JP7114460B2 - モノクローナル抗IL-1RAcP抗体 - Google Patents
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Description
ヒトIL-1RAcP(Q9NPH3(IL1AP_HUMAN、UniProtKB/Swiss-Prot))は、IL-1ファミリーの受容体を通じたシグナルの伝達に必要とされるアクセサリータンパク質である。インターロイキン-1受容体複合体は、IL-1R1とIL-1RAcPとのヘテロ二量体である。IL-1が結合すると、IL-1R1はIL-1RAcPと会合して、機能的なシグナル伝達受容体複合体を形成し、それがNFκB活性を刺激する。
本発明は、ヒトIL-1RAcPに対するモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、本発明による抗体は、マウスIL-1RAcPにさらに結合する。
i)前記ウサギをIL-1RAcPで免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップ、
ii)IL-1RAcPへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップ、
iii)その上清がヒトおよびマウスIL-1RAcPへの結合を示し、かつIL-1α、IL-1β、IL-33および/またはIL-36によって刺激されるNFκB活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップ、
iv)ステップiii)の特性を有する抗体を、前記選択された細胞から単離するステップ
を特徴とする製造方法を提供する。
i)前記ウサギを前記ターゲット抗原で免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップと、
ii)IL-1RAcPへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップと、
iii)その上清がヒトおよびマウスIL-1RAcPへの結合を示し、かつ本発明によるIL-1α、IL-1β、IL-33および/またはIL-36によって刺激されるNFκB活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップと、
iv)抗体がステップiii)による特性を示す場合に、前記選択された細胞から抗体を単離するステップと
を特徴とする製造方法を提供する。
本発明による用語「ウサギ」は、分類学上のウサギ目に属する動物、科(ノウサギおよびアナウサギ)ならびにナキウサギ科(ナキウサギ)、好ましくはアナウサギ属の動物を意味する。
免疫化は、従来技術から公知の方法に従って、例えばターゲット抗原またはその断片、完全なタンパク質抗原またはその断片、抗原発現細胞のDNAを使用することによって実施することができる。好ましくは、IL-1RAcP抗原は、前記抗原およびヒトFcポリペプチドからなる融合ポリペプチドである。好ましくは、ステップi)における免疫化は、少なくとも3回、適宜6回まで90日間の間に繰り返される(本発明による抗体が、例えば4回目の免疫後に既に特定されている場合に、さらなる免疫化は必要ない)。好ましくは、完全フロイントアジュバント(CFA)またはCFAおよび不完全フロイントアジュバント(IFA)がアジュバントとして使用される。
B細胞は、ウサギから、好ましくはウサギの血液から単離される。B細胞は、3回目ないし6回目の免疫化の後、8日目までに、好ましくは5日目~7日目に単離される。好ましくは、PBMCを単離し、マクロファージが除去され(例えば欧州特許第0488470号明細書(EP0488470)を参照)、そしてB細胞として使用される。B細胞の単離は、例えばまた、非B細胞を非B細胞マーカー、例えば抗CD2抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD36抗体、抗CD43抗体および抗CD235a抗体で標識し、そして標識された非B細胞を標識されていないB細胞から分離することによって実施することもできる。
抗体を産生しかつ抗原特異的なB細胞は、好ましくは、B細胞を、免疫化に使用されるIL-1RAcP抗原またはそれぞれの抗原を発現する細胞で処理することによって単離(濃縮)される。好ましくは、該抗原および該抗原を発現する細胞は、固定化された方式で使用されるため、その抗原特異的B細胞は、簡単に分離することができる。そのような方法は、例えばKodituwakko AP et al.,Immunol.Cell Biol.(2003)81,163-170および欧州特許第0488470号明細書(EP0488470)に記載されている。
ウサギ単一B細胞の単離は、好ましくはFACSによって行われる。好ましくは、FACS選択のために、抗ウサギIgGが使用される。そのような選択された単一B細胞は、抗体産生B細胞である。
