JP7168621B2 - Ｍｐｓ１を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Description

ムコ多糖症は、ムコ多糖とも呼ばれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の分解に関与する特定のリソソーム酵素の欠損を原因とする一群の遺伝障害である。部分的に分解されたＧＡＧの蓄積により、細胞、組織、および器官の機能が干渉を受ける。時間の経過につれて、ＧＡＧは、細胞、血液、および結合組織の内部に蓄積し、その結果、細胞および器官の損傷が増大する。ムコ多糖症（ＭＰＳ）障害の中で最も重篤なＭＰＳ Ｉは、酵素α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠損を原因とする。これにより、重症度の順でハーラー症候群、ハーラー－シャイエ症候群、およびシャイエ症候群となる、３つの臨床症候群がもたらされる。それぞれは常染色体劣性遺伝形式で遺伝し、酵素欠損症の程度が臨床表現型の重症度に直接関連する。

ＩＤＵＡ遺伝子は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と呼ばれる大きな糖分子の分解に必須であるα－Ｌ－イズロニダーゼと呼ばれる酵素を生成するためのインストラクションを与えることが報告されている。具体的には、α－Ｌ－イズロニダーゼは、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸と呼ばれる２種のＧＡＧ中に存在する硫酸化α－Ｌ－イズロン酸として知られている分子からスルフェートを除去することが報告されている。α－Ｌ－イズロニダーゼは、種々のタイプの分子を消化し、再利用する、細胞内コンパートメントであるリソソーム中に存在する。ＩＤＵＡ遺伝子における１００を超える突然変異が、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）の原因となることが見出されている。１つのＤＮＡビルディングブロック（ヌクレオチド）を変化させる突然変異が最も一般的である。ＭＰＳ Ｉを引き起こし、α－Ｌ－イズロニダーゼの機能を低下または完全に消失させる突然変異。

臨床症候群に関しては、ハーラー症候群に対する現行の標準治療は、骨髄移植（ＢＭＴ）または臍帯血移植（ＵＣＢＴ）などの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。この処置は、できるだけ早期に、かつ、この疾患が身体およびＣＮＳの両面に影響を及ぼす２歳になる前に施される。しかしながら、ＭＰＳ Ｉに対するＨＳＣＴには、罹患率の顕著な値および２０％の死亡率が依然として伴っている。移植が選択肢でない場合には、患者の生命のために毎週１回の酵素注入を必要とする酵素補充療法（ＥＲＴ）を開始することができる。ＥＲＴは、ＣＮＳ疾患の進行には影響を及ぼさないが、身体症状を部分的に改善する。臓器肥大は顕著に改善されるが、骨格系、眼、および心臓における疾患の様相は部分的にのみ改善される。患者は、腰および膝を安定化するための外科手術ならびに手根管症候群および指収縮を治療するための外科手術を必要とすることがある。心臓疾患は内科的に治療されるが、結局は外科手術が必要となることがある。

ＭＰＳ Ｉに対するＥＲＴは、リソソームに取り込ませる外因性酵素を提供し、ＧＡＧの異化を増大させた。リソソーム酵素は内部で機能するが、細胞表面マンノース－６－リン酸受容体は、これらの酵素に結合し内部移行して、それらをリソソームに送達することができる。組換えＩＤＵＡ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）、ＢｉｏＭａｒｉｎ）は、ＭＰＳ Ｉのハーラー形態およびハーラー－シャイエ形態の患者および中等度から重度の症候を示すシャイエ形態の患者に対してＦＤＡにより認可されており、肺機能および歩行能力を改善することが示されている。ＥＲＴはまた、ＭＰＳ Ｉ患者における肝臓肥大および尿中ＧＡＧレベルを低減することが観察されている。しかしながら、静脈内の酵素は脳に容易に移行しないため、ＥＲＴでは、一部のＭＰＳ Ｉ患者が経験する神経症候に対する取り組みは現在行われていない。

ＥＲＴの合併症は、軽度から最も悪化したアナフィラキシーに及び得る組換え酵素に対する免疫応答ならびに局所および全身感染などの一生涯の末梢性発症の合併症を中心に展
開する。Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅを投与された患者の最大９１％がこの酵素に対する抗体を生じるが、それがどの程度効力に影響を及ぼすかは明らかではない。さらに、ＥＲＴは、病院環境における、毎週の３～８時間にわたる静脈内（ｉ．ｖ．）注入を必要とし、これは、患者の生活の質に多大な影響を与え、費用が高い点で、医療償還制度への主要な重圧となっている。

これらの制限を考慮すると、ＭＰＳ Ｉに関する罹患率をより効果的に改善することができる治療が、未だ対処されていない医療上の必要性として残っている。

一態様では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列またはヒト細胞において機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする配列番号１に対して少なくとも約９５％同一である配列を有するヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子を含む発現カセットであって、前記発現カセットがヒト細胞においてヒトα－Ｌ－イズロニダーゼの発現を指示する調節性制御配列をさらに含み、前記調節性制御配列が肝臓特異的プロモーターを含む、発現カセットを提供する。

別の態様では、本発明は、発現カセットを含有するベクターを提供する。一実施形態では、発現カセットはシスプラスミド上に位置する。別の実施形態では、発現カセットはｐＥＮＮ．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｎＲＢＧ上に位置する。

さらに別の態様では、本発明は、ＡＡＶカプシドを有し、かつ左側逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、その発現を制御する調節配列の制御下にあるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子、およびＡＡＶの右側ＩＴＲをその中にパッケージングしている組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、前記ｈＩＤＵＡ遺伝子が、配列番号１（図１）に示す配列または機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする、配列番号１に対して少なくとも約９５％同一である配列を有する、組換えアデノ随伴ウイルス粒子を提供する。一実施形態では、機能的なｈＩＤＵＡ遺伝子は、肝臓特異的プロモーターの制御下で発現される。そのようなプロモーターはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターであってもよい。

さらなる態様では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス粒子ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｃｏを提供する。

さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載する発現カセット含むｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を治療するために有用な組成物を提供する。

なおもさらなる態様では、本発明は、ムコ多糖症Ｉ型を治療するための方法であって、薬学的に許容される担体および本明細書に記載するｒＡＡＶを含む有効量の組成物を送達することを含む方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、ハーラー症候群、ハーラー－シャイエ症候群、および／またはシャイエ症候群の症候を治療または寛解するための方法を提供する。

本発明のさらに他の態様および利点が、本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。

機能的なヒトＩＤＵＡ遺伝子の核酸配列を含む、本明細書に記載するｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡ．ＲＧＢプラスミドの配列［配列番号３］を示す。図１の位置１２５１～３２１３に位置する機能的なＩＤＵＡの遺伝子およびそのコードされた酵素配列はまた、配列番号１および２にも示す。この配列にはさらに、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、イントロン１、ウサギグロビンポリＡ、ＩＴＲ、複製起点の配列を特定するための注釈が付けられている。 ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡ．ＲＧＢの環状マップを示す。

本明細書に記載する組成物は、ヒト被験体において治療有効量の機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を発現するヒトＩＤＵＡ遺伝子を担持する発現カセットを提供する。

