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JP7284759B2 - 抗ｃｄ４０抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｃｄ４０抗体およびその使用 Download PDF

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JP7284759B2 JP2020535986A JP2020535986A JP7284759B2 JP 7284759 B2 JP7284759 B2 JP 7284759B2 JP 2020535986 A JP2020535986 A JP 2020535986A JP 2020535986 A JP2020535986 A JP 2020535986A JP 7284759 B2 JP7284759 B2 JP 7284759B2
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Description

関連出願の相互引用
本ＰＣＴ出願は、２０１７年１２月２７日出願の米国仮特許出願第６２／６１０，６４２号に基づく優先権の利益を主張し、その内容全体を引用により本明細書中に包含させる。
ＥＦＳ－ＷＥＢにより電子的に提出された配列表の引用
電子的に提出された配列表（名称：3338.112PC01_SeqListing_ST25.txt；サイズ：153,067バイト；作成日：２０１８年１２月１４日）の内容は、その全体が引用により本明細書中に包含される。
発明の背景
最近の研究により、ヒトの癌および慢性感染患症は、悪性または被感染細胞に対する患者の免疫応答を調節する薬剤で処置され得ることが明らかになってきた。例えば、Reck & Paz-Ares (2015) Semin. Oncol. 42:402を参照。ＣＰ－８７０８９３およびダセツズマブ（ＳＧＮ－４０）などのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、かかる免疫応答を増強し得るという確信に基づいて癌を処置するための試みがなされてきた。例えば、Kirkwood et al. (2012) CA Cancer J. Clin. 62:309；Vanderheide & Glennie (2013) Clin. Cancer Res. 19:1035を参照。マウスでの最近の試験により、阻害性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩｂに対する特異性が増強された抗ＣＤ４０抗体の抗腫瘍効果を増大させることが明らかになった。例えば、ＷＯ２０１２／０８７９２８；Li ＆ Ravetch （2011） Science 333：1030; Li ＆ Ravetch （2012） Proc. Nat'l Acad. Sci USA 109：10966；Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754を参照。
ヒト対象における癌および慢性感染症の治療のための改善されたアゴニスト抗ヒトＣＤ４０抗体が必要とされている。そのような抗体は、好ましくは、良好な収率および低い凝集を伴って産生される。
発明の概要
本発明は、ヒトＣＤ４０に対する実質的な親和性を維持しつつ、改善された収率を示す抗体１２Ｄ６についての改善されたヒト化重鎖および軽鎖可変ドメインを提供する。具体的には、本発明は、それぞれＬ４（配列番号４９）のような改善された軽鎖可変領域Ｌ２からＬ６（配列番号４７－５１）および／または重鎖Ｈ４（配列番号５４)のような改善された重鎖可変領域Ｈ２からＨ４（配列番号５２－５４）を含む、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を提供する。ある態様において、抗体は、それぞれ、（i）配列番号５、７、９、１１、５２、５３および５４の残基１－１１９ならびに配列番号４９；（ii）配列番号５４ならびに配列番号６、８または１０の残基１－１１２、からなる群より選択される重鎖および軽鎖可変領域の対を含む。ある態様において、抗体は、それぞれ、(i)配列番号１１の残基１－１１９ならびに配列番号４９；および（ii）配列番号５４および配列番号４９からなる群より選択される重鎖および軽鎖可変領域の対を含む。ある態様において、本発明は、重鎖可変領域H２（配列番号５２）および軽鎖可変領域L４（配列番号４９）を含む抗体を包含する。これらの抗体のいずれかは、ＩｇＧ１ｆ（配列番号４４）を含む重鎖定常領域、および／または配列番号４５の軽鎖κ定常領域をさらに含んでいてよい。あるいは、これらの抗体のいずれかは、アゴニスト活性を増強するために、１以上のアミノ酸置換を含む重鎖定常領域をさらに含んでいてよい。
さらなる態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、上記の抗体のいずれかの重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、８５％、９０％および９５％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む。別のさらなる態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に記載の抗体のいずれかの重鎖および軽鎖可変領域の配列から本質的に構成される重鎖および軽鎖可変領域を含む。
本発明はさらに、上記の抗体またはその抗原結合部分の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする核酸、該核酸分子を含む発現ベクター、該発現ベクターでトランスフェクトされた細胞、該発現ベクターで形質転換された細胞から抗体を発現させて、該抗体を回収する、抗体の製造方法、ならびに本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分および担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、対象において免疫応答が増強されるように、有効量の本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを該対象に投与することを含む、対象において免疫応答を増強する方法を提供する。特定の態様において、対象は、腫瘍を有し、腫瘍に対する免疫応答が増強される。別の態様において、対象は、ウイルス感染症、例えば慢性のウイルス感染症を有し、抗ウイルス免疫応答が増強される。
本発明はまた、腫瘍の増殖を阻害するように、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与することを含む、該対象における腫瘍の増殖阻害法を提供する。
本発明はさらに、例えば免疫療法によって癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、例えば医薬組成物として投与し、それにより癌を処置する方法を提供する。特定の態様において、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頸部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の新生物、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連の癌である。特定の態様において、癌は、転移性癌、難治性癌または再発性癌である。
本発明はまた、例えば免疫療法により慢性のウイルス感染症を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、例えば医薬組成物として投与し、それにより慢性のウイルス感染症を処置することを含む方法を提供する。
特定の態様において、本明細書に記載の免疫機能を調節する方法および処置方法は、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、１以上の追加の治療剤、例えば抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストと組み合わせて、または二重特異性薬物剤として投与することを含む。特定の態様において、抗ｈｕＣＤ４０療法は、抗ＰＤ１および／または抗ＰＤ－Ｌ１療法、例えば、ヒトＰＤ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントによる処置と組み合わされる。
いくつかの態様において、本発明の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、１以上の重鎖および１以上の軽鎖、例えば２個の重鎖および２個の軽鎖を含む。
図１は、種々アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を用いる漸増濃度での未成熟ヒト樹状細胞からのＴＮＦ－α発現を示す。抗体１２Ｄ６－２４（×印）は、未修飾の抗ＣＤ４０抗体である（重鎖および軽鎖配列：それぞれ配列番号１１および８）。抗体１２Ｄ６－２４－Ｌ４Ｈ１－６Ｐ１（白四角）および１２Ｄ６－２４－Ｌ４Ｈ１－６Ｐ２（黒四角）は、Ｌ４配列（配列番号４９）からなる修飾軽鎖可変ドメインおよび未修飾の重鎖可変ドメイン（すなわち、配列番号１１）を有する。６Ｐ１および６Ｐ２は、２つの別個のヒトドナー由来の樹状細胞を意味する。抗体１２Ｄ６－２４－Ｌ４Ｈ４（黒丸）は、Ｌ４配列（配列番号４９）からなる修飾軽鎖可変ドメインおよびＨ４配列（配列番号５４）からなる修飾重鎖可変ドメインを有する。実施例３参照。
図２Ａおよび２Ｂは、本発明の種々の抗体で処置したとき、それぞれＣＤ８３およびＣＤ８６発現によって測定される、ヒト樹状細胞の活性化を示す。樹枝細胞を、示された抗体に曝露し、蛍光抗ＣＤ８３抗体および抗ＣＤ８６抗体で染色し、実施例３に記載のとおり、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析した。シグナルは平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表示される。図１に記載されるように、抗体１２Ｄ６は、抗体１２Ｄ６－２４であり、抗体Ｌ４Ｈ１およびＬ４Ｈ４は、それぞれ１２Ｄ６－２４－Ｌ４Ｈ１および１２Ｄ６－２４－Ｌ４Ｈ４である。抗体５Ｆ１１は、本明細書に記載の別のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体であり、対照は無関係のＩｇＧ１である。各抗体の左端の黒いバーは、染色されていないサンプルである。真ん中の薄灰色のバーは、抗ＣＤ８３抗体で染色された細胞であり、右端の濃灰色のバーは、抗ＣＤ８６抗体で染色された細胞である。図２Ａは、抗ＣＤ８３抗体の励起波長で得られたデータを提供する（すなわち、主にＣＤ８３の染色を示す）。図２Ｂは、抗ＣＤ８６抗体の励起波長で得られたデータを提供する（すなわち、主にＣＤ８６の染色を示す）。
詳細な説明
本発明は、ヒトＣＤ４０（“ｈｕＣＤ４０”）に特異的に結合し、アゴニスト活性を有する、単離された抗体、特にヒト化モノクローナル抗体を提供し、具体的には、ｈｕＣＤ４０に対する実質的な親和性を保持しつつ、収率を高める、改善された重鎖および軽鎖可変領域配列を提供する。
本発明は、かかる抗体の製造方法、かかる抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫複合体および二重特異性分子、ならびに該抗体またはフラグメントを含むように製剤化された医薬組成物をさらに提供する。また、本発明は、免疫応答増強のために、単独で、または他の免疫賦活剤（例えば、抗体）および／または癌療法剤もしくは抗感染症療法剤と組合せて抗体を用いる方法も提供する。従って、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、例えば、腫瘍増殖を阻害すること、および慢性のウイルス感染症を処置することを含む、広範囲の治療用途で用いることができる。
定義
本明細書の記載をより容易に理解できるように、いくつかの用語を先ず定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載されている。
用語“ＣＤ４０”は、“ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５”（ＴＮＦＲＳＦ５）を意味する。他に特記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書中のＣＤ４０への言及は、ヒトＣＤ４０（“ｈｕＣＤ４０”）を意味し、“抗ＣＤ４０抗体”は、抗ヒトＣＤ４０抗体を意味する。ヒトＣＤ４０は、遺伝子番号（GENE ID NO)９５８およびＭＩＭ（Mendelian Inheritance in Man）： １０９５３５にさらに記載されている。２０アミノ酸のシグナル配列を含むヒトＣＤ４０の配列（GenBank 受託番号NP_001241.1）は、配列番号１に提供される。
ＣＤ４０は、ＴＮＦＳＦ５、ｇｐ３９およびＣＤ１５４とも称される、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と相互作用する。他に特記しない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書中“ＣＤ４０Ｌ”への言及は、ヒトＣＤ４０Ｌ（“ｈｕＣＤ４０Ｌ”）を意味する。ヒトＣＤ４０Ｌは、遺伝子番号９５９およびＭＩＭ：３００３８６にさらに記載されている。ヒトＣＤ４０Ｌの配列（GenBank 受託番号NP_000065.1）は、配列番号２に提供される。
特記しない限り または文脈から明らかでない限り、本明細書で用いる用語“抗体”は、抗体全体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、“抗原結合部分”）またはその一本鎖を含み得る。“抗体”とは、一態様において、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合フラグメントを意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中、ＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。特定の天然ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。特定の天然抗体において、各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中、ＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化できる。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと並べられている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。上記抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織もしくは宿主因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。
抗体は、一般的に、１０－７から１０－１１Ｍまたはそれ以下の解離定数（ＫＤ）で示される高親和性でそれらの同族抗原に特異的に結合する。約１０－６Ｍを超えるＫＤは、一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書で用いるとき、抗原に“特異的に結合する”抗体とは、高い親和性で抗原および実質的に同一の複数の抗原に結合する抗体を意味し、高い親和性とは、１０－７Ｍ以下のＫＤ、好ましくは１０－８Ｍ以下のＫＤ、さらにより好ましくは５ｘ１０－９Ｍ以下のＫＤ、最も好ましくは１０－８Ｍ以下および１０－１０Ｍ以下のＫＤを有するが、無関係な抗原に対しては高親和性で結合しないことを意味する。抗原が所定の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合、例えば、抗原が、所定の抗原の配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す場合、抗原は該所定の抗原と“実質的に同一”である。一例として、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体は、特定の非ヒト霊長動物種（例えば、カニクイザル）由来のＣＤ４０と交差反応し得るが、他の種由来のＣＤ４０、またはＣＤ４０以外の抗原とは交差反応し得ない。
他に特記しない限り、免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない、一般的に公知のアイソタイプのいずれか由来であり得る。ＩｇＧアイソタイプは、特定の種のサブクラスに分けられる：ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３。免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１には、多くとも数個のアミノ酸が互いに異なる幾つかのアロタイプが存在する。他に特記しない限り、本発明の抗体は、ＩｇＧ１ｆ定常ドメイン（配列番号４４）を含む。他に特記しない限り、“抗体”には、一例として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体；完全合成抗体；および、一本鎖抗体が含まれ得る。
本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部分”または“抗原結合フラグメント”とは、抗原（例えば、ヒトＣＤ４０）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味する。用語、抗体の“抗原結合部分”に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；および、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）を含む。単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または合成リンカーにより結合された２以上の単離ＣＤＲの組合せは、抗原を結合できる場合、抗体の抗原結合ドメインを含み得る。
一本鎖抗体構築物もまた、本発明に包含される。Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子にコードされているが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成するように対形成する、単タンパク質鎖として製造されることを可能とする合成リンカーにより、連結され得る。例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；および、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照。かかる一本鎖抗体はまた、抗体の“抗原結合部分／フラグメント”なる用語に包含されることも意図する。これらおよび他の可能性のある構築物は、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られる常套技術を用いて得られ、フラグメントは、インタクト（無傷）抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分／フラグメンは、組換えＤＮＡ技術により、またはインタクト免疫グロブリンの酵素もしくは化学開裂により産生され得る。
特許請求の範囲に記載のように抗体に言及して用いられるとき、他に特記しない限り、用語“フラグメント”は、“抗体またはフラグメント”が、“抗体またはその抗原結合フラグメント”と同じ意味を有するように、抗体の抗原結合フラグメントを意味する。
“二重特異性抗体”または“二機能性抗体”とは、２つの異なる重鎖／軽鎖対を有し、それにより異なる抗原に対する特異性を有する２つの抗原結合部位を生じさせる、人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメント連結を含む、種々の方法により産生できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照。
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体または抗体の組成物であって、その中の全抗体が特定のエピトープに単一の結合特異性および親和性を示す組成物を意味する。一般的にこのようなモノクローナル抗体は、単一細胞または核酸コード化抗体に由来し、何らかの配列変更を意図的に導入することなく増殖される。従って、用語“ヒトモノクローナル抗体”は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および所望により定常領域を有する、モノクローナル抗体を意味する。一態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは染色体導入非ヒト動物（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス）から得たＢ細胞を、不死化細胞に融合することにより得たハイブリドーマにより産生する。
本明細書で用いる用語“組換えヒト抗体”は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから製造したハイブリドーマに関してトランスジェニックまたは染色体導入である動物（例えば、マウス）から単離した抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換した宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、ならびに（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体のような、組換え手段により製造、発現、作製または単離された全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用するが、例えば、抗体成熟中に生じるその後の再配列および変異を含む、可変領域および定常領域を含む。当技術分野で知られるように(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech, 23(9):1117-1125参照)、可変領域は抗原結合ドメインを含み、これは、外来抗原に特異的な抗体を形成するように再配列される種々の遺伝子によりコードされる。再配列に加えて、可変領域は、複数の単一アミノ酸変異（体細胞変異または超変異と称する）によりさらに修飾されて、抗体の外来抗原に対する親和性が増加され得る。定常領域は、抗原に対するさらなる応答において変化し得る（すなわち、アイソタイプスイッチ）。それ故に、抗原への応答において軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする、再配列され、かつ体細胞的に変異した核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではないかもしれないが、それでも実質的に同一であるか、または類似している（すなわち、少なくとも８０％同一性を有する）。
“ヒト”抗体（ＨｕＭＡｂ）は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体を意味する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載の抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロで無作為もしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞性変異により導入した変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で用いる用語“ヒト抗体”は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語“ヒト”抗体および“完全ヒト”抗体は、同義的に用いられる。
“ヒト化”抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべてが、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置き換えられる抗体を意味する。抗体のヒト化形態の一態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべては、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置き換えられ、一方、１以上のＣＤＲ領域内のいくつか、大部分またはすべてのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、それらが抗体の特定の抗原に結合する能力を消失させない限り、許容される。“ヒト化”抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。
“キメラ抗体”とは、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体のような、可変領域がある種由来であり、定常領域が別の種由来である抗体を意味する。“ハイブリッド”抗体は、マウス（親の）重鎖およびヒト化軽鎖、またはその逆などの、異なるタイプ重鎖および軽鎖を有する抗体を意味する。
本明細書で用いる“アイソタイプ”は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体）を意味する。
“アロタイプ”とは、特定のアイソタイプ群内での天然変異体を意味し、この変異体は、１個または数個のアミノ酸が異なる。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照。
語句“抗原を認識する抗体”および“抗原に特異的な抗体”は、本明細書中、用語“抗原に特異的に結合する抗体”と互換的に用いられる。
本明細書で用いる“単離抗体”は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する（例えば、ＣＤ４０に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ４０以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ＣＤ４０のエピトープに特異的に結合する単離抗体は、異なる種からの他のＣＤ４０タンパク質との交差反応性を有している。
抗体Ｆｃ領域と任意のＦｃ受容体の相互作用に由来する“エフェクター機能”としては、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）のようなＦｃγＲ介在エフェクター機能、ならびに細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御が挙げられるが、これらに限定される必要はない。このようなエフェクター機能は、一般的に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と合わさることを必要とする。
“Ｆｃ受容体”または“ＦｃＲ”は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、対立遺伝子変異体を含むＦｃγＲファミリーの受容体およびこれらの受容体の選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲファミリーは、３個の活性化型（マウスにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトにおけるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡ）および１個の阻害型（ＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃγＲＩＩＢ等価体）受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質を表１にまとめる。生来の（innate）エフェクター細胞タイプの大部分は、１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害型ＦｃγＲＩＩＢを共発現し、一方、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、マウスおよびヒトにおいて、１つの活性化Ｆｃ受容体（マウスにおいてＦｃγＲＩＩＩおよびヒトにおいてＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、阻害性ＦｃγＲＩＩＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、それが結合する活性化Ｆｃ受容体のタイプに関して、マウスＩｇＧ２ａに対応すると考えられる。
