JP6964704B2 - 検体中の大腸菌を検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて大腸菌を検出するための方法、試薬、及びキット - Google Patents

Description

本発明は、大腸菌（Escherichia coli）が検体中に存在するか否かを検出するための抗体、並びに斯かる抗体を用いて検体中の大腸菌を検出するための方法、試薬、及びキットに関する。

微生物感染症に罹患した患者の治療に当たっては、感染症の迅速な診断が極めて重要である。微生物感染症の診断手法としては、感染症の原因菌を感染部位や血清・体液等から検出する手法や、原因菌に対する抗体を血液・体液等から検出する手法が挙げられるが、診断の確実性・迅速性の観点からは、原因菌を直接検出する手法が好ましい。

微生物感染症の原因菌の検出手法は、原因菌の分離培養を経て、その生化学的性状を基に菌の同定を行う培養同定法、原因菌特異的遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）法等により増幅して菌の同定を行う遺伝子診断法、及び、原因菌の表面抗原マーカーに対する抗体の特異反応を利用して菌の同定を行う免疫的手法に大別される。しかし、培養同定法及び遺伝子診断法は、検出結果を得るまでに時間がかかり、且つ、検出感度の面でも課題がある場合が多い。よって、短時間で高感度に原因菌を検出できる点で、免疫的手法による診断が汎用されている。

従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体との組み合わせが使われている。

大腸菌（Escherichia coli）は、通性嫌気性菌に属するグラム陰性桿菌で、環境中に存在する主要細菌種の一つである。大腸菌は腸内細菌でもあり、ヒトや動物の消化管内（特にヒト等の場合は大腸内）に生息する。大腸菌の株は種々報告されており、中には腸管内や腸管外（例えば尿路系や血液循環系）で疾病を引き起こす病原性株も存在する。斯かる病原性の大腸菌にはベロ毒素等の毒素を産生する株もあり、重篤な感染症状を引き起こす場合もある。よって、症状の悪化や感染の拡大を防ぐためにも、大腸菌の特異的な迅速診断法が求められている。

大腸菌を検出する手法として、ブレインハートインフュージョン寒天培地、トリプトソーヤ寒天培地、およびＫ３培地を使った培養法（特許文献１：特許第２８７９６９８号公報）や、マルチプレックスＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した検出法（特許文献２：国際公開第２０１５／１９０１０９号）が知られている。しかし、これらの方法は、検査に要する時間が長いという点で、満足のいくものではなかった。

本発明者等は、全ての微生物細胞に存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子として、リボソームタンパク質（Ribosomal protein）Ｌ７／Ｌ１２に着目し、斯かるタンパク質に対する抗体を利用することにより、様々な微生物を各々特異的に、且つ、同一菌種内の種々の血清型を網羅的に検出することが可能な手法を見出した（特許文献３：国際公開第２０００／００６６０３号）。しかし、斯かる既存の抗体は、その検出精度（菌種特異性）や、その検出精度を担保するための大腸菌のリボソームタンパク質（Ribosomal protein）Ｌ７／Ｌ１２への特異的抗体の結合パターンが不明であった事など、改善の余地があった。

特許第２８７９６９８号公報 国際公開第２０１５／１９０１０９号 国際公開第２０００／００６６０３号

本発明は、検出感度及び検出精度（菌種特異性）に優れた大腸菌検出用抗体を提供することを目的とする。

本発明者等は鋭意検討の結果、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基からなるＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）内に、抗原抗体反応性及び特異性に優れたエピトープとなりうる部分アミノ酸配列が存在することを見出した。その上で、斯かる部分アミノ酸配列と抗原抗体反応を生じる複数の抗体を実際に作製し、これらの抗体を用いることにより、検体中の大腸菌を高い感度且つ精度で検出できることを検証し、本発明に到達した。

即ち、本発明の主旨は以下に存する。
［１］大腸菌（Escherichia coli）を検出するための抗体であって、配列番号１に示す大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基からなるＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）内に存在するエピトープと抗原抗体反応を生じる、抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２］前記エピトープが、配列番号１の４〜２２位のアミノ酸残基から選択される１又は２以上のアミノ酸残基を含む、項［１］に記載の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［３］マイコプラズマ（Mycoplasma）属、サルモネラ（Salmonella）属、クラミジア（Chlamydia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ナイセリア（Neisseria）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、ボルデテラ（Bordetella）属、モラクセラ（Moraxella）属、及びレジオネラ（Legionella）属から選択される１以上の属の細菌と交差反応しない、項［１］又は［２］に記載の抗体、もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［４］重鎖可変領域配列として、配列番号５、配列番号９、及び配列番号１３から選択される何れか１つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
軽鎖可変領域配列として、配列番号７、配列番号１１、及び配列番号１５から選択される何れか１つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
をそれぞれ含む、項［１］〜［３］の何れか一項に記載の抗体、もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［５］重鎖可変領域配列として、配列番号５、配列番号９、及び配列番号１３から選択される何れか１つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
軽鎖可変領域配列として、配列番号７、配列番号１１、及び配列番号１５から選択される何れか１つのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
をそれぞれ含む抗体、もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
［６］項［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体をコードする核酸分子。
［７］項［６］に記載の核酸分子を含むベクター又はプラスミド。
［８］項［６］に記載の核酸分子又は項［７］に記載のベクター若しくはプラスミドで形質転換された宿主細胞。
［９］宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選ばれる真核細胞、又は細菌細胞である、項［８］に記載の宿主細胞。
［１０］項［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を発現するハイブリドーマ。
［１１］検体中の大腸菌の有無を検出するための方法であって、項［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を検体と接触させ、抗原抗体反応の有無を検出することを含む方法。
［１２］検体中の大腸菌の有無を検出するための試薬であって、項［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を含む、試薬。
［１３］検体中の大腸菌の有無を検出するためのキットであって、項［１］〜［５］のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体と、前記抗体を用いて検体中の大腸菌の有無を検出するための指示を含む指示書とを含む、キット。

本発明の抗体によれば、検体中の大腸菌を高い感度且つ精度で検出することが可能である。

図１は、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造を模式的に示す図である。 図２は、肺炎マイコプラズマのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造を模式的に示す図である。 図３は、インフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造を模式的に示す図である。 図４は、大腸菌、肺炎マイコプラズマ、及びインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）部分の立体構造をそれぞれ模式的に示す図である。 図５は、大腸菌、肺炎マイコプラズマ、及びインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）部分のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 図６Ａは、モノクローナル抗体４４Ｂ３と大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２との相互作用のＮＭＲによる解析結果を模式的に示す図である。 図６Ｂは、モノクローナル抗体１４５Ｂ２と大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２との相互作用のＮＭＲによる解析結果を模式的に示す図である。 図６Ｃは、モノクローナル抗体６２Ｃ１と大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２との相互作用のＮＭＲによる解析結果を模式的に示す図である。

以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

なお、本明細書において引用される特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、その全体が援用により、あらゆる目的において本明細書に組み込まれる。

また、本明細書に記載のアミノ酸配列を表す式では、別途記載のある場合を除き、アミノ酸を１文字コードで表すものとする。

１．大腸菌を検出するための抗体：
本発明の第１の態様は、大腸菌を検出するための抗体（以下適宜「本発明の抗体」と称する。）に関する。

（１）緒言：
本発明において「大腸菌」（Escherichia coli）は、通性嫌気性菌に属するグラム陰性桿菌を意味する。大腸菌は、環境中に存在する主要細菌種の一つであると共に、腸内細菌でもあり、ヒトや動物の消化管内（特にヒト等の場合は大腸内）に生息する。大腸菌の株は種々報告されており、中には腸管内や腸管外（例えば尿路系や血液循環系）で疾病を引き起こす病原性株も存在する。斯かる病原性の大腸菌にはベロ毒素等の毒素を産生する株もあり、重篤な感染症状を引き起こす場合もある。よって、症状の悪化や感染の拡大を防ぐためにも、大腸菌の特異的な迅速診断法が求められている。

本発明者等は、大腸菌を検出する抗体を作製するに当たり、そのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に着目した。本発明において「リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２」、或いは単に「Ｌ７／Ｌ１２」とは、微生物のタンパク質合成に必須のリボゾームタンパク質の１種であり、種々の細菌が共通して有するタンパク質である。大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２は、１２１個のアミノ酸残基から構成される単量体分子が２コピー連結された二量体構造を有する。各単量体の一次構造のアミノ酸配列を配列番号１に示す。本発明者等の解析結果によると、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の単量体は、１〜４０位のアミノ酸残基で一つの立体構造（ＮＴＤ：N-Terminal Domain）を形成しており、４１〜５３位のアミノ酸残基からなる立体構造を形成していないリンカーを経て、更に５４〜１２１位のアミノ酸残基で別の立体構造（ＣＴＤ：C-Terminal Domain）を形成している。また、斯かる立体構造を有する単量体分子が２コピー、互いのＮＴＤ同士で会合することにより、二量体構造を形成している（後述の実施例１及び図１参照）。

