。
本発明者らは、本発明の細菌粒子と組み合わせた免疫優勢な抗原の粘膜接着性担体を介する送達によって全身性炎症性T細胞応答が抑制されること、並びに顕著な寛容原効果の誘導にはそのような抗原の製剤及び送達が必要且つ十分であることを観察した。
制御性T細胞(Treg)は経口寛容の誘導及び維持に重要な役割を果たしている。Tregの誘導は、いくつかの自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び炎症性疾患の免疫療法の主要な目的である。抗原特異的抑制細胞の治療用誘導のための現在の戦略は顕著な難関に直面しており、通常、適切な数の制御細胞を単離し、取り扱い、及び移送するために困難な手法を必要としている。本発明の細菌粒子-抗原粘膜接着性担体送達システムは、これらの問題を回避し、抗原特異的Tregを効果的に誘導する。本発明において、粘膜免疫系を低用量の抗原に曝露することによって、Tregの誘導を達成できることが実証された。低用量の抗原への曝露は、好ましくは連続した曝露である。したがって、本発明はTreg細胞、好ましくはCD4CD25、CD4CD25、及びCD8Treg細胞を誘導し及び/又は増殖させる抗原に関する。
本発明において、本発明による抗原によって誘導され及び/又は増殖したTreg細胞はTGF-β及び/又はIL-10に依存する機構によって機能することがさらに実証された。TGF-βが経口寛容並びに末梢で誘導されたTregの発達に重要な役割を果たしているという証拠が以前に提示されている。したがって、本発明は内因性TGF-β及び/又はIL-10の発現を刺激する免疫優勢な抗原を提供する。
さらに、抗原特異的TGF-β産生Th3細胞が末梢において抗原特異的Foxp3制御性細胞の分化を加速することが示された。さらに、末梢のCD4CD25T細胞のCD25、CD45RB-/lowサプレッサー細胞へのTGF-β依存性変換が報告されている。CTBコンジュゲートAgによって誘導された経口寛容はFoxp3CD25の両方及びFoxp3とFoxp3CD25CD4の両方の制御性T細胞の産生によるTGF-βの増加と関連していることが示された。これらのデータは、経口寛容の誘導及び維持におけるFoxp3「適応」Tregの重要な役割を示唆している。顕著な粘膜Foxp3誘導も示す。さらに、細菌粒子単独ではGALTの中でこのFoxp3の上方制御を誘導することはできないので、「粘膜」誘導制御性T細胞は抗原特異的である傾向がある。したがって、本発明は好ましくはFoxp3Treg細胞に関する。
本発明は、本発明の抗原によって誘導され及び/又は増殖したTreg細胞が、特に脾臓及び二次リンパ節細胞において炎症を低減することをさらに実証した。さらに、IFN-γ及びIL-12の産生が低減した。したがって、本発明は、内因性IFN-γ及び/又はIL-12の産生を低減し、及び/又は内因性TGF-β及び/又はIL-10の発現を刺激する免疫優勢抗原を提供する。さらに、本発明は脾臓及び/又はリンパ節の細胞の増殖を低減する抗原に関する。本発明は炎症性の抗原特異的T細胞応答を抑制する抗原にも関する。
免疫応答
本明細書で用いる免疫応答関連疾患は、抗原に対する生体の望ましくない免疫応答によって惹起される疾患であり、前記抗原は異種抗原であっても自己抗原であってもよい。好ましくは抗原に対する免疫寛容を誘導するための本発明の方法においては、抗原は免疫応答関連疾患を惹起するか、それに関連する。免疫応答関連疾患には、それだけに限らないが、食物アレルギー、セリアック病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー皮膚炎、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、I型糖尿病、尋常性天疱瘡、及び多発性硬化症を含むアレルギー反応が含まれる。免疫応答関連疾患には、移植片対宿主疾患又は非内因性ファクターVIIIに対する抗体産生等の医薬による免疫活性化等の望ましくない免疫反応も含まれる。好ましくは、疾患はアレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、食物アレルギー、セリアック病、I型糖尿病及び治療薬の免疫不活化からなる群から選択される。
一実施形態では、本発明は、本明細書で定義する免疫応答関連疾患の予防及び/又は治療における使用のための本明細書で定義する非生存細菌粒子及び抗原を含む粘膜接着性担体に関し、粘膜接着性担体は本明細書で定義するように対象に経粘膜投与され、好ましくは抗原は免疫応答関連疾患を惹起し又はこれに関連する。
本発明によれば、用語「免疫優勢」は、免疫応答を誘導する、ペプチド断片及びその特定のエピトープを含む抗原の原理に関する。
上記に鑑みて、本発明は本明細書に記載した方法又は使用に関し、前記方法又は使用は治療用及び/又は予防用である。
本発明のさらなる態様は、ペプチド断片及びその特定のエピトープを含む抗原に対する免疫寛容を誘導する方法に関し、該方法は、粘膜接着性パッチ、フィルム、又はヒドロゲル中の細菌粒子と組み合わせた前記抗原の口腔粘膜投与を含む。抗原は細菌粒子を作製するために用いられる微生物によって産生されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、精製された抗原が別の供給源から産生され、細菌粒子と混合される。抗原は寛容化細菌粒子化合物と物理的に結合させてもよいが、細菌粒子と抗原との物理的相互作用のない混合モードでもよい。
医薬及び投与
化合物は、単純な又は複雑な、有機及び無機の分子、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、タンパク質複合体、抗体、炭水化物、核酸、又はそれらの誘導体を含む任意の化学若しくは生物学化合物又は複合体を意味する。免疫調節化合物は免疫系の機能を改変する化合物である。本明細書で用いる免疫調節化合物は寛容誘導化合物であり、寛容誘導は、非限定的な例として、Treg、Tr1、又はTh3等の制御性T細胞を誘導することによって、又はTh1/Th2のバランスをTh1若しくはTh2の方に移動させることによって、又はTh17を阻害することによって直接的に、或いは非成熟樹状細胞を活性化して寛容化樹状細胞にすること、及び/又は成熟樹状細胞上の「共刺激」因子の発現を誘導するTh2免疫応答を阻害することによって間接的に、得ることができる。免疫調節及び免疫抑制化合物は当業者には既知であり、それだけに限らないが、ビタミンD3(又はその前駆体)、D-マンノース、ゼブラリン、レチノイン酸及びホスファチジルセリン等の有機の分子、スペルグアリン等の細菌代謝物、タクロリムス、ラパマイシン、若しくはシクロスポリン等の真菌及び放線菌の代謝物、IL-4、IL-10、IFN-α、TGF-β(制御性T細胞の選択的アジュバントとして)、Flt3L、TSLP、及びRank-L(選択的寛容原性DCインデューサーとして)等の免疫抑制サイトカイン、抗CD40L、抗CD25、抗CD20、抗IgE、抗CD3、抗IL6(又はIL6R)等の抗体及び/又はアンタゴニスト、並びにタンパク質、ペプチド、又はCTL-4Ig又はCTLA-4アゴニスト融合タンパク質等の融合タンパク質が挙げられる。
本明細書で用いる送達又は投与は、それだけに限らないが、任意選択で寛容原性効果をさらに向上させるビタミンD3及び/又はD-マンノース等の化合物並びに/又は口腔粘膜投与及び/又は粘膜取り込みを促進する界面活性成分若しくはキレート化剤等の浸透促進剤の存在下で、抗原又は抗原と組み合わされた細菌粒子を含む、又はこれらを担持するパッチ、バイオフィルム、又はヒドロゲルを含む、当業者には既知の粘膜接着性材料を介する任意の送達又は投与の方法を意味する。
本明細書で用いるヒドロゲル又はフィルムは、抗原及び細菌粒子を含浸し又は負荷する(loaded)ことができる水膨潤性架橋ポリマーを意味する。ヒドロゲルに負荷された細菌粒子-抗原の組み合わせは、ヒドロゲルが口腔内で水和されるとともに制御された様式で放出される。好ましい実施形態では、本発明のヒドロゲルマトリックスはキトサン、アルギネート、及びヒアルロン酸等の多糖類を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ヒドロゲルマトリックスはキトサンを含む。キトサンは、薬剤送達、創傷治癒、及び生物医学的インプラント等の工業用及び生物医学用の適用範囲に適した特性を有する生体活性、生体親和性、生分解性、非毒性化合物である。キトサンは2-アミノ-2-デオキシ-β-D-グルコース(グルコサミン)及び2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコース(N-アセチルグルコサミン)の1,4-連結残基を含む多糖類である。キトサンは天然産生の多糖類で甲殻類、昆虫、及び真菌の殻(shell)に天然に見られるキチン(ポリ-N-アセチルグルコサミン又は(1→4)-2-デオキシ-β-D-グルカン)の少なくとも部分的な脱アセチル化によって調製される。キチンのN-アセチルグルコサミン残基の少なくとも数個からアセチル基が除去されてグルコサミン残基が形成される。
キトサンの市販調製物では、キチンのN-アセチルグルコサミン残基の通常約50%~約100%が脱アセチル化されてグルコサミン残基になっている。本発明では脱アセチル化率70%~95%のキトサンが好ましい。キトサンはpH6.5未満の酸性溶液中でかなりの量が溶解する。したがって可溶性キトサンはカチオン性で、陰性荷電を有する表面及び生物学的材料に結合することができる。キトサンはイオン架橋が可能な多糖類の目立った例である。キトサンヒドロゲルは、アニオン性のイオン又は高分子を導入して陽性荷電を有するキトサンを中和し、ゼラチン化された網目の中に静電的引力を誘導することによって、安定な網目の中に物理的に混合することができる。イオン架橋は、毒性の触媒を用いずに生体親和性のヒドロゲルを製造するために用いられる比較的安全な手法である。本発明によれば、非生存細菌粒子と抗原から製剤化されたキトサン系ヒドロゲルは、長期保存及び口腔内での容易な適用のために乾燥することができる。
本発明の別の好ましい態様では、感熱性キトサン溶液が用いられる。感熱性ヒドロゲルを得るためには、ポリオールのカウンターイオンモノ塩を用いてキトサン溶液を中和する。これらの条件下でキトサンは25℃以下で液状のままであり、感熱特性を失わずに長期保存することができる。この系は生理学的に許容される中性範囲のpH(6.8~7.2)を有し、液状又はゲル状の状態を決定するものは環境の温度のみであり、温度の上昇に伴ってゲルの形成が観察される。本発明の好ましい実施形態では、ポリオールのカウンターイオンモノ塩はβ-グリセロホスフェートであり、ゲル形成は32℃を超える温度で開始する。感熱性キトサン系ヒドロゲルの製造及び使用は「Biological Activities and Application of Marine Polysaccharides」、(Arguelles-Monalら編)等の文献に詳しく記載されている。
本明細書で用いる粘膜接着性パッチは、異なった機能を有する多数のポリマー層からなるパッチを意味する。そのような多層パッチでは、粘膜接着性層はMasekら(2017,J Control Rel 249:183-195)に記載されているナノスカフォールドリザーバ層を覆い、これに重なっている。粘膜接着性層は口腔粘膜に付着/接着するように働き、任意選択で、口腔内への医薬の拡散を防止するための非接着性裏打ち層によって覆われている。ナノスカフォールドリザーバ層は医薬の実際の担体で、口腔粘膜に面している。リザーバ層中のナノ繊維の電気紡糸を含むこの種の粘膜接着性パッチの製造は、国際公開第2016/051159号に詳細に記載されている。したがって好ましい実施形態では、粘膜接着性(たとえば粒子)担体は、a)少なくとも1つの物質又はAPIを(たとえば粒子の形態で)担持し又は含むナノスカフォールド(又はマトリックス)、及びb)粘膜接着性(層)を含み、粘膜接着性(層)はその表面の少なくとも一部で(粘膜に)接着し、又はナノスカフォールドと重なることができる。ナノスカフォールドは好ましくは10nm~1000μmの大きさの孔を含むかこれを有し、及び/又は0.1~1000μmの範囲の厚みのナノ繊維層であり、又は生体親和性ポリマー又はその混合物の層を含む。本実施形態による粘膜接着性担体は、a)粘膜接着性層が(少なくとも部分的に)ナノスカフォールドと重なり、粘膜接着性層の縁部がナノスカフォールドの縁部と重なり、及び/又は粘膜接着性層が縁部に沿ってナノスカフォールドを取り巻き、又はb)粘膜接着性担体が標的粘膜に適用されるように構成され、ナノスカフォールドが粘膜に(たとえば粘膜接着性層と同じ向きに)面しており、及び/又はナノスカフォールドと重なる粘膜接着性層の部分が粘膜接着性担体を標的粘膜に接着して固定化(接着)するように構成されているという特徴をさらに有し得る。