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“Ｆｃ領域”（結晶化可能フラグメント領域）または“Ｆｃドメイン”または“Ｆｃ”は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体への結合または古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合に介在する抗体の重鎖のＣ末端領域を意味する。従って、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除いた抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は抗体の２つの重鎖のそれぞれにＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む。ＩｇＭおよびＩｇＥ Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２－４）を含む。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１とＣγ２間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃ２２６またはＰ２３０のアミノ酸残基（またはこれら２つのアミノ酸間のアミノ酸）から重鎖のカルボキシ末端までであると定義されおり、ここで、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従う。Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD；また、米国特許出願公開第２００８／０２４８０２８号の図３Ｃ－３Ｆも参照。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０までの長さであり、一方、ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ領域内のＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、それはＩｇＧの約アミノ酸３４１から約アミノ酸４４７まで（Ｃ末端リシンを含む）の長さである。本明細書で用いるＦｃ領域は、任意の異型変異体を含む天然配列Ｆｃまたは変異体Ｆｃ（例えば、天然に存在しないＦｃ）であり得る。Ｆｃはまた、この領域を単独で、または“Ｆｃ融合タンパク質”とも称される“Ｆｃ領域を含む結合タンパク質”（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドとの関連で意味し得る。
“天然配列Ｆｃ領域”または“天然配列Ｆｃ”は、天然に存在するＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；および、天然配列ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ならびにそれらの天然変異体が含まれる。天然配列Ｆｃは、種々のアロタイプのＦｃを含む。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照。
本明細書で用いる用語“特異的結合”、“選択的結合”、“選択的に結合する”および“特異的に結合する”は、所定の抗原上のエピトープに結合するが、他の抗原には結合しない抗体を意味する。一般に、抗体は、（ｉ）例えば、所定の抗原、例えば組換えヒトＣＤ４０をアナライトとして、かつ抗体をリガンドとして用いるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーにより、または抗原陽性細胞への抗体の結合のScatchard分析により決定されるとき、約１０－７Ｍ未満、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはそれより小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合し、（ｉｉ）所定の抗原に、所定の抗原または密接に関係する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてその親和性より少なくとも２倍大きい親和性で結合する。従って、“ヒトＣＤ４０に特異的に結合する”抗体とは、可溶性または細胞結合性ヒトＣＤ４０に、１０－７Ｍ以下、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはそれより小さいＫＤで結合する抗体を意味する。“カニクイザルＣＤ４０と交差反応する”抗体とは、１０－７Ｍ以下、例えば、約１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍ未満またはそれより小さいＫＤでカニクイザルＣＤ４０に結合する抗体を意味する。
本明細書で用いる用語“ｋａｓｓｏｃ”または“ｋａ”は、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度定数を意味し、一方、本明細書で用いる用語“ｋｄｉｓ”または“ｋｄ”は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を意味する。本明細書で用いる用語“ＫＤ”は、平衡解離定数を意味し、これはｋｄ対ｋａ比（すなわちｋｄ／ｋａ)から得られ、モル濃度（Ｍ）により表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を用いて決定できる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、好ましくはForteBio Octet RED 装置を用いる、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴システムまたはフローサイトメトリーのようなバイオセンサーシステムを用いる、表面プラズモン共鳴、またはフローサイトメトリーおよびScatchard分析である。
抗体またはその抗原結合フラグメントを用いるインビトロまたはインビボアッセイにおける用語“ＥＣ５０”は、最大応答の５０％、すなわち、最大応答とベースラインの半分の応答を誘発する、抗体の濃度を意味する。
用語“固定化ＣＤ４０に結合する”とは、例えば、細胞の表面上に発現されたか、または固体支持体に結合されたＣＤ４０に結合する本明細書に記載の抗体の能力を意味する、
本明細書で用いる用語“交差反応”とは、異なる種由来のＣＤ４０に結合する本明細書に記載の抗体の能力を意味する。例えば、ヒトＣＤ４０に結合する本明細書に記載の抗体はまた、別の種由来のＣＤ４０（例えば、カニクイザルＣＤ４０）に結合し得る。本明細書において、交差反応性は、結合アッセイ（例えば、ＳＰＲ、ＥＬＩＳＡ）において精製された抗原との特異的反応性を検出するか、またはＣＤ４０を生理学的に発現する細胞に結合するか、そうでなければ機能的に相互作用することにより、測定され得る。交差反応性を決定するための方法には、本明細書に記載される標準的な結合アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００ＳＰＲ装置(Biacore AB、Uppsala、Sweden)を用いるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析、またはフローサイトメトリー技術が含まれる。
対象物に適用される、本明細書で用いる用語“天然（naturally-occurring）”とは、対象物が天然に見いだされるという事実を意味する。例えば、自然界の供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）に存在し、実験室でヒトにより意図的に改変されていない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然である。
“ポリペプチド”とは、少なくとも２個の連続して連結されたアミノ酸残基を含む鎖を意味し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１以上のアミノ酸残基は、例えばグリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの修飾を含んでいてよいが、これに限定されない。“タンパク質”とは、１以上のポリペプチドを含んでいてよい。
本明細書で用いる用語“核酸分子”は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであってもよい。
本明細書に記載の抗体配列の“保存的配列修飾”もまた提供され、すなわち、ヌクレオチド配列によりコードされる抗体またはアミノ酸配列を含む抗体の抗原への結合を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾である。例えば、修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような当分野で知られる標準技術により導入され得る。保存的配列修飾は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる保存的アミノ酸置換を含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。それゆえに、抗ＣＤ４０抗体の予想される非必須アミノ酸残基を、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基に置き換える。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当分野で周知である。例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng, 12(10):879-884 (1999); およびBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)参照。
あるいは、別の態様において、変異を、飽和変異誘発によるような、抗ＣＤ４０抗体コード化配列のすべてまたは一部に添って導入でき、得られた修飾抗ＣＤ４０抗体を、結合活性の改善についてスクリーニングし得る。
核酸について、用語“実質的相同”は、２個の核酸またはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常ヌクレオチドの少なくとも約９０％～９５％以上、好ましくは少なくとも約９８％～９９.５％が同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体とハイブリダイズするとき、実質的相同が存在する。
ポリペプチドに関して、用語“実質的相同”は、２個のポリペプチドまたはその指定配列が、最適にアラインし、比較したとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、アミノ酸の少なくとも約８０％、通常アミノ酸少なくとも約９０％～９５％以上、より好ましくは少なくとも約９８％～９９.５％が同一であることを示す。
２配列間の同一性パーセントは、配列を最適にアラインしたとき、これら配列により共有される同一位置の関数であり(すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００)、最適アラインメントは、２配列の最適アラインメントのために導入することが必要であるギャップ数および各ギャップの長さを考慮して決定する。配列の比較および２配列間の同一性パーセントの決定は、以下の非限定的例に記載するような、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を用いて決定できる。２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（version 2.0）に取り込まれているE. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて決定できる。さらに、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を用いて決定できる。
本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列を、さらに“クエリー配列”として用いて、例えば、関連配列を同定するために公的データベースに対して検索を実施できる。このような検索は、Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（version 2.0）を用いて実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記載の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施できる。比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、ギャップ付ＢＬＡＳＴを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のように実施できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付ＢＬＡＳＴプログラムを用いるとき、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中にまたは一部精製したもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸(例えば、他の染色体部分)またはタンパク質から精製されたとき、“単離される”または“実質的に純粋にされる”。Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)参照。
本明細書で用いる用語“ベクター”は、それが連結している別の核酸の輸送が可能である核酸分子を意味することを意図する。１タイプのベクターは“プラスミド”であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをライゲートし得る環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律増殖が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノムに統合され得て、それにより宿主ゲノムと共に増殖される。さらに、あるベクターは、操作可能に連結している遺伝子の発現の指向が可能である。このようなベクターは、本明細書中、“組換え発現ベクター”（または単に“発現ベクター”）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。本明細書において、“プラスミド”および“ベクター”は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、互換的に用いられ得る。しかしながら、等価な機能を提供するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも包含される。
本明細書で用いる用語“組換え宿主細胞”（または単に“宿主細胞”）は、細胞中に天然では存在しない核酸を含む細胞、および組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味することを意図する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も意味することを意図することが理解されるべきである。ある種の改変が突然変異または環境の影響により次世代に生じ得るため、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、なお、本明細書で用いる用語“宿主細胞”の範囲内に包含される。
“免疫応答”とは、外来因子に対する脊椎動物内の生物学的応答を意味し、該応答は、生物をこれらの因子およびそれが原因の疾患から保護する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用が介在し、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性のまたは他の異常細胞、あるいは、自己免疫性または病理学的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織を選択的標的化し、結合し、損傷し、破壊しおよび／または脊椎動物体内から排除する。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のようなエフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞の活性化または阻害あるいはＴｒｅｇ細胞の阻害または枯渇を含む。“Ｔエフェクター”（“Ｔｅｆｆ”）細胞は、細胞溶解性活性を伴うＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指向するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を意味するが、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は含まない。
本明細書で用いる用語“Ｔ細胞介在応答”は、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞）およびヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞）を含む、Ｔ細胞が介在する応答を意味する。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞細胞毒性および増殖を含む。
本明細書で用いる用語“細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答”は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答を意味する。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋ Ｔ細胞により介在される。
“免疫調節剤”または“免疫制御剤（immunoregulator）”は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る、因子、例えば、シグナル伝達経路の成分を意味する。免疫応答の“調節”、“制御”または“修飾”は、免疫系の細胞またはこのような細胞（例えば、エフェクターＴ細胞）の活性の何らかの変更を意味する。このような調節は、種々の細胞タイプの数の増減、これらの細胞の活性の増減または免疫系内で生じ得る何らかの他の変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性免疫調節剤の両者が同定されており、そのいくつかは、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。好ましい態様において、免疫調節剤は、Ｔ細胞の表面に位置し得る。“免疫調節性標的”または“免疫制御性標的”は、物質、薬剤、成分、化合物または分子による結合のために標的化され、その活性が該結合により改変される、免疫調節剤である。免疫調節性標的としては、例えば、細胞表面の受容体（“免疫調節性受容体”）および受容体リガンド（“免疫調節性リガンド”）が挙げられる。
“免疫療法”は、免疫応答を誘発、増強、抑制または他に修飾することを含む方法による、疾患を有するまたはそれに罹患するもしくは再発するリスクのある対象の処置を意味する。
“免疫刺激療法”または“免疫刺激性療法”は、例えば、癌を処置するための、対象における免疫応答の増加（誘発、増強または刺激；これらは全て互換的に用いられ得る）を引き起こす治療を意味する。
“内在性免疫応答の増強”は、対象における既存の免疫応答の有効性または効力の増大を意味する。有効性および効力のこの増大は、例えば、内在性宿主免疫応答を抑制する機序を制圧することにより、または内在性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することにより達成され得る。
本明細書で用いる用語“連結（linked）”は、２以上の分子の結合を意味する。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。結合はまた、遺伝子的（すなわち、組換え融合）であってよい。かかる結合は、化学的結合および組換えタンパク質生産のような多くの当技術分野で認識される技術を用いて達成できる。
本明細書で用いる“投与する”は、当業者に知られる種々の方法および送達系のいずれかを用いた、治療剤を含む組成物の対象への物理的導入を意味する。本明細書に記載の抗体のための好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。本明細書で用いる用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常注射による、投与方式をいい、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない。あるいは、本明細書に記載の抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路のような非経腸ではない経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下にまたは局所的に投与され得る。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１回以上の長期にわたり実施されてよい。
本明細書で用いる用語“阻害”または“遮断”は、互換的に用いられ、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の、部分的および完全阻害／遮断の両方を含む。
本明細書で用いる“癌”は、体内の異常細胞の無制御の増殖により特徴付けられる広範な疾患群を意味する。無制御の細胞分裂は、隣接組織に浸潤し、リンパ系または血流を介して体の離れた部分に転移することができる、悪性の腫瘍または細胞の形成を引き起こし得る。
本明細書で用いる用語“処置（treat）”、“処置する（treating）”および“処置（treatment）”は、症状、合併症、病状または疾患と関係する生化学的兆候の進行、進展、重症度または再発を逆転させる、軽減する、寛解させる、阻止するまたは減速させるあるいは予防する目的で、対象に実施されるあらゆるタイプの介入または過程あるいは活性剤の投与を意味する。予防は、疾患が生じるのを予防する、または生じてもその影響を最小にするための、疾患を有していない対象への投与を意味する。
用語“有効用量”または“有効投与量”は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な薬剤の量として定義される。薬物または療法剤の“治療的有効用量”または“治療的有効投与量”は、単独でまたは他の療法剤と組み合わせて用いたとき、疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、または疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防により証明される疾患緩解を促す、薬物の量である。薬物の“予防的有効量”または“予防的有効投与量”は、疾患を発症するまたは疾患を再発するリスクのある対象に単独でまたは他の療法剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻止する薬物の量である。療法剤または予防剤が疾患緩解を促すまたは疾患の発症もしくは再発を阻止する能力は、臨床治験中ヒト対象において、ヒトでの有効性を予測する動物モデルシステムにおいてまたはインビトロアッセイにおける薬剤の活性のアッセイによるなど、当業者に公知の種々の方法を用いて評価できる。
例として、抗癌剤は、対象における癌進行を遅延させるまたは癌退縮を促す薬物である。好ましい態様において、薬物の治療的有効量は、癌を排除するところまで、癌退縮を促す。“癌退縮を促す”とは、有効量の薬物の、単独または抗新生物剤と組合せた投与が、患者において、腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍の壊死、少なくとも１つの疾患症状の重症度の低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防または疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。薬理学的有効性は、該薬物が患者における癌退縮を促す能力である。生理学的安全性は、薬物投与に起因する、細胞、臓器および／または生物レベルでの容認できる低レベルの毒性または他の有害生理作用（有害作用）を意味する。
腫瘍処置に関する例として、薬物の治療的有効量または投与量は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、未処置対象と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい態様において、薬物の治療的有効量または投与量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを用いて評価できる。腫瘍増殖の阻害は、処置後直ぐには起こらず、一定期間後または反復投与後にしか起こらないことがある。あるいは、組成物のこの性質を、化合物が細胞増殖を阻害する能力を試験することにより評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによりインビトロで測定できる。本明細書に記載の他の好ましい態様において、腫瘍緩解が観察でき、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日またはよりさらに好ましくは少なくとも約６０日の期間継続し得る
本明細書で用いる“併用”療法は、文脈から他の意味が明らかでない限り、２以上の治療剤の協調的な方法での投与を包含することを意味し、同時投与が含まれるが、これに限定されない。具体的には、併用療法は、１つの治療剤の投与が別の治療剤の投与に何らかの形で条件付けられるという条件で、同時投与（例えば、共同製剤の投与または別個の治療組成物の同時投与）および連続または逐次投与の両方を包含する。例えば、１つの治療剤は、異なる治療剤が投与され、所定の期間作用することが可能になった後にのみ投与され得る。例えば、Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423参照。
用語“患者”および“対象”は、予防的または治療的処置を受けるあらゆるヒトを意味する。例えば、本明細書に記載の方法および組成物を、癌を有する対象の処置に用いることができる。
本明細書に記載の種々の面を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。
Ｉ．抗ＣＤ４０抗体
本出願は、癌および慢性のウイルス感染症などの疾患の処置における療法剤として用いるための望ましい特性を有するアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を開示する。これらの特性は、ヒトＣＤ４０に高親和性で結合する能力、ヒト対象における許容可能な低い免疫原性、およびＣＨＯなどの哺乳動物細胞で発現したときに許容可能な高レベルの抗体産生および低い凝集性のうち１以上を含む。本発明の抗ＣＤ４０抗体は、改善された抗体と称することができ、この場合、改善は、ｍＡｂ １２Ｄ６-２４（配列番号１１および８、またはその可変ドメインを含む）などの抗体の元の改変されていない形態を基準にして測定される。改善は、収量および単量体抗体の割合を含む何れかの特性によって、または多量体および他の高分子量種の欠如によって評価することができる。
