JP7131008B2 - アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法に関する。
生体成分を酵素的に測定する方法はこれまで種々開発されてきている。この中で、コレステロールオキシダーゼなどのオキシダーゼを用いる方法は、オキシダーゼの作用により生成した過酸化物をペルオキシダーゼの存在下、水素供与体の発色系に導き比色定量に供する。本測定系は生体成分中のアスコルビン酸の影響を受けやすいことから、過酸化水素測定前または測定時に生体成分中に存在するアスコルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼ（以下ＡＳＯと略す）を作用させ、デヒドロアスコルビン酸に変換せしめ影響を回避することが一般に行われている。しかし、溶液中のＡＳＯは非常に不安定であり、試薬保存中に失活し試薬の保存安定性を左右する要因となっている。
これに対し、安定化剤としてカタラーゼ、ゼラチン、グロブリン、ペルオキシダーゼ、メトヘモグロビンまたはヘマチン等を用いることで効果があることが示されている。また、金属と陰性の酸基とからなる化合物およびカタラーゼ及び／またはペルオキシダーゼの添加でＡＳＯの保存安定性が向上することが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。また、アスコルビン酸オキシダーゼを含む溶液に糖アルコールを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、亜硝酸若しくはその塩又は亜硝酸エステルを水性媒体中で共存させる方法（例えば、特許文献３参照）、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オンおよびこれらの塩より選ばれる物質を用いる方法（例えば、特許文献４参照）、ビリルビン酸（塩）を配合させる方法（例えば、特許文献５参照）が開示されている。しかしながら、これらの方法では液状試薬として耐えうる安定性には尚問題が残る。
本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうるようＡＳＯを安定化する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＳＯをある種の添加剤と共存させることにより、ＡＳＯを液状状態で安定に保つことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［項１］ アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
［項２］ 前記添加剤が、レオドールＴＷ－Ｌ１２０、レベノールＷＸ、コール酸、及びデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤である、項１に記載の方法。
［項３］ アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤。
［項４］ 前記添加剤が、レオドールＴＷ－Ｌ１２０、レベノールＷＸ、コール酸、及びデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤である、項３に記載の組成物。
［項５］ 項３または項４に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。
［項２］ 前記添加剤が、レオドールＴＷ－Ｌ１２０、レベノールＷＸ、コール酸、及びデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤である、項１に記載の方法。
［項３］ アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物。
（１）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤。
［項４］ 前記添加剤が、レオドールＴＷ－Ｌ１２０、レベノールＷＸ、コール酸、及びデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤である、項３に記載の組成物。
［項５］ 項３または項４に記載の組成物を含む、生体成分分析用キット。
本発明により、安定なＡＳＯ含有液状製剤を提供でき、長期間または過酷な条件下での保管後の液状製剤においてもアスコルビン酸の影響を受けることなく、正確な測定値を得ることができる。
（添加剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化）
本発明の実施態様の一つは、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。ここで、本発明に用いる前記添加剤は、後述の実施例に示すように顕著なアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果を示す。従って、これらの添加剤はアスコルビン酸オキシダーゼ安定化剤ということもできる。
本発明の実施態様の一つは、アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法である。ここで、本発明に用いる前記添加剤は、後述の実施例に示すように顕著なアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果を示す。従って、これらの添加剤はアスコルビン酸オキシダーゼ安定化剤ということもできる。
前記添加剤の種類は特に限定されない。
例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとして、レオドールＴＷ－Ｌ１２０（「レオドール」は登録商標。以下同様）、ノニオンＬＴ－２２１（「ノニオン」は登録商標。以下同様）、ノニオンＬＴ－２８０、ノニオンＬＴ－２８０Ｗ、ウィルサーブＴＦ－２０（「ウィルサーブ」は登録商標。以下同様）を挙げることができる。中でも、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしてレオドールＴＷ－Ｌ１２０を用いることが好ましい。
例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムとして、レベノールＷＸ（「レベノール」は登録商標。以下同様）、エマール２０ＣＭ（「エマール」は登録商標。以下同様）、エマールＤ－３－Ｄ、エマールＤ－４－Ｄ、ラテムルＥ－１１８Ｂ（「ラテムル」は登録商標。以下同様）、ラテムルＷＸを挙げることができる。中でも、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムとしてレベノールＷＸを用いることが好ましい。
コール酸、デキストラン硫酸ナトリウムもまた市販品が知られており、本発明にはこれらの市販品を用いることができる。