本発明の好ましい使用において、粘膜接着性パッチの多層は予め成形され、続いて細菌粒子及び抗原とともにナノ繊維リザーバ層に負荷される。この目的のため、細菌粒子及び抗原は溶液、コロイド、又は懸濁液としてナノスカフォールドリザーバ層に適用される。リザーバ層による取り込みは拡散及び吸収によって起こる。従来の乾燥又は凍結乾燥手法によって、過剰の液体を除去することができる。細菌粒子及び抗原を適切に保護するために、凍結保護剤の含有が必要なこともある。
本明細書で用いる用語「治療」、「治療する」等には、発現した心理的疾患若しくは病態の、いったん確立した改善又は排除、又はそのような疾患若しくは病態の特徴的症状の緩和が含まれる。本明細書で用いる場合、これらの用語は患者の病態に応じて疾患若しくは病態の発現又は疾患若しくは病態に関連する症状の発現を防止することをも包含し、前記疾患若しくは病態に関連する苦痛に先立って疾患若しくは病態又はそれに関連する症状の重篤度を低減させることを含む。苦痛に先立つそのような予防又は低減は、投与時にはその疾患若しくは病態に苦しめられていない患者に本発明の化合物又は組成物を投与することを意味する。「予防する」は、たとえば改善した期間の後で、疾患若しくは病態又はそれに関連する症状の再発を防止すること又は再燃防止をも包含する。心理的病態が身体的な症状の原因であることは明らかであろう。これに関して、用語「治療する」には、身体的疾患若しくは病態の予防、又は発現した身体的疾患若しくは病態の、いったん確立した改善又は排除、又はそのような病態の特徴的症状の緩和も含まれる。
本明細書で用いる場合、用語「医薬」は、治療効果を有する調製物を指示する医学分野で用いられる用語「薬剤」、「治療薬」、又はその他の用語をも包含する。
本発明に存在する抗原は治療有効量で送達されることが認識される。本明細書で用いる場合、用語「治療有効量」は、所望の治療計画に従って投与した際に所望の治療又は予防の効果又は応答を誘起する本発明の化合物又は組成物の量を指すことを意味する。免疫優勢抗原が連続的に存在する場合、炎症性抗原特異的細胞応答はさらに低減されることが観察されている。この低減は抗原そのまま若しくは細菌粒子そのままの投与、又は抗原の非連続的存在と比較して顕著に大きい。
好ましくは、化合物又は組成物は単位用量形態で提供され、たとえば粘膜接着性パッチ、バイオフィルム、又はヒドロゲルが、対象、たとえば患者の口腔に投与される。
活性成分は、所望の活性を呈するために十分なように1日あたり1~6回投与される。これらの日用量は1日1回の単回投与でもよく、全体として特定した日用量になるように1日のうち同時に又は異なる時に2つ以上の小用量として投与してもよい。好ましくは、活性成分は1日に1回又は2回投与される。たとえば、1回の用量を朝に、また1回の用量をその日の後半に摂取してもよい。
本発明のあらゆる態様において、毎日の維持用量は患者において臨床的に望ましい期間、たとえば1日から数年まで(たとえば哺乳類の全余命の間)、たとえば約(2日、3日、又は5日、1週又は2週、又は1か月)から、及び/又はたとえば約(5年、1年、6か月、1か月、1週、又は3日若しくは5日)まで投与してもよい。約3日~約5日、又は約1週~約1年の毎日の維持用量の投与が典型的である。最終製剤のその他の成分としては、保存剤、無機塩、酸、塩基、緩衝剤、栄養剤、ビタミン、又はその他の医薬が挙げられる。
抗原と組み合わせた細菌粒子は、1日あたり少なくとも0.1mg~60mg(乾燥重量)、好ましくは1日あたり0.5~20mg、最も好ましくは1日あたり1~10mgの用量で送達してもよい。
本発明は以下に番号を付けた実施形態にさらに関する。
1.患者の免疫応答関連疾患を治療する経口粘膜投与における使用のための非生存細菌粒子を含む粘膜接着性担体であって、非生存細菌粒子が前記免疫応答を惹起する少なくとも1つの抗原と組み合わされ、前記免疫応答関連疾患がセリアック病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、又は食物アレルギーからなる群から選択される、粘膜接着性担体。
2.担体が粘膜接着性パッチ、バイオフィルム、又はヒドロゲルである、実施形態1に記載の粘膜接着性担体。
3.前記パッチが電気紡糸繊維を含む、実施形態2に記載の粘膜接着性パッチ。
4.前記抗原がα-グリアジン又はホルデインである、実施形態1~3のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
5.前記抗原がハウスダストダニの1つ又は複数の免疫優勢エピトープ、好ましくはDer p2.1である、実施形態1~3のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
6.前記抗原がネコの唾液、皮膚、又は腺からのペプチドの1つ又は複数の免疫優勢エピトープ、好ましくはFel d1である、実施形態1~3のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
7.前記抗原が1型糖尿病に関与するペプチドの1つ又は複数の免疫優勢エピトープ、好ましくはpINS、GAD65、InsB9-23、又はIA2である、実施形態1~3のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
8.患者の免疫応答関連疾患を治療する経口粘膜投与における使用のための非生存細菌粒子であって、非生存粒子が前記免疫応答を惹起する少なくとも1つの抗原と組み合わされ、前記免疫応答関連疾患がセリアック病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、又は食物アレルギーからなる群から選択される、非生存細菌粒子。
9.実施形態1~7のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体、又は実施形態8に記載の非生存細菌粒子であって、非生存細菌粒子が酸性熱処理されたグラム陽性細菌、好ましくはL.ラクティスである、粘膜接着性担体又は非生存細菌粒子。
10.実施形態1~7のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体、又は実施形態8に記載の非生存細菌粒子であって、非生存細菌粒子がグラム陰性細菌、好ましくは大腸菌ニスルを溶解して得られる空の細菌エンベロープである、粘膜接着性担体又は非生存細菌粒子。
11.実施形態1~7のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体、又は実施形態8に記載の非生存細菌粒子であって、非生存細菌粒子が化学滅菌された細菌、好ましくはL.ラクティス、Lb.ラムノサス、又は大腸菌ニスルである、粘膜接着性担体又は非生存細菌粒子。
12.ヒト及び/又は動物を治療するための医薬としての使用のための実施形態1~11のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体又は非生存細菌粒子。
本書類及びその特許請求の範囲において、動詞「含む(to comprise)」及びその活用形は非制限的な意味に用いられ、その単語に続く事柄が含まれるが、特に言及されていない事柄は除外されていないことを意味する。さらに、不定冠詞「a」又は「an」による要素への言及は、ただ一つの要素しかないことが文脈によって明白に要求されない限り、2つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「a」又は「an」は通常、「少なくとも1つ」を意味する。
数値に関連して用いる場合の単語「約」又は「ほぼ」(たとえば約10)は、好ましくはその値が所与の値(10)のプラスマイナス0.1%以内でもよいことを意味する。本明細書で引用した全ての特許及び参考文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
[実施形態1]
対象における抗原に対する免疫寛容を誘導する使用のための非生存細菌粒子及び抗原を含む粘膜接着性担体であって、前記粘膜接着性担体が前記対象に経粘膜投与される、粘膜接着性担体。
[実施形態2]
前記抗原が免疫応答関連疾患を惹起し又は免疫応答関連疾患に関連する、実施形態1に記載の粘膜接着性担体。
[実施形態3]
前記免疫応答関連疾患がセリアック病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、又は食物アレルギーからなる群から選択される、実施形態2に記載の粘膜接着性担体。
[実施形態4]
前記抗原がα-グリアジン、ホルデイン、ハウスダストマイトの免疫優勢エピトープ、ネコの唾液、皮膚、又は腺からのペプチドの免疫優勢エピトープ、及び1型糖尿病に関与するペプチドの免疫優勢エピトープからなる群から選択される、実施形態1~3のいずれか1つに記載の粘膜接着性担体。
[実施形態5]
前記ハウスダストマイトの免疫優勢エピトープがDer p2.1であり、前記ネコの唾液、皮膚、又は腺からのペプチドの免疫優勢エピトープがFeld1であり、前記1型糖尿病に関与するペプチドの免疫優勢エピトープがpINS、GAD65、InsB9-23、又はIA2である、実施形態4に記載の粘膜接着性担体。
[実施形態6]
前記粘膜接着性担体が口腔粘膜に投与される、実施形態1~5のいずれか1つに記載の粘膜接着性担体。
[実施形態7]
粘膜接着性パッチ、バイオフィルム、又はヒドロゲルである、実施形態1~6のいずれか1つに記載の粘膜接着性担体。
[実施形態8]
電気紡糸繊維を含む粘膜接着性パッチである、実施形態7に記載の粘膜接着性担体。
[実施形態9]
前記非生存細菌粒子が腸内有益菌由来である、実施形態1~8のいずれか1つに記載の粘膜接着性担体。
[実施形態10]
前記腸内有益菌がラクトバチルス、ラクトコッカス、ビフィドバクテリウム、又は大腸菌ニスルである、実施形態9に記載の粘膜接着性担体。
[実施形態11]
前記非生存細菌粒子が
a)酸性熱処理されたグラム陽性細菌、好ましくはL.ラクティス、
b)グラム陰性細菌、好ましくは大腸菌ニスルを溶解して得られる空の細菌エンベロープ、又は
c)化学滅菌された細菌、好ましくはL.ラクティス、Lb.ラムノサス、又は大腸菌ニスル
から選択される、実施形態9又は10に記載の粘膜接着性担体。
[実施形態12]
ヒト及び/又は動物を治療するための医薬としての使用のための実施形態1~11のいずれか1つに記載の粘膜接着性担体。
[実施形態13]
対象における抗原に対する免疫寛容を誘導する使用のための腸内有益菌由来の非生存細菌粒子であって、前記非生存細菌粒子が前記抗原と組み合わせて前記対象に経粘膜投与され、好ましくは前記抗原が免疫応答関連疾患を惹起し又は免疫応答関連疾患に関連する、非生存細菌粒子。
[実施形態14]
前記腸内有益菌がラクトバチルス、ラクトコッカス、ビフィドバクテリウム、又は大腸菌ニスルである、実施形態13に記載の非生存細菌粒子。
[実施形態15]
前記非生存細菌粒子が
a)酸性熱処理されたグラム陽性細菌、好ましくはL.ラクティス、
b)グラム陰性細菌、好ましくは大腸菌ニスルを溶解して得られる空の細菌エンベロープ、又は
c)化学滅菌された細菌、好ましくはL.ラクティス、Lb.ラムノサス、又は大腸菌ニスル
から選択される、実施形態13又は14に記載の非生存細菌粒子。
[実施形態16]
前記免疫応答関連疾患がセリアック病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、又は食物アレルギーからなる群から選択される、実施形態13~15のいずれか1つに記載の非生存細菌粒子。
[実施形態17]
前記抗原がα-グリアジン、ホルデイン、ハウスダストマイトの免疫優勢エピトープ、ネコの唾液、皮膚、又は腺からのペプチドの免疫優勢エピトープ、及び1型糖尿病に関与するペプチドの免疫優勢エピトープからなる群から選択される、実施形態13~16のいずれか1つに記載の非生存細菌粒子。