また、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２も同様に、２分子がＮＴＤ（N-Terminal Domain、１〜４０位の残基）で会合して二量体を形成し、ランダムコイル構造のリンカー（４１〜５４位）を経て、更にＣＴＤ（C-Terminal Domain、肺炎マイコプラズマの場合は５５〜１２２位、インフルエンザ菌の場合は５５〜１２３位）を形成していることが分かった（後述の実施例２及び実施例３並びに図２及び図３参照）。

本発明者等は、大腸菌のＬ７／Ｌ１２が有するこうした立体構造の中でも、以下の検討に基づき、免疫原性に優れたエピトープの候補として、特にＮＴＤに着目した。

インフルエンザ菌、肺炎マイコプラズマ、及び大腸菌のＬ７／Ｌ１２のＮＴＤの立体構造を比較すると、表面形状と電荷分布に大きな差があることが分かった（図４）。例えば、インフルエンザ菌（ＨＩ）と大腸菌（ＥＣ）の場合、二量体のＮ末端３残基が構造上部に突出しているが、肺炎マイコプラズマ（ＭＰ）の場合は突出が見られない。また、この突出部は、インフルエンザ菌の場合は１箇所であるが、大腸菌の場合は２箇所である。ＮＴＤの表面電荷を比較すると、肺炎マイコプラズマの場合は、立体構造の中心部を疎水性（白色）〜非電荷親水性領域（薄青、薄赤色）が占めているが、インフルエンザ菌と大腸菌の場合は負電荷（赤色）が占めている。また、インフルエンザ菌の場合は立体構造の右側に負電荷領域（赤色）が、左側に正電荷領域（青色）が位置している。大腸菌の場合は対照的に立体構造の中心部に負電荷（赤色）が集中しており、構造の左右両端は疎水性領域（白色）が優勢である（後述の実施例４及び図４参照）。

さらに、インフルエンザ菌、肺炎マイコプラズマ、及び大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列を比較すると、１〜４０位の残基において菌種間の差異が大きいことも分かった（図５）。例えば、肺炎マイコプラズマの５〜７位の残基は、インフルエンザ菌及び大腸菌の４〜６位の残基に相当し、肺炎マイコプラズマのアミノ酸配列がＤ（アスパラギン酸：親水性、負電荷）、Ｋ（リジン：親水性、正電荷）、Ｎ（アスパラギン：親水性、非電荷）であるのに対し、インフルエンザ菌はＴ（トレオニン：親水性、非電荷）、Ｎ（アスパラギン：親水性、非電荷）、Ｅ（グルタミン酸：親水性、負電荷）、大腸菌はＴ（トレオニン：親水性、非電荷）、Ｋ（リジン：親水性、正電荷）、Ｄ（アスパラギン酸：親水性、負電荷）であり、アミノ酸の種類及び極性の順序が菌種ごとに異なっている。同様に、肺炎マイコプラズマの１４〜１６位の残基は、インフルエンザ菌及び大腸菌の１３〜１５位の残基に相当し、肺炎マイコプラズマのアミノ酸配列はＫ（リジン：親水性、正電荷）、Ｅ（グルタミン酸：親水性、負電荷）、Ｍ（メチオニン：疎水性）であるのに対し、インフルエンザ菌はＡ（アラニン：疎水性）、Ｓ（セリン：親水性、非電荷）、Ｋ（リジン：親水性、正電荷）、大腸菌はＡ（アラニン：疎水性、、Ａ（アラニン：疎水性）、Ｍ（メチオニン：疎水性）であり、アミノ酸の種類及び極性の順序が菌種ごとに異なっている（後述の実施例４及び図５参照）。

以上のように、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２は、ＮＴＤに菌種間差異の大きなアミノ酸配列及び立体構造（表面形状、表面電荷）を有する。こうした知見から、本発明者等は、Ｌ７／Ｌ１２全長ではなく、ＮＴＤを標的とした方が、より特異的な抗体を取得できるとの発想に至った。

そして、ＮＴＤと同様のアミノ酸配列を有するペプチドを発現させ、これに特異的に結合する抗体を作製し、スクリーニングを行うことにより、抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１を取得した（後述の実施例５参照）。その上で、これらの抗体が何れも、大腸菌のＬ７／Ｌ１２のＮＴＤ、特に特定のアミノ酸残基を含んで構成されるエピトープと抗原抗体反応を生じていることを確認した（後述の実施例６及び図６Ａ〜Ｃ参照）。更に、これらの抗体が何れも、優れた検出感度及び検出精度（菌種特異性）を有していることを確認し（後述の実施例７参照）、本発明を完成させた。
以下、より具体的に説明する。

（２）抗体の概要：
本発明において「抗体」とは、特定の抗原又は物質を認識しそれに結合するタンパク質で、免疫グロブリン（Ｉｇ）という場合もある。一般的な抗体は、通常、ジスルフィド結合により相互結合された２つの軽鎖（軽鎖）及び２つの重鎖（重鎖）を有する。軽鎖にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在し、重鎖にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖と呼ばれる５種類が存在する。その重鎖の種類によって、抗体には、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという５種類のアイソタイプが存在する。

重鎖は各々、重鎖定常（ＣＨ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。軽鎖は各々、軽鎖定常（ＣＬ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。軽鎖定常（ＣＬ）領域は単一のドメインから構成される。重鎖定常（ＣＬ）領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域は各々、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い４つの領域（ＦＲ−１、ＦＲ−２、ＦＲ−３、ＦＲ−４）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域（ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２、ＣＤＲ−３）とから構成される。重鎖定常（ＣＨ）領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）及び４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、ＦＲ−Ｈ４）を有し、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｈ３、ＦＲ−Ｈ４の順番で配列される。軽鎖定常（ＣＬ）領域は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）及び４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＦＲ−Ｌ４）を有し、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｌ３、ＦＲ−Ｌ４の順番で配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

本発明の抗体は、大腸菌を検出可能な抗体であって、以下の二つの観点から特定することができる。まず、第一の観点として、本発明の抗体は、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に存在する特定のエピトープを認識して抗原抗体反応を生じるという特徴から規定することができる。また、第二の観点として、本発明の抗体は、その重鎖及び軽鎖の各可変領域が、特定のアミノ酸配列を有するという特徴からも規定することができる。第一の観点については後記［（２）抗体の性質］欄で、第二の観点については後記［（３）抗体の構造］欄で、それぞれ説明する。なお、本発明の抗体は第一の観点又は第二の観点の何れかの特徴を満たしていればよいが、第一の観点及び第二の観点の両方の特徴を満たす抗体も、本発明の抗体に含まれることは言うまでもない。

なお、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。ポリクローナル抗体は、通常は抗原で免疫した動物の血清から調製される抗体で、構造の異なる種々な抗体分子種の混合物である。一方、モノクローナル抗体とは、特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域の組み合わせを含む単一種類の分子からなる抗体をいう。モノクローナル抗体は、抗体産生細胞由来のクローンから産生することも可能であるが、抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を取得し、斯かる核酸分子を用いて遺伝子工学的に作製することも可能である。また、重鎖及び軽鎖、或いはそれらの可変領域やＣＤＲ等の遺伝子情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことも、この分野での当業者にはよく知られた技術である。

また、本発明の抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、軽鎖及び／又は重鎖の定常領域のドメイン構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃ領域を有する抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体又は抗体の断片を抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）等が挙げられる。更には、前記の抗体又はその断片若しくは誘導体が非ヒト動物由来の場合、そのＣＤＲ以外の配列の一部又は全部をヒト抗体の対応配列に置換したキメラ抗体又はヒト化抗体も、本発明の抗体に含まれる。なお、別途明記しない限り、本発明において単に「抗体」という場合、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。

（３）抗体の性質：
本発明の抗体は、第一の観点として、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２内の特定のアミノ酸残基から構成されるエピトープと、抗原抗体反応を生じることを特徴とする。

本発明において「抗原抗体反応」とは、抗体がその抗原の何れかの成分を認識し、これと結合することをいう。

本発明において「エピトープ」とは、抗体が認識する抗原の一部分をいう。

大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２において、本発明の抗体が結合するエピトープは、配列番号１に示す大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列のうち、１〜４０位のアミノ酸残基で形成されるＮＴＤに存在する。実施例５〜実施例７において後述する本発明者等の解析結果によると、本発明者等が実施例において実際に取得した高検出感度・高検出精度（高菌種特異性）の大腸菌検出用抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１は、何れもＬ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基で形成されるＮＴＤに結合するものであることが確認されている。

中でも、本発明の抗体が結合するリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のエピトープは、配列番号１の４〜２２位のアミノ酸残基から選択される１又は２以上、中でも３以上、又は４以上、又は５以上、又は６以上、又は７以上、又は８以上、又は９以上、又は１０以上のアミノ酸残基を含むことが好ましい。特に、本発明の抗体が結合するリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のエピトープは、少なくとも配列番号１の４〜１５位から選択される１又は２以上のアミノ酸残基を含むことがより好ましく、４、５、６、１３、１４、及び１５位から選択される１又は２以上のアミノ酸残基を含むことが更に好ましい。実施例において後述する本発明者等の解析結果によると、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤの立体構造において、これらアミノ酸残基は表面付近に存在することが確認されている。また、これらのアミノ酸残基は、大腸菌のＬ７／Ｌ１２を他の細菌種のＬ７／Ｌ１２と比較した場合に、特に大腸菌の種特異性が高い場所であることからも、これらのアミノ酸残基が本発明の抗体に対するエピトープを形成していることは確実であると考えられる。

