JP7286184B2 - 血管内皮機能改善用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、プロシアニジンＢ１（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ１；以下、「ＰＢ１」とも言う）及びプロシアニジンＢ３（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎ Ｂ３；以下、「ＰＢ３」とも言う）を含有することを特徴する血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物に関し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３が松樹皮由来であることを特徴とする血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物に関する。

近年、食生活やライフスタイルの変化に伴って生活習慣病が増加している。生活習慣病とは、高血圧症、高脂血症、糖尿病などの疾患に加え、狭心症、心筋梗塞、脳循環障害、悪性腫瘍など生活習慣を改善することによって発病を予防することができると考えられる疾患の総称である。したがって、生活習慣病に対しては、これらの症状を改善でき、長く安全に摂取できる食品による予防が重要であると考えられ、そのような効果を奏する食品の開発が期待されている。

このような食品素材の一つとして、松樹皮抽出物がある。松樹皮抽出物は、プロアントシアニジンなどの抗酸化作用を有するポリフェノールを含有するとして、様々な食品に用いられてきた。また、松樹皮抽出物の研究により薬理作用を含む種々の作用が判明しており、それに基づいて種々の用途が提案されている。かかる用途としては、例えば皮膚改善剤（特許文献１）、腸内菌叢改善剤（特許文献２）、チロシナーゼ阻害剤（特許文献３）、ＤＮＡ保護剤（特許文献４）及び抗ストレス剤（特許文献５）が挙げられる。

また、プロシアニジンを豊富に含む食品素材として、ココアやブドウが知られており、これらの食品素材には血管内皮機能改善作用があることが報告されている（特許文献６、７）。しかしながら、これらの食品素材に含まれるプロシアニジンが血管内皮に及ぼす影響については調べられていない。血管内皮機能改善には有効成分を毎日継続的に摂取することが必要であることから、継続的に摂取しやすく、少量の摂取であっても優れた効果を有する組成物の開発が求められている。

特開２００３－１４６８９９号公報 特開２００７－３０８３７３号公報 特開２００３－２３８４２５号公報 特開２００３－２３８４２７号公報 特開２００３－０９５９６４号公報 特開２０１３－２５３１００号公報 特開２０１２－０４１２９６号公報

本発明は、優れた血管内皮機能改善効果を有する血管内皮機能改善用組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、血管内皮機能改善効果について、鋭意調査・研究したところ、ＰＢ１及びＰＢ３を含有することにより、優れた血流依存性血管拡張機能改善効果が得られることを見出した。

すなわち、本発明は、ＰＢ１及びＰＢ３を含有することを特徴とする組成物を摂取することで、優れた血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、及び血流依存性血管拡張機能改善効果を発揮するという知見に基づいて完成したものである。

本発明は要約すると以下の通りである。
［１］松樹皮由来のプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有することを特徴とする血流依存性血管拡張機能改善用組成物。
［２］松樹皮由来のプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有し、血流依存性血管拡張機能改善作用を有することを特徴とする血管内皮機能改善用組成物。
［３］松樹皮由来のプロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有し、血流依存性血管拡張機能改善作用を有することを特徴とする血管柔軟性向上用組成物。
［４］錠状であることを特徴とする［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有し、そのプロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の含有比がプロシアニジンＢ１に対してプロシアニジンＢ３が１．５以下であることを特徴とする血管内皮機能改善用組成物。
［６］プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有し、そのプロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の含有比がプロシアニジンＢ１に対してプロシアニジンＢ３が１．５以下であることを特徴とする血管柔軟性向上用組成物。
［７］プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有することを特徴とする血流依存性血管拡張機能改善用組成物。
［８］プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の含有比がプロシアニジンＢ１に対してプロシアニジンＢ３が０．７６以下であることを特徴とする［５］～［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の含有比がプロシアニジンＢ１に対してプロシアニジンＢ３が０．６０以下であることを特徴とする［５］～［７］のいずれかに記載の組成物。
［１０］プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３が松樹皮由来であることを特徴とする［５］～［９］のいずれかに記載の組成物。
［１１］錠状であることを特徴とする［５］～［１０］のいずれかに記載の組成物。

本発明によれば、ＰＢ１及びＰＢ３を含有することにより、血流依存性血管拡張機能改善効果に優れた組成物を提供することができる。また、本発明によれば、ＰＢ１及びＰＢ３を含有することにより、血流依存性血管拡張機能改善による血管柔軟性向上効果、血管内皮機能改善効果に優れた組成物を提供することができる。さらに、本発明によれば、松樹皮由来のＰＢ１及びＰＢ３を含有することにより、に優れた組成物を提供することができる血流依存性血管拡張機能改善効果、血流依存性血管拡張機能改善による優れた血管柔軟性向上効果、血管内皮機能改善効果に優れた組成物を提供することができる。