[実施形態18]
前記ハウスダストマイトの免疫優勢エピトープがDer p2.1であり、前記ネコの唾液、皮膚、又は腺からのペプチドの免疫優勢エピトープがFeld1であり、前記1型糖尿病に関与するペプチドの免疫優勢エピトープがpINS、GAD65、InsB9-23、又はIA2である、実施形態17に記載の非生存細菌粒子。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
実施例A1:ナノリザーバ層からの細菌粒子の負荷及びインビトロ放出の決定
緒言
種々の型のポリマー繊維から作られた予備成形したナノリザーバ層にBLPを効率的に負荷する能力、並びに乾燥後のこれらのナノリザーバから緩衝液中へのBLPのインビトロ放出を試験した。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスMG1363のBLPは、基本的には国際公開第02/101026号に従って調製した。
ナノリザーバ層:ナノリザーバ層は、ポリカプロラクトン(PCL、Mw80,000g/mol、Sigma Aldrich社)又はポリカプロラクトンと絹フィブロインの混合物(1:1)(PSF)ポリマーを用いる電気紡糸によって調製した。手順はMasekら(2017,J Control Rel,249:183-195)に記載されたようにした。このようにして、平均孔径がほぼ5μmのPCL及びPSFのナノリザーバ層が得られた。
実験の設定:リザーバ層の表面に液を滴下することによって、1cmのナノリザーバ層に10μLのBLP溶液(脱ミネラル水中5mg/mLのBLPストック)を負荷した。液滴を層に吸収させ、室温で約20分風乾した。BLPを含む乾燥したリザーバ層を走査電子顕微鏡(SEM、Hitachi8010)で検査するか、最初に1mLのPBSに10分浸漬して、その後、上記のように乾燥してSEM解析を行った。
結果
PCLナノリザーバの表面に滴下したBLP溶液の滴は実質的に表面上に残り、ナノリザーバ層に吸収されなかった。20分のインキュベーションの後、液滴を除いてPCLリザーバ層を乾燥した。SEM解析により、PCLポリマーは見かけ上疎水性であるにも関わらず、BLPはポリマー繊維に吸収され、量は限られているがいくつかの孔の中にも進入していたことが明らかになった。PCLナノリザーバをBLPとともにPBS中に浸漬することによってBLPはナノリザーバから完全に放出され、PCLナノ繊維へのBLPの吸収はこれらの条件下では可逆的であることが示された。
PSFナノリザーバの表面に滴下したBLP溶液の滴は直ちにナノリザーバ層に吸収された。乾燥後、SEM解析によって、BLPはPSF繊維に密に負荷され、BLPはリザーバ層の孔に進入していることが明らかになった。PSFナノリザーバをBLPとともにPBS中に浸漬することによってBLPの90%超がナノリザーバから放出され、PSFナノ繊維へのBLPの吸収はこれらの条件下では可逆的であることが示された。
結論
BLPを負荷し、放出するために、PCL及びPSFナノ繊維のリザーバ層を用いることができ、PSFナノリザーバ層が最も効率的である。
実施例A2:抗原と組み合わせた細菌粒子の粘膜接着性パッチ又はヒドロゲルからの口腔粘膜組織へのエクスビボ放出及び浸透の決定
緒言
粘膜接着性フィルム及びヒドロゲルを、凍結変性してバリア機能を低下させた粘膜とともに37℃でインキュベートすることによって、実際の条件下(粘膜層等に典型的な水の量が限られた湿潤粘膜組織表面)で抗原とともに製剤化された関連する細菌粒子を標的化して放出させる粘膜接着性パッチ及びヒドロゲルの能力を調べた。別の実験で、隣接する組織の断面の共焦点顕微鏡による蛍光シグナルの決定により、抗原とともに製剤化された細菌粒子の粘膜接着性パッチ及びヒドロゲルからの放出を検討した。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスMG1363のBLP及び大腸菌ニスル1917のBGは、基本的にはそれぞれ国際公開第02/101026号及び国際公開第9906567号に従って調製した。ラクトコッカス・ラクティスMG1363、ラクトバチルス・ラムノサスGG、及び大腸菌ニスルは、これらの生命体用の標準的な増殖条件を用いて、GM17、MRS、及びTB増殖培地中で一夜増殖させた。一夜の増殖の後、培養物を収穫して1倍体積の精製水で洗浄した。一夜培養した細胞収穫物を70%のエタノールと20~23℃で16~20時間インキュベートすることにより、ラクトコッカス・ラクティスMG1363、ラクトバチルス・ラムノサスGG、及び大腸菌ニスルの化学的不活化細菌粒子が得られた。化学的不活化の後、細菌粒子溶液を遠心分離し、粒子を最初の培地と同じ体積で3回洗浄した。未処理の細菌培養液(生存細菌)及び化学的不活化細菌粒子を洗浄した後、細菌/粒子をPBS中に濃度30mg/mLで再懸濁し、使用まで2~8℃で保存した。
3mgの細菌粒子を振盪器中、室温で60分、pH9.0で0.1Mのホウ酸中の0.01gのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)(Sigama社)とインキュベートすることによって、細菌粒子をFITCで標識した。インキュベーションの後、遠心分離によって細菌粒子を収穫し、PBSで十分に洗浄して最終的に濃度30mg/mLで2~8℃で保存した。
抗原:全ての実験で、未処理のLPSフリーOVAグレードVタンパク質(Sigma Aldrich社)を抗原として用いた。PBS中1mg/mLのストック溶液を調製した。OVAは、供給元の説明書に従ってAlexaFluor647(ThermoFisher社)で標識した。
口腔粘膜組織:動物を殺処分した直後に手術器具を用いて舌下腺及び頬の組織を取り出した。切除した組織をPBS緩衝液中で直ちに実験室に移送し、立方体状の小片に切断して試験に用いた。動物の殺処分と実験の開始との間の時間は20分以下であった。
粘膜接着性パッチ/ヒドロゲル:基本的には参照した特許及び上記の説明に記載されたようにして、ポリカプロラクトン-絹フィブロン(PSF)、ポリラクチド-co-グリコリド-ポリエチレングリコール(PLGA-PEG)ポリマー、又は脱アセチル化キトサンを用いて、粘膜接着性パッチ及びヒドロゲルを調製した。ヒドロゲルの重合プロセスの前に、細菌粒子及びOVAをポリマー溶液に加え、得られるヒドロゲルが0.5cmあたり0.1mgの標識された細菌粒子及び/又は1μgの標識されたOVAを含む最終濃度になるようにした。粘膜接着性パッチを得るため、PSFナノリザーバ層に2:1の比のCarbopol 934P(Lubrizol Advanced Materials社)とヒドロキシプロピルメチルセルロースK4M(HPMC、Colorcon Ltd社)からなる粘膜接着性層を重ね、粘膜接着性層がPSFナノリザーバ層に重なるようにした。ナノリザーバ層に付着していない粘膜接着性層の側をさらにEudragit(登録商標)L100-55ポリマーからなる非接着性裏打ち層で覆った。予め成形した粘膜接着性PSFパッチを調製する手順はMasekら(2017、上記)に記載されている。
標識された細菌粒子とOVAの混合物を粘膜接着性PSFパッチに負荷し、0.5cmあたり0.1mgの標識された細菌粒子及び/又は1μgの標識されたOVAの濃度が得られるようにした。試験したそれぞれの粘膜接着性パッチ/ヒドロゲルの組成を表1にまとめる。
実験の設定:基本的にはMasekら(2017、上記)に記載されているようにして、新たに切除したブタ舌下腺及び頬の組織において、抗原を負荷した細菌粒子の隣接する粘膜へのエクスビボの浸透を試験した。蛍光標識した細菌粒子及び/又はOVAを含むナノ繊維粘膜接着性フィルム/パッチを粘膜に貼付し、37℃で2時間インキュベートした。実験の間、リニアポンプ及びチューブを用いて、それぞれの粘膜の表面をPBSで湿潤化した(流量0.1mL/分)。
基本的にはMasekら(2017、上記)に記載されているようにして、共焦点顕微鏡(Leica社、SP2)による隣接する組織の断面の蛍光シグナルを決定することによって、抗原とともに製剤化した細菌粒子の粘膜接着性パッチ及びヒドロゲルからの放出を検討した。
結果
新たに切除したブタ舌下腺及び頬の組織において、抗原とともに製剤化した細菌粒子の口腔粘膜へのエクスビボの浸透を試験した。予め負荷し、標識した細菌粒子及び/又はOVAを含む所与のナノ繊維粘膜接着性フィルム/パッチを切除した粘膜に貼付し、37℃で2時間インキュベートした。実験全体の間、口腔粘膜における条件を再現するために粘膜の表面をPBS緩衝液で湿潤化した。対照の目的のため、遊離の細菌粒子を切除した粘膜に貼付した。その相違は貼付した部位における着色の強度によって明白に区別できた。ナノ繊維粘膜接着性パッチ/フィルム及びヒドロゲルでは、インキュベーションの間、抗原を担持し蛍光標識した細菌粒子が粘膜接着性リングの中央部に維持されていたが、遊離の細菌粒子は短時間の試験の後、粘膜表面から洗い流され、粘膜には全く浸透しなかった。
OVAとともに製剤化された細菌粒子の口腔粘膜への浸透は、隣接する粘膜の断面作製及び共焦点顕微鏡観察によって確認された。新たに切除した舌下腺及び頬の口腔粘膜を粘膜接着性パッチ及びヒドロゲルとともにインキュベートして試験した。細菌粒子を含む全ての試験試料で、口腔粘膜の上皮への浸透が観察された。蛍光強度は、粘膜下組織の中に深く拡散する細菌粒子の濃度勾配を反映している。組織切片の共焦点顕微鏡観察によって明白に実証されるように、上皮における細菌粒子の輸送は、細胞間隙経路を通っている。
結論
粘膜接着性パッチ及びヒドロゲルによって、抗原とともに製剤化された細菌粒子の粘膜組織における曝露時間が延長され、前記粘膜組織による前記粒子及び抗原の取り込みがより効率的になる。
実施例A3:抗原と組み合わせたBLPの粘膜接着性パッチから口腔粘膜組織及び流入領域リンパ節へのインビボ放出及び浸透の決定
緒言
標識したBLP及び/又はOVAで予備負荷したPSF粘膜接着性パッチを舌下腺又は頬の口腔粘膜に貼付することによって、実際の条件下、即ち仔ブタ口腔モデルで、抗原とともに製剤化された関連する細菌粒子を標的化して放出させる粘膜接着性パッチの能力を調べた。ブタの口腔粘膜上皮は角質化しておらず、その意味でヒトの口腔粘膜上皮に類似しているので、ブタの口腔粘膜は一般にこの種の研究には極めて適したモデルであると認識されている。隣接する組織及び流入領域リンパ節の断面の共焦点顕微鏡による蛍光シグナルの決定により、抗原とともに製剤化された細菌粒子の粘膜接着性パッチからの放出を検討した。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスMG1363のBLPは、基本的には国際公開第02/101026号に従って調製した。粒子は実施例A2に記載したように標識した。
抗原:未処理のLPSフリーOVAグレードVタンパク質を実施例A2に記載したように抗原として用いた。
動物:2~3月齢のランドレース-ヨークシャー仔ブタ
粘膜接着性パッチ:PSF粘膜接着性パッチは実施例A2に記載したように調製した。約2cmのパッチを用い、最終濃度が0.5cmあたり0.1mgのBLP及び/又は1μgの標識OVAになるように標識BLP及び/又はOVAを負荷した。いくつかのパッチでは、浸透促進剤EDTAが含まれていた。試験したそれぞれの粘膜接着性パッチの組成を表2にまとめる。
それぞれの種類のパッチを舌下腺(舌の前方又は側方)又は頬に貼付した。
実験の設定:口腔の指示された部位にパッチを貼付するため、仔ブタをZoletil(Virbac社)で短時間麻酔した。3時間又は24時間のインキュベーションの後、動物を麻酔してT61の静脈内適用によって犠牲死させた。粘膜接着性パッチが付着した舌下腺及び頬の粘膜並びに流入領域リンパ節を切除し、凍結して-80℃で保存した。基本的にはMasekら、2017に記載されているようにして組織を処理し、共焦点顕微鏡で解析した。
結果
組織化学的に染色した舌下腺及び頬の組織切片の共焦点顕微鏡により、抗原提示細胞(APC)による蛍光BLP及びOVAのエンドサイトーシスが実証された。BLP及びOVAはAPCによって内在化された。OVAの自由な拡散が見られたが、BLPについては見られなかった。APCによる取り込みは、パッチを口腔粘膜組織に付着させてから24時間後により顕著であった。口腔の頬側の位置に設置したパッチ及び/又は浸透促進剤EDTAを含むパッチで、やや良好な取り込みがあった。蛍光BLP及びOVAを含むAPCは、流入領域リンパ節においても見られた。この結果は、EDTAを含み頬の粘膜に付着させたパッチで最も顕著であった。
