JP7083756B2 - タンパク質系試料回収マトリックス及び装置 - Google Patents

Description

固相又は半固相回収マトリックスからの核酸の回収は、分子診断において広く認められている。マトリックスの典型例としては、スワブや紙の基質が挙げられる。基質材料からの非効率な抽出や、材料とピペッティング又はその他の液体取扱装置との干渉可能性のために、こうした材料から核酸を回収するのは困難であり得る。加えて、機器内の固形物質の存在はエラー信号を引き起こすことがあり、抽出中止又はその他の遅れの原因となる。

核酸の回収効率はフェノール／クロロホルムなどの厳しい及び／又は有毒条件の利用によって高めることができ、実際に高分子スワブを用いて試行されてきた。しかしながら既存の固相基質は、グアニジウムやその他より穏やかなカオトロピック溶液には不溶である。

効率的な核酸の回収、計測手段との適合性、及びカオトロピック緩衝液（例えばグアニジウム系）の利用を可能にする、タンパク質系試料回収マトリックスを提供する。

核酸を生体試料から回収するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ａ）試料回収のために構成されたタンパク質系マトリックスと、ｂ）約３～６Ｍカオトロープ、約０．５～１０％の界面活性剤、約５０～５００ｍＭの還元剤、及び溶液のｐＨを約５～８に維持する緩衝液を含む該溶液、とを含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスは、スワブを形成する。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスは、液体試料（例えば血液、血液成分、尿、唾液、粘液）を回収するためのストリップを形成する。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスを湿らせ、面（例えば病院内もしくは法医学的状況、又は皮膚上）から試料を回収するためのワイプとして用いる。

いくつかの実施形態において、キットはさらに、例えば試料が結合したタンパク質系マトリックスを溶解するための、処理容器を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、目的分析物（例えば核酸）を分離するためのろ管、磁気ガラスビーズ（ＭＧＰ）、又はその他成分を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、洗浄用緩衝液（又は保存液もしくは再水和のためのドライウォッシュ緩衝液成分）を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、溶出緩衝液（又は保存液もしくは再水和のためのドライ溶出緩衝液成分）を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらにプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫを含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに試料結合タンパク質系マトリックスの保存用容器を含む。

いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスは絹、例えば絹織物を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスは、例えば分析物に対する親和性を増すために、例えば正電荷を帯びた部分などで修飾して核酸に結合させる。

いくつかの実施形態において、カオトロープは、グアニジウム塩又はグアニジウム塩類の組合せである。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えばポリドカノール又はトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）である。いくつかの実施形態において、還元剤はＤＴＴ又はβ－メルカプトエタノールである。いくつかの実施形態において、緩衝液はクエン酸緩衝液である。いくつかの実施形態において、溶液のｐＨは５．８～７、例えば６～６．８である。

さらに、試料中の核酸を回収するための方法が提供されるが、該方法は、核酸を含む試料をタンパク質系マトリックス上に接触させることによって分析物を回収することを含む。いくつかの実施形態において、該方法はさらに試料結合タンパク質系マトリックスを容器内に配置して保存することをさらに含む。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスは絹を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスを、例えば分析物に対する親和性を増すべく、例えば正電荷を帯びた部分などで修飾して核酸に結合、又は、抗体部分で特定の標的蛋白質に結合させる。

いくつかの実施形態において、該方法はさらに、タンパク質系マトリックスと、約３～６Ｍのカオトロープ、約０．５～１０％の界面活性剤、約５０～５００ｍＭの還元剤、及び溶液のｐＨを約５～８に維持する緩衝液を含む該溶液とを接触させ、タンパク質系マトリックスをこの溶液に溶解することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質系マトリックスは少なくとも５分、例えば１０～１８０分、２０～６０分間等、該溶液に浸漬する。いくつかの実施形態において、この溶液とタンパク質系マトリックスを、例えば３０～６０℃に加熱し、マトリックスの溶解を早める。いくつかの実施形態において、カオトロープはグアニジウム塩又はグアニジウム塩類の組合せである。いくつかの実施形態において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤、例えばポリドカノール又はＴｗｅｅｎである。いくつかの実施形態において、還元剤はＤＴＴ又はβ－メルカプトエタノールである。いくつかの実施形態において、緩衝液はクエン酸緩衝液である。いくつかの実施形態において、該溶液のｐＨは５．８～７、例えば６～６．８である。

