JP6914321B2 - カブトガニｂ因子改変体 - Google Patents
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Description
本発明は、カブトガニＢ因子改変体に関する。
医薬や食品の衛生管理やヒトを含む動物の診断において、微生物由来物質を検知し、微生物汚染の程度を測定する手段は重要である。微生物汚染の程度を測定する手段としては、リムルス試験が普及している。リムルス試験は、エンドトキシン（ＬＰＳ）や（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定対象物質として微生物汚染の程度を測定する技術であり、カブトガニが有するプロテアーゼ前駆体がこれらの測定対象物質により活性化される性質を利用した測定方法である。
リムルス試験としては、カブトガニ血球抽出液（カブトガニ・アメボサイト・ライセート。以下単に「ライセート」という）を使用する方法が普及している。この方法は、セリンプロテアーゼ前駆体（Ｃ因子、Ｂ因子およびプロクロッティングエンザイム）がエンドトキシンと接触した際に、または、セリンプロテアーゼ前駆体（Ｇ因子およびプロクロッティングエンザイム）が（１→３）−β−Ｄ−グルカンと接触した際に、逐次活性化されて進行するカスケード反応を利用する方法である。
非特許文献１には、ライセートから単離されたタキプレウス・トリデンタツスＢ因子が開示されている。また、非特許文献２には、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている。しかしながら、いずれの文献においても、Ｂ因子そのものよりも優れた酵素特性を有するＢ因子改変体については開示されていない。
Nakamura, T., Horiuchi, T., Morita, T., Iwanaga, S. (1986) J. Biochem. 99, 847-57
Muta, T., Oda, T., Iwanaga, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21384-8
本発明は、カブトガニＢ因子改変体に関する技術を提供することを課題とする。詳しくは、本発明は、カブトガニＢ因子改変体のポリペプチド、当該ポリペプチドをコードする核酸、当該核酸を保持するベクター、当該核酸および／または当該ベクターを保持する細胞、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドを用いたエンドトキシンの測定方法、当該ポリペプチドを構成成分として含むエンドトキシン測定用試薬、および、当該ポリペプチドまたは当該試薬を構成品として含むエンドトキシン測定用キット等を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において特定部位のアミノ酸残基を改変する事により、カブトガニＢ因子そのものよりも優れたプロテアーゼ活性を有するＢ因子改変体を得られることを見出した。また、本発明者らは、上記により、カブトガニＢ因子そのものよりも優れた熱安定性を有するＢ因子改変体を得られることも見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、本発明を完成させた。
前記課題は、以下の態様を包含する本発明によって解決することができる。
［１］
カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
［２］
下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるポリペプチド。
（Ａ）下記（Ａ１）又は（Ａ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号７におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ａ２）配列番号７におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（Ｂ１）又は（Ｂ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１０におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ２）配列番号１０におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列（ただし、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は置換も欠失もされない）を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
（Ｄ）上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加してなる融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
［３］
前記［１］又は［２］に記載のポリペプチドをコードする核酸。
［４］
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるＤＮＡ。
（ａ）下記（ａ１）〜（ａ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ１）配列番号５における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号５における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号６における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号６における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ１）配列番号８における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号８における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号９における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号９における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ただし、塩基番号５７７〜５７９で示される塩基は保存されている）であって、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加してなる融合ＤＮＡの塩基配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［５］
前記［３］に記載の核酸、及び／又は前記［４］に記載のＤＮＡを保持するベクター。
［６］
前記［３］に記載の核酸、前記［４］に記載のＤＮＡ、及び／又は前記［５］に記載のベクターを保持する細胞。
［７］
前記［６］に記載の細胞を用いてカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドを生成させる工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
［８］
前記［７］に記載された方法により得られるポリペプチド。
［９］
下記（１）及び（２）の工程を含む、エンドトキシンの測定方法。
（１）前記［１］、［２］又は［８］に記載のポリペプチド、カブトガニＣ因子、及び被験試料を混合する工程。
（２）上記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程。
［１０］
前記［１］、［２］又は［８］に記載のポリペプチドを構成成分として含む、エンドトキシン測定用試薬。
［１１］
前記［１］、［２］又は［８］に記載のポリペプチド又は前記［１０］に記載の試薬を構成品として含む、エンドトキシン測定用キット。
［１］
カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド。
［２］
下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるポリペプチド。
（Ａ）下記（Ａ１）又は（Ａ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号７におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ａ２）配列番号７におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（Ｂ１）又は（Ｂ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１０におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ２）配列番号１０におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列（ただし、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は置換も欠失もされない）を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
（Ｄ）上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加してなる融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
［３］
前記［１］又は［２］に記載のポリペプチドをコードする核酸。
［４］
下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるＤＮＡ。
（ａ）下記（ａ１）〜（ａ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ１）配列番号５における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号５における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号６における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号６における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ１）配列番号８における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号８における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号９における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号９における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ただし、塩基番号５７７〜５７９で示される塩基は保存されている）であって、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加してなる融合ＤＮＡの塩基配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［５］
前記［３］に記載の核酸、及び／又は前記［４］に記載のＤＮＡを保持するベクター。
［６］
前記［３］に記載の核酸、前記［４］に記載のＤＮＡ、及び／又は前記［５］に記載のベクターを保持する細胞。
［７］
前記［６］に記載の細胞を用いてカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドを生成させる工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
［８］
前記［７］に記載された方法により得られるポリペプチド。
［９］
下記（１）及び（２）の工程を含む、エンドトキシンの測定方法。
（１）前記［１］、［２］又は［８］に記載のポリペプチド、カブトガニＣ因子、及び被験試料を混合する工程。
（２）上記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程。
［１０］
前記［１］、［２］又は［８］に記載のポリペプチドを構成成分として含む、エンドトキシン測定用試薬。
［１１］
前記［１］、［２］又は［８］に記載のポリペプチド又は前記［１０］に記載の試薬を構成品として含む、エンドトキシン測定用キット。
本発明によれば、カブトガニＢ因子そのものよりも優れたプロテアーゼ活性を有するＢ因子改変体を提供することができる。また、本発明によれば、カブトガニＢ因子そのものよりも優れた熱安定性を有するＢ因子改変体を提供することができる。
本発明において「リムルス因子」とは、Ｃ因子、Ｂ因子およびプロクロッティングエンザイム（凝固酵素前駆体）を個別にまたは総称していう。また、本発明において「リムルス試薬」とは、任意のリムルス因子を構成成分として含み、リムルス試験に用いられる試薬をいう。
本発明においては、エンドトキシンと接触したＣ因子が自己触媒的に活性型（活性型Ｃ因子）に変化し、当該活性型Ｃ因子のプロテアーゼ活性によりＢ因子が切断されて活性型Ｂ因子に変化する一連の反応を「カスケード反応」と称する場合がある。また、本発明においては、当該一連の反応に加えて、当該活性型Ｂ因子のプロテアーゼ活性によりプロクロッティングエンザイム（凝固酵素前駆体）が切断されてクロッティングエンザイム（凝固酵素）に変化する反応をも含む一連の反応を「カスケード反応」と称する場合もある。
＜１＞本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において特定部位のアミノ酸残基が改変されていることを特徴とするポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、具体的には、カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明のポリペプチドは、カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において特定部位のアミノ酸残基が改変されていることを特徴とするポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、具体的には、カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
カブトガニＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列においてＮ末端の２３残基はシグナル配列として機能することが知られている（非特許文献２）。よって、上記本発明のポリペプチドにおいては、当該シグナル配列を有する態様のポリペプチドの他、シグナル配列を有しない態様のポリペプチド（Ｎ末端側の２３残基を有しない態様のポリペプチド）や他のシグナル配列（カブトガニが本来的に有するシグナル配列以外のシグナル配列）を有する態様のポリペプチドも上記本発明のポリペプチドの一態様であることを当業者は理解できる。
本発明において、カブトガニの種類は、特に限定されない。カブトガニとしては、タキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、リムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）の４種が知られており、これらのカブトガニを本発明におけるカブトガニとして例示することができる。本発明のポリペプチドは、例えば、これらのカブトガニにおけるＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列において１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明において、カブトガニは、タキプレウス・トリデンタツス、リムルス・ポリフェムスまたはカルシノスコルピウス・ロツンディカウダであることが好ましく、タキプレウス・トリデンタツスまたはリムルス・ポリフェムスであることがより好ましい。
本発明のポリペプチドとしては、具体的には、下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるポリペプチドが例示される。
（Ａ）下記（Ａ１）又は（Ａ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号７におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ａ２）配列番号７におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（Ｂ１）又は（Ｂ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１０におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ２）配列番号１０におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列（ただし、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は置換も欠失もされない）を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
（Ｄ）上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加してなる融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
（Ａ）下記（Ａ１）又は（Ａ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号７におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ａ２）配列番号７におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（Ｂ１）又は（Ｂ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１０におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ２）配列番号１０におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列（ただし、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は置換も欠失もされない）を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
（Ｄ）上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加してなる融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
本発明において「アミノ酸配列を有するポリペプチド」は、当該「アミノ酸配列からなるポリペプチド」を一態様として包含する。