また、本発明の抗体は、大腸菌以外の細菌やその他の成分と交差反応を生じないことが好ましい。

具体的には、本発明の抗体は、マイコプラズマ（Mycoplasma）属、サルモネラ（Salmonella）属、クラミジア（Chlamydia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ナイセリア（Neisseria）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、ボルデテラ（Bordetella）属、モラクセラ（Moraxella）属、及びレジオネラ（Legionella）属から選択される１以上の属の細菌と、交差反応を生じないことが好ましい。中でも、本発明の抗体は、２以上の属、更には３以上の属、又は４以上の属、又は５以上の属、又は６以上の属、特に全ての属の細菌と交差反応を生じないことが好ましい。

なお、抗体とエピトープ・抗原や他の成分との抗原抗体反応の測定は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能である。そのような方法としては、酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴法（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動法（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）、発光共鳴エネルギー移動法（luminescence resonance energy transfer：ＬＲＥＴ）等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。

中でも、本発明では特に、抗原（エピトープ）と抗体との相互作用を、核磁気共鳴法（Nuclear Magnetic Resonance：ＮＭＲ）により解析することが好ましい。斯かる手法の詳細については、例えばCavanagh et al., “Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice Protein NMR”, 2nd Edition, Academic Press, 2006や、Vitha et al., “Spectroscopy: Principles and Instrumentation”, Wiley-Blackwell, 2018の記載を参照することができる。具体的な解析条件としては、制限されるものではないが、例えば後述の実施例６で本発明者等が採用した解析条件を参照することができる。

（４）抗体の構造：
第二の観点として、本発明の抗体は、その重鎖及び軽鎖の各可変領域が、特定のアミノ酸配列を有することを特徴とする。

具体的に、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖の各可変領域配列として、以下のアミノ酸配列を有することが好ましい。

重鎖可変領域配列としては、配列番号５、配列番号９、及び配列番号１３から選択される何れか１つのアミノ酸配列と８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。中でも、重鎖可変領域配列としては、配列番号５、配列番号９、及び配列番号１３から選択される何れか１つのアミノ酸配列であることがとりわけ好ましい。

軽鎖可変領域配列として、配列番号７、配列番号１１、及び配列番号１５から選択される何れか１つのアミノ酸配列と８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。中でも、軽鎖可変領域配列としては、配列番号７、配列番号１１、及び配列番号１５から選択される何れか１つのアミノ酸配列であることがとりわけ好ましい。

なお、本発明において、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。

また、ある抗体の重鎖及び軽鎖の各可変配列から、各ＣＤＲの配列を同定する方法としては、例えばKabat法（Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.5, pp.1709-1719）やChothia法（Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948）が挙げられる。これらの方法は本分野の技術常識であるが、例えばDr. Andrew C.R. Martin’s Groupのウェブサイト（http://www.bioinf.org.uk/abs/）等も参照できる。

なお、あるアミノ酸に類似するアミノ酸としては、例えばアミノ酸の極性、荷電性、及びサイズに基づく以下の分類において、同一の群内に属するアミノ酸が挙げられる（何れも各アミノ酸の種類を一文字コードで表示する。）。
・芳香族アミノ酸：Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ；
・脂肪族アミノ酸：Ｉ、Ｌ、Ｖ；
・疎水性アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ；
・荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ等：
・正荷電アミノ酸：Ｈ、Ｋ、Ｒ；
・負荷電アミノ酸：Ｄ、Ｅ；
・極性アミノ酸：Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ；
・小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｖ等：
・超小型アミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ。

また、あるアミノ酸に類似するアミノ酸としては、例えばアミノ酸の側鎖の種類に基づく以下の分類において、同一の群内に属するアミノ酸も挙げられる（何れも各アミノ酸の種類を一文字コードで表示する。）。
・脂肪族側鎖を有するアミノ酸：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
・芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ；
・硫黄含有側鎖を有するアミノ酸：Ｃ、Ｍ；
・脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸：Ｓ、Ｔ；
・塩基性側鎖を有するアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ；
・酸性アミノ酸及びそれらのアミド誘導体：Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ。

（５）抗体の作製方法：
本発明の抗体を作製する方法は、特に制限されないが、例えば以下の手法を挙げることができる。

本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合、検出対象となる大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全部又は一部、好ましくはＮＴＤを構成する配列番号１の１〜４０位のアミノ酸残基（配列番号３のアミノ酸残基）からなるポリペプチド、或いはこれと８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上、とりわけ９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９９％以上、特に１００％の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（これを以下「エピトープポリペプチド」という）を用いて作製することができる。具体的には、エピトープポリペプチドを用意し、必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することで、前記エピトープポリペプチドと抗原抗体反応を生じる抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、得られた抗血清より抗体を精製・分画し、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と抗原抗体反応を生じること、及び、他の特定の成分、例えば前記列記の属の細菌と交差反応を生じないことを指標として、公知の手法により適宜スクリーニングを行うことにより、より特異性に優れた所望の抗体を得ることが可能である。更に、所望の抗体分子を産生する抗体産生細胞を単離し、骨髄腫細胞と細胞融合させて自律増殖能を持ったハイブリドーマを作製することにより、モノクローナル抗体を得ることも可能である。また、動物への感作を必要としない方法として、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域若しくは軽鎖可変（ＶＬ）領域又はそれらの一部を発現するファージライブラリーを用いて、検出対象となる大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報から抗体を作製する技術も利用可能である。

また、上記手順により所望の抗体が得られれば、斯かる抗体の構造、具体的には重鎖定常（ＣＨ）領域、重鎖可変（ＶＨ）領域、軽鎖定常（ＣＬ）領域、及び／又は軽鎖可変（ＶＬ）領域のアミノ酸配列の一部又は全部を、公知のアミノ酸配列解析法を用いて解析することができる。こうして得られた所望の抗体のアミノ酸配列に対し、抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行う手法も、当業者には公知である。更には、所望の抗体のアミノ酸配列の全部又は一部（特に重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の全部又は一部、中でも各ＣＤＲのアミノ酸配列）を利用し、必要に応じて公知の抗体のアミノ酸配列の一部（特に重鎖定常（ＣＨ）領域及び軽鎖定常（ＣＬ）領域、並びに場合により重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の各ＦＲのアミノ酸配列）と組み合わせることにより、同様の抗原特異性を有する蓋然性の高い別の抗体を設計することも可能である。

一方、抗体の一部（ＣＤＲ又は可変領域）又は全部のアミノ酸配列が特定されている場合には、公知の手法により、斯かる所望の抗体のアミノ酸配列の全部又は一部をコードする塩基配列を有する核酸分子を作製し、斯かる核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。更には、斯かる塩基配列から所望の抗体の各構成要素を発現するためのベクターやプラスミド等を作製し、宿主細胞（哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、微生物細胞等）に導入して、当該抗体を産生させることも可能である。また、得られた抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。

なお、以上説明した、本発明の抗体を製造する方法、本発明の抗体をコードする核酸分子、斯かる核酸分子を含むベクター又はプラスミド、斯かる核酸分子やベクター又はプラスミドを含む細胞、更には本発明の抗体を産生するハイブリドーマ等も、本発明の対象となる。

なお、本明細書に記載の抗体の作製・改変等の技法は、何れも当業者には公知であるが、例えばAntibodies; A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2014)等の記載を参照することができる。また、本明細書に記載の分子生物学的技法（例えばアミノ酸配列解析法、核酸分子の設計・作製法、ベクターやプラスミドの設計・作製法等）も、何れも当業者には公知であるが、例えばMolecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Shambrook, J. et al. (1989)等の記載を参照することができる。

２．大腸菌の検出方法・試薬・キット：
本発明の別の態様は、本発明の抗体を用いて、検体中の大腸菌の有無を検出する方法（以下適宜「本発明の検出方法」と呼ぶ）に関する。

本発明の検出方法は、前記の本発明の抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体を、検体と接触させ、抗原抗体反応の有無を検出することを含む。ここで、本発明の抗体は、前述のように大腸菌の特定のエピトープと抗原抗体反応を生じることから、斯かる抗原抗体反応の有無を公知の各種の免疫測定法で検出することで、検体中に大腸菌が存在するか否かを検出することができる。

検体としては、主にヒト又は非ヒト動物由来の生体試料が挙げられる。生体試料の種類は特に制限されないが、例としては血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、尿、唾液、涙液、羊水、腹水等の液体試料や、各種組織の生検試料等の固体試料のホモジネート懸濁液や抽出液、更にはこれらの培養上清などが挙げられる。

