JP6929011B2 - 細胞分析装置およびプログラム - Google Patents

Description

本発明は、細胞分析装置および細胞分析装置のコンピュータに実行させるプログラムに関する。

所定の疾病においては、特定の遺伝子や特定のタンパク質等が、病状の進行に関与する。被検者から採取した細胞について特定の物質の存在および状況を確認することは、これら疾病の診断および治療方針の決定において極めて有用である。

たとえば、乳癌の場合、予後因子であるＨＥＲ２遺伝子が病状の進行に従って増幅する。特許文献１では、ＨＥＲ２遺伝子の増幅が、ＦＩＳＨ法を用いて解析されている。具体的には、ＨＥＲ２遺伝子のＤＮＡと結合する核酸プローブ（ＨＥＲ２プローブ）と１７番染色体のセントロメア領域（ＣＥＰ１７）と結合する核酸プローブ（ＣＥＰ１７プローブ）とをそれぞれ異なる蛍光色素により標識し、１つの細胞の中の各プローブから生じる蛍光を計数する。そして、ＣＥＰ１７の蛍光の数に対するＨＥＲ２遺伝子の蛍光の数の比が所定の値以上である場合に、ＨＥＲ２遺伝子の増幅が陽性であり、この比が所定の値未満の場合に、ＨＥＲ２遺伝子の増幅が陰性と判断する。

特開２０１２−１０３０７７号公報

上記診断手法では、診断にあたり、たとえば、蛍光の分布状態を示す画像が医師等に提供される。医師等は、提供された画像を参照しつつ病状を決定するといった煩雑な作業が要求されていた。また、上記診断手法では、提供された画像を目視により確認して病状の決定を行っていたため、医師等は判断にあたって熟練の技術が求められると共に、その診断には人によるばらつきが生じる虞もあった。

本発明の第１の態様に係る細胞分析装置は、第１蛍光色素と結合した第１物質を含む被検細胞に対し互いに異なる波長の光を照射する第１光源および第２光源と、被検細胞を撮像する撮像部と、処理部と、を備える。処理部は、被検細胞の第１蛍光色素を活性化するため、第１光源により被検細胞を照射させ、被検細胞の第１蛍光色素を不活性化するため、第２光源により被検細胞を照射させ、第１蛍光色素を不活性化するために第２光源により被検細胞を照射している間に、撮像部により複数の画像を撮像させ、撮像部により撮像された複数の画像に基づいて、被検細胞に含まれる第１物質を計数する。

本発明の第２の態様に係るプログラムは、第１蛍光色素と結合した第１物質を含む被検細胞に対し互いに異なる波長の光を照射する第１および第２光源と、被検細胞を撮像する撮像部と、を備える細胞分析装置のコンピュータに、被検細胞の第１蛍光色素を活性化するため、第１光源により被検細胞を照射させるステップ、被検細胞の第１蛍光色素を不活性化するため、第２光源により被検細胞を照射させるステップ、第１蛍光色素を不活性化するために第２光源により被検細胞を照射している間に、撮像部により複数の画像を撮像させるステップ、撮像部により撮像された複数の画像に基づいて、被検細胞に含まれる第１物質を計数するステップ、を実行させる。

本発明によれば、煩雑な作業が要求されることなく、高精度に診断を行うことが可能となる。

図１は、実施形態１に係る細胞分析装置の構成を示す図である。 図２（ａ）は、実施形態１に係る第１蛍光色素が第１物質に結合している状態を示す図であり、図２（ｂ）は、実施形態１に係る第２蛍光色素が第２物質に結合している状態を示す図である。 図３（ａ）は、実施形態１に係る全ての第１蛍光色素が活性状態にあることを示す図であり、図３（ｂ）は、実施形態１に係る全ての第１蛍光色素が消光状態にあることを示す図であり、図３（ｃ）、（ｄ）は、実施形態１に係る第１蛍光色素の一部が活性状態にあることを示す図である。 図４（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施形態１に係る第１処理工程における画像取得処理および分析処理を示すフローチャートである。 図５（ａ）は、実施形態１に係る再活性化回折限界画像および物質の数を取得する手順を説明する図であり、図５（ｂ）は、実施形態１に係る回折限界画像を取得する手順を説明する図である。 図６（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る第２処理工程における画像取得処理および分析処理を示すフローチャートである。 図７は、実施形態１に係る超解像画像および物質の数を取得する手順を説明する図である。 図８（ａ）〜（ｄ）は、実施形態１に係る第１処理工程において取得された陽性の参照画像を示す図である。 図９（ａ）〜（ｄ）は、実施形態１に係る第２処理工程において取得された陽性の参照画像を示す図であり、図９（ｅ）〜（ｇ）は、実施形態１に係る第２処理工程において取得された陰性の参照画像を示す図である。 図１０（ａ）〜（ｄ）は、比較例１において取得された陽性の参照画像を示す図であり、図１０（ｅ）〜（ｇ）は、比較例２において取得された陽性の参照画像を示す図である。 図１１は、実施形態１に係る表示処理を示すフローチャートである。 図１２（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る表示部に表示される画面の構成を示す図である。 図１３は、実施形態２に係る第１処理工程における画像取得処理を示すフローチャートである。 図１４（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施形態２に係る第２処理工程における画像取得処理および分析処理を示すフローチャートである。 図１５（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施形態２の変更例に係る第１処理工程および第２処理工程における画像取得処理を示すフローチャートである。 図１６（ａ）は、実施形態３に係る細胞分析装置の構成を示す図であり、図１６（ｂ）は、実施形態３に係る２つの焦点が光軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて受光面上で回転することを示す図である。 図１７（ａ）、（ｂ）は、実施形態３に係る３次元超解像画像を示す図であり、図１７（ｃ）、（ｄ）は、実施形態３に係る３次元超解像画像をＺ軸方向およびＹ軸方向に参照した場合の画像を示す図である。 図１８は、実施形態３に係る表示部に表示される画面の構成を示す図である。

以下に示す実施形態は、乳癌に関する情報を取得する細胞分析装置に本発明を適用したものである。

細胞分析装置が表示する「治療指標情報」とは、医師等が投薬、手術または経過観察等の治療方針を決定する際の指標となる情報のことである。以下の実施形態では、治療指標情報の一例として、乳癌の予後因子の一つであるＨＥＲ２遺伝子の数が第１物質の数として計数され、計数値、ＣＥＰ１７の数との比の判定結果が、治療指標情報として取得され表示される。この治療指標情報に基づき、医師等は、ＨＥＲ２遺伝子の増幅具合を確認できる。これにより、たとえば、ＨＥＲ２遺伝子を特異的ターゲットとする分子標的薬剤であるハーセプチン（登録商標）、一般名トラスツズマブを、当該患者の乳癌治療に用いるか否かの投薬方針を判断できる。なお、細胞分析装置が表示するのは上記の治療指標情報に限られない。第１物質である疾患マーカーの計数値や第１物質と第２物質との比等を、疾患マーカーに関連する疾病の進行状況を判断する際の指標となる「治療指標情報」として出力してもよい。

１．実施形態１
図１に示すように、細胞分析装置１０は、光源部１１と、シャッター１２と、１／４波長板１３と、ビームエキスパンダ１４と、集光レンズ１５と、ダイクロイックミラー１６と、対物レンズ１７と、ステージ１８と、撮像部１９と、コントローラ２０、２１と、情報処理装置１００と、を備える。撮像部１９は、集光レンズ１９ａと、撮像素子１９ｂを備える。撮像素子１９ｂは、たとえば、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＭＯＳイメージセンサである。

ステージ１８には、試料が載せられたスライドガラス２２が設置される。試料は、被検細胞を含み、被検細胞の核の中には、第１物質と第２物質を含む。検出対象となる第１物質および第２物質は、たとえば疾患マーカーとなる遺伝子、タンパク質またはペプチド等の生体物質である。具体的には、実施形態１では、被検細胞は病変組織から採取した細胞である。また、第１物質はＨＥＲ２遺伝子であり、第２物質は１７番染色体のセントロメア領域（ＣＥＰ１７）である。ＨＥＲ２遺伝子は乳癌の疾患マーカーである。ＣＥＰ１７は正常細胞においてはＨＥＲ２遺伝子と同数存在しており、乳癌等に罹患しても増殖をすることはない。このため、ＣＥＰ１７をＨＥＲ２遺伝子の増幅を測る際の基準となる内部コントロールとして用いている。

