JP6909728B2 - 弱毒化細菌によって送達されるリコール抗原を使用する癌の治療 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年４月２８日出願の米国仮特許出願第６２／１５３，７２８号（その内容は引用することにより本明細書の一部をなす）からの利益を主張する。

本出願を通して、様々な刊行物が括弧内及び上付き文字で言及される。これらの参考文献についての完全な引用は本明細書の最後にみることができる。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術分野をより完全に説明するために、全て引用することにより本明細書の一部をなす。

癌は、米国でも海外でも変わらず主な健康上の関心事である。２０１１年には、米国で概算１３３９７１５９人が癌と共に暮らしている。２００７年〜２０１１年の年齢補正データに基づくと、癌の新たな年間症例数は男女１０００００人当たり４６０．４人であった。年間死亡数は男女１０００００人当たり１７３．８人であった。２００９年〜２０１１年のデータに基づくと、およそ４０．４パーセントの男女が生涯のいずれかの時点で癌と診断されると推測される。年間の癌症例は、２０１２年の１４００万件から次の２０年間で２２００万件に上ると予想される（非特許文献１）。

癌免疫療法の奏功は、２つの主な問題によって妨げられる。１つの問題は、癌ワクチンで使用される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が多くの場合正常細胞と比較して、腫瘍細胞において過剰発現するか、又は変異する自己抗原であるということである。胸腺においてＴ細胞は、若年期に自己抗原に反応しないように教育されることから、ＴＡＡへの強いＴ細胞応答を誘導することは困難である。もう１つの問題は、大半の癌患者が高齢であり、高齢者は若年成人よりもワクチンに効率的に反応しないことである。これは、多くの場合、初めて新たな抗原に反応し、同じ抗原に繰り返し曝露されることによりメモリーＴ細胞の生成を担う、ナイーブＴ細胞（幼い時にのみ生成され、生涯に亘って使用される）の欠如に起因する。

World Cancer Report 2014

本発明はこれらの問題の両方、及び癌に対する治療の改善、特に転移に対する治療の改善に関する要求に取り組むものである。

本発明は、被験体において腫瘍を治療する及び／又は被験体において腫瘍の転移を軽減若しくは予防する方法であって、腫瘍を治療する及び／又は腫瘍の転移を軽減若しくは予防するのに有効量のリコール抗原を発現する弱毒化細菌を被験体に投与することを含む、方法を提供する。

