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JP6989979B2 - 抗炎症特性が増強され、細胞毒性特性が減少したポリペプチドおよび関連する方法 - Google Patents

抗炎症特性が増強され、細胞毒性特性が減少したポリペプチドおよび関連する方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年４月５日に出願された米国仮特許出願第６０／７８９，３８４号
に対して優先権を主張するものである。
連邦政府の資金による研究に関する言及
本発明に至る研究は、一部、国立衛生研究所認可番号ＡＩ０３４６６２によって支援さ
れた。したがって、米国政府が、本発明についてある程度権利を有しうる。
技術分野
本発明は、炎症性疾患の治療を目的とした、治療用ポリペプチドを設計する新規な方法
に関する。
免疫グロブリンに対する細胞受容体は、４０年近く前に最初に同定されたけれども、免
疫反応におけるそれらの中心的役割は、ここ１０年ほどで見出されたに過ぎない。免疫反
応の末梢から中枢に向かう時期（ａｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈａｓｅ）および中枢から末梢に
向かう時期（ｅｆｆｅｒｅｎｔ ｐｈａｓｅ）の双方においてそれらは中心的存在であり
、Ｂ細胞活性化の閾値および抗体産生を設定し、樹状細胞の成熟を制御し、そして抗体反
応の高い特異性を食作用、抗体依存性細胞障害ならびに炎症性細胞の動員および活性化の
ようなエフェクター経路へと導く。液性免疫システムを固有のエフェクター細胞に導く際
のそれらの中心的役割により、それらは、インビボにおける抗体活性を増強させる、また
は抑制するための魅力的な免疫治療用ターゲットとなる。
抗体および抗体－抗原複合体と、免疫システムの細胞との相互作用は、抗体依存性細胞
媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、食作用、炎症性メデ
ィエータの放出、抗原クリアランス、ならびに抗体半減期などの種々の反応を引き起こす
（Ｄａｒｏｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３－２３４（１９９７）
；Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２，
７７－９４（１９９５）；Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ ＪＲｅｖ
Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，４５７－４９２（１９９１）中で概説され，各々は、本明細書で参
照として引用される）。
抗体定常領域は、直接的には抗原への抗体の結合に関与しないが、種々のエフェクター
機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体または免疫グロブリンを、異
なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、
ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちさらにサブクラス（イソ
タイプ）、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡｌおよびＩ
ｇＡ２、に分けられるものもある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領
域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。種々のヒト免疫グロブリンクラス
のうち、ヒトＩｇＧｌおよびＩｇＧ３がＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりもより効果的にＡＤ
ＣＣを媒介する。
抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントが生成するが、このフ
ラグメントは、各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメント、および、すぐに
結晶化できることを示す名前である「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる。Ｆｃ領域は、抗体
のエフェクター機能の中心となる。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の結晶構造が決定されてきた（
本明細書に参照として引用される、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、２０、２３６１－２３７０（１９８１））。ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域は、パ
パイン消化Ｃｙｓ、２２６までのＮ末端によって生成する。
ＩｇＧは、Ｆｃフラグメントによって媒介される相互作用を通じて、炎症性、および抗
炎症性双方の活性を媒介すると長い間考えられてきている。したがって、Ｆｃ－ＦｃｙＲ
相互作用は、免疫複合体および細胞障害抗体の炎症性特性に関与する一方、静脈注射用ガ
ンマグロブリン（ＩＶＩＧ）およびそのＦｃフラグメントは、抗炎症性であり、炎症性疾
患を抑制するために広く用いられる。そのような逆説的な特性の正確なメカニズムは不明
であるが、ＩｇＧのグリコシル化がＩｇＧの細胞毒性および炎症性可能性の制御に重要で
あることが提案されてきている。
ＩｇＧは、その２つの重鎖の各々のＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７で単一の、Ｎ－結
合型グリカンを含む。共有結合した複合糖質は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡ
ｃ）およびマンノース（ｍａｎ）を含む、コア、二分岐ペンタ－ポリサッカロイドから構
成される。コア糖質構造のさらなる修飾が、可変的に見出されるフコース、分岐ＧｉｃＮ
Ａｃ、ガラクトース（ｇａｌ）および末端シアル酸（ｓａ）分子の存在によって血清抗体
中に見られる。それ故、４０を超える異なる糖型が、この一つのグリコシル化部位に共有
結合していることが見出されている。Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ ２６５、６００９（１９９０）。ＩｇＧのグリコシル化は、２つの重鎖の活性構造（
ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持することによって、全てのＦｃｙＲへの結
合に不可欠であることが示されてきている。Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｕｎｄ、Ｉｍ
ｍｕｎｅ．１ Ｌｅｔｔ．８２、５７ （２００２）、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ 、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３０９、７３７（２００１）。このようにＦｃｙＲ結合に
ＩｇＧグリコシル化が絶対不可欠であることは、脱グリコシル化ＩｇＧ抗体がＡＤＣＣ、
食作用および炎症性メディエーターの放出のような、インビボで誘発される炎症反応を媒
介することができないことの説明となる。Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃ
ｈ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２４、１９（２００６）。さらに、フコースを含むまたは欠くＩｇ
Ｇ抗体に対して報告された各々のＦｃｙＲに対して親和性が変化し、その結果として細胞
毒性に影響を与えることにより、個々のＩｇＧの糖型が炎症反応の調節に寄与しうるとい
う知見が提案されてきている。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ． ２７７、２６７３３（２００２）、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃ
ｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０、１５１０（２００５）。自己免疫状態とＩｇＧ抗体の特定
のグリコシル化パターンとの関連が、ＩｇＧ抗体のガラクトシル化およびシアル化の減少
が報告されている関節リウマチ、および自己免疫血管炎患者において見出されている。Ｐ
ａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３１６、４５２（１９８５）、Ｒａｄｅｍａ
ｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、６１
２３（１９９４）、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、１２８、６２１（２０００）、
Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ Ｄｅｃ
２７；［印刷に先立つ電子出版］２００５。ＩｇＧ糖型の変化もまた老化および免疫性に
関連することが報告されているが、これらの変化のインビボにおける重要性は究明されて
いない。Ｓｈｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１５、６８３（１９
９８）、Ｌａｓｔｒａ、ｅｔ ａｌ．、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８、２５（１９９
８）。
したがって、インビボにおけるＩｇＧ特性の種々の知見を説明しうるポリペプチドの作
製方法の開発が必要とされている。
発明の要約
本発明は、そのような方法および分子を提供することによって前述の要求を満たすもの
である。一実施態様において、本発明は、少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリ
ペプチドを提供するものであり、前記ポリペプチドは、未精製の抗体と比較してより高い
抗炎症活性およびより低い細胞毒性を有する。本発明の他の実施形態において、ポリペプ
チドは、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含み、前記ポリ
ペプチドは、未精製抗体と比較してより高いシアル酸含有量を有する。
他の実施態様において、本発明は、適切なキャリアーまたは希釈剤と組み合わせた、よ
り高い炎症活性およびより低い細胞毒性活性をもつ、少なくとも一つのＦｃ領域を有する
ポリペプチドを含む製剤を提供する。
さらに他の実施態様において、本発明は、少なくとも一つのＦｃ領域を有するポリペプ
チドの製造方法を提供するものであり、前記ポリペプチドは、未精製の抗体よりも高い抗
炎症活性および低い細胞毒性を有し、該方法は：少なくとも一つのＦｃ領域を含むポリペ
プチドの未精製源を提供し、ここで少なくとも一つのＦｃ領域を含むポリペプチドの未精
製源は、シアル酸を含む少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドを複数お
よびシアル酸を欠く少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの複数を含み
；そして、シアル酸を欠く少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの複数
に対する、シアル酸を含む少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの複数
の比率を増加させる：ことを含む。本発明の異なる実施形態において、シアル酸を欠く少
なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの複数に対する、シアル酸を含む少
なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの複数の比率は、シアル酸を欠く少
なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの除去、または、少なくとも一つの
ＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドの未精製源のシアル化のいずれかによって、達成さ
れる。
図面の簡単な説明