試料において、第１物質には第１蛍光色素が結合し、第２物質には第２蛍光色素が結合している。第１蛍光色素は、光源１１ａからの光が照射されることにより蛍光を生じる活性状態と、光源１１ａからの光が照射されても蛍光を生じない不活性状態とにスイッチング可能である。第１蛍光色素は、光源１１ａからの光が照射されると不活性化し、光源１１ｃからの光が照射されると活性化する。以下では、不活性化することを「消光する」という。被検細胞の核は、第３蛍光色素により染色されている。

実施形態１では、光源１１ｃからの光により第１蛍光色素を消光状態から活性化させる。光源１１ｃの光は、第３蛍光色素に蛍光を励起させる場合にも用いられる。このように光源１１ｃからの光を第１蛍光色素の活性化と第３蛍光色素の励起に共用できるため、細胞分析装置１０の構成の簡素化が図られ得る。光による作用に代えて、熱や化学薬品等の作用によって第１蛍光色素の活性化が行われても良い。

光源部１１は、被検細胞に対し光を照射する。光源部１１は、光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃと、ダイクロイックミラー１１ｄ、１１ｅと、を備える。光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃは、それぞれ、異なる波長の光を出射する。光源部１１としては、レーザ光源を用いるのが好ましいが、水銀ランプ、キセノンランプ、ＬＥＤ等を用いてもよい。ダイクロイックミラー１１ｄは、光源１１ｂから出射される光を透過し、光源１１ａから出射される光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｅは、光源１１ａ、１１ｂから出射される光を透過し、光源１１ｃから出射される光を反射する。光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃからそれぞれ出射される光の光軸は、ダイクロイックミラー１１ｄ、１１ｅにより互いに一致させられる。通常、光源部１１内の光源は、光源１１ｂから出射される光の波長が一番長く、光源１１ｃから出射される光の波長が一番短くなるよう配置されるのが好ましい。

光源部１１は、被検細胞に光を照射して、被検細胞から蛍光を生じさせる。具体的には、光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃから出射される光は、それぞれ、被検細胞に含まれる第１蛍光色素と、第２蛍光色素と、第３蛍光色素とを励起させて蛍光を生じさせる。

シャッター１２は、コントローラ２０により駆動され、光源部１１から出射された光を通過させる状態と、光源部１１から出射された光を遮断する状態とに切り替える。これにより、被検細胞に対する光の照射時間が調整される。１／４波長板１３は、光源部１１から出射された直線偏光の光を円偏光に変換する。蛍光色素は、所定の偏光方向の光に反応する。よって、励起用の光を円偏光に変換することにより、励起用の光の偏光方向が、蛍光色素が反応する偏光方向に一致し易くなる。これにより、被検細胞に含まれる蛍光色素に効率良く蛍光を励起させることができる。ビームエキスパンダ１４は、スライドガラス２２上における光の照射領域を広げる。集光レンズ１５は、対物レンズ１７からスライドガラス２２に平行光が照射されるよう光を集光させる。シャッター１２と１／４波長板１３は、光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃの直後に配置されても良い。

ダイクロイックミラー１６は、光源部１１から出射された光を反射し、被検細胞から生じた蛍光を透過する。対物レンズ１７は、ダイクロイックミラー１６で反射された光を、スライドガラス２２に導く。ステージ１８は、コントローラ２１により駆動され、水平面内で移動する。これにより、スライドガラス２２上に広く光が照射される。被検細胞から生じた蛍光は、対物レンズ１７を通り、ダイクロイックミラー１６を透過する。集光レンズ１９ａは、蛍光を集光して、撮像素子１９ｂの受光面に導く。撮像素子１９ｂは、蛍光を撮像し、撮像した画像を出力する。

情報処理装置１００は、パーソナルコンピュータであり、本体１１０と、表示部１２０と、入力部１３０と、を備える。本体１１０は、処理部１１１と、記憶部１１２と、インターフェース１１３と、を備える。

処理部１１１は、たとえばＣＰＵである。記憶部１１２は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスク等である。処理部１１１は、記憶部１１２に記憶されたプログラムに基づいて様々な機能を実行する。処理部１１１は、撮像素子１９ｂにより得られた画像を処理するとともに、その他の様々な処理を行う。また、処理部１１１は、インターフェース１１３を介して、光源部１１の光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃと、撮像素子１９ｂと、コントローラ２０、２１とを制御する。表示部１２０は、処理部１１１による処理結果等を表示するためのディスプレイである。入力部１３０は、ユーザによる指示の入力を受け付けるためのキーボードとマウスである。

以下、処理部１１１により実行される第１処理工程および第２処理工程について説明する。以下では、第１蛍光色素、第２蛍光色素および第３蛍光色素から励起された蛍光の撮像画像を、それぞれ「第１画像」、「第２画像」および「第３画像」という。以下の第１処理工程および第２処理工程の説明において記載する各光の波長、強度および照射時間は、第１蛍光色素、第２蛍光色素および第３蛍光色素がそれぞれ後述の「（３）実験」において用いた色素である場合に適用されるものである。各光の波長、強度および照射時間は、第１蛍光色素、第２蛍光色素および第３蛍光色素が変更されるに伴い、また色素の標識方法や標識密度が変更されるに伴い、適宜変更される。

（１）第１処理工程
まず、図２（ａ）、（ｂ）を参照し、蛍光色素の結合形態について説明する。第１処理工程において、試料の調製時には第１物質に第１蛍光色素が結合される。図２（ａ）に示すように、第１蛍光色素は、第１物質に特異的に結合する中間物質を介して第１物質に結合される。試料の調製時には第２物質に第２蛍光色素が結合される。図２（ｂ）に示すように、第２蛍光色素もまた、第２物質に特異的に結合する中間物質を介して第２物質に結合される。試料の調製時には被検細胞の核は、第３蛍光色素によって特異的に染色される。ここで、第１物質または第２物質が遺伝子の場合には、中間物質として核酸プローブを用いることができる。また、第１物質または第２物質がタンパク質の場合には、中間物質としてそのタンパク質に特異的な抗体を用いることができる。なお、蛍光色素を結合する物質は、分析目的に応じてその対象および数を変更しても良い。

図３（ａ）に模式的に示すように、一つの第１物質には多数の第１蛍光色素が結合する。図３（ａ）には、第１蛍光色素がそれぞれ結合した２つの第１物質が模式的に示されている。同様に、一つの第２物質にも多数の第２蛍光色素が結合する。上記のように、第１蛍光色素と第２蛍光色素は、所定波長のレーザ光により消光状態と活性状態とをスイッチング可能な蛍光色素である。

初期状態では、図３（ａ）に模式的に示すように、全ての第１蛍光色素が活性状態にある。図３（ａ）において、活性状態は黒丸で示される。この状態で、光源１１ａからの光が所定時間、被検細胞に照射されると、図３（ｂ）に示すように、全ての第１蛍光色素が消光する。図３（ｂ）において、消光状態は白丸で示される。

その後、光源１１ｃからの光が所定時間、被検細胞に照射されると、たとえば図３（ｃ）に示すように、一部の第１蛍光色素が活性化する。光源１１ｃからの光の照射時間を調整することにより、活性化される第１蛍光色素の割合が変化する。再び光源１１ａからの光が所定時間、被検細胞に照射されると、図３（ｂ）に示すように、全ての第１蛍光色素が消光する。その後、再び光源１１ｃからの光が所定時間、被検細胞に照射されると、たとえば図３（ｄ）に示すように、一部の第１蛍光色素が活性化する。図３（ｃ）、（ｄ）に示すように、各回の活性化処理で活性化される第１蛍光色素の分布は、その都度異なる。

第１処理工程では、第１蛍光色素は、一旦消光させた後、再度活性化させ、その後励起用の光を照射して蛍光を撮像する。したがって、第１画像は、たとえば、図３（ｃ）のように、第１蛍光色素がまばらに蛍光を発する状態で取得される。第２蛍光色素は、消光状態と活性状態にスイッチング可能であるが、第１処理工程では、消光させることなく初期状態のままで撮像される。したがって、第２画像は、図３（ａ）のように、全ての第２蛍光色素が蛍光を発する状態で取得される。

