JP7028904B2 - 合成ペプチド、それを備える薬学的組成物及び血栓塞栓症関連疾患の治療におけるその使用 - Google Patents
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Description
便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の語はその複数形を含むものとし、複数形の語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」及び「an」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも1つの」及び「1以上の」は、同じ意味を有し、1、2、3又はそれ以上を含む。
X/Y×100%
ここで、Xは、そのプログラムのA及びBのアライメントにおいて配列アライメントプログラムBLASTによる完全な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Yは、いずれか短い方のA又はBにおけるアミノ酸残基の合計数である。
本開示は、アミノ酸配列FQNEWFHNFLHD(配列番号1)、TEANLSSWVFAR(配列番号2)及びLQKNPFDLVQIL(配列番号3)をそれぞれ備える3つの合成ペプチドが血栓に対する結合親和性及び特異性を示すという発見に少なくともある程度基づく。したがって、本開示は、合成ペプチドを備える生体分子及び血栓の治療におけるその使用を提供することを目的とする。
ファージディスプレイバイオパニング
ヒト血栓は、約20年前に未固定の死体解剖の過程において死体から分離及び採取され、部分的血栓を粉末にしてから、2×1011個のファージとともに1%BSA含有PBSにおいて4℃で1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、結合したファージを以降の選択ラウンドのために、血栓組織から溶出して大腸菌を使用して増幅した。溶出及び増幅されたファージを、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)及びX-Gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-D-ガラクトシド)を含有する溶原性ブロス(LB)培地プレートにおいて滴定した。血栓ELISAのスクリーニングのためにファージクローンをランダムに選択する前に、上記のバイオパニングのステップを5回繰り返した。
コーティングバッファー中の粉砕ヒト血栓組織又はBSAを使用して、96ウェルのELISAプレートを一晩コーティングした。ブロッキングして洗浄した後、選択されたファージクローンを添加して、室温(RT)で1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、各ウェルをホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識化マウスの抗M13抗体(1:2000希釈)で室温で1時間プローブ分析した。洗浄ステップを繰り返した後、プレートをELISA基質溶液と反応させた。反応を3N塩酸で停止させ、比色基質の吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して450nmで分析した。
マウスの全血を採取し、HUVEC細胞(2×105~2×106個の細胞)を選択されたファージ(5×109~5×109pfu)とともに4℃で1時間インキュベートした。そして、サンプルを抗M13モノクローナル抗体とともに4℃で1時間インキュベートし、続いてFITC又はPE標識化抗マウスFab抗体(Abs)とともに4℃で30分間インキュベートした。蛍光プロファイルをフローサイトメトリーによって分析した。FITC及びPEを488nmレーザで励起し、蛍光発光を、それぞれグリーンチャネルフィルター(530/30)及びイエローチャネルフィルター(585/42)を使用して測定した。
マウスを麻酔し、10%FeCl3に浸漬された紙を右頸静脈に5~10分間挿入することにより血栓を誘発した。そして、マウスに5×109pfuのファージを静脈内注入した。10分間インキュベートした後、マウスを屠殺し、50mlのPBSで灌流して未結合のファージを除去した。臓器及び血栓を摘出し、サンプル中のファージをIPTG/X-Galプレート上の大腸菌細胞で力価測定した。さらに、血栓及び臓器を最適な切断温度(O.C.T.)コンパウンドに埋め込み、免疫組織化学用の切片を調製した。
生体内ファージホーミング実験からの組織サンプルをスライスしてスライド上に載置し、O.C.T.を除去し、1%BSAで30分間インキュベートして非特異的結合をブロックする前に、4%パラホルムアルデヒドでサンプルを固定した。洗浄した後、切片を1:250の希釈率でマウス抗M13抗体とともに1時間インキュベートし、続いてポリマーベースのSUPER SENSITIVE(登録商標)IHC検出システムで処置した。簡単に説明すると、切片をSuper Enhancer試薬で20分間及びポリ-HRP試薬で30分間インキュベートした。ペルオキシダーゼ活性を可視化するようにDABを色素原として使用し、サンプルをヘマトキシリンで対比染色し、封入剤で封入し、光学顕微鏡で検査した。