図１は、６Ａ６－ＩｇＧ抗体イソタイプの糖質スペクトルを示す。６Ａ６－ＩｇＧｌ、
ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ由来のＮ－グリカンは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＰ ＭＳによって
分析した。シアル酸残基を含むピークは、角括弧で示す。２９３Ｔ細胞の一過性トランス
フェクションによって製造される組み換え６Ａ６抗体スイッチ変異体（ｓｗｉｔｃｈ ｖ
ａｒｉａｎｔ）は、Ａｓｎ－２９７の位置で付加された糖質中、シアル酸残基の最小限の
レベルを含んでいた。
図２は、シアル化がＩｇＧ細胞毒性を抑制することを示す。（Ａ）抗体Ｆｃ－フラグメ
ント中のアスパラギン２９７（Ｎ２９７）に付加した、十分に進行した（ｆｕｌｌｙ ｐ
ｒｏｃｅｓｓｅｄ）糖質部分の構造。コア糖構造は、ボールド体で示されている。末端お
よび分岐糖類のような可変残基に下線が付され、特異的結合が示されている。ＰＮＧａｓ
ｅおよびノイラミニダーゼに対する切断部位も示されている。この十分に進行した構造は
、トータル血清ＩｇＧプール（１）の約５％に存在している。略記：ＧＩｃＮＡｃ＝Ｎ－
アセチルグルコサミン、ｍａｎ＝マンノース、ｇａｌ＝ガラクトース、ｓａ＝シアル酸。
（Ｂ）セイヨウニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉ
ｎ（ＳＮＡ））アフィニティークロマトグラフィーによる、シアル酸含有量が高い６Ａ６
－ＩｇＧｌおよびＩｇＧ２ｂ抗体の濃縮。（Ｃ）シアル酸（ＳＡ）を豊富に含む、または
ノイラミニダーゼ（ＮＡ）処理によってシアル酸が欠失した６Ａ６－ＩｇＧｌおよび－Ｉ
ｇＧ２ｂ抗体のインビボ活性。各抗体４μｇをマウス群に注射した（Ｎ＝４、ｍｅａｎ
＋／－ ＳＥＭ）；＊はｐ＜０．０００１、＊＊はｐ＜０．０１を示す。（Ｄ）高いレベ
ルでシアル化されている、または低いレベルでシアル化されている抗体への結合における
ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲｌＶに対する結合定数（ＫＡ）；ｎ．ｂ
．は、結合なし（ｎｏ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。太字の数字は、インビボでの抗体活性
の媒介に関与するイソタイプ特異的Ｆｃ－レセプターを示す。全ての測定において標準誤
差は５％未満であった。
図３は、インビボでの抗体活性がシアル酸により調整されることを示す。６Ａ６－Ｉｇ
Ｇｌは、ＳＮＡ－アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってシアル
酸リッチとなった。このＳＮＡリッチな処理物のフラクションは、ノイラミニダーゼで処
理された（ＳＮＡ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ＋ノイラミニダーゼ）。（Ａ）抗体処理物中のシア
ル酸含有量は、ＳＮＡを用いたレクチンブロットによって算出した。（Ｂ）インビボの抗
体活性は、各抗体処理物（グループあたりｎ＝４～５マウス）４μｇを注入することによ
って誘発される血小板減少をモニタリングすることによって試験した。
図４は、ＩＶＩＧの抗炎症活性がシアル酸を必要とすることを示す。（Ａ）ＰＢＳ、Ｉ
ＶＩＧ、およびＰＮＧａｓｅＦ－処理ＩＶＩＧ（ＰＮＧａｓｅＦ ＩＶＩＧ）で処理した
マウス中でのＫ／ＢｘＮ血清誘発性関節炎の臨床スコア。（Ｂ）図４（Ａ）で示した処理
に加えて、マウスをノイラミニダーゼ－処理ＩＶＩＧ（ＮＡ ＩＶＩＧ）またはＳＮＡ－
リッチＩＶＩＧ（ＳＮＡ ＩＶＩＧ）で処理した。（Ｃ）ＩＶＩＧのＦｃ－フラグメント
、ノイラミニダーゼ－処理Ｆｃ（ＮＡ Ｆｃ）、またはＳＮＡ－リッチＦｃ（ＳＮＡ Ｆ
ｃ）で処理したマウスの臨床スコア（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。（Ｄ）ＩＶ
ＩＧ調製物の糖質分析結果。未処理またはノイラミニダーゼ処理ＩＶＩＧ由来のＮ－グリ
カンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析結果を示す。シアル酸残基を含むピークは、角括弧
で示し、ピークの糖質組成を図５に示す。（Ｅ）ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ（０．１ｇ／ｋ
ｇ）で処理または未処理の、コントロールマウスまたはＫ／Ｎ誘発性関節炎マウスの足関
節の代表的なヘマトキシリン／エオシン染色。Ｋ／Ｎ処理マウスで観察される広範な好中
球浸潤が、ＩＶＩＧ－ＳＮＡ（０．１ｇ／ｋｇ）処理マウスでは見られない。（Ｆ）ＩＶ
ＩＧのコントロールＦｃフラグメント、ノイラミニダーゼ－処理Ｆｃ（ＮＡ Ｆｃ）およ
びセイヨウニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）
（ＳＮＡ）アフィニティークロマトグラフィーを経たシアル酸含有量が高いＦｃ（ＳＮＡ
Ｆｃ）のレクチンブロット。（Ｇ）ＩＶＩＧ中の２、３および２、６結合シアル酸残基
の分析。ＩＶＩＧは、未処理のまま（レーン２）または２、３結合シアル酸残基に特異的
なノイラミニダーゼで処理した（レーン３）または２、３および２、６結合シアル酸残基
に特異的なノイラミニダーゼで処理した（レーン４）。シアル酸の除去は、ＳＮＡ（２、
６結合シアル酸残基を認識する）およびＭＡＬ－Ｉ（２、３結合シアル酸残基を認識する
）を用いたレクチンブロットによって分析した。２、３結合シアル酸残基中の糖タンパク
質リッチに対するコントロールとして、ｆｅｔｕｉｎを用いた（レーン１）。クマシー染
色ゲルがローディングコントロールとしての役割を果たした（クマシー）。（Ｈ）２、３
または２、３および２、６結合シアル酸残基を欠失したＩＶＩＧの抗炎症活性。関節炎を
誘発するために、マウスにＫＲＮ血清を注入し、未処理のまま（ＫＲＮ）、あるいは、Ｉ
ＶＩＧ（ＫＲＮ＋ＩＶＩＧ）、２、３結合シアル酸残基を欠失したＩＶＩＧ（α２－３
シアリダーゼｔｘ ＩＶＩＧ＋ＫＲＮ）、または２、３および２、６結合シアル酸残基を
欠失したＩＶＩＧ（α２－３、６ シアリダーゼｔｘ ＩＶＩＧ＋ＫＲＮ）で処理した。
ネガティブコントロールとして、ＰＢＳをマウスに注入した（未処理）。
図５は、Ｎ２９７ ＩｇＧ Ｆｃから放出される糖質部分の構成を示す。抗体重鎖中の
アスパラギン残基２９７に連結している核となる糖構造は、Ｎ－アセチルグルコサミン（
ＧＩｃＮＡｃ）およびマンノース（Ｍａｎ）から構成される。各々の糖型は、１または２
の末端ガラクトース（Ｇａｌ）残基の付加、末端シアル酸－（ヒトに対するＮ－アセチル
ノイラミン酸またはＮｅｕ５Ａｃおよびマウスに対するＮ－グリコリルノイラミン酸また
はＮｅｕ５Ｇｃ）残基の付加、および／または分岐ＧｌｃＮＡｃまたはフコース（Ｆｕｃ
）の付加に関して変化する。数字は、異なる糖組成のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって
決定される分子量を示す。グリカン構造類の質量は、ヒトまたはマウスに対して示されて
いる（下線）。
図６は、脱シアル化ＩＶＩＧの血清半減期およびタンパク質完全性を示す。（Ａ）ＩＶ
ＩＧ処理マウスの血清中のヒトＩｇＧのレベルを、示した日数でＥＬＩＳＡによって測定
した（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。ＩＶＩＧと脱シアル化ＩＶＩＧの半減期に
は何ら顕著な違いはなかった。有意性は、ＡＮＯＶＡ－テストで繰り返し測定することに
よって算出した。（Ｂ）ＩＶＩＧまたは脱シアル化ＩＶＩＧの１０μｇを８％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて非還元下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブリリアン
トブルー染色で可視化した。ＩＶＩＧの単量体組成および構造完全性は、ノイラミニダー
ゼ処理によって影響されなかった。
図７は、ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧの血清半減期およびサブクラス組成を示す。（Ａ）Ｉ
ＶＩＧ処理マウスの血清中のヒトＩｇＧのレベルを、示した日数でＥＬＩＳＡによって測
定した（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。ＩＶＩＧおよびＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ
フラクションの半減期には何ら顕著な違いはなかった。有意性は、ＡＮＯＶＡ－テストで
繰り返し測定することによって算出した。（Ｂ）未処理およびＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ中
のＩｇＧサブクラスをＥＬＩＳＡによって決定した。何ら相違は観察されなかった。
図８は、同様の糖質構造を有するシアル化タンパク質はＫ／ＢｘＮ血清誘発性関節炎か
らマウスを防御しないことを示す。ＩＶＩＧまたはシアロタンパク質フェチュイン（ｆｅ
ｔｕｉｎ）およびトランスフェリンの同モル量（キログラムあたり６．７μｍｏｌ）また
は同量（キログラムあたり１ｇ）をＫ／ＢｘＮ血清注入の１時間前に投与し、臨床スコア
を４日目に調べた（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。ＰＢＳを追加のコントロール
として用いた。ＩｇＧと比べて、フェチュインまたはトランスフェリンは、等モル濃度で
統計的に有意な抗炎症活性は有しなかった。有意性は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓＵ
テストで算出した。
図９は、ＳＮＡリッチＩＶＩＧの抗炎症活性がＦｃγＲＩＩＢを必要とすることを示す
。（Ａ）非分画ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇマウス重量）、ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ（０．１ｇ
／ｋｇマウス重量）、またはコントロールとしてＰＢＳを、Ｋ／ＢｘＮ 血清注入の１時
間前にＦｃγＲＩＩＢ－欠失マウスに注入し、４日目に臨床スコアを調べた（Ｎ＝４、ｍ
ｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。関節炎の臨床スコアに有意な差はなかった。有意性は、Ｍａ
ｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓＵテストで算出した。（Ｂ）ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧによるイ
ンビボＦｃγＲＩＩＢ＋単球蓄積。野生型マウスに１ｇ／ｋｇ、０．１ｇ／ｋｇ ＩＶＩ
Ｇあるいは０．１ｇ／ｋｇ ＳＮＡ－リッチまたはコントロールとしてのＰＢＳを注入し
た。骨髄（左パネル）および脾臓細胞（右パネル）を回収し、注入後１日目にフローサイ
トメトリーで分析した（Ｎ＝４）。ＩＶＩＧ １ｇ／ｋｇまたはＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ
０．１ｇ／ｋｇで処理後、Ｆ４／８０＋ＦｃγＲＩＩＢ＋細胞が顕著に蓄積した。有意
性は、スチューデントテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）で算出した。
図１０は、免疫活性がＩｇＧシアル化の減少を引き起こすことを示す。（Ａ）Ｓａｍｂ
ｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ）を用いたブロットにより、シア
ル酸含有量について、未処理（免疫前）またはヒツジＩｇＧおよび腎毒性血清（ＮＴＳ）
を用いた免疫付与によって誘発される腎毒性腎炎（ＮＴＮ）のマウスからの血清ＩｇＧの
特性を明らかにした（方法参照）。（Ｂ）濃度測定法（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によ
って決定される、未処理およびＮＴＮマウス中のトータル血清ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体な
らびにヒツジＩｇＧ－特異的ＩｇＧ抗体のシアル化のレベルの定量（ｍｅａｎ ＋／－
ＳＥＭ）。マウス抗体調製物には何らヒツジＩｇＧは検出されなかった（データは示さず
）。（Ｃ）未処理またはＮＴＮマウスからのＩｇＧ抗体に付加される糖残基のＭＡＬＤＩ
－ＴＯＦ分析。シアル酸含有部分は、角括弧によって示される。個々のピークの詳細な糖