図１は、実施例２～７及び比較例２、３におけるＲＯＳ産生量を示す図である。 図２は、実施例８～１２及び比較例４におけるＮＯ合成酵素遺伝子発現量を示す図である。

本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物並びに血流依存性血管拡張機能改善用組成物（以下、これらの組成物をまとめて「本発明の組成物」とも言う）は、プロシアニジンＢ１（ＰＢ１）及びプロシアニジンＢ３（ＰＢ３）を含有することを特徴とする。本発明の組成物は、さらに必要に応じて、その他の成分を含有し得る。以下、各成分及び本発明の組成物について説明する。なお、以下に説明する構成は、本発明を限定するものでなく、本発明の主旨の範囲内で種々改変することができる。

本発明の組成物は、プロシアニジンＢ１を含有する。プロシアニジンとは、フラボノイド類のフラバン－３－オールに属する化合物であり、エピカテキンあるいはカテキンが縮合したオリゴマーあるいはポリマー（２～１５量体）である。プロシアニジンＢ１は、（－）エピカテキンと（＋）カテキンとがＣ４－Ｃ８結合した二量体である。本発明のプロシアニジンＢ１（ＰＢ１）は、合成物や松、リンゴ、ココアやブドウなどの植物由来物を用いることができ、使用時の安全性の観点から植物由来物が好ましく、ＰＢ１を豊富に含むことから、松がより好ましく、松樹皮を用いることが特に好ましい。

本発明においてＰＢ１の由来として使用できる松は、例えば、フランス海岸松、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダなどのマツ目に属する植物が挙げられるが、これらに限定されない。これらの中でも、食用として安全性が確認されており、ＰＢ１を高濃度で含有している観点から、南仏の大西洋沿岸などに生育している海洋性松であるフランス海岸松（Ｐｉｎｕｓ ｍａｒｉｔｉｍａ）が好ましい。

植物由来物の加工方法は特に限定されず、粉砕物、搾汁、抽出物等の処理物を使用することができる。粉砕物としては、粉末、顆粒等が挙げられる。搾汁や抽出物は、液状であってもよいが、ペースト状や乾燥粉末として用いることもできる。ペースト状や乾燥粉末とする場合は、そのもののみを用いて製造しても良いし、賦形剤と共に加工しても良い。本発明においては、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、及び血流依存性血管拡張機能改善効果の観点から、抽出により得ることが好ましい。以下、松樹皮抽出物の製造方法を例として植物由来物の抽出方法を説明する。

松樹皮抽出物は、松樹皮を溶媒で抽出して得られる。溶媒としては、例えば、水、有機溶媒、含水有機溶媒（含水エタノールなどの含水アルコール）が挙げられるが、これらに限定されない。抽出に用いる有機溶媒としては、通常天然物成分を抽出するのに際して許容される有機溶媒が用いられ、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ブタン、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２－テトラフルオロエタン、１，１，２－トリクロロエテンなどが挙げられる。これらの溶媒は１種を単独で、又は２種以上を組合せて用いられ得る。抽出の際の温度は、室温から抽出溶媒の沸点以下の温度まで、適宜調整することができる。本発明においては、ＰＢ１を効率的に抽出する観点から、熱水、含水エタノール及び含水プロピレングリコールが好ましく用いられる。

抽出方法は、通常天然物成分を抽出するのに際して許容される方法であれば特に限定されないが、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法などの固液抽出法が挙げられる。

加温抽出法は、例えば、被験物質と溶媒とを接触させ、溶媒の沸点以下の温度などで処理して、被験物質に含まれる成分を溶媒に抽出する方法である。還流抽出法であってもよい。

超臨界流体抽出法は、例えば、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが挙げられるが、好ましくは二酸化炭素である。

超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体を分離する分離工程とを行う。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。

エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、抽出流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ－ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類を２～２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、この流体を用いて超臨界流体抽出を行うことによって、ＯＰＣ（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ：オリゴメリック・プロアントシアニジン）、カテキン類などの目的とする抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、又は分離の選択性を増強させる方法であり、効率的な松樹皮抽出物を得る方法である。

超臨界流体抽出法は、比較的低い温度で操作できるため、高温で変質・分解する物質にも適用できるという利点、抽出流体が残留しないという利点、溶媒の循環利用が可能であるため、脱溶媒工程などが省略でき、工程がシンプルになるという利点がある。