上記（Ａ）においていう配列番号７に示されるアミノ酸配列は、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）における１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されてなるアミノ酸配列である。
上記（Ｂ）においていう配列番号１０に示されるアミノ酸配列は、リムルス・ポリフェムスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）における１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されてなるアミノ酸配列である。
上記（Ｃ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列は、上記（Ａ）または（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されているが、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は置換も欠失もされていない（１９３位のＣｙｓ残基が保存されている）アミノ酸配列である。なお、上記１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基とは、配列番号７又は１０のアミノ酸配列において保存されるシステイン（Ｃｙｓ）残基の位置を示したものである。よって、上記（Ａ）または（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個もしくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列（すなわち、上記（Ｃ）に示されるアミノ酸配列）において保存されているシステイン（Ｃｙｓ）残基は、元のアミノ酸配列（上記（Ａ）または（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列）とのアラインメントにおいて、上記１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基に相当する位置のシステイン（Ｃｙｓ）残基である。
上記（Ｃ）においていう「複数個」とは、置換、欠失、挿入、及び／又は付加してもポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を失わない程度のアミノ酸残基の数（総数）を意味する。「複数個」とは、例えば、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の総数に対して、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下の数であってよい。
よって、上記（Ａ１）または（Ｂ１）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列の場合、アミノ酸残基の総数が４００個であるので、「複数個」とは、好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜８個、特に好ましくは２〜４個であってよい。また、上記（Ａ２）または（Ｂ２）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列の場合、アミノ酸残基の総数が３７７個であるので、「複数個」とは、好ましくは２〜３７個、より好ましくは２〜１８個、さらに好ましくは２〜７個、特に好ましくは２〜３個であってよい。上記（Ｃ）において「複数個」とは、具体的な個々の数としては、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個等の整数であってよい。
上記（Ｃ）においていう「置換、欠失、挿入、及び／又は付加」は、例えば、保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合にはＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合にはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合にはＧｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合にはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合にはＡｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合にはＳｅｒ、Ｔｈｒ間で、お互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が例示される。
上記（Ｃ）に示されるポリペプチドは、例えば、上記（Ａ）または（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の類似性を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド（ただし、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は保存されている）であってもよい。なお、ここにいう「類似性」（similarity）は「同一性」（identity）を含む概念であるので、類似性を同一性と読み替えて当該ポリペプチドの好適態様に適用することができる。
上記（Ｃ）に示されるポリペプチドは、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基が置換も欠失もされていない（１９３位のＣｙｓ残基が保存されている）限り、上記（Ａ）または（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において任意のアミノ酸残基が置換または欠失されていてよいが、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）およびリムルス・ポリフェムスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）の間で保存されている（同じ位置に存在する）他のＣｙｓ残基も保存されている（置換も欠失もされていない）ことが好ましい。上記（Ｃ）に示されるポリペプチドは、具体的には、上記（Ａ）または（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１１２位、１７７位、１９３位、２６０位、３０７位、３２９位、３４０位、３６８位のＣｙｓ残基が保存されている（置換も欠失もされていない）ことが好ましい。
上記（Ｄ）においていう「ペプチドタグ」とは、検出や精製を容易にするためにポリペプチドに付加されるペプチドを意味する。「ペプチドタグ」の長さおよびアミノ酸配列は、ペプチドタグを上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加してなる融合ポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有する限り、特に限定されない。そのようなペプチドタグとしては、６×Ｈｉｓペプチド（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ）、ｃ−ｍｙｃペプチド（ｍｙｃタグ）、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）等が例示される。
ペプチドタグは、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドに直接付加されていてもよいし、任意のリンカーを介して付加されていてもよい。ここにいう「リンカー」は、任意のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってよい。ここにいう「ペプチドリンカー」の長さおよびアミノ酸配列は、ペプチドタグの場合と同様、ペプチドタグを上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドに付加した融合ポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有する限り、特に限定されない。
ペプチドタグは、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付加されていてよい。ペプチドタグは、ポリペプチドのＮ末端側にのみ付加されていてもよいし、Ｃ末端側にのみ付加されていてもよいし、両末端に付加されていてもよい。ポリペプチドに付加されるペプチドタグは１種であってもよいし、２種またはそれ以上であってもよい。また、ポリペプチドに付加される各種ペプチドタグはそれぞれ独立して１個であってもよく、２個またはそれ以上であってもよい。
本発明において「カブトガニＢ因子の機能」とは、カブトガニのＢ因子が有するプロテアーゼ前駆体としての機能を意味する。「カブトガニＢ因子の機能」とは、具体的には、活性型Ｃ因子と接触して活性型（活性型Ｂ因子）に変化し、プロテアーゼ活性を発現する機能を意味する。
カブトガニＢ因子の機能は、例えば、活性型Ｃ因子と接触して活性型（活性型Ｂ因子）に変化し、凝固酵素前駆体を切断して凝固酵素に変化させる機能である。また、カブトガニＢ因子の機能は、例えば、活性型Ｃ因子と接触して活性型（活性型Ｂ因子）に変化し、活性型Ｂ因子の基質となる検出用基質を切断して標識物質を遊離させる機能である。ここにいうＣ因子および凝固酵素前駆体ならびに検出用基質としては、例えば、後述する本発明の測定方法に記載された態様を好適に用いることができる。
ポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有するか否かは、例えば、活性型Ｃ因子と接触させることによって当該ポリペプチドがプロテアーゼ活性を発現するか否かを評価することにより判定することができる。ポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有するか否かは、具体的には、例えば、後述する＜実施例２＞または＜実施例５＞に記載された方法により判定することができる。
また、ポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有するか否かは、例えば、Ｃ因子と組み合わせて構成したリムルス試薬を用いた場合に、エンドトキシンと共存させることによってカスケード反応が進行するか否かを評価することにより判定することもできる。
さらに、ポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有するか否かは、例えば、Ｃ因子および凝固酵素前駆体と組み合わせて構成したリムルス試薬を用いた場合に、エンドトキシンと共存させることによってカスケード反応が進行するか否かを評価することにより判定することもできる。
よって、上記（Ｃ）に示されるポリペプチドは、例えば、カブトガニＢ因子の機能を指標として、カブトガニＢ因子の機能を失わずに１個もしくは複数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を行うことが可能な部位を、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列から選択して得ることができる。また、上記（Ｄ）に示されるポリペプチドは、例えば、カブトガニＢ因子の機能を指標として、カブトガニＢ因子の機能を失わずにペプチドタグを付加できるポリペプチドを、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドから選択して得ることができる。
本発明のポリペプチドの一態様は、カブトガニＢ因子そのものよりも高いプロテアーゼ活性を発現するポリペプチドである。カブトガニＢ因子そのものとは、具体的には、天然のカブトガニＢ因子と同じアミノ酸配列からなるポリペプチドである。カブトガニＢ因子そのものとは、より具体的には、例えば、上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列において、１９３位のアミノ酸残基がアラニン（Ａｌａ）残基に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）である。本発明のポリペプチドは、例えば、活性型Ｃ因子と接触して活性型（活性型Ｂ因子）に変化して発現するプロテアーゼ活性（比活性）が、カブトガニＢ因子そのものと比較して２倍以上、好ましくは５倍以上、より好ましくは１０倍以上であることを特徴とするポリペプチドであってよい。また、本発明のポリペプチドは、例えば、活性型Ｃ因子と接触して活性型（活性型Ｂ因子）に変化して発現するプロテアーゼ活性（比活性）が、８０ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌ以上、好ましくは２００ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌ以上、より好ましくは３００ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌ以上、特に好ましくは４００ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌ以上であることを特徴とするポリペプチドであってよい。ここで、１ｕｎｉｔは３７℃において１分間に１μｍｏｌの基質（検出用基質）を切断するプロテアーゼ活性に相当する。酵素活性（ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌ）の測定条件は、具体的には、例えば、＜実施例２＞または＜実施例５＞に記載の条件であってよい。
本発明のポリペプチドの一態様は、カブトガニＢ因子そのものよりも高い熱安定性を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、例えば、５０℃で２分間加熱したポリペプチドを活性型Ｃ因子と接触させて活性型（活性型Ｂ因子）に変化させた際に発現するプロテアーゼ活性（比活性）が、加熱していないポリペプチドと比較して５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上であることを特徴とするポリペプチドであってよい。また、本発明のポリペプチドは、例えば、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で２分間加熱した後においてもカブトガニＢ因子の機能を失わないことを特徴とするポリペプチドであってよい。
本発明のポリペプチドは、例えば、６０℃で２分間加熱したポリペプチドを活性型Ｃ因子と接触させて活性型（活性型Ｂ因子）に変化させた際に発現するプロテアーゼ活性（比活性）が、加熱していないポリペプチドと比較して３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上であることを特徴とするポリペプチドであってよい。また、本発明のポリペプチドは、例えば、９０℃で２分間加熱したポリペプチドを活性型Ｃ因子と接触させて活性型（活性型Ｂ因子）に変化させた際に発現するプロテアーゼ活性（比活性）が、加熱していないポリペプチドと比較して２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上であることを特徴とするポリペプチドであってよい。
活性型Ｂ因子のプロテアーゼ活性は、例えば、後述する＜実施例２＞または＜実施例５＞に記載の活性型Ｃ因子と接触させて活性化させたＢ因子（活性型Ｂ因子）のプロテアーゼ活性を測定する方法により測定することができる。
ここで、カブトガニのリムルス因子においてポリペプチドのアミノ酸配列は相同性があり、種の間において高い類似性を有している。アミノ酸配列の類似性は、周知のコンピュータソフトウェアを用いて算出することができ、例えば、アルゴリズムBLAST（Karlin, S., Altschul, SF. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 5873-7）やFASTA（Pearson, WR. (1990) Methods. Enzymol. 183, 63-98）を用いて算出することができる。アミノ酸配列の類似性は、具体的には、例えば、GENETYX（ゼネティックス社製）を用いて算出することができる。
例えば、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチド（配列番号２、ＮＣＢＩ番号：BAA03528.1）とリムルス・ポリフェムスＢ因子のポリペプチド（配列番号４、ＮＣＢＩ番号：XP_013784210.1）は９８．５％の類似性を有している。
また、例えば、タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のポリペプチド（配列番号１２、ＮＣＢＩ番号：BAA14315.1）とリムルス・ポリフェムスＣ因子のポリペプチド（配列番号１４）は９９．５％の類似性を、タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のポリペプチドとカルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のポリペプチド（配列番号１６、ＮＣＢＩ番号：AAB34361.1）は９９．８％の類似性を、リムルス・ポリフェムスＣ因子のポリペプチドとカルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のポリペプチドは９９．４％の類似性を、それぞれ有している。
さらに、例えば、タキプレウス・トリデンタツス凝固酵素前駆体のポリペプチド（配列番号１８、ＮＣＢＩ番号：AAA30094.1）とリムルス・ポリフェムス凝固酵素前駆体のポリペプチド（配列番号２０、ＮＣＢＩ番号：XP_013783518.1）は９６．０％の類似性を有している。
よって、本発明の技術は、後述する実施例において、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子およびリムルス・ポリフェムスＢ因子の各ポリペプチドの改変によって実証されるが、その他のカブトガニＢ因子のポリペプチドに対しても適用可能であることを当業者は理解できる。例えば、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダＢ因子およびタキプレウス・ギガスＢ因子の各ポリペプチドのアミノ酸配列ならびに当該ポリペプチドをコードする塩基配列は未だ知られていないものの、本発明の技術はこれらのＢ因子のポリペプチドに対しても適用できることを当業者は理解できる。
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドからなる態様であってもよいし、他の成分を含む態様であってもよい。ここにいう「他の成分」は、本発明のポリペプチドの機能を失わせる成分でない限り特に制限されない。「他の成分」としては、緩衝剤、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、界面活性剤が例示される。また、「他の成分」としては、本発明のポリペプチドを生成する細胞に由来する本発明のポリペプチド以外の成分（核酸、タンパク質、糖質、脂質等）も例示される。