結論
粘膜接着性PSFパッチによって、口腔粘膜組織におけるBLP及び抗原の効率的な取り込みが可能になり、前記粒子及び抗原は領域リンパ節に排出される。EDTA等の浸透促進剤の存在により、取り込みがさらに刺激される。
実施例B:自己免疫及びアレルギーの患者の頬由来の抗原提示細胞の細菌粒子介在抗原活性化のエクスビボ決定
緒言
細菌粒子と組み合わせた免疫優勢抗原の製剤の曝露を延長することによって、口腔粘膜の寛容原性APCが優れた様式で標的化され活性化されることを立証するため、セリアック病及びネコアレルギーの患者の新鮮なヒト口腔粘膜組織を用いることによってヒト免疫障害関連エクスビボモデルを確立し、抗原負荷細菌粒子のヒト口腔粘膜APCへの結合を標準化されたプロトコルで研究した。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスMG1363、ラクトバチルス・ラムノサスGG、及び大腸菌ニスル1917の細菌粒子は、基本的には実施例A2に記載したように調製した。
追加の寛容化化合物:粘膜取り込みを刺激し、粘膜応答を強化するためにビタミンD3(Sigma Aldrich社)及びD-マンノース(Sigma Aldrich社)を用いた。それぞれの化合物500μg/mLを含むvitD3-マンノース(VM)の単一のストック溶液を調製した。
抗原負荷粒子の再吸収における標準化されたエクスビボモデル:前庭領域の口腔粘膜組織の検体を、口腔内手術を受けているセリアック病、ハウスダストダニアレルギー、及びネコアレルギーの患者から得た。腸の生検材料の検体をセリアック病の患者から得た。また末梢血単核球(PBMC)の検体を用いた。腫瘍を有する患者は除外し、臨床的に炎症のない組織のみを採取した。遺伝学的マーカー(HLA-DQ2+及び/又はHLA-DQ8+)及び血清学的マーカー(IgA抗筋内膜抗体及び/又はIgA-tTG)と十二指腸内視鏡によって評価した十二指腸の組織学的変性との組み合わせに基づくセリアック病の既往を有する個体からの検体を用いた。ハウスダストダニ又はネコに対するアレルギーの既往のある個体からの検体は、皮膚穿刺試験及び/又は血清特異的IgEによって確認した。
全ての検体は地区の倫理委員会及び病院の倫理委員会の承認を得て、患者のインフォームドコンセントを得た後に入手した。
抗原:ネコ組み換え抗原Fel d1はALK-Albello社から提供を受けた。精製Der p1及びDer p2ハウスダストダニ抗原はCiteq社から購入した。組み換えDer p2.1(アミノ酸1~53)ハウスダストダニ抗原はChenら(Mol Immunol.2008,45:2486-2498)に記載されたようにして得た。バイタルコムギグルテン(食品グレード、Gluvital)はCargill社、オランダから購入した。脱アミド化セリアック病抗原グリアジンα1ペプチド(アミノ酸PFPQPELPY)、α2ペプチド(PQPELPYPQ)及びα2ペプチドの33マー(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPQLPYPQPQPF)はGenscript社から購入した。
移動したoLCの計算:採取したヒト口腔粘膜組織を、粘膜側を上にして無菌のペトリ皿の上に載せ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)連結抗原負荷粒子又はデキストランを10~1000mg/mLの濃度範囲で含むPBSと37℃でインキュベートした。繰り返し抗原チャレンジのために、細菌粒子と混合した10mg/mLの抗原を、間で洗浄することなく6分ごとに、前の抗原溶液を除去して新たな抗原溶液を添加することによって口腔粘膜組織に投与した。対照条件として、口腔粘膜組織をPBS単独とインキュベートするか、FITC連結抗原負荷粒子又はデキストランとインキュベートする前に4℃に冷却し、非特異的抗原結合を判定した。インキュベーションの後、口腔粘膜組織をPBSで洗浄し、10%の熱不活化FCS(Sigma社)、1%の抗生剤/抗真菌剤(Invitrogen社)、及び500IU/mLのGM-CSF(Berlex Laboratories社)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社)に37℃で入れた。時間動力学では、抗原曝露の24時間及び36時間後に、組織外に移動した細胞を採取し、フローサイトメトリー解析のためにさらに処理した。培地を交換し、組織のインキュベーションを続けた。移動した細胞を48時間後に最終的に採取し、休眠している組織をさらに処理して消化し、別に記載したようにCa2+なしの0.5%トリプシン緩衝液中、37℃で1時間、トリプシン処理をすることによって単一細胞懸濁液を調製した。4℃で組織から移動した主要なCD1a1の集団のFITC蛍光のゲートを設定することによって、oLCに対する抗原の結合を計算した。抗原の特異的結合は、FITC陽性CD1a細胞の37℃における百分率からFITC陽性CD1a細胞の48℃における百分率を差し引くことによって計算した。
口腔粘膜ランゲルハンス細胞は、抗原/デキストランへの曝露の24時間、36時間、及び48時間後に、そのCD1aの発現及び前方散乱/側方散乱における位置によってゲートした。残った組織をトリプシンで処理し、休眠しているoLCをそのCD1aの発現によって同定した。ゲートした細胞、並びに残った組織中の細胞を各移動時点で計数した。各時点で移動したoLCの百分率は、特定の時点及び前の時点におけるoLCの数の合計を検出されたoLCの総数で割ることによって計算した。
増殖アッセイ:照射したAPCを、細菌粒子と混合した抗原で一夜予備刺激した(濃度範囲1ウェルあたり10~10粒子)。任意選択で、ビタミンD3及びD-マンノースも、1ウェルあたり最終濃度5μgになるように混合物に加えた。翌日、同種T細胞を加え、2日後に[H]チミジンを加えた。さらに12~16時間インキュベートした後、プレートを収穫して、Arentz-Hansenら(J.Exp.Med.2000,191:603-612)によって記載されたようにしてBetaplate Counter(Wallac社、Turku)で[H]チミジンの取り込みを計数した。
PBMCを用いるT細胞増殖アッセイは、Seyfert-Margolisら(Diabetes 2006,55:2588-2594)に記載されているようにして実施した。手短かには、単核球をFicoll-Pacque勾配で富化し、Hybrimax2897無タンパク質培地(Sigma社)中、培養グレードの平底96ウェル培養プレートに1ウェルあたり1×10の濃度で播種した。予備活性化された及びアネルギーのT細胞の検出を可能にするため、Hybrimax培地で希釈した10単位/mLの組み換えIL-2を培養液に加えた。IL-2サプリメントの存在下に測定された応答は、抗原に対する絶対的及び用量依存的な要求を保持している。プレートを標準的なCOインキュベーター中で1週間インキュベートし、最後の12時間で1μCiの[H]チミジンを加え、自動収穫及びシンチレーションカウントを行った。PBMC培養は試験抗原及び試験抗原-BLPの組み合わせで刺激した。種々の試料における増殖応答を比較するため、刺激インデックス(抗原刺激のcpm/非刺激のcpm)としてデータを正規化した。陽性応答は、抗原刺激培養のレプリケートにおける平均刺激インデックス+3SDよりも1.5倍以上大きいものと定義した。500~1200cpmの範囲のバックグラウンドカウントは抗原刺激培養におけるものと有意差はなかった(P>0.3)。各試料について陽性応答を合計し、T細胞応答スコア(範囲0~15)を導いた。スコア4を陽性応答とした。
結果
oLCに結合する抗原製剤化細菌粒子の動力学及び取り込み、並びにその移動を検討した。この課題に対処するため、新たにエクスビボで単離した口腔粘膜組織を、細菌粒子ありとなしで、100mg/mLの抗原とともに1時間インキュベートし、細胞培養培地に入れて、アレルゲンを取り込んだoLCを組織外に移動させた。さらにビタミンD3及びD-マンノースを加えた(試験した全ての製剤の完全な一覧については表3を参照されたい)。
移動したoLCの抗原結合について24時間、36時間、及び48時間後に解析した。LCのデキストラン取り込みが大きいことが示された。したがって、FITC-デキストランとインキュベートした口腔粘膜組織を、oLCの抗原との結合の参照として用いた。これに関して、曝露の24時間後及び36時間後のoLC結合抗原の全百分率は、oLC結合デキストランの百分率より小さかった。興味あることに、oLC結合抗原の百分率は曝露の24時間後、36時間後、及び48時間後で同程度であった一方、oLC結合デキストランの百分率は曝露の24時間後に最大になり、曝露の36時間後及び48時間後には連続的に低下した。
増殖アッセイにより、抗原の存在下で明らかな患者特異的なT細胞の増殖が示された。細菌粒子の添加によってT細胞の増殖の顕著な低減が生じ、寛容化効果が示された。ビタミンD3及びD-マンノースの添加もT細胞の増殖を低減させたが、細菌粒子をビタミンD3及びD-マンノースと組み合わせた場合に効果が最も顕著であった。
結論
抗原とともに製剤化された細菌粒子が、寛容原性口腔APCへの抗原の取り込みを抗原単独と比べてより効率よく標的化し、ビタミンD3及び/又はD-マンノースの添加によりさらに向上することを実証する。さらに、抗原とともに製剤化された細菌粒子がT細胞に対して寛容化効果を有し、これはビタミンD3及び/又はD-マンノースの添加によりさらに向上することを実証する。
実施例C1:抗原と組み合わせた細菌粒子の抗原感作マウスへの口腔粘膜投与による抗原特異的脱感作のインビボ誘導及び疾患改変効果
緒言
細菌粒子が口腔APCへの抗原の取り込みを効率的に標的化し、インビトロにおける寛容原性応答を増強するために用い得ることが立証されたので、皮下免疫療法(SCIT)マウスモデルについてHesseら(Allergy 2018,73:862-874)によって述べられているものと同様にインビボ舌下腺免疫療法(SLIT)マウスモデルで、これらの製剤の抗原特異的脱感作及び疾患改変の可能性を試験した。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスのBLPは、基本的には実施例A1に記載したように調製した。任意選択で、BLPは最終濃度が10mg/mLのBLP並びに0.1mg/mLのビタミンD3及びD-マンノースになるよう、ビタミンD3及び/又はD-マンノースとともに製剤化した。
抗原:比50:1の天然に精製されたDer p1及びDer p2はCiteq社から購入した。全ての実験において、未処理のLPSフリーOVAグレードVタンパク質(Sigma Aldrich社)を抗原として用いた。
動物:BALB/cByJマウスは6~8週齢でCharles River Laboratories社から購入し、個別に換気されたケージ(IVC)に収容した。
マウスの感作:全てのマウスに、100μLのPBS中、2.25mgのAlum(Imject、Pierce社)に吸着させた5μgの粗製抽出HDM(Citeq社)又は25μgのOVAを1日目及び15日目に腹腔内注射した。
SLITの手順:8匹のマウスの群に、8週間の間(29日目から82日目まで)、最大対応用量を遊離OVAで100μg若しくは遊離Der p1/2で100μg(50:1)、又は最大対応用量を遊離BLPで100μgとして、OVA-BLP(比1:1又は5:1又は1:5)又はDer p1/2-BLP(比1:1又は5:1又は1:5)、又はPBS緩衝液を、週に5回、舌下腺処置した。SLITは、マウスの首筋を保持して舌の下に2×5μLの各処置物を適用することによって実施した。マウスが直ちに溶液を飲み込むことを防止するため、それぞれの投与の後、さらに20秒、マウスを固定した。本研究に用いた製剤を表4にまとめる。
チャレンジ:SLIT手順の2週間後、PBSに溶解した抗原(全体積25μL)の鼻内投与により、94日、96日、98日に25μgのHDM又はOVAの鼻内導入によるチャレンジを実施した。その後、気道の反応性を判定し、気管支肺胞洗浄液(BALF)、肺、及び血液を採取して解析のために保存した。