好ましくは、抗原産生B細胞は、選択ステップ(以下参照)が実施される前にフィーダー細胞と同時培養される。そのようなフィーダー細胞は、好ましくは、胸腺腫細胞株、例えばマウスEL4胸腺腫細胞株であって、好ましくは変異誘導されている細胞株であり、好ましくは、胸腺腫細胞株は、ブロモデオキシウリジン耐性変異体へと変異誘導されている(例えば、EL4-B5細胞、Wen L.et al.,Eur.J.Immunol.17(1987)887-92)。これは、細胞上清中の抗体量を増加させ(例えばZubler,R.H.,et al.,Eur.J.Immunol.14(1984)357-63、Wen L.et al.,Eur.J.Immunol.17(1987)887-92、Hoffmann P et al.,J Immunol.Methods 1996;196(1):85-91、Roy A.et al.,J Hematother.Stem Cell Res.2001;10(6):873-80、Dlu A.et al.,Proc.Nati.Acad.Sci.USA Vol.84,pp.9140-9144,1987、および欧州特許第0488470号明細書(EP0488470)を参照)、そして分泌されたウサギ抗体の分析および選択を容易にする。
本発明による抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするmRNAを含む単一B細胞の選択は、好ましくはフィーダー細胞と同時培養した後に、免疫化のために使用されたIL-1RAcP抗原に特異的に結合する分泌されたウサギ抗体について細胞上清を分析することによって実施することができる。分析は、好ましくはELISAによって行われる。次いで、免疫グロブリン配列を、選択された単一ヒトB細胞から、例えばde Wildt RM,Hoet RM.Methods Mol.Biol.2002;178:121-31に従って回収し、そして例えばRT PCRによって分析することができる。
i)前記ウサギをIL-1RAcPで免疫化した後に、前記ウサギから得られた多くの抗体産生単一細胞を単離するステップ、
ii)IL-1RAcPへの結合を、前記単一細胞の上清について個別に測定するステップ、
iii)その上清がヒトおよびマウスIL-1RAcPへの結合を示し、かつIL-1α、IL-1β、IL-33および/またはIL-36によって刺激されるNFκB活性を阻害する場合に、単一細胞を選択するステップ、
iv)ステップiii)の特性を有する抗体を、前記選択された細胞から単離するステップ
を特徴とする製造方法に関する。
ウサギを、hu-IL-1RAcP-Fcで繰り返し免疫化した。これらの動物の血液を回収し、そのBリンパ球を単離した。単一B細胞をマイクロタイタープレートのウェル中にソーティングし、増殖させた。これらのB細胞によって前処理された上清を、hu-IL-1RAcP ELISAにおいて分析した。409種のモノクローナル抗体(=全ての試験された上清の4.7%)が、hu-IL-1RAcPに結合すると特定された。23種のモノクローナル抗体は、マウスIL-1RAcPにも結合し、IL1βに誘導されるヒトまたはマウスのNF-κB活性を阻害することが判明した。
組換え型のヒトFcキメラタンパク質に融合されたヒトIL-1RAcP(IL-1RAcP-Fc)を免疫原として使用した。2つの異なる免疫化スキーム、つまりスキーム1およびスキーム2を調査した。スキーム1による免疫化のために、3匹のニュージーランドホワイト(NZW)種のウサギを、1mlの免疫原をそれぞれの動物に0日目、7日目、14日目、28日目、42日目および56日目に注射することによって免疫化した。タンパク質をPBS中で希釈し、等モル量でプールし、そして使用前に完全フロイントアジュバント(CFA)と1:1(容量/容量)で混合した。400μgの免疫原の最終濃度を動物当たりに1回目の免疫化のために使用し、2回目、3回目、4回目、5回目および6回目の免疫化のためには、200μgの免疫原を動物当たりに使用した。血液試料を、EDTAで覆われたチューブに、3回目、4回目、5回目および6回目の免疫化の後に、免疫化の5日後、6日後および7日後に回収した。本発明による抗IL-1RAcP抗体を、3回目の免疫化の後に採取された血液試料から単離した。本発明による抗体を、3回目、4回目、5回目および6回目の免疫化の後に採取された血液試料から単離した。
スキーム2による免疫化のために、6匹のNZW種のウサギのそれぞれを、1mlの免疫原で皮下的に0日目、7日目、14日目、28日目、42日目、56日目、70日目および84日目に免疫化した。1回目の注射のために、タンパク質をPBS中で希釈し、等モル量でプールし、そして使用前にCFAと1:1(容量/容量)で混合した。200μgの最終濃度の免疫原を、動物あたりに1回目の免疫化のために使用した。2回目、3回目、4回目、5回目および6回目の免疫化のために、タンパク質をPBS中で希釈し、等モル量でプールし、そして使用前に不完全フロイントアジュバント(IFA)と1:1(容量/容量)で混合した。100μgの免疫原を動物当たりに使用した。血液試料を、EDTAで覆われたチューブに、2週間の間隔の3回目、4回目、5回目および6回目の免疫化の後に、免疫化の5日後、6日後および7日後に回収した。