抗ＣＤ４０抗体の配列変異体
本明細書に記載の抗体配列における幾つかの変動性は、許容されてよく、抗体の望ましい特性を依然として維持し得る。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて描写される。したがって、本発明は、本明細書に記載の抗体（例えば、１２Ｄ６抗体は、配列番号５４および４９、配列番号１１および４９、または配列番号５２および４９の重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）の重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列を含む抗ｈｕＣＤ４０抗体を提供する。
ＩＩ．改変されたおよび修飾された抗体
標的抗原結合
種々の態様において、本発明の抗体は、抗原結合が有害であり得る組織および環境においては抗原結合を選択的に阻止するが、それが有益であり得る組織および環境においては抗原結合を許容するように修飾される。一態様において、抗体の抗原結合表面に特異的に結合し、抗原結合を妨害する遮断ペプチド“マスク”が産生され、このマスクは、ペプチダーゼ開裂可能リンカーにより抗体の結合アームの各々に連結させる。例えば、米国特許第８，５１８，４０４号（CytomX）参照。このような構築物は、非腫瘍組織と比較して腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが高度に上昇している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における開裂可能リンカーの選択的開裂は、抗原結合が望まない副作用を起こす末梢組織ではなく、腫瘍において選択的にマスキング／遮断ペプチドを解離させ、抗原結合させ得る。
あるいは、関連態様において、（二価）抗体の両抗原結合表面に結合し、抗原結合を妨害する２つの抗原結合ドメインを含む二価結合化合物（“マスキングリガンド”）が開発され、ここで、該２つの結合ドメインマスクは、例えばペプチダーゼにより開裂可能な、開裂可能リンカーで互いに（抗体ではない）連結されている。例えば、国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０７７６４３（Tegopharm Corp.）参照。マスキングリガンドは、抗体による結合が意図される抗原を含むか、またはそれ由来でもよく、あるいは独立して産生されてもよい。このようなマスキングリガンドは、非腫瘍組織と比較して、腫瘍微小環境においてプロテアーゼレベルが高度に上昇している癌の処置に有用である。腫瘍微小環境における開裂可能リンカーの選択的開裂は、２つの結合ドメインの互いからの解離を可能にし、抗体の抗原結合表面に対するアビディティーを低減させる。その結果の、マスキングリガンドの抗体からの解離は、抗原結合が望まない副作用を起こす末梢組織ではなく、腫瘍において選択的な抗原結合を可能とする。
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
本発明の抗体は、意図された使用のための抗体の生物学的活性（ある場合）に基づいて選択された、異なるＦｃ領域を含む定常ドメインと組合せた本発明の可変ドメインを含んでいてよい。Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25:1369。例えば、ヒトＩｇＧは、４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類することができ、これらの各々は、Ｆｃγ受容体（活性化受容体ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２,ｃ）；ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ａ,ｂ）および抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２ｂ）の１以上との結合について、および補体の第１成分（Ｃ１ｑ）について、独特のプロファイルを有するＦｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、全Ｆｃγ受容体に結合する；ＩｇＧ２はＦｃγＲＩＩＡＨ１３１に結合し、およびＦｃγＲＩＩＡＲ１３１ ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８に低い親和性で結合する；ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８に結合する；そして、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に対して他の全Ｆｃγ受容体より低い親和性を有する。Bruhns et al. (2009) Blood 113:3716。ＦｃγＲＩがＩｇＧ２に結合せず、ＦｃγＲＩＩＩＢがＩｇＧ２またはＩｇＧ４に結合しないことを示す試験がある。一般に、ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３≫ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２である。その結果、ＡＤＣＣが望まれるとき、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインが、薬物における使用のために選択されるはずである；ＦｃγＲＩＩＩＡ発現ＮＫ細胞、単球またはマクロファージの活性化が望まれる場合、ＩｇＧ３が選択されるはずである；そして、抗体がアレルギー患者の脱感作に使用される場合、ＩｇＧ４が選択されるはずである。抗体が全エフェクター機能を欠くことが望ましい場合、ＩｇＧ４がまた選択され得る。
本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０可変領域は、Ｆｃ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃに連結（例えば、共有結合または融合）されてよく、これは、あらゆるアロタイプまたはイソアロタイプであり得て、例えば、ＩｇＧ１に関して、Ｇ１ｍ、Ｇ１ｍ１(ａ)、Ｇ１ｍ２(ｘ)、Ｇ１ｍ３(ｆ)、Ｇ１ｍ１７(ｚ)；ＩｇＧ２に関して、Ｇ２ｍ、Ｇ２ｍ２３(ｎ)；ＩｇＧ３に関して、Ｇ３ｍ、Ｇ３ｍ２１(ｇ１)、Ｇ３ｍ２８(ｇ５)、Ｇ３ｍ１１(ｂ０)、Ｇ３ｍ５(ｂ１)、Ｇ３ｍ１３(ｂ３)、Ｇ３ｍ１４(ｂ４)、Ｇ３ｍ１０(ｂ５)、Ｇ３ｍ１５(ｓ)、Ｇ３ｍ１６(ｔ)、Ｇ３ｍ６(ｃ３)、Ｇ３ｍ２４(ｃ５)、Ｇ３ｍ２６(ｕ)、Ｇ３ｍ２７(ｖ)であってよい。例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1参照。アロタイプの選択は、例えば抗薬物抗体の形成を最小とするための、可能性のある免疫原性の懸念により影響を受け得る。
ある態様において、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ＦｃγＲＩＩｂに結合する、またはＦｃγＲＩＩｂへの結合が増強されているＦｃを有し、これは増強されたアゴニズムを提供し得る。例えば、ＷＯ２０１２／０８７９２８；Li & Ravetch (2011) Science 333:1030； Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101；White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754参照。本明細書に記載の可変領域は、阻害性受容体ＦｃｙＲＩＩｂに対する親和性を増強する、例えばアポトーシス誘導活性またはアジュバント活性を増強する、Ｆｃ変異体に連結されてよい。Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 109:10966；米国特許出願公開２０１４／００１０８１２。かかる変異体は、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃγＲＩＩｂ＋細胞に関係する免疫調節活性を有する抗体を提供し得る。一態様において、Ｆｃ変異体は、１以上の活性化受容体に比べて、ＦｃγＲＩＩｂへの親和性の選択的増強を提供する。かかる変異体はまた、増強されたＦｃＲ介在架橋を示し、その結果、増強された治療効果をもたらし得る。ＦｃγＲＩＩｂへの結合改変のための修飾は、ＥＵインデックスにより、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群より選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性増強のための例示的な置換としては、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な置換としては、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙが挙げられる。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を増強するための他のＦｃ変異体は、２３５Ｙ－２６７Ｅ、２３６Ｄ－２６７Ｅ、２３９Ｄ－２６８Ｄ、２３９Ｄ－２６７Ｅ、２６７Ｅ－２６８Ｄ、２６７Ｅ－２６８Ｅおよび２６７Ｅ－３２８Ｆが挙げられる。特に、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ－Ｌ３２８Ｆ二重変異を含むＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅ変異体は、阻害性ＦｃｙＲＩＩｂ受容体への親和性を特異的に増強する上で特に価値がある。Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926；米国特許出願公開２００６／０２４２９８；ＷＯ２０１２／０８７９２８。ＦｃγＲＩＩｂへの増強された特異性（ＦｃγＲＩＩａＲ１３１と区別して）は、Ｐ２３８Ｄ置換および他の変異の付加（Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. & Selection 26:589；ＷＯ２０１２／１１５２４１０)、ならびにＶ２６２ＥおよびＶ２６４Ｅの付加（Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc. 135:9723およびＷＯ２０１４／１８４５４５）により得ることができる。ＷＯ２０１７／００４００６参照。
半減期の延長
特定の態様において、抗体を修飾して、その生物学的半減期を延長させる。種々の試みが可能である。例えば、これは、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合親和性を高めることにより行われ得る。ある態様において、米国特許５，８６９，０４６および６，１２１，０２２（Presta et al.）に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採ったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で改変する。ＦｃＲｎへの結合が増加したおよび／または薬物動態学的特性が改善した他のＦｃバリアントの例としては、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、２５９位、３０８位および４３４位の置換が挙げられる。ＦｃＲｎへのＦｃ結合が増加した他の変異体は、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. (2006) Journal of Immunology 176:346-356）、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Shields et al. (2001) Journal of Biological Chemistry, 276(9):6591-6604）、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ（Dall' Acqua et al. (2002) Journal of Immunology, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al. (2006) Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524）を含む。米国特許第８,３６７,８０５号参照。
Ｎ４３４Ａバリアント（Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663）のような、ＩｇＧ Ｆｃにおけるある保存的残基（Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４）の修飾が、ＦｃＲｎ親和性を増大し、それにより循環における抗体半減期を延長する手段として提案されている。ＷＯ９８／０２３２８９参照。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組合せＦｃ変異体は、最大５倍のＦｃＲｎ結合増加および血清半減期延長が示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組合せＦｃ変異体も、ＩｇＧ１抗体の半減期が延長される。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ－Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ－Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ－Ｎ４３４Ｓ変異を含む組合せＦｃ変異体も半減期が延長されることが示されている。ＷＯ２００９／０８６３２０参照。
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組合せＦｃ変異体は、半減期を約４倍に延長する。Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。ＦｃＲｎ親和性を増加させるが、ｐＨ依存性は低減する関連ＩｇＧ１修飾（Ｍ２５２Ｙ－Ｓ２５４Ｔ－Ｔ２５６Ｅ－Ｈ４３３Ｋ－Ｎ４３４Ｆ）が、ＦｃＲｎへの他の抗体の結合を阻止するための競合体（competitor）として用いるＩｇＧ１構築物（“ＭＳＴ－ＨＮ Ａｂｄｅｇ”)の創出に用いられており、内在性ＩｇＧ（例えば、自己免疫性状況）または他の外来性（治療的）ｍＡｂのいずれかにおいて当該他の抗体のクリアランスの増加を生じる。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283；ＷＯ２００６／１３０８３４。
ＦｃＲｎ結合を増加させる他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671；６,２７７,３７５；６,８２１,５０５；ＷＯ９７／３４６３１；および、ＷＯ２００２／０６０９１９に記載されている。
特定の態様において、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプを用いてＦｃＲｎ結合を増加させ、おそらく半減期を延長させることができる。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッド変異体を、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、ＩｇＧ３由来のアミノ酸で、これら２つのアイソタイプが異なる位置において置換することによって構築し得る。それゆえに、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体を構築し得る。本明細書に記載の他の態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッド変異体を、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、ＩｇＧ１由来のアミノ酸で、これら２つのアイソタイプが異なる位置において置換することによって構築し得る。それゆえに、１以上の置換、例えば、以下のアミノ酸置換：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、－２３６Ｇ（位置２３６でのグリシンの挿入を意味する）および３２７Ａの１以上を含む、ハイブリッド変異体ＩｇＧ抗体を構築し得る。米国特許第８,６２９,１１３号参照。意図的に血清半減期延長および発現改善がされたＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが産生されている。米国特許第７,８６７,４９１号（その中の配列番号１８）。
本発明の抗体の血清半減期はまたペグ化により延長できる。例えば、抗体をペグ化して、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を延長できる。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントと結合する条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化を、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性水－可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施する。本明細書で用いる用語“ポリエチレングリコール”は、モノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－またはアリールオキシ－ポリエチレングリコールあるいはポリエチレングリコール－マレイミドのような他のタンパク質の誘導体化に用いられているＰＥＧのあらゆる形態を含むことを意図する。特定の態様において、ペグ化されるべき抗体はグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られており、本明細書に記載の抗体に適用できる。例えば、ＥＰ０１５４３１６（Nishimuraら）およびＥＰ０４０１３８４（Ishikawaら）参照。
あるいは、ある状況下では、本発明の抗体の半減期を、延長させるのではなく、短縮することが望ましいことがある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ（Hornick et al., (2000) J. Nucl. Med. 41:355）およびＨ４３５Ａ／Ｒ、Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ（Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819）のような修飾は、医療造影のような迅速なクリアランスが好ましい状況において使用するために、ＦｃＲｎ結合を低減し、それゆえに半減期を短縮（クリアランス増加）し得る。Kenanova et al., (2005) Cancer Res. 65:622も参照。クリアランスを増強する他の手段は、ＦａｂフラグメントのようなＦｃＲｎを結合する能力を欠く抗体フラグメントとして、本発明の抗原結合ドメインを形成することを含む。このような修飾は、抗体の循環半減期を、数週間からほんの数時間に短縮できる。次いで、抗体フラグメントの選択的ペグ化を用いて、必要に応じて、抗体フラグメントの半減期を微調整（延長）できる。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。抗体フラグメントを、半減期を延長させるために、例えば、融合タンパク質構築物において、ヒト血清アルブミンと融合させることもできる。Yeh et al., (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、二重特異性抗体を、本発明の第一抗原結合ドメインおよびヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する第二抗原結合ドメインを用いて構築し得る。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１２７６９１およびそこに引用された特許参考文献を参照。あるいは、特殊化されたポリペプチド配列、例えば“ＸＴＥＮ”ポリペプチド配列を抗体フラグメントに付加して、半減期を延長できる。Schellenberger et al., (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186；国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０９１１２２。
さらなるＦｃ変異体
ＩｇＧ４定常ドメインを用いるとき、置換２２８Ｐを包含させることが通常好ましく、これは、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それゆえに、ＩｇＧ４分子を安定化し、例えば治療抗体と処置患者における内在性ＩｇＧ４の間のＦａｂアーム交換を減少させる。Labrijn et al., (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al., (2000) J. Immunol. 164:1925。
ＩｇＧ１構築物のヒンジにおける可能性のあるプロテアーゼ開裂部位を、Ｄ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾により排除し、抗体の安定性を増加させることができる。ＷＯ２０１４／０４３３４４。
Ｆｃバリアントのそのリガンド（Ｆｃ受容体）に対する親和性および結合特性を、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））または動態（例えば、BIACORE(登録商標)SPR分析）ならびに間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）のような他の方法を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の種々のインビトロアッセイ法（生化学的または免疫学的ベースのアッセイ）により決定できる。これらおよび他の方法は、試験すべき構成成分の１以上の標識および／または発色標識、蛍光標識、発光標識または同位体標識を含むが、これらに限定されない多様な検出方法を用いることができる。結合親和性および動態の詳細な記載は、抗体－免疫原相互作用に焦点を当てる、Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見いだされ得る。
さらに他の態様において、抗体のグリコシル化を、エフェクター機能の増強または低減のために修飾する。例えば、位置２９７の保存的アスパラギン残基の変異（例えばＮ２９７Ａ）により、全エフェクター機能を欠き、ゆえに、補体およびＦｃγＲＩ結合を欠く非グリコシル化抗体を作製することができる。Bolt et al., (1993) Eur. J. Immunol. 23:403。Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595も参照（位置２９７のグリコシル化排除のためにＩｇＧ１のＮ２９７Ｑを使用）。
非グリコシル化抗体は、一般にエフェクター機能を欠くが、変異を導入してその機能を保持させることができる。非グリコシル化抗体、例えばＮ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ変異由来のものまたはタンパク質をグリコシル化しないシステム（例えば大腸菌）で産生させたものを、さらに変異させて、例えばＳ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／またはＨ（ＷＯ２００９／０７９２４２）またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ（Jung et al., (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604）、ＦｃγＲ結合を保持し得る。
糖エンジニアリングを使用して、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合した炭水化物鎖のα２,６シアリル含量の変化により、ＩｇＧ構築物の抗炎症性特性を修飾することでき、ここで、α２,６シアル酸付加形態の割合の増加が抗炎症性効果増強に至る。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513参照。逆に、α２,６シアル酸付加炭水化物を有する抗体の割合の減少が、抗炎症性特性が望まれない場合に有用であり得る。例えば、α２,６シアル酸付加形態の選択的精製または酵素修飾により、抗体のα２,６シアル酸付加含量を改変する方法が、米国特許出願公開第２００８／０２０６２４６号に提供される。他の態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸配列を修飾して、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾の包含により、α２,６シアル酸付加の効果を模倣することができる。ＷＯ２０１３／０９５９６６。
ＩＩＩ．抗体物理的特性
本明細書に記載の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかに１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合の改変により、抗体の免疫原性増加または抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Marshall et al. (1972) Ann. Rev. Biochem. 41:673-702； Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94； Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168:1099-109； Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R； Parekh et al. (1985) Nature 316:452-7； Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで生じることが知られている。ある状況において、可変領域グリコシル化を含まない抗ｈｕＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択するか、グリコシル化領域内の残基を変異させることにより、達成できる。
特定の態様において、本明細書に記載の抗体は、アスパラギン異性化部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－ＧまたはＤ－Ｇ配列で生じ得て、その結果、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を低減し得るイソアスパラギン酸残基の創出に至り得る（イソアスパラギン酸効果）。
各抗体は、固有の等電点(ｐＩ)を有し、これは、一般にｐＨ６～９.５の範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、一般にｐＨ７～９.５の範囲に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、一般にｐＨ６～８の範囲に入る。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、若干変性（unfolding）しており、インビボ条件下で不安定であり得ると推測される。従って、正常範囲に入るｐＩ値を含む抗ＣＤ４０抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体の選択または荷電表面残基の変異により達成される。
