JP7025070B1 - 血液由来成長因子含有組成物及びその調製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】創傷治癒や組織再生に対してより効果的な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法を提供する。【解決手段】本発明のある形態は、哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法である。当該方法は、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、を含む。【選択図】なし
Description
本発明は、血液由来成長因子含有組成物及びその調製方法に関する。
自己の血液を遠心分離することで調製される血小板を濃縮した血漿、多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ：以下、「ＰＲＰ」とも呼ぶ）を用いる治療法がある。この多血小板血漿は、多種の成長因子を豊富に含む。これら成長因子が創傷治癒や組織再生に効果的な役割を果たすため、多血小板血漿は再生医療分野において有望な材料である（例えば、特許文献１）。
ＰＲＰの調製には、血小板を活性化し、血小板に含まれる成長因子等を放出させる工程が含まれる。血小板の活性化には、血小板由来因子放出刺激物質、例えば、トロンビン、塩化カルシウムが用いられている。
本発明は、創傷治癒や組織再生に対して効果的な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法の提供を主課題とする。更には、本発明は、投与時の強い痛みを緩和可能な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法の提供を副課題とする。
本発明者らは、前記主課題について鋭意研究した結果、特定の成長因子｛血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：以下、「ＶＥＧＦ」とも呼ぶ）｝及びその量に着目することが重要であることを見出した。更に、本発明者らは、原料及びプロセスの無数の組み合わせの中、特定の原料及びプロセス（キレート剤の使用、バフィーコート層を採取、凍結融解）を選択することで、前記特定の成長因子を所望量以上含有する血液由来成長因子含有組成物を調製することが可能であることを見出した。更に、本発明者らは、前記副課題についても鋭意研究した結果、所定サイズのフィルターで濾過処理も併せて実施することで、投与時の強い痛みを緩和可能な血液由来成長因子含有組成物を調製することができることを見出した。具体的には、下記発明である。
すなわち、本発明によれば、
〔１〕 哺乳類の血液から調製された血液由来成長因子含有組成物であって、成長因子ＶＥＧＦの含有量が１００ｐｇ／ｍＬ以上である血液由来成長因子含有組成物；
〔２〕 抗炎症性サイトカイン：インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：以下、「ＩＬ－１Ｒａ」とも呼ぶ）の含有量が１００ｐｇ／ｍＬ以上である、前記〔１〕記載の血液由来成長因子含有組成物；
〔３〕 炎症性サイトカイン：インターロイキン－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β：以下、「ＩＬ－１β」とも呼ぶ）、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６：以下、「ＩＬ－６」とも呼ぶ）、及び腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α：以下、「ＴＮＦ－α」とも呼ぶ）の含有量が、それぞれ、１０ｐｇ／ｍＬ以下、１０ｐｇ／ｍＬ以下、２０ｐｇ／ｍＬ以下である、前記〔１〕又は〔２〕記載の血液由来成長因子含有組成物；
〔４〕 成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、１：１～５０である、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の血液由来成長因子組成物；
〔５〕 成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、１：０．００１～０．０５である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の血液由来成長因子組成物；
〔６〕 凍結乾燥状態にある、前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の血液由来成長因子組成物；
〔７〕 哺乳類の血液から血液由来成長因子組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、を含む方法；
〔８〕 前記抗凝固剤が、クエン酸、ＥＤＴＡ、又はこれらの塩を含む、前記〔７〕記載の方法；
〔９〕 前記血液から多血小板血漿を分離する工程が、前記血液について１００～１０００Ｇ、１～３０分による第１の遠心分離処理を施して血漿画分及びバフィーコートを含む上層部を回収すること；及び、前記上層部について１０００～２５００Ｇ、１～３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板及びバフィーコート成分をペレット化する；上清を除去し、前記血小板及び前記バフィーコート成分を懸濁して前記多血小板血漿を得ること；を含む、前記〔７〕又は〔８〕記載の方法；
〔１０〕 前記上層部を回収する工程において、全液量の体積を基準として、回収する体積比が、１：０．１～０．５である、前記〔９〕記載の方法；
〔１１〕 前記上清を除去する工程において、ペレットの体積を基準として、体積比が１：１～１０の体積量の上清を残しそれ以外を除去する、前記〔９〕又は〔１０〕記載の方法；
〔１２〕 前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程が、－２００℃～－２０℃、１０分以上の処理による凍結と、その後の２０℃～５０℃、１０分以上の処理による融解により行われる、前記〔７〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法；
〔１３〕 前記多血小板血漿を分離する工程の前に、前記抗凝固剤を添加された血液を０～１０℃で予冷蔵する工程をさらに含む、前記〔７〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法；
〔１４〕 活性化された前記多血小板血漿を、孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性した前記多血小板血漿に濾過処理を施す工程を更に含む、前記〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法；
〔１５〕 活性化された前記多血小板血漿を凍結乾燥する工程を更に含む前記〔７〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法
が提供される。
〔１〕 哺乳類の血液から調製された血液由来成長因子含有組成物であって、成長因子ＶＥＧＦの含有量が１００ｐｇ／ｍＬ以上である血液由来成長因子含有組成物；
〔２〕 抗炎症性サイトカイン：インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：以下、「ＩＬ－１Ｒａ」とも呼ぶ）の含有量が１００ｐｇ／ｍＬ以上である、前記〔１〕記載の血液由来成長因子含有組成物；