免疫原被覆/細胞調製
免疫化のために使用される融合タンパク質を、細胞培養6ウェルプレートの表面上にPBS中8μg/10cm2の濃度で被覆し、インキュベートした。あるいはプレートのそのセル表面上に、細胞株BT-474(DSMZ ACC 64)を播種した。使用する1日前に、細胞をDMEM+5%FCS中で、24時間後に約90%のコンフルエンスとなる密度で播種した。
PBMCを、免疫化されたウサギの全血から単離した。その血液を、PBSで1:1希釈し、Lympholyte(登録商標)上に製造元の指示(Cedarlane、CL5120)に従って成層した。末梢血単核細胞(PBMC)を、密度勾配遠心分離(800×g、20分、室温)によって赤血球から分離した。細胞を界面から取り出し、PBS(800×g、10分)で2回洗浄し、PRMI 1640ベースの細胞培養培地中に懸濁した。
PBMCを、プラスチック上で細胞培養培地中でインキュベートした。結合されなかったリンパ球を、インキュベート時間後に回収した。
抗原特異的リンパ球を、免疫原で被覆されたプレート上で、またはBT-474細胞上で直接的に濃縮した。リンパ球をPBSで2回洗浄することで、非特異的な細胞を除去し、引き続き10cm2の培養表面積当たりに750μlのトリプシンと一緒に7分間~10分間にわたりインキュベートした。引き離された細胞を、さらなるステップのために細胞培養培地中に回収した。
PBMC/リンパ球を、FITC(フルオレセインイソチオシアネート異性体1)と結合されたヤギ抗ウサギIgG抗体(Abd Serotec、STAR121F)で染色した。フローサイトメトリー分析および単一細胞ソーティングを、FACSサイトメーターを用いて実施した。単一の陽性のリンパ球を、3.0×106個の照射されたEL-4 B5フィーダー細胞を覆っている200μlの細胞培養培地に直接ソーティングした。前記の細胞培養培地に、ウサギ由来の活性化されたT細胞マクロファージ上清を5%補填した(MicroCoat)。同時培養培地に、2×10-6g/mlのSAC(スタフィロコッカス・アウレウス・コワン)溶液を供給した。B細胞とフィーダー細胞の7日間の同時培養後に、上清を抗体検出に移し、100μlのRNA単離バッファー(Qiagen、RLT)中で細胞を採取した。
分泌されたウサギ抗体の検出は、上清をビオチニル化された捕捉抗体(ヤギにおいて産生された抗ウサギIgG抗体)を介して、ストレプトアビジンマイクロタイタープレート上に覆われた1μg/mlのPBS+0.5%BSA+0.05%Tween(登録商標)20の最終濃度で、そして1:7500の最終濃度のセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合された抗ウサギIgG検出抗体を介して分析することによって行った。洗浄ステップは、PBS+0.1%Tween(登録商標)20を使用することによって実施した。3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)を基質として使用し、HClを酵素反応の停止のために使用した。
マイクロタイタープレートを、IL-1RAcPおよび/またはIL12Rβ1タンパク質(ヒトIL-1RAcPまたはIL12Rβ1の組換えFcキメラ結合体)で被覆した。ブロッキング過程後に、B細胞上清からの特異的抗体は、ターゲットに結合し、次いでPOD標識された抗ウサギIgG抗体によって検出される。IL12Rβ1結合は、カウンタースクリーニングとして使用した。IL-1RAcPタンパク質に、IL12Rβ1タンパク質と同様に、リンカーのhuFcおよびHisをタグ付けした。そのタグに結合する抗体は、両方のアッセイにおいて陽性であるが、抗原特異的抗体は、IL-1RAcPにのみ結合して、IL12Rβ1に結合しなかった。
ELISAバッファー:PBS、0.5%BSA、0.05%Tween(登録商標)20
洗浄バッファー:PBS、0.1%Tween(登録商標)20
ブロッキングバッファー:PBS、2%BSA、0.05%Tween(登録商標)20。
アッセイの原理:
NUNC Maxisorp(登録商標)384ウェルマイクロタイタープレートを、P013_03で被覆する。ブロッキング過程後に、B細胞上清からの特異的抗体は、抗原のヒト(P013-03)またはマウスIL-1RAcP(P013-04)に結合し、次いでPOD標識された抗体によって検出される。試料は、1:2希釈で試験される。
プレート: 384ウェルのNUNC Maxisorp(登録商標)プレート;カタログ番号464718
タンパク質:
P013-03(濃度1.5mg/ml;アッセイ濃度0.5μg/ml)ヒト
P013-04(濃度1.3mg/ml;アッセイ濃度0.5μg/ml)マウス
標準抗体: P013-02(濃度1mg/ml;開始アッセイ濃度2μg/ml)