いくつかの実施形態において、該方法はさらに、該溶液をろ管又は磁気ガラスビーズ（ＭＧＰ）と接触させ、該ろ管又はＭＧＰを洗浄用緩衝液で洗浄し、さらに該ろ管又はＭＧＰから、溶出緩衝液で核酸を溶出することにより、核酸を試料から単離することを含む。いくつかの実施形態において、該試料は液体試料、例えば血液、血液成分、尿、唾液、粘液等である。いくつかの実施形態において、該タンパク質系マトリックスを湿らせて、ワイプとして用いて面（例えば病院内もしくは法医学的状況、又は皮膚上）から試料を回収する。

図１は、それぞれ異なる溶液中にタンパク質系マトリックスストリップ（絹）を含む３つの管を示す。 図２は、タンパク質系マトリックス上へのカオトロピック溶液（４Ｍグアニジンチオシアン酸塩）の効果を示す。 図３は、プロテイナーゼＫ溶液のタンパク質系マトリックスへの効果を示 す。 図４は、５０対５０で混合したカオトロピック溶液及びプロテイナーゼ Ｋ（最終濃度：２Ｍグアニジンチオシアン酸塩）の効果を示す。

Ｉ．はじめに
効率的な核酸の回収、計測手段との適合性、及びカオトロピック溶液（例えばグアニジウム系）の利用を可能にする、タンパク質系試料回収マトリックスを提供する。該タンパク質系マトリックスは、試料を回収し、試料中の核酸を結合するのに用いることができる。核酸はマトリックスから溶出や、さもなければ、除去する必要はなく、これは、該タンパク質系マトリックスがカオトロピック溶液中に溶解するためである。このことが効率的な核酸の回収をもたらす。溶解した（可溶化）タンパク質はまた、ピペッティング又は検出計器に干渉することはない。該マトリックスはさらに、意図する利用によって各種形状に都合よく形成できる。例えばストリップは液体試料（例えば血液又は唾液の液滴）の回収に使用でき、スワブは細胞試料（例えば口腔又は頚）の回収に使用でき、又はワイプはあらゆるソース（例えば病院内又は法医学的設定）からの微生物又は核酸の存在について面を試験するのに使用できる。

該タンパク質系マトリックスは、初期核酸捕捉ステップとして用いたり、また例えば固相担体を用いる追加核酸精製ステップと組み合わせることが可能である。あるいは、該可溶化核酸－タンパク質溶液を、直接、検出アッセイに用いることも可能である。

ＩＩ．定義
用語「タンパク質系マトリックス」又は「タンパク質系基質」は、主としてタンパク質から構成される物質を指し、水や生理的液体中では不溶のままで、試料中の核酸やタンパク質等の生体試料の成分を捕捉するのに用いることができる。しかしながら、該タンパク質系マトリックスは、ここに記載のカオトロピック条件において可溶化（分解又は分散）できる。タンパク質系マトリックスにおいて使用できるタンパク質には水や生理的試料条件において不溶のままであるものや、理想的には多数のフォーマット（フラットストリップ、ウェル、アレイロケーション、繊維状スワブ又はワイプ）に形成可能なもの、及び皮膚又は粘膜との接触に優れた耐性を有するものが含まれる。その例としては、非限定的に、絹、ケラチン、 コラーゲン、 アルブミン、牛乳タンパク質、及びこれらの任意の数の組合せが挙げられる。タンパク質系マトリックスの非タンパク質成分には、吸着、特定のターゲティングもしくは所望の分析物の安定化を改善、又は該マトリックスの機械的特性を改善する物質が含まれ得る。

用語「固相（又は半固相）担体」は、核酸等の作用薬を固定可能な不活性面又は不活性体を指す。非限定的な例として、ガラス、シリカ、プラスチック、ニトロセルロース、膜、チップ、及び粒子（例えば磁性ガラス粒子又はＭＧＰ）が挙げられる。

用語「溶液中」は、例えば溶液中の固相担体を指し、該固相担体が溶液に暴露される（例えば溶液中の試薬との接触）か、又は該固相担体それ自体が溶液中にある（例えばビーズ又は粒子を液中に懸濁）ことを示すことができる。この用語は、マトリックスが実際に液体中で可溶化、溶解、又は分解される状況と、粒子が溶液中にそのまま残るが、懸濁する状況とを区別するのに用いる。

用語「レセプタクル」、「容器」、「管」、「ウェル」、「チャンバー」、「マイクロチャンバー」等は、乾燥及び／又は液体成分、マトリックス、試薬又はアッセイを保持できる容器を指す。該レセプタクルがキット内にあり、マトリックス担持試料、 試薬、又は増幅反応物を保持する場合、これを閉鎖又は密閉して汚染や蒸発を避けることができる。該レセプタクルをアッセイに使用している場合は、少なくともアッセイの設定中は、開放又はアクセス可能とすることができる。

