JP6822535B2 - 焦点調節装置、顕微鏡装置、焦点調節方法、及び制御プログラム - Google Patents

Description

本発明は、焦点調節装置、顕微鏡装置、焦点調節方法、及び制御プログラムに関する。

観察する試料の内部を観察する場合において、光学顕微鏡における焦点を調節する方法として次のような方法が知られている。特許文献１に記載されている方法においては、システムが試料の界面（例えば容器の底面）を検出し、検出した界面に焦点を合わせる。そして、このシステムは、界面を基準として対物レンズをＺ方向（対物レンズの光軸方向）に一定量（固定距離）だけ移動させて焦点位置を試料の内部にずらす。その後、このシステムは、試料の内部においてＺ方向の所定間隔ごとに多数の画像を取得し、取得した多数の画像の中から最適な焦点位置を決定する。

また、特許文献２に記載されている方法においては、システムが試料の界面（例えばスライドガラス又はカバーガラス）を検出し、検出した界面に焦点を合わせる。そして、このシステムは、ステージと対物レンズの少なくとも一方をＺ方向に一定量だけ移動させる。その後、このシステムは、ステージと対物レンズの少なくとも一方をＺ方向（試料の内部）に移動させるとともに所定の測定時間間隔ごとに試料の撮影を行う。このようにして特許文献２に記載されている方法ではタイムラプス観察が行われる。

米国特許第５４５０２０４号明細書 特許第４８４７６９０号公報

しかし、上記特許文献１，２に記載されている方法においては、システムが試料の界面（例えば容器の底面）の位置に焦点を合わせ、その後に焦点位置を界面の位置から試料の内部に一定量移動させるという２段階の動作が必要となる。従って、上記特許文献１，２に記載されている方法においては、短時間に焦点位置の調節を行うことが困難であった。

本発明の態様では、観察試料の内部を観察する際、より短時間に焦点位置の調節を行うことを目的とする。

本発明の態様によれば、観察対象物の所定の位置に第１の光を集光する第１光学系と、観察対象物を収容する容器の所定の位置に第２の光を集光する第２光学系と、容器で反射した第２の光を検出する検出部と、制御部と、撮像部と、を有し、制御部は、観察対象物の撮像を所定の時間待機した後に実行する手法において所定の時間待機する間に、検出部からの光に基づいて対物レンズとステージとの少なくとも一方を対物レンズの光軸方向に移動させることにより、第１の光の集光位置を容器の所定の位置から第１の距離離れた位置に維持する焦点維持制御を実行し、所定の時間待機した後、ステージと対物レンズとの少なくとも一方を対物レンズの光軸方向に移動させて第１の光の集光位置を複数の位置に移動させ、各位置で撮像部に観察対象物を撮像させて複数の画像を取得し、複数の画像に基づいてステージと対物レンズとの少なくとも一方を対物レンズの光軸方向に移動させて観察対象物を容器の所定の位置から第２の距離離れた位置で撮像部に撮像させる、顕微鏡が提供される。また、本発明の第１態様によれば、観察対象物を収容する容器にある界面の位置を検出する界面検出部と、界面検出部で検出された界面から対物レンズの光軸方向に一定距離の基準位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、撮像部による撮像タイミングにおいて、基準位置を参照し対物レンズと観察対象物との少なくとも一方を光軸方向に移動させることで焦点位置を基準位置から変更する制御部と、を備える焦点調節装置が提供される。

本発明の第２態様によれば、上記の焦点調節装置を備えた顕微鏡装置が提供される。

本発明の第３態様によれば、観察対象物に合焦させる焦点調節方法であって、観察対象物を収容する容器にある界面の位置を検出することと、検出された界面から対物レンズの光軸方向に一定距離の基準位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、撮像部による撮像タイミングにおいて、基準位置を参照し対物レンズと観察対象物との少なくとも一方を光軸方向に移動させることで焦点位置を基準位置から変更することと、を備える焦点調節方法が提供される。

本発明の第４態様によれば、コンピュータに、観察対象物を収容する容器にある界面の位置を界面検出部に検出させる検出処理と、検出処理で検出された界面から対物レンズの光軸方向に一定距離の基準位置に対物レンズの焦点位置を維持する焦点維持制御を実行し、撮像部による撮像タイミングにおいて、基準位置を参照し対物レンズと観察対象物との少なくとも一方を光軸方向に移動させることで焦点位置を基準位置から変更する制御処理と、を実行させる制御プログラムが提供される。