第１処理工程では、光源１１ａ、１１ｂ、１１ｃから出射される光の波長は、それぞれ、６４０ｎｍ、７３０ｎｍ、４０５ｎｍである。

図４（ａ）に示すように、ステップＳ１０１において、処理部１１１は、光源１１ｂからの光を被検細胞に２０ｍＷで１．５秒照射することにより、第２蛍光色素から蛍光を生じさせ、生じた蛍光を撮像部１９により撮像する。処理部１１１は、光が被検細胞に照射されている間に撮像を繰り返して１００枚の第２画像を取得する。なお、ステップＳ１０１において１００枚の第２画像を取得したが、取得する画像の枚数自体はこれに限られず、たとえば１枚の画像が取得されても良い。

ステップＳ１０２において、処理部１１１は、光源１１ｃからの光を被検細胞に１ｍＷで１．５秒照射することにより、第３蛍光色素から蛍光を生じさせ、生じた蛍光を撮像部１９により撮像する。処理部１１１は、光が被検細胞に照射されている間に撮像を繰り返して１００枚の第３画像を取得する。なお、ステップＳ１０２において１００枚の第３画像を取得したが、取得する画像の枚数自体はこれに限られず、たとえば１枚の画像が取得されても良い。

ステップＳ１０３において、処理部１１１は、光源１１ａからの光を被検細胞に８０ｍＷで照射することにより、第１蛍光色素を消光させる。ステップＳ１０４において、処理部１１１は、光源１１ｃからの光を被検細胞に１５ｍＷで０．１５秒照射することにより、第１蛍光色素を活性化する。ステップＳ１０５において、処理部１１１は、光源１１ａからの光を被検細胞に８０ｍＷで２秒照射することにより、第１蛍光色素から蛍光を生じさせ、生じた蛍光を撮像部１９により撮像する。処理部１１１は、光が被検細胞に照射されている間に撮像を繰り返して１００枚の第１画像を取得する。ステップＳ１０５では、ステップＳ１０３と同じ光が用いられるため、ステップＳ１０５において光が照射される間に、第１蛍光色素が消光する。こうして、第１処理工程の画像取得処理が終了する。なお、ステップＳ１０５において１００枚の第１画像を取得したが、取得する画像の枚数自体はこれに限られず、たとえば１枚の画像が取得されても良い。

その後、処理部１１１は、図４（ｂ）に示すステップＳ１１１において、第１画像、第２画像および第３画像に基づいて、それぞれ、第１蛍光色素、第２蛍光色素および第３蛍光色素の回折限界画像を作成する。以下、消光および再活性化を介して取得された蛍光色素の回折限界画像のことを、特に「再活性化回折限界画像」という。

図５（ａ）に示すように、再活性化回折限界画像は、図４（ａ）のステップＳ１０３〜Ｓ１０５に示すように消光と活性化が１回だけ行われることにより取得された画像を平均化することにより作成される。したがって、第１蛍光色素の再活性化回折限界画像は、ステップＳ１０５で取得される１００枚の第１画像を平均化することにより作成される。

図５（ｂ）に示すように、回折限界画像は、図４（ａ）のステップＳ１０１、Ｓ１０２に示すように消光と活性化が行われることなく取得された画像を平均化することにより作成される。したがって、第２蛍光色素の回折限界画像は、ステップＳ１０１で取得される複数の第２画像を平均化することにより作成される。第３蛍光色素の回折限界画像は、ステップＳ１０２で取得される複数の第３画像を平均化することにより作成される。

図４（ｂ）に戻り、ステップＳ１１２において、処理部１１１は、ステップＳ１１１で取得した３つの画像を重ね合わせて参照画像を作成する。参照画像は、後述する判定結果を表示する画面に表示される。ステップＳ１１３において、処理部１１１は、ステップＳ１１１で取得した第３蛍光色素の回折限界画像に基づいて、被検細胞の核の領域を特定する。

ステップＳ１１４において、処理部１１１は、第１物質の総数を取得する。具体的には、図５（ａ）に示すように、処理部１１１は、ステップＳ１１１で取得した第１蛍光色素の再活性化回折限界画像において、ステップＳ１１３で取得した被検細胞の核の領域内にある蛍光領域の総面積を算出する。続いて、処理部１１１は、算出した蛍光領域の総面積を、予め記憶部１１２に記憶された１個の第１物質に対応する蛍光領域の面積で除算し、除算結果を第１物質の総数とする。なお、第１物質の総数の求め方は、蛍光領域の総面積を単位面積で除算する方法に限られない。たとえば、後述の第２処理工程において用いる図７の手法を１００枚の第１画像に適用して第１物質の総数を求めても良い。

図４（ｂ）に戻り、ステップＳ１１５において、処理部１１１は、ステップＳ１１４と同様にして、第２物質の総数を取得する。すなわち、処理部１１１は、ステップＳ１１１で取得した第２蛍光色素の回折限界画像において、ステップＳ１１３で取得した被検細胞の核の領域内にある蛍光領域の総面積を算出する。続いて、処理部１１１は、算出した蛍光領域の総面積を、予め記憶部１１２に記憶された１個の第２物質に対応する蛍光領域の面積で除算し、除算結果を第２物質の総数とする。ステップＳ１１４の処理とステップＳ１１５の処理とは、順序が逆になるよう入れ替えられても良い。

ステップＳ１１６において、処理部１１１は、第１物質の数の総数と第２物質の数の総数との比、すなわち、“第１物質の数／第２物質の数”を算出する。たとえば、撮像された画像に３０個の被検細胞が含まれている場合、処理部１１１は、３０個の被検細胞における第１物質の数の総数を、３０個の被検細胞における第２物質の数の総数で除算することにより、比を算出する。こうして、第１処理工程の分析処理が終了する。

ステップＳ１１６において、処理部１１１は、１個の被検細胞における第１物質の数を、１個の被検細胞における第２物質の数で除算することにより、比を算出しても良い。この場合、処理部１１１は、１個の被検細胞における第１物質の数を、被検細胞ごとに取得した第１物質の数を平均化することにより取得する。また、処理部１１１は、１個の被検細胞における第２物質の数を、被検細胞ごとに取得した第２物質の数を平均化することにより取得する。

（２）第２処理工程
第１処理工程では、撮像の際に、第１蛍光色素について消光処理と再活性化処理が１回のみ行われたが、第２処理工程では、第１蛍光色素について消光処理、再活性化処理および撮像処理を複数回繰り返して第１画像を取得する。また、第２処理工程では、取得した各第１画像について輝点を抽出し、抽出した輝点を第１物質に対応するグループに分類して第１物質の数を取得する。

なお、第２処理工程は、第１処理工程における画像取得処理および分析処理がなされた後に、これらの処理を引き継いで行われることが想定されている。したがって、第２処理工程において、画像取得処理の開始時には、第１処理工程における撮像処理すなわち図４（ａ）のステップＳ１０５によって、第１蛍光色素が消光された状態にある。第１処理工程を引き継ぐことなく独立して第２処理工程の処理を行う場合は、図６（ａ）のステップＳ１２１の前に、図４（ａ）のステップＳ１０１〜Ｓ１０３が追加され、図６（ｂ）のステップＳ１３２の後段に、図４（ｂ）のステップＳ１１３が追加され、図６（ｂ）のステップＳ１３３の後段に、図４（ｂ）のステップＳ１１５が追加される。

図６（ａ）に示すように、ステップＳ１２１において、処理部１１１は、光源１１ｃからの光を被検細胞に１５ｍＷで０．１５秒照射することにより、第１蛍光色素を活性化する。ステップＳ１２２において、処理部１１１は、光源１１ａからの光を被検細胞に８０ｍＷで２．２５秒照射することにより、第１蛍光色素から蛍光を生じさせ、生じた蛍光を撮像部１９により撮像する。処理部１１１は、光が被検細胞に照射されている間に撮像を繰り返して１００枚の第１画像を取得する。ステップＳ１２２において光が照射される間に、第１蛍光色素が消光する。

ステップＳ１２３において、処理部１１１は、第１画像の取得が終了したか否かを判定する。処理部１１１は、ステップＳ１２１、Ｓ１２２の処理を所定回数繰り返す。ここでは、ステップＳ１２１、Ｓ１２２の処理が２９回繰り返される。こうして、処理部１１１は、図４（ａ）のステップＳ１０５で取得した１００枚の第１画像と、ステップＳ１２１、Ｓ１２２の処理を２９回繰り返して取得した２９００枚の第１画像とを合わせて、計３０００枚の第１画像を取得する。