マトリックス又は固相担体結合核酸の文脈における用語「固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ、ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ）」、「捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ、ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）、「結合（ｂｉｎｄ、ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、非共有結合を指す。固定化は、試料がタンパク質系マトリックス中の空隙内に保持される吸収、及び／又は、試料成分がタンパク質系マトリックスの表面に吸引される吸着を含み得る。試料は典型的には乾燥又はここに記載のタンパク質系マトリックス上に捕捉される結果、核酸が該マトリックスに接着する。タンパク質系マトリックスの構築に好適な天然タンパク質が有する目的分析物に対する親和性は限られたものなので、こうした天然タンパク質は、より高い親和性を有する異なるタンパク質又はポリペプチド配列（例えば負電荷を帯びた核酸を引き付けるための正電荷を帯びたアミノ酸）に連結するか又はこれと混合できる。こうした混合タンパク質は、 組換え的に作製、又は部分的な加水分解により等電点を変えて修飾することもできる。タンパク質はまた、構造的又は化学的部分を導入し所望の分析物の保持を強化することによって修飾することもできる。修飾部分には、抗体、ハプテン及びチオール、アミン、並びにカルボン酸部分が含まれる。

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド（例えばリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを指し、自然に発生するもの（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル及びチミジン）、非自然的に発生するもの、及び修飾核酸を含む。この用語は、ポリマーの長さ（例えばモノマーの数）によって制限されるものではない。核酸は一本鎖か又は二本鎖であってよく、通常は５’-３’ ホスホジエステル結合を含むが、場合によってはヌクレオチドアナログが他の連鎖を有してもよい。モノマーは典型的にはヌクレオチドと称する。用語「非天然ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオチド」は、修飾窒素塩基、糖もしくはリン酸塩群を含有するヌクレオチド、又は非天然部分をその構造に取り込むヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化、アミノ化、脱アミノ化、アルキル化、ベンジル化及びフルオロフォア標識ヌクレオチドが挙げられる。

用語「プライマー」は、好適な条件下での核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として作用する、短い核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。ポリヌクレオチド合成及び増幅反応には、典型的には適切な緩衝液、ｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ、ならびに１つ以上の任意の補助因子が含まれ、また好適な温度で実施される。プライマーは、典型的には少なくとも実質的に該標的配列に相補的（例えば０、１、２、又は３個のミスマッチを有する）な、少なくとも１つの標的がハイブリダイズする領域を含む。この領域は、典型的には約８～約４０ヌクレオチド長、例えば１２～２５個のヌクレオチド長である。用語「プローブ」は、特別に意図する標的生体分子に選択的に結合可能ないずれの分子をも指す。例えばプローブは、目的の核酸配列に相補的な配列を有する核酸であり得る。

用語「相補的」又は「相補性」は、ポリヌクレオチドにおける核酸が、第二のポリヌクレオチドにおける別の核酸と塩基対を形成する能力を指す。例えば配列Ａ－Ｇ－Ｔ（ＲＮＡではＡ－Ｇ－Ｕ）は、配列Ｔ－Ｃ－Ａ（ＲＮＡではＵ－Ｃ－Ａ）に相補的である。 相補性は部分的であってもよく、その場合、核酸のうちいくつかのみが塩基対形成に従い一致するか、又は、完全であってもよく、その場合、全ての核酸が塩基対形成に従い一致する完全一致となる。プローブ又はプライマーは、それが少なくとも部分的に標的配列に相補的であれば、該標的配列に「対して特異的」であると考えられる。条件次第では、標的配列に対する相補性の程度は、典型的には、より長い配列についてよりもプライマー（例えば８０％超、９０％超、９５％超、又はより高い％等）などのより短い核酸のほうが高い。

２つ以上の核酸又は２つ以上のポリペプチドの文脈における用語「同一の」又は「％同一性」は２つ以上の配列又は部分配列を指し、これらは同じであるか又は特定のパーセンテージのヌクレオチド又はアミノ酸が、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０の配列比較アルゴリズムで測定、又は手操作によるアライメント及び目視検査により測定した場合に、同じである（比較用窓又は指定領域において最大限対応するように比較、整列させた際に、特定の領域について例えば約６０％同一性、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはこれより高い同一性）ことを指す。例えばＮＣＢＩウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ/ＢＬＡＳＴを参照されたい。こうした配列は次いで「実質的に同一」ともいう。％同一性は典型的には、配列を最適にアライメントさせて判定するため、本定義は、欠失及び／又は追加を有する配列、ならびに置換を有する配列に適用される。当該技術分野で通常用いるアルゴリズムは、ギャップその他に相当する。典型的には、同一性は、少なくとも約８～２５個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長の配列を含む領域、又は５０～１００個のアミノ酸又はヌクレオチド長である領域、又は基準配列の全長にわたって存在する。