〔３〕 炎症性サイトカイン：インターロイキン－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β：以下、「ＩＬ－１β」とも呼ぶ）、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６：以下、「ＩＬ－６」とも呼ぶ）、及び腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α：以下、「ＴＮＦ－α」とも呼ぶ）の含有量が、それぞれ、１０ｐｇ／ｍＬ以下、１０ｐｇ／ｍＬ以下、２０ｐｇ／ｍＬ以下である、前記〔１〕又は〔２〕記載の血液由来成長因子含有組成物；
〔４〕 成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、１：１～５０である、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の血液由来成長因子組成物；
〔５〕 成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、１：０．００１～０．０５である、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の血液由来成長因子組成物；
〔６〕 凍結乾燥状態にある、前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の血液由来成長因子組成物；
〔７〕 哺乳類の血液から血液由来成長因子組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、を含む方法；
〔８〕 前記抗凝固剤が、クエン酸、ＥＤＴＡ、又はこれらの塩を含む、前記〔７〕記載の方法；
〔９〕 前記血液から多血小板血漿を分離する工程が、前記血液について１００～１０００Ｇ、１～３０分による第１の遠心分離処理を施して血漿画分及びバフィーコートを含む上層部を回収すること；及び、前記上層部について１０００～２５００Ｇ、１～３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板及びバフィーコート成分をペレット化する；上清を除去し、前記血小板及び前記バフィーコート成分を懸濁して前記多血小板血漿を得ること；を含む、前記〔７〕又は〔８〕記載の方法；
〔１０〕 前記上層部を回収する工程において、全液量の体積を基準として、回収する体積比が、１：０．１～０．５である、前記〔９〕記載の方法；
〔１１〕 前記上清を除去する工程において、ペレットの体積を基準として、体積比が１：１～１０の体積量の上清を残しそれ以外を除去する、前記〔９〕又は〔１０〕記載の方法；
〔１２〕 前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程が、－２００℃～－２０℃、１０分以上の処理による凍結と、その後の２０℃～５０℃、１０分以上の処理による融解により行われる、前記〔７〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法；
〔１３〕 前記多血小板血漿を分離する工程の前に、前記抗凝固剤を添加された血液を０～１０℃で予冷蔵する工程をさらに含む、前記〔７〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法；
〔１４〕 活性化された前記多血小板血漿を、孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性した前記多血小板血漿に濾過処理を施す工程を更に含む、前記〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法；
〔１５〕 活性化された前記多血小板血漿を凍結乾燥する工程を更に含む前記〔７〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法
が提供される。
本発明によれば、創傷治癒や組織再生に対して効果的な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法を提供することができる。更には、本発明によれば、投与時の強い痛みを緩和可能な血液由来成長因子含有組成物及び前記血液由来成長因子含有組成物の調製方法をも提供することができる。
以下、本発明について詳述する。以下、本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物の調製方法を説明し、次いで、前記調製方法により得られる、本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物を説明する。
≪血液由来成長因子含有組成物の調製方法≫
本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物の調製方法は、哺乳類の血液から血液由来成長因子組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程（以下、「添加工程」とも呼ぶ）と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程（以下、「分離工程」とも呼ぶ）と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程（以下、「凍結融解工程」とも呼ぶ）と、を少なくとも含む方法である。ここで、「哺乳類の血液」とは、成長因子が含有されていれば特に制限されず、好ましくはヒト由来である。また、前記「哺乳類の血液」は好ましくは自己由来である。以下、上述した各工程について詳述する。
本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物の調製方法は、哺乳類の血液から血液由来成長因子組成物を調製する方法であって、金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程（以下、「添加工程」とも呼ぶ）と、前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程（以下、「分離工程」とも呼ぶ）と、前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程（以下、「凍結融解工程」とも呼ぶ）と、を少なくとも含む方法である。ここで、「哺乳類の血液」とは、成長因子が含有されていれば特に制限されず、好ましくはヒト由来である。また、前記「哺乳類の血液」は好ましくは自己由来である。以下、上述した各工程について詳述する。
＜添加工程＞
本実施形態の方法においては、金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤が添加された血液を使用する。抗凝固剤は、採取された血液に後から添加してもよいが、予め抗凝固剤を含む採血管又は採血バッグ等の容器に血液を採取することが望ましい。
本実施形態の方法においては、金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤が添加された血液を使用する。抗凝固剤は、採取された血液に後から添加してもよいが、予め抗凝固剤を含む採血管又は採血バッグ等の容器に血液を採取することが望ましい。
金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤としては、金属イオン（例えばカルシウムイオン）とキレート錯体を形成する化合物、例えば、ポリカルボン酸及びその塩が挙げられる。ポリカルボン酸としては、クエン酸及びＥＤＴＡ等が挙げられる。ポリカルボン酸塩としては、クエン酸２Ｎａ（クエン酸塩）、ＥＤＴＡ－２Ｋ、及びＥＤＴＡ－２Ｎａ等のＥＤＴＡ塩が挙げられる。