耳の腫脹応答(ESR):アレルギー性感作を試験するため、SCIT処置の前後に耳の腫脹試験(EST)を実施し、HDMに対する早期相応答を評価した。
メタコリンに対する気道の過敏性の測定:用量を増加させたメタコリン(Sigma-Aldrich社)の静脈内投与に対する気道の抵抗(R、cmHO.s/mL)及び肺のコンプライアンス(C、mL/HO)を測定することにより、気道の過敏性(AHR)を評価した。AHRは、3cmHO.s/mLのRを誘導するために必要なメタコリンの有効用量(ED3)として表した。
気管支肺胞洗浄液(BALF):肺を洗浄し、Hesse、Nawijn,Inflammation:Methods and Protocols(2017,New York,NY:Springer New York;2017:137-168)に従って細胞遠心分離調製液を作製した。
T細胞の応答:肺細胞の再刺激。肺の単一細胞懸濁液(5×10/ウェル)をRPMI1640の中で1ウェルあたり0又は10μgのDerP1/2で5日間刺激し、上清を3つに分けて保存した(-80℃)。ELISAにより、メーカーの説明書(BD Pharmingen社)に従ってIL-5、IL-10、IL-13、及びIFN-γの濃度を決定した。
肺組織中のサイトカインレベルの解析:総タンパク質の測定のために右上葉を用い、MILLIPLEX Map Kit(Merck Millipore社)を用いてIL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、IL-33、IFN-γ、TGF-β、エオタキシン/CCL11、TARC/CCL17、及びMIP3-α/CCL20の濃度を測定し、メーカーのプロトコルに従って解析した。
抗原特異的免疫グロブリン:実験中、いくつかの時点で血液を採取した(前及び後の血清)。マウス血清をハウスダストダニ(HDM)-spIgE、Der p1-spIgE及びp2-spIgE、Der p1-spIgG1及びDer p1-spIgG2aのレベル、又はOVA-spIgE、OVA-spIgG1、及びOVA-spIgG2aについてELISAで分析した。簡単に述べると、ポリスチレン製の高結合性96ウェル平底プレート(Immulon2HB、VWR International社)を4℃で一夜インキュベートすることにより、100μL/ウェルの0.05M炭酸塩重炭酸塩緩衝液(pH9.6)中の抗原(100μg/mL)でコートした。プレートを200μL/ウェルの0.5%Tween20含有PBS(PBST)で3回洗浄し(Automatic Plate Washer,ELX405、BioTek Instruments Inc.社)、200μL/ウェルのPBS中3%Tweenで、室温で1.5時間、ウェルをブロッキングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、PBSTで100倍に希釈した血清を100μL/ウェルでトリプリケートとして加えて、室温で2時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、8000倍に希釈した100μLのアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体(全分子、Sigma社)をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)中のポリニトロフェノール-ホスファターゼ基質(Sigma社、1mg/mL)の溶液(100μL/ウェル)を加えて、室温、暗所でインキュベートした。対照には、血清なしのウェル、並びに陽性(抗体が高いプールした35日目の血清)及び陰性血清(10日目からプールした血清)のウェルが含まれていた。陽性対照の光学密度(OD)が1に達したときに、ELISAプレートリーダー(EL808、BioTek Instruments Inc社)を用いて405nmでウェルのODを測定した。抗原を入れたウェルの吸収値からブランク吸収(血清なし)値を差し引くことによって非特異結合効果を補正する装置のソフトウェアを用いて、全ての試料について正味の吸収値を計算した。各トリプリケート試験血清の平均ODを、以下のように陽性対照に対する百分率(陽性率)として表した。OD変化%=[試料OD/(陽性対照OD-陰性対照OD)]
統計解析:全てのデータは平均±SEMとして表す。結果を解析するためにMann-Whitney U検定を用い、P<0.05を有意と考えた。AHR測定の中では、SPSS Statistics 20.0.0.2を用いる一般化推定式(GEE)解析を用いた。
結果
細菌粒子が抗原を口腔APCに効率的に標的化するために用いることができ、これらが患者特異的T細胞に対して寛容化効果を有することが立証されたので、OVA又はHDMで感作したマウスを用いる前臨床SLITモデルで、これらの製剤を試験した。これらのマウスは重篤なAHR、即ち細胞浸潤を伴う肺の炎症、及び全身性のOVA又はHDM特異的Th2免疫応答を示す。オブアルブミン又はハウスダストダニで感作したマウスに、PBS、OVA若しくはDer p1/2単独、BLP単独、又はBLPと製剤化したOVA若しくはDer p1/2を、8週間にわたって週に5日、舌下腺処置した。BLPと製剤化したOVA若しくはDer p1/2についてはビタミンD3及びD-マンノースの存在下及び非存在下とした。OVA-BLP又はDer p1/2-BLPによる舌下腺処置によって、試験した全ての動物においてAHR及び好酸球の浸潤が低減し、これは抗原:BLPの比を1:1としたときに最も顕著であった。さらに、製剤中にビタミンD3及びD-マンノースが存在する場合に、より顕著なAHR及び好酸球浸潤への傾向が観察された。対照的に、可溶性OVA又はDer p1/2単独の処置ではAHRに対して中程度の効果しかなかった。この序列は、OVA-BLP又はDer p1/2-BLPで処置され、肺及びBALFでの2型サイトカインレベルの顕著な抑制及び抗原-spIgG応答の増大を示した動物のサイトカインの測定値と類似していた。SLITの後の抗原特異的IgG1のレベルはチャレンジ後のIL-5、IL-13、及びCCL20のレベルと負に相関し、マウスモデルにおけるこの中和抗体応答に対する保護的な役割を示している。さらに、PBS又は粒子単独で処置した動物と比較して、抗原に応答するIL10及びTGF-βのより高い産生が見られ、組み合わせによる免疫のシフト及び制御性寛容原性応答の誘導が示された。
結論
HDM-BLP及びOVA-BLPを用いるSLITの成功により、肺組織及びBAL液におけるTh2の応答が、IL-10及びTGF-βの産生を介して抗原特異的応答を抑制する、より保護的なTh1/T制御性プロファイルの方向にシフトされ、その結果、チャレンジ後のAHR及び好酸球浸潤が抑制された。
実施例C2:抗原と組み合わせた細菌粒子による抗原特異的寛容の抗原感作野生型仔ブタへのインビボ誘導
緒言
細菌粒子が抗原で感作されたマウスを効率的に脱感作するために用い得ることが立証され、仔ブタの口腔粘膜系がヒトのそれに極めて類似していることが知られているので、インビボの仔ブタ食物アレルギーモデルにおいて、粘膜接着性パッチ中に送達されたこれらの製剤の寛容誘導能を試験した。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスのBLPは、基本的には実施例A1に記載したように調製した。任意選択で、BLPは最終濃度が30mg/mLのBLP並びに0.1mg/mLのビタミンD3及びD-マンノースになるよう、ビタミンD3及び/又はD-マンノースとともに製剤化した。
抗原:全ての実験において、未処理のLPSフリーOVAグレードVタンパク質又はOvmタンパク質(Sigma Aldrich社)を抗原として用いた。PBS中1mg/mLのストック溶液を調製した。
粘膜接着性パッチ:PSFナノリザーバを含む粘膜接着性パッチは実施例A2に記載したように調製した。得られる粘膜接着性PSFパッチが0.5cmあたり0.1mgのBLP及び/又は5μgのvitD3-マンノース及び/又は1μgのOVA若しくはOvmを含む最終濃度になるように、BLP及びOVA若しくはOvmを添加した。研究に用いた粘膜接着性パッチを表5にまとめる。
ブタの感作:Rupaら(Int Arch Allergy Immunol.2008,146:11-18)及びRupaら(Vet Immunol Immunopathol.2011,140:23-29)によって記載されたプロトコルに従い、OVA又はOvmに対する過敏性を誘導するために、非近交系、同腹の未処理ランドレース-ヨークシャー仔ブタをスプリット-リッターデザインで用いた。ブタは10日齢で後眼窩洞から採血して感作前血清を採取し、4つの処置群にランダムに割り付けた(n=6/群)。3群には14日目、21日目、及び35日目に、200μLのリン酸塩緩衝食塩液(PBS、0.1M、pH7.4)中、種々の用量(10、25、又は50μg)のコレラトキシン(CT、List Biological Laboratories,Inc社)とともに100μg若しくは200μgのOVA又は100μgのOvmを腹腔内注射した。第4群(対照)には、50μgのCTのみを投与した。免疫応答の進行を検出するため、21日目、35日目、及び45日目に採血して血清とした。室温で1時間凝血させた後、個別の血清を採取して、OVA又はOvmに対するIgG(全分子)関連抗体を検出するために-20℃で保存した。PCA反応のため、同腹動物の個別の血清を同量プールした(別々に感作し対照をプールした)。45日目、52日目、59日目、66日目、73日目、80日目に動物の舌下腺又は頬の口腔上皮に口腔粘膜PSFパッチを貼付して処置した。チャレンジ後、アレルギーの臨床的兆候がないかブタを監視した(0~60分)。
チャレンジ:92日目に、3:2(v/v)の卵白:ヨーグルトを含む40mLのヨーグルトスラリーを経口で動物にチャレンジした。
血清の分析:ブタ血清の抗OVA又は抗Ovm抗体をELISAで分析した。簡単に述べると、ポリスチレン製の高結合性96ウェル平底プレート(Immulon2HB、VWR International社)を4℃で一夜インキュベートすることにより、100μL/ウェルの0.05M炭酸塩重炭酸塩緩衝液(pH9.6)中のOVA又はOvm(100μg/mL)でコートした。プレートを200μL/ウェルの0.5%Tween20含有PBS(PBST)で3回洗浄し(Automatic Plate Washer,ELX405、Biotek Instruments Inc.社)、200μL/ウェルのPBS中3%Tweenで、室温で1.5時間、ウェルをブロッキングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、PBSTで100倍に希釈した血清を100μL/ウェルでトリプリケートとして加えて、室温で2時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、8000倍に希釈した100μLのアルカリホスファターゼコンジュゲートウサギ抗ブタIgG(全分子、Sigma社)をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ジエタノールアミン緩衝液(pH9.8)中のポリニトロフェノール-ホスファターゼ基質(Sigma社、1mg/mL)の溶液(100μL/ウェル)を加えて、室温、暗所でインキュベートした。対照には、血清なしのウェル、並びに陽性(抗体が高いプールした35日目の血清)及び陰性血清(10日目からプールした血清)のウェルが含まれていた。陽性対照の光学密度(OD)が1に達したときに、ELISAプレートリーダー(EL808、BioTek Instruments Inc社)を用いて405nmでウェルのODを測定した。OVA又はOvm抗原を入れたウェルの吸収値からブランク吸収(血清なし)値を差し引くことによって非特異結合効果を補正する装置のソフトウェアを用いて、全ての試料について正味の吸収値を計算した。各トリプリケート試験血清の平均ODを、以下のように陽性対照に対する百分率(陽性率)として表した。OD変化%=[試料OD/(陽性対照OD-陰性対照OD)]