松樹皮からの抽出は、上述の抽出法以外に、液体二酸化炭素回分法、液体二酸化炭素還流法、超臨界二酸化炭素還流法などにより行ってもよい。

松樹皮からの抽出は、複数の抽出方法を組み合わせてもよい。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成の松樹皮抽出物を得ることが可能となる。

抽出により得られた松樹皮抽出物は、限外濾過、吸着性担体（ダイヤイオンＨＰ－２０、Ｓｅｐｈａｄｅｘ－ＬＨ２０、キチンなど）を用いたカラム法、バッチ法などにより精製を行うことが安全性の面から好ましい。

松樹皮抽出物は、保存性や加工性の観点から、粉末状のものであることが好ましく、乾燥粉末状のものであることがより好ましい。乾燥手段は特に限定されず、例えば、溶媒を含む松樹皮抽出物を、加温、日干し、熱風乾燥、凍結乾燥、減圧などによる乾燥手段を挙げることができる。乾燥の程度は、松樹皮抽出物の溶媒含有量が十分に低下したことが確認されるまでの程度であればよく、例えば、溶媒含有量が１０ｗｔ％以下、好ましくは５ｗｔ％以下となるまでの程度である。

松樹皮抽出物乾燥粉末を得るための粉末化の方法としては、例えば、当業者が通常用いる方法であるボールミル、ハンマーミル、ローラーミルなどにより、松樹皮抽出物を粉砕及び粉末化する方法が挙げられるが、これらに限定されない。乾燥と粉末化の順序を入れ替えて、乾燥前の松樹皮抽出物を予め粉砕しておき、この粉砕物を乾燥して松樹皮抽出物乾燥粉末とすることもできる。

松樹皮抽出物は市販されているものでもよく、市販の松樹皮抽出物としては、例えば、フラバンジェノール（登録商標；株式会社東洋新薬）などが挙げられる。

本発明の組成物は、プロシアニジンＢ３を含有する。プロアントシアニジンＢ３は、（＋）カテキンと（＋）カテキンとがＣ４－Ｃ８結合した二量体である。本発明のプロシアニジンＢ３（ＰＢ３）は、合成物や松、リンゴ、ココアやブドウなどの植物由来物を用いることができ、使用時の安全性の観点から植物由来物が好ましく、松がより好ましく、ＰＢ１を豊富に含むことから、松樹皮を用いることが特に好ましい。本発明の組成物に使用できる松の種類や植物由来物の加工方法は、ＰＢ１に記載した内容を参照できる。

本発明の血管内皮機能改善用組成物はＰＢ１及びＰＢ３を含有することを特徴とする。本発明において、ＰＢ１とＰＢ３との含有比は特に限定されないが、血管内皮機能改善作用の効果を高める観点から、そのＰＢ１とＰＢ３の含有比がＰＢ１に対してＰＢ３が１．５以下であることが好ましく、ＰＢ３が０．７６以下であることがより好ましく、ＰＢ３が０．６８以下であることが特に好ましく、ＰＢ３が０．６０以下であることがより特に好ましい。また、ＰＢ３の含有比の下限は特に限定されないが、血管内皮機能改善作用の効果を高める観点から、ＰＢ１とＰＢ３の含有比がＰＢ１に対してＰＢ３が０．２０以上であることが好ましく、０．３６以上であることがより好ましく、０．４１以上であることが特に好ましい。

本発明の血管柔軟性向上用組成物はＰＢ１及びＰＢ３を含有することを特徴とする。本発明において、ＰＢ１とＰＢ３との含有比は特に限定されないが、血管柔軟性向上作用の効果を高める観点から、そのＰＢ１とＰＢ３の含有比がＰＢ１に対してＰＢ３が１．５０以下であることが好ましく、ＰＢ３が０．７６以下であることがより好ましく、ＰＢ３が０．６８以下であることが特に好ましく、ＰＢ３が０．６０以下であることがより特に好ましい。また、ＰＢ３の含有比の下限は特に限定されないが、血管柔軟性向上作用の効果を高める観点から、ＰＢ１とＰＢ３の含有比がＰＢ１に対してＰＢ３が０．２０以上であることが好ましく、ＰＢ３が０．３６以上であることがより好ましく、０．４１以上であることが特に好ましい。