本明細書で使用する場合、「治療有効量」は、ハーラー症候群、ハーラー－シャイエ症候群、および／もしくはシャイエ症候群、ならびに／またはＭＰＳ Ｉの症候を寛解または治療するために十分な酵素量を標的細胞に送達し発現させる組成物量を指す。「治療」には、これらの症候群（またはＭＰＳ Ｉ）の１つの症候の悪化の予防と、おそらくはそれらの症候の１つまたは複数の回復とが含まれ得る。

本明細書で使用する場合、「機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ」は、ＭＰＳ１またはハーラー症候群、ハーラー－シャイエ症候群、および／またはシャイエ症候群などの関連症候群に罹患していないヒトにおいて、正常に機能するヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素を指す。逆に、ＭＰＳ１またはこれらの症候群の１つの原因となるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素変異体は、非機能的であると見なされる。一実施形態では、機能的なヒトα－ｌ－イズロニダーゼは、Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．１０４（３）：２８９－２９４（２０１１）、配列番号２（６５３個のアミノ酸）に再現されているＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１９４．２によって記載される野生型ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼのアミノ酸配列を有している。しかしながら、この配列のいくつかの天然に存在する機能的な遺伝子多型（変異体）が記載されており、それらは本発明の範囲内に包含され得る。これらの変異体としては、配列番号２に関連して、位置１１０でのＮに連結した糖鎖付加［Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，８：６５１－６６１（２００９）］、アミノ酸位置３３でのＨからＱへの変化［配列番号７、ＶＡＲ＿００３３５０；Ｓｃｏｔｔ，ＨＳ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８８：９６９５－９６９９（１９９１）；Ｓｃｏｔｔ，ＨＳ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２：１３１１－１３１３（１９９２）；Ｓｃｏｔｔ ＨＳ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，９０：３２７－３２７（１９９２）；Ｂｅｒｔｏｌａ Ｆ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，３２：Ｅ２１８９－Ｅ２２１０（２０１１）］、アミノ酸位置８２でのＨからＱへの縮小［配列番号８、ＶＡＲ＿０２０９７６；Ｓｃｏｔｔ，ＨＳ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、上記に引用］、位置１０５でのＲからＱへの変化［配列番号９、ＶＡＲ＿００３３５６；Ｓｃｏｔｔ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、上記に引用；Ｂｅｒｔｏｌａ ｅｔ ａｌ、上記に引用］、位置１１６でのＧからＲへの変化［配列番号１２、ＶＡＲ＿００３３６７］、位置２７９でのＶからＡへの変化［配列番号１１、ＶＡＲ＿００３３５９、］、位置３４６でのＬからＲへの変化［配列番号１２、ＶＡＲ＿０１７４３６、Ｔｅｎｇ，ＹＮ，ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ，５７：１３１－１３６（２０００）］、位置３６１でのＡからＴへの変化［配列番号１３、ＶＡＲ＿００３３６４；Ｓｃｏｔｔ，ＨＳ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２：１４７１－１４７３（１９９３）；Ｙｏｇａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，２４：１９９－２０７（２００４）；Ｂｅｒｔｏｌａ，ｅｔ ａｌ、上記に引用］、位置４４９でのＨからＮへの変化［配列番号１４、ＶＡＲ＿０６６２２８、Ｂｅｒｔｏｌａ ｅｔ ａｌ、上記
に引用］、位置４５４でのＶからＩへの変化［配列番号１５、ＶＡＲ＿００３３７２；Ｙｏｇａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ、上記に引用；Ｂｅｒｔｏｌａ，ｅｔ ａｌ、上記に引用］、位置５９１でのＡからＴへの変化［配列番号１６、ＶＡＲ＿００６６２３１、Ｂｅｒｔｏｌａ ｅｔ ａｌ、上記に引用］、および位置６２２でのＡからＴへの変化［配列番号１７、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、上記に引用］が挙げられる。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ；ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ３５４７５を参照されたい。別の実施形態では、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼは、リーダー（シグナル）ペプチドに相当する配列番号２の最初の２６個のアミノ酸のすべてまたは一部が異種のリーダーペプチドに置換されている合成アミノ酸配列を含むことができる。酵素をその分泌経路を介して細胞から循環に輸送する役割を果たすこのリーダーペプチドは、例えば、インターロイキン２（ＩＬ－２）またはオンコスタチンからのリーダーペプチドなど、別の適切なリーダーペプチドで置換することができる。適切なリーダーペプチドは、必ずしもそうである必要はないが、ヒト起源が好ましい。適切なリーダーペプチドは、参照により本明細書に組み込まれるｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｌｉｎｅ．ｂｉｃ．ｎｕｓ．ｅｄｕ．ｓｇ／ｓｐｄｂ／ｚｈａｎｇ２７０．ｈｔｍから選択することも、または選択されたタンパク質中のリーダー（シグナル）ペプチドを判定するための種々の計算プログラムを使用して決定することもできる。限定されるものではないが、このような配列の長さは、約１５～約５０個のアミノ酸、もしくは約２０～約２８個のアミノ酸、または必要に応じてより長いかもしくはより短いものになり得る。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの少なくとも１つが、ＩＤＵＡ酵素の酵素活性を評価するために有用であると記載されている［例えば、Ｋａｋｋｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂｏｌ，２００１ Ｍａｒ；７２（３）：１９９－２０８を参照されたい］。

適切には、本明細書に記載する組成物および方法は、長期間にわたる毎週の治療量の反復注射を必要としない。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載する方法は、ＭＰＳＩ障害に付随した身体症候に加えて中枢神経系表現型を修復するのに有用であると考えられる。

発現カセット
発現カセットは、遺伝子およびその調節配列で最低限構成される。カセットが組換えアデノ随伴ウイルスから発現されるように設計されている場合、発現カセットはさらに、５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。これらのＩＴＲは、完全長であっても、ＩＴＲの一方もしくは両方が短縮されていてもよい。例えば、Ｄ配列の欠失および末端分解部位（ｔｒｓ）の欠失を含有する短縮５’ＩＴＲは、例えば自己相補的ＡＡＶのために使用することができる。一実施形態では、ｒＡＡＶは偽型である。すなわち、ＡＡＶカプシドはＩＴＲを提供するＡＡＶとは異なる供給源ＡＡＶに由来する。一実施形態では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲが使用される。しかしながら、他の適切な供給源に由来するＩＴＲを選択してもよい。

本明細書に記載するように、本明細書に記載する病態の１つに罹患する患者に、細胞において機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の発現を指示する調節配列の制御下にある機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子を担持する発現カセットを送達する。

発現カセットは、配列番号１のヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＵＡ遺伝子を含有する。本発明者らにより開発されたこの配列は、配列番号２をコードするＧｅｎｂａｎｋ ＮＰ０００１９４．２の公開遺伝子配列と約８３％の同一性を有する。別の実施形態では、発現カセットは、配列番号１に対して少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列を有することを特徴とするｈＩＤＵＡ遺伝子を含有し、機能的なヒトα－
Ｌ－イズロニダーゼをコードする。別の実施形態では、配列は、配列番号１に対して少なくとも約８５％同一であるかまたは配列番号１に対して少なくとも約９０％同一であり、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。別の実施形態では、配列は、配列番号１に対して少なくとも約９５％同一であるか、配列番号１に対して少なくとも約９７％同一であるか、または配列番号１に対して少なくとも約９９％同一であり、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする。一実施形態では、これは、配列番号ｌのおよそ１～およそ７８に相当する、ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（すなわち、配列番号２のおよそアミノ酸２６またはおよそアミノ酸２７～およそアミノ酸６５３をコードする）のリーダーペプチド配列を含む完全長ｈＩＤＵＡ遺伝子を包含する。別の実施形態では、ｈＩＤＵＡ遺伝子は、機能的なα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素の分泌部分、すなわち、配列番号２のおよそアミノ酸２７～およそ６５３に融合した異種リーダー配列を含む合成ペプチドである機能的な合成ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素または本明細書で特定されるその機能的な変異体の１つをコードする。