皮膚過敏性:即時能動的過敏反応を試験するため、10日目の感作前及び21日目、35日目、46日目、67日目、及び88日目の感作後に、全ての動物について皮内皮膚試験を実施した。内腿の注射部位には消えないインクペンでマークした。各皮膚試験について、ツベルクリンシリンジ及び25ゲージの針を用いて、PBS中100μL(100μg)のOVA又はOvmを皮内注射した。陰性対照はPBSであった。全ての皮内試験(血清及びPBS)は、同時に実施し、同時に読み取った。1人の研究者が全ての注射を実施した。注射の15分後に、少なくとも2人の観察者が腫脹及び発赤の応答について各部位を個別に検査し、陽性又は陰性について合意が得られた。
臨床スコア:92日目の口腔粘膜チャレンジによる誘導の後、スコアリングシステムを用いて過敏性応答を評価した。口腔チャレンジの後、0~60分で、少なくとも3人の観察者による盲検法により、目視で応答をスコア付けした。それぞれのブタを個別に評価して以下のようにスコア付けした。0=兆候なし。1=不動性、不活発、沈滞、引っ掻き、発疹。2=下痢、嘔吐。3=呼吸数の増加、頸部伸展。4=強制呼気。5=その他の兆候(様々)。総スコアは各動物に割り当てた個別のスコアを合計することによって得た。
受身皮膚アナフィラキシー:処置群(CT処置対照及び感作)から血清をプールし、アリコートを56℃で熱し4時間処理して、想定されるIgE-抗OVA若しくは抗Ovm PCA介在抗体を不活化した。未処理のブタの内腿のマークした部位に血清を体積100μLのデュプリケートで皮内注射した。24時間後に、23ゲージの針を用いて背部耳静脈に1.0mLの無菌PBS中5mgのOVA又はOvmを注射した。皮膚注射部位における腫脹又は発赤の反応の発現を少なくとも3人の観察者によって検査した。同腹のそれぞれにおける感作したブタから得た血清も個別にPCA応答について検査し、相対的重篤度に基づいて各部位をグレード付けした(+、++、+++、++++)。
解析:InStat Package4.0(GraphPad Software Inc社)を用いてデータを解析した。有意性評価において信頼区間を少なくとも95%に設定した。比較は、血清IgG-抗OVA又は抗Ovmの10日目と45日目との間、及び対照(CT)と感作(OVA又はOvm)抗体との間で行った。検出された抗体の比較のための一次データは、実験ユニットとして動物を用いる一方向ANOVA検定及びそれに続く処置群の間の有意差を求めるTukeyの多重比較検定によって解析した。PCA反応と臨床スコアとの間の関係は、直線回帰及びPearson相関解析(GraphPad Prism、version4.0)によって評価した。
結果
細菌粒子が抗原を口腔APCに効率的に標的化するために用いることができ、これらが患者特異的T細胞に対して寛容化効果を有することが立証されたので、OVA又はOvmで感作した仔ブタを用いる前臨床モデルで、これらの製剤を試験した。これらの仔ブタは重篤なAHR、即ち細胞浸潤を伴う肺の炎症、及び全身性のOVA又はOvm特異的Th2免疫応答を示す。オブアルブミン又はオボムコイドで感作した仔ブタに、PBS、OVA若しくはOvm、BLP単独又はBLPと製剤化したOVA若しくはOvmを、6週間にわたって週に1回、粘膜接着性PSFパッチを介して送達して、口腔粘膜処置した。
OVA又はOvmを負荷したBLPを粘膜接着性PSFパッチとともに投与する口腔粘膜処置により、試験した全ての動物でAHRが劇的に低減した。一方、可溶性のOVA又はOvm単独での処置では、AHRに対して中程度の効果しかなかった。OVA又はOvmを負荷したBLPでは、6週間の口腔粘膜投与の後に仔ブタから回収した縦隔及び頸部のリンパ節で評価した細胞応答によって測定すると、中程度の効果を有していた。この序列は、粘膜接着性のOVA-BLP又はOvm-BLPで処置され、PBS又は粒子のみで処置された動物と比較して抗原に応答して低いIL-13及びIL-5の産生並びに高いIL10の産生を示した動物の頸部リンパ節からのサイトカインの測定値と類似しており、組み合わせによる免疫のシフト及び制御性寛容原性応答の誘導が示された。
結論
ヒト類似食物アレルギーモデルにおいて、BLP粘膜接着性PSFパッチによる抗原の口腔粘膜送達は、抗原単独の場合と比較して、免疫応答を短期間で制御し寛容誘導効果に導く点で優れている。さらに、ビタミンD3及びD-マンノースの存在により、寛容原性効果はさらに向上する。
実施例D1:前記自己抗原と組み合わせたBLPの口腔粘膜投与に続くインスリンへの寛容の誘導
緒言
自己免疫は、自己抗原への寛容の喪失に起因する自発的な炎症組織損傷及び生理学的機能の低下によって特徴付けられる。これは部分的に過活性の免疫系と関連し、それはヘルパーT(Th)細胞の過剰によって特徴付けられる。感受性遺伝子及び環境因子等の素因は支配することが困難であり、したがって免疫療法を開発するための最近の努力は、病原性エフェクター細胞を低減させ及び/又は免疫制御性T細胞を増大させることによって両者の機能的バランスを再確立することに注がれている。膵島β細胞の自己免疫性破壊は1型糖尿病(T1D)の主因である。この破壊はいくつかのβ細胞自己抗原に対する細胞性及び液性の免疫応答に関連しており、両方が疾患の臨床的発現に先行する可能性がある。
ここで、細菌粒子と組み合わせた自己抗原の口腔粘膜送達によって、抗原特異的CD4制御性T細胞の誘導を介して糖尿病特異的免疫応答が抑制されることを実証する。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスのBLPは、基本的には実施例A1に記載したように調製した。BLPは最終濃度が10mg/mLのBLP並びに0.1mg/mLのビタミンD3及びD-マンノース、及び/又は10mg/mLの抗原になるよう、ビタミンD3(Sigma Aldrich社)及び/又はD-マンノース(Sigma Aldrich社)とともに製剤化した。用いた製剤を表6にまとめる。
抗原:インスリンペプチド断片InsB9-23
マウス
非肥満の雌及び雄の糖尿病(NOD)マウス及びNOD-重症複合免疫不全(SCID)(Balb/cバックグラウンド)マウスはJackson Laboratory社から購入した。Balb/c野生型(WT)マウスはCharles River Italy社から購入した。マウスは特定病原体なしの中央動物施設で維持した。マウスは機関のガイドラインに従って取り扱い、使用した。
実験の設定
治療の設定において、BLP-InsB9-23の組み合わせ(又は対照としてBLP)を、8週間連続で週に5回、糖尿病NODマウスに舌下腺投与した。SLIT手順の終了後1週間で、マウスを犠牲死させ、分析を実施した。
SLIT手順:安定な糖尿及び高血糖を示す(12~23週)8匹のNOD雌マウスの群に、BLP-InsB9-23溶液(用量あたり100μgのBLP及び100μgのInsB9-23)又はBLP(100μg)及びPBS対照を週に5回、舌下腺投与した。SLITはマウスの首筋を保持して舌の下に2×5μLの各処置物を適用することによって実施した。マウスが直ちに溶液を飲み込むことを防止するため、それぞれの投与の後、さらに20秒、マウスを固定した。陽性(寛容化)対照群として、Bressonら(J.Clin Invest.2006,116:1371-1381)に記載されているように糖尿病NODマウスを処置した。尿糖の消失及び正常血糖への復帰を完全寛解の定義とした。
同系島移植の設定において、糖尿病を最近発現した雌NODマウスをBLP-InsB9-23又は陰性対照としてBLPで4週間、舌下腺で処置した。4週間後に、非糖尿病NODマウスから新たに単離した500個の膵島を、糖尿病のNODマウスに移植した。次いで糖尿病の再発まで、又はグラフト後15週まで、血中グルコースを週3回モニターした。2回連続でグルコースレベルが250mg/dL以上の動物を糖尿病と考え、殺処分して血清を採取し、移植片を組織学的に解析する。
NODマウスを特異的自己抗原で再チャレンジした後、NOD-SCIDマウスへの養子T細胞伝達によって、寛容誘導の正確な機構をインビトロ及びインビボで解析した。
糖尿病の検出
グルコースのモニタリング:尿中グルコースはDiastix(Miles社)を用いて測定し、血中グルコースモニタリングシステムOne Touch Ultra(LifeScan Inc社)による血中グルコース測定によって確認した。2回連続で250mg/dL以上の血中グルコース値を糖尿病と定義した。
膵島炎:CO窒息によってマウスを殺処分し、膵臓を10%ホルマリンで一夜固定し、パラフィンに包埋して、連続した5μmの切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。膵島炎のスコア(平均±SD)は、マウス1匹あたり10~15個の島について細胞浸潤の程度を顕微鏡で以下のようにグレード付けして決定した。0、島浸潤の目視できる兆候なし。1、島周辺の浸潤。2、50%未満の浸潤。3、50%超の浸潤。
島の単離及び移植:膵島炎及び糖尿病のない14~21日齢のドナーNODマウスの島を無菌的に取り出した後で、激しく振盪しながらHanksの平衡塩類溶液中、コラーゲナーゼで膵腺を消化することによって島を単離した。島の単離は、立体顕微鏡下、手で直接採取することによって行った。レシピエントの糖尿病NODマウスは、アベルチン(0.02mL/gBWT)の腹腔内注射によって麻酔し、腰部の切開によって左腎を露出して、500個の新たに単離した島を腎被膜下に投与した。
免疫組織化学:
膵臓β細胞におけるインスリン、CD4、及びCD8の発現を検出するため、Christenら(Diabetes 2004,53:591-596)に記載されたように、一次抗体(Dako社のモルモット抗ブタインスリン(300倍希釈)、BD Biosciences社の抗CD4 RM4.5、及び抗CD8a IHC(50倍希釈))を凍結組織切片に加えた。
インビトロ増殖アッセイ
脾臓、腸間膜リンパ節(MLN)、及びPLNの単一細胞懸濁液を調製する。全脾臓細胞集団の増殖アッセイ、2×10個の細胞を単独で、又は段階を付けた濃度(1~100μg/mL)の精製したヒトインスリン若しくはCD4T細胞に特異的なペプチド(InsB9-23、H-2d or g拘束性)若しくはCD8T細胞に特異的なペプチド(InsB15-23、K拘束性)(Sigma社)とともに、或いは抗IL-10又は抗TGF-β中和モノクローナル抗体あり又はなしで、全体積200μLの完全培地中、96ウェルU底プレートで培養した。中和抗体は1、0.1、及び0.01μg/mLで加えた。全CD3T細胞、CD8T細胞、CD4T細胞、及びCD4CD25T細胞集団の増殖アッセイのため、0.2×10個のT細胞を、インスリン又はGAD65又はCD4若しくはCD8T細胞に特異的なペプチドを負荷したWT Balb/cマウスの1×10個の照射した脾細胞とともに、中和抗体あり又はなしで、全体積200μLの完全培地中、96ウェルU底プレートで培養した。5%COの加湿したインキュベーター中、37℃で72時間後、1μCi/ウェルの[H]チミジンを加えることによって増殖を評価した。16~18時間後に、DNAに結合した放射活性をガラス繊維フィルターマット(Perkin Elmer社、Boston、USA)に収穫し、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer社)で測定した。T細胞は、CD3、CD4、又はCD8単離キット(MACS、Milteny Biotec社、Auburn、CA)を用いる磁性ビーズ分離による陰性選択によって、PLN又は脾臓から精製した。CD4T細胞は全細胞として用いるか、又はCD25単離キット(Milteny Biotec社)を用いるMACSによってCD25及びCD25にさらに分離する。細胞集団の純度(90%超)は、フローサイトメトリー解析によって決定する。
サイトカインの測定のため、上記の種々の増殖アッセイ(抗原特異的刺激)に用いた細胞培養の上清を培養の72時間後に採取し、サイトカインの分析を実施するまで-80℃で凍結した。サイトカインの産生はMouse Inflammation Cytometric Bead Assay(BD Biosciences社、Mountain View、CA、USA)を用いて定量した。精製したCD3T細胞、CD4T細胞、又はCD8T細胞を培養し、抗CD3/抗CD28混合物(それぞれ1μg/mL)で24時間、インビトロで非特異的に刺激し、或いは対照として刺激なしのままとした。上清を収穫し、FCAPアレイソフトウェア(BD Biosciences社)を用いるBD FACSArray Bioanalyzerで、BD(商標)Cytometric Bead Arrayフレックスセットを用いて、IL-10、IL-4、IL-5、及びIFN-γの産生について解析した。Quantikineキット(R&D Systems社)を用いる捕捉ELISA実験を用いてTGF-β1を決定した。