各抗体は、特徴的融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボでの全体的安定性がより高いことを示す（Krishnamurthy & Manning (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3:361-71）。一般に、ＴＭ１（最初の変性温度）が６０℃より高いのが好ましく、好ましくは６５℃より高い、よりさらに好ましくは７０℃より高い。抗体の融点は、示差走査熱量測定（Chen et al. (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett. 68:47-52）または円二色性（Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）を用いて測定できる。好ましい態様において、急速に分解しない抗体を選択する。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いて測定できる（Alexander & Hughes (1995) Anal Chem. 67:3626-32）。
別の好ましい態様において、最小凝集効果を有する抗体を選択し、凝集効果は、望まない免疫応答の惹起および／または改変されたもしくは不都合な薬物動態特性に至り得る。一般に、２５％以下、好ましくは２０％以下、よりさらに好ましくは１５％以下、よりさらに好ましくは１０％以下およびよりさらに好ましくは５％以下の凝集を有する抗体が許容される。凝集は、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、いくつかの技術により測定できる。
ＩＶ．核酸分子
本明細書に記載の別の面は、本明細書に記載の抗体をコードする核酸分子である。核酸は、細胞全体中、細胞溶解物中または一部精製したもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分または他の汚染物、例えば、他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然で単離されたＤＮＡと連結している染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他を含む標準技術により精製されたとき、“単離”されまたは“実質的に純粋”である。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。本明細書に記載の核酸は、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含んでも、含んでいなくてもよい。特定の態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
本明細書に記載の核酸を、標準分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、さらに以下に記載するような、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）により発現される抗体に関して、ハイブリドーマにより産生された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を用いる）から得られた抗体に関して、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収できる。
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂフラグメント遺伝子にまたはｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準組み換えＤＮＡ技術によりさらにエンジニアリングし得る。これらの操作において、ＶＬ－またはＶＨ－コード化ＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域または可動性リンカーのような他のタンパク質をコードする他のＤＮＡフラグメントに操作可能に連結される。この文脈で用いる用語“操作可能に連結”は、２つのＤＮＡフラグメントが、該２つＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がフレーム内のままであるように連結されることを意味することを意図する。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコード化ＤＮＡを重鎖定常領域（ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と操作可能に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Kabat, E. A. el al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、例えば、ＩｇＧ１領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子に関して、ＶＨコード化ＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする他のＤＮＡ分子に操作可能に連結できる。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子にＶＬコード化ＤＮＡを操作可能に連結することにより、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
ｓｃＦｖ遺伝子を創出するために、ＶＨおよびＶＬコード化ＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ)３をコードする他のフラグメントと、ＶＨおよびＶＬ配列が隣接一本鎖タンパク質として発現でき、ＶＬ領域とＶＨ領域が可動性リンカーにより連結しているように、操作可能に連結される（例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554参照）。
Ｖ．抗体産生
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
配列が提供されている特定の抗体および他の関連抗ＣＤ４０抗体の両者を含む本発明の抗体を、当技術分野で周知のように、例えば、組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生させ得る（Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、軽鎖および重鎖の一部または完全長をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術（例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、該ＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に連結するように、発現ベクターに挿入できる。この文脈において、用語“操作可能に連結”は、抗体遺伝子が、ベクター内での転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を制御する意図する機能を発揮するように、ベクターにライゲートされることを意味することを意図する。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターに挿入しても、両遺伝子同じ発現ベクターに挿入してもよい。抗体遺伝子は、標準方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補性制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しないならば平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに操作可能に連結し、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに操作可能に連結するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにそれらを挿入することにより、あらゆる抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を創出できる。これに加えてまたはこれとは別に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム内で連結されるように、ベクターにクローン化できる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を担持し得る。用語“制御配列”は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載される。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることは、当業者には認識され得る。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を支持するウイルス要素を含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーターのような非ウイルス制御配列を用い得る。なおさらに、ＳＶ４０早期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列由来の配列を含む、ＳＲαプロモーターシステムのような異なる起源由来の配列からなる制御要素を用い得る（Takebe, Y. et al., (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子のようなさらなる配列を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４,３９９,２１６号、同第４,６３４,６６５号および同第５,１７９,０１７号（全てAxelら）参照）。例えば、一般に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ－宿主細胞とメトトレキサート選択／増幅を使用するために）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のために）を含む。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。用語“トランスフェクション”の種々形態は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどの、原核または真核宿主細胞に外来性ＤＮＡを導入するのに一般に用いられる幅広い多くの技術を含むことを意図する。本明細書に記載の抗体を原核または真核宿主細胞で発現させることは理論的には可能であるが、真核細胞および最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が、このような真核細胞および特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を構築し、分泌する可能性が高いため、最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は、活性抗体の高収率での産生に無効であることが報告されている（Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。本発明の抗体はまた、酵母ピキア・パストリスの糖改変株でも産生され得る。Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:210。
本明細書に記載の組換え抗体の発現に好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に用いる、Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ－ ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と用いるために、別の好ましい発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に開示のＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現または、より好ましくは、宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体を、標準タンパク質精製法を用いて、培養培地から回収できる。
本発明の抗体ポリペプチド鎖のＮおよびＣ末端は、一般に観察される翻訳後修飾により、予想される配列と異なるかもしれない。例えば、Ｃ末端リシン残基は、抗体重鎖から欠失していることが多い。Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132。Ｎ末端グルタミン残基および程度は少ないがグルタミン酸残基は、治療抗体の軽鎖および重鎖の両者でピログルタミン酸残基に変換されることが多い。Dick et al. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu et al. (2011) J. Biol. Chem. 286:11211。
本発明の種々のアゴニスト抗ｈｕＣＤ40抗体についてのアミノ酸配列を、表７にまとめる配列リストに提供する。上記の理由により、Ｃ末端リシンは、重鎖または重鎖定常ドメインの配列リストのどの配列にも含まれていない。しかしながら、別の態様では、本発明の抗ｈｕＣＤ40抗体の各重鎖、および／あるいはそのような抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードする遺伝子構築物は、重鎖の一方または両方のＣ末端にこの追加のリシン残基を含む。
ＶＩ．アッセイ
本明細書に記載の抗体を、例えば、標準ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ４０への結合について試験できる。すなわち、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１～２μｇ／ｍｌの精製ＣＤ４０でコーティングし、次いでＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈物（例えば、ＣＤ４０免疫化マウスの血漿の希釈物）を各ウェルに添加し、３７℃にて１～２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした二次試薬（例えば、ヒト抗体について、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ポリクローナル試薬）と、３７℃にて１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（Moss Inc.、製品: ABTS-1000）と反応させ、分光光度計でＯＤ４１５～４９５で分析する。次いで、免疫化マウスからの血清を、ヒトＣＤ４０を発現する細胞株に結合するが、ＣＤ４０を発現しない対照細胞株に結合しないことについて、フローサイトメトリーによりさらにスクリーニングする。すなわち、抗ＣＤ４０抗体の結合を、ＣＤ４０発現ＣＨＯ細胞と、抗ＣＤ４０抗体を、１：２０希釈でインキュベートすることにより評価する。細胞を洗浄し、結合を、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出する。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用いて行う。好ましくは、最高力価を発生させるマウスを融合に用いる。マウス抗ｈｕＣＤ４０抗体を検出する場合は、抗マウス検出抗体を用いて同様の試験を行うことができる。
上記のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗体をスクリーニングし、それゆえに、ＣＤ４０免疫原と陽性反応性を示す抗体を生産するハイブリドーマをスクリーニングできる。次いで、好ましくは高親和性で、ＣＤ４０に結合する抗体を生産するハイブリドーマをサブクローン化し、さらに特徴付けすることができる。次いで、親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡによる）各ハイブリドーマからの１クローンを、細胞バンクの製造および抗体精製のために選択できる。
抗ＣＤ４０抗体を精製するために、選択ハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために２リットルスピナーフラスコ中で増殖させ得る。上清を濾過し、濃縮して、その後プロテインＡ－セファロースを用いる親和性クロマトグラフィー（Pharmacia, Piscataway, NJ）に付し得る。溶出ＩｇＧを、純度確認のためゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーで確認できる。緩衝液をＰＢＳに交換してよく、濃度を、１.４３吸光係数（extinction coefficient）を用いてＯＤ２８０により決定できる。モノクローナル抗体を分注し、－８０℃で保存してよい。
選択抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかを決定するために、各抗体を、市販試薬（Pierce, Rockford, IL）を用いてビオチニル化できる。ビオチニル化ｍＡｂ結合を、ストレプトアビジン標識プローブで検出できる。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を用いる競合試験を、上記のようにＣＤ４０被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて実施できる。
精製抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを、１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで、４℃にて一夜被覆できる。１％ＢＳＡでブロッキング後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、環境温度で１～２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートプローブと反応させる。プレートを、上記のように反応させ、分析する。
ＣＤ４０を発現する生存細胞へのモノクローナル抗体の結合を試験するために、フローサイトメトリーを用い得る。簡潔にいうと、膜結合ＣＤ４０を発現する細胞株（標準増殖条件下で増殖）を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、種々の濃度のモノクローナル抗体と４℃にて１時間混合する。洗浄後、細胞を、一次抗体染色と同一条件下、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＩｇＧ抗体と反応させる。サンプルを、単一細胞をゲーティングする光および側方散乱性質を使用するＦＡＣＳｃａｎ装置により分析し、標識抗体の結合を決定する。蛍光顕微鏡を用いる代替アッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えてまたはその代わりに用い得る。細胞をまさに上記のように染色し、蛍光顕微鏡で試験できる。この方法は、個々の細胞の可視化を可能にするが、抗原の密度により感受性が低下し得る。
抗ｈｕＣＤ４０抗体を、ウェスタンブロッティングによりＣＤ４０抗原との反応性についてさらに試験し得る。すなわち、ＣＤ４０発現細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清でブロッキングし、試験すべきモノクローナル抗体でプローブする。ＩｇＧ結合を抗ＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Sigma Chem, Co., St. Louis, MO）で発色させ得る。
多様な抗ＣＤ４０抗体の結合親和性、交差反応性および結合動態を分析する方法は、当技術分野で知られる標準アッセイ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)２０００ ＳＰＲ装置（Biacore AB, Uppsala, Sweden）を用いる、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を含む。
一態様において、抗体は、ヒトＣＤ４０の細胞外領域に特異的に結合する。抗体は、ＣＤ４０の細胞外ドメイン内の特定のドメイン（例えば、機能性ドメイン）に特異的に結合し得る。特定の態様において、抗体は、ヒトＣＤ４０の細胞外領域およびカニクイザルＣＤ４０の細胞外領域に特異的に結合する。好ましくは、抗体は、高親和性でヒトＣＤ４０に結合する。
ＶＩＩ．二重特異性分子
本明細書に記載の抗体を、二重特異性分子の形成に使用し得る。抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、別の官能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）で誘導体化または連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生できる。本明細書に記載の抗体は、実際１個を超える他の官能性分子で誘導体化または連結して、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子と結合する多特異的分子を産生できる；このような多特異的分子も、本明細書で用いる用語“二重特異性分子”に包含されることを意図する。本明細書に記載の二重特異性分子を創出するために、本明細書に記載の抗体を、二重特異性分子が生じるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣剤のような１以上の他の結合分子と（例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合的結合またはその他により）機能的に連結できる。
したがって、本発明は、ＣＤ４０に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む、二重特異性分子を提供する。二重特異性分子が多特異的である本明細書に記載の態様において、分子は、第３の結合特異性をさらに含み得る。
一態様において、本明細書に記載の二重特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１個の抗体またはその抗体フラグメントを含む。抗体はまた、軽鎖または重鎖二量体あるいは何らかのその最小フラグメント、例えば、Ladnerらの米国特許第４,９４６,７７８号（その内容は引用により明示的に本明細書に包含される）に記載のようなＦｖまたは単鎖構築物であってもよい。
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本明細書に記載の二重特異性分子に用いられ得る他の抗体としては、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。
本明細書に記載の二重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を用いて、構成要素の結合特異性を共役化することにより作製できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、個別に生成され、次いで互いに合し得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、種々のカップリング剤または架橋剤を共有結合に用い得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ-スクシンイミジル－Ｓ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５,５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロハキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照）。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83、およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載の方法がふくまれる。好ましい共役剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ－ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co.（Rockford、IL）から入手可能である。
結合特異性分子が抗体であるとき、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合（コンジュゲーション）可能である。特に好ましい態様において、ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、奇数個の、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
あるいは、両結合特異性分子を同じベクター内にコードし、同じ宿主細胞内で発現および組み立てることもできる。この方法は、二重特異性分子が、ｍＡｂ ｘ ｍＡｂ、ｍＡｂ ｘ Ｆａｂ、Ｆａｂ ｘ Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド ｘ Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本明細書に記載の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子であるか、または２つの結合決定基を含む単鎖に二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子を作製する方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；および、同第５，４８２，８５８号に記載されている。
それらの特異的標的への二重特異性分子の結合は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウェスタンをブロットアッセイなどの当技術分野で認識された方法を用いて確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般的に、目的の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることにより、特定の目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。
ＶＩＩＩ．組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤される、本明細書に記載の１以上の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物、例えば医薬組成物をさらに提供する。かかる組成物は、本明細書に記載の（例えば、２以上の異なる）抗体、または免疫複合体もしくは二重特異性分子のうち１つまたは組み合わせを含み得る。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的な活性を有する抗体（または免疫複合体もしくは二重特異性分子）の組み合わせを含み得る。
特定の態様において、組成物は、抗ＣＤ４０抗体を、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、または１－３００ｍｇ／ｍｌもしくは１００－３００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。
本明細書に記載の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち、他の薬剤と組合せて投与され得る。例えば、併用療法は、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体を少なくとも１つの他の抗癌剤および／またはＴ細胞刺激剤（例えば、活性化剤）と組み合わせることを含む。併用療法で用いられ得る療法剤の例は、本明細書に記載の抗体の使用の項で以下にさらに詳細に記載されている。