配列に関する同一性または類似性は、本明細書では、配列をアライメントし、必要とする場合、最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、本明細書に提供するペプチドおよびポリペプチド領域と同一（すなわち、同じ残基）または類似（すなわち、共通側鎖特性に基づいて同じグループに属するアミノ酸残基、下記を参照のこと）の候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセント（％）同一性は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の類縁性の尺度であり、それぞれ、そのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を比較することによって決定される。一般に、比較される２つの配列は、配列間で最大の相関を与えるようにアライメントされる。２つの配列のアライメントを検査し、２つの配列間の正確なアミノ酸またはヌクレオチドの一致を与える位置の数を決定し、それをアライメントの全長で割り、１００を掛けて、％同一性の数値を得る。この％同一性の数値は、比較される配列の全長にわたって決定しても（これは、同じかまたは極めて類似した長さで、高度に相同である配列に特に適している）、より短い指定の長さにわたって決定してもよい（これは、長さが等しくないかまたは相同性が低レベルである配列により適している）。いくつかのアルゴリズムおよびそれらに基づいたコンピュータプログラムが存在し、それらは、アライメントおよびパーセント同一性を得るために、文献上および／または公的もしくは商業的に利用可能である。アルゴリズムまたはプログラムの選択により本発明が限定されることはない。

適切なアライメントプログラムの例としては、例えば、Ｕｎｉｘ下のものであるが、その後Ｂｉｏｅｄｉｔプログラム（Ｈａｌｌ，Ｔ．Ａ．１９９９，ＢｉｏＥｄｉｔ：ａ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｅｄｉｔｏｒ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ９５／９８／ＮＴ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５－９８）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３８７－３９５，１９８４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡより入手可能）にインポートされたソフトウェアＣＬＵＳＴＡＬＷが挙げられる。プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰは、２つのポリヌクレオチド間の％同一性および２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定するために使用することができる。

配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムとしては、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＵＳＡから入手可能であり、またｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）でＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能なＢＬＡＳＴファミリーのプログラム群、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェア
パッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）が挙げられる。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用することができる；およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８，１９８８、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅの一部として入手可能）。ＳｅｑＷｅｂソフトウェア（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅへのウェブベースのインターフェース：Ｇａｐプログラム）。

本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、他の成分、要素、整数、工程等について包括的である。逆に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語およびその変形体は、他の成分、要素、整数、工程等について排他的である。「約」という用語は、特に明記されない限り、±１０％以内の変動を包含する。

一実施形態では、発現カセットは、ヒト肝臓指向性の発現のために設計される。したがって、肝臓特異的プロモーターは、この発現カセットに特によく適合している。一実施形態では、チロキシン結合グロブリンプロモーターが選択される。一実施形態では、ＴＢＧプロモーターは、図１のヌクレオチド４４２～９０１の配列を有する。あるいは、別の肝臓特異的プロモーターが選択されてもよい。組織特異的なプロモーターの例は、肝臓および他の組織についてよく知られており（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：５１２４－３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、骨オステカルシン（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６）；骨シアロタンパク質（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：１０６３－８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体鎖）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）などのニューロン性が挙げられる。他のプロモーター（肝臓特異的でない）を選択することもできるが、それを含有する発現カセットは、ＴＢＧまたは別の肝臓特異的プロモーターを有する発現カセットの利点を必ずしもすべて有するとは限らない。あるいは、調節可能なプロモーターが選択されてもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／１２６８０８Ｂ２号パンフレットを参照されたい。

一実施形態では、発現カセットは１つまたは複数の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーには、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーが含まれ得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在させることができる。あるいは、このエンハンサーのデュアルコピーを、１つまたは複数の配列により分離させることもできる。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えばＰｒｏｍｅｇａイントロンをさらに含有する。他の適切なイントロンとしては、例えば国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットに記載されているものなど、当技術分野で公知のものが挙げられる。

さらに、本発明の発現カセットは、適切なポリアデニル化シグナルを備えている。一実施形態では、ポリＡ配列は、ウサギグロブリンポリＡである。一実施形態では、ポリＡ配列は、図１のｎｔ３２６１～３３８７の配列を特徴とする。あるいは、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、または合成ポリＡもある。さらに他の従来の調節エレメントを追加するか、または任意選択的に発現カセットに含めることができる。

一実施形態では、発現カセットは、当業者に公知の技術を使用して、適切なベクター、例えばプラスミドベクター上に遺伝子操作される。任意選択的に、本発明の組成物は、改変ヒトＩＤＵＡ遺伝子を含む第１の発現カセットと、異なる遺伝子を含む第２の発現カセットとを含有することができる。さらに別の実施形態では、機能的なヒトＩＤＵＡは、例えば、国際公開第２０１１／１２６８０８号パンフレットに記載されているように、複数ベクター上に位置してもよい２つ以上の発現カセットから発現させることができる。

一実施形態では、発現カセットは、ｐＥＮＮ．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｎＲＢＧにより担持され、このプラスミドは、発現カセットを担持する組換えアデノ随伴ウイルスを作製するために使用される。

ＡＡＶウイルス粒子の生成
一実施形態では、本発明は、ＡＡＶカプシドを有し、かつ５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、その発現を制御する調節配列の制御下にあるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子、およびＡＡＶの３’ＩＴＲをその中にパッケージングしている組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、前記ｈＩＤＵＡ遺伝子が、配列番号１（図１）に示す配列または機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする、配列番号１に対して少なくとも約９５％同一である配列を有する、組換えアデノ随伴ウイルス粒子を提供する。特に望ましい１つのｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｃｏである。

ＡＡＶベースのベクターを調製する方法は公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号明細書（２００７年２月１５日）を参照されたい。ＡＡＶ８のＡＡＶカプシドの使用は、本明細書に記載する組成物および方法に特によく適合している。ＡＡＶ８の配列、およびＡＡＶ８カプシドに基づくベクターの作製方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、および米国特許第８，３１８，４８０号明細書に記載されている。また、ＡＡＶ９カプシドも本発明での使用によく適合している。ＡＡＶ９の配列、およびＡＡＶ９カプシドに基づいたベクターの作製方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９０６，１１１号明細書に記載されている。しかしながら、他のＡＡＶカプシドを本発明での使用のために選択または作製してもよい。いくつかのそのようなＡＡＶの配列は、上記に引用の米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号明細書、米国特許第７，７９０，４４９号明細書、米国特許第８，３１８，４８０号明細書、および米国特許第７，９０６，１１１号明細書に提供されており、かつ／またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。任意のＡＡＶカプシドの配列は、合成的にまたは種々の分子生物学および遺伝子工学技術を使用して容易に作製することができる。適切な生成手法が当業者には周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。あるいは、ペプチド（例えば、ＣＤＲ）をコードするオリゴヌクレオチドまたはペプチド自体を合成的に、例えば周知の固相ペプチド合成法によって作製することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，８５：２１４９；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）ｐｐ．２７－６２）。また、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ
８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４も参照されたい。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；および同第７，４５６，６８３号明細書に記載されており、これらのそれぞれは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらおよび他の適切な生成方法は、当業者の知識の範囲内であり、本発明を限定するものではない。