また、リコール抗原を発現する弱毒化細菌を含む医薬組成物及び癌ワクチンが提供される。

リステリア−リコール抗原モデルの概要図である。 図２Ａ：リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}ワクチンの開発を示す図である。破傷風トキソイド（ＴＴ）ｃＤＮＡのＣ末端にある非毒性フラグメント（アミノ酸８５６位〜１３１３位）をＬＬＯプロモータ（Ｐ）の制御下、リステリア^ａｔプラスミドｐＧＧ３４中にトランケート非細胞溶解性リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）との融合タンパク質としてクローニングした（Ａ）。ＴＴタンパク質の検出のためｍｙｃタグを含めた。 図２Ｂ：リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}ワクチンの開発及び感染した４Ｔ１腫瘍細胞におけるＴＴ発現の試験を示す図である。ＬＭ−ＬＬＯ−ＴＴ（リステリア^ａｔ−ＴＴ）によるＬＬＯ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質の分泌を、抗ｍｙｃ抗体を使用するウエスタンブロッティングによって確認した。レーン１：陰性対照（培地）；レーン２：リステリア^ａｔ−ＴＴ培養上清；レーン３：リステリア^ａｔ−ＴＴ培養物のペレット。 図２Ｃ：リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}ワクチンの開発及び感染した４Ｔ１腫瘍細胞のＴＴ発現の試験を示す図である。リステリア^ａｔ−ＴＴによる感染は、抗ｍｙｃ抗体によってここに示される４Ｔ１腫瘍細胞におけるＴＴ抗原の発現をもたらした。レーン１：４Ｔ１腫瘍細胞；レーン２：リステリア^ａｔで感染させた４Ｔ１腫瘍細胞；レーン３：リステリア^ａｔ−ＴＴで感染させた４Ｔ１腫瘍細胞。 ＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質内の免疫優性エピトープに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の発生を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに１週間の間隔で５μｇの精製したＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質と１０μｇのＣｐＧとにより３回の免疫を与え、治療マウス及び対照マウスの白血球を７２時間に亘って免疫優性ＣＤ８ ＴＴペプチド（ＧＹＮＡＰＧＩＰＬ）（配列番号１）で再度刺激した後、フローサイトメトリーによって分析した。２つの実験の代表値。ｎ＝１群当たりマウス５匹。 リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}は、乳癌モデル４Ｔ１における転移に対して非常に有効である。ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスを、図３について記載されるＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質及びＣｐＧで免疫した。１週間後、４Ｔ１腫瘍細胞（０．５×１０^５）を乳腺脂肪体に注入し、腫瘍が直径５ｍｍに達した後、リステリア^ａｔ−ＴＴによる免疫を適用した（一日おき）。これを２週間継続した。最後の免疫から２日後、全てのマウスを安楽死させ、転移の数について分析した。１群当たりマウス５匹を含む２つの実験の平均。マン−ホイットニー検定では^＊ｐ＜０．０５が有意である。 前臨床モデル膵癌（Ｐａｎｃ−０２）における転移（左パネル）及び腫瘍（右パネル）に対するリステリア−ＴＴ及びゲムシタビン（Ｇｅｍ）の効果を示す図である。Ｃ５７Ｂｌ６マウスの乳腺脂肪体に２×１０^６のＰａｎｃ−０２腫瘍細胞を注入した。腫瘍細胞注入の３日後、全研究を通してマウスをゲムシタビン腹腔内投与（ip）（１．２ｍｇ／３００μｌ）で３日毎（合計６回の治療）に治療した。１０^７ＣＦＵのリステリア−ＴＴを４日間に亘って毎日腹腔内注射した後、３日間の休止期間に続いて、１０^７ＣＦＵのリステリア−ＴＴの注射を更に３日間毎日行った。全てのマウスを２１日目に安楽死させ、転移数及び腫瘍重量について分析した。Ｎ＝１群当たりマウス３匹。 図６Ａ−６Ｂ．ＧＥＭ及びリステリア−ＴＴは、Ｐａｎｃ−０２及びＫＰＣのマウスにおける進行した膵癌を強く排除する。（Ａ）Ｐａｎｃ−０２モデル。ＴＴに対するメモリーＴ細胞を生成するため０日目から開始して１週間の間隔でヒトＴＴワクチンによりＣ５７Ｂｌ／６マウスを３回免疫した。後に、Ｐａｎｃ−０２腫瘍細胞（１０^５／１００μｌ）を乳腺脂肪体に注入した（２１日目）。腫瘍が１０ｍｍ（３１日目）になると、１回の高用量のリステリア−ＴＴ（１０^７のＣＦＵ）を腹腔内注射し、その後（３６日目）、２週間に亘って毎日低用量のリステリア−ＴＴ（１０^４のＣＦＵ）を注射した（合計１４回投薬）。３４日目に開始して３日毎に（合計５回投薬）ＧＥＭ（１．２ｍｇ／マウス）を投与した。全てのマウスを５２日目に安楽死させ、転移の数について分析した（治療していないマウスは、肝臓及び膵臓に顕著に転移があり、間葉リンパ節及び横隔膜では転移が少なかった）。ｎ＝１群当たりマウス５匹。２つの実験の平均。マン−ホイットニー ^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。エラーバーはＳＥＭを表す。（Ｂ）ＫＰＣモデル。３．５ヶ月齢のＫＰＣマウスにはＰａｎｃ−０２マウスと同じ治療を施した。４．５ヶ月齢にマウスを安楽死させた。 図７Ａ−７Ｂ。（Ａ）ＧＥＭは、Ｐａｎｃ−０２マウス血中のＭＤＳＣ集団を減少させる。Ｃ５７Ｂｌ６マウスをＰａｎｃ−０２腫瘍細胞でチャレンジし、図７Ａに記載されるリステリア−ＴＴ＋ＧＥＭで治療した。最後の治療から２日後に、ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋）の割合を血中でフローサイトメトリーによって特定した。Ｎ＝１群当たりマウス５匹。２つの実験の代表値。（Ｂ）ＧＥＭは、Ｐａｎｃ−０２マウスの転移におけるＴＡＭ集団を減少させる。Ｃ５７Ｂｌ６マウスをＰａｎｃ−０２腫瘍細胞でチャレンジし、図７Ａに記載されるリステリア−ＴＴ＋ＧＥＭで治療した。最後の治療から２日後に、ＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋）の割合を原発性腫瘍においてフローサイトメトリーによって特定した。Ｎ＝１群当たりマウス５匹。２つの実験の代表値。エラーバーはＳＥＭを表す。 膵癌に対するリステリア−ＴＴ及びＧＥＭの相乗効果を示す図である。リステリアは、感染によって腫瘍細胞へとＴＴを送達し、高免疫原性の腫瘍細胞を生じ、ＤＣの感染によってＴＴに対してメモリーＴ細胞を再活性化する（図示していない）。同時に、リステリアは腫瘍細胞及びマクロファージにおいて高レベルのＲＯＳを誘導し、これはＣＤＡの減少によってＧＥＭ感受性を改善する。ＧＥＭはＭＤＳＣ及びＴＡＭの集団を減少して、Ｔ細胞応答の改善をもたらす。これらの相乗効果は、ＴＴ特異的Ｔ細胞、ＧＥＭ、及びリステリア誘導性ＲＯＳによる腫瘍細胞の殺傷に結びつく。 リステリアはＣＤＡを減少させる。Ｈｅｌａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞株）又はＰＡＮＣ−１（ヒト膵癌細胞株）を様々なＣＦＵ数のリステリア菌（ＬＭ）（１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^６ＣＦＵ／ｍｌの及び１０^４ＣＦＵ／ｍｌ）と共に２時間で培養した後、全ての細胞外細菌を殺傷するためゲンタマイシンと共に一晩培養した。ウサギ抗ヒトＣＤＡ抗体を使用するウエスタンブロッティングによってＣＤＡ発現を分析した。 マウスにおけるリステリア−リコール抗原及びゲムシタビンの免疫化プロトコルの概要図である。