検出抗体: 抗ウサギIgG、ペルオキシダーゼに結合された種特異的全抗体(ロバ由来)(ECL);GE;カタログ番号NA9340;アッセイ希釈:1:5000
PBS: Buffers in a Box、プレミックスされたPBSバッファー、10×;Roche Applied Sciences;カタログ番号11666789001
BSA: ウシ血清からのウシ血清アルブミンフラクションV;Roche Applied Sciences;カタログ番号10735086001
Tween(登録商標)20: Tween(登録商標)20;Carl Roth;カタログ番号9127.2
TMB: TMB溶液;Life Technologies;カタログ番号SB02
HCl: 1MのTitripur(登録商標)塩酸;Merck;カタログ番号1090571000
ELISAバッファー:PBS、0.5%BSA、0.05%Tween(登録商標)
洗浄バッファー:PBS、0.1%Tween(登録商標)
ブロッキングバッファー:PBS、2%BSA、0.05%Tween(登録商標)
試料:ELISAバッファー中1:2希釈。
1. 12.5μLのPBS中P013-03(0.5μg/ml)を384ウェルのNUNC Maxisorp(登録商標)プレートに添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
2. 90μlの洗浄バッファーで3回洗浄する。
3. 90μLのブロッキングバッファーを各ウェルに添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
4. 洗浄バッファーで3回洗浄する。
5. 12.5μLの標準抗体(ELISAバッファー中1:2希釈)または試料(ELISAバッファー中1:2希釈)を添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
6. 洗浄バッファーで3回洗浄する。
7. 1:5000のPOD抗体(ELISAバッファー中)12.5μLを添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
8. 洗浄バッファーで6回洗浄する。
9. 15μLのTMBを添加する。
10. 十分な進展後に15μLのHClを添加する。
11. 450nm/620nmで吸光度を読み取る。
アッセイの原理:
NUNC Maxisorp(登録商標)384ウェルマイクロタイタープレートを、P013_04で被覆する。ブロッキング過程後に、B細胞上清からの特異的抗体は、抗原に結合し、次いでPOD標識された抗体によって検出される。試料は、1:2希釈で試験される。
プレート: 384ウェルのNUNC Maxisorp(登録商標)プレート;カタログ番号464718
タンパク質: P013-04(濃度1.3mg/ml;アッセイ濃度0.5μg/ml)
標準抗体: P013-02(濃度1mg/ml;開始アッセイ濃度2μg/ml)
検出抗体: 抗ウサギIgG、ペルオキシダーゼに結合された種特異的全抗体(ロバ由来)(ECL);GE;カタログ番号NA9340;アッセイ希釈:1:5000
PBS: Buffers in a Box、プレミックスされたPBSバッファー、10×;Roche Applied Sciences;カタログ番号11666789001
BSA: ウシ血清からのウシ血清アルブミンフラクションV;Roche Applied Sciences;カタログ番号10735086001
Tween 20: Tween(登録商標)20;Carl Roth;カタログ番号9127.2
TMB: TMB溶液;Life Technologies;カタログ番号SB02
HCl: 1MのTitripur(登録商標)塩酸;Merck;カタログ番号1090571000
ELISAバッファー:PBS、0.5%BSA、0.05%Tween(登録商標)
洗浄バッファー:PBS、0.1%Tween(登録商標)
ブロッキングバッファー:PBS、2%BSA、0.05%Tween(登録商標)
試料:ELISAバッファー中1:2希釈。
1. 12.5μLのPBS中P013-04(0.5μg/ml)を384ウェルのNUNC Maxisorp(登録商標)プレートに添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
2. 90μlの洗浄バッファーで3回洗浄する。
3. 90μLのブロッキングバッファーを各ウェルに添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
4. 洗浄バッファーで3回洗浄する。
5. 12.5μLの標準抗体(ELISAバッファー中1:2希釈)または試料(ELISAバッファー中1:2希釈)を添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
6. 洗浄バッファーで3回洗浄する。
7. 1:5000のPOD抗体(ELISAバッファー中)12.5μLを添加し、室温で1時間にわたりインキュベートする。
8. 洗浄バッファーで6回洗浄する。