本明細書に記載する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、公知の技術を使用して作製することができる。そのような方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；機能的なｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子で最低限構成される発現カセット；ならびにＡＡＶカプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするための十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。

ＡＡＶカプシドの中にＡＡＶ発現カセットをパッケージングするために宿主細胞中で培養される必要がある成分は、トランスで宿主細胞に提供されてもよい。あるいは、必要な成分（例えば、発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）の任意の１つまたは複数は、当業者に公知の方法を使用して、必要な成分の１つまたは複数を含有するように操作された安定な宿主細胞により提供されてもよい。最適には、そのような安定な宿主細胞は、誘導プロモーターの制御下にある、必要な成分を含有することになる。しかしながら、必要な成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの例が、導入遺伝子との使用に適した調節エレメントの論述の中で本明細書に提供される。さらに別の代替形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分を含有することができる。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を作製することができる。さらに他の安定な宿主細胞は、当業者により作製可能である。

本発明のｒＡＡＶを生成するのに必要な発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、その上に担持される配列を移入する任意の遺伝エレメントの形態でパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝エレメントは、本明細書に記載のものを含む任意の適切な方法によって送達することができる。本発明の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作の技術者には公知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成手法を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は周知であり、適切な方法の選択により、本発明が限定されることはない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

他に明記されない限り、ＡＡＶ ＩＴＲ、および本明細書に記載の他の選択されたＡＡＶ成分は、任意のＡＡＶの中から容易に選択することができる。これらのＩＴＲまたは他
のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な手法を使用して、ＡＡＶ配列から容易に単離することができる。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、または公的な供給源（例えば、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から単離または入手することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献または例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）等のデータベースから入手可能であるものなど公表された配列を参照して、統合的または他の適切な手段によって得ることができる。

Ａ．発現カセット
発現カセットは本明細書に定義された通りである。加えて、本明細書に記載する発現カセットおよび／またはベクターはさらなる導入遺伝子または調節配列を含有することができる。カプシドタンパク質の中にパッケージングされ、選択された宿主細胞に送達される発現カセット。

１．導入遺伝子
本発明は、複数の導入遺伝子の使用を含むことができる。適切な導入遺伝子は、当業者により容易に選択可能である。導入遺伝子の選択により、本発明が限定されるとは見なされない。

２．調節エレメント
発現カセットについて上記に特定された主要なエレメントに加え、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされたかまたは本発明により生成されたウイルスに感染した細胞中でのその転写、翻訳、および／または発現を可能にするように導入遺伝子に作動的に連結される従来の調節エレメントを含む。本明細書で使用する場合、「作動的に連結される」配列には、目的の遺伝子に近接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。

発現調節配列には、適切な転写開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；および必要に応じて、コードされた産物の分泌を高める配列が含まれる。天然、構成的、誘導性、および／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、かつ利用することができる。

構成的プロモーターの例としては、限定はされないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的に、ＲＳＶエンハンサーと共に）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的に、ＣＭＶエンハンサーと共に）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，（１９８５）Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０を参照のこと］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因性に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは特定の生理学的状態の存在、例えば細胞の急性期、特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性システムは、限定はされないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、およびＡｒｉａｄを含む、種々の商業的供給源から入手可能である。他の多くのシステムが記載されており、当業者により容易に選択可能である。外因性に供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモ
ーターシステム［国際特許公開国際公開第９８／１００８８号パンフレット］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６－３３５１］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ
ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７－５５５１］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６－１７６９、さらにＨａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２－５１８も参照のこと］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９－２４３、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２－４４１］、ならびにラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５－２８７２］が、例えばＡｒｉａｄから入手可能なＡｒｇｅｎｔ（商標）系を含めて挙げられる。これに関連して有用となり得る他のタイプの誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、例えば細胞の温度、急性期、特定の分化状態により、または複製細胞においてのみ調節されるものである。

導入遺伝子の別の実施形態では、組織特異的プロモーターに作動的に連結された遺伝子が含まれる。例えば、骨格筋での発現が必要な場合、筋で活性なプロモーターが使用されるべきである。これらには、骨格β－アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、デスミン、ＭＨＣ、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、および天然のプロモーターよりも高活性を有する合成の筋プロモーターが含まれる（Ｌｉ ｅｔ
ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１－２４５を参照のこと）。組織特異的なプロモーターの例は、例えば、とりわけ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５）、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）など、ＣＮＳ／ニューロン性について知られている。別の実施形態では、導入遺伝子の天然のプロモーターを使用することになる。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが望ましい場合、天然のプロモーターが好ましくなり得る。導入遺伝子の発現を、一時的にもしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節しなければならない場合、天然のプロモーターを使用することができる。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他の天然の発現制御エレメントも、天然の発現を模倣するために使用することができる。

導入遺伝子、プロモーター／エンハンサー、ならびに５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲの組合せは、本明細書での言及を容易にするために発現カセットと呼ぶ。本発明の教示が与えられれば、そのような発現カセットの設計は、従来の手法により行うことができる。

３．ＡＡＶパッケージング宿主細胞への発現カセットの送達
発現カセットは、宿主細胞に送達される任意の適切なベクター、例えばプラスミド上に担持することができる。本発明に有用なプラスミドは、複製および任意選択的に原核細胞、哺乳動物細胞、またはその両方における組み込みに適するように操作することができる。これらのプラスミド（または発現カセットを担持する他のベクター）は、真核生物および／または原核生物における発現カセットならびにこれらの系の選択マーカーの複製を可能にする配列を含有する。選択可能マーカーまたはレポーター遺伝子としては、とりわけ、カナマイシン、ジェネテシン、ハイグロマイシン、またはピューリマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）抵抗性をコードする配列を挙げることができる。プラスミドはまた、アンピシリン抵抗性など、細菌細胞中でベクターの存在を伝達するために使用できる特定の選択
可能レポーターまたはマーカー遺伝子を含有することができる。プラスミドの他の成分としては、複製起点、およびエプスタインバーウイルス核抗原を使用するアンプリコンシステムなどのアンプリコンを挙げることができる。このアンプリコンシステムまたは他の同様のアンプリコン成分は、細胞中での高コピーのエピソーム複製を可能にする。好ましくは、発現カセットを担持する分子は、細胞にトランスフェクトされ、そこで一過性に存在することができる。あるいは、発現カセットは、染色体性にまたはエピソームとしてのいずれかで、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよい。特定の実施形態では、発現カセットは、複数コピーで、任意選択的にヘッドトゥーヘッド、ヘッドトゥーテール、またはテールトゥーテールのコンカテマーで存在することができる。適切なトランスフェクション手法は公知であり、宿主細胞に発現カセットを送達するために容易に利用することができる。

一般に、トランスフェクションにより発現カセットを含むベクターを送達する場合、ベクターは、約５μｇ～約１００μｇＤＮＡ、約１０μｇ～約５０μｇＤＮＡの量で、約１×１０⁴細胞～約１×１０¹³細胞、または約１×１０⁵細胞に送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択されたベクター、送達方法、および選択された宿主細胞などの因子を考慮に入れて調節することができる。