用語「キット」は、ここに記載のＲＮＡ又はＤＮＡの捕捉、タギング（標識付け）／変換、増幅又は検出のための溶液又は緩衝液などの少なくとも１つの試薬を含むいずれの製品（例えばパッケージ又は容器）をも指す。

用語「試料」又は「生体試料」は、核酸を含有するか又は核酸を含有すると推定されるいずれの成分をも指す。この用語には、細胞、組織又は血液、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、無細胞部分又は細胞溶解物の精製又は分離成分が含まれる。最近開示された装置においては、試料が液体、例えば血液又は血液成分（血漿又は血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、涙、リンパ、脳脊髄液、口／咽喉のすすぎ、気管支肺胞洗浄、スワブより洗浄した物質等である。試料はさらに、個体から取得した細胞株などの細胞の生体外培養物の構成成分や成分を含んでよい。該液体試料はさらに、個体から直接取得した試料、例えば細胞溶解物又は赤血球除去血液から部分的に処理することもできる。

本開示において、用語「未結合液体」又は「未結合試料」は、固相担体又はＭＧＰに結合されていない、例えば核酸又はその他標的を除去した液体の、液体及びその他成分（例えばタンパク質性材料又は細胞片）を指す。該未結合液体は、さらに核酸又は標的の残量をさらに含んでよい。

「対照（コントロール）」試料又は値は、試験試料又は試験条件と比較するための基準値、通常は既知の基準値として機能する値を指す。例えば対照は反応条件に応じて調製できる。例えば核酸の存在についての陽性対照は、試料（例えばβアクチン、βグロビン、ＤＨＦＲ、もしくはコハク酸デヒドロゲナーゼなどのハウスキーピング遺伝子、又は、例えば指定の長さを有するもの等の既知の追加ポリヌクレオチド）中に存在することが既知の配列を検出する、プライマー又はプローブを含み得る。陰性対照の１例は、核酸が無いもの、又は、例えば異なる種に由来する等の試料中には存在しないと考えられる配列に対して特異的なプライマー又はプローブを含むものである。対照はさらに、多くの試験又は結果から集めた平均値又は範囲を表し得る。陽性及び陰性対照の選択が、例えば当該対照が細胞タイプで生物に適当となるような特定のアッセイに依存することは、当業者には理解されるであろう。例えばタンパク質溶解性、核酸安定性、核酸収量等のいずれの数のパラメータの評価用にも対照を設計可能であることは、当業者に理解されるであろう。対照はさらに、データの有意性の判定にも有用である。例えば所定のパラメータについての値が対照によって広く相違する場合、試験試料におけるばらつきは有意であるとは考えられない。

他に定義しない限り、ここに用いる技術的及び科学的用語は、当業者により通例理解されるものと同じ意味を有する。例えばＬａｃｋｉｅ、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（第４版、２００７年）； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）を参照されたい。用語「１つ（ａ又はａｎ）」は、「１つ以上」を意味する。ステップ又は要素の列挙に先立って用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、更なるステップ又は要素の追加が任意であり除外されないことを意味することを意図する。

ＩＩＩ．核酸含有試料
核酸増幅用試料は、核酸を含有すると考えられるいずれのソースからも取得できる。いくつかの実施形態において、こうした試料は、液体試料、例えば尿、唾液、血液もしくは血液分画物（例えば血漿又は血清）、細胞培養物、涙、精液、リンパ、ミルク、胎盤液、粘液及び非動物系液体である。いくつかの実施形態において、該試料は、スワブ又はワイプに収集する、例えば粘膜組織、口腔試料、膣もしくは子宮頚部試料、皮膚、又は機器もしくは表面ワイプからの試料である。試料は細胞性又は非細胞性であり得る。

細胞を含む試料において、細胞を分離して取得することができ（例えばサイズに基づく濾過又は遠心分離を用いる）、これによりエキソソーム、微小胞、ウイルス粒子内の核酸、又は自由に循環する核酸等の無細胞核酸（ｃｆＮＡ）が得られる。あるいは、こうした細胞を溶解して、タンパク質系試料回収マトリックスの存在下か、細胞溶解物を該タンパク質系試料回収マトリックスに添加する前のどちらかにおいて、細胞核酸を取得できる。