抗凝固剤は、固体のまま添加してもよいが、当該抗凝固剤を純水などの溶媒（生理学的に許容されるものが好ましい）に溶解させた溶液として添加してもよい。全血に抗凝固剤を添加した後のもの（全血＋抗凝固剤、又は全血＋抗凝固剤溶液）における抗凝固剤最終濃度は、クエン酸２Ｎａの場合には、好ましくは０．５～１．５質量％、さらに好ましくは０．８～１．０質量％であり、ＥＤＴＡ-２Ｋの場合には、好ましくは０．５～２．０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１．１～１.７ｍｇ／ｍＬであり、ＥＤＴＡ-２Ｎａの場合には、好ましくは０．５～２．０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１．０～１．５ｍｇ/ｍＬである。
＜予冷蔵工程＞
本実施形態の方法は、金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤が添加された血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、抗凝固剤が添加された血液を予冷蔵する工程をさらに含んでもよい。血液を予冷蔵する工程における冷蔵温度は、例えば、０～１０℃である。血液を予冷蔵する工程の工程時間は、例えば、０時間超７２時間以下である。当該工程時間の下限値は、３０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、８時間以上としてもよい。当該工程時間の上限値は、６０時間以下、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下としてもよい。
本実施形態の方法は、金属イオンとキレート錯体を形成する抗凝固剤が添加された血液から多血小板血漿を分離する工程の前に、抗凝固剤が添加された血液を予冷蔵する工程をさらに含んでもよい。血液を予冷蔵する工程における冷蔵温度は、例えば、０～１０℃である。血液を予冷蔵する工程の工程時間は、例えば、０時間超７２時間以下である。当該工程時間の下限値は、３０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、８時間以上としてもよい。当該工程時間の上限値は、６０時間以下、４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下としてもよい。
＜分離工程＞
本実施形態の方法は、抗凝固剤が添加された血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程を含む。ここで、「バフィーコート」とは、血液を遠心分離したとき赤血球と血漿画分の中間にできる白血球を多く含んだ薄く白い層を指す。また、「バフィーコート成分を含む」とは、バフィーコートの少なくとも一部を含むことを意味する。
本実施形態の方法は、抗凝固剤が添加された血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程を含む。ここで、「バフィーコート」とは、血液を遠心分離したとき赤血球と血漿画分の中間にできる白血球を多く含んだ薄く白い層を指す。また、「バフィーコート成分を含む」とは、バフィーコートの少なくとも一部を含むことを意味する。
この分離工程の間において、血液及び多血小板血漿の温度は、４～２５℃に制御することが好ましい。
血液（全血）から多血小板血漿を分離する手段に制限はなく、公知の任意の手段が使用可能である。通常は、血液について比較的低速度の第１の遠心分離処理を施して、赤血球を含む画分と、バフィーコートと、多血小板血漿（ＰＲＰ）と、少血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｐｏｏｒ ｐｌａｓｍａ）とに分離して、多血小板血漿が得られる。ここで、分離工程は、比較的低速度の第１の遠心分離処理と比較的高速度の第２の遠心分離処理を含むことが好適である。第１の遠心分離処理及び第２の遠心分離処理は、それぞれ独立して複数回実行してもよい。または、比較的低速度の第１の遠心分離処理単独によって多血小板血漿及びバフィーコートを取得してもよい。以下、第１の遠心分離処理、第２の遠心分離処理並びに血小板及びバフィーコート成分の濃縮・純化処理を詳述する。
（第１の遠心分離処理）
比較的低速度の第１の遠心分離処理は、１００～１０００Ｇ（通常の遠心分離器においては２００～２０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。回転条件は、１５０～７５０Ｇ、２００～５００Ｇとしてもよい。処理時間は、１～３０分、５～２０分、１０～１５分としてもよい。
比較的低速度の第１の遠心分離処理は、１００～１０００Ｇ（通常の遠心分離器においては２００～２０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。回転条件は、１５０～７５０Ｇ、２００～５００Ｇとしてもよい。処理時間は、１～３０分、５～２０分、１０～１５分としてもよい。
比較的低速度の第１の遠心分離処理後、血漿画分全て（多血小板血漿及び少血小板血漿）及びバフィーコートを含む上層部を回収する。
前記上層部を回収する工程は、赤血球を含む画分を（例えば視認上）可能な限り含まないように、任意の体積量を回収できる。具体的には、例えば、全液量の体積を基準として、回収する前記上層部の体積比が好ましくは１：０．１～０．５であり、より好ましくは１：０．２～０．５であり、さらに好ましくは１：０．３～０．５である。
（第２の遠心分離処理）
血小板及びバフィーコート成分が、第１の遠心分離処理後に回収した前記上層部について比較的高速度の第２の遠心分離処理によってペレット化される。
血小板及びバフィーコート成分が、第１の遠心分離処理後に回収した前記上層部について比較的高速度の第２の遠心分離処理によってペレット化される。
比較的高速度の第２の遠心分離処理は、１０００～２５００Ｇ（通常の遠心分離器においては２０００～５０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。回転条件は、１１００～２０００Ｇ、１２００～１５００Ｇとしてもよい。処理時間は、１～３０分、５～２０分、１０～１５分としてもよい。
（血小板及びバフィーコート成分の純化・濃縮処理）
第２の遠心分離処理により得られたものから上清を除去し、その後、懸濁させることで、血小板及びバフィーコート成分を純化・濃縮することができる。ここで、上清を除去する工程では、任意の体積量を除去できる。具体的には、例えば、ペレットの体積を基準として、体積比が好ましくは１：１～１０であり、より好ましくは１：１～５であり、さらに好ましくは１：１～３の体積量の上清を残しそれ以外を除去できる。
第２の遠心分離処理により得られたものから上清を除去し、その後、懸濁させることで、血小板及びバフィーコート成分を純化・濃縮することができる。ここで、上清を除去する工程では、任意の体積量を除去できる。具体的には、例えば、ペレットの体積を基準として、体積比が好ましくは１：１～１０であり、より好ましくは１：１～５であり、さらに好ましくは１：１～３の体積量の上清を残しそれ以外を除去できる。
＜凍結融解工程＞
本工程によって、多血小板血漿が活性化され、多数の成長因子及び抗炎症性サイトカインが放出される。
本工程によって、多血小板血漿が活性化され、多数の成長因子及び抗炎症性サイトカインが放出される。