Ｂ．パッケージング宿主細胞
発現カセットに加えて、宿主細胞は、宿主細胞において本発明のＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動する配列、および発現カセットに見出されるＡＡＶ ＩＴＲの供給源と同じ供給源のｒｅｐ配列または交差相補（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）供給源のｒｅｐ配列を含有する。パッケージング宿主細胞はまた、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能を必要とする。そのようなヘルパー機能は、当技術分野で周知であり、本明細書で繰り返されることはない。同様に、ＡＡＶカプシドを有する適切なベクターを作製する方法は公知である。［例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号明細書を参照のこと］。

本明細書に記載する発現カセットをコードするｒＡＡＶのコンストラクトは、生理学的に適合する担体に懸濁することができ、被験体に投与可能となる。一実施形態では、担体は、滅菌生理食塩水単独であるか、または任意選択的に、いくつかの緩衝液のうちのいずれかと一緒の滅菌生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）である。他の代表的な担体としては、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ゴマ油、および水が挙げられる。担体の選択により本発明が限定されることはない。

任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含有することができる。一実施形態では、送達は静脈内送達を介するものである。しかしながら、さらに他の投与経路も選択することができる。代替的または追加的に、投与経路を、必要に応じて組み合わせてもよい。

一実施形態では、本発明は、本明細書に記載するｒＡＡＶまたはｒＡＡＶの混合物を凍結乾燥形態で含有する凍結乾燥組成物を含む。任意選択的に、１つまたは複数の安定剤または防腐剤がこの組成物中に存在する。適切には、使用のために、凍結乾燥組成物は、適切な希釈剤、例えば、滅菌生理食塩水または緩衝食塩水で再構成される。

ウイルスベクターの投薬量は、主として、治療される症状、患者の年齢、体重、および健康などの因子に依存することになり、したがって、患者間で変動し得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効投薬量は、一般に、約３×１０⁹～３×１０¹³ゲノムウイルスベ
クター（粒子）／ｍＬ水性懸濁剤の濃度を含有する溶液の約０．１ｍＬ～約１００ｍＬ、
または約０．１ｍＬ～約１０ｍＬ、または約０．１ｍＬ～約５ｍＬ、または約０．５ｍＬ～約１ｍＬの範囲である。別の例示的な投薬量は、１ｋｇ当たり約３×１０⁹～３×１０¹³ＡＡＶゲノムである。１つの適切な容量は約１ｍＬである。別の実施形態では、ｒＡＡ
Ｖコンストラクトの治療有効用量は、約０．００１ｎｇ～約１０００ｍｇ／７０ｋｇ動物の範囲であり、これは単回投与で送達しても、一連の２回以上にわたる投与で送達してもよい。他の適切な投薬量を決定してもよい。投薬量は、いかなる副作用に対しても治療効果とのバランスを取るように調節されることになり、そのような投薬量は、組換えベクターが使用される治療用途に応じて変動し得る。

治療方法
本発明の組成物は、軽度から最も悪化したアナフィラキシーに及び得る、組換え酵素に対する免疫応答に関連した、酵素補充療法の合併症ならびに局所および全身感染などの一生涯の末梢性発症の合併症を回避する。さらに、ＥＲＴとは対照的に、本明細書の組成物は、長期間にわたる毎週の反復注射を必要としない。理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載する肝臓指向性の治療方法は、高い形質導入効率でベクターにより提供される効率的で長期間の遺伝子移入（これは血液脳関門を横断する治療レバレッジ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅｖｅｒａｇｅ）を提供する、継続して高い循環ＩＤＵＡレベルを提供することができるであろう）を実現することにより、ＭＰＳＩ障害に関連した中枢神経系表現型を修復するために有用であると考えられる。加えて、ＡＡＶ肝臓遺伝子移入は、能動的な寛容性を惹起し、酵素に対する抗体産生を防止することができる。

ムコ多糖症Ｉ型を治療する方法であって、本明細書に記載する治療有効量の改変ｈＩＤＵＡ発現カセットを送達することを含む方法を提供する。また、ハーラー症候群、ハーラー－シャイエ症候群、およびシャイエ症候群の症候を治療および／または寛解するための方法も提供する。

一実施形態では、ｒＡＡＶは静脈内送達される。

別の実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０⁹～約３×１０¹²の量で送達され、被験体
に送達される。ｒＡＡＶの単回投与は効果的であると予想されるが、肝臓は再生器官であるため、投与は反復されてもよい（例えば、年４回、年２回、年１回、または必要に応じて）。任意選択的に、治療有効量の初回用量を、被験体の年齢および注入に耐える能力を考慮して、注入時間を分割して送達してもよい。しかしながら、十分な治療用量を毎週反復注射することは必要ではなく、これは、快適さと治療アウトカムの両方の点から患者にとって利点となる。

以下の実施例は、単なる例示であり、本明細書に記載する本発明を限定するものではない。

実施例１ － 導入遺伝子およびベクター生成
機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする改変ヌクレオチド配列を合成した。得られた配列は、ヒト発現に特によく適合しており、機能的なヒトＩＤＵＡ遺伝子（ｈＩＤＵＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＰ０００１９４．２）に対して約９０％未満の同一性を有する。次いで、得られた導入遺伝子を、操作されたＭｌｕＩおよびＳａｌＩ部位を使用してＵＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから入手可能であるＡＡＶベクター中にパッケージングするために必要なシスエレメントを含有するプラスミドに挿入した。遺伝子発現はヒトサイロキシン結合グロブリンにより駆動した（ＴＢＧ，Ｈａｙａｓｈｉ Ｙ，Ｍｏｒｉ
Ｙ，Ｊａｎｓｓｅｎ ＯＥ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ：ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３；７：１０４９－１０６０）。図２に示す得られたプラスミドｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＩＤＵＡ．ＲＧＢは、肝臓特異的ＴＢＧプロモーターを含む発現制御配列の制御下にある改変ｈＩＤＵＡ遺伝子を含有する。このプラスミドはさらに、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ、アルファｍｉｃ／ｂｉｃエンハンサーの縦列反復、ＴＢＧプロモーター、Ｐｒｏｍｅｇａイントロン配列、配列番号１の改変ヒトＩＤＵＡ遺伝子、ウサギグロビンポリＡ、およびＡＡＶ２－３’ＩＴＲを含有する。

大規模ベクター調製は、基本的に、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．［Ｒａｐｉｄ，ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ ｓｃａｌｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１（１０）：１２５９－１２７１．（２０１０）］によって記載されるように行った。ＰＥＩベースのトランスフェクションは、７５％コンフルエントの単層ＨＥＫ２９３細胞を含有する、１０層の細胞スタックで行った。細胞スタックからの１０Ｌのフィードストック培地を澄明にした後、接線フロー濾過により濃縮した。濃縮した澄明フィードストックを、イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）勾配上で精製した。可視の夾雑タンパク質バンドの直下にあるすべての分画を回収し、プールした。プールした分画を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５スピン濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳ／３５ｍＭ ＮａＣｌに対してダイアフィルトレートして濃縮した。ダイアフィルトレートして濃縮した生成物にグリセロールを最終５％になるまで加え、この調製物を小分けして－８０℃に保存した。得られたベクターは、本明細書では、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡまたはＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡと称される。特定の場所では
、組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡｃｏまたはＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡｃｏと呼ばれる。このプラスミドはさらに、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ、アルファｍｉｃ／ｂｉｃエンハンサーの縦列反復、ＴＢＧプロモーター、Ｐｒｏｍｅｇａイントロン配列、配列番号１の改変ヒトＩＤＵＡ遺伝子、ウサギグロビンポリＡ、およびＡＡＶ２－３’ＩＴＲを含有する。