本発明は、被験体において腫瘍を治療する及び／又は被験体において腫瘍の転移の発生率若しくは可能性を減少する方法であって、腫瘍を治療する及び／又は腫瘍の転移の発生率若しくは可能性を減少するのに有効量のリコール抗原を発現する弱毒化細菌を被験体に投与することを含む、方法を提供する。

細菌は、例えばリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、サルモネラ・チフィリウム（正：Salmonella thyphimurium)、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）、クロストリジウム（Clostridium）、及びビフィドバクテリウム・ブレヴェ（Bifidobacterium breve）の１以上であってもよい。好ましい実施形態では、細菌はリステリア・モノサイトゲネスである。細菌を弱毒化して、病原性を減少させるか又は排除する。本明細書で使用される弱毒化リステリア（Listeria）は、例えばリステリア^ａｔと表される。

本明細書で使用されるリコール抗原は、被験体が予め若年期に曝露された抗原である。リコール抗原として、例えば破傷風トキソイド、麻疹ウイルス及びポリオウイルス抗原等の幼年期の予防接種に使用さる抗原が挙げられ得る。大半の個体は、幼年期にこれらの抗原でワクチン接種及びブーストされて、生涯に亘って血流中を循環するメモリーＴ細胞を生じる。これらのメモリーＴ細胞は、いかなる年齢でも、腫瘍微小環境であっても再活性化可能である。

使用可能なリコール抗原の例として、限定されないが、破傷風トキソイド、麻疹ウイルス及びポリオウイルスの１以上の免疫優性エピトープを１以上含むエピトープ又はフラグメントが挙げられる。好ましい実施形態では、抗原は１以上の免疫優性エピトープを含む破傷風トキソイドフラグメントである。

この原理は、幼年期抗原のみならず、若年期に患者が遭遇したほぼ全ての免疫原性抗原に適用可能である。例えば、全女性の最大７０％は、若年期又は高齢期にカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）感染を受け（１）、この感染により熱ショック蛋白質（Ｈｓｐ）７０を含む非常に免疫原性のタンパク質が発現される（２）。他方、インフルエンザウイルスは、それらの連続的な抗原ドリフトのためにさほど適してはいない。基本的に、このアプローチに使用される免疫原性抗原の数は制限されない。