なお、本発明の抗体は、前述のように大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に存在する特定のエピトープを認識して抗原抗体反応を生じることから、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を細菌の細胞膜外に露出させることで、検出感度を向上させることができる。従って、本発明の抗体を検体に接触させる前に、検体に対して細菌を溶菌させる処理を施してもよい。斯かる細菌の溶菌処理としては、限定されるものではないが、界面活性剤や溶菌酵素等を用いた溶菌処理が挙げられる。溶菌処理に使用可能な界面活性剤としては、例えばTriton X-100、Tween 20、Briji 35、Nonidet P-40、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、オクチル−β−Ｄ−グルコシド等の非イオン性界面活性剤；Zwittergent 3-12、ＣＨＡＰＳ（３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート）等の両イオン性界面活性剤；ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）等の陰イオン性界面活性剤等が挙げられる。溶菌処理に使用可能な溶菌酵素としては、例えばリゾチーム、リゾスタフィン、ペプシン、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アクロモペプチダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等が挙げられる。

本発明の抗体を検体と接触させる手法や、抗原抗体反応を検出するための免疫測定法は、限定されない。免疫測定法の例としては、限定されるものではないが、抗体を担持させたマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着）法；抗体を担持させたラテックス粒子（例えばポリスチレンラテックス粒子等）を用いるラテックス粒子凝集測定法；抗体を担持させたメンブレン等を用いるイムノクロマト法；着色粒子又は発色能を有する粒子、酵素若しくは蛍光体等で標識した検出用抗体と、磁気微粒子等の固相担体に固定化した捕捉用抗体とを用いるサンドイッチアッセイ法等、種々の公知の免疫測定法が挙げられる。なお、サンドイッチアッセイ法等の検出用抗体及び捕捉用抗体を併用する免疫測定法の場合、本発明の抗体は捕捉用抗体として用いてもよく、検出用抗体として用いてもよい。

本発明の検出方法によれば、検体中の大腸菌の有無を迅速且つ簡便に検出することが可能となる。

なお、本発明の検出方法に使用するべく、本発明の抗体を含む試薬や、本発明の抗体を用いて検体中の大腸菌の有無を検出するための指示を含む指示書と共に含むキットも、本発明の対象となる。斯かる試薬の溶媒やその他の成分、また、斯かるキットの指示書における操作や用途の指示、更には斯かるキットに含まれるその他の構成要素は、大腸菌の検出に使用される具体的な免疫測定法の種類に応じて適宜決定すればよい。中でも、検体中の大腸菌の有無を簡易に検出可能なキットの具体例としては、ラテラルフロー方式のキットと、フロースルー方式のキットとを挙げることができる。ここで、ラテラルフロー方式とは、捕捉用抗体を表面に固定化させた検出領域を含むメンブレンに対し、検出対象試料及び検出用抗体を順に滴下して平行に展開させ、メンブレンの検出領域に捕捉された目的物質を検出する方法である。一方、フロースルー方式とは、捕捉用抗体を表面に固定化させたメンブレンに、検出対象試料及び検出用抗体を順に滴下して垂直に通過させ、メンブレンの表面に捕捉された目的物質を検出する方法である。本発明の検出方法は、ラテラルフロー方式のキットとフロースルー方式のキットの何れに対しても適用することが可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

［実施例１］大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造解析
＜１：大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の取得＞
大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２遺伝子（配列番号２）をクローニングしたｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミド（GE Healthcare社製）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株（Promega社製）に導入した。

得られた大腸菌株を、Ｍ９培地（４７．７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、２２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０μＭ ＺｎＳＯ_４、１００μＭ ＣａＣｌ_２、４．１μＭ ビオチン、７．２μＭ 塩化コリン、２．３μＭ 葉酸、８．２μＭ ニコチンアミド、４．６μＭ パントテン酸カルシウム、６μＭ 塩酸ピリドキサール、０．３μＭ リボフラビン、１６．６μＭ 塩酸チアミン、２７ｍＭ アンピシリンナトリウム、１８．７ｍＭ ^１５Ｎ−ＮＨ_４Ｃｌ、１１．１ｍＭ ^１３Ｃ−グルコース）で、３７℃でＯＤ_６００が０．６に達するまで培養し、氷水で急冷した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加え、１６℃で３６時間培養した後、７０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、大腸菌を回収した。

得られた大腸菌１ｇにつき、BugBuster（Merck Millipore社製）を５ｍＬ、ベンゾナーゼ^{（登録商標）}エンドヌクレアーゼ（Merck Millipore社製）を５μＬ添加し、室温で３０分間振盪し、大腸菌を完全に溶解した。０．４５μｍフィルターで濾過した後、Profiniaタンパク質精製システム（Bio-Rad社製）を用いて、グルタチオン−セファロースカラムでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製した。得られたタンパク質溶液１５ｍＬに１．５ｍＬの１０倍濃度ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及びPrescissionプロテアーゼ（GE Healthcare社製）を加え、室温で２時間振盪した。反応液をグルタチオン−セファロースカラムに再度通し、素通り画分をリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２として取得した。

取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８を外液として透析し、４倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で希釈し、イオン交換カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に２ｍＬ／分の流速で流した。続いて、１Ｍ ＮａＣｌを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を０〜５０％まで直線的に増加するように２ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を溶出した。

得られたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を移動相として、ゲル濾過カラムHiLoad 16/60 Superdex 75pg（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に１ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を取得した。取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をプロテインアッセイキットＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、型番５０００００１ＪＡ）を用いて１ｍＭになるように遠心濃縮した後、ＮＭＲ測定に供した。

＜２：ＮＭＲによる大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造解析＞
Shigemi ＮＭＲ試料管に、１ｍＭ リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を２５０μＬ、重水を２０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ ＤＳＳ（４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸）を１μＬ入れ、アスピレーターで脱気後、ＮＭＲ装置に設置した。

AVANCE III HD 600MHz ＮＭＲ装置（Bruker社製）で、ＨＮＣＯ（積算回数４、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮＣＡ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮＣＡＣＢ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡ（積算回数３２、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）１２８×１２８×１０２４）のパルスシーケンスを用いて各ＦＩＤを、Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ８００ＭＨｚ ＮＭＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）５１２×２０４８）、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）８６８×２０４８）、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｒｏｍａｔｉｃ（積算回数３２、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）２０４×２０４８）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（積算回数４、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）９６×２５６×２０４８）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）１２８×１２８×２０４８）、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×２５６×２０４８）、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）９６×２５６×２０４８）、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×２５６×２０４８）のパルスシーケンスを用いて各ＦＩＤを得た。得られた各ＦＩＤをＮＭＲ Ｐｉｐｅソフトを用いてフーリエ変換し、各スペクトルを取得した。

取得した各スペクトルをＳｐａｒｋｙソフト上で帰属した。まず、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の主鎖−ＮＨ−をＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡの各スペクトルを用いて、［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣスペクトル上に帰属した。次に、側鎖−ＣＨ−、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_３−をＣ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃの各スペクトルを用いて、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｌｉｐｈａｔｉｃスペクトルと［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｒｏｍａｔｉｃスペクトル上に帰属した。最後に、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃの各スペクトルを用いて、５Ａ以内の距離にある^１Ｈを検出、帰属した。帰属方法の詳細は、PROTEIN NMR SPECTROSCOPY PRINCIPLES AND PRACTICE SECOND EDITION, 2007, Cavanagh, J., Fairbrother, W.J., Palmer, III, A.G., Rance, M., and Skelton, N.J., Elsevier Academic Press.に従った。

帰属した原子座標と^１Ｈ間距離情報をＣＹＡＮＡ立体構造自動計算ソフトに入力して、２０回の立体構造計算を経て充分にエネルギー値を収束させ、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２立体構造の空間原子座標を得た。

取得した空間原子座標をＰｙｍｏｌソフトに入力し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造を描画した（図１）。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の主鎖の立体構造を表示すると、１〜４０位のアミノ酸残基で一つの立体構造（ＮＴＤ：N-Terminal Domain）を形成しており、およそ１３個のアミノ酸残基からなる、立体構造を形成していないリンカーを経て、更に５４〜１２１位のアミノ酸残基で別の立体構造（ＣＴＤ：C-Terminal Domain）を形成していることが分かった（図１）。また、斯かる立体構造を有するリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２分子が２つ、互いのＮＴＤ同士で会合し、二量体を形成していることが分かった（図１）。

［実施例２］肺炎マイコプラズマのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造解析
＜１：肺炎マイコプラズマのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の取得＞
肺炎マイコプラズマのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２遺伝子（配列番号１８）をクローニングしたｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミド（GE Healthcare社製）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株（Promega社製）に導入した。

得られた大腸菌株を、Ｍ９培地（４７．７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、２２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０μＭ ＺｎＳＯ_４、１００μＭ ＣａＣｌ_２、４．１μＭ ビオチン、７．２μＭ 塩化コリン、２．３μＭ 葉酸、８．２μＭ ニコチンアミド、４．６μＭ パントテン酸カルシウム、６μＭ 塩酸ピリドキサール、０．３μＭ リボフラビン、１６．６μＭ 塩酸チアミン、２７ｍＭ アンピシリンナトリウム、１８．７ｍＭ ^１５Ｎ−ＮＨ_４Ｃｌ、１１．１ｍＭ ^１３Ｃ−グルコース）で、３７℃でＯＤ_６００が０．６に達するまで培養し、氷水で急冷した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加え、１６℃で３６時間培養した後、７０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、大腸菌を回収した。