図６（ｂ）に示すように、ステップＳ１３１において、処理部１１１は、第１蛍光色素の超解像画像を作成する。

図７に示すように、超解像画像は、図４（ａ）のステップＳ１０３〜Ｓ１０５と図６（ａ）のステップＳ１２１〜Ｓ１２３により取得された第１画像に基づいて作成される。具体的には、各第１画像について、ガウスフィッティングにより蛍光の輝点が抽出される。これにより、２次元平面において、各輝点の座標が取得される。ここで、第１画像上の各蛍光領域について、ガウスフィッティングにより、所定範囲で基準波形とのマッチングが得られた場合は、この範囲に応じた広さの輝点領域が各輝点に割り当てられる。基準波形と１点でマッチングする蛍光領域の輝点については、最低レベルの広さの輝点領域が割り当てられる。こうして得られた各輝点の輝点領域が全ての第１画像について重ね合わせられることにより、超解像画像が作成される。

したがって、第１蛍光色素の超解像画像は、図４（ａ）のステップＳ１０３〜Ｓ１０５と図６（ａ）のステップＳ１２１、Ｓ１２２で取得された３０００枚の第１画像から輝点が抽出され、抽出された輝点の輝点領域が重ね合わせられることにより作成される。

図６（ｂ）に戻り、ステップＳ１３２において、処理部１１１は、ステップＳ１３１で取得した第１蛍光色素の超解像画像と、図４（ｂ）のステップＳ１１１で取得した第２蛍光色素の回折限界画像および第３蛍光色素の回折限界画像とを重ね合わせて参照画像を作成する。参照画像は、後述する判定結果を表示する画面に表示される。

ステップＳ１３３において、処理部１１１は、第１物質の数を取得する。具体的には、図７に示すように、処理部１１１は、ステップＳ１３１の超解像画像の作成時に抽出した輝点を一つの第１物質に対応するグループ毎に分類する。すなわち、処理部１１１は、まず、３０００枚の第１画像から抽出した全ての輝点を座標平面にマッピングする。次に、処理部１１１は、所定の広さの参照領域で座標平面を走査し、参照領域に含まれる輝点の数を参照する。さらに、処理部１１１は、参照領域に含まれる輝点の数が閾値よりも多く、且つ、周囲よりも多い参照領域の位置を抽出し、抽出した位置において参照領域に含まれる輝点のグループを第１物質に対応するグループに分類する。なお、第１物質に対応するグループに輝点を分類する方法はこれに限られず、他のクラスタリングの手法によって第１物質に対応するグループに輝点を分類しても良い。

ここで、図３（ａ）〜（ｄ）を参照して説明したように、一つの第１物質には、多数の第１蛍光色素が結合する。また、図３（ｃ）、（ｄ）に示すように、一つの第１物質に結合した第１蛍光色素は、まばらに活性化され、且つ、各回の消光処理および活性化処理によって活性化される第１蛍光色素の分布が異なる。このため、第１物質に対応する輝点は、第１画像ごとに僅かにずれる。しかしながら、上記のように輝点をグループ化することにより、互いに接近する、一つの第１物質に結合した複数の第１蛍光色素に基づく輝点が、一つのグループに分類される。

図６（ｂ）のステップＳ１３３において、処理部１１１は、さらに、座標平面上において、ステップＳ１１３で取得した被検細胞の核の領域を特定し、被検細胞の核の領域に含まれるグループの数を計数する。こうして、処理部１１１は、計数したグループの数を第１物質の数として取得する。ここで、第１画像に複数の被検細胞が含まれる場合、第１物質の数は、たとえば、被検細胞ごとに取得された第１物質の数を平均化することにより取得される。

このように、被検細胞の核の領域が、図４（ｂ）のステップＳ１１３において撮像部１９により撮像された撮像画像に基づいて特定されるため、ステップＳ１３３において被検細胞の核の領域と第１蛍光色素の輝点とを画像上で重ね合わせることができ、被検細胞の核の領域ごとに、第１蛍光色素の輝点を円滑に抽出できる。これにより、第１物質の数を円滑に取得できる。

ステップＳ１３４において、処理部１１１は、ステップＳ１３３で取得した第１物質の数と、１個の被検細胞における第２物質の数との比、すなわち、“第１物質の数／第２物質の数”を算出する。１個の被検細胞における第２物質の数は、図４（ｂ）のステップＳ１１５で取得した第２物質の数の総数を、被検細胞中の核の数で除算して取得される。こうして、第２処理工程の分析処理が終了する。なお、図６（ａ）のステップＳ１２２で取得される第１画像の数は１００に限られず、他の数であっても良い。

以下の説明において、第１処理工程のステップＳ１１４、Ｓ１１５で取得した第１物質の総数および第２物質の総数をもとに、核ごとの第１物質の数および第２物質の数を取得する場合には、ステップＳ１３４と同様、これら第１物質の総数および第２物質の総数を、被検細胞中の核の数で除算する処理が行われる。

上記のように、第１蛍光色素を消光させる不活性化処理を行った後、活性化処理を行うと、それぞれの第１物質に結合された第１蛍光色素のうち一部のみが活性化される。また、前回の活性化処理によって活性化されなかった第１蛍光色素が、今回の活性化処理によって活性化されることも起こり得る。したがって、不活性化処理、活性化処理および撮像処理を複数回繰り返すことにより、第１蛍光色素を満遍なく発光させつつ、それぞれの第１画像に第１蛍光色素の蛍光を分散させ得る。よって、それぞれの第１画像から、第１蛍光色素に基づく輝点を円滑に抽出できる。そして、抽出した輝点を第１物質に対応するグループに分類することにより、第１物質の数を計数できる。これにより、被検細胞における第１物質の数を精度良く計数できる。

なお、第１処理工程と第２処理工程では、第１蛍光色素を１分子レベルで検出できるように、光源１１ｃから出射される活性化のための光の強度を調整する必要がある。実施形態１の場合、活性化のための光の強度と活性化のための光の露光時間との積に比例して活性化効率は上昇し、活性化効率は所定のレベルで飽和した。活性化効率とは、消光された第１蛍光色素のうち、１回の活性化処理により活性化される第１蛍光色素の割合のことである。第１蛍光色素を精度良く検出するための活性化効率は、２０％以下であり、好ましくは１０％以下である。活性化効率が所望の値となるよう活性化のための光の強度と活性化のための光の露光時間とが調整されることにより、第１蛍光色素を精度良く検出できるようになる。

このように活性化効率を低く設定する場合、全ての第１蛍光色素を活性化させ検出するためには、消光と活性化を繰り返す回数が多い方が良い。しかしながら、繰り返し回数が多いと測定時間が長くなってしまう。そこで、実施形態１では、測定時間をできるだけ短くするために、第１処理工程と第２処理工程により消光と活性化を繰り返す総回数を３０回とした。消光と活性化を繰り返す回数は、３０回に限らず、活性化効率と測定時間とを考慮して所望の回数に設定され得る。なお、第１蛍光色素を１分子レベルで検出する必要がない場合、活性化効率は５０％以上であっても良い。活性化効率は、被検細胞内の密度によって決められる。

（３）実験
次に、発明者らが行った実験について説明する。なお、この実験では、便宜上、第２蛍光色素として、消光状態と活性状態にスイッチング可能な色素を用いたが、上記のように実施形態１では第１および第２処理工程において第２蛍光色素は消光されないため、スイッチング可能でない蛍光色素を用いても良い。このような第２蛍光色素として、たとえば、Ｃｙ２などの蛍光色素が用いられ得る。

＜ＨＥＲ２のＦＩＳＨ染色試料の作製＞
以下の工程により、実験用の試料を作成した。

ベンタナインフォームDual ISH HER2キット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を用いて、HER2 Dual ISH 3-in-1コントロールスライド（Ventana）上のＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３、陰性のＭＣＦ７細胞の染色を行った。

［FFPE試料の調整工程］
Dry Block Bath THB（アズワン）上で、６５℃、２０分間コントロールスライドを乾燥させた。７５℃で５分間、Ez Prepをスライド上に乗せ脱パラフィンを行った。この操作を５回繰り返した後、Reaction Bufferに浸漬した。Dry Block Bath THBを９０℃にし、CC2を滴下し、１０分間コンディショニングを行った。スライドが乾燥しないように、CC2は適宜追加した。この操作を３回行った後、Reaction Bufferに４分間浸漬した。この操作を３回繰り返した。スライド上にISH Protease IIを８０μＬ滴下し、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で１６分間酵素処理を行った。