本発明のポリペプチドは、任意の形状であってよい。本発明のポリペプチドは、例えば、凍結乾燥物等の固形状であってもよく、水性溶媒等の任意の溶媒に溶解された状態の液状であってもよい。
本発明のポリペプチドにおいて本発明のポリペプチドが占める重量濃度は、例えば、０．００１％以上、０．０１％以上、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、２５％以上、または５０％以上であってよい。また、本発明のポリペプチドにおいて本発明のポリペプチドが占める重量濃度は、例えば、１００％以下、７５％以下、５０％以下、２５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下であってよい。
本発明のポリペプチドは、本明細書の記載に基づいて、公知の手法により調製することができる。本発明のポリペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法により調製することができる。本発明のポリペプチドは、具体的には、例えば、後述する本発明の製造方法により調製することができる。本発明のポリペプチドは、例えば、当該本発明の製造方法に従って細胞を培養して得られる培養液そのものであってもよいし、当該培養液を所望の程度に精製した画分であってもよい。
＜２＞本発明の核酸
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である限り、特に限定されない。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である限り、遺伝暗号（コドン）の縮重（縮退）によって異なっているが同一のポリペプチドをコードする塩基配列を有する全ての核酸を包含する。ここにいう「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である限り、特に限定されない。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸である限り、遺伝暗号（コドン）の縮重（縮退）によって異なっているが同一のポリペプチドをコードする塩基配列を有する全ての核酸を包含する。ここにいう「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが包含される。
本発明の核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。本発明の核酸が二本鎖である場合は、ＤＮＡとＲＮＡからなるハイブリッド鎖であってもよい。また、本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸であるから、本発明のポリペプチドをコードする領域内にイントロンの配列を有する核酸であってもよく、当該領域内にイントロンの配列を有しない核酸であってもよい。さらに、本発明の核酸は、ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体または成熟ｍＲＮＡ）であってもよく、ｍＲＮＡから逆転写反応によって合成されたＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい。本発明の核酸は、単離された核酸であってよい。
本発明の核酸は、例えば、カブトガニＢ因子のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの塩基配列において、塩基番号５７７の塩基がチミン（Ｔ）、塩基番号５７８の塩基がグアニン（Ｇ）、塩基番号５７９の塩基がチミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）に置換された塩基配列を有するＤＮＡであって、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明の核酸としては、具体的には、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるＤＮＡが例示される。
（ａ）下記（ａ１）〜（ａ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ１）配列番号５における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号５における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号６における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号６における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ１）配列番号８における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号８における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号９における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号９における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ただし、塩基番号５７７〜５７９で示される塩基は保存されている）であって、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加してなる融合ＤＮＡの塩基配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）下記（ａ１）〜（ａ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ１）配列番号５における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号５における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号６における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号６における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ１）配列番号８における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号８における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号９における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号９における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ただし、塩基番号５７７〜５７９で示される塩基は保存されている）であって、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加してなる融合ＤＮＡの塩基配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
本発明において「塩基配列を有する核酸」は、当該「塩基配列からなる核酸」を一態様として包含する。よって、本発明において「塩基配列を有するＤＮＡ」は、当該「塩基配列からなるＤＮＡ」を一態様として包含する。
上記（ａ）においていう配列番号５に示される塩基配列は、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号１）の塩基配列において、塩基番号５７７の塩基がチミン（Ｔ）に、塩基番号５７８の塩基がグアニン（Ｇ）に、塩基番号５７９の塩基がチミン（Ｔ）に置換された塩基配列である。
上記（ａ）においていう配列番号６に示される塩基配列は、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号１）の塩基配列において、塩基番号５７７の塩基がチミン（Ｔ）に、塩基番号５７８の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された塩基配列である。
上記（ｂ）においていう配列番号８に示される塩基配列は、リムルス・ポリフェムスＢ因子のポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号３）の塩基配列において、塩基番号５７７の塩基がチミン（Ｔ）に、塩基番号５７８の塩基がグアニン（Ｇ）に置換された塩基配列である。
上記（ｂ）においていう配列番号９に示される塩基配列は、リムルス・ポリフェムスＢ因子のポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号３）の塩基配列において、塩基番号５７７の塩基がチミン（Ｔ）に、塩基番号５７８の塩基がグアニン（Ｇ）に、塩基番号５７９の塩基がシトシン（Ｃ）に置換された塩基配列である。
上記（ｃ）においていう「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。よって、ここにいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、上記（ａ）または（ｂ）に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対し、特異的なハイブリッドが形成される条件を意味する。ストリンジェントな条件としては、類似性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の類似性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより類似性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が例示される。このような条件としては、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件が例示される。また、このような条件としては、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、および１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡからなる溶液中で４２℃においてハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる溶液で室温において洗浄し、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳからなる溶液で５０℃においてさらに洗浄する条件も例示される（Sambrook J, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）。
上記（ｃ）に示されるＤＮＡは、例えば、上記（ａ）または（ｂ）に示されるＤＮＡに対して核酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加（以下総称して「変異の導入」という）を同塩基配列における塩基番号５７７〜５７９以外の領域に行うことで調製することができる。ここにいう「変異の導入」は、例えば、公知の方法により行うことが可能である。
「変異の導入」を行う方法としては、制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる方法が例示される。すなわち、変異を導入したＤＮＡ断片の両末端を制限酵素によって限定分解し、同じ制限酵素で限定分解した上記（ａ）または（ｂ）に示されるＤＮＡをサブクローニングしたベクターと混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって両者をライゲーションさせることにより、変異を導入したＤＮＡを得ることができる。ここにいう「変異を導入したＤＮＡ断片」は、例えば、そのような変異を導入したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応により得ることができる。
また、「変異の導入」を行う方法としては、部位特異的変異導入法も例示される。部位特異的変異導入法としては、ＰＣＲ反応を用いる方法（Higuchi, R. (1989) in PCR technology (Erlich, H. A., ed.) Stockton Press, New York, pp. 61-70、Carter, P. (1987) Methods Enzymol. 154, 382-403）や、ファージを用いる方法（Kramer, W., Fritz, H. J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-67、Kunkel, T. A., Roberts, J. D., Zakour, R. A. (1987) Methods Enzymol. 154, 367-82）が例示される。部位特異的変異導入法は、具体的には、例えば、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社製）を利用して行うことができる。
上記（ｃ）に示されるＤＮＡは、塩基番号５７７〜５７９で示される部位に変異の導入が行われていない（塩基番号５７７〜５７９で示される塩基が保存されている）限り、上記（ａ）または（ｂ）に示されるＤＮＡの塩基配列において任意の部位に変異の導入が行われていてよいが、タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）およびリムルス・ポリフェムスＢ因子のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）の間で保存されている（同じ位置に存在する）他のＣｙｓ残基も保存されている（置換も欠失もされていない）ポリペプチドをコードするＤＮＡであることが好ましい。上記（ｃ）に示されるＤＮＡは、具体的には、塩基番号３３４〜３３６、塩基番号５２９〜５３１、塩基番号５７７〜５７９、塩基番号７７８〜７８０、塩基番号９１９〜９２１、塩基番号９８５〜９８７、塩基番号１０１８〜１０２０、塩基番号１１０２〜１１０４で示される塩基配列（コドン）が保存されている（ＴＧＴまたはＴＧＣである）ことが好ましい。
上記（ｄ）においていう「ペプチドタグ」の態様は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」における態様と同じである。よって、ＤＮＡがコードするポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有する限りにおいて、ペプチドタグをコードするＤＮＡを上記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示されるＤＮＡに付加した融合ＤＮＡも本発明の核酸として例示される。
このような「ペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡ」は、例えば、制限酵素およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる方法により調製することができる。すなわち、ペプチドタグをコードするＤＮＡ断片の両末端を制限酵素によって限定分解し、同じ制限酵素で限定分解した上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるＤＮＡをサブクローニングしたベクターと混合した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって両者をライゲーションさせることにより、当該ＤＮＡを得ることができる。
また、このような「ペプチドタグをコードするＤＮＡを付加した融合ＤＮＡ」は、例えば、当該ペプチドタグをコードするＤＮＡの塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに示されるＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ反応によっても得ることができる。
本発明の核酸がコードするポリペプチドは、例えば、後述する本発明の製造方法により調製することができる。本発明の製造方法としては、具体的には、後述する＜実施例１＞または＜実施例４＞に記載の哺乳類細胞を用いる方法が例示される。
本発明の核酸がコードするポリペプチドは、カブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドである。ここにいう「カブトガニＢ因子の機能」の定義は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」における記載の通りである。よって、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」に記載された方法に従って、核酸がコードするポリペプチドがカブトガニＢ因子の機能を有するか否かを判定することにより、上記（ｃ）または（ｄ）に示されるＤＮＡを選択することができる。
本発明の核酸は、本明細書の記載に基づいて、公知の手法により調製することができる。本発明の核酸は、遺伝子工学的手法によって調製することができる。本発明の核酸は、具体的には、例えば、後述する＜実施例１＞または＜実施例４＞に記載のＰＣＲ反応により調製することができる。また、本発明の核酸は、例えば、その塩基配列を化学的に全合成することによっても調製することができる。
＜３＞本発明のベクター
本発明のベクターは、本発明の核酸を保持するベクターである。本発明のベクターが保持する本発明の核酸の種類や数は特に限定されない。本発明のベクターが保持する本発明の核酸は１種であってもよいし、２種またはそれ以上であってもよい。また、本発明のベクターが保持する各種の本発明の核酸はそれぞれ独立して１個（１コピー）であってもよく、２個（２コピー）またはそれ以上であってもよい。
本発明のベクターは、本発明の核酸を保持するベクターである。本発明のベクターが保持する本発明の核酸の種類や数は特に限定されない。本発明のベクターが保持する本発明の核酸は１種であってもよいし、２種またはそれ以上であってもよい。また、本発明のベクターが保持する各種の本発明の核酸はそれぞれ独立して１個（１コピー）であってもよく、２個（２コピー）またはそれ以上であってもよい。
ここにいう「ベクター」は、本発明の核酸の増幅および／または本発明の核酸がコードするポリペプチドの発現のために用いられる核酸分子を意味する。本発明においてベクターは、これを導入する細胞において本発明の核酸もしくは当該ベクターの増幅または本発明の核酸がコードするポリペプチドの発現が可能なベクターである限り、特に限定されない。そのようなベクターとしては、ファージ、プラスミド、ウイルス等が例示される。
ベクターは、これを導入する細胞の種類や本発明の核酸がコードするポリペプチドの所望の発現量等の諸条件に応じて適宜選択することができる。例えば、細胞として細菌細胞等の原核細胞を利用する場合、ベクターとしては、ファージやプラスミドを好適に利用することができる。また、例えば、細胞として昆虫細胞や哺乳類細胞等の真核細胞を利用する場合、ベクターとしては、プラスミドやウイルスを好適に利用することができる。