例として、リステリアへクローニングされた破傷風トキソイド（ＴＴ）（アミノ酸位置 ８５６〜１３１３）のアミノ酸配列（大文字）（配列番号５）及びＤＮＡ配列（小文字）（配列番号６）を以下に示す（実験の詳細を参照されたい）。ＤＮＡ配列の下線太字の部分は、リステリアへのＴＴのクローニングに使用したプライマー配列を表す。アミノ酸配列の下線太字の部分は、Ｐａｎｃ−０２モデル（Ｃ５７Ｂｌ６マウス）において免疫優性のＴＴ中のＣＤ８エピトープを表す。イタリック体太字フォントのアミノ酸配列の部分は、４Ｔ１モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス）において免疫優性のＴＴ中のＣＤ８エピトープを表す。

また例として、リステリアへクローニングされたポリオウイルス（ＰＶ）（アミノ酸位置：ＶＰ１中４９〜２７３）のアミノ酸配列（配列番号７）及びＤＮＡ配列（配列番号８）を以下に示す。ＤＮＡ配列の下線太字の部分は、リステリアへのＰＶ ＶＰ１のクローニングに使用したプライマー配列を表す。イタリック体太字フォントのアミノ酸配列の部分は、４Ｔ１モデル（ＢＡＬＢ／ｃマウス／Ｈ２−ｄハプロタイプ）において免疫優性のＰＶ ＶＰ１中のＣＤ８エピトープを表す。

また更なる例として、リステリアへクローニングされた麻疹ウイルス（ＭＶ）アミノ酸（ヌクレオカプシドアミノ酸位置：３８〜３５１）のアミノ酸配列（配列番号９）及びＤＮＡ配列（配列番号１０）を以下に示す。ＤＮＡ配列の下線太字の部分は、リステリアへのＭＶのクローニングに使用したプライマー配列を表す。イタリック体太字フォントのアミノ酸配列の部分は、４Ｔ１モデル（ＡＫＲマウス／Ｈ２−ｋハプロタイプ）において免疫優性のＭＶ中のＣＤ８エピトープを表す。

腫瘍は、例えば、膵臓、卵巣、子宮、頸部、頭部、乳房、前立腺、肝臓、肺、腎臓、神経細胞、グリア、結腸、精巣、又は膀胱の１以上の腫瘍であってもよい。腫瘍は手術不可能な腫瘍であってもよい。

好ましくは、被験体への投与に先立って、細菌を酵母培地で培養する。

上記方法は、被験体にアジュバントとしてシトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）を投与することを更に含んでもよい。

一実施形態では、被験体への細菌の投与に先立って、被験体をそれらの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）１ハプロタイプについてスクリーニングし、被験体がＣＤ８ Ｔ細胞リコール応答を示す抗原を投与する。

一実施形態では、被験体への細菌の投与に先立って、抗原のエピトープを被験体に投与して抗原に対するメモリーＴ細胞を生成する。この方法は、若年の被験体よりも少ないナイーブＴ細胞を有するより高齢の被験体においてはさほど有効ではなくなる。

細菌を種々の経路によって被験体に投与することができる。例えば、細菌を、例えば静脈内投与等によって、被験体に全身投与することができる。細菌を被験体の腫瘍部位への直接注入によって投与することができる。骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）を使用して、原発性及び転移性の腫瘍性病変の両方の微小環境に弱毒化細菌を送達することができ、そこで弱毒化細菌がＭＤＳＣから腫瘍細胞へと広がる（例えば１０を参照されたい）。その後、感染した腫瘍細胞は活性化された免疫細胞の標的となる。

被験体は、リコール抗原を発現する弱毒化細菌の反復投与を受けることが好ましい。例えば、投与は、満足な治療成果が達成されるまで数日間に亘って毎日であっても、一日おきであってもよい。

本明細書に使用される腫瘍を「治療すること」は、腫瘍それ自体、その転移、腫瘍の血管新生、又はその疾患が特徴とする他のパラメーター等の疾患の１以上の症状が、軽減される、改善される、緩解の状態にある、又は緩解の状態に維持されることを意味する。また、腫瘍を「治療すること」は、腫瘍の１以上の特徴が治療によって排除又は減少され得ることを意味する。かかる特徴の非限定的な例として、基底膜及び近位の細胞外マトリクスの制御されない分解、新たな機能毛細血管への内皮細胞の遊走、分裂及び器質化、並びにかかる機能毛細血管の持続が挙げられる。上記方法は、腫瘍成長及び／又は腫瘍サイズを減少させるのに有効であることが好ましい。