9. 15μLのTMBを添加する。
10. 十分な進展後に15μLのHClを添加する。
11. 450nm/620nmで吸光度を読み取る。
本発明による抗体のヒトIL-1RAcPへの結合を、ELISAで分析した:EC50値を、従来技術に従って計算した。
アッセイの原理:
NF-κB-REホタルルシフェラーゼレポーターを発現する293T/17-FR細胞を、ポリ-D-リジン-細胞培養プレートに播種する。P013の刺激後に、293T/17-FR溶解物を、活性化されたNF-κBについてSteady-Gloルシフェラーゼアッセイキットを使用して試験する。機能的抗体を含む上清は、P013に結合し、NF-κB活性化を阻害し、それは低いシグナルで示される。試料は、P013溶液中1:2希釈で試験される。
プレート: セルプレート:384ウェルのPDL Costar細胞培養プレート;カタログ番号3844
アッセイプレート: 384ウェルのLumitrac(登録商標)白色プレート;Corning;カタログ番号3572
細胞: 293T/17-FR;アッセイ濃度250000細胞/ml
タンパク質:
P013_05(濃度0.03mg/ml;アッセイ濃度115pg/ml;作業濃度230pg/ml)
IL-1α、IL-33およびIL-36
標準抗体: P013_06(濃度0.2mg/ml;開始作業濃度6μg/ml)
キット: Steady-Gloルシフェラーゼアッセイシステム;Promega;カタログ番号E2510
細胞培地: DMEM培地;PAN Biotech;カタログ番号P04-04510
FCS: ウシ胎児血清、HyClone;Thermo;カタログ番号St30070.03
293T/17-FR培地: DMEM培地、10%FCS(+20μg/mlのハイグロマイシンB、培養の場合のみ)
前処理されたB細胞培地(MAB Discovery)
試料: DMEM培地+10%FCS中のP013_05で1:2希釈。
1. コンフルエントな293T/17-FR細胞を、毎月曜日(採取種細胞:5×106細胞/T175フラスコ)および毎金曜日(採取種細胞:3×106細胞/T175フラスコ)にトリプシン/EDTAを用いて継代培養する(室温でちょうど30秒間にわたりインキュベートする)。
2. 25μlのDMEM+10%FCS中の細胞(0.25×106細胞/ml)を、384ウェルのPDLプレート(Corning カタログ番号3844)に播種し、37℃および5%CO2で一晩インキュベートする。
3. 培地を吸引し、試料またはP013_06を、前処理された培地または前処理されたばかりの培地中で1:3希釈した希釈物12.5μlを添加し、37℃および5%CO2で30分間にわたりインキュベートする(プログラム:3 Aspiration and Sample transfer)。
4. DMEM+10%FCS中のP013_05を12.5μl添加し、37℃および5%CO2で5時間にわたりインキュベートする(プログラム:4_Add P013_05)。
5. 培養細胞を室温で10分間にわたり平衡化する。
6. 25μlのSteady-Glo(登録商標)試薬を添加し、ピペットで数回混合する(プログラム:6_Steady Glo(登録商標))。
7. 5分間待機した後に、45μlの上清を384ウェルのLumitrac(登録商標)白色プレート(Corning カタログ番号3572)に移す(プログラム:7_Transfer 45ul)。
8. ルミネッセンスをTecan社製のリーダー(Tecan Group Mannedorf、スイス)において測定する:積分時間:0.5秒。
材料:
細胞: ホタルルシフェラーゼNF-κBレポーターおよびウミシイタケルシフェラーゼ(正規化対照のため)を安定的に発現するHEK-293T細胞。IL1RAcPおよびIL1R1は、内因的に発現される
培地: DMEM(ATCC カタログ番号30-2002)+10%熱不活化FBS
試薬:
IL-1α(R&D 番号200-LA);10μg/mlのPBS+0.1%のBSA
抗IL1RAcPポジティブコントロール抗体(R&D 番号AF676);200μg/ml
MAB Discovery抗体:
プレート1の抗体は、750μg/ml
プレート2の抗体は、250μg/ml
ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega 番号E1500)。
1. 細胞を50000個/ウェルで96ウェルプレート中に100μlのDMEM+10%FBS中でプレーティングし、37℃、5%CO2でインキュベートする。
2. 4倍希釈の抗体をDMEM+10%FBS中で2×最終濃度で調製する。
3. 細胞を吸引分離し、抗体を60μlのDMEM+10%FBS中の2×最終濃度で添加し、細胞を37℃、5%CO2で30分間インキュベートする。
4. IL-1αを175pg/mlの最終濃度で60μlの完全培地において添加し(175pg/mlはEC50である)、37℃、5%CO2で4時間インキュベートする。
5. 細胞を150μlのPBSで洗浄する。