2×SSCに４分間、３回浸漬し洗浄した。HybReadyとHER2 DNAカクテルプローブを混合し、スライドに３０μＬ滴下した後、カバーガラスを被せ、ペーパーボンドで封入した。Dry Block Bath THB上で９５℃で２０分間熱変性を行った。その後、４４℃のDry Block Bath THB上でオーバーナイトでハイブリダイゼーションを行った。６２℃の2×SSCに４分間浸漬し洗浄した。この操作を３回繰り返した後、Reaction Bufferに浸漬した。スライド上に１％ BSA/Reaction bufferを５００μＬ滴下し、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で２０分間ブロッキングを行った。Reaction bufferに浸漬し、洗浄した。

［染色工程］
Rabbit Anti DNP Antibodyと、Mouse Anti DIG Antibodyとを混合し、スライドに滴下し、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で２０分間反応させた。Reaction Bufferに３分間浸漬し、洗浄した。これを３回行った。AlexaFluor 647 F(ab’)₂ fragment of goatanti-rabbit IgG (H+L)(Life Technologies,A-21246)、Alexa Fluor 750 Goat Anti Mouse IgG(H+L) (Life Technologies,A-21037)、Hoechst 33342(Life Technologies, H1399) (１００ｍｇをPBS １０ｍＬに希釈して保存)を１％BSA/Reaction bufferで１０００倍希釈しスライドに８０μＬ滴下、カバーガラスを被せ、３７℃のインキュベーターに入れた湿潤箱中で２０分間反応させた。TBSTに３分間浸漬し洗浄した。この操作を３回行った。PBSに３分間浸漬し洗浄した。この操作を３回行った。精製水に浸漬し洗浄した。この操作を２回行った後、３７℃のインキュベーターで１５分間乾燥させた。

Alexa Fluor 647は、上記第１蛍光色素に対応する。Alexa Fluor 750は、上記第２蛍光色素に対応する。Hoechst 33342は、上記第３蛍光色素に対応する。

［撮像準備工程］
０．０４μｍ FluoSphere Dark Red（life technology, F8789）をPBSで希釈し、スライド上に５０μＬ滴下、カバーガラスを被せ１０分間静置した。PBS ５００μＬで洗い流し、マウントメディウム５０μＬを滴下後、カバーガラスを被せ、マニキュアで固定した。マウントメディウムの組成は下記の通りである。

１Ｍ Tris（ｐＨ ７．４） ５μＬ
１Ｍ NaCl １μＬ
２５％ glucose ４０μＬ
2-mercaptoethanol １μＬ
５０００ Ｕ／ｍＬ Glucose Oxidase １μＬ
１０００ μｇ／ｍＬ catalase １μＬ
Ｈ_２Ｏ ５１μＬ

＜第１処理工程の処理結果＞
上記試料に対して、第１処理工程による処理を行った。ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料の場合に、図４（ｂ）のステップＳ１１２で作成された参照画像を、図８（ａ）〜（ｄ）に示す。図８（ａ）〜（ｄ）において、点線矢印は、第１物質、すなわちＨＥＲ２遺伝子を示し、太線矢印は、第２物質、すなわちＣＥＰ１７を示している。

第１処理工程の処理により、図４（ｂ）のステップＳ１１６で算出された比は、ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料の場合は６．１２であり、ＨＥＲ２遺伝子増幅陰性のＭＣＦ７細胞に基づく試料の場合は０．８３であった。乳癌ガイドラインでは、比が２．２より大きいと陽性であり、比が１．８より小さいと陰性であり、比が１．８以上２．２以下であると境界としている。したがって、第１処理工程の処理によると、陽性の試料に対して適正に陽性と判断でき、陰性の試料に対して適正に陰性と判定できることが分かる。

＜第２処理工程の処理結果＞
次に、上記試料に対して、さらに第２処理工程による処理を行った。ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料の場合に、図６（ｂ）のステップＳ１３２で作成された参照画像を、図９（ａ）〜（ｄ）に示す。ＨＥＲ２遺伝子増幅陰性のＭＣＦ７細胞に基づく試料の場合に、図６（ｂ）のステップＳ１３２で作成された参照画像を、図９（ｅ）〜（ｇ）に示す。図９（ａ）〜（ｇ）においても、図８（ａ）〜（ｄ）と同様、点線矢印は、第１物質、すなわちＨＥＲ２遺伝子を示し、太線矢印は、第２物質、すなわちＣＥＰ１７を示している。

第２処理工程の処理により、図６（ｂ）のステップＳ１３４で算出された比は、ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料の場合は６．４２であり、ＨＥＲ２遺伝子増幅陰性のＭＣＦ７細胞に基づく試料の場合は１．１８であった。したがって、第２処理工程によっても、陽性の試料に対して適正に陽性と判断でき、陰性の試料に対して適正に陰性と判定できることが分かる。

＜比較例＞
次に、比較例１として、ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料に対して、消光と活性化を行わずに参照画像を取得する処理を行った。比較例１で作成された参照画像を、図１０（ａ）〜（ｄ）に示す。

このとき、算出される比は、ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料の場合は７．４８であり、ＨＥＲ２遺伝子増幅陰性のＭＣＦ７細胞に基づく試料の場合は１．１６であった。したがって、比較例１においても、陽性の試料に対して適正に陽性と判断でき、陰性の試料に対して適正に陰性と判定できることが分かる。

次に、比較例２として、ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料に対して、共焦点レーザ顕微鏡を用いて消光と活性化を行わずに参照画像を取得する処理を行った。比較例２で作成された参照画像を、図１０（ｅ）〜（ｇ）に示す。比較例２では、第２物質、すなわちＣＥＰ１７についての画像は取得されていない。

図８（ａ）〜（ｄ）に示す第１処理工程による参照画像と、図１０（ａ）〜（ｇ）に示す比較例１、２による参照画像とを比較すると、第１処理工程の方が、ＨＥＲ２遺伝子に対応する輝点が分離されていることが分かる。図８（ａ）〜（ｄ）に示す第１処理工程による参照画像と、図９（ａ）〜（ｄ）に示す第２処理工程による参照画像とを比較すると、第２処理工程の方が、ＨＥＲ２遺伝子に対応する輝点がさらに分離されていることが分かる。

図８（ａ）〜図９（ｄ）の参照画像によれば、ＨＥＲ２遺伝子増幅陽性のｃａｌｕ−３に基づく試料であっても、第２物質であるＣＥＰ１７は数が少なく、空間的によく分離されている。このため、ＣＥＰ１７に結合する第２蛍光色素は、消光させた後、再活性化させる工程を踏まずとも、分解能高く、蛍光領域が特定された。よって、このように、消光と再活性化の工程を踏まずとも蛍光領域を特定できる第２物質については、第２蛍光色素を消光させる不活性化処理を行わずに第２画像を取得することで、処理の簡素化が図られ得る。

＜その他の検証＞
第２処理工程の処理による実験では、図９（ｂ）、（ｄ）の四角で囲まれた領域に示すように、第１蛍光色素に基づく輝点領域が線状に繋がる部分が確認された。発明者らの検証によると、他のＨＥＲ２遺伝子増幅陽性の被検細胞を第２処理工程の処理により検証した場合も、図９（ｂ）、（ｄ）と同様に、超解像画像において、輝点領域が線状に繋がる部分が確認された。これは、乳癌の進行に伴い第１物質であるＨＥＲ２遺伝子の増幅が顕著となり、ＨＥＲ２遺伝子間の距離が短くなるために、輝点領域が線状に繋がって表示されたものと考えられる。よって、乳癌においては、さらに、上記比による判定とともに、第１物質の配置に関する情報、すなわち第１物質間の距離に基づいて判定を行うことにより、病状の判断や治療方針の決定を精度良く行えると考えられる。この判定は、乳癌以外の他の疾病においても、同様に適用可能であると考えられる。

ここでは、第１物質間の距離に注目したが、第１物質の種類によっては、病状または増幅の進行に伴って、第１物質間の距離の他、第１物質の位置や大きさ等の分布状況に変化が見られることが想定され得る。よって、さらに、第１物質の分布状況に基づいて判定を行うことにより、病状の判断や治療方針の決定を精度良く行えると考えられる。