本明細書で使用される腫瘍の転移の軽減又は予防は、転移、その広がりの程度、転移の血管新生、又はその疾患が特徴とする他のパラメーター等の疾患の任意の症状が、軽減される、改善される、予防される、緩解の状態にある、緩解の状態に維持される、又は排除されることを意味する。上記方法は転移を軽減させるのに有効であることが好ましい。上記方法は、腫瘍の転移の発生率又は可能性を減少させることができる。

上記方法は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させる化学療法剤を被験体に投与することを更に含んでもよい。かかる化学療法剤として、例えばゲムシタビン、ビタミンＡ誘導体、アミロライド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、ドセタキセル、５−フルオロウラシル、ＧＷ２５８０、シルデナフィル及びスニチニブ（３、４）が挙げられる。

被験体は哺乳動物であってもよい。種々の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ラバ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、去勢ウシ、雄ウシ、家畜、霊長動物、サルであり、又は好ましくはヒトである。ヒトは、例えば、６０歳以上の人等の種々の年齢であってもよい。

また、薬学的に許容可能な担体と、リコール抗原を発現する弱毒化細菌とを含む医薬組成物が提供される。細菌は、例えばリステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィムリウム、ビブリオ・コレラ、クロストリディウム及びビフィドバクテリウム・ブレヴェの１以上であってもよい。リコール抗原は、例えば破傷風トキソイド、麻疹ウイルス及びポリオウイルスの１以上のエピトープであってもよい。

許容可能な薬学的担体の例として、限定されないが、添加溶液−３（additive solution-3）（ＡＳ−３）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、乳酸化リンゲル溶液、ロック−リンゲル溶液、クレブスリンゲル溶液、ハルトマン緩衝生理食塩水、及びヘパリン化クエン酸ナトリウムデキストロース溶液が挙げられる。使用される薬学的に許容可能な担体は、投与経路に依存し得る。限定されないが、経口投与、非経口投与、静脈内投与、経皮投与、筋内投与、鼻腔内投与、腫瘍部位への直接注入、及び浸透圧ミニポンプによる投与を含む当該技術分野で既知の任意の方法による投与に対して医薬組成物を製剤化することができる。

また、リコール抗原を発現する弱毒化細菌を含む癌ワクチンが提供される。細菌は、例えばリステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・チフィムリウム、ビブリオ・コレラ、クロストリディウム及びビフィドバクテリウム・ブレヴェの１以上であってもよい。リコール抗原は、例えば破傷風トキソイド、麻疹ウイルス及びポリオウイルスの１以上のエピトープであってもよい。

本発明は以下の実験の詳細からよりよく理解されよう。しかしながら、当業者であれば、論じられる具体的な方法及び結果は、添付の特許請求の範囲においてより完全に記載される本発明を単に例示するにすぎないことを容易に認識するであろう。

実験の詳細
緒言
幼年期リコール抗原である破傷風トキソイド（ＴＴ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）及びポリオウイルス（ＰＶ）の免疫優性エピトープにより抗原を発現するリステリアコンストラクトを開発した。ＴＴに対するメモリーＴ細胞を有するマウスにおけるリステリア−ＴＴを用いる反復する免疫化は、副作用を伴わずに、転移性乳癌を有するマウスにおける転移をほぼ完全に排除する。膵癌を有するマウスおいてゲムシタビンと組み合わせたリステリア−ＴＴは、おそらくはゲムシタビンが骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の排除によって免疫抑制を減少させることから、リステリア−ＴＴ単独よりも更に有効であった。

リステリア−リコール抗原モデルの概要図
図１は、リステリア−リコール抗原モデルについての概要図を提供する。ＴＴ等のリコール抗原に対するメモリーＴ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスにおいてヒトＴＴワクチンを用いて生じさせることができる。ＴＴタンパク質は抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれて、ナイーブＴ細胞へと提示され得る。反復曝露により、ナイーブＴ細胞は生涯に亘って血流中を循環するメモリーＴ細胞に分化する。後に、４Ｔ１腫瘍細胞を乳腺脂肪体に注入し（これは若齢及び老齢において行うことができる）、続いて、腫瘍が触知可能になったら、低用量リステリア−ＴＴを用いて頻繁に免疫を行う。これは、若年期のＴＴに対するメモリーＴ細胞の活性化をリコールするものである。同時に、ＴＴは、リステリア−ＴＴによる感染によって腫瘍細胞へと送達され、ＴＴ抗原の提示をもたらす。最後に、ＴＴ特異的メモリーＴ細胞は腫瘍細胞へと遊走し、その時ＴＴエピトープを提示する４Ｔ１腫瘍細胞を殺傷する。