多血小板血漿を活性化する方法として、薬剤添加が知られている。多血小板血漿を活性化する薬剤としては、一般的には、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウムイオン源化合物が挙げられる。本実施形態の方法においては、薬剤添加によらず、凍結融解により、多血小板血漿の活性化を達成できる。このため、カルシウムイオン源化合物の使用を極力減らし、添加物を最小限にできる。
多血小板血漿の凍結は、多血小板血漿を凍結が起こる低温に暴露することにより行うことができる。具体的には、多血小板血漿を、例えば、－１０℃以下、－２０℃以下、－１００℃以下、又は－２００℃以下、好ましくは－２０℃～－２００℃の温度条件下に置くことにより凍結させることができる。これは液体窒素との接触やフリーザー中での保存によって実行されてもよい。
多血小板血漿を凍結して血小板を活性化する工程の時間は、特に制限はない。当該凍結する工程時間は、１分以上、５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、２５分以上、３０分以上としてもよい。他方、１８０分以下、１５０分以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下としてもよい。具体的には、例えば、多血小板血漿を含む容器を液体窒素中に１分以上浸漬することにより凍結を実施することができる。
多血小板血漿の融解は、多血小板血漿を融解が起こる温度に暴露することにより行うことができる。具体的には、凍結した多血小板血漿を、例えば、２０℃以上、２５℃以上、又は３０℃以上、かつ５０℃以下、４０℃以下、又は３８℃以下、好ましくは２０℃～５０℃の温度条件下に置くことにより融解を行うことができる。多血小板血漿を融解して血小板を活性化する工程の時間は、特に制限はない。当該融解する工程時間の下限値は、１分以上、５分以上、１０分以上、１５分以上、２０分以上、２５分以上、３０分以上としてもよい。他方、当該融解する工程時間の上限値は、１８０分以下、１５０分以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下としてもよい。具体的には、例えば、多血小板血漿を含む容器を室温で１０分～３０分静置することにより血小板を活性化することができる。
活性化させた多血小板血漿に溶媒を添加して、再懸濁してもよい。再懸濁させる溶媒は、生理学的に許容されるものであれば任意である。例えば、血漿、生理食塩水、緩衝生理食塩水｛例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）｝、リンゲル液（例えば乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液）などが挙げられる。なお、いずれの溶媒に再懸濁させたいずれの血小板再懸濁液も、本明細書においては『多血小板血漿』と表現する。また濃度調整や添加剤の配合などを目的として、この再懸濁液に上記溶媒をさらに添加してもよく、添加後の液も『多血小板血漿』と表現する。
＜細胞除去工程＞
本実施形態の方法は、多血小板血漿から血液細胞を除去する工程をさらに含んでもよい。
本実施形態の方法は、多血小板血漿から血液細胞を除去する工程をさらに含んでもよい。
この細胞除去工程の間において、多血小板血漿は４～２５℃に制御することが好ましい。
多血小板血漿は血小板を含んでいる。また、本実施形態の方法によると、当該多血小板血漿は、バフィーコート由来の白血球も含む。さらに、当該多血小板血漿は僅かな量の赤血球を含む場合もある。
血液細胞を除去する手段は、例えば、加熱処理、酸処理、フィルタリング処理等が挙げられる。これらのうち、成長因子の変性を招くリスクが小さいことからフィルタリング処理が好ましい。すなわち本工程は、フィルタリング処理によって多血小板血漿から血液細胞を除去する濾過処理工程であることが好ましい。
フィルタリング処理に使用するフィルターは、血液細胞を除去できるものであれば制限はない。血液細胞の大きさは、血小板が約２μｍで最も小さいため、例えば、孔径が１μｍ以下、０．７μｍ以下、０．５μｍ以下のメンブレンフィルターを使用することができる。なお、メンブレンフィルターの孔径の下限値に制限はないが過度に小さいものは目詰まりを起こすリスクが大きくなる。そのため、孔径は０．２μｍ以上、０．３μｍ以上、０．４μｍ以上が好ましい。通常市販されているメンブレンフィルターのうち、この範囲を満たすものとしては孔径が約０．２μｍのメンブレンフィルターと孔径が約０．４５μｍのメンブレンフィルターがある。本実施形態においてはいずれも使用可能であり、孔径が約０．４５μｍのメンブレンフィルターが最適なメンブレンフィルターである。
フィルタリング処理は、前述のフィルターが設けられた遠心分離用チューブを用いた遠心分離によって実行されてもよい。この際の遠心分離は、例えば、８００～１８００Ｇ（通常の遠心分離器においては１５００～４０００ｒｐｍ程度に相当）の遠心分離である。工程時間は、例えば、１～３０分、５～１５分、１０分である。
この処理の結果、フィルターを通過した、血液細胞を実質的に含まない多血小板血漿を得ることができる。
＜凍結乾燥工程＞
本実施形態の方法は、多血小板血漿を凍結乾燥する工程をさらに含んでもよい。
本実施形態の方法は、多血小板血漿を凍結乾燥する工程をさらに含んでもよい。
凍結乾燥の手法は、従来周知のタンパク質の凍結乾燥手法であれば特に制限はない。
凍結乾燥は、多血小板血漿を冷凍処理し、その後真空凍結乾燥処理を行う。
冷凍処理において、多血小板血漿の温度又は環境温度が－６０℃以下、－７０℃以下、又は－８０℃以下になるように調節される。これは液体窒素との接触やフリーザー中での保存によって実行されてもよい。
冷凍処理の実行時間は一瞬でもよい。通常は、多血小板血漿全てが確実に冷凍されるように冷凍処理の上述温度において６～２４時間に亘って実行される。すなわち冷凍処理の開始時刻から真空凍結乾燥処理の開始時刻のインターバルは０～２４時間又は６～２４時間でもよい。
真空凍結乾燥処理の温度条件は、特に制限はない。当該温度条件の上限値は、－３０℃以下、－３５℃以下、－４０℃以下、－４５℃以下としてもよい。下限値に特に制限はないが、－８０℃以上、－７５℃以上、－７０℃以上、－６５℃以上、－５５℃以上、－５０℃以上としてもよい。
真空凍結乾燥処理の気圧条件は、特に制限はない。当該気圧条件の上限値は、２０Ｐａ以下、１８Ｐａ以下、１６Ｐａ以下、１５Ｐａ以下としてもよい。下限値は０Ｐａ以上であり、１Ｐａ以上、２Ｐａ以上、３Ｐａ以上、４Ｐａ以上、５Ｐａ以上としてもよい。
真空凍結乾燥処理を実行する時間は、特に制限はなく、液量に応じた時間を設定し得る。当該凍結乾燥処理時間の下限値は、例えば、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上としてもよい。他方、上限値は、２４時間以下、２０時間以下、１５時間以下、１０時間以下、８時間以下としてもよい。
真空凍結乾燥処理を実行する手段は特に制限はなく任意の手段が使用される。例えば、ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて実行してもよい。
真空凍結乾燥処理を終えると、ほぼ完全に乾燥した粒状又は粉末状の多血小板血漿を得ることができる。
≪血液由来成長因子含有組成物≫
本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物は、哺乳類の血液から調製された血液由来成長因子含有組成物であって、特定の成長因子の含有量が極めて高い血液由来成長因子含有組成物である。当該血液由来成長因子含有組成物は液体、半固体、又は乾燥固体であってもよい。以下、含有成分について詳述する。
本実施形態に係る血液由来成長因子含有組成物は、哺乳類の血液から調製された血液由来成長因子含有組成物であって、特定の成長因子の含有量が極めて高い血液由来成長因子含有組成物である。当該血液由来成長因子含有組成物は液体、半固体、又は乾燥固体であってもよい。以下、含有成分について詳述する。