（４）実施形態１の表示処理
第１処理工程の処理では、蛍光領域の総面積を蛍光１個の第１物質に対応する蛍光領域の面積で除算して、第１物質の数が取得される。この方法では、第１物質の数が少なく、第１物質間の距離が大きい場合は、再活性化回折限界画像において第１物質ごとの蛍光領域が分離されるため、比較的正しく第１物質の数を取得できる。したがって、第１処理工程の処理によっても、乳癌陰性の判定は適正に行われ得る。

しかしながら、乳癌の進行が進み、第１物質の数が増加すると、再活性化回折限界画像において第１物質ごとの蛍光領域が重なりあうことが起こり得る。このため、第１処理工程の処理では、比に基づく乳癌の判定結果の精度が低下することが起こり得る。これに対し、第２処理工程の処理では、このように第１物質の数が増加した場合でも、第１物質の数を高精度に取得できるため、適正に乳癌の判定が行われ得る。そこで、以下の表示処理では、まず、第１処理工程の処理を行って疾患マーカーの増幅が陰性であるか否かを判定し、陰性でない場合のみ、第２処理工程の処理を行う。

図１１に示すように、ステップＳ１４１において、処理部１１１は、図４（ａ）、（ｂ）に示す第１処理工程の処理を実行する。これにより、処理部１１１は、図４（ｂ）のステップＳ１１６において、第１物質の増幅の有無を示す比を取得する。ステップＳ１４２において、処理部１１１は、図４（ｂ）のステップＳ１１６で算出した比に基づいて、疾患マーカーの増幅の判定を行う。具体的には、処理部１１１は、比が２．２より大きいと陽性と判定し、比が１．８より小さいと陰性と判定し、比が１．８以上２．２以下であると境界と判定する。

続いて、ステップＳ１４３において、処理部１１１は、ステップＳ１４２の判定結果が陰性であるか否かを判定する。ステップＳ１４２の判定結果が陰性である場合、ステップＳ１４４において、処理部１１１は、第１処理工程で取得した第１物質の増幅の有無を示す比と、ステップＳ１４２で取得した判定結果とを、治療指標情報として表示部１２０に表示する。こうして、表示処理が終了する。この場合、第２処理工程に基づく判定および表示は行われない。他方、ステップＳ１４２の判定結果が陽性または境界の場合、処理部１１１は、ステップＳ１４５に処理を進める。

ステップＳ１４５において、処理部１１１は、図６（ａ）、（ｂ）に示す第２処理工程の処理を実行する。ステップＳ１４６において、処理部１１１は、図６（ｂ）のステップＳ１３４で算出した比に基づいて、疾患マーカーの増幅の判定を行う。判定方法は、ステップＳ１４２と同様である。上述したように、第２処理工程によれば、第１物質の数が精度良く計数される。したがって、ステップＳ１４６では、精度良く計数された第１物質の数に基づいて、分子標的薬の標的分子となる第１物質の増幅の判定がなされる。このため、より精度の高い病状の判定結果が得られ得る。

続いて、ステップＳ１４７において、処理部１１１は、ステップＳ１４６の判定結果が陽性であるか否かを判定する。ステップＳ１４６の判定結果が陽性である場合、ステップＳ１４８において、処理部１１１は、ステップＳ１４６で取得した判定結果を含む治療指標情報を表示部１２０に表示する。こうして、表示処理が終了する。他方、ステップＳ１４６の判定結果が陰性または境界である場合、処理部１１１は、ステップＳ１４９に処理を進める。

ステップＳ１４９において、処理部１１１は、図６（ｂ）のステップＳ１３２で作成した参照画像に、第１物質の線状構造があるか否かを判定する。第１物質の線状構造は、図９（ｂ）、（ｄ）の四角で囲まれた領域に示すような構造である。処理部１１１は、第１物質であるＨＥＲ２遺伝子間の距離が閾値よりも短いものが所定数連続する場合に、参照画像に第１物質の線状構造があると判定する。

処理部１１１は、第１物質の線状構造があると判定すると、ステップＳ１５０において、ステップＳ１４６で取得した判定結果を陽性に変更する。他方、処理部１１１は、第１物質の線状構造がないと判定すると、ステップＳ１４６で取得した判定結果を変更することなく、処理をステップＳ１４８に進める。こうして、表示処理が終了する。

ステップＳ１４２、Ｓ１４６では、第１物質の数および第２物質の数の比に基づいて乳癌の判定が行われたが、核ごとの第１物質の数を閾値と比較して乳癌の判定が行われても良い。ただし、上記のように病状の進行に伴って第１物質の数と第２物質の数のバランスが変化するような場合は、第１物質の数とともに第２物質の数をも参照して病状の判定を行うことにより、病状の判定精度を高め得る。

上記のように、乳癌では、異常な細胞分裂に伴い、被検細胞の核の中において、第１物質であるＨＥＲ２遺伝子の数が増加するため、ＨＥＲ２遺伝子の数とＣＥＰ１７の数のバランスが変化する。よって、上記の処理のように、第１物質の数と第２物質の数の比に基づいて疾患マーカーの増幅の判定を行うことにより、より的確に疾患マーカーの増幅の有無を判定できる。第１物質の数と第２物質の数のバランスを示す値は、比に限られず、たとえば第１物質の数と第２物質の数の差でも良い。

図１１のフローチャートでは、第２処理工程による判定結果が陽性で無い場合に処理がステップＳ１４９へと進められたが、判定結果に拘わらずステップＳ１４９へと処理が進められても良い。また、線状構造がある場合に、陰性または境界であるとの判定結果が陽性に変更されたが、判定結果は変更されず、線状構造があることの表示が判定結果に付記されても良い。

図１２（ａ）、（ｂ）に示すように、表示処理において表示部１２０に表示される画面２００は、結果領域２１０とコメント領域２２０を備える。結果領域２１０は、第１処理工程または第２処理工程の処理によって取得される情報を表示する。具体的には、結果領域２１０は、被検細胞１つ当たりの第１物質の数と、比と、第１物質に関連する病状の判定結果とを含む治療指標情報と、線状構造の有無を示す他の治療指標情報と、参照画像とを表示する。コメント領域２２０は、結果領域２１０の内容についての補足説明を表示する。

図１２（ａ）、（ｂ）に示す画面２００は、何れも、第２処理工程の処理が実行された場合のものである。図１２（ａ）では被検細胞に線状構造が存在せず、図１２（ｂ）では被検細胞に線状構造が存在する。

図１２（ｂ）に示す画面２００では、コメント領域２２０に線状構造があったことを示すメッセージが表示されている。図１２（ａ）、（ｂ）に示すように、画面２００には、判定結果を含む治療指標情報が表示されるため、医師等は、目視により輝点を計数するといったような煩雑な作業を要求されることなく、高精度に病状の診断を行える。医師等は、病状の診断にあたって熟練の技術が求められることがないため、医師による診断のばらつきが抑制される。第１物質の数および第２物質の数の比が結果領域２１０に表示されるため、医師等は、この比を参照することにより、治療方針を決定できる。なお、表示される治療指標情報は、図１２（ａ）、（ｂ）に示すものに限定されるものではなく、たとえば、第１物質の数の表示が省略され、あるいは、判定結果の表示が省略されても良い。

第１処理工程の判定結果が陰性では無い場合、結果領域２１０には、第２処理工程で取得された参照画像が表示される。この参照画像は、第１蛍光色素の超解像画像に基づいて作成されているため、第１蛍光色素の輝点の分布状況を示す高精度な画像である。したがって、医師等は、この画像により輝点の分布状況を参照することにより、病状をより詳細に確認できる。

第１処理工程の判定結果が陰性であり第２処理工程の処理がスキップされる場合は、第１処理工程の処理に基づく数値および判定結果と参照画像とが結果領域２１０に表示され、線状構造の欄はマスクされる。

上記のように、乳癌に罹患していない患者の被検細胞では、ＨＥＲ２遺伝子の数が少なく互いに接近しにくいため、第１処理工程の画像解析によっても、被検細胞におけるＨＥＲ２遺伝子の数を正しく計数でき、第１物質の増幅が陰性であることを精度良く判定できる。よって、第１処理工程の判定が陰性となった場合に、第２処理工程の処理がスキップされても、判定結果に問題はない。また、この場合に、第２処理工程の処理をスキップすることにより、医師等に迅速に、判定結果を提供できる。第１処理工程の判定が陰性ではない場合は、より精度よくＨＥＲ２遺伝子の数を計数できる第２処理工程の処理が実行されて判定がなされるため、医師等に精度の高い判定結果を提示できる。