ヒト組換えtPA及びペプチド-融合tPAを発現ベクターにクローニングした。プラスミドを293細胞に個別にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を無血清培地において37℃で1週間継続的にインキュベートし、組換えタンパク質を生成した。次に、培養培地を回収し、遠心分離し、0.45μmの濾過膜に通した。上清中のタンパク質をカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物をPBSで透析した後、精製したタンパク質をクマシーブルー染色によるSDS-PAGEによって検査した。タンパク質濃度を評価した。
蛍光定量の動的なELISAにおいてtPAタンパク質活性を測定するために、アッセイバッファー(50mM Tris、0.01%Tween-20、pH8.5)において、5ng/μlのtPA又は標的ペプチド-tPA融合物を100μMのZ-Gly-Gly-Arg-AMCペプチド基質と混合した。酵素活性を380nm励起及び460nm発光での蛍光分光光度計によって測定した。
50マイクログラムのtPA又は標的ペプチド-tPA融合物及び4nMのHILYTE FLUOR(登録商標)750を、接合を促進するように室温で45分間混合した。溶液を3.5-kDa-カットオフメンブレンにより4℃で一晩透析した。HILYTE FLUOR(登録商標)750標識化tPA又は標的ペプチド-tPA融合タンパク質を静脈内注入後の血栓を有するマウスにおいて、経時的な蛍光測定を行った。蛍光画像を、撮像システムを用いて撮影した。血栓におけるHILYTE FLUOR(登録商標)750の蓄積を、バックグラウンドの蛍光強度を減少させることによって定量化した。
50マイクログラムの血栓親和性ペプチド-tPAを4nMのHILYTE FLUOR(登録商標)750と混合し、接合を促進するように暗所において室温で45分間インキュベートした。過剰な色素を除去するように、3.5-kDa-カットオフメンブレンによって4℃で一晩透析を行った。HILYTE FLUOR(登録商標)750標識化融合タンパク質又はtPAを静脈内に注入した後、赤外蛍光画像の経時変化を取得した。HILYTE FLUOR(登録商標)750結合タンパク質の赤外蛍光画像を、撮像システムを用いて生体において撮影した。誘発された血栓におけるHILYTE FLUOR(登録商標)750蛍光シグナルの蓄積をソフトウェアによって定量化及び分析した。
マウスを37℃の加温パッド上に仰向けに載置し、イソフルランで麻酔した。tPA又は標的ペプチド-tPA融合物(2~10mg/kg)を注入する前に、右外頸静脈の血栓症における血流の測定を20分間行った。そして、tPA又は標的ペプチド-tPA融合物の注入の直前及び実験期間を通して、レーザードップラースキャナを使用して血流を評価した。
右内頸動脈の血栓症の血流の測定を行った。外科的処置の前にマウスをアベルチンで麻酔し、イソフルランで維持した。tPA又は標的ペプチド-tPA融合物(2~10mg/kg)を注入する前及び実験期間を通してカラードップラーを行い、血流を分析した。
マウスMCAOモデルを、軽微な修正によって確立した。簡潔に説明すると、10週齢のC57BL/6マウスの体重を測定し、10%イソフルランで麻酔した。前頸部の皮膚を切開して、総頸動脈、内頸動脈及び外頸動脈を露出させ、そして迷走神経から分離した。総頸動脈分岐部の上流に血管クリップを載置し、内頸動脈上に小さな吸入口を作製した。ナイロン縫合糸を使用して中頸動脈を45分間閉塞し、その後縫合糸を除去した。モデルの成功はレーザードップラー流量計によって確認され、脳の内頸動脈の血流は30%以上減少した。マウスの脳を、水平ボアMRIシステムによって薬物送達後24時間で画像形成した。コントラストT2強調スピンエコー画像を撮影した(TR=400ms、TE=10.8ms、FOV=2×2cm、NEX=8、スライス厚0.8mm)。SNRを、ROI(平均画素強度)の信号をバックグラウンドノイズの標準偏差で除算することによって計算した。
1.1 ファージディスプレイ技術による新規ペプチドの選択
血栓症を特異的に標的とするペプチドを同定するために、ファージディスプレイペプチドライブラリを採用して血栓に結合するペプチドを選択した。5ラウンドのバイオパニングの後、血栓結合ファージの力価は106倍まで増加した(図1A)。バイオパニングの第5ラウンドからの72個のファージクローンのスクリーニングを行い、ファージクローンPC30、PC39、PC44、PC45及びPC66を、それらの比較的高い結合親和性に基づいて選択した(図1B)。非血栓組織に非特異的に結合するペプチドの選択を回避するように、全血細胞及びHUVECをフローサイトメトリーによる対抗選択についての陰性対照物として使用した(データ不図示)。ELISAによる用量依存的結合の分析により、陰性対照物としてBSAの結合を用いて(図1D)、ファージクローンPC30(FQNEWFHNFLHD;配列番号1)、PC39(TEANLSSWVFAR;配列番号2)及びPC66(LQKNPFDLVQIL;配列番号3)が最良の血栓特異的結合を示すことが明らかとなった(図1C)。