インビトロT細胞増殖阻害アッセイ
最近糖尿病になった雌NOD(8~12週齢)から単離した2×10個の精製した全脾臓CD4CD25T細胞を、WT Balb/cマウスのT細胞が枯渇し照射したインスリン又はペプチドを負荷した2×10個の脾細胞の存在下に、別の実験群の脾臓、MLN、又はPLNから単離した様々な数のCD8T細胞、CD4T細胞、及びCD4CD25T細胞集団と共培養した。5%COの加湿したインキュベーター中、37℃で72時間後、1μCi/ウェルの[H]チミジンを加えることによって増殖を評価する。16~18時間後に、DNAに結合した放射活性をガラス繊維フィルターマット(Perkin Elmer社、Boston、USA)に収穫し、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer社)で測定した。
インビトロ細胞毒性アッセイ
用いたリンパ芽球標的はBALB/cマウスのConA活性化脾細胞であった。全部で10個の標的細胞を100μCiの51Cr(Amersham International社、Buckinghamshire、UK)で37℃、90分、標識し、3回洗浄して、1μg/mlのペプチド(InsB15-23又は無関係のペプチド)と37℃で1時間インキュベートした。標的細胞を2回洗浄し、ウェルあたり10個の細胞を播種した。脾臓、MLN、及びPLNから単離したCD8T細胞を種々のエフェクター:標的(E:T)比でトリプリケートとして各ウェルに加えた。プレートを500rpmで2分遠心し、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーションの後、51Crの放出を決定するため上清を採取した[%溶解=100×(試験cpm-自発cpm)/(全cpm-自発cpm)]。間接殺傷アッセイのため、エフェクターとのインキュベーションの前にCD8T細胞を5μg/mLの抗CD3抗体(クローン145-2C11、Pharmingen社)とインキュベートした。
糖尿病の養子伝達
8~10週齢のNOD-SCIDマウスに、別のBLP処置実験群から単離した、ビーズで精製し、段階を付けた数のCD3T細胞、CD8T細胞、CD4T細胞、CD4CD25、又はCD4CD25T細胞と組み合わせ又は組み合わせずに、糖尿病の雌NODマウス(6週、12週、及び18週)から単離した脾細胞2×10個を静脈内、又は5×10個を腹腔内注射した。未処理のマウスを対照として用いた。糖尿病の進行は血中グルコースレベルを連続的に週3回モニターすることによって判定した。
結果
BLP-InsB9-23は同系島移植後の糖尿病の再発を遅延させる。BLP-InsB(9-23)が経口寛容を誘導するか否かを評価するため、同系島移植後の糖尿病の再発を研究した。したがって、上記(実験の設定)のようにマウスの口腔粘膜を処置し、上記(島の単離及び移植)のように膵島を移植した。糖尿病の再発はInsB9-23群において対照と比較して遅延していた。
BLP-InsB9-23は非肥満糖尿病マウスの遊離InsB9-23の寛容誘導能を有意に向上させた。経口寛容の誘導を研究するため、上記(実験の設定)のようにマウスの口腔粘膜を処置した。InsB9-23群において脾細胞の自己抗原特異的増殖応答が対照及び遊離のInsB9-23群と比較して有意に低減したので、BLP-InsB9-23の舌下腺投与は自己抗原に対する寛容の誘導を有意に向上させた。
BLP-InsB9-23は膵島炎の低減、β細胞の崩壊速度の低減、及び脾細胞によるIL-10産生の増大に伴って経口寛容を増強した。経口寛容の誘導を研究するため、上記(実験の設定)のようにマウスに経口で飼料を与えた。上記自己抗原に応答する膵島炎の存在、β細胞の崩壊の速度、及びサイトカインの産生は、上記のようにして決定した。組織学的解析により、BLP-InsB9-23群において対照群及び遊離のInsB9-23群と比較して膵島炎及びβ細胞の崩壊の有意な低減、並びにIL-10産生の増大が示される。
BLP-InsB9-23はCD4T細胞を介して経口寛容を向上させる。CD4T細胞が経口寛容の誘導に介在しているかを評価するため、膵細胞及びリンパ節における自己抗原特異的増殖CD4T細胞応答を研究した。したがって、上記(実験の設定)のようにマウスに経口で飼料を与え、上記(インビトロ増幅アッセイ)のように自己抗原特異的CD4T細胞増殖を判定した。対照群及び遊離のInsB9-23群と比較したBLP-InsB9-23群における自己抗原特異的CD4T細胞の応答。
NODマウスにおける自己攻撃性CD8応答はBLP-InsB9-23療法の後で抑制される。発明者らの組み合わせアプローチによって、バイスタンダー抑制機構による糖尿病の制御が可能な抑制性CD4T細胞が誘導されるかを検討するため、CD8自己攻撃性T細胞に対する影響を解析した。抗原特異的自己攻撃性CD8細胞の百分率及び/又は活性は、BLP-InsB9-23療法の後で著しく低減した。
BLP-InsB9-23療法の後、抗原誘導T制御細胞はインビボで自己免疫様応答からの保護を伝達することができる。経口寛容プロトコルで処置したマウスにおける糖尿病様応答の能動的抑制を試験するため、上記(糖尿病の養子伝達)のように別の処置群から脾細胞を養子伝達した。対照群及び遊離のInsB9-23群と比較して、糖尿病様応答はBLP-InsB9-23群で有意に低減し、発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコルにおける制御性CD4T細胞の活性化を示した。
結論
細菌粒子による自己抗原の口腔粘膜送達により、自己免疫疾患における免疫応答は、抗原特異的CD4制御性T細胞の誘導を介して口腔粘膜で抑制されることを実証する。
実施例D2:前記自己抗原と組み合わせたBLPの経口投与の後のグリアジンに対する寛容の誘導
緒言
セリアック病は、摂取した食事中のグリアジンに対する寛容の喪失によって惹起され、HLA-DQ2又はHLA-DQ8拘束性T細胞応答によって介在される。効果的な処置は、コムギ又はライムギ若しくはオオムギ等の関連する穀物のタンパク質の中に存在するグリアジンを含む食物を生涯にわたって摂取できないという社会的に制限された食事によってしか、達成することができない。厳密にグルテンを含まない食事によって腸は治癒するが、グルテンに対する不寛容は永久的であり、より良い治療の選択肢が必要である。セリアック病については、トリガー(グルテンタンパク質グリアジン)、遺伝的関連(HLA-DQ2又はHLA-DQ8)、及び高度に特異的な液性応答がよく特徴解析されてきた。疾患の活性は抗原の存在及び量に強く相関するので、医薬の舌下腺送達を用いる抗原特異的な経口寛容の誘導(SLIT)は、魅力的な治療アプローチである。経口寛容は、抗原特異的エフェクターT細胞のアネルギー、欠失、及び/又は制御性T細胞(Treg)による能動的抑制等の多重の機構によって介在される。
ここで本発明者らは、BLPの存在下における脱アミノ化グリアジンペプチドの経口送達によってNOD ABDQ8トランスジェニックマウスにおける全身性DQ8特異的T細胞応答の抑制が誘導され、DQ8d抗原特異的寛容を誘導する方法が提供されるかを検討する。
材料及び方法
細菌粒子:ラクトコッカス・ラクティスのBLPは、基本的には実施例A1に記載したように調製した。任意選択で、BLPは最終濃度が10mg/mLのBLP並びに0.1mg/mLのビタミンD3及びD-マンノース、及び/又は10mg/mLの抗原になるよう、ビタミンD3(Sigma Aldrich社)及びD-マンノース(Sigma Aldrich社)とともにPBS中で製剤化した。
抗原:脱アミノ化DQ8dペプチドGAPVPYPDPLEPRQYPSGEGSFQPSQENPQAはGenscript社から購入した。
研究に用いた口腔製剤を表7にまとめる。
マウス
NOD ABDQ8トランスジェニックマウス及びNOD ABマウスはMayo Clinicから購入した。7~16週齢のマウスを実験に用いた。マウスを乳離れさせ、グルテンを含まない餌で維持し、8~12週齢になるまで従来の動物施設に保持した。マウスは国家ガイドラインに従って処置し、使用した。
実験の設定
グルテンを含まない餌を与えたNOD ABDQ8マウスを、100μLの1:1CFA(完全フロイントアジュバント、Becton,Dickinson and CompanyのDifco社より購入)食塩液中、100μgのDQ8dペプチドを1日目に尾の基部に皮下注射することによって感作した。感作に用いたペプチドは処置に用いたペプチドと同じ配列を有していた。7~16週齢のマウスを実験に用いた。マウスを乳離れさせ、グルテンを含まない餌で維持し、8~12週齢になるまで従来の動物施設に保持した。1処置群あたり8匹のマウスの群を用いた。マウスには陰性対照としてPBS、及び表7に示す製剤を投与した。マウスには8週間にわたって週に5回、用量あたり100μgのDQ8d及び/若しくは100μgのBLP、又はPBS緩衝液を舌下腺投与した。SLITはマウスの首筋を保持して舌の下に2×5μLの各処置物を適用することによって実施した。マウスが直ちに溶液を飲み込むことを防止するため、それぞれの投与の後、さらに20秒、マウスを固定した。SLIT処置の1週間後に開始して1週間隔で4回、抗原特異的DTH応答を評価した。その後24時間でDTH測定を実施した。抗原特異的DTH応答の測定のため、技師用マイクロメーター(Mitsutoyo)を用いてベースラインの耳の厚さを測定した。次いでマウスの耳介に10μLの食塩液中、10μgのDQ8dを注射した。チャレンジの24時間後に盲検法で耳の厚さを再測定した。DTH応答は、ベースラインの耳の厚さとDQ8dの注射の24時間後の耳の厚さとの差として表した。続いてマウスを犠牲死させ、脾臓及びリンパ節を収穫し、細胞のDQ8d特異的増殖及びサイトカインの産生を評価した。
固有層細胞の単離:マウスをCO吸入で麻酔し、小腸を取り出してメスの刃を用いて長さ方向及び横方向に長さ2cmの小片を切り出した。組織をCMF/HEPES溶液(1×ハンクス平衡塩類溶液、15mMのHEPES、2%のFBS)で6回洗浄し、続いてCMF/FBS/EDTA溶液(1×ハンクス平衡塩類溶液、10%のFBS、15mMのHEPES、5mMのEDTA、100μgのペニシリン/ストレプトマイシン)中で1時間インキュベートして上皮細胞を除いた。続いてコラーゲナーゼ(100U/mL)で1時間消化して固有層のリンパ球を放出させた。
細胞培養、増殖、及びサイトカイン産生アッセイ:実験の11日目に、1×PBS中で組織グラインダー(VWR International Inc社)で組織をホモジナイズすることによって、脾臓及びリンパ節の細胞懸濁液を調製した。塩化アンモニウム/カリウム溶解緩衝液とインキュベートすることによって、脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去した。培地単独、10μg/mLのConA、50μg/mLの無関係なペプチド、又は50μg/mLのDQ8dエピトープを含むサプリメントを加えたRPMI1640(1.5%のHEPES、1%のPenstrep、及び10%のFBS)中、37℃、0.2mLの体積、5×10個の細胞/ウェルで、96ウェルマイクロタイタープレート中で細胞をインキュベートした。別の実験で、IL-10、TGF-β、IL-10及びTGF-β、又はLAP中和抗体を、処置したマウスの脾細胞に加えた。24時間後、培養の最後の24時間で、1μCi/ウェルの[H]チミジンを加えることによって増殖を評価した。DNAに結合した放射活性をガラス繊維フィルターマット(Perkin Elmer社)に収穫し、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンター(Perkin Elmer社)で測定した。結果はトリプリケートウェルの1分あたり平均カウント(CPM)として表した。中和抗体増殖アッセイについては、結果はPBS処置群と比較した処置群の増殖の百分率として表した。サイトカインの測定のため、上記の種々の増殖アッセイで用いた細胞培養の上清を培養の24時間後に採取し、サイトカインの分析を実施するまで-20℃で凍結した。サイトカインの産生はMouse Inflammation Cytometric Bead Assay(BD Biosciences社)を用いて定量した。