得られた大腸菌１ｇにつき、BugBuster（Merck Millipore社製）を５ｍＬ、ベンゾナーゼ^{（登録商標）}エンドヌクレアーゼ（Merck Millipore社製）を５μＬ添加し、室温で３０分間振盪し、大腸菌を完全に溶解した。０．４５μｍフィルターで濾過した後、Profiniaタンパク質精製システム（Bio-Rad社製）を用いて、グルタチオン−セファロースカラムでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製した。得られたタンパク質溶液１５ｍＬに１．５ｍＬの１０倍濃度ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及びPrescissionプロテアーゼ（GE Healthcare社製）を加え、室温で２時間振盪した。反応液をグルタチオン−セファロースカラムに再度通し、素通り画分をリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２として取得した。

取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８を外液として透析し、４倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で希釈し、イオン交換カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に２ｍＬ／分の流速で流した。続いて、１Ｍ ＮａＣｌを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を０〜５０％まで直線的に増加するように２ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を溶出した。

得られたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を移動相として、ゲル濾過カラムHiLoad 16/60 Superdex 75pg（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に１ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を取得した。取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をプロテインアッセイキットＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、型番５０００００１ＪＡ）を用いて１ｍＭになるように遠心濃縮した後、ＮＭＲ測定に供した。

＜２：ＮＭＲによる肺炎マイコプラズマのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造解析＞
Shigemi ＮＭＲ試料管に、１ｍＭ リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を２５０μＬ、重水を２０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ ＤＳＳ（４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸）を１μＬ入れ、アスピレーターで脱気後、ＮＭＲ装置に設置した。

AVANCE III HD 600MHz ＮＭＲ装置（Bruker社製）で、ＨＮＣＯ（積算回数４、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮＣＡ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮＣＡＣＢ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡ（積算回数３２、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）１２８×１２８×１０２４）のパルスシーケンスを用いて各ＦＩＤを、Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ８００ＭＨｚ ＮＭＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）５１２×２０４８）、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）８６８×２０４８）、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｒｏｍａｔｉｃ（積算回数３２、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）２０４×２０４８）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（積算回数４、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）９６×２５６×２０４８）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）１２８×１２８×２０４８）、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×２５６×２０４８）、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）９６×２５６×２０４８）、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×２５６×２０４８）のパルスシーケンスを用いて各ＦＩＤを得た。得られた各ＦＩＤをＮＭＲ Ｐｉｐｅソフトを用いてフーリエ変換し、各スペクトルを取得した。

取得した各スペクトルをＳｐａｒｋｙソフト上で帰属した。まず、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の主鎖−ＮＨ−をＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡの各スペクトルを用いて、［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣスペクトル上に帰属した。次に、側鎖−ＣＨ−、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_３−をＣ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃの各スペクトルを用いて、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｌｉｐｈａｔｉｃスペクトルと［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｒｏｍａｔｉｃスペクトル上に帰属した。最後に、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃの各スペクトルを用いて、５Ａ以内の距離にある^１Ｈを検出、帰属した。帰属方法の詳細は、PROTEIN NMR SPECTROSCOPY PRINCIPLES AND PRACTICE SECOND EDITION, 2007, Cavanagh, J., Fairbrother, W.J., Palmer, III, A.G., Rance, M., and Skelton, N.J., Elsevier Academic Press.に従った。

帰属した原子座標と^１Ｈ間距離情報をＣＹＡＮＡ立体構造自動計算ソフトに入力して、２０回の立体構造計算を経て充分にエネルギー値を収束させ、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２立体構造の空間原子座標を得た。

取得した空間原子座標をＰｙｍｏｌソフトに入力し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造を描画した（図２）。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の主鎖の立体構造を表示すると、１〜４０位のアミノ酸残基で一つの立体構造（ＮＴＤ：N-Terminal Domain）を形成しており、およそ１４個のアミノ酸残基からなる、立体構造を形成していないリンカーを経て、更に５５〜１２２位のアミノ酸残基で別の立体構造（ＣＴＤ：C-Terminal Domain）を形成していることが分かった（図２）。また、斯かる立体構造を有するリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２分子が２つ、互いのＮＴＤ同士で会合し、二量体を形成していることが分かった（図２）。

［実施例３］インフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造解析
＜１：インフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の取得＞
インフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２遺伝子（配列番号２０）をクローニングしたｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミド（GE Healthcare社製）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株（Promega社製）に導入した。

得られた大腸菌株を、Ｍ９培地（４７．７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、２２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０μＭ ＺｎＳＯ_４、１００μＭ ＣａＣｌ_２、４．１μＭ ビオチン、７．２μＭ 塩化コリン、２．３μＭ 葉酸、８．２μＭ ニコチンアミド、４．６μＭ パントテン酸カルシウム、６μＭ 塩酸ピリドキサール、０．３μＭ リボフラビン、１６．６μＭ 塩酸チアミン、２７ｍＭ アンピシリンナトリウム、１８．７ｍＭ ^１５Ｎ−ＮＨ_４Ｃｌ、１１．１ｍＭ ^１３Ｃ−グルコース）で、３７℃でＯＤ_６００が０．６に達するまで培養し、氷水で急冷した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加え、１６℃で３６時間培養した後、７０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、大腸菌を回収した。

得られた大腸菌１ｇにつき、BugBuster（Merck Millipore社製）を５ｍＬ、ベンゾナーゼ^{（登録商標）}エンドヌクレアーゼ（Merck Millipore社製）を５μＬ添加し、室温で３０分間振盪し、大腸菌を完全に溶解した。０．４５μｍフィルターで濾過した後、Profiniaタンパク質精製システム（Bio-Rad社製）を用いて、グルタチオン−セファロースカラムでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製した。得られたタンパク質溶液１５ｍＬに１．５ｍＬの１０倍濃度ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及びPrescissionプロテアーゼ（GE Healthcare社製）を加え、室温で２時間振盪した。反応液をグルタチオン−セファロースカラムに再度通し、素通り画分をリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２として取得した。

取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８を外液として透析し、４倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で希釈し、イオン交換カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に２ｍＬ／分の流速で流した。続いて、１Ｍ ＮａＣｌを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を０〜５０％まで直線的に増加するように２ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を溶出した。

得られたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を移動相として、ゲル濾過カラムHiLoad 16/60 Superdex 75pg（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に１ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を取得した。取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をプロテインアッセイキットＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、型番５０００００１ＪＡ）を用いて１ｍＭになるように遠心濃縮した後、ＮＭＲ測定に供した。

＜２：ＮＭＲによるインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造解析＞
Shigemi ＮＭＲ試料管に、１ｍＭ リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を２５０μＬ、重水を２０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ ＤＳＳ（４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸）を１μＬ入れ、アスピレーターで脱気後、ＮＭＲ装置に設置した。

AVANCE III HD 600MHz ＮＭＲ装置（Bruker社製）で、ＨＮＣＯ（積算回数４、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮＣＡ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮＣＡＣＢ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡ（積算回数３２、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×１２８×１０２４）、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ（積算回数１６、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）１２８×１２８×１０２４）のパルスシーケンスを用いて各ＦＩＤを、Ｕｎｉｔｙ ＩＮＯＶＡ ８００ＭＨｚ ＮＭＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）５１２×２０４８）、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）８６８×２０４８）、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｒｏｍａｔｉｃ（積算回数３２、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）２０４×２０４８）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（積算回数４、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）９６×２５６×２０４８）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃ（積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）１２８×１２８×２０４８）、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×２５６×２０４８）、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）９６×２５６×２０４８）、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃ（ミキシングタイム７５ミリ秒、積算回数８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２×Ｆ３）６４×２５６×２０４８）のパルスシーケンスを用いて各ＦＩＤを得た。得られた各ＦＩＤをＮＭＲ Ｐｉｐｅソフトを用いてフーリエ変換し、各スペクトルを取得した。

取得した各スペクトルをＳｐａｒｋｙソフト上で帰属した。まず、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の主鎖−ＮＨ−をＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＡＣＢ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡの各スペクトルを用いて、［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣスペクトル上に帰属した。次に、側鎖−ＣＨ−、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_３−をＣ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃの各スペクトルを用いて、［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｌｉｐｈａｔｉｃスペクトルと［^１Ｈ−^１３Ｃ］ ＨＳＱＣ ａｒｏｍａｔｉｃスペクトル上に帰属した。最後に、^１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｌｉｐｈａｔｉｃ、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ＮＯＥＳＹ ａｒｏｍａｔｉｃの各スペクトルを用いて、５Ａ以内の距離にある^１Ｈを検出、帰属した。帰属方法の詳細は、PROTEIN NMR SPECTROSCOPY PRINCIPLES AND PRACTICE SECOND EDITION, 2007, Cavanagh, J., Fairbrother, W.J., Palmer, III, A.G., Rance, M., and Skelton, N.J., Elsevier Academic Press.に従った。