哺乳類細胞で利用できるプラスミドとしては、例えば、pCA7（Takeda, M., Ohno, S., Seki, F., Nakatsu, Y., Tahara, M., Yanagi, Y. (2005) J. Virol. 79, 14346-54.）、pCI-neo（Promega社製）が例示される。昆虫細胞で利用できるプラスミドとしては、pIZ-V5（Life Technologies社製）が例示される。細菌細胞で利用できるプラスミドとしては、pBlue Script II SK(+)（アジレント・テクノロジー社製）、ｐＥＴ（タカラバイオ社製）が例示される。
哺乳類細胞で利用できるウイルスとしては、動物ウイルスが例示される。動物ウイルスとしては、センダイウイルスが例示される。昆虫細胞で利用できるウイルスとしては、バキュロウイルス（Baculovirus）が例示される。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（Nuclear Polyhedrosis Virus；NPV）が例示される。
細菌細胞で利用できるファージとしては、バクテリオファージ（Bacteriophage）が例示される。バクテリオファージとしては、ラムダファージ（λファージ）やＴ４ファージが例示される。
本発明のベクターは、例えば、ベクターへ本発明の核酸を導入することにより得られる。ベクターへの本発明の核酸の導入は、常法に従って行うことができる。
ベクターに本発明の核酸を導入する方法としては、ベクターが有するマルチクローニングサイトを利用する方法が例示される。例えば、ベクターが有するマルチクローニングサイトに存在する制限酵素サイトから任意の２つを選択し、ベクターと本発明の核酸をこれらの制限酵素で限定分解した後にライゲーションすることにより、本発明のベクターを得ることができる。当該用途における本発明の核酸としては、例えば、制限酵素サイトを５’末端側に付加したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、本発明の核酸を鋳型として用いるＰＣＲ反応によって得られるＤＮＡを用いることができる。また、例えば、カブトガニＢ因子のポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを鋳型としたインバースＰＣＲ反応によって、当該ポリペプチドのアミノ酸配列において１９３位のアミノ酸残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基となるように変異の導入を行うことにより、本発明のベクターを得ることもできる。本発明のベクターを製造する方法としては、具体的には、後述する＜実施例１＞または＜実施例４＞に記載された方法が例示される。
＜４＞本発明の細胞
本発明の細胞は、本発明の核酸および／または本発明のベクター（以下、総称して「本発明のベクター等」という）を保持する細胞である。本発明のベクターは本発明の核酸を有するベクターであるので、本発明のベクターを保持する細胞は、本発明の核酸を保持する細胞にも該当する。
本発明の細胞は、本発明の核酸および／または本発明のベクター（以下、総称して「本発明のベクター等」という）を保持する細胞である。本発明のベクターは本発明の核酸を有するベクターであるので、本発明のベクターを保持する細胞は、本発明の核酸を保持する細胞にも該当する。
本発明の細胞は、例えば、本発明のベクター等を細胞に導入することにより得ることができる。よって、本発明の細胞は、例えば、細胞を本発明のベクター等を用いて形質転換（形質導入）することにより得ることができる。本発明において細胞は、本発明のベクター等の導入やこれを用いた形質転換が可能である限り特に限定されない。本発明において細胞は、単離された細胞であることが好ましい。
本発明の細胞が保持する本発明のベクター等の種類や数は特に限定されない。本発明の細胞が保持する本発明のベクター等は１種であってもよいし、２種またはそれ以上であってもよい。また、本発明の細胞が保持する各種の本発明のベクター等はそれぞれ独立して１個（１コピー）であってもよく、２個（２コピー）またはそれ以上であってもよい。
本発明の細胞は、染色体上に本発明のベクター等を保持していてもよく、染色体外に本発明のベクター等を保持していてもよく、染色体上と染色体外の両方に本発明のベクター等を保持していてもよい。本発明の細胞は、具体的には、本発明のベクター等を導入またはこれを用いて形質転換された細胞であってよい。
本発明の細胞において「細胞」は、例えば、宿主細胞である。ここにいう「宿主細胞」は、本発明のベクター等を増幅させるための宿主として、および／または本発明のベクター等がコードする本発明のポリペプチドを発現させるための宿主として用いられる細胞を意味する。
本発明において細胞は、本発明のベクター等を使用する目的に応じて適宜選択できる。
例えば、本発明のベクター等の増幅を目的とする場合は、細胞は、原核細胞であることが好ましく、具体的には、細菌細胞であることが好ましく、中でも大腸菌（Escherichia coli）であることが好ましい。大腸菌としては、ＪＭ１０９株やＤＨ５α株が例示される。
また、例えば、本発明のベクター等がコードするポリペプチドの発現を目的とする場合は、細胞としては、例えば、その細胞が本来的に有しないポリペプチドを発現させるために通常用いられる細胞を利用できる。そのような細胞は、例えば、真核細胞であることが好ましく、具体的には、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞または酵母細胞であることが好ましい。真核細胞は、哺乳類細胞または昆虫細胞であることが好ましく、哺乳類細胞であることがより好ましい。
哺乳類細胞は、霊長類の細胞またはげっ歯類の細胞であることが好ましい。霊長類としては、ヒト、サル、チンパンジーが例示される。霊長類の細胞としてはヒトの細胞が例示される。ヒトの細胞としては、具体的には、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ細胞）が例示される。ＨＥＫ細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞が例示される。ＨＥＫ２９３細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞が例示される。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ−細胞が例示される。また、げっ歯類としては、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが例示される。げっ歯類の細胞としてはハムスターの細胞が例示される。ハムスターの細胞としては、チャイニーズハムスターの細胞が例示される。チャイニーズハムスターの細胞としては、ＣＨＯ細胞が例示される。ＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞が例示される。
細胞への核酸の導入は、常法に従って行うことができる。本発明において細胞へ核酸を導入する方法は、細胞への本発明のベクター等の導入が可能な方法である限り特に限定されない。細胞へ核酸を導入する方法としては、具体的には、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が例示される。細胞の形質転換は、例えば、後述する＜実施例１＞または＜実施例４＞に記載された方法により行うことができる。
＜５＞本発明の製造方法
本発明の製造方法は、本発明の細胞を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法である。本発明の製造方法は、具体的には、本発明の細胞を用いて本発明のポリペプチドを生成させる工程（以下「生成工程」という）を含む、ポリペプチドの製造方法である。生成工程は、例えば、本発明の細胞を培養して本発明のポリペプチドを発現させる工程である。
本発明の製造方法は、本発明の細胞を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法である。本発明の製造方法は、具体的には、本発明の細胞を用いて本発明のポリペプチドを生成させる工程（以下「生成工程」という）を含む、ポリペプチドの製造方法である。生成工程は、例えば、本発明の細胞を培養して本発明のポリペプチドを発現させる工程である。
本発明の製造方法において本発明の細胞を培養する条件（以下単に「培養条件」という）は、本発明のポリペプチドを細胞に発現させることができる条件である限り特に制限されない。培養条件は、細胞の種類や本発明のベクター等がコードする本発明のポリペプチドの所望の発現量等の諸条件に応じて適宜選択することができる。細胞の培養は、例えば、当該細胞の培養に通常用いられる培地を用いることにより行うことができる。培養条件としては、具体的には、後述する＜実施例１＞または＜実施例４＞に記載の条件が例示される。
本発明の製造方法は、生成工程を含む限り、さらに他の工程を含んでいてもよい。ここにいう「他の工程」は、例えば、生成工程において生成させた本発明のポリペプチドを採取する工程（以下「採取工程」という）である。ここにいう「採取工程」は、例えば、細胞の培養液から本発明のポリペプチドを含む画分を得る工程である。
例えば、本発明のポリペプチドが細胞外に分泌される態様で発現された場合、採取工程は、培養液そのもの、遠心分離後の上清、またはこれらをカラム等に供して精製した後の画分を本発明のポリペプチドとして採取する工程であってよい。
また、例えば、本発明のポリペプチドが細胞内に蓄積される態様で発現された場合、採取工程は、細胞そのもの、細胞を破砕して得られる破砕物（細胞残渣）もしくは抽出液、またはこれらをカラム等に供して精製した後の画分を本発明のポリペプチドとして採取する工程であってよい。
上記において「破砕」は、細胞の種類に応じて適宜選択する方法により実施できる。破砕する方法としては、ホモジェナイズする方法、超音波処理する方法、凍結融解する方法、界面活性剤を添加する方法が例示される。破砕に用いるこれらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
上記において「精製」は、ポリペプチドの精製に通常用いられる手法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーが例示される。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
このようにして採取した画分中に本発明のポリペプチドが含まれているか否かは、例えば、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」において記載した方法に従い、カブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドの有無を測定して判定することができる。また、このようにして採取した画分中に本発明のポリペプチドが含まれているか否かは、例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いる方法によって判定することもできる。
＜６＞本発明の測定方法
本発明の測定方法は、本発明のポリペプチドを用いてエンドトキシンの測定を行う方法である。本発明において、測定は、検出、検知、および定量を含む総称として用いられる。よって、本発明の測定方法は、例えば、エンドトキシンの検出方法、エンドトキシンの検知方法、またはエンドトキシンの定量方法であってもよい。
本発明の測定方法は、本発明のポリペプチドを用いてエンドトキシンの測定を行う方法である。本発明において、測定は、検出、検知、および定量を含む総称として用いられる。よって、本発明の測定方法は、例えば、エンドトキシンの検出方法、エンドトキシンの検知方法、またはエンドトキシンの定量方法であってもよい。
本発明の測定方法は、例えば、下記（１）および（２）の工程を含む、エンドトキシンの測定方法である。
（１）本発明のポリペプチド、カブトガニＣ因子、及び被験試料を混合する工程。
（２）上記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程。
（１）本発明のポリペプチド、カブトガニＣ因子、及び被験試料を混合する工程。
（２）上記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程。
上記（１）の工程は、本発明のポリペプチド、カブトガニＣ因子および被験試料を混合する工程である。被験試料がエンドトキシンを含有する試料である場合、当該エンドトキシンと接触したＣ因子が活性型Ｃ因子に変化し、続いてＢ因子が活性型Ｂ因子に変化するカスケード反応が進行する。
上記（１）の工程においては、本発明のポリペプチド、Ｃ因子および被験試料を混合する操作を含んでいる限り、さらに他の物質を混合する操作を含んでいてもよい。ここにいう「他の物質」としては、凝固酵素前駆体、緩衝剤、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、界面活性剤、検出用基質が例示される。上記（１）の工程が本発明のポリペプチド、Ｃ因子、凝固酵素前駆体および被験試料を混合する工程であり、かつ、被験試料がエンドトキシンを含有する試料である場合、当該エンドトキシンと接触したＣ因子が活性型Ｃ因子に変化し、Ｂ因子が活性型Ｂ因子に変化し、凝固酵素前駆体が凝固酵素に変化するカスケード反応が進行する。
本発明において「Ｃ因子」は、カブトガニＣ因子の機能を有するＣ因子である限り特に限定されない。ここにいう「カブトガニ」の定義は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」における記載の通りである。「カブトガニＣ因子の機能」とは、カブトガニのＣ因子が有するプロテアーゼ前駆体としての機能を意味する。「カブトガニＣ因子の機能」とは、具体的には、エンドトキシンの共存下で活性型（活性型Ｃ因子）に変化し、プロテアーゼ活性を発現する機能を意味する。カブトガニＣ因子の機能は、例えば、エンドトキシンの共存下で活性型（活性型Ｃ因子）に変化し、Ｂ因子を切断して活性型（活性型Ｂ因子）に変化させる機能である。
本発明において「凝固酵素前駆体」は、カブトガニ凝固酵素前駆体の機能を有する凝固酵素前駆体である限り特に限定されない。ここにいう「カブトガニ」の定義は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」における記載の通りである。「カブトガニ凝固酵素前駆体の機能」とは、カブトガニの凝固酵素前駆体が有するプロテアーゼ前駆体としての機能を意味する。「カブトガニ凝固酵素前駆体の機能」とは、具体的には、活性型Ｂ因子の共存下で活性型（凝固酵素）に変化し、プロテアーゼ活性を発現する機能を意味する。カブトガニ凝固酵素前駆体の機能は、例えば、活性型Ｂ因子の共存下で活性型（凝固酵素）に変化し、コアギュローゲンを切断してコアギュリンゲルを形成させる機能である。また、カブトガニ凝固酵素前駆体の機能は、例えば、活性型Ｂ因子の共存下で活性型（凝固酵素）に変化し、凝固酵素の基質となる検出用基質を切断して標識物質を遊離させる機能である。
本発明においてＣ因子および凝固酵素前駆体は、それぞれ独立して、カブトガニから得られる天然のリムルス因子であってもよく、遺伝子工学的手法によって調製された組換え体のリムルス因子であってもよく、天然のリムルス因子と組換え体のリムルス因子を任意の割合で含む混合物であってもよい。
天然のリムルス因子は、カブトガニの血球を原料とし、常法に従って取得されたライセートを適宜精製して分取されたものであってもよい。リムルス因子の分取は、例えば、文献（Nakamura, T., Horiuchi, T., Morita, T., Iwanaga, S. (1986) J. Biochem. 99, 847-57）に記載された方法を参照して行うことができる。
組換え体のリムルス因子は、リムルス因子のポリペプチドをコードする核酸を導入した細胞に当該リムルス因子を生成させることで取得することができる。リムルス因子をコードする核酸の塩基配列は、ＮＣＢＩ（www.ncbi.nlm.nih.gov）等の公知のデータベースから取得できる。
細胞によるリムルス因子の生成は、公知の手法により行うことができる。細胞によるリムルス因子の生成は、具体的には、後述する＜実施例１＞または＜実施例４＞に記載の哺乳類細胞を用いる方法が例示される。また、細胞によるリムルス因子の生成は、例えば、文献（国際公開第２０１２／１１８２２６号、または国際公開第２０１４／０９２０７９号）に記載された方法を参照して行うこともできる。さらに、細胞によるリムルス因子の生成は、例えば、前記「＜５＞本発明の製造方法」に記載された方法を準用して行うこともできる。
本発明においてＣ因子および凝固酵素前駆体の具体的な態様は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」の記載を準用して表すことができる。例えば、本発明においてリムルス因子は、組換え体であることが好ましい。また、例えば、本発明においてリムルス因子の生成に用いる細胞は、哺乳類細胞または昆虫細胞であることが好ましく、哺乳類細胞であることが好ましい。
本発明におけるＣ因子としては、具体的には、下記（１）〜（５）のいずれかに示されるポリペプチドが例示される。
（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＣ因子の機能を有するポリペプチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＣ因子の機能を有するポリペプチド。
（１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（２）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（３）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＣ因子の機能を有するポリペプチド。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＣ因子の機能を有するポリペプチド。
本発明における凝固酵素前駆体としては、具体的には、下記（６）〜（９）のいずれかに示されるポリペプチドが例示される。
（６）配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（７）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（８）上記（６）又は（７）に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニ凝固酵素前駆体の機能を有するポリペプチド。
（９）上記（６）〜（８）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニ凝固酵素前駆体の機能を有するポリペプチド。
（６）配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（７）配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（８）上記（６）又は（７）に示されるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつカブトガニ凝固酵素前駆体の機能を有するポリペプチド。