例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとして、レオドールＴＷ－Ｌ１２０（「レオドール」は登録商標。以下同様）、ノニオンＬＴ－２２１（「ノニオン」は登録商標。以下同様）、ノニオンＬＴ－２８０、ノニオンＬＴ－２８０Ｗ、ウィルサーブＴＦ－２０（「ウィルサーブ」は登録商標。以下同様）を挙げることができる。中でも、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしてレオドールＴＷ－Ｌ１２０を用いることが好ましい。
例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムとして、レベノールＷＸ（「レベノール」は登録商標。以下同様）、エマール２０ＣＭ（「エマール」は登録商標。以下同様）、エマールＤ－３－Ｄ、エマールＤ－４－Ｄ、ラテムルＥ－１１８Ｂ（「ラテムル」は登録商標。以下同様）、ラテムルＷＸを挙げることができる。中でも、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムとしてレベノールＷＸを用いることが好ましい。
コール酸、デキストラン硫酸ナトリウムもまた市販品が知られており、本発明にはこれらの市販品を用いることができる。
ＡＳＯを含む溶液中の添加剤の濃度としては特に限定されるものではないが、範囲の上限は、好ましくは２０ｇ／Ｌさらに好ましくは１０ｇ／Ｌ、範囲の下限は０．１ｇ／Ｌさらに好ましくは０．５ｇ／Ｌで、使用されるのが望ましい。
本発明で用いられるＡＳＯとは、ＥＣ１．１０．３．３に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えばキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどを含有する。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６－２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えば微生物などから採取されるものなどを含有する。前記微生物としては特に限定されないが、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、特に限定されないが、酵素の起源によっても異なり、通常０．１～５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えばキュウリ、カボチャ等の植物などから採取されるものなどを含有する。
また、本発明に用いられるＡＳＯには特開平６－２０９７７０に記載の以下の反応を触媒する酵素も含む。
Ｌ－アスコルビン酸＋１／２Ｏ２→デヒドロアスコルビン酸＋Ｈ２Ｏ２
上記酵素の由来は特に限定されないが、例えば微生物などから採取されるものなどを含有する。前記微生物としては特に限定されないが、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属またはユペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。
ＡＳＯを含む溶液中のＡＳＯの濃度は、特に限定されないが、酵素の起源によっても異なり、通常０．１～５０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられる。
本発明のＡＳＯの安定化方法においては、さらに防腐剤などを共存させてもよい。防腐剤は特に限定されないが、例えば、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
また、本発明のＡＳＯの安定化方法は、種々の生化学診断方法に適用できる。該生化学診断方法としては、例えば尿酸、遊離脂肪酸、グルコース、中性脂肪、コレステロール、リン脂質等を測定する方法が挙げられる。
具体的には、本発明のＡＳＯの安定化方法には、前記診断方法に必要な他の構成成分を共存させてもよい。例えば中性脂肪測定試薬を構成する成分には、一般にＡＳＯのほか、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体などが挙げられ、これらのすべてを共存させてもよいし、これらの中から適宜必要なものを選んで共存させてもよい。
具体的には、本発明のＡＳＯの安定化方法には、前記診断方法に必要な他の構成成分を共存させてもよい。例えば中性脂肪測定試薬を構成する成分には、一般にＡＳＯのほか、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体などが挙げられ、これらのすべてを共存させてもよいし、これらの中から適宜必要なものを選んで共存させてもよい。
（アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物）
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（１）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤。
本発明の別の実施態様は、アスコルビン酸オキシダーゼ、および、以下の（１）を含む、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化された組成物である。
（１）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、コール酸、およびデキストラン硫酸ナトリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤。
前記添加剤の詳細については、前記の添加剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化の項で説明したとおりである。
本発明は、前記に記載の組成物を含む、生体成分分析用キットであってもよい。
種々の生体成分測定方法が既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＳＯ安定化方法やＡＳＯ含有組成物を生体成分分析用キットに適用して、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。その組成は特に限定されない。
本発明の組成物またはキットは、汎用自動分析機への適用などを考慮して２つ以上に分包される態様をとる場合もあるが、その場合ＡＳＯは少なくともいずれかに含まれていればよく、その場合、ＡＳＯを含むほうの組成物に添加剤を共存させればよい。また、本発明の組成物（キットに含まれる形態を含む）は、水溶液であっても凍結乾燥したものであってもよい。本発明によれば、ＡＳＯが経時的に失活し易い液状製剤においても長期的な保存安定性を示すことができる。かかる観点を考慮すれば、本発明は液状製剤（例えば、水溶液等の液状の組成物）において、より有効に用いられ得る。