質組成は、図５に示す。（Ｄ）完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ））中のヒツジＩｇＧを用いた前免疫あり（ＮＴ
Ｓ＋ＣＦＡ）、または前免疫なし（ＮＴＳのみ）の腎毒性血清を注入されたマウスの糸球
体中に蓄積される抗体中のシアル酸含有量の検出。
発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべきことに、ＩｇＧ Ｆｃドメインの細胞毒性および抗炎症反応が
、Ｆｃに結合したコア多糖のシアル化が異なることに起因することを見出した。ＩｇＧ抗
体の細胞毒性は、シアル化によって減ぜられる；逆に、ＩＶＩＧの抗炎症活性は増強され
る。ＩｇＧ シアル化は、抗原特異的免疫反応の誘導によって制御されることが示され、
したがって、抗原投与によって、定常状態の固有の抗炎症分子から、適応的、炎症性種に
ＩｇＧを転換する新規な方法を提供する。
したがって、本明細書では、所望の細胞毒性および抗炎症性ポテンシャルを有するＩｇ
Ｇの製造および選択の有利な戦略を提供する。
定義
本明細書および請求項を通じて、免疫グロブリン重鎖における残基のナンバリングは、
本明細書に参照として明示的に引用される、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ
、 ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 Ｍｄ． （１
９９１）中のようなＥＵｉｎｄｅｘのものである。「Ｋａｂａｔ中のようなＥＵｉｎｄｅ
ｘ」は、ヒトＩｇＧｌ ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
「ネイティブ」または「親（ｐａｒｅｎｔ）」という用語は、Ｆｃアミノ酸配列を含む
改変されていないポリペプチドを指す。親ポリペプチドは、ネイティブ配列Ｆｃ領域また
は（付加、欠失および／または置換のような）予め存在するアミノ酸配列の改変を持つＦ
ｃ領域を含みうる。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含む種々のタン
パク質断片を指し、限定されるものではないが、例えば、抗体、例えばＩｇＧ抗体のよう
な完全に機能的なタンパク質が挙げられる。
「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域を規定するために用い
られる。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域であっても、または変異Ｆｃ領域であ
ってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆ
ｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６位、またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からそのカルボキ
シル末端まで伸びると規定される。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとしても言及される
）は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで拡がる。ＣＨ２ドメインは、他
のドメインと厳密に対をなさない点でまれである。正確には、２つのＮ－結合分岐糖質鎖
が、正常ネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に入っている。糖質は、ドメイ
ン－ドメイン対の代わりとなり、ＣＨ２ドメインの安定化を助けると考えられている（本
明細書に参照として引用される、Ｂｕｒｔｏｎ、ＭｏＩ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２、１６１
－２０６（１９８５））。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインまでのＣ－末端残基の拡がりを含
む（すなわち、ＩｇＧの約アミノ酸残基３４１から約アミノ酸残基４４７まで）。
「ヒンジ領域」という用語は、一般的には、ヒトＩｇＧｌのＧｌｕ２１６からＰｒｏ２
３０までの拡がりとして定義される（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５）。他のＩｇＧイソタイプ
のヒンジ領域は、最初および最後にシステイン残基が配置され、同じ位置で重鎖Ｓ－Ｓ結
合間を形成することによって、ＩｇＧｌ配列に揃えられる。
「結合ドメイン」は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合、
結合ドメインは、Ｆｃ領域との結合に関与する、そのポリペプチド鎖の部分を含みうる（
例えば、そのα鎖）。結合ドメインの一例は、ＦｃＲ鎖の細胞外ドメインである。
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の部分的「エファクター機能」を少な
くとも有する。「エフェクター機能」の例としては、Ｃｉｑ結合；補体依存性細胞傷害；
Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レ
セプター（例えば、Ｂ細胞レセプター（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）；ＢＣＲ）の
ダウンレギュレーションなどが挙げられる。かようなエフェクター機能は、通常、結合ド
メイン（例えば、抗体可変領域）に結合されるために、Ｆｃ領域を必要とし、例えば本明
細書で開示されているような種々のアッセイを用いて分析することができる。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に一致した
アミノ酸配列を含む。当業者によって認識されているように、「変異Ｆｃ領域」は、少な
くとも一つの「アミノ酸修飾」のためにネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異な
るアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親
ポリペプチドのＦｃ領域と較べて少なくとも一つのアミノ酸置換、例えば、ネイティブ配
列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１から約１０アミノ酸置換、好ま
しくは約１から約５アミノ酸置換を有する。本明細書における変異Ｆｃ領域は、好ましく
は、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８
０％の相同性、より好ましくはこれらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはこ
れらと少なくとも約９５％の相同性、より好ましくは少なくとも約９９％の相同性を有す
るであろう。
「変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）グリコシル化」という用語は、上記で定義したような、
ネイティブであろうと、修飾されていようと、特定の糖成分を増加させるか、減少させる
ために重鎖定常領域への糖質付加がコントロールされているポリペプチドを指す。例えば
、Ｌｅｃ２またはＬｅｃ３のような特定の細胞株中で準備された抗体のようなポリペプチ
ドは、フコースやシアル酸のような糖部分の付加に欠けている可能性がある。
「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプ
ターを表すために用いられる。本発明の一実施形態において、ＦｃＲはネイティブ配列ヒ
トＦｃＲである。他の実施形態において、ヒトＦｃＲを含むＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合
し（γレセプター）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレ
セプターを含み、これにはこれらのレセプターの対立遺伝子多型および選択的スプライス
型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）および
ＦｃγＲＩＩＢ（「抑制レセプター」）を含むが、これらのレセプターは主としてこれら
の細胞質ドメインにおいて異なる、同様のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであ
るＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｉ
ｍｍｕｎｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
ｍｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ））を含む。抑制レセプターであるＦｃγＲＩｌＢは、細胞質ド
メインにおいて、免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ））を
含む（レビュー参照、各々は本明細書に参照として引用される：Ｄａｒｏｎ、 Ａｎｎｕ
Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １５、 ２０３－２３４ （１９９７）；ＦｃＲｓは以下
で概説される。Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、９、４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈ
ｏｄｓ、４、２５－３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｌａ
ｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ、１２６、３３０－４１（１９９５）、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａ
ｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ ２００６、Ｒａｖｅｔｃｈ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ
Ｆｕｎｄｅｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｅｄ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｐａｕｌ ５
ｔｈ Ｅｄ．）。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲを発現する細胞障害
性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞やマクロファージのような単球細胞）が
標的細胞上に結合している抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、インビト
ロまたはインビボ細胞媒介反応を指す。原則として、活性化ＦｃγＲを有するいかなるエ
フェクター細胞もＡＤＣＣを媒介する誘因となりうる。そのような細胞の一つである、Ｎ
Ｋ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は活性化、局在、または分化に依存
して、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血
細胞上のＦｃＲ発現は、本明細書に参照として引用される、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｂ
ｏｌｌａｎｄ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２００１）において要約される。
「ヒトエフェクター細胞」は、一以上のＦｃＲを発現している白血球であり、エフェク
ター機能を行う。好ましくは、細胞は、例えばＦｃγＲｌＩＩのような活性化Ｆｃレセプ
ターの少なくとも一つの型を発現し、ＡＤＣＣエファクター機能を遂行する。ＡＤＣＣを
媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ
ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、
単球、および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞
は、本明細書で開示されているように、例えば血液またはＰＢＭＣなどのこれらの天然源
から分離しうる。
「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、特にモノクローナル抗体（完全長の
モノクローナル抗体を含む）、ポリクロール抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗
体）、および所望の生物学的活性を示す限り抗体断片にまでわたる。
抗体の「シアル酸含有量」という語は、語が文脈上他の意味を意図していることを明確
に示していない場合には、抗体重鎖のＦｃ領域上のシアル酸残基の総数および未精製抗体
調製物中の非シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）抗体に対するシアル化抗体の比率の双
方を指す。
本発明の目的のために定義されるとき、「抗体断片」は、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）
抗体の抗原結合または可変領域、あるいはＦｃＲ結合能力を保持している抗体のＦｃ領域
を広く含む、インタクト抗体の部分を含む。抗体断片の例としては、線状（ｌｉｎｅａｒ
）抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。抗
体断片は、好ましくはＩｇＧ重鎖の少なくともヒンジの部分、場合によってはＣＨｌ領域
を保持する。より好ましくは、抗体断片は、ＩｇＧ重鎖の全定常領域を保持し、ＩｇＧ軽
鎖を含む。
本明細書で用いられる場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に同質の抗体のポピュ
レーション（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）から得られる抗体、すなわち、ポピュレーションを
含む個々の抗体が、少量で存在しうる、自然に起こりうる変異を除いて一致しているもの
を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的で、単一の抗原部位をターゲットにしてい
る。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向している異なる抗体を通常含む従
来の（ポリクローナル）抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決
定基に対して向けられている。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の実質的に同質なポ
ピュレーションから得られるような抗体の特徴を示し、特定の方法が抗体の製造に必要と
されるように解釈されるものではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクロ
ーナル抗体は、本明細書に参照として引用される、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅ
ｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５－４９７ （１９７５）によって最初に開示された
ハイブリドーマ法によって製造されてもよいし、組み換えＤＮＡ法によって製造されても
よい（例えば、本明細書に参照として引用される、米国特許第４、８１６、５６７号参照
）。モノクローナル抗体は、例えば、各々が本明細書に参照として引用される、Ｃｌａｃ
ｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４－６２８（１９９１）およびＭ
ａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ、２２２、５８１－５９７（１９９１）
において開示されている技術を用いたファージ抗体ライブラリーから分離してもよい。
本発明の他の実施形態において、少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチ
ドは、限定されるものではないが、タンパク質全体などの他のタンパク質断片に融合され
てもよい。当業者は、限定されるものではないが他の免疫グロブリン、特に、それぞれの
Ｆｃ領域を欠く免疫グロブリンなどの種々のタンパク質を、本発明のポリペプチドに融合
しうることを確かに理解するであろう。あるいは、例えば、本明細書に参照として引用さ
れる米国第６、６６０、８４３号において開示されているように、他の生物学的に活性な
タンパク質またはその断片を、本発明のポリペプチドに融合しうる。この実施形態は、そ
のような生物学的に活性なタンパク質またはその断片をＦｃレセプターを発現する細胞へ
運搬することにとりわけ有利である。さらに、例えば、ＧＳＴタグまたは緑色蛍光タンパ
ク質、もしくはＧＦＰのような異なるマーカーを用いてもよい。
重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスまたは
サブクラスに属している抗体中の対応する配列に一致しており、または相同しており、一
方、鎖の残余が他の種由来の抗体または他の抗体クラスまたはサブクラスに属している抗
体中の対応する配列に一致しており、または相同している、「キメラ」抗体（免疫グロブ
リン）および所望の生物学的活性である限り、これらの抗体の断片を、本明細書のモノク
ローナル抗体は明確に含む（各々が本明細書に参照として引用される、米国特許第４、８
１６、５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ、８１、６８５１－６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、６０４－６０８ （１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、４５２－４５４（１９８５）；国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ
８５／００３９２参照）。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配
列を含むキメラ抗体である。大部分、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント
抗体）であり、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能
力を有する、マウス、ラット、ウサギまたはヒト以外の霊長類のような非ヒト種の超可変
領域（ドナー抗体）由来の残基で置換されている。例えば、ヒト免疫グロブリンのＦｖフ
レームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに
、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中に、またはドナー抗体中に存在しない残基を含んで
いてもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに向上させるためになされる。一般的には
、ヒト化抗体は、少なくとも一つの、通常は２つの可変ドメインの実質的に全てを含むが
、そのヒト化抗体において、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブ
リンの超可変ループに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン
配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体は、また、場合によっては、免疫グロブリン定常領域
（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンの一部を含むであろう。さらに詳
細には、各々が本明細書に参照として引用される、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３２１、５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａ
ｔｕｒｅ、３３２、３２３－３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｓｔ
ｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ、２、５９３－５９６（１９９２）；米国特許第５、２２５、５３９
号参照。
少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、重鎖定常領域をコードする
遺伝子を改変するために組み換えＤＮＡ技術を用いることによって特定のアミノ酸置換、
付加または欠失が親配列に導入されているポリペプチドを含む。これらの改変の導入は、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ、（２
００１））のようなマニュアルにおいて開示されているように、分子生物学の確立された
技術に従う。さらに、少なくとも一つのＦｃ領域を有するポリペプチドは、グリコシル化
特異性のために知られているセルラインにおける発現（Ｓｔａｎｌｅｙ Ｐ．、ｅｔ ａ
ｌ．、ＧＩｙｃｏｂＩｏＩｏｇｙ、６、６９５－９（１９９６）；Ｗｅｉｋｅｒｔ Ｓ．
、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、１１１６－１１２
１（１９９９）；Ａｎｄｒｅｓｅｎ ＤＣ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｎ Ｌ．、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、１１７－１２３（２
００２））または特異的レクチン上の濃縮または除去または酵素処理（Ｈｉｒａｂａｙａ
ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ、７７１、６７－８７（２００２）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、６、１－１５（１９９６）
）のいずれかによって得られる、特定の糖質改変を含むために選択されるポリペプチドを
含むであろう。抗体グリコシル化の質および程度は、用いられた細胞種および培養環境に
依存して異なることが本分野において知られている。（例えば、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ
．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、２８５、８３９－８４５（１９９２））は、糖側鎖に結合して
いる抗体中のシアル酸含有量は、抗体が腹水症のとき、または血清フリーもしくは血清を
含む培地中で製造された場合、顕著に異なることを報告している。さらに、Ｋｕｎｋｅｌ
ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ、１６、４６２－４７０（２０００）
は、細胞成長に対して異なるバイオリアクターの使用および培地中に溶解している酸素の
量が糖部分に結合した抗体中のガラクトースおよびシアル酸量に影響を与えることを示し
た。しかしながら、これらの研究は、シアル酸残基の変化するレベルがどのようにインビ
ボにおいて抗体活性に影響を与えるかについては取り上げていなかった。
ホスト発現系
本発明のポリペプチドは、Ｎ－結合型グリコシル化ができるホスト発現系、すなわち、
ホスト細胞において発現させることができる。通常、そのようなホスト発現系としては、
菌の、植物の、脊椎動物または無脊椎動物発現系が挙げられる。一実施形態において、ホ
スト細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＣＨＯ－Ｋｌ；ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ－６１）、Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ細胞株（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ１（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、ＣＯＳ ７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１））のような