＜成長因子＞
（ＶＥＧＦ）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、成長因子ＶＥＧＦの含有量が少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１００００ｐｇ／ｍＬである。ここで、本明細書及び本特許請求の範囲における「ｐｇ／ｍＬ」は、濾過処理工程後の多血小板血漿における濃度であり、又は凍結乾燥工程後の多血小板血漿を、溶媒１ｍＬあたり３００ｍｇ融解した多血小板血漿における濃度である。ＶＥＧＦは、血小板にも含まれるが、バフィーコートに多く含まれる成長因子である。ＶＥＧＦは血管新生作用があり、ＶＥＧＦを多く含む血液由来成長因子含有組成物は、より高い創傷治癒効果が期待できる。また、当該組成物の乾燥質量に対する、ＶＥＧＦの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７００ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは１０００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば３００００ｐｇ／ｇである。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は、下記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
（乾燥条件）
ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて、５Ｐａ、－４５℃の条件下、１６時間に亘って、乾燥対象の組成物に対して真空凍結乾燥処理を施す。
（ＶＥＧＦ）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、成長因子ＶＥＧＦの含有量が少なくとも９０ｐｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは３００ｐｇ／ｍＬ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１００００ｐｇ／ｍＬである。ここで、本明細書及び本特許請求の範囲における「ｐｇ／ｍＬ」は、濾過処理工程後の多血小板血漿における濃度であり、又は凍結乾燥工程後の多血小板血漿を、溶媒１ｍＬあたり３００ｍｇ融解した多血小板血漿における濃度である。ＶＥＧＦは、血小板にも含まれるが、バフィーコートに多く含まれる成長因子である。ＶＥＧＦは血管新生作用があり、ＶＥＧＦを多く含む血液由来成長因子含有組成物は、より高い創傷治癒効果が期待できる。また、当該組成物の乾燥質量に対する、ＶＥＧＦの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７００ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは１０００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば３００００ｐｇ／ｇである。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は、下記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
（乾燥条件）
ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて、５Ｐａ、－４５℃の条件下、１６時間に亘って、乾燥対象の組成物に対して真空凍結乾燥処理を施す。
（他の成長因子）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、他の成長因子を含んでもよい。成長因子の種類は、特に限定されないが、例えば、血小板由来成長因子（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、他の成長因子を含んでもよい。成長因子の種類は、特に限定されないが、例えば、血小板由来成長因子（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
＜抗炎症性サイトカイン＞
（１Ｌ－１Ｒａ）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａを含んでもよい。ＩＬ－１Ｒａの含有量は、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば５００００ｐｇ／ｍＬである。ＩＬ－１Ｒａは主に白血球に含まれる。ＩＬ－１Ｒａは、炎症性サイトカインＩＬ－１α及びＩＬ－１βのアンタゴニストとして作用し、炎症を抑制する。また、当該組成物の乾燥質量に対する、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは４５０ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１５００００ｐｇ／ｇである。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は上記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
（１Ｌ－１Ｒａ）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａを含んでもよい。ＩＬ－１Ｒａの含有量は、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１５０ｐｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは２００ｐｇ／ｍＬ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば５００００ｐｇ／ｍＬである。ＩＬ－１Ｒａは主に白血球に含まれる。ＩＬ－１Ｒａは、炎症性サイトカインＩＬ－１α及びＩＬ－１βのアンタゴニストとして作用し、炎症を抑制する。また、当該組成物の乾燥質量に対する、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは４５０ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１５００００ｐｇ／ｇである。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は上記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
＜炎症性サイトカイン＞
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、炎症性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを含んでもよい。ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量はそれぞれ独立に、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは９．５ｐｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは９．０ｐｇ／ｍＬ以下である。ＴＮＦ－αの含有量は、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１９ｐｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１８ｐｇ／ｍＬ以下である。これらの炎症性サイトカインの過剰な発現は、関節リウマチなどの疾患発症を招くおそれがある。本実施形態による血液由来成長因子含有組成物に含まれる炎症性サイトカインは上記範囲のような低濃度にすることで、人体に投与してもこのような副作用を引き起こしにくい。