ＩＶ．タンパク質系マトリックス可溶化用溶液
ここに記載のタンパク質系マトリックスは、その構造を保持し、水中や生理学的に許容可能な液体中の核酸を結合するが、高度カオトロピック溶液中では構造を失い、可溶化できる。いくつかの実施形態において、溶液中の該カオトロープ濃度は２Ｍ以上、例えば約３～８Ｍ、３～６Ｍ、３．５～５．５Ｍ、３．５～５Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、又は８Ｍ（例えば溶解度の限界まで）である。カオトロープは膜を破壊し、タンパク質を変性し、これを核酸から分離し、さらにヌクレアーゼ活性を阻害するよう作用する。適当なカオトロープとしては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソシアン酸塩、グアニジン炭酸塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、チオ尿素、及びこれらの任意の数の組合せが挙げられる。

該可溶化溶液には、界面活性剤、還元剤、キレート剤、及び／又は 緩衝液等のその他の成分を含むことができる。いくつかの実施形態において、該溶液は、約３～６Ｍのカオトロープ、約０．５～１０％の界面活性剤、約２５～５００ｍＭの還元剤、及び該溶液のｐＨを約３．５～８に維持する緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、該溶液は、約３．５～５Ｍのカオトロープ、３～５％の界面活性剤、１００～１５０ｍＭの還元剤、及びクエン酸濃度が１０～５００ｍＭ、例えば３０～２００ｍＭの範囲にあるｐＨ６～６．５のクエン酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、該クエン酸緩衝液は、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム及び０．４８ｍＭのクエン酸を含む。

適当な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤（例えばポリドカノール、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｉｇｅｐａｌ、ＮＰ－４０）及びイオン性界面活性剤（例えばサルコシン、ポリオキシエチレンソルビタン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、タウロデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＤＣ）、ＮａＴＣ、グリココール酸ナトリウム（ＮａＧＣ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＣ）、コール酸ナトリウム、ＮａＡＢＳ、Ｎ－ラウロイルザルコシン（ＮＬＳ））、塩類、及びこれらの任意の数の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、該界面活性剤は、約０．５～１０％、例えば２～５％、３～６％、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％で溶液中に存在する。

還元剤は、ジスルフィド結合及びタンパク質を破壊し、ヌクレアーゼを不活性化する。適当な還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２-メルカプトエタノール、２-メルカプトエチルアミン、２-アミノエタンチオール、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、及びこれらの任意の数の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、該還元剤は、２５～５００ｍＭ、例えば５０～３００ｍＭ、８０～２００ｍＭ、１００～１５０ｍＭ、又は約１００ｍＭ、１３０ｍＭ、１５０ｍＭ、もしくは２００ｍＭで溶液中に存在する。

適当な緩衝液を、溶液のｐＨを約３．５～８、例えば約５～７又は約６～６．５に維持するのに用いることができる。記載のよう使用できる緩衝液としては、例えばクエン酸やクエン酸ナトリウムを含むクエン酸緩衝系が挙げられる。さらに適当な緩衝液としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸 （ＭＥＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸 （ＢＥＳ）、１，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビス－トリス）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ－２－アセトアミド－２－イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２-エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、重炭酸塩、リン酸塩、ＥＤＴＡ、及びこれらの任意の数の組合せが挙げられる。クエン酸ナトリウム及びＥＤＴＡはさらにキレート剤として作用できる。当業者であれば、緩衝液や試料タイプの選択次第で緩衝液濃度が多様になり得ること、またｐＨを適合酸又は塩基を用いて調整可能であることを理解するだろう。

Ｖ．核酸単離及び検出
核酸を生体試料から単離する方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋに記載のように周知であり、いくつかのキットが市販されている（例えばＲｏｃｈｅより入手可能な、細胞と組織用ＤＮＡ単離キット、哺乳動物の血液用ＤＮＡ単離キット、高純度ＦＦＰＥＴ ＤＮＡ単離キット、高純度ＲＮＡ単離キット、高純度ウイルス核酸キット、及びＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ Ｔｏｔａｌ核酸単離キット）。いくつかの実施形態において、ここに記載の核酸及び可溶化タンパク質系マトリックスは、核酸をタンパク質及びその他成分から分離する、核酸単離方法のためのインプットとして利用できる。

いくつかの実施形態において、該核酸の単離では、例えばろ管内等における、例えばガラス繊維フィルターのフィルターを利用する。いくつかの実施形態において、該核酸の単離では、固相又は半固相担体、例えば粒子（例えば微小粒子又はビーズ）を利用する。どちらかの場合、該核酸は該フィルター又は微小粒子上に固定される一方、その他成分は結合しないか又は該核酸よりも低い親和性で結合する。