実施例２ － Ａ．細胞ベースのアッセイ
ＨＥＫ ２９３細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＸＸＸ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐ／ｓ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を含有する増殖培地で維持した。プラスミドＤＮＡトランスフェクションは、製造業者の推奨に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を使用して行った。手短に言えば、トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ、ｐ／ｓなし）中、６ウェル組織培養ディッシュに５×１０⁵細胞／ウェルの密度で、細胞を播種し、５
％ＣＯ₂中、３７℃で一晩付着させた。翌日、９０～９５％コンフルエントであるか細胞
をチェックし、培地をリフレッシュした。プラスミドＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を、最終的な比が１：２．５（ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００）になるようにＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ（登録商標）Ｒｅｄｕｃｅｄ
Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（無血清）で希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション溶液を２２℃で５分間インキュベートした後、ＤＮＡ溶液と混合した。ＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００溶液を含有する、この最終的なトランスフェクション混合物を、２０分間（２２℃）さらにインキュベートした後、細胞および培地を含有するウェルに加えた。プラスミドＤＮＡを受容せずかつｅＧＦＰをコードするプラスミドを受容したｍｏｃｋ細胞を、トランスフェクション対照として使用した。試験する各コンストラクトについて、３つのウェルにトランスフェクトした。細胞を５％ＣＯ₂中、３７℃でインキュベートし、４時間後に、培地を増殖培地に置
き換えた。各ウェルの内容物を７２時間後に回収し、４℃で１５分間、４０００ｒｐｍで収集した。１００μｌ／ウェル溶解緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）に細胞を再懸濁し、ボルテックスすると共に凍結／解凍を３回行った。さらに、ベンゾナーゼで溶解物を３７℃で３０分間処理した後、最終的な凍結／解凍を行った。１００００ｒｐｍ（４℃）で１０分間、細胞片をペレット化し、最終的に澄明にした細胞溶解物を氷上に置き、直ちに酵素活性についてアッセイした。

Ｂ．組織溶解およびタンパク質抽出
凍結した組織を、１層のドライアイス上、ボックス中で半解凍し、小断片の湿った組織を小ペトリ皿に切り分けた（約２０ｍｇ、脾臓について約１０ｍｇ）。次いで、１ｍｌの溶解緩衝液（０．２％Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ－１００、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）および５ｍｍの鋼ビーズを入れた２ｍｌのエッペンドルフ中に、前処理した組織を沈めた。試料をｔｉｓｓｕｅ－ｌｙｚｅｒ上、３０Ｈｚで２分間ホモジナイズした。ホモジナイズした試料を、６０００ｒｐｍで３０秒間、短く回転させ、５ｍｍの鋼ビーズを除去した。組織溶解物をさらに、直径１～１／１６インチのマイクロホーン（ｍｉｃｒｏｈｏｒｎ）を使用する超音波処理により破壊し、－８０℃で一晩凍結した。翌日、処理した試料を２２℃で解凍し、遠心分離（１００００ｒｐｍ／１０分間／４℃）により澄明にした。脳からの浮遊脂質層または他の脂肪組織をアッセイ前に吸引した。次いで、試料を湿った氷上に用意し、直ちに酵素活性についてアッセイした。

Ｃ．タンパク質評価
総タンパク質を、製造業者のプロトコールに従い、ＣｏｏｍａｓｓｉｅベースのＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して評価した。手短に言えば、ｌ～２５μｇ／ｍｌの評価範囲になるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して標準曲線を作成し、ＢＳＡ不含タンパク質希釈緩衝液をブランクとした。試料を、９６ウェル平底ディッシュ中で、１／３００～１／１２００まで２倍希釈し、希釈タンパク質：Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬を１：１の比で混合した。試料を２２℃で１５分間平衡化し、プレートリーダー上、推奨波長５９５ｎｍで吸光度を収集した。ブランク補正した標準曲線を使用して、生の数値をμｇ／ｍｌ濃度に変換した。次いで、マイクログラム量を変換して、ミリグラム単位で報告した。

Ｄ．酵素活性アッセイ
ＩＤＵＡ酵素活性は、以前に公表された方法［Ｋａｋｋｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ，２００１ Ｍａｒ；７２（３）：１９９－２０８］に従い、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イドピラノシドウロン酸，シクロヘキシルアンモニウム塩（４－ＭＵ－Ｉｄｏ；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を基質として使用してアッセイした。手短に言えば、溶解物または血清５～１５μｌを再蒸留水（ｄｄＨ₂０）で１００μｌに合わせ、反応緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐＨ３．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で希釈した１００μΜ ４－ＭＵ－Ｉｄｏ基質１００μｌをアクリル酸メチルキュベット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で混合した。反応物を３７℃水浴中で１～３時間インキュベートし、１倍停止緩衝液（２９０ｍＭグリシン、１８０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）で終了させた。生成物を、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（商標）－ＳＴ上、ＵＶチャネル（Ｅｘ３６５ｎｍ、Ｅｍ４４０－４７０ｎｍ）により読み取った。蛍光の生数値を記録し、既知量の４－メチルウンベリフェロン（Ｍ－５４１０；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ（登録商標））の標準曲線を使用して、ｎｍｏｌ／ｍｌ／時に変換した。細胞および組織の溶解物をタンパク質評価値に規準化した（ｎｍｏｌ／ｍｇ／時；「タンパク質評価」と題する方法の項を参照のこと）。

Ｅ．ＤＮＡ抽出およびゲノムコピー分析
二倍体細胞におけるベクターＤＮＡ負荷を決定するために、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲを使用した。リアルタイムＰＣＲによるベクターゲノムの検出および定量のために、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、全細胞ＤＮＡを組織から抽出した。プライマーおよびプローブのセットを、以下の配列；順方向：ＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＧＡＣＡＴ、逆方向：ＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧ、プローブ：６ＦＡＭ－ＡＴＧＡＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴ－ＴＡＭＲＡを使用して、ベクターのｎＲＢＧポリＡ領域を標的化するように設計した。ベクターゲノム定量のための標準曲線は、対応するベクターの生成に使用したシスプラスミドで確立した。ＰＣＲは、鋳型として２００ｎｇの全細胞ＤＮＡ、３００ｎＭのプライマー、および２００ｎＭのプローブをそれぞれ含む、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で行った。サイクルは、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、９５℃で１５秒間の４０サイクル、および６０℃で１分間とした。