帰属した原子座標と^１Ｈ間距離情報をＣＹＡＮＡ立体構造自動計算ソフトに入力して、２０回の立体構造計算を経て充分にエネルギー値を収束させ、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２立体構造の空間原子座標を得た。

取得した空間原子座標をＰｙｍｏｌソフトに入力し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の立体構造を描画した（図３）。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の主鎖の立体構造を表示すると、１〜４０位のアミノ酸残基で一つの立体構造（ＮＴＤ：N-Terminal Domain）を形成しており、およそ１４個のアミノ酸残基からなる、立体構造を形成していないリンカーを経て、更に５５〜１２３位のアミノ酸残基で別の立体構造（ＣＴＤ：C-Terminal Domain）を形成していることが分かった（図３）。また、斯かる立体構造を有するリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２分子が２つ、互いのＮＴＤ同士で会合し、二量体を形成していることが分かった（図３）。

［実施例４］大腸菌、肺炎マイコプラズマ、及びインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤ部分の比較検討
図４は、大腸菌、肺炎マイコプラズマ、及びインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）部分の立体構造をそれぞれ模式的に示す図である。本図から明らかなように、大腸菌、肺炎マイコプラズマ、及びインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤの立体構造を比較すると、表面形状と電荷分布に大きな差がある領域が認められた（図４の点線部）。この領域の表面電荷分布を3菌種で比較すると、肺炎マイコプラズマの場合は、中心部を疎水性（白色）〜非電荷親水性領域（薄青、薄赤色）が占めている。インフルエンザ菌の場合は、ほぼ全領域を負電荷（赤色）が占め、大腸菌の場合は中心部を負電荷領域（赤色）が占めるものの、その周辺部は疎水性（白色）〜非電荷親水性領域（薄青、薄赤色）が位置しており、これら２菌種間で差異が見られた。

図５は、大腸菌、肺炎マイコプラズマ、及びインフルエンザ菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）部分のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。本図から明らかなように、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）部分のアミノ酸配列にも、３菌種で大きな差異が認められた。当該領域は、肺炎マイコプラズマのＬ７／Ｌ１２の５〜２３位のアミノ酸残基であり、インフルエンザ菌及び大腸菌のＬ７／Ｌ１２の４〜２２位のアミノ酸残基に相当する。肺炎マイコプラズマの５〜７位の残基は、インフルエンザ菌及び大腸菌の４〜６位の残基に相当し、肺炎マイコプラズマのアミノ酸配列がＤ（アスパラギン酸：親水性、負電荷）、Ｋ（リジン：親水性、正電荷）、Ｎ（アスパラギン：親水性、非電荷）であるのに対し、インフルエンザ菌はＴ（トレオニン：親水性、非電荷）、Ｎ（アスパラギン：親水性、非電荷）、Ｅ（グルタミン酸：親水性、負電荷）、大腸菌はＴ（トレオニン：親水性、非電荷）、Ｋ（リジン：親水性、正電荷）、Ｄ（アスパラギン酸：親水性、負電荷）であり、アミノ酸の種類及び極性の順序が菌種ごとに異なっている（図５）。また、肺炎マイコプラズマの１４〜１６位の残基は、インフルエンザ菌及び大腸菌の１３〜１５位の残基に相当し、肺炎マイコプラズマのアミノ酸配列はＫ（リジン：親水性、正電荷）、Ｅ（グルタミン酸：親水性、負電荷）、Ｍ（メチオニン：疎水性）であるのに対し、インフルエンザ菌はＡ（アラニン：疎水性）、Ｓ（セリン：親水性、非電荷）、Ｋ（リジン：親水性、正電荷）、大腸菌はＡ（アラニン：疎水性、）、Ａ（アラニン：疎水性）、Ｍ（メチオニン：疎水性）であり、アミノ酸の種類及び極性の順序が菌種ごとに異なっている（図５）。同様に、肺炎マイコプラズマの１９位及び２２位のアミノ酸残基と、これに相当するインフルエンザ菌及び大腸菌の１８位及び２１位のアミノ酸残基との間にも、極性の違いが認められた（図５）。

以上のように、大腸菌のＬ７／Ｌ１２の４〜２２位の立体構造及びアミノ酸残基の極性は、他２菌種と比較して大きく異なることから、抗体との相互作用の中心部位に近いと予測される（図４及び５）。さらに、３菌種間のアミノ酸極性の違いから、大腸菌のＬ７／Ｌ１２のＮＴＤを構成するアミノ酸残基の中でも、好ましくは４〜１５位、より好ましくは４〜６位又は１３〜１５位が、抗体との相互作用の中心であると予測される（図５）。

［実施例５］大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に結合する抗体の取得
以下の手順で、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基により形成されるＮＴＤを単独で発現させ、これを抗原抗体反応により認識するモノクローナル抗体として４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１を取得した。

＜１：大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤを単独で発現する大腸菌の調製＞
ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素切断部位を追加した大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号３）をコードする塩基配列（配列番号４）を含む人工合成遺伝子（GenScript社製）を、前述２種類の制限酵素で切断後、１．５％アガロースゲル中にて電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色を行った。ゲルから約４００ｂｐのバンドを切り取った。このバンドをQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）で精製し、一般的なベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（GE Healthcare社製）に挿入した。

具体的には、ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と、先のＤＮＡ（制限酵素で切断し、ゲルで精製した人工合成遺伝子）とを、そのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen社製）にてベクターに当該ＤＮＡを組み込んだ。前記ＤＮＡを組み込んだベクターｐＧＥＸ６Ｐ−１を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌株（Promega社）に遺伝子学的手法により導入し、ついで５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（シグマ社）を含む半固体状の培養プレートであるＬＢ Ｌ−ブロス寒天（宝酒造株式会社製）に接種した。プレートを３７℃で１２時間インキュベートし、成長したコロニーを無差別に選択し、同じ濃度のアンピシリンを含むＬ−ブロス培養液に接種した。３７℃で８時間振盪培養後、遠心分離にて集菌し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社）を用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。得られたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて切断処理し、約３７０ｂｐのＤＮＡを切断することによって、ＰＣＲ生成物の挿入を確認した。挿入されたＤＮＡの塩基配列を上記クローンを用いて決定した。

具体的に、挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、蛍光シークエンサー（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。シークエンスサンプルの調製は、PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社製）を用いて行った。まず、９．５μＬの制限酵素反応液、４．０μＬのＴ７プロモータープライマー（Gibco BRL社製）（濃度０．８ｐｍｏｌ／μＬ）、及び０．１６μｇ／μＬのテンプレートＤＮＡ（濃度６．５μＬ）を、０．５ｍＬのマイクロチューブに加えて混合した。混合物を２層の１００μＬ鉱油で覆ったのち、２５サイクルのＰＣＲ増幅処理を行った。ここで、１サイクルは、９６℃での３０秒間の処理、５５℃での１５秒間の処理、及び６０℃での４分間の処理からなる。生成物を４℃で５分間保持した。反応終了後、８０μＬの無菌精製水を加え、攪拌した。生成物を遠心分離し、水層をフェノールークロロホルム混合液で３回抽出した。１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２と３００μＬのエタノールを１００μＬの水層に加え、攪拌した。その後１４，０００ｒｐｍ、室温で１５分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μＬの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃で２分間変性した。このものは氷中で冷却してシークエンスに供した。

無差別に選択した５個のクローンのうち２個は、ＰＣＲに用いたプローブと配列上の相同性を有していた。また、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基の遺伝子配列と一致したＤＮＡ配列が明白であった。この遺伝子断片は、明らかに大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基からなるＮＴＤを遺伝子をコードするものである。

＜２：大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤを単独で発現する大腸菌の培養による同ＮＴＤの調製＞
前述で得られた大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基により形成されるＮＴＤを単独で発現する大腸菌を用いて、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基により形成されるＮＴＤに対応するタンパク質（ＮＴＤタンパク質）の調製を行った。

具体的には、同大腸菌株を、Ｍ９培地（４７．７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、２２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０μＭ ＺｎＳＯ_４、１００μＭ ＣａＣｌ_２、４．１μＭ ビオチン、７．２μＭ 塩化コリン、２．３μＭ 葉酸、８．２μＭ ニコチンアミド、４．６μＭ パントテン酸カルシウム、６μＭ 塩酸ピリドキサール、０．３μＭ リボフラビン、１６．６μＭ 塩酸チアミン、２７ｍＭ アンピシリンナトリウム、１８．７ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、１１．１ｍＭ グルコース）で、３７℃でＯＤ_６００が０．６に達するまで培養し、氷水で急冷した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加え、１６℃で３６時間培養した後、７０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、大腸菌を回収した。得られた大腸菌１ｇにつき、BugBuster（Merck Millipore社製）を５ｍＬ、ベンゾナーゼ エンドヌクレアーゼ（Merck Millipore社製）を５μＬ添加し、室温で３０分間振盪し、大腸菌を完全に溶解した。０．４５μｍフィルターで濾過した後、Profiniaタンパク質精製システム（Bio-Rad社製）を用いて、グルタチオン−セファロースカラムでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製した。得られたタンパク質溶液１５ｍＬに１．５ｍＬの１０倍濃度ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及びPrescissionプロテアーゼ（GE Healthcare社製）を加え、室温で２時間振盪した。反応液をグルタチオン−セファロースカラムに再度通し、素通り画分をＮＴＤタンパク質含有画分として取得した。