２．実施形態２
実施形態２では、第２蛍光色素についても第１蛍光色素と同様に、消光と活性化が行われる。

図１３に示すように、実施形態２では、図４（ａ）の第１処理工程の処理におけるステップＳ１０１の直前にステップＳ２０１、２０２が追加される。これにより、第２物質に結合する第２蛍光色素も、ステップＳ２０１で消光された後、ステップＳ２０２で活性化されて、ステップＳ１０１で蛍光が撮像される。ステップＳ１０１の処理により、第２蛍光色素が消光される。この場合、図４（ｂ）のステップＳ１１１では、第２物質についても、第１物質と同様に再活性化回折限界画像が取得され、ステップＳ１１２において、取得された再活性化回折限界画像が他の画像と重ねられる。これにより、参照画像は、第２物質の蛍光領域が実施形態１に比べて分離される。その結果、図４（ｂ）のステップＳ１１５にて取得される第２物質の数の精度が高まる。ステップＳ２０１、Ｓ２０２、Ｓ１０１の処理と、ステップＳ１０３〜Ｓ１０５の処理とは、順序が逆になるよう入れ替えられても良い。

図１４（ａ）に示すように、実施形態２では、図６（ａ）の第２処理工程の処理におけるステップＳ１２１の前に、ステップＳ２１１〜Ｓ２１３が追加される。第２物質に結合する第２蛍光色素も、ステップＳ２１１で活性化された後、ステップＳ２１２で撮像および消光がなされる処理が、ステップＳ２１３で規定される回数繰り返されて、複数の第２画像が取得される。

この場合、図１４（ｂ）に示すように、図６（ｂ）のステップＳ１３３の後段にステップＳ２２１が追加される。ステップＳ１３１では、第２物質についても、第１物質と同様に、第２画像に対して輝点が抽出されて超解像画像が取得され、ステップＳ１３２において、取得された超解像画像が他の画像と重ねられる。これにより、参照画像において、第２物質の輝点領域の解像度が顕著に高まる。また、ステップＳ２２１では、ステップＳ１３３における第１物質の数の取得と同様に、第２物質についても、輝点をグループに分類して、第２物質の数が取得される。これにより、第２物質の数の精度が高まる。その結果、ステップＳ１３４にて算出される比の精度も高まる。

実施形態２では、第２蛍光色素に対しても消光と活性化が行われるため、実施形態１に比べて、第２物質の分布をより解像度よく表示できる。

病状の進行に伴い被検細胞における第２物質の増幅が顕著となる場合は、２つの第２物質が互いに近接することが起こり得る。この場合、近接する２つの第２物質に結合する全ての第２蛍光色素が同時に蛍光を発すると、各蛍光を分離して撮像することが困難となる。実施形態２では、第２物質に結合する第２蛍光色素についても、消光と再活性化の工程を行って蛍光を撮像するため、病状の進行に伴い第２物質の増幅が顕著となる場合にも、第２蛍光色素に基づく蛍光を分離して撮像できる。これにより、病状の判定精度が高められ得る。

実施形態２のように第２物質について超解像画像が取得される場合、第１物質と同様に、第２物質の配置や第２物質の分布状況を取得しても良い。第２物質の配置は、たとえば第２物質間の距離である。第２物質の種類によっては、病状または増幅の進行に伴って、第２物質間の距離と、第２物質の位置や大きさ等の分布状況とに変化が見られることが想定され得る。よって、さらに、第２物質間の距離や第２物質の分布状況に基づいて、病状の診断や治療方針の決定を精度良く行えると考えられる。

＜変更例＞
このように、第２蛍光色素についても、消光および活性化させる場合、第１蛍光色素および第２蛍光色素として、励起に用いる光の波長は互いに異なるが活性化に用いる光の波長は共通するスイッチング可能な蛍光色素を用い得る。この変更例では、第１蛍光色素および第２蛍光色素として、このような蛍光色素が用いられる。

この場合、図１５（ａ）に示すように、第１処理工程の処理について、図１３のステップＳ２０１以降が変更される。ステップＳ３０１、Ｓ３０２において、異なる波長の光がそれぞれ被検細胞に照射されて第２蛍光色素および第１蛍光色素が消光され、ステップＳ３０３において、所定波長の光が照射されて第２蛍光色素および第１蛍光色素が同時に活性化される。その後、ステップＳ３０４、３０５において、被検細胞に第１蛍光色素および第２蛍光色素を励起する光がそれぞれ照射されて、第１画像と第２画像が取得される。ステップＳ３０４、Ｓ３０５の処理により、第１蛍光色素および第２蛍光色素がそれぞれ消光される。

また、図１４（ａ）に示す第２処理工程の処理は、図１５（ｂ）に示すように変更される。ステップＳ３１１において、所定波長の光が照射されて第２蛍光色素および第１蛍光色素が同時に活性化され、ステップＳ３１２、Ｓ３１３において、被検細胞に第１蛍光色素および第２蛍光色素を励起する光がそれぞれ照射されて、第１画像と第２画像が取得される。ステップＳ３１２、Ｓ３１３の処理により、第１蛍光色素および第２蛍光色素がそれぞれ消光される。ステップＳ３１１〜Ｓ３１３の活性化、撮像および消光の処理が、ステップＳ３１４に規定された回数繰り返されて、複数の第１画像および第２画像が取得される。

上記のように、消光された第１蛍光色素および第２蛍光色素の活性化を同一工程にて行うことにより、処理が簡素化され得る。特に、超解像画像の取得のために消光と再活性化が多数繰り返される場合には、第１蛍光色素および第２蛍光色素の活性化を一つの工程にて行うことにより、処理が顕著に簡素化され得る。

３．実施形態３
実施形態３では、実施形態１と比較して、光学系の一部が変更され、処理部１１１によって撮像部１９の光軸方向における輝点の位置が取得される。

図１６（ａ）に示すように、細胞分析装置１０において、撮像部１９に、ビームエキスパンダ１９ｃと位相板１９ｄが追加されている。試料から生じた蛍光は、ビームエキスパンダ１９ｃと、位相板１９ｄと、集光レンズ１９ａとを順に透過した後、撮像素子１９ｂにより撮像される。

位相板１９ｄは、フーリエ面に配置され、撮像素子１９ｂの受光面に２点の焦点が現れるように点像分布関数を変調する作用を有する。１つの蛍光色素から生じた蛍光は、位相板１９ｄの作用により、撮像素子１９ｂの受光面上で２つの焦点に結像される。このとき、２つの焦点は、図１６（ｂ）に示すように、撮像部１９の光軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて受光面上で回転する。つまり、２つの焦点を結ぶ直線と、基準となる直線とがなす角が、光軸方向における蛍光の発光点の位置に応じて、撮像素子１９ｂの受光面上において変化する。

たとえば、スライドガラス２２において撮像部１９の光軸方向に異なる２つの位置にある蛍光色素から生じた蛍光は、それぞれ位相板１９ｄにより２つに分割され、撮像素子１９ｂの受光面上に照射される。このとき、受光面上における２つの焦点を結ぶ直線は、たとえば、図１６（ｂ）に示すように、一方の蛍光色素については基準線と＋θ１の角をなし、もう一方の蛍光色素については基準面と＋θ２の角をなす。したがって、２つの焦点を結ぶ直線が、基準線に対してなす角を取得すれば、光軸方向における蛍光色素の位置を取得できる。

具体的には、処理部１１１は、第２処理工程と同様、消光と活性化を繰り返して取得した第１画像について、ガウスフィッティングを行って輝点を抽出し、さらに、抽出した輝点の輝度を取得する。次に、処理部１１１は、輝度が同程度で且つ距離が所定の範囲以内にある２つの輝点をペアリングする。続いて、処理部１１１は、ペアリングした２つの輝点を、予め記憶部１１２に記憶された２つの輝点のテンプレートとフィッティングさせ、ある精度以上でフィッティングできた２つの輝点を、１つの蛍光色素から生じた蛍光が位相板１９ｄにより分割されたものであると判定する。