方法及び結果
リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}ワクチンの開発。以下に述べるようにリステリア−ＴＴワクチンを開発した。ＴＴ_{８５６〜１３１３}（６２ｋＤａ）をＬＬＯプロモーター（Ｐ）の制御下、リステリア^ａｔ（ｐＧＧ３４）中にトランケートリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）（４８ｋＤａ）及びＴＴタンパク質の検出用ｍｙｃ配列との融合タンパク質としてクローニングした（図２Ａ）。リステリア^ａｔ系ワクチンによるＬＬＯ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質の分泌を、抗ｍｙｃ抗体を使用するウエスタンブロッティングによって検出した（図２Ｂ）。リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}による４Ｔ１腫瘍細胞の感染は、腫瘍細胞におけるＴＴタンパク質の発現をもたらした（図２Ｃ）。また、ＭＶ及びＰＶのフラグメントをリステリア^ａｔへクローニングした。マウスにおける免疫優性リコール抗原のエピトープを表１に示す。

ＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質における免疫優性エピトープに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答の発生。ＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質がＴＴ_{８５６〜１３１３}の免疫優性エピトープに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導するかどうかを試験した。この目的のため、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスをＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質及びＣｐＧで３回免疫した。最後の免疫の２日後に、マウスを安楽死させ、白血球をＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質内の免疫優性ペプチドＧＹＮＡＰＧＩＰＬ_{１２２８〜１２３６}（配列番号１）で再度刺激した（７）。ＣＤ８ Ｔ細胞をＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス血液中の免疫優性Ｔ_{１２２８〜１２３６}エピトープに対して活性化した（図３）。

リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}によるワクチン接種は、乳癌モデル４Ｔ１における転移に対して非常に有効である。リステリア−ＴＴ_{８５６〜１３１３}ワクチンの効力を、４Ｔ１モデルにおける転移性乳癌に対して試験した。最初に、免疫優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープに対するメモリーＴ細胞をＴＴ_{８５６〜１３１３}タンパク質及びＣｐＧを用いて生じさせた。その後、４Ｔ１腫瘍及び転移を乳腺脂肪体への４Ｔ１細胞株の注入によって生じさせ、腫瘍サイズが５ｍｍに達した後、リステリア^ａｔ−ＴＴのワクチン接種を一日おきに２週間適用した。リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}は、原発性腫瘍（図示していない）に対してではなく転移（図４）に対して非常に有効であった。ＣｐＧをアジュバントとして使用した。興味深いことに、ＣｐＧ自体も転移に対して有効であった。ＣｐＧは、ＭＤＳＣを排除することがわかった（３）。また、リステリア^ａｔはそれ自体が初期の研究（１２）の確認においてＲＯＳの産生によって腫瘍細胞を殺傷することにより転移に対して有効であった。しかしながら、ＣｐＧ＋ＴＴ／リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}の組み合わせが最も有効であり、すなわち、全ての対照群と比較して、ＣｐＧ＋ＴＴ／リステリア^ａｔ−ＴＴ_{８５６〜１３１３}群の転移の数は有意に低かった。

リステリア−ＴＴ及びゲムシタビンは、膵癌を有するマウスにおける転移及び腫瘍に対して非常に有効である。膵癌を有する患者におけるリステリア−リコール抗原の臨床試験では、患者をゲムシタビンで治療すると予想される。したがって、ゲムシタビンがリステリア−リコール抗原免疫に影響を与えたかどうかを試験した。ゲムシタビンは免疫抑制の主な原因物質であるＭＤＳＣを排除することが知られているため、ゲムシタビンが免疫抑制を減少させ、リコール抗原はより優れた働きをすると期待された。