また、当該組成物の乾燥質量に対する、ＩＬ－１β及びＩＬ－６及びの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）はそれぞれ独立に、好ましくは３０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは２８ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは２７ｐｇ／ｇ以下である。さらに、当該組成物の乾燥質量に対する、ＴＮＦ－αの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは６０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは５７ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは５４ｐｇ／ｇ以下である。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は上記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、炎症性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを含んでもよい。ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量はそれぞれ独立に、好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは９．５ｐｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは９．０ｐｇ／ｍＬ以下である。ＴＮＦ－αの含有量は、好ましくは２０ｐｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１９ｐｇ／ｍＬ以下であり、さらに好ましくは１８ｐｇ／ｍＬ以下である。これらの炎症性サイトカインの過剰な発現は、関節リウマチなどの疾患発症を招くおそれがある。本実施形態による血液由来成長因子含有組成物に含まれる炎症性サイトカインは上記範囲のような低濃度にすることで、人体に投与してもこのような副作用を引き起こしにくい。
また、当該組成物の乾燥質量に対する、ＩＬ－１β及びＩＬ－６及びの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）はそれぞれ独立に、好ましくは３０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは２８ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは２７ｐｇ／ｇ以下である。さらに、当該組成物の乾燥質量に対する、ＴＮＦ－αの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは６０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは５７ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは５４ｐｇ／ｇ以下である。ここで、当該組成物が乾燥形態でない場合には、当該組成物の乾燥質量は上記乾燥条件にて当該組成物を乾燥させた後のものの質量である。
＜成分比＞
（成長因子と抗炎症性サイトカイン）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、好ましくは１：１～５０であり、より好ましくは１：１～１５であり、さらに好ましくは１：１～１０である。このような比率で成長因子と抗炎症性サイトカインを含む血液由来成長因子含有組成物は、創傷治癒効果と炎症抑制効果を併せ持つため、人体に投与したときにより高い治療効果を奏する。
（成長因子と抗炎症性サイトカイン）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、好ましくは１：１～５０であり、より好ましくは１：１～１５であり、さらに好ましくは１：１～１０である。このような比率で成長因子と抗炎症性サイトカインを含む血液由来成長因子含有組成物は、創傷治癒効果と炎症抑制効果を併せ持つため、人体に投与したときにより高い治療効果を奏する。
（成長因子と炎症性サイトカイン）
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子を多く含みつつ、炎症性サイトカインをほとんど含まない。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、好ましくは１：０．００１～０．０５であり、より好ましくは１：０．００１～０．０３であり、さらに好ましくは１：０．００１～０．０１である。このような比率で成長因子と炎症性サイトカインを含む血液由来成長因子含有組成物は、人体に投与したときに炎症を引き起こしにくく、高い治療効果を奏する。
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子を多く含みつつ、炎症性サイトカインをほとんど含まない。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、好ましくは１：０．００１～０．０５であり、より好ましくは１：０．００１～０．０３であり、さらに好ましくは１：０．００１～０．０１である。このような比率で成長因子と炎症性サイトカインを含む血液由来成長因子含有組成物は、人体に投与したときに炎症を引き起こしにくく、高い治療効果を奏する。
≪凍結乾燥品≫
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、凍結乾燥状態にあってもよい。
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、凍結乾燥状態にあってもよい。
＜成長因子＞
（ＶＥＧＦ）
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、成長因子ＶＥＧＦの含有量が好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７００ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは１０００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば３００００ｐｇ／ｇである。
（ＶＥＧＦ）
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、成長因子ＶＥＧＦの含有量が好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは７００ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは１０００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば３００００ｐｇ／ｇである。
（他の成長因子）