Ｆ．免疫ブロッティング
免疫ブロッティングは標準的方法により行った。手短に言えば、ＮｕＰＡＧＥゲルシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４～１２％ｂｉｓ－ｔｒｉｓゲルを使用した。２０Ｖで３０分間後に、ＰＶＤＦメンブレンへの転写を行った。ブロックはＴ－ＰＢＳ中の１０％ＮＦＤＭ（一晩）であった。一次ＭＡｂはマウス抗ヒトＩＤＵＡ １：３００（１．５時間）；Ｔ－ＰＢＳ中の１％ＮＦＤＭであった。二次：ＨＲＰ連結ウサギ抗マウス １：３０００（１時間）；Ｔ－ＰＢＳ中の１％ＮＦＤＭ。検出は、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｘ線フィルム上の３０秒間露出で行った。

実施例３ － マウスおよびイヌにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＩＤＵＡ欠損はイヌで見出され得るものであり、これにより、大動物における疾患および治療の試験が可能になる。ＭＰＳ Ｉイヌは、ＩＤＵＡ遺伝子の劣性（ヌル）突然変異を担持しており、イントロン１のドナースプライス部位におけるＧ＞Ａ突然変異により、エキソンイントロンジャンクションにおける中途での終止コドンが生成される［Ｍｅｎｏｎ，Ｋ．Ｐ．，Ｐ．Ｔ．Ｔｉｅｕ，ａｎｄ Ｅ．Ｆ．Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ ＩＤＵＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃａｎｉｎｅ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９２．１４（３）：ｐ．７６３－８．］。イヌにおける疾患過程はハーラー－シャイエ症候群に類似しており、疾患症状には、胸変形を含む顕著な骨疾患が含まれる。

尿中ＧＡＧ分析は、臨床環境におけるＭＰＳ Ｉに対する治療効力を判定するために使用される生化学マーカーである。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積を、パラフィン切片のアルシアンブルー（ｐＨｌ）染色により主要な器官で評価した。細胞内のプロセシングされていないＧＡＧの蓄積は、トルイジンブルーで染色された、プラスチック包埋組織からの１μｍ薄切片上で特によく可視化される。トルイジンブルーで染色された、エポン包埋組織の薄切片（１μｍ）。これにより、貯蔵物質を含有する細胞（「泡沫状スポンジ細胞」）が示される。

脳において、ガングリオシドＧＭ３に対する抗体を用いて免疫組織化学を行った。ニューロン中にＧＭ３の異常な貯蔵が示される。イヌでは皮質を評価し、マウスでは皮質および視床下部を評価した。肝臓におけるヒトＩＤＵＡの発現を免疫蛍光法により評価した。

Ａ．マウス試験
実施例１に記載するように、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．改変ｈＩＤＵＡを調製した。マウス（約３か月）に、約１×１０¹¹ＧＣ、３×１０¹⁰ＧＣ、３×１０⁹ＧＣ、１×１０⁹ＧＣの用量で静脈内注射し、注射約２週間後に評価した。

結果から、１×１０¹¹、３×１０¹⁰、および３×１０⁹を投与した動物では、ＧＡＧ染
色が減少または完全に欠如していることがわかった。これらの動物では、貯蔵病変の減少または完全な欠如が、薄切片で観察された。

１×１０⁹ＧＡＧを投与した動物では、貯蔵は無処置のマウスと多かれ少なかれ同じよ
うに見え、貯蔵病変も無処置のマウスと多かれ少なかれ同じように見えた。

ＧＭ３貯蔵については、１×１０¹¹ＧＣおよび３×１０¹⁰ＧＣを投与した動物のみを評価し、ニューロン中のＧＭ３貯蔵の若干の改善が観察された。

ＩＤＵＡの強力な発現（肝細胞の１００％）が１×１０¹¹ＧＣを投与した動物で観察された。これは低用量になると低減し、１×１０⁹ＧＣではほんのわずかな陽性肝細胞しか
見えなかった。

Ｂ．イヌ試験
実施例１に記載するように、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．改変ｈＩＤＵＡを調製した。イヌ（約８か月齢）に、１×１０¹¹ＧＣの用量を静脈内注射し、注射４か月後（すなわち１歳）に、評価した。

この試験では、貯蔵病変の回復が示される。より具体的には、すべての主要器官におけるＧＡＧ貯蔵の実質的に完全なクリアランスがアルシアンブルー染色によって認められる。心臓、腎臓、または肝臓の薄切片では貯蔵病変が観察されない。ＧＭ３蓄積の低下または完全なクリアランスがニューロンで観察される。肝臓におけるＩＤＵＡの発現は、肝細胞の９５％超で免疫蛍光法により観察される。

実施例４ － ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡによるハーラー－シャイエの治療 ＩＤＵＡのＡＡＶ８媒介遺伝子移入を、ハーラー－シャイエ患者で評価する。被験体は、末梢静脈へのベクターの単回注入を受けることになる。これは、前臨床データに基づくと、正常な患者で得られるものに近いレベルで酵素の安定な産生をもたらすはずである。この試験は、種々の用量のベクター、例えば３×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ；ｌ×１０¹²ＧＣ／ｋｇ；３×ｌ０¹²ＧＣ／ｋｇを含み得、用量範囲を加えてもよい。最も非侵襲性の効力評価は、この疾患で上昇し、ＥＲＴ後に部分的に修復する尿中ＧＡＧレベルである。導入遺伝子生着およびその発現レベルを、血清ＩＤＵＡを測定することより判定する。尿中ＧＡＧはまた遺伝子療法の前後にも測定する。

配列表フリーテキスト
以下の情報が、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列に対して提供される。