本発明の血流依存性血管拡張機能改善用組成物はＰＢ１及びＰＢ３を含有することを特徴とする。本発明において、ＰＢ１とＰＢ３との含有比は特に限定されないが、血流依存性血管拡張機能改善作用の効果を高める観点から、ＰＢとＰＢ３の含有比の上限は、ＰＢ１に対してＰＢ３が１．３０以下であることが好ましく、ＰＢ３が０．７６以下であることがより好ましく、０．６８以下であることが特に好ましい。また、同様にＰＢ１とＰＢ３の含有比の下限は、血流依存性血管拡張機能改善作用の効果を高める観点から、ＰＢ１とＰＢ３の含有比がＰＢ１に対してＰＢ３が０．２０以上であることが好ましく、０．３６以上であることがより好ましく、０．４１以上であることが特に好ましい。

ＰＢ１及びＰＢ３を含有する組成物は、後述する実施例に示されているとおり、血流依存性血管拡張機能改善作用を示すことから、血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用などが期待できるものである、という態様を採り得る。

本発明の組成物の１日の使用量は特に限定されず、使用態様や使用者の使用内容などに応じて適宜設定され得るが、例えば、１日摂取量当たりのＰＢ１とＰＢ３の合計量は、０．１～１００ｍｇであり、好ましくは１ｍｇ～５０ｍｇであり、血管内皮機能改善用組成物作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用の観点から、さらに好ましくは２～１０ｍｇである。

本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、期待される作用効果が奏される限り特に限定はなく、ヒト以外の動物に対して適用することができる。本発明の松樹皮抽出物含有剤の使用者は特に限定されず、例えば、健常者であってもよいが、血管内皮のリスクファクターを有する者や４０歳以上の中高年者に用いることがより好ましい。本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物の使用頻度は特に限定されないが、好ましくは２日に１度以上、より好ましくは１日に１度以上、特に好ましくは１日に２度以上である。組成物中に含有する１回当たりのＰＢ１とＰＢ３の合計量は、０．１～１００ｍｇであり、好ましくは１ｍｇ～５０ｍｇであり、血管内皮機能改善用組成物作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用の観点から、さらに好ましくは２～１０ｍｇである。

本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物におけるＰＢ１とＰＢ３の合計量の配合割合は、その投与形態や剤形などによって適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、ＰＢ１とＰＢ３の合計量は、全体を１００質量部として、ＰＢ１とＰＢ３の合計量の下限値は乾燥質量で、０．００１質量部以上、好ましくは０．０１質量部以上、より好ましくは０．０５質量部以上と設定することができ、ＰＢ１とＰＢ３の合計量の上限値は乾燥質量で、例えば、１００質量部以下、好ましくは５０質量部以下、より好ましくは１０質量部以下と設定することができる。

本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物における松樹皮抽出物の配合量は、その投与形態や剤形などによって適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、松樹皮抽出物の配合量は、全体を１００質量部として、松樹皮抽出物の下限値は乾燥質量で、０．００１質量部以上、０．０１質量部以上、好ましくは０．１質量部以上と設定することができ、松樹皮抽出物の上限値は乾燥質量で、例えば、１００質量部以下、好ましくは５０質量部以下、より好ましくは３０質量部以下と設定することができる。

本発明の組成物は、ＰＢ１及びＰＢ３に加えて、適宜選択したその他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、例えば、種々の賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤、増量剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、添加剤、化粧品原料、医薬品原料などを挙げることができる。その他の成分の含有量は、本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物の利用形態などに応じて適宜選択することができる。

本発明の組成物は、血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用、若しくは血流依存性血管拡張機能改善作用を得ることを目的とした種々の形態で利用することができ、例えば、経口用又は非経口用の形態とすることができる。本発明の組成物は、その形態に応じて、そのまま経口的又は非経口的に使用してもよいし、松樹皮抽出物を溶解するための溶媒などに溶解して経口的又は非経口的に使用してもよいが、本発明の効果である血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用をより効果的に発揮できる観点から、経口が好ましい。

本発明の組成物の形態が経口用である場合、その形態としては、経口的な使用に適した形態であれば良く、例えば、顆粒状、粉末状、錠状、チュアブル状、カプセル状、液状、シロップ状などが挙げられる。これらの中でも、ＰＢ１及びＰＢ３の効率的な摂取の観点から、錠状が好ましい。

また、本発明の組成物としては、有効成分を含有する血管内皮機能改善用食品の他、食品に対して有効成分を添加して得た血管内皮機能改善用食品を挙げることができ、例えば、通常の食品に比して本発明の有効成分含有量を増加させた食品や、本発明の有効成分を通常含まない食品に対して有効成分を添加した食品を挙げることができる。有効成分の添加は、それぞれの成分を別々に添加してもよいし、同時に添加してもよく、また、有効成分以外の他の成分と共に添加してもよい。