本発明の態様によれば、短時間に焦点位置の調節を行うことができる。

実施形態に係る焦点調節装置を備えた顕微鏡装置の構成を示す図である。 第１実施形態に係る顕微鏡装置の制御系の構成を示すブロック図である。 オフセットレンズを移動したときの反射像の合焦状態を表す図であって、（ａ）はオフセット値０の状態を表す図であり、（ｂ）はオフセットレンズを移動したときの状態を表す図であり、（ｃ）は焦点位置が調節された状態を表す図である。 マイクロプレートのうねりに追従して焦点調節を行う動作を示す図であって、（ａ）は焦点維持制御だけを行った場合を示す図であり、（ｂ）は焦点維持制御と画像ＡＦ制御とを行った場合を示す図である。 第１実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。 第２実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。 第３実施形態に係る顕微鏡装置の制御系の構成を示すブロック図である。 第３実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。 第４実施形態に係る顕微鏡装置の制御系の構成を示すブロック図である。 第４実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。 第５実施形態に係る顕微鏡装置の制御系の構成を示すブロック図である。 第５実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。

以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。また、図面においては、実施形態を説明するため、一部分を大きくまたは強調して記載するなど適宜縮尺を変更して表現する場合がある。

＜第１実施形態＞
図１は、実施形態に係る焦点調節装置を備えた顕微鏡装置１の構成を示す図である。図１において、ＸＹＺ座標系を用いて図中の方向を説明する。このＸＹＺ座標系においては、水平面に平行な平面をＸＹ平面とする。このＸＹ平面において紙面の右方向をＸ方向と表記し、ＸＹ平面においてＸ方向に直交する方向（紙面の表から裏に向かう方向）をＹ方向と表記する。また、ＸＹ平面に垂直な方向（上下方向）をＺ方向と表記する。

図１に示す実施形態に係る顕微鏡装置１は、観察の対象物である試料２（標本又は観察対象物ともいう。）の拡大像を形成して試料２の観察に用いられる光学顕微鏡と、この光学顕微鏡の動作を制御する制御装置とを備えている。光学顕微鏡は、ＸＹステージ１０、結像光学系２０、界面検出部３０、第２光源４０、照明光学系５０、撮像部６０、信号処理部６１、及び駆動部１１，３４，３６を有している。この光学顕微鏡は、試料２の下に対物レンズ２１が配置され、下側から試料２を観察する倒立型顕微鏡である。制御装置は、制御部７１、入力部７２、及び記憶部７３を有している。結像光学系２０は対物レンズ２１と撮像部６０間の光路であるが、照明光学系５０である第２光源４０から対物レンズ２１までの光路の内、ダイクロイックミラー５２から対物レンズ２１までの光路は照明光学系５０と共通の光路となる。

ＸＹステージ１０上には試料２を収容したマイクロプレート（試料容器）３が載置される。マイクロプレート３は透明なプラスチックで成形されている。また、マイクロプレート３は多数の微細な試料保持区画（以下、ウェルと呼ぶ。）を備え、各ウェルに試料２が保持される。試料２は例えば蛍光染色されたＨｅＬａ細胞とされる。使用者（観察者、作業者）は、各ウェル内における様々な濃度の溶液（媒質）中にＨｅＬａ細胞を保持させる。ＨｅＬａ細胞の核はHoechst33452で染色され、アクチン繊維はAlexa Fluor 488 Phalloidinで染色される。なお、図１において、試料２はマイクロプレート３上に浮いているのではくマイクロプレート３に載置されている。本実施形態において、試料２の中心部分（例えば細胞の核の部分）が、使用者が観察したい部分である。この部分のＺ方向の位置の面を試料面２ａ（又は標本面）という。

ＸＹステージ１０には下側（対物レンズ２１側）からの光（つまり、Ｚ方向の光）を試料２に導く開口部１０ａがマイクロプレート３のウェルの位置に対応して形成されている。ＸＹステージ１０は、ステージ駆動部１１による駆動に応じてＸ方向及びＹ方向に移動する。これにより、撮像対象のウェルが対物レンズ２１の対向位置に移動される。ステージ駆動部（第２駆動部）１１は、制御部７１からの制御信号に基づいて、ＸＹステージ１０をＸ方向及びＹ方向に移動させる。