（９）上記（６）〜（８）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加した融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニ凝固酵素前駆体の機能を有するポリペプチド。
上記（１）においていう配列番号１２に示されるアミノ酸配列は、タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のポリペプチドのアミノ酸配列である。
上記（２）においていう配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、リムルス・ポリフェムスＣ因子のポリペプチドのアミノ酸配列である。
上記（３）においていう配列番号１６に示されるアミノ酸配列は、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のポリペプチドのアミノ酸配列である。
上記（６）においていう配列番号１８に示されるアミノ酸配列は、タキプレウス・トリデンタツス凝固酵素前駆体のポリペプチドのアミノ酸配列である。
上記（７）においていう配列番号２０に示されるアミノ酸配列は、リムルス・ポリフェムス凝固酵素前駆体のポリペプチドのアミノ酸配列である。
上記（４）および（８）においていう「複数個」および「置換、欠失、挿入、及び／又は付加」の態様は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」における態様と同じである。
上記（４）に示されるポリペプチドは、例えば、上記（１）〜（３）のいずれかに示されるアミノ酸配列全体に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の類似性を有し、かつカブトガニＣ因子の機能を有するポリペプチドであってもよい。また、上記（８）に示されるポリペプチドは、例えば、上記（６）又は（７）に示されるアミノ酸配列全体に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の類似性を有し、かつカブトガニ凝固酵素前駆体の機能を有するポリペプチドであってもよい。なお、これらにおいていう「類似性」（similarity）は、「同一性」（identity）を含む概念であるので、類似性を同一性と読み替えて当該ポリペプチドの好適態様に適用することができる。
上記（４）および（８）においていう「ペプチドタグ」の態様は、前記「＜１＞本発明のポリペプチド」における態様と同じである。
本発明において「検出用基質」は、活性化したリムルス因子の有無やその量、カスケード反応の進行を測定するために用いられる基質である。検出用基質は、活性型Ｂ因子を測定するための基質であってもよく、凝固酵素を測定するための基質であってもよい。検出用基質は、活性化したリムルス因子の基質となる基質である限り特に限定されない。検出用基質は、例えば、タンパク質、ペプチド、またはこれらの誘導体であってよい。
上記タンパク質は、天然のタンパク質であってもよく、組換えのタンパク質であってもよい。上記タンパク質としては、凝固酵素の基質であるコアギュローゲンが例示される。例えば、天然のコアギュローゲンは、ライセートから分取して調製することができる。また、例えば、組換えのコアギュローゲンは、文献（宮田ら、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.29; P30-43; 1986）に記載された方法を参照して調製することができる。
上記ペプチドは、例えば、化学的に合成された合成基質であってよい。合成基質は、活性化したリムルス因子の有無やその量、カスケード反応の進行を測定するのに好適な基質である限り特に制限されない。合成基質は、ペプチドの誘導体であることが好ましい。
合成基質としては、一般式Ｙ−Ｘ−Ｚ（式中、Ｙは存在しても存在しなくてもよく、Ｙが存在する場合はＹは保護基であり、Ｘはペプチドであり、Ｚは標識物質である。）で表される基質が例示される。このような合成基質は、活性化されたリムルス因子によってＸ−Ｚ間の共有結合が切断され、標識物質Ｚが遊離する性質を有していればよい。前記一般式において、保護基（Ｙ）は、ペプチドのＮ末端のアミノ基に対する保護基であることが好ましい。前記一般式において、Ｙ−Ｘ間の結合は、保護基のカルボキシ基とペプチドのＮ末端のαアミノ基との間に形成されるアミド結合であることが好ましい。また、前記一般式において、Ｘ−Ｚ間の結合は、ペプチドのＣ末端のカルボキシ基と標識物質Ｚのアミノ基との間に形成されるアミド結合であることが好ましい。
保護基（Ｙ）は特に制限されず、ペプチドの保護に適用可能な公知の保護基を用いることができる。保護基（Ｙ）としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ベンジル基（Ｂｚｌ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、アセチル基（Ａｃ）が例示される。
ペプチド（Ｘ）は、活性化されたリムルス因子の基質となるアミノ酸配列を有するペプチドである限り、特に限定されない。ペプチドは、セリンプロテアーゼの測定に好適な基質であることが好ましく、Ａｒｇ（Ｒ）残基をＣ末端に有するペプチドであることが好ましい。
リムルス因子がＢ因子である場合、ペプチドは一般式Ｘ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。具体的には、リムルス因子がＢ因子である場合、ペプチドはＬｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＬＴＲ）またはＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＭＴＲ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
リムルス因子が凝固酵素前駆体である場合、ペプチドは一般式Ｘ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である。）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。具体的には、リムルス因子が凝固酵素前駆体である場合、ペプチドはＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）またはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＥＧＲ）で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
標識物質（Ｚ）は特に制限されず、プロテアーゼ活性の測定に適用可能な公知の標識物質を用いることができる。標識物質としては、例えば、ペプチドから遊離すると発色または蛍光として検出できるようになる標識物質を用いることができる。そのような標識物質としては、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）、７−メトキシクマリン−４−酢酸（ＭＣＡ）、２，４−ジニトロアニリン（ＤＮＰ）が例示される。また、標識物質としては、例えば、ペプチドから遊離すると電気化学測定法（ボルタンメトリー、アンペロメトリー等）によって検出できるようになる標識物質を用いることができる。そのような標識物質としては、ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）、ｐ−メトキシアニリン（ｐＭＡ）、Ｎ−メチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＭＰＤＤ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＤＭＰＤ）が例示される。
上記本発明の測定方法における（１）の工程において本発明のポリペプチド、リムルス因子、被験試料、検出用基質および他の物質（緩衝剤等）は、任意の順序で添加して混合されてよい。例えば、上記（１）の工程において被験試料は、本発明のポリペプチド、リムルス因子、検出用基質、他の物質の混合物に対して添加して混合されてよい。また、例えば、上記（１）の工程において被験試料は、本発明のポリペプチド、リムルス因子、検出用基質、他の物質の混合物を添加されて混合されてよい。上記（１）の工程において混合は、例えば、一端に開口を有する容器（試験管、バイアル等）の内部（容器内）で行われてよい。上記被験試料は特に限定されず、注射用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器（医療用具）、医薬部外品、化粧品などのほか、食品、飲料水、空気、河川、土壌などの環境試料、天然のタンパク質や遺伝子組換えタンパク質、核酸、酵素、糖質、電解質に加え、血液、体液、組織などの生体成分等を挙げることができる。
上記（２）の工程は、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程である。当該工程は、例えば、検出用基質から遊離した標識物質を測定する工程である。当該工程では、本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性（全活性）に応じた量（モル数）の標識物質が検出用基質から遊離されるため、検出用基質から遊離した標識物質を測定することにより本発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定することができる。検出用基質から遊離した標識物質は、例えば、分光光度計や蛍光光度計等の光学的機器によって測定することができる。また、検出用基質から遊離した標識物質は、例えば、ボルタンメトリー計やアンペロメトリー計等の電気化学的測定機器によって測定することができる。例えば、当該工程において示される測定値をブランク値（エンドトキシンフリーの被験試料を測定対象とした場合の測定値）と比較することにより、被験試料中のエンドトキシンの有無を判定することができる。
本発明の測定方法は、上記（１）および（２）の工程に加えて、さらに他の工程を含んでいてもよい。本発明の測定方法は、例えば、上記（２）の工程において得られる測定をブランク値と比較することにより、被験試料中のエンドトキシンの有無を判定する工程を含んでいてもよい。また、本発明の測定方法は、例えば、混合液のゲル化の有無を判定することにより、被験試料中のエンドトキシンの有無を判定する工程を含んでいてもよい。さらに、本発明の測定方法は、例えば、上記（２）の工程において得られる測定値を他の値に変換する工程を含んでいてもよい。測定値を他の値に変換する工程としては、例えば、測定値に基づき、エンドトキシンの量を算出する工程が例示される。そのような工程は、具体的には、例えば、被験試料を濃度既知の標準物質に置き換えて測定した時に得られる測定値と標準物質の濃度との関係（標準曲線）に基づき、被験試料を測定した時に得られる測定値をエンドトキシンの量に変換する工程である。
本発明の測定方法においてリムルス反応は、水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われることが好ましい。
＜７＞本発明の試薬
本発明の試薬は、本発明のポリペプチドを構成成分として含むことを特徴とするエンドトキシン測定用試薬である。本発明の試薬は、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
本発明の試薬は、本発明のポリペプチドを構成成分として含むことを特徴とするエンドトキシン測定用試薬である。本発明の試薬は、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
本発明の試薬は、本発明のポリペプチドを構成成分として含む限り、他の構成成分をさらに含んでいてよい。ここにいう他の構成成分としては、例えば、カブトガニＣ因子、カブトガニ凝固酵素前駆体、検出用基質、緩衝剤、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、界面活性剤が例示される。
本発明の試薬は、本発明のポリペプチドの他にカブトガニＣ因子を構成成分として含んでいることが好ましく、さらにカブトガニ凝固酵素前駆体を構成成分として含んでいることがより好ましい。また、本発明の試薬は、凍結乾燥品として提供されることが好ましい。
＜８＞本発明のキット
本発明のキットは、本発明のポリペプチドまたは本発明の試薬を構成品として含むことを特徴とするエンドトキシン測定用キットである。本発明のキットは、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
本発明のキットは、本発明のポリペプチドまたは本発明の試薬を構成品として含むことを特徴とするエンドトキシン測定用キットである。本発明のキットは、本発明の測定方法を行うために好適に用いることができる。
本発明のキットは、本発明のポリペプチドまたは本発明の試薬を構成品として含む限り、他の構成品をさらに含んでいてよい。ここにいう他の構成品としては、例えば、カブトガニＣ因子、カブトガニ凝固酵素前駆体、検出用基質、緩衝液、蒸留水、エンドトキシン標準品、マイクロプレート、製品情報を記載した添付文書が例示される。
本発明のキットは、各構成品をそれぞれ別個に含んでいてもよいし、各構成品を任意に組み合わせてなる混合物として含んでいてもよい。本発明のキットは、例えば、各リムルス因子を別個に含んでいてもよいし、予め混合された態様として含んでいてもよいし、さらに検出用基質も予め混合された態様として含んでいてもよい。
以下、実施例によって本発明の一態様を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例のみには限定されない。
本発明の実施例においては、以下の略号が使用される場合がある。
（ａ）ＴＦＣ：タキプレウス・トリデンタツスＣ因子
（ｂ）ＴＦＢ：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子
（ｃ）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体
（ｄ）ＬＦＣ：リムルス・ポリフェムスＣ因子
（ｅ）ＬＦＢ：リムルス・ポリフェムスＢ因子
（ｆ）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体
（ａ）ＴＦＣ：タキプレウス・トリデンタツスＣ因子
（ｂ）ＴＦＢ：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子
（ｃ）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体
（ｄ）ＬＦＣ：リムルス・ポリフェムスＣ因子
（ｅ）ＬＦＢ：リムルス・ポリフェムスＢ因子
（ｆ）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体
本発明の実施例において発現ベクターの調製、リムルス因子の調製、およびリムルス因子の活性測定は、文献（Kobayashi, Y., Takahashi, T., Shibata, T., Ikeda, S., Koshiba, T., Mizumura, H., Oda, T., Kawabata, S. (2015) J. Biol. Chem. 290, 19379-86）に記載された方法を参照して行うことができる。
本発明の実施例においてＰＣＲ反応は、別段の記載がある場合を除き、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。
本発明の実施例においてＰＣＲ反応液からのＤＮＡの精製は、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。
本発明の実施例においてＤＮＡの分取は、ＤＮＡを含む試料をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のＤＮＡ断片をメスで切り取って回収した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。
本発明の実施例においてライゲーション反応は、別段の記載がある場合を除き、T4 DNA ligase（New England Biolabs社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。
本発明の実施例においてベクターの増幅と精製は、ベクターを用いて形質転換した大腸菌を培養した後、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System（Promega社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。具体的には、ベクターを用いて形質転換した大腸菌ＤＨ５α株をアンピシリン含有ＬＢ（ＬＢ／Ａｍｐ）寒天培地のプレート上に塗布して終夜静置培養して得られるシングルコロニーをアンピシリン含有ＬＢ培地に植菌して３７℃で終夜振盪培養してベクターの増幅を行い、上記培養液中の大腸菌の菌体からベクターを精製した。
本発明の実施例においてＤＮＡの脱リン酸化は、Alkaline Phosphatase（E. coli C75）（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。
本発明の実施例においてタンパク質濃度の測定は、Micro BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。また、本発明の実施例においてリムルス因子のモル濃度は、上記測定により得られるタンパク質濃度をリムルス因子の分子量で除して算出した。
＜参考例１＞ＴＦＣの調製
（１）ＴＦＣ発現ベクターの作製
タキプレウス・トリデンタツスＣ因子（ＴＦＣ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
（１）ＴＦＣ発現ベクターの作製
タキプレウス・トリデンタツスＣ因子（ＴＦＣ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
Ｎ末端のシグナル配列を除くＴＦＣの全長をコードするＤＮＡ（配列番号１１における塩基番号７６〜３０５７で示される塩基配列を有するＤＮＡ）をＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応の鋳型には、pSecTag2Aベクター（Invitrogen社製）にＴＦＣをコードするＤＮＡが挿入されたベクター（Koshiba, T., Hashii, T., Kawabata, S. (2007) J. Biol. Chem. 282, 3962-7）を用いた。また、ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー１（配列番号２１）およびBGH reverseプライマー（配列番号２８）を用いた。