続いて、処理部１１１は、受光面上のペアとなる２つの輝点の中点を蛍光色素の撮像アングルにおける２次元平面上の位置とする。処理部１１１は、上述したようにペアとなる２つの輝点を結ぶ直線と、基準線とのなす角に基づいて、撮像部１９の光軸方向における蛍光色素の位置を決定する。こうして、処理部１１１は、２次元平面上の位置と、光軸方向における位置とに基づいて、複数の蛍光色素の座標点を３次元座標軸において特定し、特定した座標点を全ての第１画像について重ね合わせることにより、３次元超解像画像を作成する。

さらに、処理部１１１は、特定した座標点を、第１物質に対応するグループに分類して被検細胞における第１物質の数を取得する。座標点のグループ化は、たとえば、所定の参照空間を３次元座標空間において走査させ、この参照空間内に含まれる座標点の数が閾値より多く、且つ、周囲よりも輝点の数が多い参照空間の位置を抽出し、抽出した位置において参照空間に含まれる輝点のグループを第１物質に対応するグループに分類する。

続いて、処理部１１１は、被検細胞の３次元空間における核の範囲を取得する。具体的には、処理部１１１は、対物レンズ１７を撮像部１９の光軸方向に変位させて、光軸方向の異なる複数のフォーカス位置において画像を取得する。このとき、第３蛍光色素に基づく蛍光が検出される領域は核に対応し、第３蛍光色素に基づく蛍光が検出されない領域は、核以外、すなわち細胞質に対応する。処理部１１１は、取得した複数の画像ごとに、蛍光が検出された領域から核の輪郭を取得する。そして、処理部１１１は、各フォーカス位置とその位置の核の輪郭とに基づいて、３次元空間における核の範囲を取得する。なお、第３蛍光色素としては、上述したHoechst 33342のほかに、7-AAD、DAPI、SYTOX系蛍光色素、SYTO系蛍光色素、ヨウ化プロピジウム等が挙げられる。そして、処理部１１１は、被検細胞の核の範囲に含まれるグループの数を、第１物質の数として取得する。

たとえば、３次元超解像画像は、図１７（ａ）、（ｂ）のように取得される。各図において、Ｘ−Ｙ平面が撮像アングルにおける２次元平面であり、Ｚ軸方向が撮像部１９の光軸方向である。図１７（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、乳癌の判定結果が陰性および陽性であった試料について実際に３次元超解像画像を取得したものである。図１７（ａ）、（ｂ）の３次元超解像画像をＺ軸方向およびＹ軸方向に参照すると、図１７（ｃ）、（ｄ）に示すような画像が得られる。

３次元超解像画像が作成される場合、表示処理において、図１８に示すような画面３００が表示部１２０に表示される。画面３００は、図１２（ａ）、（ｂ）に示す画面２００と同様、結果領域３１０とコメント領域３２０を備える。結果領域３１０は、３次元超解像画像をＺ軸方向およびＹ軸方向に参照した場合の画像を表示している。結果領域３１０は、図１７（ａ）、（ｂ）に示すような３次元超解像画像を表示しても良い。

実施形態３によれば、第１蛍光色素について、撮影アングルにおける２次元平面上の位置とともに、撮像部１９の光軸方向における位置を特定可能な３次元超解像画像が取得されるため、２次元平面上では重なる輝点についても、分離して抽出できる。よって、第１物質の数をさらに正しく計数でき、医師等に、より精度の高い判定結果を提示できる。また、医師等は、３次元超解像画像を参照することにより、光軸方向における第１物質の分布をも把握でき、病状の判断や治療方針の決定をより的確に行える。

３次元超解像画像に基づいて、第１物質間の距離や第１物質の分布状況を取得しても良い。３次元超解像画像によれば、第１物質間の距離や第１物質の分布状況をより正確に把握することができるため、病状の判断や治療方針の決定をより的確に行える。また、第２物質についても３次元超解像画像を取得し、取得した３次元超解像画像に基づいて、第２物質間の距離や第２物質の分布状況を取得しても良い。この場合も、第２物質間の距離や第２物質の分布状況をより正確に把握することができるため、病状の判断や治療方針の決定をより的確に行える。

なお、実施形態１〜３では、治療対象となる疾病を乳癌とし、治療方針の判断指標となる第１物質をＨＥＲ２としたが、これに限らず、他の疾病を治療対象とし、治療方針の判断指標となる第１物質を、対象となる疾病に合わせて他の物質としても良い。また、第２物質についても、対象となる疾病に合わせて他の物質としても良い。第１物質が他の物質とされる場合、上記実施形態とは異なり、第１物質が病状により正常時から減少することも想定され得る。実施形態１〜３の手法は、適宜、第１物質の減少の検出にも用いられ得るため、ＨＥＲ２を対象とする場合と同様、第１物質の減少を精度良く検出できる。また、病状により第２物質が増減する場合も、同様に実施形態１〜３の手法を適用可能である。

１０ … 細胞分析装置
１１ … 光源部
１９ … 撮像部
１１１ … 処理部
１２０ … 表示部

Claims (10)

1. 第１蛍光色素と結合した第１物質を含む被検細胞に対し互いに異なる波長の光を照射する第１光源および第２光源と、
   被検細胞を撮像する撮像部と、
   処理部と、を備え、
   前記処理部は、
   被検細胞の前記第１蛍光色素を活性化するため、前記第１光源により被検細胞を照射させ、
   被検細胞の前記第１蛍光色素を不活性化するため、前記第２光源により被検細胞を照射させ、
   前記第１蛍光色素を不活性化するために前記第２光源により被検細胞を照射している間に、前記撮像部により複数の画像を撮像させ、
   前記撮像部により撮像された前記複数の画像に基づいて、被検細胞に含まれる前記第１物質を計数する、
   細胞分析装置。
2. 前記処理部は、前記複数の画像を合成した合成画像に基づいて、被検細胞に含まれる前記第１物質を計数する、請求項１に記載の細胞分析装置。
3. 前記処理部は、前記合成画像の蛍光領域に基づいて、被検細胞に含まれる前記第１物質を計数する、請求項２に記載の細胞分析装置。
4. 前記処理部は、前記合成画像の蛍光領域の面積と、１個の前記第1物質に対応する蛍光領域の面積とに基づいて、被検細胞に含まれる前記第１物質を計数する、請求項３に記載の細胞分析装置。
5. 前記処理部は、前記合成画像における核領域を特定し、特定した前記核領域に含まれる前記蛍光領域に基づいて、被検細胞に含まれる前記第１物質を計数する、請求項３または４に記載の細胞分析装置。
6. 前記処理部は、前記撮像部により、核を染色する核染色蛍光色素によって染色された被検細胞を撮像させ、当該画像に基づき、前記合成画像における核領域を特定する、請求項５に記載の細胞分析装置。
7. 前記処理部は、前記複数の画像を平均化することにより、前記合成画像を生成する、請求項２ないし６の何れか一項に記載の細胞分析装置。
8. 前記処理部は、
   前記第１蛍光色素が活性化状態にある被検細胞に、前記第２光源により被検細胞を照射させて前記第１蛍光色素を不活性化した後、被検細胞の前記第１蛍光色素を活性化するため、前記第１光源により被検細胞を照射させる、請求項１ないし７の何れか一項に記載の細胞分析装置。
9. 前記処理部は、被検細胞に含まれる第２物質の数を取得し、前記第1物質の数と前記第２物質の数とに基づいて、治療方針の判断の指標となる治療指標情報を取得する、請求項１ないし８の何れか一項に記載の細胞分析装置。
10. 第１蛍光色素と結合した第１物質を含む被検細胞に対し互いに異なる波長の光を照射する第１光源および第２光源と、被検細胞を撮像する撮像部と、を備える細胞分析装置のコンピュータに、
    被検細胞の前記第１蛍光色素を活性化するため、前記第１光源により被検細胞を照射させるステップ、
    被検細胞の前記第１蛍光色素を不活性化するため、前記第２光源により被検細胞を照射させるステップ、
    前記第１蛍光色素を不活性化するために前記第２光源により被検細胞を照射している間に、前記撮像部により複数の画像を撮像させるステップ、
    前記撮像部により撮像された前記複数の画像に基づいて、被検細胞に含まれる前記第１物質を計数するステップ、を実行させるためのプログラム。

Images