結像光学系２０は、対物レンズ２１及び結像レンズ２２を有している。対物レンズ２１は、ＸＹステージ１０の下側に配置されている。対物レンズ２１の同焦点距離は、対物レンズ２１の胴付き面（対物レンズ２１の取り付け基準面、フランジ面）から対物レンズ２１の焦点位置の面（焦点面）までの距離、すなわち、試料面２ａに焦点が合っているときの対物レンズ２１の胴付き面から試料面２ａまでの距離である。一般に、対物レンズ２１の同焦点距離は一定距離に設計されている。また、対物レンズ２１及び結像レンズ２２は、同一の光路上に配置されている。対物レンズ２１及び結像レンズ２２の光軸が第１光軸Ｏ１である。本実施形態では、第１光軸Ｏ１の方向はＺ方向となっている。なお、以下の説明において、対物レンズ２１のＺ方向の焦点位置を焦点位置Ｆという。図１に示す例では、焦点位置Ｆは試料面２ａの位置に一致している。

本実施例では、界面検出部３０は、試料２を保持するマイクロプレート３の底部（ボトム）の底面３ａの位置を検出する。しかし、「界面」はこれに限定されるものではない。例えば液浸対物レンズを用いた観察の場合、容器とこれに収容される標本が接触している面である底部を界面としてもよい。また乾式対物レンズを用いた観察の場合、容器を載置する顕微鏡のステージと接触する容器の面部を界面としてもよい。更に観察試料を密閉した空間内に収容可能な培養容器を用い、容器の上面部に観察試料が張り付く（ぶら下がった状態）で存在する場合は、容器の上面部を界面とすることでもよい。界面検出部３０は、図１に示すように、第１光源（光源）３１、オフセットレンズ（レンズ）３２とダイクロイックミラー３３とを含むフォーカス光学系３０Ａ、レンズ駆動部３４、及び光電変換器３５を有している。図１示す界面検出部３０及び対物レンズ２１において、点線は、第１光源３１から放出された光の光路、及びマイクロプレート３の底部の底面３ａで反射される光の光路を示している。また、光路上の矢印は光の進行方向を示している。フォーカス光学系３０Ａは、界面検出部３０と対物レンズ２１の間の光路であるが、ダイクロイックミラー３３から対物レンズ２１までの間の光路は、結像光学系２０と照明光学系５０と共通の光路となる。

第１光源３１は、例えば赤外光（又は近赤外光）を照射する赤外線ＬＥＤ（Light Emitting Diode；発光ダイオード）である。フォーカス光学系３０Ａは、第１光源３１が照射した赤外光を対物レンズ２１に導く。フォーカス光学系３０Ａを構成するオフセットレンズ３２は、第２光軸Ｏ２に移動可能に構成され、第２光軸方向Ｏ２に移動することで後述するオフセット値ＯＳを変更するためのレンズである。なお、後述するように、オフセットレンズ３２は例えば凸レンズ３２ａと凹レンズ３２ｂとを備えている（図３参照）。

フォーカス光学系３０Ａを構成するダイクロイックミラー３３は、特定の波長の光（本実施形態では赤外光）を反射し、その他の波長の光（可視光や蛍光）を透過する。このダイクロイックミラー３３は、結像光学系２０の光路上であって対物レンズ２１の像側に配置されている。このダイクロイックミラー３３は、オフセットレンズ３２を通過した第１光源３１から発せられた赤外光を反射して対物レンズ２１に導く。また、このダイクロイックミラー３３は、マイクロプレート３の底部の底面３ａで反射され対物レンズ２１を通過した反射光（赤外光）を反射してオフセットレンズ３２に導く。レンズ駆動部３４は、制御部７１からの制御信号に基づいてオフセットレンズ３２を第２光軸方向Ｏ２に移動させる。光電変換器３５は、フォーカス光学系３０Ａによる反射光の結像位置に設けられている。この光電変換器３５は、例えばマイクロプレート３の底部の底面３ａからの反射光（赤外光）を受光し、受光した光を電気信号に変換するラインＣＣＤセンサ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）である。

ここで、第１光源３１から照射された赤外光が光電変換器３５で受光されるまでの過程を説明する。第１光源３１から照射された赤外光は、オフセットレンズ３２により曲率変化を受けた後、対物レンズ２１の像側に配置されたダイクロイックミラー３３でＺ方向に反射されて対物レンズ２１に導かれる。対物レンズ２１は、赤外光を集光させてマイクロプレート３の底部に照射する。対物レンズ２１による赤外光に基づく光像のＺ方向の結像位置を結像位置Ａという。図１に示す例では、結像位置Ａはマイクロプレート３の底部の底面３ａの位置に一致している。対物レンズ２１から照射された赤外光は、マイクロプレート３の底部の底面３ａで反射される。以下の説明において、底面３ａのことを反射面という。なお、反射面３ａのことを界面又は境界面ともいう。