上記ＰＣＲ反応によって得られたＤＮＡを精製し、上記ＤＮＡに対して制限酵素（Age IおよびKpn I）による限定分解と分取を行った。pHLsecベクター（Aricescu, AR., Lu, W., Jones, EY. (2006) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1243-50）に対して上記と同様にして制限酵素による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡとのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターに対して制限酵素（EcoR I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片１（pHLsecベクター由来の分泌シグナルのアミノ酸配列をコードする塩基配列および配列番号１１における塩基番号７６〜２２９８で示される塩基配列を有し、５’末端および３’末端にEcoR Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。また、上記ベクターに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片２（配列番号１１における塩基番号２２９９〜２５４５で示される塩基配列を有し、５’末端にEcoR Iの粘着末端を、３’末端にXho Iの粘着末端を有するＤＮＡ）およびＤＮＡ断片３（配列番号１１における塩基番号２５４６〜３０５７で示される塩基配列およびpHLsecベクター由来のＨｉｓタグのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、５’末端および３’末端にXho Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。
pCA7ベクター（Takeda, M., Ohno, S., Seki, F., Nakatsu, Y., Tahara, M., Yanagi, Y. (2005) J. Virol. 79, 14346-54.）に対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡ断片２とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターに対して制限酵素（Xho I）による限定分解、脱リン酸化、分取を行った後、上記ＤＮＡ断片３とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターに対して制限酵素（EcoR I）による限定分解、脱リン酸化、分取を行った後、上記ＤＮＡ断片１とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。このようにして、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するＴＦＣをコードするベクターを得た。
上記ベクターを鋳型とし、プライマー８（配列番号２９）およびプライマー２（配列番号２２）を用いたＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを精製した。上記ＤＮＡに対して制限酵素（EcoR I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片１を得た。また、上記ＤＮＡに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片２およびＤＮＡ断片４（配列番号１１における塩基番号２５４６〜３０５７で示される塩基配列を有し、５’末端および３’末端にXho Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。
pCA7ベクターに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡ断片２とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターに対して制限酵素（Xho I）による限定分解、脱リン酸化、分取を行った後、上記ＤＮＡ断片４とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターに対して制限酵素（EcoR I）による限定分解、脱リン酸化、分取を行った後、上記ＤＮＡ断片１とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。このようにして、Ｃ末端にＨｉｓタグを有しないＴＦＣをコードするベクターを得た。
上記ベクターに対して制限酵素（EcoR I）による限定分解、脱リン酸化、分取を行い、ＤＮＡ断片５（配列番号１１における塩基番号２２９９〜３０５７で示される塩基配列およびpCA7ベクターの塩基配列を有し、５’末端および３’末端にEcoR Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。
pPSC8ベクター（Protein Sciences社製）にＮ末端のシグナル配列を含むＴＦＣの全長をコードするＤＮＡ（配列番号１１における塩基番号１〜３０５７で示される塩基配列を有するＤＮＡ）が挿入されたベクターを鋳型とし、プライマー３（配列番号２３）およびプライマー２（配列番号２２）を用いたＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを精製した。上記ＤＮＡに対して制限酵素（EcoR I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片６（配列番号１１における塩基番号１〜２２９８で示される塩基配列を有し、５’末端および３’末端にEcoR Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。続いて、上記ＤＮＡ断片５とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。このようにして、Ｎ末端のシグナル配列を含むＴＦＣ全長をコードするベクターを得た。
上記ベクターを鋳型とし、リン酸化されたプライマー（プライマー４（配列番号２４）およびプライマー５（配列番号２５））を用いたインバースＰＣＲ反応を行った。インバースＰＣＲ反応は、Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。上記ＰＣＲ反応液に制限酵素（Dpn I）を添加して鋳型を分解し、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿を行ってＤＮＡの分取を行った後、DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ライゲーション反応（セルフライゲーション）を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。このようにして、シグナル配列の直後に６×ＨｉｓタグとＦａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列（ＩＥＧＲ）のアミノ酸配列が挿入されたＴＦＣをコードするベクターを得た。
上記ベクターを鋳型とし、プライマー６（配列番号２６）およびプライマー７（配列番号２７）を用いたＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを精製した。ＰＣＲ反応は、Q5 High-Fidelity DNA Polymeraseを用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。上記ＤＮＡに対して制限酵素（Age IおよびNhe I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片７（６×Ｈｉｓタグをコードする塩基配列、ＩＥＧＲをコードする塩基配列、および配列番号１１における塩基番号７６〜２２３６で示される塩基配列を有し、５’末端にAge Iの粘着末端を、３’末端にNhe Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。
上記Ｃ末端にＨｉｓタグを有しないＴＦＣをコードするベクターに対して制限酵素（Age IおよびNhe I）による限定分解、脱リン酸化、分取を行い、ＤＮＡ断片８（配列番号１１における塩基番号２２３７〜３０５７で示される塩基配列およびpCA7ベクターの塩基配列を有し、５’末端にNhe Iの粘着末端を、３’末端にAge Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。続いて、上記ＤＮＡ断片７とのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、Ｎ末端のシグナル配列を除くＴＦＣ配列のＮ末端側に６×ＨｉｓタグとＦａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列（ＩＥＧＲ）を有するポリペプチドの発現ベクター（以下「ＴＦＣ／ｐＣＡ７」という）を得た。
（２）ＴＦＣの調製
タキプレウス・トリデンタツスＣ因子（ＴＦＣ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
タキプレウス・トリデンタツスＣ因子（ＴＦＣ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
上記（１）で得たＴＦＣの発現ベクター（ＴＦＣ／ｐＣＡ７）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ−細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−３０２２）を形質転換した。具体的には、８０％〜９０％コンフルエントに達した上記細胞に対して形質転換培地（ＴＦＣ／ｐＣＡ７（１．８μｇ／ｍＬ）、ポリエチレンイミン（２．７μｇ／ｍＬ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液（和光純薬工業社製）、および２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）を０．２２ｍＬ／ｃｍ２となるように添加し、終濃度で２ｍＭとなるようにベンザミジンを添加して１２０時間静置培養した。このようにして、細胞から分泌されたＴＦＣを含む培養液を得た。
上記培養液を６，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。上記上清と０．１倍量の緩衝溶液（０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ イミダゾール）を混合した後、ニッケルカラム（nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：１．０ｃｍ×長さ：５．０ｃｍ）にアプライした。カラムを洗浄溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した後、溶出溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０〜２００ｍＭ イミダゾール）を用いてＴＦＣを溶出させた。ＴＦＣの溶出画分はゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。
ＴＦＣの溶出画分を回収し、限外ろ過によって溶液を反応溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）に置換した。続いて、ファクターＸａを３．３μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃に１６時間静置してＴＦＣのＮ末端からＨｉｓタグを遊離させた。
上記反応溶液をセファロースカラム（benzamidine-Sepharose column、内径：０．２５ｃｍ×長さ：１．５ｃｍ）にアプライし、ファクターＸａをカラムに吸着させて除去した。続いて、上記カラムの素通り画分（フロースルー）をニッケルカラム（nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：０．２５ｃｍ×長さ：１．５ｃｍ）にアプライし、ＴＦＣから遊離されたＨｉｓタグをカラムに吸着させて除去した。上記カラムの素通り画分をＴＦＣとして以後の試験に用いた。
＜参考例２＞ＴＦＢの調製
（１）ＴＦＢ発現ベクターの作製
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子（ＴＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
（１）ＴＦＢ発現ベクターの作製
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子（ＴＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
Ｎ末端のシグナル配列を除くＴＦＢの全長をコードするＤＮＡ（配列番号１における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列を有するＤＮＡ）をＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応の鋳型には、pPSC8ベクターにＴＦＢをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを用いた。また、ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー９（配列番号３０）およびプライマー１０（配列番号３１）を用いた。
上記ＰＣＲ反応によって得られたＤＮＡを精製し、上記ＤＮＡに対して制限酵素（Age IおよびXho I）による限定分解と分取を行った。pCA7ベクターに対して制限酵素（Age IおよびXho I）による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡとのライゲーション反応を行った。上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、Ｎ末端のシグナル配列を除くＴＦＢの発現ベクター（ＴＦＢ／ｐＣＡ７）を得た。
（２）ＴＦＢの調製
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子（ＴＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子（ＴＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
ＴＦＣの発現ベクター（ＴＦＣ／ｐＣＡ７）に代えて上記（１）で得たＴＦＢの発現ベクター（ＴＦＢ／ｐＣＡ７）を用い、ベンザミジンを添加しなかったことを除き、前記＜参考例１＞における「（２）ＴＦＣの調製」と同じ操作を行って、細胞から分泌されたＴＦＢを含む培養液を得た。
上記培養液を６，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。上記上清に５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ６．８）を添加して５倍希釈した後、ＳＰカラム（SP-Sepharose column、内径：１．０ｃｍ×長さ：１０ｃｍ）にアプライした。カラムを５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ６．８）で洗浄した後、溶出溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ６．８）、５０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてＴＦＢを溶出させた。ＴＦＢの溶出画分はゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。
ＴＦＢの溶出画分を回収し、限外ろ過によって溶液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に置換した。上記溶液をＤＥＡＥカラム（DEAE-Sepharose column、内径：１．０ｃｍ×長さ：１．０ｃｍ）にアプライした後、溶出溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０〜２００ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてＴＦＢを溶出させた。ＴＦＢの溶出画分はゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。上記ＴＦＢの溶出画分をＴＦＢとして以後の試験に用いた。
＜実施例１＞Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの調製
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
（１）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ発現ベクターの作製
上記ＴＦＢ／ｐＣＡ７を鋳型とし、リン酸化されたプライマー（プライマー１１（配列番号３２）およびプライマー１２（配列番号３３））を用いたインバースＰＣＲ反応を行った。インバースＰＣＲ反応は、Tks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。上記ＰＣＲ反応液に制限酵素（Dpn I）を添加して鋳型を分解し、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿を行ってＤＮＡの分取を行った後、DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ライゲーション反応（セルフライゲーション）を行った。
上記ＴＦＢ／ｐＣＡ７を鋳型とし、リン酸化されたプライマー（プライマー１１（配列番号３２）およびプライマー１２（配列番号３３））を用いたインバースＰＣＲ反応を行った。インバースＰＣＲ反応は、Tks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って実施した。上記ＰＣＲ反応液に制限酵素（Dpn I）を添加して鋳型を分解し、フェノール／クロロフォルム抽出およびエタノール沈殿を行ってＤＮＡの分取を行った後、DNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を用い、添付のプロトコールに従った操作を行って、ライゲーション反応（セルフライゲーション）を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの発現ベクター（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ／ｐＣＡ７）を得た。
（２）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの調製
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