ある態様において、本明細書に記載の治療用組成物は、癌の処置に用いられる他の化合物、薬剤および／または薬物を含んでいてよい。かかる化合物、薬剤および／または薬物としては、例えば、化学療法剤、小分子薬剤または所与の癌に対する免疫応答を刺激する抗体が挙げられる。いくつかの例において、治療用組成物としては、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても公知）抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体、ＴＬＲアゴニストまたはＩＤＯもしくはＴＧＦβの小分子アンタゴニストが挙げられる。
本明細書で用いる“薬学的に許容される担体”は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与（例えば、注射または点滴による）に適する。投与経路により、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子を、該化合物を不活化し得る酸および他の天然条件から該化合物を保護する物質でコーティングし得る。
本明細書に記載の医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含み得る。“薬学的に許容される塩”は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まない毒性効果を何ら付与しない塩を意味する（例えば、Berge, S.M., et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19）。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、亜リン酸塩などのような非毒性無機酸ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などのような非毒性有機酸由来のものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属ならびにＮ,Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような非毒性有機アミン由来のものを含む。
本明細書に記載の医薬組成物はまた、薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水可溶性抗酸化剤；(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなどのような油可溶性抗酸化剤；および(３)クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート剤を含む。
本明細書に記載の医薬組成物で用い得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）および適当なこれらの混合物、オリーブ油のような植物油およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルを含む。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散製剤の場合必要な粒子径の維持により、そして界面活性剤の使用により維持できる。
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントも含み得る。微生物の存在の防止は、上記の滅菌法および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含ませることの両者により確実にできる。組成物に糖、塩化ナトリウムなどのような等張剤を含ませることも望ましいことがある。さらに、注射用医薬形態の持続吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を含ませることにより達成し得る。
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散液および無菌注射用溶液または分散液の即座の調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬物の使用は当分野で公知である。ある常用の媒体または薬物が活性化合物と非適合性ではない限り、本明細書に記載の医薬組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物も組成物に包含させ得る。
治療組成物は、一般に製造および保存条件下で、無菌かつ安定でなければならない。組成物を溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の高薬物濃度に適する規則的構造として製剤できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）および適当なこれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散製剤の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持できる。
無菌注射用溶液を、必要な量の活性化合物を、適切な溶媒に、必要に応じて上記成分の１個または組み合わせと共に組み込み、次いでマイクロ濾過により滅菌することにより調製できる。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒体および上記のものからの必要な他の成分を含む、無菌媒体に取り込むことにより調製する。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め無菌濾過した溶液からの活性成分とさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
単一投与量形態を作製するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置すべき対象および特定の投与方法により変わる。単一投与量形態を作製するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％中、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせた約０.０１パーセント～約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０.１パーセント～約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント～約３０パーセントの活性成分の範囲である。
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）が提供されるように調節される。例えば、１回のボーラスを投与してよく、数分割用量を長い期間をかけて投与してよくまたは治療状況の緊急度により示されるように、用量を徐々に減らしても増やしてもよい。投与の容易さおよび用量の均一さのために、非経腸組成物を投与量単位形態に製剤するのが特に有利である。本明細書で用いる投与量単位形態は、処置すべき対象のための単位投与量として適する物理的に分かれた単位であり、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。本明細書に記載の投与量単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性に対するこのような活性化合物の処置における当技術分野に固有の制限、によって定められ、これらに直接的に依存する。
抗体の投与について、投与量は、約０.０００１～１００ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲であり、より一般には０.０１～５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば投与量は、０.３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。例示的処置レジメは、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヶ月に１回または３～６ヶ月に１回の投与を必要とする。
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与する各抗体の投与量は、示された範囲内に入る。治療用抗体は、通常複数回投与する。一投与量の間の間隔は、例えば、週、月、３ヶ月または年であり得る。患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルの測定により指示されるように、間隔は不規則でもよい。ある方法において、投与量を、約１～１０００μｇ／ｍｌ、ある方法において約２５～３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度となるよう調節する。
抗体を、持続放出製剤として投与でき、この場合、必要な投与頻度は少ない。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体は、最長半減期を示し、続いてヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体である。投与量および頻度は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかにより変わり得る。予防適用において、長期間にわたり、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で投与する。ある患者は、死亡するまで処置を受け続ける。治療適用において、比較的短い間隔で比較的高投与量が、疾患の進行が低減するか停止するまで、好ましくは患者が疾患症の部分的なまたは完全な改善を示すまで、時には必要である。その後、多くの免疫腫瘍学の適応症では継続処置は必要ないが、患者に予防レジメンを投与することができる。
本明細書に記載の医薬組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方法で所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように、変えてよい。選択された投与量レベルは、用いる本明細書に記載の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置の期間、他の薬物、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、病状、全般的健康状態および既往症ならびに医薬分野で周知の類似要素を含む、多くの薬物動態要素により変わる。
本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体の“治療有効投与量”は、好ましくは疾患症状の重症度の軽減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大または疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。癌の状況において、治療有効用量は、好ましくは癌と関連する身体的症状のさらなる悪化を予防する。癌の症状は当分野で周知であり、例えば、異常な黒子特徴、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の見かけの変化、新たに着色された皮膚領域、異常黒子、爪の下の黒ずんだ領域、乳房腫瘤、乳頭変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、弱化、過度の疲労、摂食困難、食欲減退、慢性の咳、進行性息切れ、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨張、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、重度発汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉痙攣、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難などを含む。治療効果は、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０ｍＡｂの最初の投与直後に観察できるか、または一定期間および／または一連の投与後にのみ観察され得る。このような効果の遅れは、数か月後、最大６月、９月または１２月後にのみ観察される。本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂは、幾つかの免疫腫瘍剤によって示される遅延効果に照らして、治療効果がないということを時期尚早に決定しないことが重要である。
治療有効用量は、癌の発症を、該疾患の早期または先行徴候が存在するときに望まれるように、予防または遅延し得る。癌の診断に利用する臨床検査は、化学（可溶性ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌレベル測定を含む）（Hock et al. (2006) Cancer 106:2148; Chung & Lim (2014) J. Trans. Med. 12:102）、血液学、血清学および放射線学を含む。したがって、前記のいずれかをモニターするあらゆる臨床的または生化学的アッセイを、特定の処置が、癌処置に治療有効用量であるか否かを決定するために使用し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択した特定の組成物または投与経路のような因子に基づき、このような量を決定できる。
本明細書に記載の組成物を、当技術分野で知られる１以上の多くの方法を用いて、１以上の投与経路で投与できる。当業者には明らかなとおり、投与経路および／または方法は、所望の結果によって変わる。本明細書に記載の抗体の好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。本明細書で用いる用語“非経腸投与”は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方式をいい、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
あるいは、本明細書に記載の抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所的のような非経腸ではない経路で投与できる。
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤のような、急速な放出から化合物を保護する担体を用いて製造できる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを用い得る。このような製剤の製造のための多くの方法が特許されるか、または当業者に一般に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
治療組成物を、当技術分野で知られる医療装置を用いて投与できる。例えば、好ましい態様において、本明細書に記載の治療組成物を、米国特許第５,３９９,１６３号；同第５,３８３,８５１号；同第５,３１２,３３５号；同第５,０６４,４１３号；同第４,９４１,８８０号；同第４,７９０,８２４号；または同第４,５９６,５５６号に開示の装置のような無針皮下組織注射器で投与できる。本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体で用いるための周知のインプラントおよびモジュールの例としては、米国特許第４,４８７,６０３号（制御された速度で薬を分配するためのインプラント可能微量注入ポンプを記載)；米国特許４,４８６,１９４(皮膚から薬を投与するための治療デバイスを記載)；米国特許第４,４４７,２３３号（正確な注射速度で薬を送達するための投薬注入ポンプを記載）；米国特許第４,４４７,２２４号（連続的薬物送達のための可変流動インプラント可能注入装置を記載）；米国特許第４,４３９,１９６号（多チャンバー区画を有する浸透圧性薬物送達系を記載）；および、米国特許第４,４７５,１９６号（浸透圧性薬物送達系を記載）が挙げられる。これらの特許を、引用により本明細書中に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールが当業者に知られている。
特定の態様において、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤できる。例えば、血液－脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本明細書に記載の治療化合物がＢＢＢを通過することを確実にするために（望むのであれば）、例えば、リポソームに製剤できる。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号；同第５,３７４,５４８号；および同第５,３９９,３３１号を参照。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、そうして標的化薬物送達を増強する１以上の成分を含み得る（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。例示的ターゲティング成分は、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５,４１６,０１６号（Lowら）参照）；マンノシド（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインＡ受容体（Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）を含む；K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照。
ＩＸ．使用および方法
本明細書に記載の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＣＤ４０シグナル伝達をアゴナイズすることにより免疫増強を伴う、多くのインビトロおよびインビボ適用を有する。好ましい態様において、本明細書に記載の抗体はヒトまたはヒト化抗体である。例えば、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、培養中の細胞に、インビトロまたはエクスビボでまたはヒト対象に、例えば、インビボで投与し、多くの疾患における免疫を増強できる。したがって、本発明は、対象に、該対象における免疫応答が増強、刺激または上方制御されるように、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における免疫応答を修飾する方法を提供する。
好ましい対象には、免疫応答の増強が望ましいであろうヒト患者が含まれる。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞介在免疫応答）を増強することによって処置することができる障害を有するヒト患者を処置するのに特に適している。特定の態様において、方法は、インビボでの癌処置に特に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、目的の抗原または処置対象（例えば、腫瘍担持対象またはウイルス担持対象）に既に存在し得る抗原と共に投与できる。ＣＤ４０に対する抗体を他の薬剤と投与するとき、２剤を別々に投与しても、同時に投与してもよい。
サンプルおよび対照サンプルと、ヒトＣＤ４０に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、抗体またはそのフラグメントとヒトＣＤ４０の複合体の形成を可能にする条件下で、接触させることを含む、該サンプルにおけるヒトＣＤ４０抗原の存在を検出するまたはヒトＣＤ４０抗原の量を測定する方法も包含される。次いで、複合体の形成を検出し、ここで、対照サンプルと比較したサンプル間の複合体形成の差異が、該サンプルにおけるヒトＣＤ４０抗原の存在の指標である。さらに、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体を、免疫親和性精製によるヒトＣＤ４０精製に用い得る。
Ｔ細胞応答、例えば抗原特異的Ｔ細胞応答の共刺激を増強するために本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体の能力を考慮すると、本発明は、本明細書に記載の抗体を用いて、抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激、増強または上方制御する、インビトロおよびインビボ方法を提供する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、抗ＣＤ４０抗体を用いて増強できる。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＴ細胞毒性（Ｔｃ）細胞であり得る。
さらに、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）が増強されるように、該対象に本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を投与することを含む、対象における免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答）を増強する方法も包含される。好ましい態様において、対象は、腫瘍担持対象であって、腫瘍に対する免疫応答が増強される。腫瘍は、固形腫瘍または液性腫瘍（liquid tumor）、例えば、血液悪性腫瘍（hematological malignancy）である。特定の態様において、腫瘍は、免疫原性腫瘍である。特定の態様、腫瘍は非免疫原性腫瘍である。特定の態様において、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陽性である。特定の態様において、腫瘍は、ＰＤ－Ｌ１陰性である。対象は、ウイルス担持対象であってもよく、ウイルスに対する免疫応答が増強される。
さらに、対象において腫瘍の増殖を阻害するように、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を該対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖阻害の方法も提供される。また、対象において慢性のウイルス感染症が処置されるように、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を該対象に投与することを含む、対象における慢性のウイルス感染症の処置法も提供される。
特定の態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、補助療法剤として対象に投与される。癌を有する対象の抗ｈｕＣＤ４０抗体での処置は、現在の標準療法と比べて長期的な持続的応答；少なくとも１、２、３、４、５、１０年またはそれ以上の長期生存、少なくとも１、２、３、４、５または１０年あるいはそれ以上の無再発生存期間をもたらし得る。特定の態様において、癌を有する対象の抗ｈｕＣＤ４０抗体での処置は、例えば、１、２、３、４、５または１０年あるいはそれ以上、癌の再発を防止するか、または癌の再発を遅延させる。
本明細書に記載のこれらおよび他の方法を、以下にさらに詳細に記載する。
癌
本発明は、癌、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖を阻止または低減する、および／または腫瘍が退行するように、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を対象に投与することを含む、癌を有する対象を処置するための方法を提供する。抗ｈｕＣＤ４０抗体を、癌性腫瘍の増殖阻止に単独で用い得る。あるいは、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、下記のように、他の薬剤、例えば、他の免疫原性薬剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて用い得る。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のようなＰＤ－１の阻害剤との併用もまた提供される。例えば、Ellmark et al. (2015) OncoImmunology 4:7 e1011484参照。
従って、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体、例えば、１２Ｄ６、５Ｆ１１、８Ｅ８、５Ｇ７もしくは１９Ｇ３のヒト化形態、またはその抗原結合フラグメントを、対象に投与することを含む、該対象における、例えば、腫瘍細胞の増殖阻止による、癌を処置する方法を提供する。抗体は、ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体(例えば、本明細書に記載のヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体のいずれか）、ヒトキメラ抗ｈｕＣＤ４０抗体、またはヒト化非ヒト抗ｈｕＣＤ４０抗体、例えば、本明細書に具体的に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体の少なくとも１つと、結合に関して競合するか、またはそれと同じエピトープに結合するヒト、キメラまたはヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体であり得る。
本発明の抗体を用いて増殖が阻害され得る癌は、一般に免疫療法に応答性の癌を含む。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌、扁平上皮非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、子宮頚癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌腫)、胃癌、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、皮膚または眼内悪性黒色腫のような転移悪性黒色腫)、骨腫瘍、皮膚癌、子宮癌、肛門周辺癌、精巣癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物(ＣＮＳ)、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌(例えば、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)関連腫瘍)および２つの主要な血液細胞系統、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞を産生する)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞を産生する)のいずれか由来の血液系腫瘍、例えば、全タイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ (Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球性白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球性白血病(Ｍ７)、孤立性顆粒球性肉腫および緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病(Ｔ－Ｌｂｌｙ／Ｔ－ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真性組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも呼ばれる)およびワルデンシュトレーム高ガンマグロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)；骨髄腫、例えば、ＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(緩徐進行性骨髄腫とも呼ばれる)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉性起源の腫瘍；星状細胞腫、シュワン腫を含む、精上皮腫、奇形癌、中枢および末梢神経の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む、間葉性起源の腫瘍；および小細胞および大脳様細胞型を含むＴ－前リンパ性白血病(Ｔ－ＰＬＬ)のようなＴ細胞障害を含むが、これに限定されない、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌、リンパ系造血性腫瘍、例えばＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む、他の腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ Ｔ－ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽球性サブタイプ)；血管中心性(鼻)Ｔ細胞リンパ腫；頭頚部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄リンパ腫、ならびに該癌のあらゆる組み合わせを含む。本明細書に記載の方法は、転移癌、難治性癌(例えば、遮断ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１抗体での先の免疫療法に難治性の癌)および再発性癌の処置にも用いられ得る。