哺乳類細胞；マウス細胞（例えばＮＳ／０）、Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ
（ＢＨＫ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６３２またはＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０
）、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３））、また
は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．Ｆｕｒｔｈｅｒのような公的なバンクから入手可能な他の適切な
細胞株である。さらに、鱗翅目細胞株のような昆虫細胞株、例えばＳｆ９、植物細胞株、
菌細胞株、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐのような酵母。当業者には、ヒトＩ
ｇＧのＦｃ領域上で通常見られるように複雑な、二分岐の糖となるためには、ホスト細胞
への修飾がＮ－結合型グリコシル化およびグリカン成熟が確実に起こるために必要とされ
る場合もあることが理解されるであろう（例えばＨａｍｉｌｔｏｎ、ＳＲ、 ｅｔ ａｌ
．Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１３、１４４１（２００６）；Ｌｉ、Ｈ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、２１０（２００６）；Ｗｉｌｄｔ、Ｓ ａｎ
ｄ Ｇｒｅｎｇｒｏｓｓ、ＴＵ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ ３、１１９（２００５）参照）。
治療製剤
少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を有するポリペプチドを含む治療製剤は、所望の精
製度を有する本発明のポリペプチドと、任意に生理学的に許容されるキャリアー、賦形剤
または安定剤とを混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保管のた
めに製造されうる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）参照
）。許容されるキャリアー、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および濃度で患者
に毒性がなく、そして、キャリアー、賦形剤または安定剤としては、リン酸塩、クエン酸
塩および他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化
剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；
塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェニル、ブチルまたはベンジルアルコー
ル；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノ
ール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾールのような）防腐剤
；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グ
ロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン
、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸
；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖質；Ｅ
ＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトー
ルのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク
質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）ま
たはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなノニオン活性剤が挙げられる。
本明細書における製剤は、治療される特定の適応症に対する一以上の活性化合物、好適
には互いに影響を与えない相補的活性を有する化合物を必要に応じて含んでいてもよい。
そのような分子は、所望の目的に効果的な量で、適切に共存する。活性成分は、例えば、
それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マクロカプセルおよびポリ－（メ
チルメタクリレート）マクロカプセルのようなコアセルベーション技術によって、または
界面重合によって製造されたマイクロカプセル中、コロイドドラッグデリバリーシステム
（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノ
カプセル）またはマクロエマルション中に取り込まれていてもよい。かような技術はＲｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）中に開示されている。
好適な実施形態において、インビボ投与用に用いられる製剤は殺菌されている。本発明
の製剤は、例えば、殺菌した濾過膜を通した濾過によって、容易に殺菌することができる
。
徐法性製剤もまた準備されうる。徐法性製剤の適切な例としては、修飾抗体を含む固形
疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、該マトリクスは、例えばフィルム、また
はマイクロカプセルなどの造形物の形態である。徐法性マトリクスの例としては、ポリエ
ステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、または
ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（例えば、米国特許第３、７７３、９１９号
参照）、Ｌ－グルタミン酸およびｙ エチル－Ｌ－グルタミン酸塩のコポリマー、非分解
性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸－グリコール酸コ
ポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）のような
分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が
挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸のようなポリマーは、１００
日を越える分子の放出が可能であるが、ヒドロゲルの中にはより短い期間タンパク質を放
出するものもある。カプセル化された抗体は長時間体内に残存すると、３７℃で湿度に晒
される結果、変性する、または凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変
化する可能性がある。安定化に対する合理的戦略が、関連するメカニズムによって考え出
されうる。例えば、凝集メカニズムがチオール－ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ－Ｓ
結合形成であることが見出されたならば、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶
液から凍結乾燥し、湿度量を制御し、添加物を用い、そして特定のポリマーマトリクスを
開発することによって達成されうる。
少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むシアル化されたポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、未修飾、および／または未精製の抗体と比較してシアル酸の
量が増加するように、さらに精製または改変（修飾）することができる。この目的に到達
するために多数の方法が存在する。ある一つの方法では、例えば、ＩＶＩＧが通常精製さ
れるＩｇＧを含む血漿フラクションのような未精製のポリペプチド源を、シアル酸に結合
することが知られているレクチンを有するカラムに通過させる。ある実施形態では、レク
チンはセウヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓ ｎｉｇｒａ）から分離される。したがっ
て、少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドのシアル化フラクションは、
カラム中に保持されるが、一方、非シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）フラクションは
、通過するであろう。少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドのシアル化
フラクションは、異なるストリンジェンシーな条件のさらなる洗浄によって溶出されうる
。このようにして、通常の含有量と比較してシアル酸含有量が増加している本発明のポリ
ペプチドの調製物を得ることができる。さらに、シアル酸転移酵素および例えば米国特許
第２００６００３０５２１号で開示されているようなシアル酸の供与体を用いた酵素反応
を用いてもよい。
限定されるものではないが、請求されている方法において有用なシアル酸転移酵素の適
切な例はα－（２、３）シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａ
ｓｅ）（ＥＣ ２．４．９９．６）、およびα－（２、６）シアリルトランスフェラーゼ
（ＥＣ ２．４．９９．１）とも称されるＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩである。α－（２、３）
シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ－β－１、３ＧｉｃＮＡｃまたはＧａｌ－β－１
、４ＧＩｃＮＡｃ配糖体のＧａｌへのシアル酸転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎ ｅｔ ａ
ｌ． 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；Ｖａｎ ｄｅｎ
Ｅｉｊｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１
）参照）、糖ペプチド中のアスパラギン結合オリゴ糖のシアル化に関与する。２つの単糖
間のα連関（α－ｌｉｎｋａｇｅ）の形成とともにシアル酸はＧａｌへと連結される。単
糖間の結合（連関）は、ＮｅｕＡｃの２位およびＧａｌの３位間である。この特有の酵素
は、ラット肝から単離することができ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５ （１９８２））；ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２－２２７８７；Ｋ
ｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９
４－１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１－９３８）ＤＮＡ配列が知られ、組み換え発現によるこの
酵素の製造を促進する。
α－（２、６）シアリルトランスフェラーゼの活性により、６－シアル化ガラクトース
を含む６－シアル化オリゴ糖が得られる。「α－（２、６）シアリルトランスフェラーゼ
」の名は、アクセプターの多糖の６番目の原子にシアル酸を付加するシアル酸転移酵素の
ファミリーを指す。ａ－（２、６）シアリルトランスフェラーゼの異なる型は、異なる組
織から単離されうる。例えば、この酵素のある特定の型であるＳＴ６Ｇａｌ ＩＩは、脳
および胎生組織から単離することができる。Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ－Ｒｅｃｃｈｉ ｅｔ
ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０、９５０（２００３）。
さらに、平均的な当業者であれば、シアル化率を変化させるために細胞培養条件をコン
トロールすることができることを理解するであろう。例えば、シアル酸含有量を増加させ
るために、生成率を減少させ、培養される特定のホスト細胞に適切なより低い範囲内で浸