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、他の成長因子を含んでもよい。成長因子の種類は、特に限定されないが、例えば、血小板由来成長因子（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、他の成長因子を含んでもよい。成長因子の種類は、特に限定されないが、例えば、血小板由来成長因子（例えばＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＢＢ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（例えばＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。
＜抗炎症性サイトカイン＞
（１Ｌ－１Ｒａ）
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａを含んでもよい。ＩＬ－１Ｒａの含有量は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは４５０ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１５００００ｐｇ／ｇである。
（１Ｌ－１Ｒａ）
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来成長因子含有組成物は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａを含んでもよい。ＩＬ－１Ｒａの含有量は、好ましくは３００ｐｇ／ｇ以上であり、より好ましくは４５０ｐｇ／ｇ以上であり、さらに好ましくは６００ｐｇ／ｇ以上である。上限値は、血液を採取した哺乳類の個体差によって変わるが、例えば１５００００ｐｇ／ｇである。
＜炎症性サイトカイン＞
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、炎症性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを含み得る。ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量はそれぞれ独立に、好ましくは３０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは２８ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは２７ｐｇ／ｇ以下である。また、ＴＮＦ－αの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは６０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは５７ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは５４ｐｇ／ｇ以下である。
本実施形態による血液由来成長因子含有組成物は、炎症性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを含み得る。ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量はそれぞれ独立に、好ましくは３０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは２８ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは２７ｐｇ／ｇ以下である。また、ＴＮＦ－αの含有量（ｐｇ／乾燥物１ｇ）は、好ましくは６０ｐｇ／ｇ以下であり、より好ましくは５７ｐｇ／ｇ以下であり、さらに好ましくは５４ｐｇ／ｇ以下である。
＜成分比＞
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来因子含有組成物は、好適には、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、好ましくは１：１～５０であり、より好ましくは１：１～１５であり、さらに好ましくは１：１～１０である。また、当該血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子を多く含みつつ、炎症性サイトカインをほとんど含まない。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、好ましくは１：０．００１～０．０５であり、より好ましくは１：０．００１～０．０３であり、さらに好ましくは１：０．００１～０．０１である。
本実施形態による凍結乾燥状態にある血液由来因子含有組成物は、好適には、成長因子と抗炎症性サイトカインをバランスよく含む。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、抗炎症性サイトカインＩＬ－１Ｒａの質量比が、好ましくは１：１～５０であり、より好ましくは１：１～１５であり、さらに好ましくは１：１～１０である。また、当該血液由来成長因子含有組成物は、好適には、成長因子を多く含みつつ、炎症性サイトカインをほとんど含まない。具体的には、成長因子ＶＥＧＦの質量を基準した、炎症性サイトカインＩＬ－１βの質量比が、好ましくは１：０．００１～０．０５であり、より好ましくは１：０．００１～０．０３であり、さらに好ましくは１：０．００１～０．０１である。
以上説明したように、本実施形態によれば、バフィーコート成分を含む血液由来成分を簡便に回収することができ、成長因子が飛躍的に増大し、ひいては創傷治癒や組織再生効果を奏する血液由来成長因子含有組成物を調製できる。
本実施形態による血液由来因子含有組成物は再生医療等に使用でき、特に、ＰＲＰ療法等に使用できる。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１～５の作製）
男性５人からそれぞれ約３４ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管（ＢＤバイキュアナ採血管 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社＃３６４６０６）に適宜採取した。これらを恒温槽において４℃で一晩（約１６時間）冷蔵保存した。保存後、第１の遠心分離処理｛１２００ｒｐｍ（２８０Ｇ相当）、１０分間、２４℃｝を行い、上清である血漿（１５ｍＬ：全液量の体積を基準として、回収した体積比は１：０．４）を回収した。この血漿について第２の遠心分離処理｛２６８０ｒｐｍ（１４００Ｇ相当）、１０分間、２４℃｝を行い、ペレットと上清に分離した。分離後、ペレットの体積を基準として、体積比が１：２となる上清は残し、それ以外の上清（血漿）を除去した。残った上清によってペレットを懸濁させ、懸濁液（多血小板血漿）を得た。
男性５人からそれぞれ約３４ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管（ＢＤバイキュアナ採血管 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社＃３６４６０６）に適宜採取した。これらを恒温槽において４℃で一晩（約１６時間）冷蔵保存した。保存後、第１の遠心分離処理｛１２００ｒｐｍ（２８０Ｇ相当）、１０分間、２４℃｝を行い、上清である血漿（１５ｍＬ：全液量の体積を基準として、回収した体積比は１：０．４）を回収した。この血漿について第２の遠心分離処理｛２６８０ｒｐｍ（１４００Ｇ相当）、１０分間、２４℃｝を行い、ペレットと上清に分離した。分離後、ペレットの体積を基準として、体積比が１：２となる上清は残し、それ以外の上清（血漿）を除去した。残った上清によってペレットを懸濁させ、懸濁液（多血小板血漿）を得た。