6. 細胞を50μlの1×細胞培養溶解試薬(ルシフェラーゼアッセイシステムによる)中で振とう器において周囲温度で15分間にわたり溶解する。
7. ピペットで出し入れを行い、20μlの溶解物をlumitrac-200プレートに移し、100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたWallac Victor2を用いて読み取る。
材料:
細胞: ホタルルシフェラーゼNF-κBレポーターおよびウミシイタケルシフェラーゼ(正規化対照のため)を安定的に発現するHEK-293T細胞。IL1RAcPおよびIL1R1は、内因的に発現される
培地: DMEM(ATCC カタログ番号30-2002)+10%熱不活化FBS
試薬:
IL-1β(R&D 番号201-LB);25μg/mlのPBS+0.1%のBSA
抗IL1RAcPポジティブコントロール抗体(R&D 番号AF676);200μg/ml
抗IL1RAcPウサギpAbポジティブコントロール抗体(ONCO ロットAP14)/200μg/ml(PBS)
正常ウサギIgG(JL 番号011-000-003);200μg/ml(PBS)
MAB Discovery抗体
プレート1の抗体は、750μg/ml
プレート2の抗体は、250μg/ml
ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega 番号E1500)。
1. 細胞を50000個/ウェルで96ウェルプレート中に100μlのDMEM+10%FBS中でプレーティングし、37℃、5%CO2で一晩インキュベートする。
2. 4倍希釈の抗体をDMEM+10%FBS中で2×最終濃度で調製する。
3. 細胞を吸引分離し、抗体を60μlのDMEM+10%FBS中の2×最終濃度で添加し、細胞を37℃、5%CO2で30分間インキュベートする。
4. IL-1βを175pg/mlの最終濃度で60μlの完全培地において添加し(175pg/mlはEC50である)、37℃、5%CO2で4時間インキュベートする。
5. 細胞を150μlのPBSで洗浄する。
6. 細胞を50μlの1×細胞培養溶解試薬(ルシフェラーゼアッセイシステムによる)中で振とう器において周囲温度で15分間にわたり溶解する。
7. ピペットで出し入れを行い、20μlの溶解物をlumitrac-200プレートに移し、100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたWallac Victor2を用いて読み取る。
材料:
細胞: CMVプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼNF-κBレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼ(正規化対照のため)およびIL-33Rで一過性トランスフェクションされたHEK-293T細胞。IL1RAcPは、内因的に発現される
培地: DMEM(ATCC カタログ番号30-2002)+10%熱不活化FBS
試薬:
IL-33(R&D 番号3625-IL);10μg/mlのPBS+0.1%のBSA
抗IL1RAcPポジティブコントロール抗体(R&D 番号AF676);200μg/ml
MAB Discovery抗体
プレート1の抗体は、750μg/ml
プレート2の抗体は、250μg/ml
ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega 番号E1500)。
1. 細胞を、ルシフェラーゼレポーターおよびIL-33Rで25000細胞/ウェルにおいて、アッセイ前に約24時間にわたりトランスフェクションさせる。
2. 4倍希釈の抗体をDMEM+10%FBS中で2×最終濃度で調製する。
3. 細胞を吸引分離し、抗体を60μlのDMEM+10%FBS中の2×最終濃度で添加し、細胞を37℃、5%CO2で30分間インキュベートする。
4. IL-33を250pg/mlの最終濃度で60μlの完全培地において添加し、37℃、5%CO2で4時間インキュベートする。
5. 細胞を150μlのPBSで洗浄する。
6. 細胞を50μlの1×細胞培養溶解試薬(ルシフェラーゼアッセイシステムによる)中で振とう器において周囲温度で15分間にわたり溶解する。
7. ピペットで出し入れを行い、20μlの溶解物をlumitrac-200プレートに移し、100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたWallac Victor2を用いて読み取る。
材料:
細胞: CMVプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼNF-κBレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼ(正規化対照のため)およびIL-36Rで安定的にトランスフェクションされたHEK-293T細胞。IL1RAcPは、内因的に発現される