リステリアを生理食塩水中で３０分間に亘って飢餓状態においた後、６０分間に亘って酵母培地で培養した（リステリアを生存させるが、リステリアは複製しない）。この処理は、毎日１０^４ＣＦＵに代えて１０^７ＣＦＵのリステリアの注射を可能にした。その後、リステリア−ＴＴをゲムシタビン（Ｇｅｍ）と組み合わせて試験した。膵癌を有するマウスをゲムシタビンで腹腔内治療し（１回の投与量当たり１．２ｍｇ／３００μｌ；腫瘍細胞注入の後３日目から開始して３日毎）、続いて腫瘍細胞注入の後１０日目にリステリア−ＴＴ腹腔内治療を開始した（４日間に亘って毎日１０^７ＣＦＵ、続いて３日間の休止期間、その後１０^７ＣＦＵのリステリア−ＴＴで更に３回の注射を続けた）。全てのマウスを２１日目に安楽死させた。治療していないマウスは、この非常に攻撃的な（aggressive：侵攻性の）膵癌モデルにおいて腫瘍細胞注入後、２１日目〜２８日目の間に死亡する。ゲムシタビンとリステリア−ＴＴとの組み合わせは転移を完全に排除し、原発性腫瘍をほぼ完全に排除した（図５）。これは、乳癌モデル（４Ｔ１）におけるリステリア−ＴＴよりはるかに良好であった。結果は、ゲムシタビンがＰａｎｃ−０２腫瘍に対するＴＴの効果を改善しながら、より多くのリステリア（１０Ｅ４に代えて１０Ｅ７）が完全に転移を排除したことを示唆するものである。結論として、ゲムシタビンはリステリア−ＴＴに正の効果を有した。

図６は、進行した膵癌に対するリステリア−ＴＴとゲムシタビンとの組み合わせの効力を説明する。先の図は、初期の膵癌に対する効果を示す。

図７は、ゲムシタビンが骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の集団を減少させることを示す。いずれもＴ細胞を強力に抑制した。これらの集団を減少させることによって、表２及び表３に示されるように、Ｔ細胞応答が強く改善される。

表２は、リステリア−ＴＴ及びゲムシタビンで治療したＰａｎｃ−０２マウスにおけるＴ細胞応答を示す。リステリア−ＴＴ及びゲムシタビンにおけるＴ細胞応答は、別々の群におけるよりもはるかに良好である。

表３はリステリア−ＴＴ及びゲムシタビンで治療したＫＰＣマウスにおけるＴ細胞応答を示す。リステリア−ＴＴ及びゲムシタビンにおけるＴ細胞応答は、別々の群におけるよりもはるかに良好である。

表４は、リステリア−ＴＴとゲムシタビンとの組み合わせがＭＤＳＣ及びＴＡＭによってもたらされる阻害性サイトカインを減少させ、Ｔ細胞刺激に関与するＣＤ８０の発現レベルを改善することを示す。

図８は、リステリア−リコール抗原とゲムシタビン（ＧＥＭ）とを組み合わせた新たなモデルを示す。リステリアは、高レベルの活性酸素種（ＲＯＳ）を誘導し、ＲＯＳはシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）酵素のレベルを減少させる。ＣＤＡはゲムシタビンを不活性化し、癌患者及び担腫瘍マウスにおいて腫瘍細胞及びマクロファージに高レベルで存在する酵素である。リステリアの使用によって腫瘍細胞は、そのときリステリア誘導性ＲＯＳによってゲムシタビンに感受性となる。図９は、リステリアがＨｅｌａ及びＰＡＮＣ−１腫瘍細胞中のＣＤＡを減少させることを示す。図１０は、併用療法に対して開発された免疫化プロトコルを示す。

考察
癌免疫療法の奏功は、２つの主な問題によって妨げられていた。１つの問題は、癌ワクチンで使用される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が多くの場合正常細胞と比較して、腫瘍細胞において過剰発現するか、又は変異する自己抗原であるということである。胸腺においてＴ細胞は、若年期に自己抗原に反応しないように教育されることから、ＴＡＡへの強いＴ細胞応答を誘導することは困難である。もう１つの問題は、大半の癌患者が高齢であり、高齢者は若年成人よりもワクチンに効率的に反応しないことである。これは、多くの場合、初めて新たな抗原に反応し、同じ抗原に繰り返し曝露されることによりメモリーＴ細胞の生成を担う、ナイーブＴ細胞（幼い時にのみ生成され、生涯に亘って使用される）の欠如に起因する。現在入手可能なワクチンには、高齢者でナイーブＴ細胞を必要としないものは存在せず、いずれのワクチンも生きた弱毒化細菌による腫瘍細胞への直接的な高免疫原性リコール抗原の送達を可能としない。