また、本発明の組成物の形態が非経口用である場合、その形態としては、例えば、非経口的な使用に適した形態、具体的には、ローション状、クリーム状、リキッド状、ミスト状、エマルション状、スプレー状、ムース状、ジェル状などが挙げられる。

本発明の組成物の製造方法は特に限定されず、使用形態に応じて当業者に知られる一般的な製造方法に準じて製造される。例えば、顆粒状や固形状である場合、ＰＢ１及びＰＢ３をそのまま又は上記のその他の成分と同時又は数段階に分けて混和したものを、流動層造粒法、攪拌造粒法、押出造粒法などの造粒方法に従って造粒して顆粒状とし、さらに打錠機などを用いる常法に従って圧縮成形することによって錠状に成形できる。また、液状やクリーム状の場合は、ＰＢ１及びＰＢ３を上記のその他の成分と同時又は数段階に分けて混合し、調整することができる。

本発明の組成物は、血管内皮機能改善、血管柔軟性向上、若しくは血流依存性血管拡張機能改善に用いられる点において、製品として他の製品と区別することができるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、本発明に係る製品の本体、包装、説明書、宣伝物のいずれかに血管内皮機能改善作用の機能がある旨を表示したものが本発明の範囲に含まれる。例えば、医薬品（医薬部外品を含む）や、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の所定機関より効能の表示が認められた機能性食品などのいわゆる健康食品や、飼料等を挙げることができる。いわゆる健康食品においては、「血管機能を高める」、「血管機能を維持する」、「血管内皮機能を高める」、「血管内皮機能を維持する」、「加齢によって衰える動脈の血管内皮機能を高める」、「加齢によって衰える動脈の血管内皮機能を維持する」、「血管を締め付けた後の血管の拡張度を高める」、「血管を締め付けた後の血管の拡張度を維持する」、「血管柔軟性を高める」、「血管柔軟性を維持する」、「血管のしなやかさを高める」、「血管のしなやかさを維持する」等を表示したものを例示することができる。

本発明の別の態様は、ＰＢ１及びＰＢ３を含有する組成物、又は、ＰＢ１及びＰＢ３を含有する松樹皮抽出物を含有する組成物を使用させることを含む、血管内皮機能、血管柔軟性、若しくは血流依存性血管拡張機能を改善、又は維持する方法である。ただし、本発明の方法は、ヒトに対する医療行為を除外するものである。

本発明の血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物の包装形態は特に限定されず、剤形などに応じて適宜選択できるが、例えば、ＰＴＰなどのブリスターパック；ストリップ包装；ヒートシール；アルミパウチ；プラスチックや合成樹脂などを用いるフィルム包装；バイアルなどのガラス容器；アンプルなどのプラスチック容器などが挙げられる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

＜試験１ 血流依存性血管拡張機能の評価＞
（１）被験者と試験デザイン
倫理的配慮により試験開始前に同意が得られた４０歳以上、６５歳未満の健常な成人男女３５名で、ＢＭＩが３０未満の人を被験者として選定した。被験者を無作為の２群（実施例群：１８名、比較例群：１７名）に分け、二重盲検法による並行群間比較試験をした。１日摂取目安量である１袋（錠剤０．２５ｇ×２粒）の試験食品を１日１回、水またはぬるま湯とともに摂取させ、８週間摂取後に検査を行った。

（２）試験食品
実施例１には、熱水で抽出されたフランス海岸松の松樹皮抽出物に、粉末還元麦芽糖水飴、微結晶セルロース、ショ糖脂肪酸エステル、微粒二酸化ケイ素を混合し、打錠した錠剤を使用した。比較例１には、外観で実施例との区別がつかないようにするため、実施例中の松樹皮抽出物をカラメル色素に置き換えたものを使用した。実施例１及び比較例１ともに１日摂取目安量（０．２５ｇ×２粒）を無地アルミ個包装し、被験者及び介入実施者への盲検性を確保した。試験食品の１日摂取目安量あたりの熱量及び栄養成分の分析結果を表１に示す。

（３）ＰＢ１及びＰＢ３含有量の分析
ＰＢ１及びＰＢ３量を以下の方法により測定した。松樹皮抽出物の重量を精密に測り、１０％エタノールを加えてメスアップし、口径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過し、試験溶液を得た。下記の条件でＨＰＬＣに供し、ＰＢ１、ＰＢ３の定量を行った。松樹皮抽出物に含まれるＰＢ１及びＰＢ３を測定し、実施例１（０．２５ｇ×２粒中；１日摂取目安量）に含まれるＰＢ１及びＰＢ３を算定した。実施例１に含まれるＰＢ１は１．７ｍｇであり、ＰＢ３は０．７ｍｇであり、ＰＢ１とＰＢ３の合計は２．４ｍｇであった。ＰＢ１に対するＰＢ３の比率は、０．４１であった。
（ＨＰＬＣ条件）
・分析カラム：Ｌ－Ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ ３μｍ、４．６×２５０ｍｍ（一般財団法人化学物質評価研究機構製）
・カラム温度：４０℃
・注入量 ：１０μＬ
・流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・測定波長 ：２８０ｎｍ
・移動相 ：（Ａ液）０．１Ｍ酢酸水溶液
（Ｂ液）０．１Ｍ酢酸アセトニトリル溶液
・グラジエントプログラム：表２参照