反射面３ａで反射された反射光（赤外光）は、再び対物レンズ２１を通過し、対物レンズ２１を通過した反射光は、ダイクロイックミラー３３で反射されてオフセットレンズ３２に導かれる。そして、オフセットレンズ３２を通過した反射光は、光電変換器３５の受光面で結像される。そして、光電変換器３５は、受光した光を電気信号に変換し、変換した電気信号に応じた検出信号を制御部７１に出力する。

図１の例では図に示すように、対物レンズ２１と界面検出部３０とは結合されている。ユニット駆動部（第１駆動部）３６は、制御部７１からの制御信号に基づいて、対物レンズ２１及び界面検出部３０をＺ方向に移動させる（つまり、上下移動させる）。なお、図１においては図示していないが、複数個の対物レンズを切り替えるレボルバは、対物レンズ２１と界面検出部３０との結合部分に設けられる。ただし、対物レンズ２１とレボルバと界面検出部３０の位置関係はこれ限定されるものではなく、第１光源３１と光電変換器及びオフセットレンズ３２、レンズ駆動部３４をレボルバとは隔離して配置することも可能である。この場合、ダイクロイックミラー３３へ第１光源３１からの光を導く光学系を設ける必要がある。また、このような配置にすることにより、例えば焦点調節のために対物レンズ２１を保持したレボルバをZ方向に移動させる場合、第１光源３１と光電変換器及びオフセットレンズ３２、レンズ駆動部３４は、レボルバとは別体として配置されるので、レボルバの上下動速度に悪影響を及ぼすことが避けられる。

第２光源４０は、試料２の例えば蛍光観察を行うための励起照明光を照射するＬＥＤである。照明光学系５０は、コリメータレンズ５１及びダイクロイックミラー５２を含んでいる。コリメータレンズ５１は、第２光源４０から照射された照明光を平行光束又は略平行光束に変換する。ダイクロイックミラー５２は、照明光を反射し、蛍光を透過する。このダイクロイックミラー５２は、結像光学系２０の光路上に配置されている。このダイクロイックミラー５２は、コリメータレンズ５１を通過した照明光（平行光束又は略平行光束）の一部を反射して対物レンズ２１に導く。また、このダイクロイックミラー５２は、試料２からの信号光（例えば、照明光により励起された蛍光）を透過して結像レンズ２２に導く。図１示す結像光学系２０及び照明光学系５０において、実線は、第２光源４０から放出された光の光路を示している。

ここで、第２光源４０から照射された照明光が撮像部６０で受光されるまでの過程を説明する。第２光源４０から照射された照明光は、コリメータレンズ５１で平行光束又は略平行光束に変換される。コリメータレンズ５１で平行光束又は略平行光束に変換された照明光は、ダイクロイックミラー５２でＺ方向に反射される。そして、ダイクロイックミラー５２で反射された蛍光は、ダイクロイックミラー３３を透過して対物レンズ２１に導かれる。対物レンズ２１は、照明光を集光させてマイクロプレート３内の試料２に照射する。上述したように、図１においては、対物レンズ２１の焦点位置Ｆは試料面２ａの位置となっている。

試料２からの信号光は再び対物レンズ２１を通過し、対物レンズ２１を通過した信号光はダイクロイックミラー３３を透過する。ダイクロイックミラー３３を透過した信号光の一部はダイクロイックミラー５２を透過して結像レンズ２２に導かれる。結像レンズ２２は、信号光を撮像部６０の受光面（撮像面）に結像させる。

撮像部６０は、ＸＹステージ１０上の試料２の画像を取得する。この撮像部６０は、例えば受光した信号光を電気信号（画素ごとの画像信号）に変換するＣＣＤセンサで構成される。この撮像部６０は、変換した電気信号を信号処理部６１に出力する。信号処理部６１は、撮像部６０から出力された電気信号に対して信号処理を施すことで試料２の像のコントラスト（コントラストの評価値）を表すコントラスト信号を生成する。そして、信号処理部６１は、生成したコントラスト信号を制御部７１に出力する。また、信号処理部６１は、撮像部６０から出力された電気信号に対して信号処理を施すことで画像データを生成する。そして、信号処理部６１は、生成した画像データを制御部７１に出力する。