本発明のアプローチは、高免疫原性リコール抗原の使用により癌ワクチン接種における免疫原性の低い抗原の問題を克服し、同時に高齢者におけるナイーブＴ細胞の必要性を回避するものである。本発明の処置は、多くのナイーブＴ細胞が利用可能な幼年期に大半の個体が曝露されることがある、破傷風トキソイド（ＴＴ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）抗原等の外来の高免疫原性抗原に対してメモリーＴ細胞を再活性化することを含み、これは弱毒化された非毒性で非病原性のリステリア・モノサイトゲネス等の細菌による腫瘍細胞へのこれらの抗原の選択的な送達によるものである。これらのメモリーＴ細胞は、そうして高免疫原性抗原を提示する感染した腫瘍細胞を殺傷する。先の研究では、リステリアは、腫瘍微小環境へ、また転移の腫瘍細胞及び腫瘍への抗癌剤の選択的送達に使用されてきた。リステリアは、転移及び原発性腫瘍の極度に免疫抑制された微小環境中ではなく正常組織における免疫系によって効果的に除去された（１０、１１）。

しかしながら、免疫抑制は、この治療によって完全には克服されない場合がある。この問題は、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の数を減少させるゲムシタビン等の化学療法剤とリステリア−リコール抗原とを組み合わせることにより解消され得る。ＭＤＳＣは腫瘍微小環境における免疫抑制に対して最も有力な原因物質である。

まとめると、これらの結果は非常に印象的である。また、リステリア誘導性ＲＯＳがゲムシタビン感受性を改善する機構は、ほとんどの臨床医が膵癌患者におけるゲムシタビン治療を停止したくないことから、非常に重要である。また最も重要なことに、上記併用療法は進行した膵癌に対して有効であり、高齢の患者がナイーブＴ細胞（メモリーＴ細胞の発生に必要）を欠くことから、若年及び老年において作用可能である。本発明のアプローチにより、破傷風トキソイド抗原、麻疹ウイルス抗原及びポリオウイルス抗原に対してメモリーＴ細胞が即座に再活性化され、高齢者におけるナイーブＴ細胞の必要性が回避される。リコール抗原と共にリステリアが選択的にｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞に感染すると、生涯に亘って血中を循環するメモリーＴ細胞は感染した腫瘍細胞を殺傷することができる。これらのメモリーＴ細胞は幼年期ワクチンにより幼年期の間に生成されたものである。

本発明の最も明白な使用は、ほぼ常に転移形態で検出される膵癌、又は卵巣癌等の事実上有効な治療がないタイプの癌の治療である。また、良好な候補は、頭頸部癌又は手術不可能な肝細胞癌等の腫瘍位置のために、原発性腫瘍を除去する手術が選択肢とされないことが多い癌を含む。かかる治療法から利益を得ると予想される患者の第３のコホートは、例えば、乳癌と同じく肺及び大腸の癌等の再発性であるか、又は標準治療に対して治療抵抗性である、様々なタイプの転移性疾患を有する患者である。

参照文献

Claims (9)

1. 被験体において腫瘍を治療する及び／又は被験体において腫瘍の転移を軽減若しくは予防するための医薬の調製における、リコール抗原を発現する弱毒化細菌の使用であって、前記細菌がリステリア・モノサイトゲネスであり、前記リコール抗原が、破傷風トキソイドのエピトープであり、かつ、前記腫瘍が膵臓の腫瘍である使用。
2. 前記被験体への投与に先立って、前記細菌を酵母培地で培養する、請求項１に記載の使用。
3. 前記医薬はゲムシタビンと併用される、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記被験体がヒトである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記被験体が哺乳動物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
6. 薬学的に許容可能な担体とリコール抗原を発現する弱毒化細菌とを含む、被験体において腫瘍を治療する及び／又は腫瘍の転移を軽減若しくは予防するための医薬組成物であって、前記細菌がリステリア・モノサイトゲネスであり、前記リコール抗原が、破傷風トキソイドのエピトープであり、かつ、前記腫瘍が膵臓の腫瘍である、医薬組成物。
7. リコール抗原を発現する弱毒化細菌を含む、膵癌を治療するための癌ワクチンであって、前記細菌がリステリア・モノサイトゲネスであり、前記リコール抗原が、破傷風トキソイドのエピトープである、癌ワクチン。
8. ゲムシタビンと併用される、請求項６に記載の医薬組成物。
9. ゲムシタビンと併用される、請求項７に記載の癌ワクチン。

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