取得したＮＴＤタンパク質含有画分を、５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８を外液として透析し、４倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で希釈し、イオン交換カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に２ｍＬ／分の流速で流した。続いて、１Ｍ ＮａＣｌを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を０％から５０％まで直線的に増加するように２ｍＬ／分の流速で流し、ＮＴＤタンパク質を溶出した。

得られたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を移動相として、ゲル濾過カラムHiLoad 16/60 Superdex 75pg（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に１ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製し、プロテインアッセイキットＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、型番５０００００１ＪＡ）を用いて濃度定量し、モノクローナル抗体取得用の大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤタンパク質として供した。

＜３：大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤタンパク質を用いたマウスモノクローナル抗体株の取得＞
取得したモノクローナル抗体取得用の大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤタンパク質を用いて、国際公開第２００１／０５７１９９号の実施例３に記載の方法に従って、同ＮＴＤタンパク質に対するモノクローナル抗体株４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１の３株を取得した。

具体的には、前記手順にて得られた大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤタンパク質１００μｇを抗原として、２００μＬのＰＢＳに溶解した後、フロイントのコンプリートアジュバント（Freund's Complete Adjuvant）を２００μＬ加え、混合してエマルジョン化した。得られた抗原エマルジョン２００μＬを、マウスの腹腔内に注射した。また、初回抗原投与から２週間後、４週間後、及び６週間後に、同じ抗原エマルジョンをマウスの腹腔内に注射した。更に、初回抗原投与から１０週間後及び１４週間後に、２倍濃度の抗原エマルジョンをマウスの腹腔内に注射した。最終抗原投与から３日後に、マウスから脾臓を摘出し、無菌的に脾細胞を採取して、以下の手順にて骨髄腫細胞との細胞融合を行った。

骨髄腫細胞としては、ＮＳ−１系の細胞株を用いた。当該細胞株を、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前からは、０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍＬのＭＣ−２１０、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養した後、更に１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養してから用いた。

前記手順により無菌的に採取したマウスの脾細胞１０^８個と、前記培養後の骨髄腫細胞２×１０^７個とを、ガラスチューブ内でよく混合した後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを廃棄してから、細胞を更によく混合した。この混合細胞試料に、３７℃に保持したＲＰＭＩ１６４０培養液５０ｍＬを加え、１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去し、３７℃に保持した５０％ポリエチレングリコール１ｍＬを加え、１分間攪拌した。この細胞混合液に、３７℃に保持したＲＰＭＩ１６４０培養液１０ｍＬを加え、殺菌したピペットで約５分間吸引・排出することにより激しく攪拌した後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、細胞濃度が５×１０^６／ｍＬとなるように３０ｍＬのＨＡＴ培養液を加え、均一になるまで攪拌した。この細胞混合液を０．１ｍＬずつ９６ウェル培養プレートの各ウェルに注ぎ、７％の炭酸ガス雰囲気下、３７℃で培養した。培養開始から第１日、第１週、及び第２週に、ＨＡＴ培地をそれぞれ０．１ｍＬずつ加え、ＥＬＩＳＡ法により所望の抗体を産生する融合細胞のスクリーニングを行った。

ＥＬＩＳＡ法により所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングした。大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤタンパク質に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質を融合し、ＧＳＴフュージョンＬ７／Ｌ１２ＮＴＤタンパク質を作製した。得られたＧＳＴフュージョンＬ７／Ｌ１２ＮＴＤタンパク質及びＧＳＴタンパク質を、０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳに、それぞれ１０μｇ／ｍＬ濃度で溶解した希釈した液を作製した。これらの液を１００μＬずつ、９６穴プレートの各ウェルに別々に分注し、４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μＬを添加し、室温で１時間反応させてブロッキングした。上澄み液を除去し、生成物を洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄した後、融合細胞の培養液１００ｍＬを加え、室温にて２時間反応させた。上澄み液を除去し、沈殿を洗浄液で洗浄した後、ペルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液（濃度５０ｎｇ／ｍＬ）１００μＬを加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した後、ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社製）を１００μＬずつ加え、室温にて２０分間反応させた。着色したところで、各セルに１Ｎ硫酸１００μＬを加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

この結果、ＧＳＴフュージョンＬ７／Ｌ１２ＮＴＤタンパク質のみに反応し、ＧＳＴタンパク質には反応しない陽性ウェルが見出され、これらのウェルにはＬ７／Ｌ１２ＮＴＤタンパク質に対する抗体が含まれていることが判明した。そこで、各陽性ウェル中の細胞を回収し、２４穴プラスティックプレートに入れ、ＨＡＴ培地を加えて培養した後、細胞数が約２０個／ｍＬになるようにＨＴ培地で希釈し、その５０μＬを９６穴培養プレートの各ウェルに入れた。ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０^６個を加えて混合した後、７％ＣＯ_２条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｌ７／Ｌ１２ＮＴＤタンパク質との反応が陽性の細胞を回収した。更に同様の希釈検定及びクローニング操作を繰り返すことにより、Ｌ７／Ｌ１２ＮＴＤタンパク質に対するモノクローナル抗体株４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１を産生する各ハイブリドーマを取得した。

前述のようにして取得した陽性クローンモノクローナル抗体株４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１の３株を用いて、定法にしたがってモノクローナル抗体を生産、回収した。

＜４：得られたマウスモノクローナル抗体株の軽鎖及び重鎖各可変領域のアミノ酸配列の決定＞
取得したモノクローナル抗体株４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１の３株について、定法にしたがって軽鎖及び重鎖各可変領域のアミノ酸配列及び対応する塩基配列を決定した。

モノクローナル抗体株４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１の重鎖及び軽鎖各可変領域のアミノ酸配列及び塩基配列を、それぞれ以下の表１に示す配列番号で示す。

［実施例６］大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と抗体の相互作用解析
実施例５で得られた、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤを認識するモノクローナル抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１について、以下の手順により、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２との相互作用のＮＭＲによる解析を行った。

＜１：大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の取得＞
実施例１で作成した大腸菌株を、Ｍ９培地（４７．７ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、２２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、８．６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、５０μＭ ＺｎＳＯ_４、１００μＭ ＣａＣｌ_２、４．１μＭ ビオチン、７．２μＭ 塩化コリン、２．３μＭ 葉酸、８．２μＭ ニコチンアミド、４．６μＭ パントテン酸カルシウム、６μＭ 塩酸ピリドキサール、０．３μＭ リボフラビン、１６．６μＭ 塩酸チアミン、２７ｍＭ アンピシリンナトリウム、１８．７ｍＭ ^１５Ｎ−ＮＨ_４Ｃｌ、１１．１ｍＭ ^１２Ｃ−グルコース）で、３７℃でＯＤ_６００が０．６に達するまで培養し、氷水で急冷した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を終濃度１ｍＭになるように加え、１６℃で３６時間培養した後、７０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、大腸菌を回収した。得られた大腸菌１ｇにつき、BugBuster（Merck Millipore社製）を５ｍＬ、ベンゾナーゼ エンドヌクレアーゼ（Merck Millipore社製）を５μＬ添加し、室温で３０分間振盪し、大腸菌を完全に溶解した。０．４５μｍフィルターで濾過した後、Profiniaタンパク質精製システム（Bio-Rad社製）を用いて、グルタチオン−セファロースカラムでリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製した。得られたタンパク質溶液１５ｍＬに１．５ｍＬの１０倍濃度ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及びPrescissionプロテアーゼ（GE Healthcare社製）を加え、室温で２時間振盪した。反応液をグルタチオン−セファロースカラムに再度通し、素通り画分をリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２として取得した。

取得したリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．８を外液として透析し、４倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で希釈し、イオン交換カラムＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に２ｍＬ／分の流速で流した。続いて、１Ｍ ＮａＣｌを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を０％から５０％まで直線的に増加するように２ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を溶出した。

得られたリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を移動相として、ゲル濾過カラムHiLoad 16/60 Superdex 75pg（GE Healthcare社製）を接続したＡＫＴＡタンパク質精製システム（GE Healthcare社製）に１ｍＬ／分の流速で流し、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を精製し、プロテインアッセイキットＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製、型番５０００００１ＪＡ）を用いて濃度定量した後、ＮＭＲ測定に供した。

＜２：大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の抗体の前処理＞
実施例５で得られた、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤを認識するモノクローナル抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を外液として透析し、紫外光（波長２８０ｎｍ）の吸光度により濃度定量した後、ＮＭＲ測定に供した。