ＴＦＣの発現ベクター（ＴＦＣ／ｐＣＡ７）に代えて上記（１）で得たＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの発現ベクター（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢ／ｐＣＡ７）を用い、ベンザミジンを添加しなかったことを除き、前記＜参考例１＞における「（２）ＴＦＣの調製」と同じ操作を行って、細胞から分泌されたＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢを含む培養液を得た。
前記＜参考例２＞における「（２）ＴＦＢの調製」と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢを含む溶出画分を得た。上記Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの溶出画分をＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢとして以後の試験に用いた。
＜参考例３＞ＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）の測定
１６０ｎＭ ＴＦＣ、３．２μＭ ＬＰＳ（Salmonella minnesota R595由来、重量平均分子量１，７００Ｄａ、List Biological Laboratories社製）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液を調製し、３７℃に２０分間静置してＴＦＣを活性化させた。以下、活性化したＴＦＣを「α−ＴＦＣ」という。
１６０ｎＭ ＴＦＣ、３．２μＭ ＬＰＳ（Salmonella minnesota R595由来、重量平均分子量１，７００Ｄａ、List Biological Laboratories社製）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液を調製し、３７℃に２０分間静置してＴＦＣを活性化させた。以下、活性化したＴＦＣを「α−ＴＦＣ」という。
５０ｎＭ ＴＦＢ、０．２ｎＭ α−ＴＦＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を２０μＬ調製し、３７℃に１時間静置した。この溶液に対し２０％ ＤＭＦに溶解した２ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）を５μＬ加え、３７℃に５分間静置した。０．６Ｍ 酢酸（７５μＬ）を添加して酵素反応を終了させた後、ペプチドから遊離したＭＣＡの量（活性化したＴＦＢのプロテアーゼ活性（全活性）に比例する）を蛍光検出器で測定した。検出は、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍの条件で行った。
上記の結果、ＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）は、３１．０７±２．５０ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌであった。
＜実施例２＞Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）の測定
ＴＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢを用い、前記＜参考例３＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。
ＴＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢを用い、前記＜参考例３＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。
上記試験の結果、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）は、４１６．８７±２０．５０ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌであった。
＜参考例３＞および＜実施例２＞の結果を図１に示す。上記試験の結果より、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢはＴＦＢと比較して１３．４倍のプロテアーゼ活性（比活性）を有することが示された。
＜参考例４＞ＴＦＢの熱安定性の評価
１００ｎＭ ＴＦＢ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ調製し、所定の温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃）に２分間静置した。その後、この溶液に０．４ｎＭ α−ＴＦＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ添加し、３７℃に１時間静置した。以後、前記＜参考例３＞と同じ操作を行って、ＴＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。上記試験の結果を表１に示す。
１００ｎＭ ＴＦＢ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ調製し、所定の温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃）に２分間静置した。その後、この溶液に０．４ｎＭ α−ＴＦＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ添加し、３７℃に１時間静置した。以後、前記＜参考例３＞と同じ操作を行って、ＴＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。上記試験の結果を表１に示す。
表１において「相対活性」は、各温度で２分間静置したＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）を前記＜参考例３＞に示したＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）で除した値を百分率表示した数値（％）である。
＜実施例３＞Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの熱安定性の評価
ＴＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢを用い、前記＜参考例４＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの熱安定性を評価した。上記試験の結果を表２に示す。
ＴＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢを用い、前記＜参考例４＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢの熱安定性を評価した。上記試験の結果を表２に示す。
表２において相対活性は、各温度で２分間静置したＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）を前記＜実施例２＞に示したＭｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）で除した値を百分率表示した数値（％）である。
＜参考例４＞および＜実施例３＞の結果を図２に示す。上記試験の結果より、ＴＦＢは６０℃以上で２分間加熱することにより、プロテアーゼ活性を完全に失う（失活する）ことが示された。一方、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢは９０℃で２分間加熱しても４０％以上のプロテアーゼ活性を維持し、ＴＦＢよりも高い熱安定性を有することが示された。
＜参考例５＞ＬＦＣの調製
（１）ＬＦＣ発現ベクターの作製
リムルス・ポリフェムスＣ因子（ＬＦＣ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
（１）ＬＦＣ発現ベクターの作製
リムルス・ポリフェムスＣ因子（ＬＦＣ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
Ｎ末端のシグナル配列を除くＬＦＣの全長をコードするＤＮＡ（配列番号１３における塩基番号７６〜３０６０で示される塩基配列を有するＤＮＡ）をTks Gflex DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応の鋳型には、pBluescript II SK(+)（アジレント・テクノロジー社製）にＬＦＣをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを用いた。また、ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー１３（配列番号３４）およびプライマー１４（配列番号３５）を用いた。
上記ＰＣＲ反応によって得られたＤＮＡをフェノール／クロロフォルム抽出を行って回収し、上記ＤＮＡに対して制限酵素（Age IおよびXho I）による限定分解と分取を行った。ＴＦＣ／ｐＣＡ７に対して上記と同様にして制限酵素による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡとのライゲーション反応を行った。
上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、Ｎ末端のシグナル配列を除くＬＦＣ配列のＮ末端側に６×ＨｉｓタグとＦａｃｔｏｒ Ｘａ切断配列（ＩＥＧＲ）を有するポリペプチドの発現ベクター（以下「ＬＦＣ／ｐＣＡ７」という）を得た。
（２）ＬＦＣの調製
リムルス・ポリフェムスＣ因子（ＬＦＣ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
リムルス・ポリフェムスＣ因子（ＬＦＣ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
上記（１）で得たＬＦＣの発現ベクター（ＬＦＣ／ｐＣＡ７）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｓ ＧｎＴＩ−細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−３０２２）を形質転換した。具体的には、８０％〜９０％コンフルエントに達した上記細胞に対して形質転換培地（ＬＦＣ／ｐＣＡ７（１．８μｇ／ｍＬ）、ポリエチレンイミン（２．７μｇ／ｍＬ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液、および２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地）を０．２２ｍＬ／ｃｍ２となるように添加し、終濃度で２ｍＭとなるようにベンザミジンを添加して１２０時間静置培養した。このようにして、細胞から分泌されたＬＦＣを含む培養液を得た。
上記培養液を６，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。上記上清と０．１倍量の緩衝溶液（０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ イミダゾール）を混合した後、ニッケルカラム（nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：１．０ｃｍ×長さ：２．０ｃｍ）にアプライした。カラムを洗浄溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール）で洗浄した後、溶出溶液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０〜２００ｍＭ イミダゾール）を用いてＬＦＣを溶出させた。ＬＦＣの溶出画分はゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。
ＬＦＣの溶出画分を回収し、限外ろ過によって溶液を反応溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）に置換した。続いて、ファクターＸａを３．３μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温に２日間静置してＬＦＣのＮ末端からＨｉｓタグを遊離させた。
上記反応溶液をセファロースカラム（benzamidine-Sepharose column、内径：０．２５ｃｍ×長さ：１．５ｃｍ）にアプライし、ファクターＸａをカラムに吸着させて除去した。続いて、上記カラムの素通り画分（フロースルー）をニッケルカラム（nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：０．２５ｃｍ×長さ：１．５ｃｍ）にアプライし、ＬＦＣから遊離されたＨｉｓタグをカラムに吸着させて除去した。上記カラムの素通り画分をＬＦＣとして以後の試験に用いた。
＜参考例６＞ＬＦＢの調製
（１）ＬＦＢ発現ベクターの作製
リムルス・ポリフェムスＢ因子（ＬＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
（１）ＬＦＢ発現ベクターの作製
リムルス・ポリフェムスＢ因子（ＬＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
ＬＦＢ全長配列をコードするＤＮＡ（配列番号３における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列を有するＤＮＡ）をTks Gflex DNA polymeraseを用いたＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応の鋳型には、pBluescript II SK(+)にＬＦＢをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを用いた。また、ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー１５（配列番号３６）およびプライマー１８（配列番号３９）を用いた。
上記ＰＣＲ反応によって得られたＤＮＡを精製し、上記ＤＮＡに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行った。pCA7ベクターに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡとのライゲーション反応を行った。上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、ＬＦＢ全長配列を有するポリペプチドの発現ベクターを得た。
上記ベクターを鋳型とし、プライマー１５（配列番号３６）およびプライマー１９（配列番号４０）を用いたＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを精製した。上記ＤＮＡに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片（配列番号３における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列および６×Ｈｉｓタグをコードする塩基配列を有し、５’末端にEcoR Iの粘着末端を、３’末端にXho Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。
pCA7ベクターに対して制限酵素（EcoR IおよびXho I）による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡとのライゲーション反応を行った。上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、ＬＦＢ全長配列のＣ末端側に６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチドの発現ベクターを得た。
上記ベクターを鋳型とし、プライマー２０（配列番号４１）およびプライマー２１（配列番号４２）を用いたＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡを精製した。上記ＤＮＡに対して制限酵素（Age IおよびXho I）による限定分解と分取を行い、ＤＮＡ断片（配列番号３における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列および６×Ｈｉｓタグをコードする塩基配列を有し、５’末端にAge Iの粘着末端を、３’末端にXho Iの粘着末端を有するＤＮＡ）を得た。
pCA7ベクターに対して制限酵素（Age IおよびXho I）による限定分解と分取を行った後、上記ＤＮＡとのライゲーション反応を行った。上記ライゲーション反応液を用いて大腸菌を形質転換した後、ベクターの増幅と精製を行った。上記ベクターの塩基配列をシークエンス解析し、ＰＣＲエラーによる変異の導入がないことを確認した。このようにして、Ｎ末端のシグナル配列を除くＬＦＢ配列のＣ末端側に６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチドの発現ベクター（ＬＦＢ／ｐＣＡ７）を得た。
（２）ＬＦＢの調製
リムルス・ポリフェムスＢ因子（ＬＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
リムルス・ポリフェムスＢ因子（ＬＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
ＬＦＣの発現ベクター（ＬＦＣ／ｐＣＡ７）に代えて上記（１）で得たＬＦＢの発現ベクター（ＬＦＢ／ｐＣＡ７）を用い、ベンザミジンを添加しなかったことを除き、前記＜参考例５＞における「（２）ＬＦＣの調製」と同じ操作を行って、細胞から分泌されたＬＦＢを含む培養液を得た。
上記培養液をニッケルカラム（nickel-nitrilotriacetic acid-agarose column、内径：１．０ｃｍ×長さ：１．５ｃｍ）にアプライし、ＬＦＢの溶出画分を得た。カラム精製は、前記＜参考例５＞における「（２）ＬＦＣの調製」に記載の手順に従って実施した。
ＬＦＢの溶出画分を回収し、限外ろ過によって溶液を反応溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に置換した。このようにして得たＬＦＢを以後の試験に用いた。
＜実施例４＞Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢの調製
リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ）の発現ベクターは、以下の手順に従って作製した。
Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのＮ末端側をコードするＤＮＡ（配列番号９における塩基番号１〜５９４で示される塩基配列を有するＤＮＡ。以下「ＤＮＡ断片９」という）をTks Gflex DNA polymeraseを用いたＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応の鋳型には、pCA7にＬＦＢをコードするＤＮＡが挿入されたベクターを用いた。また、ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー１５（配列番号３６）およびプライマー１６（配列番号３７）を用いた。
上記と同様にして、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのＣ末端側をコードするＤＮＡ（配列番号９における塩基番号５６２〜１２００で示される塩基配列を有するＤＮＡ。以下「ＤＮＡ断片１０」という）をＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー１７（配列番号３８）およびプライマー１８（配列番号３９）を用いた。
上記ＰＣＲ反応によって得られたＤＮＡを精製し、ＤＮＡ断片９およびＤＮＡ断片１０を得た。
Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ全長配列をコードするＤＮＡ（配列番号９における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列を有するＤＮＡ）をTks Gflex DNA polymeraseを用いたＰＣＲ反応により調製した。ＰＣＲ反応の鋳型には、ＤＮＡ断片９と１０を混合したものを用いた。また、ＰＣＲ反応のプライマーには、プライマー１５（配列番号３６）およびプライマー１８（配列番号３９）を用いた。以後、前記＜参考例６＞における「（１）ＬＦＢ発現ベクターの作製」と同じ操作を行った。このようにして、Ｎ末端のシグナル配列を除くＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ配列のＣ末端側に６×Ｈｉｓタグを有するポリペプチドの発現ベクター（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ／ｐＣＡ７）を得た。
（２）Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢの調製
リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ）は、以下の手順に従い、哺乳類細胞発現系によって調製した。細胞培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で実施した。
ＬＦＢの発現ベクター（ＬＦＢ／ｐＣＡ７）に代えて上記（１）で得たＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢの発現ベクター（Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢ／ｐＣＡ７）を用い、前記＜参考例６＞における「（２）ＬＦＢの調製」と同じ操作を行った。このようにして得たＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢを以後の試験に用いた。
＜参考例７＞ＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）の測定
１６０ｎＭ ＬＦＣ、３．２μＭ ＬＰＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液を調製し、３７℃に２０分間静置してＬＦＣを活性化させた。以下、活性化したＬＦＣを「α−ＬＦＣ」という。
１６０ｎＭ ＬＦＣ、３．２μＭ ＬＰＳ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液を調製し、３７℃に２０分間静置してＬＦＣを活性化させた。以下、活性化したＬＦＣを「α−ＬＦＣ」という。
５０ｎＭ ＬＦＢ、２ｎＭ α−ＬＦＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を２０μＬ調製し、３７℃に１時間静置した。この溶液に対し２０％ ＤＭＦに溶解した２ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡを５μＬ加え、３７℃に５分間静置した。０．６Ｍ 酢酸（７５μＬ）を添加して酵素反応を終了させた後、ペプチドから遊離したＭＣＡの量（活性化したＬＦＢのプロテアーゼ活性（全活性）に比例する）を蛍光検出器で測定した。検出は、励起波長３８０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍの条件で行った。
上記の結果、ＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）は、４４．６７±０．６１ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌであった。
＜実施例５＞Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）の測定
ＬＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢを用い、前記＜参考例７＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。
ＬＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢを用い、前記＜参考例７＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。
上記試験の結果、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）は、３２０．８０±９．５６ｕｎｉｔｓ／μｍｏｌであった。
上記試験の結果より、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢは、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢと同様に、改変前のポリペプチド（ＬＦＢ）よりも高いプロテアーゼ活性（比活性）を有することが示された。
＜参考例８＞ＬＦＢの熱安定性の評価
１００ｎＭ ＬＦＢ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ調製し、所定の温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃）に２分間静置した。その後、この溶液に４ｎＭ α−ＬＦＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ添加し、３７℃に１時間静置した。以後、前記＜参考例７＞と同じ操作を行って、ＬＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。上記試験の結果を表３に示す。
１００ｎＭ ＬＦＢ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ調製し、所定の温度（４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃）に２分間静置した。その後、この溶液に４ｎＭ α−ＬＦＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの溶液を１０μＬ添加し、３７℃に１時間静置した。以後、前記＜参考例７＞と同じ操作を行って、ＬＦＢのプロテアーゼ活性を測定した。上記試験の結果を表３に示す。
表３において「相対活性」は、各温度で２分間静置したＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）を前記＜参考例７＞に示したＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）で除した値を百分率表示した数値（％）である。
＜実施例６＞Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢの熱安定性の評価
ＬＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢを用い、前記＜参考例８＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢの熱安定性を評価した。上記試験の結果を表４に示す。
ＬＦＢに代えてＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢを用い、前記＜参考例８＞と同じ操作を行って、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢの熱安定性を評価した。上記試験の結果を表４に示す。
表４において相対活性は、各温度で２分間静置したＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）を前記＜実施例５＞に示したＭｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢのプロテアーゼ活性（比活性）で除した値を百分率表示した数値（％）である。
上記試験の結果より、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＬＦＢは、Ｍｕｒａｓａｍｅ−ＴＦＢと同様に、改変前のポリペプチド（ＬＦＢ）よりも高い熱安定性を有することが示された。
本発明によれば、天然のカブトガニＢ因子よりもプロテアーゼ活性に優れたポリペプチドを製造することができる。よって、本発明により提供されるポリペプチドは、天然のカブトガニＢ因子と比較してエンドトキシン測定を高感度化できるカブトガニＢ因子改変体であると期待される。また、本発明によれば、天然のカブトガニＢ因子よりも熱安定性に優れたポリペプチドを製造することができる。よって、本発明により提供されるポリペプチドは、天然のカブトガニＢ因子と比較して試薬としての保存安定性に優れたカブトガニＢ因子改変体であると期待される。
＜配列表の説明＞
配列番号１：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のアミノ酸配列
配列番号３：リムルス・ポリフェムスＢ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号４：リムルス・ポリフェムスＢ因子のアミノ酸配列
配列番号５：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（１）
配列番号６：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（２）
配列番号７：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体のアミノ酸配列
配列番号８：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（１）
配列番号９：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（２）
配列番号１０：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体のアミノ酸配列
配列番号１１：タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１２：タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のアミノ酸配列
配列番号１３：リムルス・ポリフェムスＣ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１４：リムルス・ポリフェムスＣ因子のアミノ酸配列
配列番号１５：カルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１６：カルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のアミノ酸配列
配列番号１７：タキプレウス・トリデンタツス凝固酵素前駆体のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１８：タキプレウス・トリデンタツス凝固酵素前駆体のアミノ酸配列
配列番号１９：リムルス・ポリフェムス凝固酵素前駆体のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２０：リムルス・ポリフェムス凝固酵素前駆体のｃＤＮＡのアミノ酸配列
配列番号２１〜４２：プライマー
配列番号１：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子のアミノ酸配列
配列番号３：リムルス・ポリフェムスＢ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号４：リムルス・ポリフェムスＢ因子のアミノ酸配列
配列番号５：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（１）
配列番号６：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（２）
配列番号７：タキプレウス・トリデンタツスＢ因子改変体のアミノ酸配列
配列番号８：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（１）
配列番号９：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体のｃＤＮＡの塩基配列（２）
配列番号１０：リムルス・ポリフェムスＢ因子改変体のアミノ酸配列
配列番号１１：タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１２：タキプレウス・トリデンタツスＣ因子のアミノ酸配列
配列番号１３：リムルス・ポリフェムスＣ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１４：リムルス・ポリフェムスＣ因子のアミノ酸配列
配列番号１５：カルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号１６：カルシノスコルピウス・ロツンディカウダＣ因子のアミノ酸配列
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配列番号１８：タキプレウス・トリデンタツス凝固酵素前駆体のアミノ酸配列
配列番号１９：リムルス・ポリフェムス凝固酵素前駆体のｃＤＮＡの塩基配列
配列番号２０：リムルス・ポリフェムス凝固酵素前駆体のｃＤＮＡのアミノ酸配列
配列番号２１〜４２：プライマー
Claims (10)
- 下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示されるポリペプチド。
（Ａ）下記（Ａ１）又は（Ａ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号７におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ａ２）配列番号７におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ）下記（Ｂ１）又は（Ｂ２）に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
（Ｂ１）配列番号１０におけるアミノ酸番号１〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｂ２）配列番号１０におけるアミノ酸番号２４〜４００で示されるアミノ酸配列。
（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列（ただし、１９３位のシステイン（Ｃｙｓ）残基は置換も欠失もされない）を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。
（Ｄ）上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかに示されるポリペプチドにペプチドタグを付加してなる融合ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチド。 - 請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｄ）のいずれかに示されるＤＮＡ。
（ａ）下記（ａ１）〜（ａ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ１）配列番号５における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ２）配列番号５における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ａ３）配列番号６における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ａ４）配列番号６における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかに示される塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ１）配列番号８における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ２）配列番号８における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ３）配列番号９における塩基番号１〜１２００で示される塩基配列。
（ｂ４）配列番号９における塩基番号７０〜１２００で示される塩基配列。
（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡにペプチドタグをコードするＤＮＡを付加してなる融合ＤＮＡの塩基配列を有し、かつカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 請求項２に記載の核酸、及び／又は請求項３に記載のＤＮＡを保持するベクター。
- 請求項２に記載の核酸、請求項３に記載のＤＮＡ、及び／又は請求項４に記載のベクターを保持する細胞。
- 請求項５に記載の細胞を用いてカブトガニＢ因子の機能を有するポリペプチドを生成させる工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
- 請求項６に記載された方法により得られるポリペプチド。
- 下記（１）及び（２）の工程を含む、エンドトキシンの測定方法。
（１）請求項１又は７に記載のポリペプチド、カブトガニＣ因子、及び被験試料を混合する工程。
（２）上記ポリペプチドのプロテアーゼ活性を測定する工程。 - 請求項１又は７に記載のポリペプチドを構成成分として含む、エンドトキシン測定用試薬。
- 請求項１又は７に記載のポリペプチド又は請求項９に記載の試薬を構成品として含む、エンドトキシン測定用キット。
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