固有層細胞を用いるT細胞増殖のアッセイ:SLIT処置から固有層細胞を単離した。次いでこれらの細胞(5×10個/mL)を培地(RPMI、Sigma-Aldrich社)、DQ8dエピトープ(50μg/mL)又は無関係なペプチド(50μg/mL)と24時間インキュベートし、さらに24時間、[H]チミジンを添加した。次いで脾細胞と同様にして細胞を収穫した。
フローサイトメトリー解析:SLIT処置したマウスの脾臓及び頸部リンパ節組織を単離し、上記のように調製し、CD4、CD25、及びFoxp3について染色した。Foxp3についてはメーカーの説明書(eBiosciences社)に従って細胞内染色を実施し、Becton Dickinson社のFACSCalibursによるフローサイトメトリーで測定した。細胞はCD4CD25及びCD4CD25サブ集団でゲートし、これらの集団の中でFoxp3ヒストグラムを用いて平均蛍光強度(MFI)を決定した。
T細胞の表現型の決定:CD4抗体及びCD25抗体はBD Biosciences社から購入した。APC抗Foxp3染色キットはeBiosciences社から購入した。抗IL-10中和モノクローナル抗体(1μg/mL、クローンJES052A5)、TGF-β中和モノクローナル抗体(1μg/mL、クローン1D11)、及びLAP(潜在関連ペプチド)中和抗体(1μg/mL、クローン27235)は、R&D Systems社から得た。
統計解析:サイトカイン測定の結果は平均±SEMとして表す。DQ8d特異的増殖、耳の厚さ、及びサイトカインの測定を、一方向ANOVA及びそれに続くstudentのt検定比較により有意差検定し、個別の群の間の差を判定した。全ての試験について0.05未満のP値を用いて統計的有意を示した。
結果
DQ8d-BLPによるDTH及び増殖応答の抑制。NOD ABDQ8トランスジェニックマウスを、DQ8d、BLP、Dq8d-BLP、及びDQ8d-BLP-VM(追加のビタミンD3及びD-マンノース)並びにPBS(陰性対照として)で10日間連続、SLIT処置した。10日目に、マウスの耳に10μgのDQ8dを注射し、24時間後に耳の厚さの測定を実施した。対照マウス(PBS)は明らかにDQ8dに感作された。DQ8d-BLPによる毎日のSLIT処置により、試験期間全体にわたってDTH応答が有意に低減した(P<0.05)。耳の腫脹もDQ8d-BLP-VM処置マウスでは対照と比較して有意に低減した(P<0.01)が、Dq8d-BLP群とは統計的有意差はなかった。DQ8d及びBLPの群の耳の腫脹は僅かに低減したが、PBS群と比較して統計的有意差には達しなかった。これらのデータは、経口投与されたDQ8d-BLPがビタミンD3及びD-マンノースの存在下又は非存在下において、免疫されたNOD ABDQ8トランスジェニックマウスの全身性炎症性T細胞応答を抑制すること、及び有意な寛容原性効果を誘導するには抗原とBLPの両方が必要であることを示している。
脾臓及び流入領域頸部リンパ節細胞のDQ8d特異的増殖を検討することによって、末梢免疫応答をさらに解析した。PBS、BLP、又はDQ8-BLP若しくはDQ8-BLP-VMで処置したマウスの脾細胞をSLITの11日後に単離し、DQ8dペプチド又は無関係なペプチドによるエクスビボ刺激によってDQ8d特異的増殖応答を評価した。感作したマウスの脾細胞は高いDQ8d特異的増殖応答を示したが、これはDQ8-BLP又はDQ8-BLP-VMによる毎日のSLIT処置によって、PBSで処置した対照マウスと比較して有意に抑制され、DQ8-BLP-VMにおいてより良好な抑制の傾向があった。BLP群では有意な抑制は観察されなかった。しかし、頸部リンパ節はこのSLITプロトコルにおいて主要な抗原認識部位であるので、これらのリンパ球の増殖能も検討した。頸部リンパ節細胞の増殖はDQ8d-BLP又はDQ8d-BLP-VM処置群においてPBS処置群と比較して有意に減少し、BLP群では有意な増殖はなかった。3つの処置群全てにおいて、無関係な対照ペプチドを加えた場合には、脾細胞及び頸部リンパ節細胞は増殖応答を示さなかった。
固有層細胞において抗原特異的抑制が存在するかを判定するため、DQ8d-BLP、DQ8d-BLP-VMでSLIT処置したマウス、並びにPBS単独又はBLPで処置したマウスから、これらの細胞を単離した。次いでこれらの細胞をインビボで、培地、DQ8d、又は無関係な対照ペプチドで処理した。処置したマウスの3群全てで固有層細胞の増殖の高いバックグラウンドが観察された。しかし、DQ8d-BLP又はDQ8d-BLP-VMで処置したマウスでDQ8dペプチドのみの添加によって増殖が抑制された。固有層における増殖は無関係な対照ペプチドの添加によっては消失しなかった。これは、固有層においてはDQ8d-BLP(-VM)によるSLIT処置によって誘導された抑制がDQ8dペプチドに特異的であることを実証している。
抗原誘導T細胞増殖の低減に関与する機構を検討するため、エクスビボで刺激された脾細胞又は鼠径部リンパ節細胞のサイトカインプロファイルを決定した。DQ8dでエクスビボ刺激された脾細胞は、DQ8d-BLP及びDQ8d-BLP-VMで処置された群においてのみ、陰性対照(PBS)と比較してIL-10の顕著な上方制御及びIL-12産生の下方制御を示した。さらに、DQ8d-BLP及びDQ8d-BLP-VM処理により、鼠径部リンパ節におけるDQ8dに誘導されるIFN-γの産生が陰性対照(PBS)処理マウスと比較して有意に低減した。無関係なペプチドで脾細胞及び鼠径部リンパ節細胞を刺激した場合には、処理群にわたってサイトカインレベルに相違はなかった。無関係なペプチドの添加はまた、4つの処理群の培地のIL-10及びIL-12p70のレベルを変化させなかった。まとめると、増殖及びサイトカインのデータは、DQ8d-BLP(-VM)SLIT処置によって、NOD ABDQ8トランスジェニックマウスのT細胞応答を抗原特異的に全身的に抑制できることを示している。
DQ8d-BLP介在性抑制におけるTGF-β及びIL-10の重要な役割。DQ8d-BLP及びDQ8d-BLP-VMで処置したマウスの脾細胞のDQ8d特異的脾細胞増殖応答に対するTGF-β、IL-10、及びLAP(膜関連TGF-β)の、PBS対照群と比較した機能的重要性を、中和抗体を用いて評価した。IL-10、TGF-β、又はLAPの個別の中和はDQ8d-BLP及びDQ8d-BLP-VMで処置したマウスの低下した脾細胞増殖応答に有意には干渉しなかったが、TGF-βとIL-10の中和モノクローナル抗体の組み合わせを添加すると、脾細胞の低下したDq8d特異的増殖能が完全に失われた。これらのデータは、DQ8d-BLP又はDQ8d-BLP-VM処置が介在するT細胞活性化の抑制がIL-10とTGF-βの相互作用によることを強く示唆している。
CD4CD25及びCD4CD25T細胞によるFoxp3発現の増大。DQ8d-BLP又はDQ8d-BLP-VMによって誘導された寛容の誘導における制御性T細胞(Treg)の役割を解析するため、CD4T細胞集団の中のFoxp3の発現をFACS解析によって検討した。DQ8d-BLP及びDQ8d-BLP-VMで処置したマウスの脾臓で、対照群(PBS)と比較してFoxp3CD4CD25細胞並びにFoxp3CD4CD25細胞の数の有意な増加が見られたが、BLP又はDQ8dのみの群はFoxp3CD4T細胞の数の有意な増加を示さなかった。DQ8d-BLP及びDQ8d-BLP-VMで処置したマウスの口腔流入領域リンパ節組織においても、PBS、BLP、又はDQ8d処置マウスと比較してFoxp3CD4CD25細胞の数の増加が検出されたが、CD4CD25の集団では増加は検出されなかった。これらのデータは、DQ8d-BLP(-VM)のSLIT投与によるFoxp3T細胞の増加とグリアジンに対する免疫応答の抑制との間に強い関連があることを示唆している。
結論
ここで、BLPの存在下における脱アミノ化グリアジンペプチドの舌下腺経口送達(SLIT)がNOD ABDQ8トランスジェニックマウスの全身性DQ8特異的T細胞応答の抑制を誘導し、DQ8d抗原特異的寛容を誘導する方法を提供することを実証する。結果は、BLPをビタミンD3及びD-マンノースと共製剤化した際に最も顕著であった。さらに、このアプローチは、非生存細菌粒子と関連して、口腔粘膜免疫系に適切な様式で正しい抗原を送達する方法を提供し、セリアック病の効果的で毒性のない治療となる可能性を有している。ここではNOD ABDQ8トランスジェニックマウスの全身性DQ8特異的T細胞応答の抑制を誘導するためにDQ8d-BLPを用いたが、同様の動物モデルでこれらの抗原の代わりにDQ2.5又はDQ2.2を用いても同じ結果が得られるであろう。

Claims (9)

  1. 対象における抗原に対する免疫寛容を誘導する使用のための非生存細菌粒子及び抗原を含む粘膜接着性担体であって、
    前記粘膜接着性担体が前記対象に経粘膜投与され、
    前記粘膜接着性担体が、
    前記非生存細菌粒子及び精製された抗原が組み込まれた又は負荷されたナノ繊維を含むパッチであり、又は、
    前記非生存細菌粒子及び精製された抗原が含浸された又は負荷された水膨潤性の架橋ポリマーのヒドロゲル又はフィルムであり、
    前記非生存細菌粒子が、
    a)酸性熱処理されたグラム陽性細菌、
    b)グラム陰性細菌を溶解して得られる空の細菌エンベロープ、又は
    c)化学滅菌された細菌
    であり、前記非生存細菌粒子が、腸内有益菌(プロバイオティクス)に用いられる無害の細菌に由来する、粘膜接着性担体。
  2. 前記抗原が免疫応答関連疾患を惹起し又は免疫応答関連疾患に関連する、請求項1に記載の粘膜接着性担体。
  3. 前記免疫応答関連疾患が、セリアック病、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、I型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、リウマチ性関節炎、尋常性天疱瘡、及び食物アレルギーからなる群から選択される、請求項2に記載の粘膜接着性担体。
  4. 前記抗原が、
    α-グリアジン、
    ホルデイン、
    ハウスダストマイトの免疫優勢エピトープ、
    ネコの唾液、皮膚又は腺からのペプチドの免疫優勢エピトープ、及び
    1型糖尿病に関与するペプチドの免疫優勢エピトープ
    からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
  5. 前記ハウスダストマイトの免疫優勢エピトープが、Der p2.1であり、
    前記ネコの唾液、皮膚又は腺からのペプチドの免疫優勢エピトープが、Feld1であり、
    前記1型糖尿病に関与するペプチドの免疫優勢エピトープが、pINS、GAD65、InsB9-23、又はIA2である、請求項4に記載の粘膜接着性担体。
  6. 前記粘膜接着性担体が、電気紡糸繊維を含むパッチである、請求項1~5のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
  7. 前記非生存細菌粒子が、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ビフィドバクテリウム、又は大腸菌ニスルに由来する、請求項6に記載の粘膜接着性担体。
  8. a)前記酸性熱処理されたグラム陽性細菌が、L.ラクティスであり、
    b)前記空の細菌エンベロープが、大腸菌ニスルを溶解して得られるものであり、
    c)前記化学滅菌された細菌が、L.ラクティス、Lb.ラムノサス、又は大腸菌ニスルである、請求項6又は7に記載の粘膜接着性担体。
  9. 前記対象が、ヒト又は動物である、請求項1~8のいずれか一項に記載の粘膜接着性担体。
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