3つの選択されたファージの生体内での血栓結合を特徴付けるために、実施例1.1で選択されたファージを、右頸静脈に誘発された血栓を有するマウスに注入した(図2A)。ELISA(図2B)及びファージの力価アッセイ(図2C)によって、誘発された血栓においてはファージが高度に蓄積されるが、脳、肺、心臓、肝臓及び腎臓などの臓器は非特異的なファージ結合が低いレベルを示すことが明らかとなった。免疫組織化学によって、選択されたファージは独占的に血栓に存在し、正常な臓器には検出されなかったことが確認された(図3)。
2.1 融合タンパク質の調製
生体内において血栓へのtPAを特異的に標的とするために、この実施例において融合タンパク質を構築した。N末端からC末端に、融合物は、マウスIg kappaからの分泌シグナル、(PC30又はPC66からの)選択された血栓結合ペプチド、可動性グリシンリッチリンカー(GGGGS)、tPA、検出用のmycタグ及び精製用のHisタグを備えた。PC30及びPC66のファージクローンからの血栓標的ペプチドを、以下ではそれぞれSP30及びSP66という。
この実施例では、生体マウスにおけるSP30/SP66-tPAの局在化及び局所濃度を直接モニタリングするように、赤外蛍光プローブ(HILYTE FLUOR(登録商標)750)をSP30-tPA及びSP66-tPAに接合させた。
血栓結合ペプチド-tPA融合タンパク質が脳卒中疾患モデルにおいてtPAよりも血流を回復させるか否かを検査する目的のために、この実施例ではマウスMCAOモデルを採用した。MCAOを行い、マウスをtPA又はSP30/SP66-tPA融合タンパク質で処置した。薬物投与24時間後のMCAOマウスの脳のT2強調MRIによると、SP30-tPAを注入したマウスの脳梗塞の面積は、対照物(PBS)又はtPAのみを注入したこれらのマウスの脳梗塞の面積と比較して小さかった(図6)。これらの結果は、血栓への標的tPAが脳卒中誘発性組織損傷に対するその効果を改善できることを示唆した。
Claims (13)
- FQNEWFHNFLHD(配列番号1)、TEANLSSWVFAR(配列番号2)又はLQKNPFDLVQIL(配列番号3)のアミノ酸配列を含む、合成ペプチド。
- 請求項1に記載の合成ペプチドと、請求項1に記載の合成ペプチドに結合された治療剤と、を具備し、前記治療剤が、抗凝固剤又は血栓溶解剤である、抗血栓剤。
- グリシン(G)及びセリン(S)残基を具備するリンカーをさらに具備し、前記治療剤が、前記リンカーを介して請求項1に記載の合成ペプチドに結合される、請求項2に記載の抗血栓剤。
- 前記抗凝固剤が、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、フェニンジオン、ブロジファクム、ジフェナクム、ヘパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン、クマジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル又はプラスグレルである、請求項2に記載の抗血栓剤。
- 前記血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼである、請求項2に記載の抗血栓剤。
- 前記tPAが、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼである、請求項5に記載の抗血栓剤。
- 請求項1に記載の合成ペプチド又は前記治療剤に結合されるレポーター分子をさらに具備し、前記レポーター分子が、タグ分子、放射性分子、蛍光分子、燐光分子又は化学発光分子である、請求項2に記載の抗血栓剤。
- 前記合成ペプチドの上流に配置されて接続されているシグナルペプチドをさらに具備する請求項2に記載の抗血栓剤。
- それを必要とする被検体において、血栓塞栓症関連疾患を予防及び/又は治療するための薬学的組成物であって、請求項2に記載の抗血栓剤及び薬学的に許容可能な賦形剤を具備する薬学的組成物。
- 前記抗凝固剤が、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、フェニンジオン、ブロジファクム、ジフェナクム、ヘパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン、クマジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル又はプラスグレルである、請求項9に記載の薬学的組成物。
- 前記血栓溶解剤が、tPA、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼである、請求項9に記載の薬学的組成物。
- 前記tPAが、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼである、請求項11に記載の薬学的組成物。
- 前記被検体がヒトである、請求項9に記載の薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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