透圧がおおよそ維持される。シアル酸含有量を増加させるためには、約２５０ｍＯｓｍか
ら約４５０ｍＯｓｍの範囲内の浸透圧が適切である。この、および他の適切な細胞培養条
件は、例えば米国特許第６、６５６、４６６号に開示されている。Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、２８５、８３９－８４５（１９９２）において、もし抗体が
腹水症から、あるいは血清フリーまたは血清含有培養培地中で製造される場合、抗体に結
合した糖側鎖中のシアル酸含有量は顕著に異なることが報告されている。さらに、Ｋｕｎ
ｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１６、４６２－４７０ （
２０００）において、細胞成長に対して異なるバイオリアクターの使用および培地中の溶
解酸素量が抗体に結合した糖部分中のガラクトースおよびシアル酸の量に影響を与えるこ
とが示されている。
別の実施形態において、例えば、不死化ヒト胎生期網膜細胞のようなホスト細胞を、Ｃ
ＭＶプロモーターようなプロモーターに操作して結合されている、例えば、α－２、３－
シアリルトランスフェラーゼまたはα－２、６－シアリルトランスフェラーゼのようなシ
アル酸転移酵素をコードする核酸を導入することによって改変してもよい。α－２、３－
シアリルトランスフェラーゼは、ＳＩＡＴ４ＣまたはＳＴＺ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｌ２３７６７）として知られ、例えば、米国特許第２００５
０１８１３５９号において開示されているヒトα－２、３－シアリルトランスフェラーゼ
であってもよい。
シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法によってホスト
細胞に導入されうる。外来の核酸配列を導入する適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎ
ｄ Ｒｕｓｓｅｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ
ｒｅｓｓ、ＮＹ、２０００中にも開示されている。これらの方法としては、限定されるも
のではないが、例えば、マイクロインジェクションまたはエレクトロポーションのような
物理的導入技術；例えば、リン酸カルシウムトランスフェクションのようなトランスフェ
クション；例えば、リポソームを用いた膜融合転写（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ
ｔｒａｎｓｆｅｒ）；および例えば、ＤＮＡまたはレトロウイルスベクターを用いた導入
のようなウイルス導入が挙げられる。
少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、細胞上清から回収してもよ
く、所望であれば、例えば、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーのよう
な一以上の精製段階に付してもよい。適切な精製方法は、当業者にとって明白であろう。
当業者であれば、上述したシアル化方法の異なる組合わせによって、シアル化が非常に
高いレベルであるＩｇＧ Ｆｃ領域を少なくとも一つ含むポリペプチドを製造することが
できることを理解するであろう。例えば、上述したようにシアル酸転移酵素を過剰発現し
たホスト細胞中で、少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチドを発現するこ
とができ、次いで、例えば酵素反応中でこれらのポリペプチドをシアル化し、続いてレク
チンを含むカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって、これ
らのポリペプチドのシアル化フラクションをさらに濃縮することができる。同様に、アフ
ィニティークロマトグラフィーが続く酵素反応を、少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を
含むＩＶＩＧ源に用いてもよい。
少なくとも一つのＩｇＧ Ｆｃ領域を含むポリペプチド上のグリコシル化の程度を調べ
るために、これらのポリペプチドを精製し、還元条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて分析す
ることができる。グリコシル化は、特定のレクチンを用いて単離されたポリペプチドを反
応させることによって決定することができ、または、当業者によって認識されているよう
に、糖型を同定するためにＨＰＬＣ次いで質量分析を用いることができる（Ｗｏｒｍａｌ
ｄ、ＭＲ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ ３６：１３７０（１９９７）。
本発明をより詳細に説明するために、非制限的な実施例を下記に記載する。
実施例１．シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧは、細胞毒性の減少を示す
ＩｇＧの特定の糖型が抗体のエフェクター機能を調節することに関与するかどうかを究
明するために、あるＩｇＧモノクローナル抗体の細胞毒性の媒介における特定のＡｓｎ２
９７に結合した糖質の役割を調べた。Ｎｉｔｎｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕ
ｎｉｔｙ ２３、４１（２００５）中で以前開示されているように、２９３細胞中でＩｇ
Ｇｌ、２ａまたは２ｂスイッチ変異体のいずれかとして発現している６Ａ６ハイブリドー
マ由来の抗血小板抗体を、これらの具体的な糖質組成および構造を決定するために質量分
析によって分析した（図１）。これらの抗体は、最小限のシアル酸残基を含む。セイヨウ
ニワトコレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるシアル酸含有種の濃縮は、シ
アル酸含有量で６０～８０倍濃度が高い抗体を産生した（図２Ｂおよび図３）。シアル化
された、および非シアル化６Ａ６－ＩｇＧｌおよび２ｂ抗体の血小板クリアランスを媒介
する能力を比較すると、シアル化とインビボ活性との間で逆相関を示した。６Ａ６ Ｉｇ
Ｇ抗体のシアル化により、生物学的活性が４０～８０％低下した（図２Ｃおよび図３）。
活性におけるこの減少のメカニズムを究明するため、マウスＦｃＹＲの各々に対するこ
れらの抗体について関連した抗原に対する表面プラズモン共鳴結合を行った。
表面プラズモン共鳴分析は、Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ３１０、１５１０（２００５）中に記載されているように行った。簡潔に述べ
ると、糖側鎖中のシアル酸残基の高い、または低いレベルを有する６Ａ６抗体変異体を、
ＣＭ５センサーチップの表面上に固定した。水溶性Ｆｃｙ－レセプターを、３０μＩ／分
の流量でＨＢＳ－ＥＰランニングバッファー（１ＯｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中
、室温にてフローセルを通じて異なる濃度で注入した。水溶性Ｆｃ－レセプターを３分間
注入し、７分間結合分子の解離を観察した。コントロールフローセルに対するバックグラ
ウンド結合を自動的に引いた。物質移動の制限を排除するためにコントロール実験を行っ
た。結合および解離段階に対する同時フィッティングならびに一連の全てのカーブに対す
るグローバルフィッティングを用いて、親和定数をセンサーグラムデータから導いた。１
：１ラングミュア結合モデルが観察されたセンサーグラムデータに最も適合し、全ての実
験においてこれを用いた。
各々の活性化ＦｃｙＲに対するこれらの抗体のシアル化型で、非シアル化の対応物と比
較して結合親和性が５～１０倍減少することが観察された一方、抗原に対する結合親和性
においては何ら相違がなかった（図２Ｄ）。したがって、ＩｇＧのＡｓｎ２９７結合グリ
カン構造のシアル化は、サブクラス－限定的活性ＦｃｙＲに対する結合親和性の減少をも
たらし、したがってインビボ細胞毒性の減少をもたらした。
ＩｇＧのＮ－結合型グリカンのシアル化がインビボ免疫活性を調節することに関与して
いるという知見の一般性を明らかにするため、我々は次にＩＶＩＧの抗炎症活性における
Ｎ－結合型グリカンの役割を調べた。５～１０、０００ドナーのプールされた血清から得
られるこの精製ＩｇＧフラクションは、高投与量（１～２ｇ／ｋｇ）で静脈内投与される
とき、広く炎症疾患の処置に対する治療に用いられている。Ｄｗｙｅｒ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．３２６、１０７（１９９２）。この抗炎症活性は、Ｆｃ－フラグメントの特
性であり、ＩＴＰ、ＲＡおよび腎毒性腎炎のネズミモデルにおいて守られる。Ｉｍｂａｃ
ｈ ｅｔ ａ１．、Ｌａｎｃｅｔ １、１２２８（１９８１）、Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１、４８４（２００１）、Ｂｒｕｈｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８、５７３（２００３）、Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３、７８９（２００６）。
エフェクターマクロファージ上の阻害性ＦｃｙＲＩＩＢ分子の表面発現の誘導、それに
よる細胞毒ＩｇＧ抗体、または活性ＦｃｙＲトリガーによるエフェクター細胞反応を誘導
する免疫複合体に必要とされる閾値を高めることを含む、この抗炎症活性の共通のメカニ
ズムが提案された。Ｎｉｒａｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ２４、１９（２００６）。
実施例２ ＩＶＩＧの脱シアル化がマウス関節炎モデルにおけるＩＶＩＧの抗炎症効果
を減少させる
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６およびＮＯＤマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バー
ハーバー、メイン州）から購入した。ＦｃｙＲＩＩＢ－／－マウスは、発明者の研究室で
作製され、Ｃ５７ＢＬ／バックグラウンドへ１２世代戻し交配された。Ｃ５７ＢＬ／６バ
ックグラウンド（Ｋ／Ｂ）のＫＲＮ ＴＣＲトランスジェニックマウスは、Ｄ．Ｍａｔｈ
ｉｓおよびＣ．Ｂｅｎｏｉｓｔ（ハーバードメディカルスクール、ボストン、マサチュー
セッツ州）から贈与され、Ｋ／ＢｘＮマウスを作製するためにＮＯＤマウスに対して交配
させた。８～１０週齢のメスマウスを全ての実験に用い、ロックフェラーユニバーシティ
動物施設で飼育した。全ての実験は連邦法および機関ガイドラインにしたがって行われ、
ロックフェラーユニバーシティ（ニューヨーク、ニューヨーク州）によって認証された。
抗体および水溶性Ｆｃレセプター
６Ａ６抗体スイッチ変異体は、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション、次いでＮ
ｉｍｍｅｒｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３、 ４１ （２００５）
ａｎｄ Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０
、１５１０（２００５）に開示されているようにプロテインＧを用いて精製することによ
って作製した。シアル酸リッチ抗体変異体を、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌ
ｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ）アガロース（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリ
ンゲーム、カリフォルニア州）を用いたレクチンアフィニティークロマトグラフィーによ
ってこれらの抗体調製物から分離した。シアル酸含有量が高いことは、レクチンブロット
によって確認した（下記参照）。静脈注射用ヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、１０％マル
トース中５％、クロマトグラフィー精製）は、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ（Ｈｅｍｄｏｎ、バ
ージニア州）から購入した。Ｋａｎｅｋｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３
、７８９（２００６）に開示されているように、ヒトＩＶＩＧの消化を行った。簡単に述