＜３：ＮＭＲによる大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と抗体の相互作用解析＞
大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を、抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、又は６２Ｃ１とそれぞれ混合した。Ｌ７／Ｌ１２と抗体４４Ｂ３との混合比率は１：２．５（モル比）、抗体１４５Ｂ２との混合比率は１：３（モル比）、抗体６２Ｃ１との混合比率は１：１．３（モル比）とした。各混合物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で２５
０μＬまでメスアップした後、重水を２０μＬ、５ｍｇ／ｍＬ ＤＳＳ（４，４−ジメチ
ル−４−シラペンタン−１−スルホン酸）を１μＬ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）およびＡＥＢＳＦ（フッ化４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニル）を各々終濃度１．８ｍＭになるように添加し、Shigemi ＮＭＲ試料管に移し、アスピレーターで脱気後、ＮＭＲ装置に設置した。

AVANCE III HD 600MHz ＮＭＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ社製）で、［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣ（積算回数１２８、データポイント数（Ｆ１×Ｆ２）５１２×２０４８）のパルスシーケンスを用いてＦＩＤを得た。得られたＦＩＤをＮＭＲ Ｐｉｐｅソフトを用いてフーリエ変換し、スペクトルを取得した。取得したスペクトルに対し、Ｓｐａｒｋｙソフト上で、実施例１の帰属情報を追記した。

ＮＭＲでは、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のように低分子量（１３、０００）であれば、明瞭（ｓｈａｒｐ）な信号として観測可能であるが、抗体のような高分子量（１５０、０００）の場合は、非常に幅広く不明瞭（ｂｒｏａｄ）な信号となるため、強度不足により観測不可能である。また、一般的に抗原抗体反応の結合／解離定数は１μＭ以下であり、結合側に偏った平衡状態にあると考えられている。従って、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２が抗体と相互作用（結合）すると、抗体の影響を受けてリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の信号がｂｒｏａｄ化し、その強度が減衰すると考えられる。そこで、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣスペクトル（アミノ酸１個につき１信号が観測される）上で、抗体の添加により信号強度が減衰する残基を追跡することで相互作用部位を同定しようと試みた。相互作用解析の詳細は、Williamson, M. P., Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding, Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 73(2013):1-16に従った。

リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と、抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、又は６２Ｃ１とをそれぞれ上記比率で混合した場合のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の各アミノ酸残基の［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣ信号強度を、抗体と混合する前のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の各アミノ酸残基の［^１Ｈ−^１５Ｎ］ ＨＳＱＣ信号強度で除算し、その除算値を縦軸に、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列を横軸に示したグラフを作成した（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。ＮＴＤ（１〜４０位の残基）の除算値が概ね０．４以下（抗体と相互作用してリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の信号強度が６０％以上減衰したことを意味する）であったため、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２はＮＴＤ（１〜４０位の残基）で抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、又は６２Ｃ１と相互作用していることが判った（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。

［実施例７］大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に結合する抗体の交差反応性の検討
実施例５で得られた、大腸菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のＮＴＤを認識するモノクローナル抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、及び６２Ｃ１について、以下の手順により、大腸菌以外の細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２との交差反応性のＥＬＩＳＡによる解析を行った。

＜１：交差反応性解析用の各細菌種の組換全長リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の調製＞
以下の方法により交差反応性試験用の組換え全長リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を調製した。まず、交差反応性解析に用いる対象細菌種として、下記表２に示す各菌種のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の人工合成遺伝子（GenScript社製）を含むプラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を作製した。

得られた各菌種のＬ７／Ｌ１２遺伝子を担持するプラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を、大腸菌One Shot Competent Cells（Invitrogen社製）に導入し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（Sigma社製）を含むＬＢ培地（宝酒造社製）の半固型培地のプレートに播種し、３７℃で１２時間程度放置し、生じたコロニーを無作為に選択し、同濃度のアンピシリンを含むLB液体培地２ｍＬに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収した。得られた菌体からQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社）を用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。得られたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて切断処理した。約 ３７０ｂｐのＤＮＡを切断することによって、各細菌種のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２人工合成遺伝子の挿入を確認した。当該プラスミドベクターを導入した大腸菌を、５０ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で１晩培養した後、５００ｍＬのＴＢ培地に入れ、１時間培養した。その後、１００ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を５５０μＬ加えて、更に４時間培養した。回収後、１／１００量のBugBuster（Merck社製）を加えて、室温で２０分間振盪した。その後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、大腸菌を回収した。

前記実施例１と同様の方法により、組換全長リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の採取・精製を行い、各菌種の組換全長リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を得た。

＜２：交差反応性解析用ＥＬＩＳＡの実施＞
前記各菌種の組換えリボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を、それぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化し、前記モノクローナル抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、又は６２Ｃ１の各々を反応させ、洗浄した後、固相化された各菌種のＬ７／Ｌ１２に結合したモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させ、各モノクローナル抗体と各菌種のＬ７／Ｌ１２との交差反応性を評価した。

具体的には、大腸菌及び前記各菌種の組換え全長リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２それぞれ０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬの濃度で含むＰＢＳ溶液各１００μＬを、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Nunc社製Maxsorp ELISA plate）に分注し、４℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μＬを添加し、室温で１時間反応させてプロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で数回洗浄し、抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、又は６２Ｃ１を１μｇ／ｍＬになるように０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで希釈した抗体溶液、又は、約１×ＰＢＳそのもの（陰性コントロール）をそれぞれ１００μＬ添加し、室温にて１時間反応させた。上澄みを除去した後、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体試薬を２次抗体として、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにて最終濃度１μｇ／ｍＬになるように希釈した液を１００μＬずつ添加し、室温にて１時間反応させた。上澄み除去後、さらに洗浄液で数回洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液（KPL社製）を１００μＬずつ加え、室温で１０分間反応させた後、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１００μＬ添加して反応を停止させた。得られた溶液の４５０ｎｍの吸光度を測定し、陰性コントロールの４５０ｎｍの吸光度との差を求めることにより、各モノクローナル抗体と各菌種のＬ７／Ｌ１２との交差反応性を評価した。

結果として得られた、抗体４４Ｂ３、１４５Ｂ２、又は６２Ｃ１と、大腸菌又は他の各菌種の組換え全長リボゾームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２との反応性の評価結果を、下記の表３に示す。下記表中、陽性（＋）は、陰性コントロールに対する吸光度の差が０．５以上のもの、陰性（−）は、陰性コントロールに対する吸光度の差が０．１以下の値のものをそれぞれ示す。

本発明は、検体中の大腸菌の検出が求められる分野、主に医療の分野に幅広く利用でき、その産業上の有用性は極めて高い。

Claims (12)

1. 重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列として以下の何れかを含む抗体又はその抗原結合断片：
   （１）重鎖可変領域配列として配列番号５のアミノ酸配列、及び、軽鎖可変領域配列として配列番号７のアミノ酸配列；
   （２）重鎖可変領域配列として配列番号９のアミノ酸配列、及び、軽鎖可変領域配列として配列番号１１のアミノ酸配列；又は
   （３）重鎖可変領域配列として配列番号１３のアミノ酸配列、及び、軽鎖可変領域配列として配列番号１５のアミノ酸配列。
2. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子。
3. 請求項２に記載の核酸分子を含むベクター又はプラスミド。
4. 請求項２に記載の核酸分子又は請求項３に記載のベクター若しくはプラスミドで形質転換された宿主細胞。
5. 宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選ばれる真核細胞、又は細菌細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
6. 請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を発現するハイブリドーマ。
7. 検体中の大腸菌の有無を検出するための試薬であって、請求項１に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、又はそれらの誘導体を含む、試薬。
8. 検体中の大腸菌の有無を検出するためのキットであって、請求項１に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、又はそれらの誘導体と、前記抗体を用いて検体中の大腸菌の有無を検出するための指示を含む指示書とを含む、キット。
9. 検体中の大腸菌を検出するための抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、配列番号１の大腸菌のＬ７／Ｌ１２の１〜４０位のアミノ酸残基からなるＮＴＤのうち、少なくとも４〜２２位のアミノ酸残基を有するエピトープポリペプチドをヒトを除く動物へ接種せしめ、形成された抗体又はその抗原結合断片を含む血清を当該動物から回収することを含む方法。
10. 前記エピトープポリペプチドが、配列番号１の１〜４０位のアミノ酸残基を有する、請求項９に記載の方法。
11. 前記血清に含まれる抗体又はその抗原結合断片から、マイコプラズマ（Mycoplasma）属、サルモネラ（Salmonella）属、クラミジア（Chlamydia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、ナイセリア（Neisseria）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、ボルデテラ（Bordetella）属、モラクセラ（Moraxella）属、及びレジオネラ（Legionella）属から選択される１以上の属の細菌と交差反応しない抗体又はその抗原結合断片をスクリーニングすることを更に含む、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 検体中の大腸菌の有無を検出するための方法であって、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を、検体と接触させ、抗原抗体反応の有無を検出することを含む方法。

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