培地: DMEM(ATCC カタログ番号30-2002)+10%熱不活化FBS
試薬:
IL-36β(R&D 番号6834-IL);100μg/mlのPBS+0.1%のBSA
抗IL1RAcPポジティブコントロール抗体(R&D 番号AF676);200μg/ml
MAB Discovery抗体
プレート1の抗体は、750μg/ml
プレート2の抗体は、250μg/ml
ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega 番号E1500)。
1. 細胞を50000個/ウェルで96ウェルプレート中に100μlのDMEM+10%FBS中でプレーティングし、37℃、5%CO2で一晩インキュベートする。
2. 4倍希釈の抗体をDMEM+10%FBS中で2×最終濃度で調製する。
3. 細胞を吸引分離し、抗体を60μlのDMEM+10%FBS中の2×最終濃度で添加し、細胞を37℃、5%CO2で30分間インキュベートする。
4. IL-36βを15ng/mlの最終濃度で60μlの完全培地において添加し(15ng/mlはEC50である)、37℃、5%CO2で4時間インキュベートする。
5. 細胞を150μlのPBSで洗浄する。
6. 細胞を50μlの1×細胞培養溶解試薬(ルシフェラーゼアッセイシステムによる)中で振とう器において周囲温度で15分間にわたり溶解する。
7. ピペットで出し入れを行い、20μlの溶解物をlumitrac-200プレートに移し、100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、ルミネッセンスを、液体インジェクタまたはその他の適切な光度計を備えたWallac Victor2を用いて読み取る。
Claims (25)
- ヒトIL-1RAcPに特異的に結合するモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体は、
以下の群:
-配列番号156のCDR1H、配列番号233のCDR2H、配列番号310のCDR3H、配列番号387のCDR1L、配列番号464のCDR2Lおよび配列番号541のCDR3L;
-配列番号157のCDR1H、配列番号234のCDR2H、配列番号311のCDR3H、配列番号388のCDR1L、配列番号465のCDR2Lおよび配列番号542のCDR3L;および
-配列番号158のCDR1H、配列番号235のCDR2H、配列番号312のCDR3H、配列番号389のCDR1L、配列番号466のCDR2Lおよび配列番号543のCDR3L;
から選択された3個の重鎖CDRsと3個の軽鎖CDRsとのセットを含むことを特徴とする、モノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。 - 前記モノクローナル抗体が、以下の群:
-配列番号2のVHおよび配列番号79のVL;
-配列番号3のVHおよび配列番号80のVL;および
-配列番号4のVHおよび配列番号81のVL;
から選択された重鎖および軽鎖の可変領域(VHおよびVL)の対を含む、
ことを特徴とする、請求項1に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。 - 前記モノクローナル抗体が、配列番号156のCDR1H、配列番号233のCDR2H、配列番号310のCDR3H、配列番号387のCDR1L、配列番号464のCDR2Lおよび配列番号541のCDR3Lを含むことを特徴とする、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号2のVHおよび配列番号79のVLを含む、請求項1から3までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号157のCDR1H、配列番号234のCDR2H、配列番号311のCDR3H、配列番号388のCDR1L、配列番号465のCDR2Lおよび配列番号542のCDR3Lを含む、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号3のVHおよび配列番号80のVLを含む、請求項1、2または5に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号158のCDR1H、配列番号235のCDR2H、配列番号312のCDR3H、配列番号389のCDR1L、配列番号466のCDR2Lおよび配列番号543のCDR3Lを含む、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号4のVHおよび配列番号81のVLを含む、請求項1、2または7に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記ヒト化抗体が、前記CDRsの1個における、1個までの保存的アミノ酸置換を有し、保存的アミノ酸置換は、システインからセリンへの置換であり、その