上記にかかわらず、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０アゴニストでの処置によって悪化する可能性のある、ＣＤ４０発現を伴う血液性癌の処置における使用は見出されない。特定の癌は、ＣＤ４０を発現することが知られており、従って、そのような悪化の対象となり得て、故に、分類的に除外され得る。他の態様において、特定の腫瘍サンプルがＣＤ４０の発現について試験され、その試験結果に基づいて本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体での処置から除外される。
抗ｈｕＣＤ４０抗体は、単剤療法として投与され得るか、または唯一の免疫刺激療法として投与され得るか、または癌ワクチン戦略において、癌性細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞のような免疫原性薬剤と組み合わせてもよい（He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチド、あるいはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞を含む。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている（Rosenberg、S., 2000, Development of Cancer Vaccines、ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738参照；また、Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043(DeVitaら)(eds.), 1997、Cancer: Principles and Practice of Oncology、Fifth Editionも参照）。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を用いて調製されている。これらの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ－ＣＳＦを発現するように形質導入されたとき、最も有効であることが示されている。ＧＭ－ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている。Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539-43。
多くの腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義がもたらされている（Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍内および腫瘍が発生した細胞内で発現される分化抗原、例えばメラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ－２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見出される腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることが示されている。ＣＤ４０アゴニストを、腫瘍において発現される組換えタンパク質および／またはペプチドの集合体と共に、これらのタンパク質に対する免疫応答を産生するために使用してよい。これらのタンパク質は、通常免疫系により自己抗原と見なされ、それゆえにそれらに対して耐容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であり、８５％を超えるヒト癌で発現され、限られた数の体細胞組織でしか発現されない、タンパク質テロメラーゼを含み得る（Kim et al., (1994) Science 266: 2011-2013）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を変化させるか、または２つの無関係な配列の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ－ａｂｌ）を創出する体細胞性変異のため、癌細胞において発現される“ネオ抗原”またはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプでもあり得る。
他の腫瘍ワクチンは、ヒト乳頭腫ウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒト癌と関与するウイルスからのタンパク質を含み得る。ＣＤ４０阻害と組み合わせて用い得る腫瘍特異的抗原の別の形態は、腫瘍組織自体から単離された精製ヒートショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらのヒートショックタンパク質は、腫瘍細胞からのタンパク質のフラグメントを含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫の惹起のための抗原提示細胞の送達に極めて有効である（Suot & Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al., (1997) Science 278:117-120）。
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答の誘発に使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで産生され、多様なタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を負荷することができる（Nestle et al., (1998) Nature Medicine 4: 328-332）。ＤＣはまた同様にこれらの腫瘍抗原を発現する遺伝的手段により形質導入することもできる。ＤＣはまた免疫化の目的で腫瘍細胞に直接的に融合されている（Kugler et al., (2000) Nature Medicine 6:332-336）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化を、ＣＤ４０アゴニズムと効率的に組み合わせて、より強力な抗腫瘍応答を活性化（誘発（unleash））できる。
ＣＤ４０のアゴニズムはまた、標準的な癌療法（例えば、外科手術、放射線および化学療法）と組み合わせ得る。ＣＤ４０のアゴニズムを、化学療法レジメと効率的に組合せることができる。これらの例において、投与される化学療法剤の用量を低減することが可能であり得る（Mokyr et al., (1998) Cancer Research 58: 5301-5304）。このような組合せの例は、黒色腫の処置のためのダカルバジンと組み合わせた抗ｈｕＣＤ４０抗体である。このような組み合わせの他の例は、黒色腫の処置のためのインターロイキン－２（ＩＬ－２）と組み合わせた抗ｈｕＣＤ４０抗体である。ＣＤ４０アゴニストと化学療法の組み合わせの背後にある科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果として生じる細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルを増加させることにある。細胞死によりＣＤ４０アゴニズムとの相乗性をもたらし得る他の併用療法は、放射線、外科手術およびホルモン遮断である。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の源を創出する。血管形成阻害剤も、ＣＤ７３４０アゴニストと組み合わせ得る。血管形成の阻害は、腫瘍細胞死をもたらし、これが宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給し得る。
本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体はまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化させる二重特異性抗体と組み合わせても使用し得る（例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同第５,８３７,２４３号参照）。二重特異性抗体を用いて、２個の別々の抗原を標的化することができる。例えば抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために用いられている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効率的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＣＤ４０のアゴニズムによって増強され得る。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体の使用により、ＤＣに直接的に送達させ得る。
腫瘍は、様々な機序により宿主の免疫監視を逃れる。これらの機序の多くが、腫瘍により発現される免疫抑制性タンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、とりわけＴＧＦ－β（Kehrl et al., (1986) J. Exp. Med. 163: 1037-1050）、ＩＬ－１０（Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200）およびＦａｓリガンド（Hahne et al., (1996) Science 274: 1363-1365）が含まれる。これらの各々に対する抗体を、抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて用いて、免疫抑制剤の作用を逆転し、宿主による腫瘍免疫応答を有利にし得る。
抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代用し得る（Ridge et al., (1998) Nature 393: 474-478）。ＣＴＬＡ－４（例えば、米国特許第５,８１１,０９７号）、ＯＸ－４０（Weinberg et al. (2000) Immunol. 164: 2160-2169）、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ（Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997)）、およびＩＣＯＳ（Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266）などのＴ細胞共刺激性分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化の増加レベルを提供し得る。ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤も抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて用いられ得る。
また、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および増殖ならびにこれらの細胞の受容者への養子移植を含むいくつかの実験的処置プロトコールもある（Greenberg & Riddell (1999) Science 285: 546-51）。これらの方法は、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答を活性化するためにも用いられ得る。抗ＣＤ４０抗体の存在下でのエクスビボ活性化により、養子移植Ｔ細胞の頻度および活性を増加させ得る。
慢性のウイルス感染症
別の面において、本明細書に記載の発明は、対象が感染症の処置を受けるように、該対象に抗ｈｕＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における感染症の処置法を提供する。
上記のような腫瘍への適用と同様に、抗体介在性ＣＤ４０アゴニズムは、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を増強するために、単独で用いられ得るか、またはアジュバントとしてワクチンと組み合わせて用いられ得る。この治療アプローチが特に有用であり得る病原体の例としては、現在有効なワクチンが存在しない病原体、または従来のワクチンが完全に有効ではない病原体が挙げられる。これらには、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢおよびＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌などが含まれるが、これらに限定されない。ＣＤ４０アゴニズムは、感染の過程で変化した抗原を提示するＨＩＶなどの病原体による確立された感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＣＤ４０抗体投与時に異物と認識され、強力なＴ細胞応答を誘発する。
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスの例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ－１、ＨＡＶ－６、ＨＳＶ－ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟体動物ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌の例としては、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、ライムス病菌が挙げられる。
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌の例としては、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス（フミガーツス、ニガー等）、ムコラレス属（ムコール、アブシディア、リゾプス属）、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストマイセス・デルマチチジス、ブラジルパラコクシジオイデス、クシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムが挙げられる。
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生虫の例としては、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸バランジウム（Balantidium coli）、フォーラーネグレリア（Naegleriafowleri）、アカントアメーバ属、ジアルジア・ランビア、クリプトスポリジウム属、ニューモシスティス・カリニ、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、バベシア・ミクロチ、ブルーストリパノソーマ（Trypanosoma brucei）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、リーシュマニア・ドノバン、トキソプラズマ・ゴンディイ、ブラジル鉤虫（Nippostrongylus brasiliensis）が挙げられる。
上記の全ての方法において、ＣＤ４０アゴニズムは、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２）、または腫瘍抗原の増強された提示を提供する二重特異性抗体療法などの他の免疫療法と組み合わせることができる。例えば、Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123参照。
ワクチンアジュバント
本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を用いて、抗ｈｕＣＤ４０抗体と目的の抗原、例えばワクチンとの共投与により、抗原特異的免疫応答を増強することができる。従って、本発明は、対象において抗原に対する免疫応答が増強されるように、該対象に（ｉ）抗原；および、（ｉｉ）抗huCD４０抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む、対象における免疫応答の増強方法を提供する。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であり得る。かかる抗原の非限定的例は、上記の腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）、または上記のウイルス、細菌もしくは他の病原体由来の抗原などの、上に記載のものを含む。
本明細書に記載の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル 抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与するのに好適な経路は、当技術分野で周知であり、当業者であれば選択できる。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈内または皮下）に投与され得る。用いる分子の好適な投与量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または剤形化によって変わる。
上記のように、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体は、１以上の他の療法剤と、例えば、細胞傷害性薬剤、放射毒性剤または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、（免疫複合体として）薬剤に連結されてよいか、または薬剤とは別に投与されてよい。後者の場合（別個に投与する場合）、抗体は、薬剤投与の前、後または同時に投与されてよいか、あるいは他の公知の療法剤と、例えば抗癌剤、例えば放射線と共投与されてよい。かかる療法剤としては、とりわけ、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミド・ヒドロキシウレアなどの抗新生物剤が挙げられ、これらはそれ自体が、患者に対して毒性または準毒性であるので、あるレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週に１回、１００ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日毎に１回、６０－７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの化学療法剤との共投与は、異なる機序により作動する２つの抗癌剤を提供し、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果をもたらす。このような共投与は、薬剤に対する耐性の発生または抗体と反応しないようにする腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決することができる。
本明細書に記載の範囲内には、本明細書に記載の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子あるいは免疫複合体）および使用説明書を含むキットも含まれる。キットは、少なくとも１つの追加の反応剤、または本明細書に記載の１以上の追加のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なるＣＤ４０抗原中のエピトープに結合する相補的活性を有するヒト抗体）をさらに含み得る。キットは、一般的に、キットの内容物の用途を示すラベルを含む。用語ラベルは、キットに添付されたまたはキットと共に提供された、あるいはキットに付随する、何らかの文書または記録された材料を含む。
併用療法
上記の併用療法に加えて、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体は、以下に記載のように、例えば癌の処置のための、併用療法においても用いられ得る。
本発明は、抗ｈｕＣＤ４０抗体を、免疫応答の刺激に有効であり、それゆえに対象における免疫応答をさらに増強、刺激または上方制御する１以上のさらなる薬剤、例えば抗体と共投与する、併用治療の方法を提供する。
一般に、本明細書に記載の抗ｈｕＣＤ４０抗体を、(i)共刺激性受容体のアゴニストおよび／または(ii)Ｔ細胞上の阻害性シグナルのアンタゴニストと組み合わせることができ、この両者とも、抗原特異的Ｔ細胞応答（免疫チェックポイント調節因子）の増強をもたらす。共刺激性および共阻害性分子の大部分は、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体を、免疫応答増加のために、ＩｇＳＦファミリーのメンバーを標的とする薬剤と共に投与してよい。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの一つの重要なファミリーは、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１(ＰＤ－Ｌ１)、Ｂ７－ＤＣ(ＰＤ－Ｌ２)、Ｂ７－Ｈ２(ＩＣＯＳ－Ｌ)、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７－Ｈ６を含むＢ７ファミリーである。共刺激性または共阻害性受容体に結合する膜結合リガンドの他のファミリーは、同族ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα １β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む（例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照）。
別の面において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は、免疫応答刺激のために、例えば癌のような増殖性疾患の処置のために、Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ；他の“免疫抑制性サイトカイン”）のアンタゴニストあるいはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストと組み合わせて用いられ得る。
一面において、Ｔ細胞応答は、本発明の抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂおよび以下の薬剤の１以上の組合せにより刺激され得る：(i) ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ガレクチン－９、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ－１およびＴＩＭ－４のような、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）のアンタゴニスト、(ii) Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＣＤ２８、４－１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４－１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３およびＣＤ２８ＨのようなＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト。
上記タンパク質の１つを調節し、癌の処置のために、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば、本明細書に記載のものと組み合わせ得る薬剤の例としては、ヤーボイ（登録商標）／イピリムマブまたはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ－４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ－９３６５５８(ＰＤ－１に対する)、ピディリズマブ／ＣＴ－０１１(ＰＤ－１に対する)、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）／ペムブロリズマブ／ＭＫ－３４７５(ＰＤ－１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７－ＤＣ／ＰＤ－Ｌ２に対する)、ＢＭＳ－９３６５５９(Ｂ７－Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７－Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ－５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する－ＷＯ１１／１０９４００）、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ－３に対する)、ウレルマブ／ＢＭＳ－６６３５１３およびＰＦ－０５０８２５６６(ＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する)、バルリルマブ(varlilumab)／ＣＤＸ－１１２７(ＣＤ２７に対する)、ＭＥＤＩ－６３８３およびＭＥＤＩ－６４６９（ＯＸ４０に対する)、ＲＧ－７８８８（ＯＸ４０Ｌに対する－ＷＯ０６／０２９８７９)、アタシセプト（ＴＡＣＩに対する）、ムロモナブ－ＣＤ３（ＣＤ３に対する）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４に対する）が挙げられる。
癌の処置のために、アンタゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせ得る他の分子は、ＮＫ細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストまたはＮＫ細胞上の活性化受容体のアゴニストを含む。例えば、抗ｈｕＣＤ４０アンタゴニスト抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えば、リリルマブ）と組み合わせ得る。
併用療法のためのさらに他の薬剤は、ＲＧ７１５５（ＷＯ１１／７００２４、ＷＯ１１／１０７５５３、ＷＯ１１／１３１４０７、ＷＯ１３／８７６９９、ＷＯ１３／１１９７１６、ＷＯ１３／１３２０４４）またはＦＰＡ－００８（ＷＯ１１／１４０２４９；ＷＯ１３／１６９２６４；ＷＯ１４／０３６３５７）を含むＣＳＦ－１Ｒアンタゴニスト抗体のようなＣＳＦ－１Ｒアンタゴニストを含むが、これらに限定されない、マクロフージまたは単球を阻害または枯渇する薬剤が含まれる。