いくつかの実施形態において、該微小粒子は磁性ガラス粒子（ＭＧＰ）である。ＭＧＰは、非共有的に核酸を結合するガラス、及び磁界に対応する少なくとも１つの磁気コア（例えば磁気コアの分散）を含む。シリカは一成分であり得るが、該ガラスは必ずしも純粋なシリカである必要はない。ＭＧＰは、標準的なピペット先端内でピペッティングして懸濁液を形成するのに充分に小さく、典型的には０．５～１５μｍである。ＭＧＰは平均してほぼ球形であり、かつ多孔性又は非多孔性であり得る。該磁気コアは、強磁性又は常磁性（磁界の存在下でのみ磁化される）であり得る。好適なＭＧＰは、例えば米国特許第６２５５４７７及び６５４５１４３等に詳細な記載がある。

該フィルター又はＭＧＰどちらかのガラス成分は典型的にはシリカ系であり、例えば酸化ケイ素やグラスパウダー、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウム、又はＮＨ２－活性化シリカである。いくつかの実施形態において、該ガラスは、少なくとも１つの金属酸化物（例えばＳｉＯ₂、Ｂ₂Ｏ₃、Ａｌ₂Ｏ₃、Ｋ₂Ｏ、ＣａＯ、及び／又はＺｎＯ）を含む。核酸はカオトロピック溶液内でガラスに結合する。上述のように、カオトロピック溶液には、グアニジンチオシアン酸塩（ＧｕＳＣＮ）、グアニジン塩酸塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、臭素イオン、酢酸イオン、塩素イオン、フッ素イオン、もしくは硫黄イオン、又はその組合せを含むことができる。いくつかの実施形態において、該カオトロープは溶液内に約１～１０Ｍ、例えば２～８Ｍ又は４～６Ｍで存在し、核酸結合を可能にする。

洗浄溶液は、未結合成分、例えばタンパク質、塩類等の除去に使用できる。該洗浄溶液は、固相担体に結合した核酸を保持する必要があり、これは例えば酸性ｐＨにおける洗浄剤の利用、又は該カオトロープの濃度の維持によって達成できる。

核酸は典型的にはいかなる固相担体からも分析前に溶出されるが、ＭＧＰはいくつかのアッセイに適合可能である（例えばＭＧＰ上の核酸にハイブリダイズした標識化プローブの検出、ＰＣＲ、又はサザンブロッティングなどのアッセイの一部として溶出が起こる場合）。溶出緩衝液が、核酸と、ＭＧＰ、例えばｐＨ＞７、又は、核酸とＭＧＰとの結合に用いるよりも低いカオトロピック濃度もしくはイオン強度、及び／又は上昇した温度等を有する水や緩衝液との非共有的（例えば結合／連合性又はイオン性）相互作用を妨げることは、当業者であれば理解するところであろう。

精製した核酸試料は、例えば次世代シーケンシング、マイクロアレイ（ＲＮＡ又はＤＮＡ）、サザンもしくはノーザンブロットを用いる検出、又は、いずれかのプライマー依存方法を用いる核酸増幅に利用できる。ＤＮＡに基づく方法は、例えばＰＣＲ等の増幅及び検出に利用できる。いくつかの実施形態において、リアルタイム又は定量ＰＣＲ（ＲＴ ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）を使用する。ｑＰＣＲでは、ＰＣＲプロセスの各サイクル間に生成された産物の信頼性のある検出及び測定が可能である。こうした技法は当該分野で周知であり、キット及び試薬は例えばＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ等から市販されている。例えばＰｆａｆｆｌ （２０１０年） Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｏｎｇｏｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｑＰＣＲ ｖｏｌ．５０； ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９９５年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア）１４章；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９０年）を参照されたい。

いくつかの実施形態において、予備逆転写ステップを実施し、試料中ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（リアルタイムＰＣＲと混同しないよう、ＲＴ－ＰＣＲとも称する）を調製する。次いで、該ｃＤＮＡはＰＣＲの鋳型として用いることができる。例えばＨｉｅｒｒｏら（２００６年） ７２：７１４８を参照されたい。本明細書で用いる用語「ｑＲＴ－ＰＣＲ」は、逆転写とこれに続く定量ＰＣＲを指す。両方の反応を、例えば試薬の添加の中断なしで単一管内で実施できる。例えばポリＴプライマーを用いて、試料中の全てのｍＲＮＡをポリＡテールで逆転写することができ、又はプライマーを、ｃＤＮＡに逆転写される特定の標的転写産物に特異的であるように設計することができる。さらに別のＲＮＡに基づく増幅方法、例えば核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）又は転写に媒介される増幅（ＴＭＡ）を用いることもできる。

検出装置は当該分野で周知であり、選択した標識にとって適当なものを選択できる。定量ＰＣＲに適当な検出装置としては、ｃｏｂａｓ（登録商標）及びＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）、ＰＲＩＳＭ７０００及び７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等が挙げられる。