べると、ＩＶＩＧを３７℃で１時間０．５ｍｇ／ｍｌパパインによって消化し、２．５ｍ
ｇ／ｍｌヨードアセトアミドを添加することによって止めた。ＦａｂおよびＦｃ結果物フ
ラグメントは、ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓ－２００ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ
ｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）上で、非消化ＩＶＩＧから分離し、次
いでプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびプロテインＬカラム（Ｐ
ｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を用いてＦｃおよびＦａｂフラグメントの精
製を行った。フラグメント精製は、抗－ヒトＩｇＧ ＦａｂまたはＦｃ－特異的抗体（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ペンシルバニア
州）を用いて免疫ブロット法によって確認した。精製は９９％より高いと判別された。Ｆ
４／８０抗体はＳｅｒｏｔｅｃ（オックスフォード、イギリス）社製である。Ｌｙ １７
．２抗体は、Ｃａｌｔａｇ（バーリンゲーム、カリフォルニア州）社製である。ヒツジ抗
－糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗血清（腎毒性血清（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃ ｓｅｒｕｍ）
、ＮＴＳ）は、Ｍ．Ｐ．Ｍａｄａｉｏ（ペンシルバニア大学、フィラデルフィア、ペンシ
ルバニア州）から贈与された。Ｃ－末端ヘキサヒスチジンタグを含む水溶性Ｆｃ レセプ
ターは、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製し、製造元（Ｑｉａｇ
ｅｎ社）によって示されているようにＮｉ－ＮＴＡアガロースを用いて細胞培養上清から
精製した。
ＩＶＩＧをノイラミニダーゼで処理し、得られた調製物の組成および構造を質量分析に
よって解析した。ノイラミニダーゼ処理後には、グリカンを含むシアル酸は何ら検出され
なかった（図４Ｄ、Ｆおよび５）。次いで、これらのＩｇＧ調製物に対し、ＩｇＧｌ免疫
複合体が介する炎症性疾患モデルである、ＫｘＮ血清の受動伝達によって誘発される関節
炎からマウスを保護できるかについて試験した。ノイラミニダーゼによる脱シアル化は、
ＫｘＮ血清誘発性関節炎モデルにおいてＩＶＩＧ調製物の保護効果を消滅させた（図４Ｂ
、Ｃ、Ｅ）。この活性の消失は、非シアル化ＩｇＧ（図６Ａ）調製物の血清半減期の減少
の結果またはＩｇＧ（図６Ｂ）の単量体組成もしくは構造的完全性に対する変化の結果で
はなかった。ＰＮＧａｓｅを用いた全てのグリカンの除去は同様の効果を有し、インビボ
でのＩＶＩＧの保護効果を消滅させた（図４Ａ）。２、６シアル酸結合の選択的除去はＩ
ＶＩＧ活性を消滅させた一方、２、３結合の除去は何ら明白な効果を持たなかった（図４
Ｇ、Ｈ）。
実施例３．シアル酸含有量が濃縮されたＩＶＩＧフラクションはマウス関節炎モデルに
おいて炎症を減少させる
シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧの調製物
シアル酸はＩＶＩＧの抗炎症活性に必要とされるようであるから、この抗炎症活性に対
して高投与量要件基準（１ｇ／ｋｇ）は、全ＩｇＧ調製物中のシアル化ＩｇＧの限定濃度
でありうる。シアル酸修飾グリカン構造が濃縮されたＩｇＧ分子を得るために、ＩＶＩＧ
をＳＮＡ－レクチンアフィニティカラム上で分画した。
ＫｘＮ血清転移関節炎モデルにおける保護的効果について、分画されていないＩＶＩＧ
と比較してこれらのシアル酸濃縮フラクションを試験した。分画されていないＩＶＩＧ
１ｇ／ｋｇに対し、ＳＮＡ濃縮ＩＶＩＧでは０．１ｇ／ｋｇで同等の保護が得られたよう
に、１０倍の保護増強がＳＮＡ－結合フラクションについて観察された（図４Ｂ、Ｃ）。
ＳＮＡ濃縮フラクションの血清半減期およびＩｇＧサブクラス分布は、分画されていない
ＩＶＩＧのものと同等であった（図７Ａ、Ｂ）。シアル化の効果は、ＩｇＧに特異的であ
った；同じような２つのアンテナ（ｂｉ－ａｎｔｅｎｎａｒｙ）、複合糖質構造を有する
フェチュインまたはトランスフェリンのようなシアル化Ｎ－結合型グリコプロテインはＩ
ｇＧの同等のモル濃度で統計的に有意な抗炎症活性を何ら有さなかった（図８）。最終的
に、シアル化ＩＶＩＧ調製物の保護機構は、ＦｃｙＲＩＩＢ発現に依存しており、エフェ
クターマクロファージ上にこの阻害性レセプターの発現の増大をもたらすという点で分画
されていないＩＶＩＧと同様である（図９）。
実施例４．シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧの抗炎症反応の増強は、ＦＣドメイン上
のＮ－結合型グリカンのシアル化によって介される
シアル化されうる、軽鎖または重鎖可変領域上のＯおよびＮ結合型グリカンをＩＶＩＧ
中のポリクローナルＩｇＧも含むので、ＳＮＡ－リッチＩｇＧ調製物の抗炎症活性の増加
がＦｃ上のＮ－結合型グリコシル化部位のシアル化が増加した結果であることを我々は確
認した。Ｆｃ－フラグメントは、分画化されていない、およびＳＮＡ分画されたＩＶＩＧ
から作製し、それらのインビボ活性を試験した。インタクトＩｇＧで観察されたように、
分画化されていないＩＶＩＧから作製したＦｃ－フラグメントと比較した場合、ＳＮＡ－
精製Ｆｃ－フラグメントはインビボにおける保護効果を増強した（図４Ｃ）。その一方、
Ｆａｂフラグメントはインビボアッセイにおいて何ら抗炎症活性を示さなかった。したが
って、ＩＶＩＧの抗炎症活性には高投与量が必要であることは、全調製物中に存在するシ
アル化ＩｇＧの寄与がより小さいことに起因している可能性がある。シアル酸結合レクチ
ンクロマトグラフによってこれらのフラクションを濃縮することは、その結果として抗炎
症活性を増加した。
ＩｇＧ抗体の受動免疫法を用いたこれらの結果は、炎症性から抗炎症種へと切り替える
ＩｇＧの能力がＦｃドメイン上のＮ－結合型グリカンのシアル化の程度によって影響され
ることを示した。
実施例５．ＩｇＧのシアル化によって媒介される抗炎症活性の増加は、活性免疫反応の
間に起こる
グッドパスチャー症候群のマウスモデル
このモデルにおいて、マウスを最初にアジュバントを併用したヒツジＩｇＧで感作し、
４日後にヒツジ抗マウス糸球体基底膜調製物を注入した（腎毒性血清、ＮＴＳ）。簡単に
述べると、ＣＦＡ中ヒツジＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）２００μｇをマウスに腹腔内に予め
免疫し、次いで４日後に体重グラムあたりＮＴＳ血清２．５μｌを静脈注射した。血液を
抗ＧＢＭ抗血清注入４日後に未処理コントロールマウスから回収し、血清ＩｇＧをプロテ
インＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、プリンストン、ニュージャージー州）、およびＮ
ＨＳ－活性化セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、プリンストン、ニュー
ジャージー州）上にヒツジＩｇＧを共有カップリングすることによって作製される、セフ
ァロース結合ヒツジＩｇＧカラム、アフィニティークロマトグラフィーで精製した。
予備感作、続いてのＮＴＳ処理は、マウスＩｇＧ２ｂ抗－ヒツジＩｇＧ抗体を誘発する
（ＮＴＮ免疫付与）。Ｋａｎｅｋｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０３：７
８９（２００６）。マウスＩｇＧ２ｂ抗体は、ＮＴＳ抗体とともに糸球体中に蓄積され、
浸潤性マクロファージ上のＦｃｙＲＩＶのＩｇＧ２ｂ媒介活性による急性および劇症炎症
反応をもたらす。予備感作がない場合、炎症は観察されず、これは、マウスＩｇＧ２ｂ抗
－ヒツジＩｇＧ抗体は炎症性反応のメディエーターであることを示す。
炎症をもたらす炎症活性がシアル化の変化と関連するかどうかを明らかにするために、
予備免疫からの血清ＩｇＧおよびＩｇＭならびにＮＴＳ免疫マウスについて、ＳＮＡレク
チン結合によってシアル酸含有量を特性化した（図１ＯＡ、Ｂ、Ｃ）。全ＩｇＧシアル化
は、免疫されていないコントロールと比較して免疫されたマウスにおいて平均で４０％減
少した。効果はＩｇＧに特異的であり；ＩｇＭのシアル化は前免疫および後免疫で同等で
あった。マウス血清からのヒツジ特異的ＩｇＧフラクションを分析すると、前免疫ＩｇＧ
と比較してシアル化が５０～６０％減少したことを示し、このシアル化の相違がより顕著
となった（図１０Ｂ）。
これらの結果は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析によって裏付けられた。単糖組成分析
は、ＵＣＳＤ Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（サンデ
ィエゴ、カリフォルニア州）によって行った。糖タンパク質サンプルを、ＳＤＳおよび２
－メルカプトエタノールで変性し、ＰＮＧａｓｅ Ｆで消化した。放出された混合Ｎ－グ
リカンは逆相ＨＰＬＣおよび固相抽出によって精製し、次いでＮ－グリカンの露出した水
酸基をメチル化した。得られた誘導体化単糖類は逆相ＨＰＬＣで再度精製し、ＭＡＬＤＩ
－ＴＯＦ－ＭＳを行った。
ＩｇＧ前免疫および後免疫の分析によって、Ｎ－グリカン構造における変化が末端シア
ル酸部分に特異的であることが確認された（図１０Ｃ）。ＦｃｙＲＩＶ産生、浸潤性マク
ロファージの関与に関連することが以前示された、糸球体中に沈降したマウスＩｇＧ２ｂ
抗－ヒツジ抗体は、前免疫されたコントロールと比較してシアル酸含有量が減少すること
が示された（図１０Ｄ）。
本明細書で引用される全ての特許および非特許文献は、これらの特許および非特許文献
の各々が全体で参照によって本明細書に組み込まれる範囲で本明細書に組み込まれる。さ
らに、本明細書の発明が例え特定の例や実施形態を参照して説明されているとしても、こ
れらの実施例や実施形態は、本発明の原理および適用を単に説明するにすぎないと理解さ
れるべきである。したがって、次の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精
神および範囲から離れることなく実例の実施形態に対する多数の改変がなされ、また、他
の改変が考え出されうることが理解されるべきである。
図１は、６Ａ６－ＩｇＧ抗体イソタイプの糖質スペクトルを示す。６Ａ６－ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ由来のＮ－グリカンは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＰ ＭＳによって分析した。シアル酸残基を含むピークは、角括弧で示す。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって製造される組み換え６Ａ６抗体スイッチ変異体（ｓｗｉｔｃｈ ｖａｒｉａｎｔ）は、Ａｓｎ－２９７の位置で付加された糖質中、シアル酸残基の最小限のレベルを含んでいた。 図２は、シアル化がＩｇＧ細胞毒性を抑制することを示す。（Ａ）抗体Ｆｃ－フラグメント中のアスパラギン２９７（Ｎ２９７）に付加した、十分に進行した（ｆｕｌｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）糖質部分の構造。コア糖構造は、ボールド体で示されている。末端および分岐糖類のような可変残基に下線が付され、特異的結合が示されている。ＰＮＧａｓｅおよびノイラミニダーゼに対する切断部位も示されている。この十分に進行した構造は、トータル血清ＩｇＧプール（１）の約５％に存在している。略記：ＧＩｃＮＡｃ＝Ｎ－アセチルグルコサミン、ｍａｎ＝マンノース、ｇａｌ＝ガラクトース、ｓａ＝シアル酸。（Ｂ）セイヨウニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ））アフィニティークロマトグラフィーによる、シアル酸含有量が高い６Ａ６－ＩｇＧｌおよびＩｇＧ２ｂ抗体の濃縮。（Ｃ）シアル酸（ＳＡ）を豊富に含む、またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）処理によってシアル酸が欠失した６Ａ６－ＩｇＧｌおよび－ＩｇＧ２ｂ抗体のインビボ活性。各抗体４μｇをマウス群に注射した（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）；＊はｐ＜０．