（４）ＦＭＤ値の測定
血流依存性血管拡張機能は、超音波検査機器を用いたＦＭＤ（ｆｌｏｗ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｌａｔｉｏｎ）により有効性評価をした。具体的には上腕部の安静時動脈血管径を計測した後、前腕部をカフで５分間圧迫し、駆血解放後の最大動脈血管径を計測した。ＦＭＤ値は最大動脈血管径と安静時動脈血管径の差を、安静時動脈血管径で除し、百分率で算出した。結果を表３に示す。

二元配置分散分析において交互作用が認められ（ｐ＜０．０５）、摂取８週間後の実測値及び摂取前から摂取８週間後の変化量において、実施例１の群は比較例１の群と比較して有意な増加が認められた。

以上より、本試験の結果、ＰＢ１及びＰＢ３を含有する錠剤を摂取することによって、ＦＭＤ値は増加し、血流依存性血管拡張機能の改善が確認された。したがって、本発明の組成物は血流依存性血管拡張機能改善による優れた血管柔軟性向上効果、血管内皮機能改善効果を有することがわかる。特に、ＰＢ１とＰＢ３を合計で１日当たり２．４ｍｇ配合した錠剤を摂取することで、優れた血流依存性血管拡張機能の改善効果が見られることから、本発明の組成物は、ＰＢ１とＰＢ３を合計で１日当たり２～１０ｍｇ摂取することで、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が顕著に発揮されることが示唆された。

＜試験２ 酸化ストレス下での活性酸素種（ＲＯＳ）産生量の評価＞
本試験では、酸化ストレス下での活性酸素種（ＲＯＳ）産生量について評価した。酸化ストレスによって増加したＲＯＳはＮＯを酸化し、酸化されたＮＯは生理活性を低下させる。酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量の抑制は、ＮＯの酸化による生理活性の低下を防ぎ、ＮＯ利用能の改善につながるため、血管内皮機能改善、血管柔軟性向上、血流依存性血管拡張機能改善が期待できる。以上より、酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量を評価することで、血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用及び、血流依存性血管拡張改善作用の評価ができる。

被験物質
ＰＢ１及びＰＢ３の量が表４の割合となるように、熱水で抽出されたフランス海岸松の松樹皮抽出物をＤＭＳＯで溶解し、添加濃度でＤＭＳＯが０．５％になるようにＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（ＥＧＭ－２）培地（ＬＯＮＺＡ製）で希釈することで、実施例及び比較例の被験物質を調製した。なお、ＰＢ１及びＰＢ３の量は、「試験１（３）ＰＢ１及びＰＢ３含有量の分析」に記載される方法と同様の方法で測定した。

（２）細胞培養と酸化ストレス
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をコラーゲンコートされた９６ウェルのブラックプレート（ＲＯＳ産生量測定用）とクリアプレート（細胞増殖試験用）に８．０×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で、２４時間培養した。培地を除去後、被験物質含有培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２２時間培養した。その後、過酸化水素（ナカライテスク製）を終濃度が１００μＭとなるように添加することで、酸化ストレスを与えた。その後、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で、２時間培養した後に、ＲＯＳ産生量の測定と細胞増殖試験を行った。

（３）ＲＯＳ産生量の測定
ブラックプレート（ＲＯＳ産生量測定用）に関して、培地を除去後、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、１０μＭのＤＣＦＨ－ＤＡ試薬を５０μＬ／ｗｅｌｌ 添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で３０分間培養した。培地を除去後、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、ＰＢＳを２００μｌ／ｗｅｌｌ添加した。４８５ｎｍで励起したときの５３０ｎｍにおける蛍光強度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）測定し、ＲＯＳ産生量を算出した。

（４）細胞増殖率の測定
クリアプレート（細胞増殖試験用）に関して、培地を除去後、無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８溶液を１５０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。インキュベーター内で適度に発色させ、４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）で測定した。