「Ｚ６６２２ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と標識の付いた配列表は、電子形態で本明細書と共に提出されている。この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。２０１３年３月１５日に出願された優先権出願米国特許出願第６１／７８８，７２４号明細書を含む、本出願に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示されているかのように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、理解が明瞭になるように、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、特定の変更形態および改変形態が、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それらになされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかであろう。
以下に本発明の主な特徴と態様を列挙する。
１． 配列番号１のヌクレオチド配列または機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする配列番号１に対して少なくとも約８０％同一である配列を有するヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子を含む発現カセットを担持する組換えベクターであって、前記発現カセットが前記ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼの発現を指示する調節性制御配列をさらに含み、前記調節性制御配列が肝臓特異的プロモーターを含む、組換えベクター。２． 前記改変ｈＩＤＵＡ遺伝子が、配列番号１に対して少なくとも約８５％～約９０％同一である、１．に記載の組換えベクター。
３． 前記改変ｈＩＤＵＡ遺伝子が、配列番号１に対して少なくとも約９５％～約９９％同一である、２．に記載の組換えベクター。
４． 前記機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼが、
（ａ）配列番号２のおよそアミノ酸１～およそ６５３と、
（ｂ）配列番号２のおよそ酸２７～およそ６５３に融合した異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素と、
（ｃ）アミノ酸位置８２でのＨからＱへの縮小（配列番号８）；位置１０５でのＲからＱへの変化（配列番号９）；位置１１６でのＧからＲへの変化（配列番号１０）；位置２７９でのＶからＡへの変化（配列番号１１）；位置３４６でのＬからＲへの変化（配列番号１２）；位置３６１でのＡからＴへの変化（配列番号１３）；位置４４９でのＨからＮへの変化（配列番号１４）；位置４５４でのＶからＩへの変化（配列番号１５）；位置５９１でのＡからＴへの変化（配列番号１６）；および位置６２２でのＡからＴへの変化（配列番号１７）を含む改変の１つまたは複数を有する、配列番号２のアミノ酸配列の変異体と
からなる群から選択される、１．に記載の組換えベクター。
５． 前記プロモーターがＴＢＧプロモーターである、１．に記載の組換えベクター。
６． 前記ベクターが１つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、１．に記載の組換えベクター。
７． 前記エンハンサーが同じであるかまたは異なっている、６．に記載の組換えベクター。
８． 前記エンハンサーが、イントロン、ＣＭＶエンハンサー、およびアルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーからなる群から選択される、６．に記載の組換えベクター。
９． 前記選択されたエンハンサーの２つ以上のコピーが前記ベクター中に存在する、６．に記載の組換えベクター。
１０． 前記エンハンサーの前記２つ以上のコピーが縦列して位置する、９．に記載の組換えベクター。
１１． 前記発現カセットが、ウサギグロブリンポリＡから選択されるポリＡをさらに含む、１．に記載の組換えベクター。
１２． プラスミドｐＥＮＮ．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｎＲＢＧである、１．に記載の組換えベクター。
１３． ＡＡＶカプシドを有し、かつ５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、その発現を制御する調節配列の制御下にあるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子、およびＡＡＶの３’ＩＴＲをその中にパッケージングしている組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、前記ｈＩＤＵＡ遺伝子が、配列番号１（図１）に示す配列または機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする、配列番号１に対して少なくとも約９５％同一である配列を有する、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
１４． 前記改変ｈＩＤＵＡ遺伝子が、肝臓特異的プロモーターの制御下で発現される、１３．に記載のｒＡＡＶ。
１５． 前記プロモーターがＴＢＧプロモーターである、１４．に記載のｒＡＡＶ。
１６． ベクターが１つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、１３．に記載のｒＡＡＶ。
１７． 前記エンハンサーが同じであるかまたは異なっている、１６．に記載のｒＡＡＶ。
１８． 前記エンハンサーが、イントロン、ＣＭＶエンハンサー、およびアルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーからなる群から選択される、１６．に記載のｒＡＡＶ。
１９． 選択されたエンハンサーの２つ以上のコピーが前記ベクター中に存在する、１８．に記載のｒＡＡＶ。
２０． 前記エンハンサーの前記２つ以上のコピーが縦列して位置する、１９．に記載のｒＡＡＶ。
２１． 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシドを含む、１３．に記載のｒＡＡＶ。
２２． 前記ｒＡＡＶが偽型である、２１．に記載のｒＡＡＶ。
２３． 前記ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、２２．に記載のｒＡＡＶ。
２４． 組換えアデノ随伴ウイルス粒子ＡＡＶ２／８．ＴＢＧ．ｈＩＤＵＡ．ｃｏ。
２５． １３～２４．のいずれか一項に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む、ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を治療するために有用な組成物。
２６． ムコ多糖症Ｉ型を治療するための方法であって、薬学的に許容される担体および１３～２４．のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを含む有効量の組成物を送達することを含む方法。
２７． 前記ｒＡＡＶが静脈内送達される、２５．に記載の方法。
２８． ｒＡＡＶの約３×１０⁹～約３×１０¹²のゲノムコピーが被験体に送達される、
１．に記載の方法。
２９． ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）の治療に使用するための、１３～２４．のいずれか一項に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む組成物の使用。

Claims (15)

1. 宿主細胞中での組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の生成方法であって、
   少なくとも（ａ）ヒトα-Ｌ-イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子の発現を制御する調節配列の制御下にあるｈＩＤＵＡ遺伝子を含んでなる発現カセット、（ｂ）宿主細胞中でｒｅｐタンパク質の発現を駆動する調節配列に作動的に連結されたｒｅｐ配列；および（ｃ）宿主細胞中でＡＡＶカプシドの発現を駆動する調節配列に作動的に連結されたＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、並びに、ＡＡＶカプシドへ発現カセットをパッケージングするための十分なヘルパー配列、を含む宿主細胞を培養することを含んでなり、
   ここで、前記発現カセットは、前記発現カセットの５’末端でＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に及び前記発現カセットの３’末端でＡＡＶ３’ＩＴＲ配列に、隣接しており、そして、前記ｈＩＤＵＡ遺伝子は、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする、配列番号１の配列か又は配列番号１に対して少なくとも約９５％同一の配列、を有しており、
   ここで、前記宿主細胞は、前記ｒｅｐ及びカプシドタンパク質を発現して、組み立てられたカプシド中に前記発現カセットをパッケージングしてｒＡＡＶ粒子を生成する、
   上記方法。
2. 更にｒＡＡＶ粒子を精製することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
3. 前記宿主細胞が、哺乳動物細胞培養および原核細胞培養から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 前記機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼが、
   （ａ）配列番号２のアミノ酸１～アミノ酸６５３と、
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸２７～アミノ酸６５３に融合した異種リーダー配列を含む合成ヒト酵素と、
   （ｃ）アミノ酸位置８２でのＨからＱへの縮小（配列番号８）；位置１０５でのＲからＱへの変化（配列番号９）；位置１１６でのＧからＲへの変化（配列番号１０）；位置２７９でのＶからＡへの変化（配列番号１１）；位置３４６でのＬからＲへの変化（配列番号１２）；位置３６１でのＡからＴへの変化（配列番号１３）；位置４４９でのＨからＮへの変化（配列番号１４）；位置４５４でのＶからＩへの変化（配列番号１５）；位置５９１でのＡからＴへの変化（配列番号１６）；および位置６２２でのＡからＴへの変化（配列番号１７）を含む改変の１つまたは複数を有する、配列番号２のアミノ酸配列の変異体と、
   からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記調節配列が肝臓特異的プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記肝臓特異的プロモーターがチロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ＡＡＶ５’及びＡＡＶ３’ＩＴＲ配列が完全長ＩＴＲまたは自己相補的ＩＴＲである、請求項１に記載の方法。
10. 請求項１～９のいずれかに記載の方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子。
11. （ａ）ヒトα-Ｌ-イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）遺伝子の発現を制御する調節配列の制御下にあるｈＩＤＵＡ遺伝子を含んでなる発現カセット、（ｂ）ｒｅｐ配列；および（ｃ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、並びに、ＡＡＶカプシドへ発現カセットをパッケージングするための十分なヘルパー配列、を含む宿主細胞であって、
    ここで、前記発現カセットは、前記発現カセットの５’末端でＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に及び前記発現カセットの３’末端でＡＡＶ３’ＩＴＲ配列に、隣接しており、そして、前記ｈＩＤＵＡ遺伝子は、機能的なヒトα－Ｌ－イズロニダーゼをコードする、配列番号１の配列か又は配列番号１に対して少なくとも約９５％同一の配列、を有している、
    上記宿主細胞。
12. 前記調節配列が肝臓特異的プロモーターを含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
13. 前記肝臓特異的プロモーターがチロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである、請求項１２に記載の宿主細胞。
14. ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）の治療に使用するための医薬組成物であって、請求項１～９のいずれか１に記載の方法によって生成されたか又は請求項１１～１３のいずれか１に記載の宿主細胞から生成された有効量のｒＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される担体とを含む、上記組成物。
15. 前記ｒＡＡＶが、１ｋｇ当たり３×１０⁹～３×１０¹³ＡＡＶゲノムコピーのｒＡＡＶ粒子を含む用量に処方される、請求項１４に記載の使用のための医薬組成物。

Images