制御部７１は、顕微鏡装置１の制御全般を司る処理部である。この制御部７１は、記憶部７３に記憶されている制御プログラムに基づいて各種の制御及び処理を実行する。この制御部７１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などの演算装置を備えている。入力部７２は、使用者の操作に応じてオフセット値ＯＳの情報を含む各種情報を入力する。記憶部７３は、試料２の画像データを記憶する。また、記憶部７３は、制御部７１に各種の制御及び処理を実行させるための制御プログラムも記憶する。

図２は、第１実施形態に係る顕微鏡装置１の制御系の構成を示すブロック図である。なお、図２に示す構成において、図１に示した構成と同一構成については同一符号を付して重複する説明を省略する。図２に示すように、制御部７１は、第１制御部７１ａ及び第２制御部７１ｂを有している。

第１制御部７１ａは、ステージ駆動部１１に対して制御信号を出力してステージ駆動部１１を駆動させることにより、撮像対象のウェルが対物レンズ２１の対向位置となるようにＸＹステージ１０をＸＹ方向に移動させる。また、第１制御部７１ａは、ＸＹステージ１０の移動が行われているときに、光電変換器３５からの検出信号に基づいて反射像を検出し、検出した反射像に基づいて反射面３ａの位置を認識する。そして、第１制御部７１ａは、認識した反射面３ａの位置からＺ方向に一定距離（オフセット値ＯＳ）離れた基準位置に焦点位置Ｆを維持する焦点維持制御を実行する。このとき、第１制御部７１ａは、基準位置に焦点位置Ｆを維持するために、レンズ駆動部３４及びユニット駆動部３６に対して制御信号を出力してレンズ駆動部３４は一定位置に保ち、ユニット駆動部３６を駆動させる。

第２制御部７１ｂは、信号処理部６１からの取得した試料の画像のコントラスト信号に基づいて、焦点位置Ｆを試料面２ａの位置に変更する画像ＡＦ制御（ＡＦ；Automatic Focusing）を実行する。すなわち、第２制御部７１ｂは、ＸＹステージ１０の移動が行われていないときに（つまり、撮像部６０による撮像タイミングのときに）、信号処理部６１からのコントラスト信号に基づいて試料面２ａの位置を検出する。具体的には、第２制御部７１ｂは、複数のＺ位置で撮像した試料の画像のコントラスト信号に基づいて、試料２の像のコントラストが最大となるようなＺ方向の位置を試料面２ａの位置として検出する。そして、第２制御部７１ｂは、検出した試料面２ａの位置に焦点位置Ｆを移動させる。このとき、第２制御部７１ｂは、焦点位置Ｆを試料面２ａの位置に移動させるために、ユニット駆動部３６に対して制御信号を出力してユニット駆動部３６を駆動させる。

なお、顕微鏡装置１における焦点調節装置は、ＸＹステージ１０、結像光学系２０（対物レンズ２１、結像レンズ２２）、界面検出部３０、撮像部６０、信号処理部６１、駆動部１１，３４，３６、制御部７１などで構成される。

次に、オフセットレンズ３２の作用について説明する。図３は、オフセットレンズを移動したときの反射像の合焦状態を表す図であって、（ａ）はオフセット値０の状態を表す図であり、（ｂ）はオフセットレンズを移動したときの状態を表す図であり、（ｃ）は焦点位置が調節された状態を表す図である。

なお、図３においては、オフセットレンズ３２の作用の説明に必要な構成についてだけ示している。すなわち、図３においてはダイクロイックミラー３３を省略している。また、図３においては、オフセットレンズ３２は凸レンズ３２ａと凹レンズ３２ｂとで構成されている。また、図１においてはコレクタレンズを示していなかったが、フォーカス光学系３０Ａはコレクタレンズを備え、そのコレクタレンズによって第１光源３１からの赤外光が平行光束又は略平行光束に変換されるものとする。また、図３において、赤外光を点線で示し、照明光及び信号光を実線で示している。

オフセットレンズ３２は、第２光軸Ｏ２方向に移動することにより、対物レンズ２１を介して反射面３ａに照射される赤外光に基づく光像の結像位置ＡをＺ方向に移動させる働きをする。このように、光像の結像位置Ａが移動することにより、反射面３ａで反射される光像の反射像の結像位置も第２光軸Ｏ２方向に移動される。