一般的に、本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、正の共刺激性受容体を連結するアゴニスト薬剤、阻害性受容体を介するシグナル伝達を減弱する遮断剤、および抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身性に高める１以上の薬剤、腫瘍微小環境内の多様な免疫抑制経路に打ち勝つ薬剤（例えば、阻害性受容体結合遮断（例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用）、Ｔｒｅｇ枯渇または阻害（例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ）またはエクスビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇の使用）、ＩＤＯのような代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは消耗の回復／予防）および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する薬剤の１以上と共に用いられ得る。
本発明は、例えば、腫瘍増殖阻害または抗ウイルス応答刺激のために、対象における免疫応答が刺激されるように、該対象にＣＤ４０アゴニスト、例えば、抗体および１以上の追加の免疫刺激性抗体、例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体および／またはＬＡＧ３アンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗体を投与することを含む、対象における免疫応答を刺激する方法を提供する。ある態様において、対象に、アンタゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体を投与する。ある態様において、対象に、アンタゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与する。ある態様において、対象に、アンタゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与する。ある態様において、少なくとも１つの追加の免疫刺激性抗体（例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ－１、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４および／またはアンタゴニスト抗ＬＡＧ３抗体）はヒト抗体である。あるいは、少なくとも１つの追加の免疫刺激性抗体は、例えば、キメラまたはヒト化抗体（例えば、マウス抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＬＡＧ３抗体から製造される）であり得る。
本発明は、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニストＰＤ－１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置する方法を提供する。特定の態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ－１抗体は治療量以下の用量で投与され、または両者は治療量以下の用量で投与され、ここで、治療量以下の用量とは、当該薬剤での単剤療法を参照している。また、本発明は、対象に抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ－１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置に関連する有害事象を変える方法も提供する。特定の態様において、対象はヒトである。特定の態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に記載の抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のような、ヒト化モノクローナル抗体である。
本明細書に記載の方法における使用に好適なＰＤ－１アンタゴニストとしては、リガンド、抗体（例えば、モノクローナル抗体および二重特異性抗体）、多価薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、ＰＤ－１アンタゴニストは、融合タンパク質、例えば、ＡＭＰ－２４４のようなＦｃ融合タンパク質である。ある態様において、ＰＤ－１アンタゴニストは、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
抗ＰＤ－１抗体の例は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）／ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８）またはＷＯ２００６／１２１１６８に記載の抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１のうち１つのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。特定の態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載のＭＫ－３４７５（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）／ペムブロリズマブ／以前はランブロリズマブ）；ＷＯ２０１２／１４５４９３に記載のＡＭＰ－５１４／ＭＥＤＩ－０６８０；およびＣＴ－０１１（ピディリズマブ；以前は、ＣＴ－ＡｃＴｉｂｏｄｙまたはＢＡＴ；例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409参照）である。さらに既知のＰＤ－１抗体および他のＰＤ－１阻害剤は、ＷＯ２００９／０１４７０８、ＷＯ０３／０９９１９６、ＷＯ２００９／１１４３３５、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１１／１６１６９９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同第８,２１７,１４９号および米国特許公報２００９／０３１７３６８に記載のものを含む。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示される抗ＰＤ－１抗体のいずれも用い得る。これらの抗体のうち１つと、ＰＤ－１との結合について競合するおよび／またはＰＤ－１と同じエピトープに結合する抗ＰＤ－１抗体もまた、併用療法に用い得る。
特定の態様において、抗ＰＤ－１抗体は、ヒトＰＤ－１に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＰＤ－１に１×１０-８Ｍ～１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
本発明は、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびアンタゴニストＰＤ－Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置する方法を提供する。特定の態様において、抗ｈｕＣＤ４０抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は治療量以下の用量で投与されまたは両者は治療量以下の用量で投与される。本発明は、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置と関連する有害事象を変える方法を提供する。特定の態様において、対象はヒトである。特定の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に記載の抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のような、ヒト化モノクローナル抗体である。
一態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９(ＷＯ２００７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号で１２Ａ４と称される)またはＰＣＴ公開ＷＯ０７／００５８７４および米国特許第７,９４３,７４３号に記載される、３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体である。特定の態様において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（抗Ｂ７－Ｈ１としても公知）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６としても公知）である。ＷＯ２０１３／１７３２２３、ＷＯ２０１１／０６６３８９、ＷＯ２０１２／１４５４９３、米国特許第７,６３５,７５７号および同第８,２１７,１４９号および米国特許公報２００９／１４５４９３に開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれも用いられ得る。これらの抗体のいずれかと競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体もまた、併用療法に使用し得る。
さらなる態様において、本発明のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を、第３の免疫療法剤と組合せて、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＰＤ－Ｌ１アンタゴニストのような、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達のアンタゴニストと併用する。一態様において、該第３の免疫療法剤は、ＧＩＴＲアンタゴニストまたはＯＸ－４０アンタゴニスト、例えば本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＯＸ４０抗体である。
別の面において、免疫腫瘍学製剤は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えばアゴニスト性ＧＩＴＲ抗体である。好適なＧＩＴＲ抗体としては、例えばＢＭＳ－９８６１５３、ＢＭＳ－９８６１５６、ＴＲＸ－５１８（ＷＯ０６／１０５０２１、ＷＯ０９／００９１１６）およびＭＫ－４１６６（ＷＯ１１／０２８６８３）が挙げられる。
別の面において、免疫腫瘍学製剤は、ＩＤＯアンタゴニストである。好適なＩＤＯアンタゴニストとしては、例えば、ＩＮＣＢ－０２４３６０（ＷＯ２００６／１２２１５０、ＷＯ０７／７５５９８、ＷＯ０８／３６６５３、ＷＯ０８／３６６４２）、インドキシモド、またはＮＬＧ－９１９（ＷＯ０９／７３６２０、ＷＯ０９／１１５６６５２、ＷＯ１１／５６６５２、ＷＯ１２／１４２２３７）が挙げられる。
本発明は、本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体およびＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置する方法を提供する。特定の態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、治療量以下の用量で投与され、抗ＣＴＬＡ－４抗体は治療量以下の用量で投与され、または両者は治療量以下の用量で投与され、ここで、治療量以下の用量とは、当該薬剤での単剤療法を参照している。本発明は、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置に関連する有害事象を変える方法を提供する。特定の態様において、対象はヒトである。特定の態様において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヤーボイ（登録商標）（イピリムマブまたはＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４に記載の抗体１０Ｄ１)、トレメリムマブ（以前はチシリムマブ、ＣＰ－６７５,２０６）、以下の文献：ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４；米国特許第６,２０７,１５６号；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505(抗体ＣＰ－６７５２０６)；およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304に記載の抗ＣＴＬＡ－４抗体からなる群より選択される抗体である。ＷＯ２０１３／１７３２２３に開示の抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれも使用し得る。
本発明は、対象にアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および抗ＬＡＧ－３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患（例えば、癌）を処置する方法を提供する。さらなる態様において、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は治療量以下の用量で投与され、抗ＬＡＧ－３抗体は治療量以下の用量で投与されまたは両者は治療量以下の用量で投与される。ここに提供するのは、対象に抗ＣＤ７３抗体および治療量以下の抗ＬＡＧ－３抗体を投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置と関連する有害事象を変える方法である。本発明は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および治療量以下の用量の抗ＬＡＧ－３抗体を対象に投与することを含む、過増殖性疾患の免疫刺激剤での処置に関連する有害事象を変える方法を提供する。特定の態様において、対象はヒトである。特定の態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体であり、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体は、本明細書に記載の抗体のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のような、ヒト化モノクローナル抗体である。抗ＬＡＧ３抗体の例は、米国特許公報ＵＳ２０１１／０１５０８９２およびＷＯ２０１４／００８２１８に開示される、抗体２５Ｆ７、２６Ｈ１０、２５Ｅ３、８Ｂ７、１１Ｆ２または１７Ｅ５のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体を含む。ある態様において、抗ＬＡＧ－３抗体はＢＭＳ－９８６０１６である。用いられ得る他の当技術分野で認識される抗ＬＡＧ－３抗体は、ＵＳ２０１１／００７０２３に記載のＩＭＰ７３１を含む。ＩＭＰ－３２１も使用し得る。これらの抗体のいずれかと競合するおよび／または同じエピトープに結合する抗ＬＡＧ－３抗体もまた、併用療法で用いられ得る。
特定の態様において、抗ＬＡＧ－３抗体は、ヒトＬＡＧ－３に５×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＬＡＧ－３に１×１０-８Ｍ以下のＫＤで結合する、ヒトＬＡＧ－３に５×１０-９Ｍ以下のＫＤで結合するまたはヒトＬＡＧ－３に１×１０-８Ｍ～１×１０-１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体、ならびにＬＡＧ－３および／またはＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１などの第二の標的抗体の１以上に対するアンタゴニスト、例えばアンタゴニスト抗体の投与は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強できる。本発明の抗体を用いて増殖を阻害し得る癌は、一般に免疫療法に応答する癌を含む。本発明の併用療法で処置する癌の代表例は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体での単剤療法の部分で具体的に上記した癌を含む。
特定の態様において、本明細書に記載の治療抗体の組合せを、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時に、または薬学的に許容される担体中の各抗体を用いる別個の組成物として逐次的に、投与してよい。別の態様において、治療抗体の組合せを逐次的に投与し得る。例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するか、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＣＴＬＡ－４抗体を次に投与するように、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ－１抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するか、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＰＤ－１抗体を次に投与するように、抗ＰＤ－１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するか、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を次に投与するように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を逐次的に投与し得る。これに加えてまたはこれとは別に、抗ＬＡＧ－３抗体を最初に投与し、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を次に投与するか、またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を最初に投与し、抗ＬＡＧ－３抗体を次に投与するように、抗ＬＡＧ－３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を逐次的に投与し得る。
さらに、併用療法の２以上の用量を逐次的に投与する場合、逐次投与の順は、各投与時に逆になっても同じ順のままでもよく、逐次投与を、同時投与または何れかのこれらの組合せと組み合わせ得る。例えば、組合せ抗ＣＴＬＡ－４抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＣＴＬＡ－４抗体が先で、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体がその次、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が先で、抗ＣＴＬＡ－４抗体がその次などであり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組合せ抗ＰＤ－１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＰＤ－１抗体が先で、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体がその次、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が先で、抗ＰＤ－１抗体がその次などであり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組合せ抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体が先で、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体がその次、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が先で、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がその次などであり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組合せ抗ＬＡＧ－３抗体およびアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の最初の投与は同時であってよく、二回目の投与は、抗ＬＡＧ－３抗体が先で、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体がその次、三回目の投与は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体が先で、抗ＬＡＧ－３抗体がその次などであり得る。他の代表的投薬スキームは、先ずアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０を投与し、次いで抗ＣＴＬＡ－４抗体（および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体）の投与を含み、その後の投与は同時であり得る。
所望により、唯一の免疫治療剤としてのアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体またはアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と１以上の追加の免疫治療抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３)の組合せを、さらに癌性細胞、精製腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞のような免疫原性剤と組み合わせ得る(He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28)。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのような黒色腫抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞(以下にさらに記載)を含む。ＣＤ４０アゴニストおよび１以上の追加の抗体(例えば、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断剤)を、さらに標準的癌療法剤と組み合わせてもよい。例えば、ＣＤ４０アゴニストおよび１以上のさらなる抗体(例えば、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断剤)を、化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの例において、本開示の組合せと共に投与する他の化学療法剤の用量を低減することが可能である(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組合せ剤の例は、ＣＤ４０アゴニストと、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体のような追加の抗体を伴うかまたは伴わず、さらに黒色腫の処置のためのダカルバジンとの組合せを含む組み合わせである。他の例は、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／または抗ＬＡＧ－３抗体のような追加の抗体を伴うかまたは伴わず、さらに黒色腫の処置のためのインターロイキン－２(ＩＬ－２)との組合せの組み合わせである。ＣＤ４０アゴニズムおよびＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断剤と化学療法剤の併用の背後の科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加をもたらすはずであることである。細胞死によりＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断剤を伴いまたは伴わない組合せＣＤ４０アゴニズムとの相乗性をもたらし得る他の併用療法は、放射線、外科手術またはホルモン遮断を含む。これらのプロトコールの各々は、宿主における腫瘍抗原の起源を創出する。血管形成阻害剤も、組合せＣＤ４０アゴニズムおよびＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断剤と組み合わせ得る。血管形成の阻害は、腫瘍細胞死をもたらし、これが宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給し得る。
唯一の免疫治療剤としてのアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体またはＣＤ４０アンタゴニストとＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断抗体との組合せはまた、ＦｃαまたはＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化させる二重特異性抗体と組み合わせても使用し得る（例えば、米国特許第５,９２２,８４５号および同第５,８３７,２４３号参照）。二重特異性抗体を、２個の別個の抗原を標的化するために用い得る。これらの応答のＴ細胞アームは、組合せＣＤ４０アゴニズムおよびＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断剤の使用により増強され得る。
別の例において、唯一の免疫治療剤としてのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体あるいは抗ＣＤ４０抗体および追加の免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体および／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および／またはＬＡＧ－３剤、例えば、抗体の組合せを、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標) (トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標) (イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標) (アレムツズマブ)、LYMPHOCIDE(登録商標) (エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標) (ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標) (エルロチニブ)などのような抗新生物抗体と組み合わせて使用できる。例として、理論は別として、抗癌抗体または毒素にコンジュゲートした抗癌抗体での処置は、癌細胞死（例えば、腫瘍細胞死）を引き起こすことができ、これが、免疫刺激剤、例えば、ＣＤ４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＬＡＧ－３剤、例えば、抗体が介在する免疫応答を増強する。例示的態様において、過増殖性疾患(例えば、癌腫瘍)の処置は、同時または逐次的または任意のこれらの組み合わせでの、抗癌剤、例えば、抗体とアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および所望により追加の免疫刺激剤、例えば、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３剤、例えば、抗体との組合せを含んでよく、これは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。