ＶＩ．キット
いくつかの実施形態において、ここに開示の方法を実施するための試薬及び材料は、キットに含まれる。

いくつかの実施形態において、該核酸捕捉用キットは、タンパク質系マトリックスを含む。いくつかの実施形態において、該タンパク質系マトリックスは、ストリップ、スワブ、又はワイプ状に形成する。いくつかの実施形態において、該タンパク質系マトリックスは、実質的に絹、コラーゲン、ケラチン、アルブミン、及び牛乳タンパク質から選択したタンパク質から成る。いくつかの実施形態において、該タンパク質系マトリックスは、絹、コラーゲン、ケラチン、アルブミン、及び牛乳タンパク質から選択した２つ以上のタンパク質の組合せである。いくつかの実施形態において、該タンパク質系マトリックスは、滅菌して密封する。いくつかの実施形態において、該タンパク質系マトリックスはストリップ状に形成し、試料添加のために露出してある領域を有する非タンパク質カバー（例えば紙、カードボード、プラスチック等）内に密閉する。

いくつかの実施形態において、キットはさらに約３～６Ｍのカオトロープ、約０．５～１０％の界面活性剤、約５０～５００ｍＭの還元剤、及び溶液のｐＨを約３．５～８又は５～８に維持する緩衝液を含む該溶液を含む。いくつかの実施形態において、該溶液は３．５～５．５Ｍのグアニジウム塩を含む。いくつかの実施形態において、この溶液は３～５％の界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、この溶液は、１００～１５０ｍＭの還元剤を含む。いくつかの実施形態において、この溶液は、ｐＨ６～７の緩衝液（例えばクエン酸緩衝液）を含む。いくつかの実施形態において、この溶液は、キレート剤を含む。いくつかの実施形態において、この溶液は、濃縮した形態（例えば５ｘ又は１０ｘ）で提供され、希釈すると上術のような濃度を有する。

いくつかの実施形態において、キットはさらに可溶化したタンパク質から核酸を単離するための構成要素を含む。いくつかの実施形態において、こうした構成要素としては、磁性ガラス粒子（ＭＧＰ）又はマイクロビーズが挙げられる。いくつかの実施形態において、こうした構成要素としてはろ管が挙げられる。いくつかの実施形態において、こうした構成要素としてはさらに洗浄用緩衝液及び／又は溶出緩衝液が挙げられる。いくつかの実施形態において、該洗浄用緩衝液及び／又は溶出緩衝液は、濃縮した形態で提供され、使用前に希釈される。

いくつかの実施形態において、キットはさらに、少なくとも１つの対照、例えば既知のサイズ又は濃度の核酸断片を保持するタンパク質系マトリックスを含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、消耗品、例えば核酸捕捉及び／又は分離用プレート又は管、試料回収用管等を含む。いくつかの実施形態において、キットは、処理／可溶化前に該タンパク質系マトリックスを保存するための容器を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、使用方法、参照用ウェブサイト又はソフトウェアを含む。

ＶＩＩ．実施例
実施例１：タンパク質系試料回収マトリックスとしての絹の評価
絹織物は、Ｊｏ Ａｎｎ Ｆａｂｒｉｃｓから購入し、小さなストリップに切断した。ストリップを１枚ずつ３つの試験管に加えた（図１）。３つの異なる緩衝液を、絹の可溶化能について試験し、ピペッティングし、処理をし、下流核酸の単離を行った。

管１には、１ｍＬの緩衝液（４Ｍのグアニジンチオシアン酸塩、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１２９．６ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、４％のポリドカノール、０．４８ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２）を含ませた。管２には、０．５ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液（１０ｍＭのトリス－ＨＣＬ ｐＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＣａ－ＥＤＴＡ、５０％のグリセリン、１ｍｇ/ｍｌのプロテイナーゼＫ）を含ませた。管３には、０．５ｍＬの緩衝液及び０．５ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液を含ませた。

これらの管を５５℃で３０分間インキュベートし、冷却してから、撮影した。

図２に示すように、管１の絹織物では、絹は顕著に破砕され、完全性を喪失した。懸濁液内には目視可能な最小限の繊維が存在した。図３は、プロテイナーゼＫが、管２において検出可能な効果をもたらさなかったことを示す。図４は、組み合わせて用いた緩衝液によって、絹織物にいくらか破砕がもたらされたことを示す。