種々の生体成分測定方法が既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＡＳＯ安定化方法やＡＳＯ含有組成物を生体成分分析用キットに適用して、各種試料中の生体成分の量又は濃度を測定することができる。その組成は特に限定されない。
本発明の組成物またはキットは、汎用自動分析機への適用などを考慮して２つ以上に分包される態様をとる場合もあるが、その場合ＡＳＯは少なくともいずれかに含まれていればよく、その場合、ＡＳＯを含むほうの組成物に添加剤を共存させればよい。また、本発明の組成物（キットに含まれる形態を含む）は、水溶液であっても凍結乾燥したものであってもよい。本発明によれば、ＡＳＯが経時的に失活し易い液状製剤においても長期的な保存安定性を示すことができる。かかる観点を考慮すれば、本発明は液状製剤（例えば、水溶液等の液状の組成物）において、より有効に用いられ得る。
（アスコルビン酸オキシダーゼの活性測定法）
ＡＳＯの活性測定は、以下の測定条件で行う。
＜反応液＞
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．６
０．５ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸
＜測定条件＞
（１）上記反応液を１ｍＭキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液を同様に急高度を測定する。
ＡＳＯの活性測定は、以下の測定条件で行う。
＜反応液＞
１００ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ５．６
０．５ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸
＜測定条件＞
（１）上記反応液を１ｍＭキュベットにとり、３０℃で約５分間予備加温する。
（２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し反応を開始する。正確に５分間反応させた後に、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて反応を停止させる。この液を分光光度計で２４５ｎｍの吸光度を測定する。
（３）盲検は反応液を３０℃で５分放置後、０．２Ｎ塩酸溶液３．０ｍＬを加えて混和し、次いで酵素溶液０．１ｍＬを加えて調製する。この液を同様に急高度を測定する。
本発明において「アスコルビン酸オキシダーゼが安定である」とは、アスコルビン酸オキシダーゼの経時的な失活が抑制され、長期的な保存安定性が改善されていることをいう。具体的には、添加剤を含まない蒸留水（但し、塩化マグネシウムを１ｇ／Ｌを含んでいてもよい）で保存した場合に比べて、３５℃で７日間保存後のＡＳＯの残存酵素活性が高められていることをいう。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
実施例１：添加剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水に溶解し、この水溶液に各種添加剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、またはコール酸）を１ｇ／Ｌ加え、添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬを塩化マグネシウム（１ｇ／Ｌ）を含む蒸留水に溶解し、この水溶液に各種添加剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、またはコール酸）を１ｇ／Ｌ加え、添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
結果を表１に示す。
ＡＳＯ水溶液にポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、またはコール酸を加えることで、添加剤を加えない場合に対し良好な安定性が得られた。
ＡＳＯ水溶液にポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、またはコール酸を加えることで、添加剤を加えない場合に対し良好な安定性が得られた。
実施例２：添加剤によるアスコルビン酸オキシダーゼの安定化
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬを蒸留水に溶解し、この水溶液にデキストラン硫酸ナトリウムを１ｇ／Ｌ加え、添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
ＡＳＯ（東洋紡製ＡＳＯ－３１１）３Ｕ／ｍＬを蒸留水に溶解し、この水溶液にデキストラン硫酸ナトリウムを１ｇ／Ｌ加え、添加剤を加えない場合を対照として、３７℃で７日間保存し、残存活性（溶解直後の活性値＝[スタート活性]に対する保存後の活性値の割合）を検討した。
結果を表２に示す。
ＡＳＯ水溶液にデキストラン硫酸ナトリウムを加えることで、添加剤を加えない場合に対し良好な安定性が得られた。
ＡＳＯ水溶液にデキストラン硫酸ナトリウムを加えることで、添加剤を加えない場合に対し良好な安定性が得られた。
本発明により、ＡＳＯを含有する、より長期間安定な液状試薬を供することができる。
Claims (4)
- アスコルビン酸オキシダーゼを、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、及びコール酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤と共存させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- ３５℃で７日間保存しても安定である、請求項１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- 液状組成物におけるアスコルビン酸オキシダーゼの濃度が０．１～５０Ｕ／ｍＬとなるように共存させる、請求項１又は２に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
- 液状組成物におけるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、及びコール酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の添加剤の濃度が０．５～２０ｇ／Ｌとなるように共存させる、請求項１～３のいずれかに記載のアスコルビン酸オキシダーゼの液状組成物における安定化方法。
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- 2018-03-23 JP JP2018056333A patent/JP7131008B2/ja active Active
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