本発明は、対象に、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体を治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３剤、例えば抗体を伴いまたは伴わずに投与することを含む、過増殖性疾患(例えば、癌)の免疫刺激剤での処置に関連する有害事象を変える方法を提供する。例えば、本明細書に記載の方法は、患者への非吸収性ステロイドの投与による、免疫刺激性治療抗体誘発大腸炎または下痢の発生を低減する方法を提供する。本明細書で用いる“非吸収性ステロイド”は、肝臓で代謝後、バイオアベイラビリティが低いステロイド、すなわち、約２０％未満であるような、強い初回通過代謝効果（pass metabolism）を示すグルココルチコイドである。本明細書に記載の一態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、局所作用性グルココルチコステロイドであり、これは、経口投与後、主に肝臓で強く代謝される。エントコートＥＣ(登録商標)(Astra-Zeneca)は、回腸へのおよび結腸中の薬物送達を最適化するために開発された、ブデソニドのｐＨおよび時間依存的経口製剤である。エントコートＥＣ(登録商標)は、回腸および／または上行結腸が関与する軽度～中程度クローン病の処置について米国で承認されている。クローン病の処置のためのエントコートＥＣ(登録商標)の通常の経口投与量は６～９mg／日である。エントコートＥＣ(登録商標)は、吸収される前に腸で放出され、腸粘膜に保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、エントコートＥＣ(登録商標)は肝臓のシトクロムＰ４５０系で強く代謝されて、無視できるほど低いグルココルチコイド活性の代謝物となる。それゆえに、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低バイオアベイラビリティは、初回通過代謝効果があまり強くない他のグルココルチコイドと比較して、治療率を改善させる。ブデソニドは、全身作用性コルチコステロイドより、低視床下部視床下部－下垂体抑制を含む、有害作用が少ない。しかしながら、エントコートＥＣ(登録商標)の慢性投与は、副腎皮質機能亢進および副腎抑制のような全身性グルココルチコイド作用をもたらし得る。PDR 58th ed. 2004; 608-610参照。
なおさらなる態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせた、ＣＴＬＡ－４および／またはＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３遮断を伴うまたは伴わないＣＤ４０アゴニスト(すなわち、ＣＤ４０に対する免疫刺激性治療抗体および所望により抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３抗体)を、サリチレートとさらに組み合わせ得る。サリチレートは、例えば：スルファサラジン(アザルフィジン(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；オルサラジン(DIPENTUM(登録商標)、Pharmacia & UpJohn)；バルサラジド(COLAZAL(登録商標)、Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(アサコール(登録商標)、Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ(登録商標)、Shire US；CANASA(登録商標)、Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標)、Solvay)のような５－ＡＳＡ剤を含む。
本明細書に記載の方法により、抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／またはＬＡＧ－３抗体および非吸収性ステロイドを伴うまたは伴わないアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体と組み合わせて投与されるサリチレートは、免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生を減少させる目的で、サリチレートおよび非吸収性ステロイドのあらゆる重複または逐次投与を含み得る。従って、例えば、本明細書に記載の免疫刺激性抗体により誘発される大腸炎の発生を減少させる方法は、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを同時にまたは逐次的に(例えば、サリチレートを非吸収性ステロイドの６時間後に投与する)またはこれらの何れかの組合せで投与することを包含する。さらに、サリチレートおよび非吸収性ステロイドを、同一の経路(例えば、両者とも経口投与)または異なる経路(例えば、サリチレートを経口投与および非吸収性ステロイドを直腸内投与)で投与してよく、これは、抗ｈｕＣＤ４０および抗ＣＴＬＡ－４および／または抗ＰＤ－１および／または抗ＰＤ－Ｌ１および／または抗ＬＡＧ－３抗体の投与に用いる経路と異なってよい。
本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組合せ抗体療法を、処置すべき適応症(例えば、癌)に対する特定の有用性について選択される他の周知治療と組み合わせても使用できる。本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の組合せを、既知の薬学的に許容される薬剤と逐次的に用いることができる。
例えば、本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組合せ抗体療法を、放射線照射、化学療法(例えば、カンプトテシン(ＣＰＴ－１１)、５－フルオロウラシル(５－ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン－パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５－ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(６Ｘコンボ)を使用)、１以上のプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)、１以上のＢｃｌ－２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ－２’(ｂｃｌ－ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ－１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０)、ＡＴ－１０１(Ｒ－(－)－ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ－２６３(小分子)、ＧＸ－１５－０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ－１(骨髄白血病細胞分化タンパク質－１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質阻害因子)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃ模倣剤、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ－３５１５６(ＧＥＭ－６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、抗血管形成因子ターゲティングＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ(例えば、アバスチン(登録商標))、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808参照)、ｃ－ＦＬＩＰ(細胞ＦＬＩＣＥ－阻害性タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ラパマイシンおよびテムシロリムスのようなｍＴＯＲ阻害剤、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物のようなさらなる処置と組み合わせて(例えば、同時にまたは別個に)用い得る。
本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体および組合せ抗体療法を、さらに１以上の抗増殖性細胞毒性薬剤と組み合わせて使用できる。抗増殖性細胞毒性薬剤として使用し得る化合群は、以下の物を含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサン（商標）)、フォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホｒアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類縁体、プリン類縁体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体との組み合わせに適当な抗増殖性薬剤は、タキサン類、パクリタキセル（パクリタキセルはタキソール（商標）として市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシドＡ、エポチロン類、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]－デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３－シクロプロピル－エポチロンＡ、Ｃ６－Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ－９,１０－デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ－９,１０－デヒドロエポチロンＤ、１６－デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ－９０６)、ＫＯＳ－８６２、ＫＯＳ－１５８４、ＺＫ－ＥＰＯ、ＡＢＪ－７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ－１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ－６５１(塩酸タシドチン)、ハリコンドリンＢ、メシル酸エリブリン(Ｅ－７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ－２８６)、Ｅ－７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ－３５５７０３、マイタンシノイド免疫複合体(ＤＭ－１)、ＭＫＣ－１、ＡＢＴ－７５１、Ｔ１－３８０６７、Ｔ－９００６０７、ＳＢ－７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ－７４３９２１、ＭＫ－０７３１、ＳＴＡ－５３１２、エリュテロビン、１７ベータ－アセトキシ－２－エトキシ－６－オキソ－Ｂ－ホモ－エストラ－１,３,５(１０)－トリエン－３－オール、シクロストレプチン、イソラウリマライド、ラウリマライド、４－エピ－７－デヒドロキシ－１４,１６－ジデメチル－(＋)－ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１と、さらに当技術分野で知られる他の微小管安定化剤であり、これらに限定されない。
本明細書に記載のアゴニスト抗ｈｕＣＤ４０抗体の処置と組み合わせてまたはその前に異常に増殖性の細胞を静止状態にすることが望ましい場合、１７ａ－エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル－テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックス（商標）のようなホルモンおよびステロイド(合成類縁体を含む)も患者に投与し得る。本明細書に記載の方法または組成物を使用するとき、抗模倣藥(antimimetics)のような臨床治験で腫瘍増殖または転移の制御に用いられる他の薬剤も、所望により投与してよい。
化学療法剤の安全かつ有効な投与の方法は当業者に知られている。さらに、それらの投与は、標準的文献に記載されている。例えば、多くの化学療法剤の投与は、Physicians' Desk Reference(PDR)、例えば、１９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)に記載され、その開示内容を引用により本明細書に包含させる。
化学療法剤および／または放射線治療を、当技術分野で周知の治療プロトコールにより適用できる。化学療法剤および／または放射線治療の投与が、処置すべき疾患および該疾患に対する化学療法剤および／または放射線治療の既知効果により変わり得ることは当業者には明らかである。また、熟練した臨床医の知識により、治療プロトコール(例えば、投与用量および投与回数)は、患者における投与治療剤で観察される効果によりおよび投与治療剤に対する疾患の観察される応答により変わり得る。
Ｘ．特異的アゴニスト抗ＣＤ４０抗体
本発明の改良されたヒト化重鎖および軽鎖可変領域配列を有するアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＷＯ２０１７／００４００６に記載の抗ＣＤ４０抗体に由来した。ＷＯ２０１７／００４００６に記載の例示的な抗体の可変ドメインおよびＣＤＲ配列領域は、配列表に提供されており、表２にまとめられている。本発明の改善された抗ＣＤ４０抗体の可変ドメインおよびＣＤＲ領域の番号付けは、同じ元のクローンに由来するすべての抗体について同じであり、すなわち、本明細書に記載のヒト化変異体は、改善改変型ｍＡｂ １２Ｄ６の配列番号４７～５１に提供される軽鎖可変領域配列および配列番号５２～５４に提供される重鎖可変領域配列を除いて、いなかる挿入も削除も含まない。
Figure 0007284759000002
本発明を、さらなる限定として解釈してはならない、次の実施例によりさらに説明する。本明細書において引用している全ての図および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願は、引用により明示的に本明細書に包含させる。
実施例
実施例１
ヒトＣＤ４０に対するヒト化モノクローナル抗体の特性化
本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０抗体、例えば抗体１２Ｄ６－２４を、ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションにより作製した。治療用タンパク質への開発のための実現可能性を評価するために、単量体の収量および割合を決定した。Ｅｘｐｉ２９３発現システム（商標）タンパク質発現系（Thermo Fisher Scientific、Waltham Mass., USA）での５日後の抗体１２Ｄ６－２４（それぞれ、配列番号１１の残基１－１１９および配列番号８の残基１－１１２からなる重鎖および軽鎖可変領域を含む）の力価は、１８ｍｇ／Ｌであり、材料の６７％のみが単量体型であった。他の同様の抗体は、通常５０～１００ｍｇ／Ｌで発現し、９５％を超えて単量体あった。低生産性および凝集傾向は、治療用抗体にとって望ましくない特性であった。
軽鎖の不十分な発現が鎖の不均衡を生じ、重鎖二量体および高分子量種の形成を引き起こすと仮設立てされた。さらなる試験により、重鎖をコードするＤＮＡに対する軽鎖をコードするＤＮＡの比率を増すことで、収量および単量体率の両方が向上することが分かった。表３を参照。
Figure 0007284759000003
これらの結果は、ｍＡｂ １２Ｄ６－２４の合理的な収量および単量体の高比率（低減した凝集）を得るためには、鎖の適当なバランスをとることが重要であるという仮説を確認した。
実施例２
ヒト化抗ｈｕＣＤ４０抗体１２Ｄ６－２４のための改変型重鎖および軽鎖可変領域
低発現レベルおよび凝集傾向を含む、実施例１で同定された臨床用製造特性の低さに鑑み、アゴニスト抗ｈｕＣＤ４０ ｍＡｂ １２Ｄ６－２４の重鎖および軽鎖可変ドメインの両方を再設計し、その結果、新規の軽鎖可変領域配列Ｌ２（配列番号４７）、Ｌ３（配列番号４８）、Ｌ４（配列番号４９）およびＬ５（配列番号５０）ならびに新規の重鎖可変領域配列Ｈ２（配列番号５２）およびＨ３（配列番号５３）を得た。
ヒトＩｇＧ軽鎖のための発現ベクターを作製するために、軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ分泌リーダー配列の制御下で発現ベクター中、ヒトカッパ一定常領域をコードするＤＮＡに遺伝的に融合させた。同様に、ヒトＩｇＧ重鎖のための発現ベクターを作製するために、重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターおよびヒトＩｇＧ分泌リーダー配列の制御下で、発現ベクター中、ヒトＣＨ１、ヒンジおよびヒトＩｇＧ１ＦｃをコードするＤＮＡに遺伝的に融合させた。
ユニークな抗体を調製するために、ユニークな軽鎖の各々のための発現ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞にユニークな重鎖の各々と同時トランスフェクトした。インキュベーション５日後に、培地中の各抗体の濃度を測定し、該ユニークな抗体を、ＭＡＢ選択クロマトグラフィーにより精製した。精製後、抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーにより凝集性を、そしてＥＬＩＳＡにより結合親和性をそれぞれ評価した。表４を参照。
Figure 0007284759000004
追加の重（Ｈ４）鎖および軽（Ｌ６）鎖可可変領域を、それぞれ配列番号５４および５１に示されるように、フレームワーク配列の一部を生殖細胞に戻すことにより設計した。発現ベクターを調製し、発現、凝集能および抗原結合性を評価した。表５を参照。
Figure 0007284759000005
Ｌ２またはＬ３をＨ１、Ｈ２、またはＨ３と組み合わせることにより、発現および精製収率が増加したが、結果として得られる抗体は、ヒトＣＤ４０への検出可能な結合を失った。Ｌ５をＨ１、Ｈ２またはＨ３と組み合わせることで、結果として得られる抗体の発現および結合の両方が減少した。Ｈ１、Ｈ２またはＨ４をＬ６と組み合わせることにより、発現が顕著に低下し、精製収率も低かったため、これらの抗体を用いたそれ以上の分析は行われなかった。対照的に、Ｈ４をＬ１またはＬ４のいずれかと組み合わせると、プロテインＡ精製後の発現が高くなり、モノマーの割合が高くなった。
全てのデータを考慮して、Ｌ４は、Ｈ１、Ｈ２またはＨ４と組み合わせたとき、抗体の生産性が向上した。加えて、重鎖の寄与度を比較したとき、重鎖４はロバストな発現をもたらし、親抗体よりも顕著に高く、凝集傾向を有意に低下させることが見いだされた。
さらに本発明の改変型重鎖および軽鎖可変領域配列を含む抗体のうち最も有望なものについて、さらに試験を行った。表６を参照。Ｌ４Ｈ１は、それぞれ、配列番号４９の軽鎖および重鎖可変領域ならびに配列番号１１の残基１～１１９を含む。Ｌ４Ｈ２は、それぞれ配列番号４９および配列番号５２の軽鎖および重鎖可変領域を含む。Ｌ４Ｈ４は、それぞれ配列番号４９および配列番号５４の軽鎖および重鎖可変領域を含む。抗体（未修飾ｍＡｂ １２Ｄ６－２４を含む）は、その他の点では同一であった。
Figure 0007284759000006
抗体１２Ｄ６の改良された形態、特にＬ４Ｈ１およびＬ４Ｈ４は、改善された収率を示し、顕著に改善された単量体率（凝集の減少）を示したことが明らかであった。
改良された抗体がＣＤ４０に対する親和性を保持していることをＥＬＩＳＡで確認した。表６を参照。これらの改良された抗ＣＤ４０抗体はすべて、元のｍＡｂ １２Ｄ６－２４と同様の結合性を保持した（Ｋｄ＝０．２４μＭ）。
実施例３
改良された重鎖および軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４０抗体の生物学的活性
本発明の改良された抗ＣＤ４０（ｍＡｂ １２Ｄ６）抗体の生物学的活性を評価するために、さらに試験した。最初の試験では、ヒト単球（ＣＤ１４＋）を、プラスチック付着またはヒトＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて健常ドナーから単離した。単球を、１００ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ（Miltenyi Biotec）および１００ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－４（Miltenyi Biotec）で培養した。２日目および５日目に、培地の半分を除去して補充した。６－７日目に、未成熟樹状細胞を回収した。ＤＣを、３７℃にて一晩、示された抗体濃度でインキュベートした。細胞培養上清を集め、ヒトＴＮＦ－α産生についてアッセイした。図１を参照。
増殖培地単独（ＡＩＭＶ）および対照ヒトＩｇＧ１抗体は、ＴＮＦ－α産生を誘発しない。修飾されていないｍＡｂ １２Ｄ６－２４および改変型Ｌ４Ｈ４は中央の曲線で表されているが、一方、改変型Ｌ４Ｈ１（２つのドナー－６Ｐ１および６Ｐ２由来のＤＣを用いて実施された）は上側の曲線で表されている。本発明の改良型重鎖および／または軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４０抗体が、未修飾ｍＡｂ １２Ｄ６－２４と同様に、このアッセイにおいて生物学的活性を保持することは明らかである。
細胞表面マーカーＣＤ８３およびＣＤ８６の誘導によって測定されるように、本発明の改良型アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の樹状細胞を活性化する能力を測定するために第二の試験を行った。活性化を、（前段に記載のように単離された）未成熟樹状細胞を９６ウェルプレートに播種し、示された抗体を添加し、３７℃にて一晩インキュベートして、インビトロにて測定した。その後、細胞を回収し、蛍光抗ＣＤ８３抗体および蛍光抗ＣＤ８６抗体で染色し、これらはそれぞれ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって検出された。結果は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表される。ＦＡＣＳに用いた蛍光抗ＣＤ８３抗体は、励起波長６４７ｎｍのAlexa Fluor（登録商標） 647抗ヒトＣＤ８３抗体であり、蛍光抗ＣＤ８６抗体は、励起波長４８８ｎｍのAlexa Fluor（登録商標） 488抗ヒトＣＤ８６抗体であった（両方とも、BioLegend、San Diego Calif.、USAからのもの）。図２Ａは、６４７ｎＭでの励起で得られたデータを提供し、したがって主にＣＤ８３の染色（薄い灰色の棒グラフ）を示し、図２Ｂは、６４７ｎＭでの励起で得られたデータを提供し、したがって主にＣＤ８６の染色（暗い灰色の棒グラフ）を示す。対照試験（黒い棒グラフ）は、染色抗体を用いずに行った。
データは、本発明のアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ １２Ｄ６の改良形態（Ｌ４Ｈ１およびＬ４Ｈ４）が、未成熟樹状細胞の表面上のＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を、少なくとも未修飾ｍＡｂ １２Ｄ６－２４と同程度に強力に誘導することを示している。抗体Ｌ４Ｈ１およびＬ４Ｈ４は、ＣＤ４０結合親和性および生物学的活性を保持しながら、収量および純度の向上を示すため、臨床開発の優れた候補となっている。
Figure 0007284759000007
Figure 0007284759000008
配列表は、成熟重鎖および軽鎖の配列を提供する（すなわち、配列はシグナルペプチドを含まない）。例えば、ヒト細胞において、本発明の抗体の産生のためのシグナル配列は、配列番号４６に提供される。本明細書で用いる“配列番号５４の残基１－１１９”は、配列番号５４が１１９残基からなるため、“配列番号５４”と同義である。残基の番号付けは、同じ用語および特許請求の範囲の要素の可変領域配列および全長重鎖配列または軽鎖配列への参照を容易にするためだけに、配列番号５４に包含されることがある。
均等物：
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、または常套の実験を用いて確認することができる。そのような均等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (15)

  1. ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合部分であって、
    ａ）（ｉ）配列番号１１の残基１－１１９；
    （ｉｉ）配列番号５２；および
    （ｉｉｉ）配列番号５４、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに
    ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、単離抗体またはその抗原結合部分。
  2. ａ）配列番号１１の残基１－１１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
  3. ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
  4. ａ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
    ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
    を含む、請求項１記載の単離抗体またはその抗原結合部分。
  5. 請求項１から４のいずれか一項記載の単離抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸。
  6. 請求項５記載の核酸を含む発現ベクター。
  7. （ｉ）請求項６記載の発現ベクター；または（ｉｉ）請求項１から４のいずれか一項記載の単離抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域をコードする核酸を含む発現ベクターおよび請求項１から４のいずれか一項記載の単離抗体またはその抗原結合部分の軽鎖可変領域をコードする核酸を含む別の発現ベクター、を用いて形質転換された細胞。
  8. ａ）請求項７記載の細胞中で、抗体またはその抗原結合部分を発現させること；および
    ｂ）該細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離すること
    を含む、抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を製造する方法。
  9. ａ）請求項１から４のいずれか一項記載の単離抗体またはその抗原結合部分；および
    ｂ）担体
    を含む、医薬組成物。
  10. それを必要とする対象において免疫応答を刺激するための、請求項９記載の医薬組成物。
  11. 対象が腫瘍を有し、および医薬組成物が、該対象に投与された際に、該腫瘍に対する免疫応答を刺激することができる、請求項１０記載の医薬組成物。
  12. 対象が慢性のウイルス感染症を有し、および医薬組成物が、該対象に投与された際に、該慢性のウイルス感染症に対する免疫応答を刺激することができる、請求項１０記載の医薬組成物。
  13. それを必要とする対象において癌を処置するための、請求項９記載の医薬組成物。
  14. 癌が、膀胱癌、乳癌、子宮／子宮頚癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、食道癌、消化器癌、膵臓癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、頭頚部癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝臓癌、甲状腺癌、皮膚癌、中枢神経系の腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、肉腫およびウイルス関連の癌からなる群より選択される、請求項１３記載の医薬組成物。
  15. それを必要とする対象において慢性のウイルス感染症を処置するための、請求項９記載の医薬組成物。
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EA041323B1 (ru) Антитела к cd40 с усиленной агонистической активностью

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