この多血小板血漿を、－６０℃環境下に１０分間暴露し凍結させた後、取り出して３７℃に設定したドライバス中に１５分間静置することにより融解させた。融解後、多血小板血漿の安定化のために、乳酸リンゲル液（扶桑薬品工業株式会社製）をそれぞれ６．５ｍＬ添加し、再懸濁した。
これをシリンジに移し替え、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターによってフィルタリングした。このフィルタリングによって多血小板血漿は、フィルター上に残留する血小板などの細胞と、フィルターを通過した多血小板血漿とに分離された。当該多血小板血漿をバイアルに移して－６０℃で冷凍処理を施し、同温度にて２４時間凍結保存した。
各バイアルについて、ＦＤＵ－１１１０（東京理化器械株式会社製）を用いて、約５Ｐａ、約－４５℃の条件下、約１６時間に亘って真空凍結乾燥処理を施した。こうして実施例１～５の試料を得た。
（実施例６～１０の作製）
男性１人から約８５ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管に採取し、５本に分注した。こうして検体６～１０を得た。その後、検体７及び８は、冷蔵庫において４℃で、それぞれ約２４時間及び約４８時間に亘り冷蔵した。また、検体９及び１０は、室温（２５℃）で、それぞれ約２４時間及び約４８時間に亘り静置した。これら検体６～１０について、実施例１～５と同様に、多血小板血漿を回収する工程、凍結融解し活性化する工程及び、凍結乾燥する工程を施し、実施例６～１０の試料を得た。
男性１人から約８５ｍＬの全血をＡＣＤ溶液入り採血管に採取し、５本に分注した。こうして検体６～１０を得た。その後、検体７及び８は、冷蔵庫において４℃で、それぞれ約２４時間及び約４８時間に亘り冷蔵した。また、検体９及び１０は、室温（２５℃）で、それぞれ約２４時間及び約４８時間に亘り静置した。これら検体６～１０について、実施例１～５と同様に、多血小板血漿を回収する工程、凍結融解し活性化する工程及び、凍結乾燥する工程を施し、実施例６～１０の試料を得た。
（各因子の測定）
実施例１～５の試料について乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子、抗炎症性サイトカイン、及び炎症性サイトカインの量／濃度を解析した。その結果を表１に示す。ＶＥＧＦ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの含有量はそれぞれ１００ｐｇ／ｍＬ以上、１００ｐｇ／ｍＬ以上、１０ｐｇ／ｍL以下、１０ｐｇ／ｍL以下及び２０ｐｇ／ｍL以下であった。
また、これより算出された成長因子、抗炎症性サイトカイン、及び炎症性サイトカインの量／乾燥物（１ｇ）の結果を表２に示す。
実施例１～５の試料について乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子、抗炎症性サイトカイン、及び炎症性サイトカインの量／濃度を解析した。その結果を表１に示す。ＶＥＧＦ、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αの含有量はそれぞれ１００ｐｇ／ｍＬ以上、１００ｐｇ／ｍＬ以上、１０ｐｇ／ｍL以下、１０ｐｇ／ｍL以下及び２０ｐｇ／ｍL以下であった。
また、これより算出された成長因子、抗炎症性サイトカイン、及び炎症性サイトカインの量／乾燥物（１ｇ）の結果を表２に示す。
実施例１～５の試料についての前記解析した結果に基づき、成長因子ＶＥＧＦの量を基準としたときの各サイトカイン量比を表３に示す。
（予冷蔵による影響の確認）
実施例６～１０の試料について、乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子(ＶＥＧＦ)、抗炎症性サイトカイン(ＩＬ－１Ｒａ)の量／濃度を解析した。採血後、予冷蔵を経ずに作製したもの（実施例６）を１００％としたときの各サイトカイン量比を図１に示す。４℃で２４時間（実施例７）又は４８時間（実施例８）予冷蔵した場合、各因子の含有量がＩＬ－１Ｒａは約５００％、ＶＥＧＦは約２００％に増加していた。一方、予冷蔵に代えて、室温に２４時間（実施例９）又は４８時間（実施例１０）静置した場合は、各因子の顕著な増加は確認されなかった。
実施例６～１０の試料について、乾燥物３００ｍｇに対して注射用水を１ｍＬ加え融解し、ＥＬＩＳＡ法によって成長因子(ＶＥＧＦ)、抗炎症性サイトカイン(ＩＬ－１Ｒａ)の量／濃度を解析した。採血後、予冷蔵を経ずに作製したもの（実施例６）を１００％としたときの各サイトカイン量比を図１に示す。４℃で２４時間（実施例７）又は４８時間（実施例８）予冷蔵した場合、各因子の含有量がＩＬ－１Ｒａは約５００％、ＶＥＧＦは約２００％に増加していた。一方、予冷蔵に代えて、室温に２４時間（実施例９）又は４８時間（実施例１０）静置した場合は、各因子の顕著な増加は確認されなかった。
Claims (8)
- 哺乳類の血液から血液由来成長因子含有組成物を調製する方法であって、
金属イオンとキレート錯体を形成し得る抗凝固剤を前記血液に添加する工程と、
前記抗凝固剤が添加された前記血液からバフィーコート成分を含む多血小板血漿を分離する工程と、
前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程と、
を含み、
前記多血小板血漿を分離する工程が、
前記抗凝固剤が添加された前記血液について１００～１０００Ｇ、１～３０分による第１の遠心分離処理を施して血漿及びバフィーコートを含む上層部を回収するステップ；前記上層部について１０００～２５００Ｇ、１～３０分による第２の遠心分離処理を施して血小板及びバフィーコート成分をペレット化するステップ；及び、上清を除去し、前記血小板及び前記バフィーコート成分を懸濁して多血小板血漿を得るステップ；を含み、
前記上層部を回収するステップにおいて、全液量の体積を基準として、回収する前記上層部の体積比が、１：０．１～０．５であり、且つ、
前記多血小板血漿を得るステップにおいて、ペレットの体積を基準として、体積比が１：１～１０の体積量の上清を残しそれ以外を除去する
方法。 - 前記抗凝固剤が、クエン酸、ＥＤＴＡ、又はこれらの塩を含む、請求項１記載の方法。
- 前記多血小板血漿を凍結融解して活性化させる工程が、－２００℃～－２０℃、１０分以上の処理による凍結と、その後の２０℃～５０℃、１０分以上の処理による融解により行われる、請求項１又は２記載の方法。
- 前記多血小板血漿を分離する工程の前に、前記抗凝固剤を添加された血液を０～１０℃で予冷蔵する工程を更に含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
- 孔径０．２～１μｍのフィルターを用いて、活性化された前記多血小板血漿を濾過処理する工程を更に含む、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
- 活性化された前記多血小板血漿を凍結乾燥する工程を更に含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- 請求項１～５のいずれか１項記載の方法により調製された血液由来成長因子含有組成物。
- 請求項６に記載の方法により調製された血液由来成長因子含有凍結乾燥物。
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Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
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