（５）ＲＯＳ産生量の評価
ＲＯＳ産生量を細胞増殖率で割り戻すことで、細胞数当たりのＲＯＳ産生量を算出し、酸化ストレスを与え、被験物質を投与しなかった群（比較例２）の細胞数当たりのＲＯＳ産生量を１００とした場合の、相対的なＲＯＳ産生量を算出した。結果を図１に示す。

被験物質を投与せず、酸化ストレスを与えなかった群（比較例３）に比べて、被験物質を投与せず、酸化ストレスを与えた群（比較例２）はＲＯＳ産生量が極めて高いことから、酸化ストレスによって、ＲＯＳが産生されることが確認された。比較例２及び実施例２～７との比較から、ＰＢ１及びＰＢ３を含有する被験物質を投与した群（実施例２～７）において、酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量の抑制が認められた。したがって、ＰＢ１とＰＢ３を含有する組成物を摂取することにより、酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量の抑制効果が発揮されることで、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が発揮されることが分かった。特に、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．３６～１．３０である被験物質を投与した群（実施例２～６）は、酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量の抑制に優れており、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６８である被験物質を投与した群（実施例３～５）は、酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量の抑制により優れており、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６０である被験物質を投与した群（実施例３、４）は、酸化ストレス下でのＲＯＳ産生量の抑制に極めて優れていることが認められた。このことから、本発明の組成物はＰＢ１及びＰＢ３を含有することにより、優れた血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が発揮され、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．３６～１．３０である場合には、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が顕著に発揮され、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６８である場合には、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果がより顕著に発揮され、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６０である場合には、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が極めて顕著に発揮されることが分かった。

＜試験３ ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の評価＞
本試験では、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量について評価した。血管内皮でＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）によりＮＯが産生し、拡散されて血管平滑筋に届くと、筋肉が弛緩されて血管が拡張する。ＮＯ合成酵素遺伝子発現量が増加すると、ＮＯ合成酵素量が増加し、ＮＯ産生量が増加するため、血管内皮機能改善、血管柔軟性向上、血流依存性血管拡張機能改善が期待できる。以上より、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量を評価することで、血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用及び、血流依存性血管拡張改善作用の評価ができる。

（１）被験物質
ＰＢ１及びＰＢ３の量が表５の割合となるように、熱水で抽出されたフランス海岸松の松樹皮抽出物をＤＭＳＯで溶解し、添加濃度でＤＭＳＯが０．５％になるようにＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ２（ＥＧＭ－２）培地（ＬＯＮＺＡ製）で希釈することで、実施例及び比較例の被験物質を調製した。なお、ＰＢ１及びＰＢ３の量は、「試験１（３）ＰＢ１及びＰＢ３含有量の分析」に記載される方法と同様の方法で測定した。

（２）細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をコラーゲンコートされた２４ウェルのプレートに５．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した。培地を除去後、被験物質含有培地を５００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した。

（３）ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の測定
培地を除去後、ＰＢＳで２回洗浄した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてＲＮＡを回収し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標） ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ｅＮＯＳ遺伝子のプライマー（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いて、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）により定量リアルタイムＰＣＲを行い、ｅＮＯＳ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。内在性コントロールとして、βＡｃｔｉｎのプライマー（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて、βＡｃｔｉｎのｍＲＮＡ発現量を測定した。

（５）ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の評価
被験物質を投与しなかった群（比較例４）の発現量を１とした場合の、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の相対値を算出した。結果を図２に示す。

ＰＢ１及びＰＢ３を含有する被験物質を投与した群（実施例８～１２）において、被験物質を投与しなかった群（比較例４）と比べて、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の増加が認められた。したがって、ＰＢ１及びＰＢ３を含有する組成物を摂取することにより、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の増加効果が発揮されることで、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が発揮されることが分かった。特に、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６８である被験物質を投与した群（実施例９～１１）は、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の増加により優れており、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６０である被験物質を投与した群（実施例９、１０）は、ＮＯ合成酵素遺伝子発現量の増加効果に極めて優れていることが認められた。このことから、本発明の組成物はＰＢ１及びＰＢ３を含有することにより、優れた血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が発揮され、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６８である場合には、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果がより顕著に発揮され、ＰＢ１に対するＰＢ３の比が０．４１～０．６０である場合には、血管内皮機能改善効果、血管柔軟性向上効果、血流依存性血管拡張機能改善効果が極めて顕著に発揮されることが分かった。