こうした結果は、タンパク質系マトリックスが試料回収に利用可能であり、またカオトロピック緩衝液中に効率的に可溶化されたことを示す。

実施例３：スワブにおけるタンパク質系マトリックスの使用
スワブは、分子診断と分子法医学アプリケーションとの両方に広範に利用される。スワブは、ＭＲＳＡもしくはＣＴ/ＮＧ試験の場合のヒトの皮膚などの面、又は、犯行現場のサンプリングとこれに続くヒトの同一性試験の場合の不活性面に由来する生体試料を物理的に保持するのに用いられる。スワブは典型的には、高分子円筒プラスチックコア上に支持される紡績もしくは織り、繊維状、セルロース組成物から作成され、そのため、グアニジンチオシアン酸塩を含む従来の試料調製液体に溶解しない。タンパク質性材料を紡績もしくは織って作成した絹などの繊維状材料で生産されるスワブは、皮膚又は不活性面から生体試料をサンプリングする能力に関する限り、セルローススワブヘッドにおいて望ましい全ての特性を有する。該スワブは、下流分子分析のために生体試料を回収し保存することができる。

このようなスワブは、面から生体物質を効率的に回収でき、また、抽出液に懸濁した際の、タンパク質性スワブからの生体物質の抽出及び回収効率をより高めることを通じてその後の分析を強化する。スワブヘッド内及び周囲に保持される抽出液の容積のために、従来のスワブからの生体試料の抽出及び回収効率は、決して完全ではない。

該タンパク質系（例えば絹）スワブヘッドは、中実を残して溶解できる。あるいは、この中実は、同様のタンパク質性材料から構築可能であるため、スワブ全体が溶解可能であり、その中実により、例えばトランスファーピペットを使って、機械的干渉無くして、懸濁生体試料をトランスファーできる。

実施例４：織物におけるタンパク質系マトリックスの使用
このコンセプトは、織物等の織物基質を含む、スワブを超えるさらに別の形式にまで広げることができる。絹織物パッドは、上述のスワブヘッドと同様に生体試料を捕捉及び解放可能である。こうしたパッドはエアサンプリングに用いるような、フィルターを含む多くの形に構成し得る。こうした可溶フィルター材料により、カオトロピック塩での処理時に、より多くの量の捕捉生体物質へのアクセスが提供される。これは例えば細菌戦剤のエアモニタリングのために利用できる。

Claims (10)

1. 試料から核酸を単離するためのキットであって、
   ａ）試料回収のために構成されたタンパク質系マトリックス、および
   ｂ）３．５～５Ｍのカオトロープ、３～５％の界面活性剤、１００～１５０ｍＭの還元剤、及び溶液のｐＨを６～６．５に維持するクエン酸緩衝液を含む溶液、
   を含み、
   ここで、上記タンパク質系マトリックスは液体回収のためのスワブ又はストリップを形成し、そして水中や生理学的に許容可能な液体中でその構造を保持するが、カオトロピック溶液ｂ）中で可溶化することができ、
   上記タンパク質系マトリックスは絹であり、上記カオトロープはグアニジウム塩であり、上記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、及び上記還元剤はジチオスレイトールである、キット。
2. 処理容器をさらに含む、請求項１に記載のキット。
3. ろ管又は磁気ガラスビーズ（ＭＧＰ）をさらに含む、請求項１又は２に記載のキット。
4. 洗浄用緩衝液及び溶出緩衝液をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のキット。
5. 前記タンパク質系マトリックス及び試料を保存するための容器をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット。
6. 前記非イオン性界面活性剤は、ポリドカノール、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｉｇｅｐａｌ、またはＮＰ－４０である、請求項１～５のいずれか一項に記載のキット。
7. 試料中の核酸を回収するための方法であって、核酸を含む試料を、タンパク質系マトリックス上に接触させ、核酸を回収し、前記タンパク質系マトリックスを容器内に配置して保存し、前記タンパク質系マトリックスと、３．５～５Ｍのカオトロープ、３～５％の界面活性剤、１００～１５０ｍＭの還元剤、及び溶液のｐＨを６～６．５に維持するクエン酸緩衝液を含む前記溶液とを接触させ、これによって前記タンパク質系マトリックスを前記溶液内に可溶化することを含み、
   ここで、上記タンパク質系マトリックスは絹であり、上記カオトロープはグアニジウム塩であり、上記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、及び上記還元剤はジチオスレイトールである、方法。
8. 前記タンパク質系マトリックスを前記溶液中に少なくとも１０分間浸漬させる、請求項７に記載の方法。
9. 前記溶液と、ろ管又は磁気ガラスビーズ（ＭＧＰ）とを接触させ、前記ろ管又はＭＧＰを洗浄用緩衝液で洗浄し、及び前記核酸を前記ろ管又はＭＧＰから溶出緩衝液を用いて溶出することによって、前記核酸を前記試料から単離することをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記非イオン性界面活性剤は、ポリドカノール、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｉｇｅｐａｌ、またはＮＰ－４０である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。

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