０００１、＊＊はｐ＜０．０１を示す。（Ｄ）高いレベルでシアル化されている、または低いレベルでシアル化されている抗体への結合におけるＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲｌＶに対する結合定数（ＫＡ）；ｎ．ｂ．は、結合なし（ｎｏ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す。太字の数字は、インビボでの抗体活性の媒介に関与するイソタイプ特異的Ｆｃ－レセプターを示す。全ての測定において標準誤差は５％未満であった。 図３は、インビボでの抗体活性がシアル酸により調整されることを示す。６Ａ６－ＩｇＧｌは、ＳＮＡ－アガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーによってシアル酸リッチとなった。このＳＮＡリッチな処理物のフラクションは、ノイラミニダーゼで処理された（ＳＮＡ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ＋ノイラミニダーゼ）。（Ａ）抗体処理物中のシアル酸含有量は、ＳＮＡを用いたレクチンブロットによって算出した。（Ｂ）インビボの抗体活性は、各抗体処理物（グループあたりｎ＝４～５マウス）４μｇを注入することによって誘発される血小板減少をモニタリングすることによって試験した。 図４は、ＩＶＩＧの抗炎症活性がシアル酸を必要とすることを示す。（Ａ）ＰＢＳ、ＩＶＩＧ、およびＰＮＧａｓｅＦ－処理ＩＶＩＧ（ＰＮＧａｓｅＦ ＩＶＩＧ）で処理したマウス中でのＫ／ＢｘＮ血清誘発性関節炎の臨床スコア。（Ｂ）図４（Ａ）で示した処理に加えて、マウスをノイラミニダーゼ－処理ＩＶＩＧ（ＮＡ ＩＶＩＧ）またはＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ（ＳＮＡ ＩＶＩＧ）で処理した。（Ｃ）ＩＶＩＧのＦｃ－フラグメント、ノイラミニダーゼ－処理Ｆｃ（ＮＡ Ｆｃ）、またはＳＮＡ－リッチＦｃ（ＳＮＡ Ｆｃ）で処理したマウスの臨床スコア（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。（Ｄ）ＩＶＩＧ調製物の糖質分析結果。未処理またはノイラミニダーゼ処理ＩＶＩＧ由来のＮ－グリカンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析結果を示す。シアル酸残基を含むピークは、角括弧で示し、ピークの糖質組成を図５に示す。 （Ｅ）ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ（０．１ｇ／ｋｇ）で処理または未処理の、コントロールマウスまたはＫ／Ｎ誘発性関節炎マウスの足関節の代表的なヘマトキシリン／エオシン染色。Ｋ／Ｎ処理マウスで観察される広範な好中球浸潤が、ＩＶＩＧ－ＳＮＡ（０．１ｇ／ｋｇ）処理マウスでは見られない。（Ｆ）ＩＶＩＧのコントロールＦｃフラグメント、ノイラミニダーゼ－処理Ｆｃ（ＮＡ Ｆｃ）およびセイヨウニワトコレクチン（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＳＮＡ）アフィニティークロマトグラフィーを経たシアル酸含有量が高いＦｃ（ＳＮＡ Ｆｃ）のレクチンブロット。（Ｇ）ＩＶＩＧ中の２、３および２、６結合シアル酸残基の分析。ＩＶＩＧは、未処理のまま（レーン２）または２、３結合シアル酸残基に特異的なノイラミニダーゼで処理した（レーン３）または２、３および２、６結合シアル酸残基に特異的なノイラミニダーゼで処理した（レーン４）。シアル酸の除去は、ＳＮＡ（２、６結合シアル酸残基を認識する）およびＭＡＬ－Ｉ（２、３結合シアル酸残基を認識する）を用いたレクチンブロットによって分析した。２、３結合シアル酸残基中の糖タンパク質リッチに対するコントロールとして、ｆｅｔｕｉｎを用いた（レーン１）。クマシー染色ゲルがローディングコントロールとしての役割を果たした（クマシー）。（Ｈ）２、３または２、３および２、６結合シアル酸残基を欠失したＩＶＩＧの抗炎症活性。関節炎を誘発するために、マウスにＫＲＮ血清を注入し、未処理のまま（ＫＲＮ）、あるいは、ＩＶＩＧ（ＫＲＮ＋ＩＶＩＧ）、２、３結合シアル酸残基を欠失したＩＶＩＧ（α２－３ シアリダーゼｔｘ ＩＶＩＧ＋ＫＲＮ）、または２、３および２、６結合シアル酸残基を欠失したＩＶＩＧ（α２－３、６ シアリダーゼｔｘ ＩＶＩＧ＋ＫＲＮ）で処理した。ネガティブコントロールとして、ＰＢＳをマウスに注入した（未処理）。 図５は、Ｎ２９７ ＩｇＧ Ｆｃから放出される糖質部分の構成を示す。抗体重鎖中のアスパラギン残基２９７に連結している核となる糖構造は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）およびマンノース（Ｍａｎ）から構成される。各々の糖型は、１または２の末端ガラクトース（Ｇａｌ）残基の付加、末端シアル酸－（ヒトに対するＮ－ アセチルノイラミン酸またはＮｅｕ５Ａｃおよびマウスに対するＮ－グリコリルノイラミン酸またはＮｅｕ５Ｇｃ）残基の付加、および／または分岐ＧｌｃＮＡｃまたはフコース（Ｆｕｃ）の付加に関して変化する。数字は、異なる糖組成のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって決定される分子量を示す。グリカン構造類の質量は、ヒトまたはマウスに対して示されている（下線）。 図６は、脱シアル化ＩＶＩＧの血清半減期およびタンパク質完全性を示す。（Ａ）ＩＶＩＧ処理マウスの血清中のヒトＩｇＧのレベルを、示した日数でＥＬＩＳＡによって測定した（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。ＩＶＩＧと脱シアル化ＩＶＩＧの半減期には何ら顕著な違いはなかった。有意性は、ＡＮＯＶＡ－テストで繰り返し測定することによって算出した。（Ｂ）ＩＶＩＧまたは脱シアル化ＩＶＩＧの１０μｇを８％ポリアクリルアミドゲルを用いて非還元下、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブリリアントブルー染色で可視化した。ＩＶＩＧの単量体組成および構造完全性は、ノイラミニダーゼ処理によって影響されなかった。 図７は、ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧの血清半減期およびサブクラス組成を示す。（Ａ）ＩＶＩＧ処理マウスの血清中のヒトＩｇＧのレベルを、示した日数でＥＬＩＳＡによって測定した（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。ＩＶＩＧおよびＳＮＡ－リッチＩＶＩＧフラクションの半減期には何ら顕著な違いはなかった。有意性は、ＡＮＯＶＡ－テストで繰り返し測定することによって算出した。（Ｂ）未処理およびＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ中のＩｇＧサブクラスをＥＬＩＳＡによって決定した。何ら相違は観察されなかった。 図８は、同様の糖質構造を有するシアル化タンパク質はＫ／ＢｘＮ血清誘発性関節炎からマウスを防御しないことを示す。ＩＶＩＧまたはシアロタンパク質フェチュイン（ｆｅｔｕｉｎ）およびトランスフェリンの同モル量（キログラムあたり６．７μｍｏｌ）または同量（キログラムあたり１ｇ）をＫ／ＢｘＮ血清注入の１時間前に投与し、臨床スコアを４日目に調べた（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。ＰＢＳを追加のコントロールとして用いた。ＩｇＧと比べて、フェチュインまたはトランスフェリンは、等モル濃度で統計的に有意な抗炎症活性は有しなかった。有意性は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓＵテストで算出した。 図９は、ＳＮＡリッチＩＶＩＧの抗炎症活性がＦｃγＲＩＩＢを必要とすることを示す。（Ａ）非分画ＩＶＩＧ（１ｇ／ｋｇマウス重量）、ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ（０．１ｇ／ｋｇマウス重量）、またはコントロールとしてＰＢＳを、Ｋ／ＢｘＮ 血清注入の１時間前にＦｃγＲＩＩＢ－欠失マウスに注入し、４日目に臨床スコアを調べた（Ｎ＝４、ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。関節炎の臨床スコアに有意な差はなかった。有意性は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓＵテストで算出した。（Ｂ）ＳＮＡ－リッチＩＶＩＧによるインビボＦｃγＲＩＩＢ＋単球蓄積。野生型マウスに１ｇ／ｋｇ、０．１ｇ／ｋｇ ＩＶＩＧあるいは０．１ｇ／ｋｇ ＳＮＡ－リッチまたはコントロールとしてのＰＢＳを注入した。骨髄（左パネル）および脾臓細胞（右パネル）を回収し、注入後１日目にフローサイトメトリーで分析した（Ｎ＝４）。ＩＶＩＧ １ｇ／ｋｇまたはＳＮＡ－リッチＩＶＩＧ ０．１ｇ／ｋｇで処理後、Ｆ４／８０＋ＦｃγＲＩＩＢ＋細胞が顕著に蓄積した。有意性は、スチューデントテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）で算出した。 図１０は、免疫活性がＩｇＧシアル化の減少を引き起こすことを示す。（Ａ）Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ）を用いたブロットにより、シアル酸含有量について、未処理（免疫前）またはヒツジＩｇＧおよび腎毒性血清（ＮＴＳ）を用いた免疫付与によって誘発される腎毒性腎炎（ＮＴＮ）のマウスからの血清ＩｇＧの特性を明らかにした（方法参照）。（Ｂ）濃度測定法（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって決定される、未処理およびＮＴＮマウス中のトータル血清ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体ならびにヒツジＩｇＧ－特異的ＩｇＧ抗体のシアル化のレベルの定量（ｍｅａｎ ＋／－ ＳＥＭ）。マウス抗体調製物には何らヒツジＩｇＧは検出されなかった（データは示さず）。（Ｃ）未処理またはＮＴＮマウスからのＩｇＧ抗体に付加される糖残基のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析。シアル酸含有部分は、角括弧によって示される。個々のピークの詳細な糖質組成は、図５に示す。（Ｄ）完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＣＦＡ））中のヒツジＩｇＧを用いた前免疫あり（ＮＴＳ＋ＣＦＡ）、または前免疫なし（ＮＴＳのみ）の腎毒性血清を注入されたマウスの糸球体中に蓄積される抗体中のシアル酸含有量の検出。

Claims (5)

  1. ＩＶＩＧを含む組成物を提供し；
    前記ＩＶＩＧを含む組成物をα－（２，６）シアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸の供与体で処理して、Ｆｃ領域のＮ－グリカン上にα－（２，６）結合Ｎ－アセチルノイラミン酸を有するＩＶＩＧの組成物中のフラクションを増加させ、処理されたＩＶＩＧをカラムクロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーを含む方法によって精製することによって前記ＩＶＩＧよりも抗炎症活性が増加した修飾ＩＶＩＧを含む組成物を提供すること；
    を含む、修飾ＩＶＩＧの製造方法。
  2. 前記修飾ＩＶＩＧを含む組成物を処理して製剤を製造することをさらに含み、ここで、前記処理は前記修飾ＩＶＩＧを生理学的に許容されるキャリアー、賦形剤または安定剤と混合することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記修飾ＩＶＩＧのシアル酸含有量を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記測定する段階が、アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、および質量分析の１以上を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記修飾ＩＶＩＧの抗炎症活性を測定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
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