製造例：実施例の結果に基づいて、以下の製造例を提示する。

（製造例１）
健康食品（錠剤）
松樹皮抽出物 ３０ｇ
（ＰＢ１とＰＢ３を合計して、５質量％含む。ＰＢ１：ＰＢ３＝１：０．６）
結晶セルロース １０ｇ
ショ糖脂肪酸エステル ５ｇ
二酸化ケイ素 ２ｇ
還元麦芽糖 ５３ｇ
を混合・撹拌して均一に調整し、打錠し、１錠２５０ｍｇである錠剤を製造した。得られた錠剤を１日２回、１回当たり２粒摂取することで、優れた血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用が得られる。

（製造例２）
健康食品（カプセル剤）
松樹皮抽出物 ３ｍｇ
（ＰＢ１とＰＢ３を合計して、８０質量％含む。ＰＢ１：ＰＢ３＝１：０．７６）
ココナッツミルク末 ６０ｍｇ
イソマルトオリゴ糖 ６０ｍｇ
麦芽糖 ６０ｍｇ
二酸化ケイ素 １０ｍｇ
ナイアシン １ｍｇ
マグネシウム １ｍｇ
を混合・撹拌して均一に調整し、ハードカプセルに封入し、カプセル剤を製造した。得られたカプセル剤を１日１回、１回当たり１粒摂取することで、優れた血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用が得られる。

（製造例３）
健康食品（顆粒剤）
松樹皮抽出物 ５ｇ
（ＰＢ１とＰＢ３を合計して、８質量％含む。ＰＢ１：ＰＢ３＝１：１．４０）
大麦若葉末 ５０ｇ
フラクトオリゴ糖 １０ｇ
イソマルトオリゴ糖 １０ｇ
還元麦芽糖 ３０ｇ
ショ糖脂肪酸エステル ３ｇ
二酸化ケイ素 ２ｇ
を混合・撹拌して均一に調整し、顆粒剤を製造した。得られた顆粒剤２ｇを１００ｇの水に溶解し、１日１回摂取することで、優れた血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用が得られる。

ＰＢ１及びＰＢ３を含有すことを特徴とする組成物に優れた血流依存性血管拡張機能の改善が見出されたことから本発明は、優れた血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物を提供することができる。優れた血管内皮機能改善用組成物、血管柔軟性向上用組成物、及び血流依存性血管拡張機能改善用組成物は、血管内皮機能改善作用、血管柔軟性向上作用、及び血流依存性血管拡張機能改善作用を有し、経口剤として用いることができることから、本発明の産業上の有用性は高い。

Claims (7)

1. プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有するフランス海岸松樹皮熱水抽出物を含有し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を有効成分とすることを特徴とする血流依存性血管拡張機能改善用組成物であって、プロシアニジンＢ１に対するプロシアニジンＢ３の比率が０．３６以上１．７３以下であることを特徴とする血流依存性血管拡張機能改善用組成物。
2. プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有するフランス海岸松樹皮熱水抽出物を含有し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善用組成物であって、プロシアニジンＢ１に対するプロシアニジンＢ３の比率が０．３６以上１．７３以下であることを特徴とする血管内皮機能改善用組成物。
3. プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有するフランス海岸松樹皮熱水抽出物を含有し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を有効成分とすることを特徴とする血管柔軟性向上用組成物であって、プロシアニジンＢ１に対するプロシアニジンＢ３の比率が０．３６以上１．７３以下であることを特徴とする血管柔軟性向上用組成物。
4. プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有するフランス海岸松樹皮熱水抽出物を含有し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を有効成分とすることを特徴とする血流依存性血管拡張機能改善用組成物であって、プロシアニジンＢ１に対するプロシアニジンＢ３の比率が０．３６以上１．７３以下であり、プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の合計摂取量が１日当たり２～１０ｍｇであることを特徴とする血流依存性血管拡張機能改善用組成物。
5. プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有するフランス海岸松樹皮熱水抽出物を含有し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を有効成分とすることを特徴とする血管内皮機能改善用組成物であって、プロシアニジンＢ１に対するプロシアニジンＢ３の比率が０．３６以上１．７３以下であり、プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の合計摂取量が１日当たり２～１０ｍｇであることを特徴とする血管内皮機能改善用組成物。
6. プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を含有するフランス海岸松樹皮熱水抽出物を含有し、前記プロシアニジンＢ１及びプロシアニジンＢ３を有効成分とすることを特徴とする血管柔軟性向上用組成物であって、プロシアニジンＢ１に対するプロシアニジンＢ３の比率が０．３６以上１．７３以下であり、プロシアニジンＢ１とプロシアニジンＢ３の合計摂取量が１日当たり２～１０ｍｇであることを特徴とする血管柔軟性向上用組成物。
7. 錠状であることを特徴とする請求項１～６に記載の組成物。

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