際、前記ヒト化抗体は、前記モノクローナル抗体の特異性を維持する、請求項1から8までのいずれか1項に記載のヒト化抗体、または請求項1から8までのいずれか1項に記載のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記ヒト化抗体が、前記CDR3Lにおける、1個までの保存的アミノ酸置換を有する、請求項9に記載のヒト化抗体、または請求項9に記載のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記ヒト化抗体が、配列番号543のCDR3Lにおける、1個までの保存的アミノ酸置換を有する、請求項9に記載のヒト化抗体、または請求項9に記載のヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、(i)IL-1RAcPに誘導されるNFκB活性を阻害する、および/または(ii)IL-1α、IL-1β、IL-33および/またはIL-36で刺激されるNFκB活性を阻害する、請求項1から11までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、IL-1β/IL-1R1/IL-1RAcP、IL-1α/IL-1R1/IL-1RAcP、IL-33/ST2/IL-1RAcPおよび/またはIL-36/IL-36R/IL-1RAcPからなる群から選択される複合体によって刺激されるNFκB活性を阻害する、請求項12に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、5μg/mlの濃度で、0.5μg/mlのヒトIL-1α、IL-1β、IL-33および/またはIL-36で刺激された293T/17細胞において、NFκB活性を、70%以上、好ましくは80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上阻害する、請求項1から13までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、5μg/mlの濃度で、0.5μg/mlのマウスIL-1α、IL-1β、IL-33および/またはIL-36で刺激されたマウス細胞株において、NFκB活性を、70%以上、好ましくは80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上阻害する、請求項14に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、ヒトIgG1のFc領域のL234AおよびL235AまたはヒトIgG4のFc領域のS228PおよびL235Eのアミノ酸置換を少なくとも含むことを特徴とする、請求項1から15までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 前記モノクローナル抗体が、ウサギ/ヒトのキメラ抗体であることを特徴とする、請求項1から16までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 請求項1から8までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを改変する方法であって、前記CDRsの1個に1個までの保存的アミノ酸置換を導入することを含み、前記保存的アミノ酸置換は、システインからセリンへの置換であり、改変されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、請求項1から8までのいずれか1項に記載のモノクローナル抗体の特異性を維持する、前記方法。
- 前記保存的アミノ酸置換は、CDR3Lに導入される、請求項18に記載の方法。
- 前記保存的アミノ酸置換は、配列番号543のCDR3Lに導入される、請求項18に記載の方法。
- 請求項18から20までのいずれか1項に記載の方法によって生成できる、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 請求項1から17までのいずれか1項または請求項21に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメントの、医薬組成物の製造のための使用。
- 患者におけるIL-1媒介疾患の治療に使用するための、請求項1から17までのいずれか1項または請求項21に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメント。
- 医薬品に許容可能な担体と、請求項1から17までのいずれか1項または請求項21に記載のモノクローナル抗体、そのヒト化抗体、または前記モノクローナル抗体またはヒト化抗体の抗原結合フラグメントの治療的有効量とを含む医薬組成物。
- 患者におけるIL-1媒介疾患の治療に使用するための、請求項24に記載の医薬組成物。
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