図３（ａ）では、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが反射面３ａに位置し、かつ、対物レンズ２１の焦点位置Ｆも反射面３ａに位置するように、凹レンズ３２ｂの第２光軸Ｏ２方向の位置と、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）のＺ方向（第１光軸Ｏ１方向）の位置とが調節されている。なお、対物レンズ２１の同焦点距離は一定距離であり、対物レンズ２１の焦点位置も対物レンズ２１の胴付き面から一定距離の位置となっている。この状態がオフセット値ＯＳが０の状態である。

図３（ｂ）では、凹レンズ３２ｂが第２光軸Ｏ２方向の第１光源３１側へ距離ｘだけ移動することにより、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが対物レンズ２１に近づくように反射面３ａの位置からＺ方向に移動する。この状態では、結像位置Ａと、反射面３ａの位置にある焦点位置Ｆとがずれている。

図３（ｃ）では、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）がＺ方向の試料２側へ移動することにより、赤外光に基づく光像の結像位置Ａが反射面３ａの位置に移動し、対物レンズ２１の焦点位置Ｆも同じ距離だけＺ方向に移動する。図３（ｃ）では相対的に試料がＺ方向に移動しているように示してある。この状態では、結像位置Ａが反射面３ａに位置し、かつ、結像位置Ａと焦点位置Ｆとがずれている。結像位置Ａと焦点位置Ｆとのずれ量（結像位置Ａから焦点位置Ｆまでの距離）がオフセット値ＯＳである。

このように、第１制御部７１ａは、オフセットレンズ３２（凹レンズ３２ｂ）を第２光軸Ｏ２方向に移動させることによりオフセット値ＯＳを調節することができる。また、第２制御部７１ｂは、結像位置Ａが反射面３ａの位置となるように対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させることにより、常に反射面３ａから一定距離（一定量）だけＺ方向に離れた位置に対物レンズ２１の焦点位置Ｆを合わせることができる。

次に、本発明の概要について説明する。図４は、マイクロプレート３の底面のうねりに追従して焦点調節を行う動作を示す図であって、（ａ）は焦点維持制御だけを行った場合を示す図であり、（ｂ）は焦点維持制御と画像ＡＦ制御とを行った場合を示す図である。

上述したようにマイクロプレート３はプラスチックで成形されているので、図４（ａ）及び図４（ｂ）に示すように、マイクロプレート３の底面は、例えば１０μｍ〜２００μｍのうねりが生じる。図４（ａ−１）〜（ａ−３）に示すように、第１制御部７１ａが焦点維持制御だけを行った場合は、第１制御部７１ａは反射面３ａ（マイクロプレート３の底面）のうねりに追従して、常に反射面３ａから一定距離だけＺ方向に離れた位置に対物レンズ２１の焦点位置Ｆを維持することができる。

しかし、ウェル内の試料２の位置は常に一定ではない。図４（ａ−２）に示すように、試料２が図４（ａ−１）の位置よりも底面に対して高い位置にある場合や、図４（ａ−３）に示すように、試料２が図４（ａ−１）の位置よりも低い位置（底面に対して近い位置）にある場合もある。この場合は、対物レンズ２１の倍率が低倍で、試料２が反射面３ａの位置に対して比較的一定の位置に存在している場合は、試料２のＺ方向の位置ずれが対物レンズ２１の焦点深度の範囲内におさまっているので、焦点維持制御だけで良好な焦点調節を行うことができる。一方、１０倍以上の対物レンズ２１の場合は、焦点維持制御だけで良好な焦点調節を行うことができない。

そこで、第２制御部７１ｂは、焦点維持制御を行った後に、第１制御部７１ａによる制御を一旦停止してから、画像ＡＦ制御を実行する。図４（ｂ−１）〜（ｂ−３）に示すように、第１制御部７１ａは、反射面３ａのうねりに追従して、常に反射面３ａから一定距離だけＺ方向に離れた位置に対物レンズ２１の焦点位置Ｆを維持する。そして、図４（ｂ−２）及び（ｂ−３）に示すように、第２制御部７１ｂは、反射面３ａから一定距離の位置を基準位置（焦点位置Ｆ）とし、この基準位置からＺ方向の所定範囲において所定間隔ごとにコントラスト信号の取得を開始する。次に、第２制御部７１ｂは、取得したコントラスト信号に基づいて最もコントラスト値が大きい最適な焦点位置Ｆ（新たな焦点位置）を求め、その位置の画像を取得する。このような構成によれば、焦点位置Ｆをウェル内の試料２の位置（試料面２ａ）に正確に合わせることができる。また、画像ＡＦ制御において例えば反射面３aを基準位置とし、この位置から画像AFを実行することなく、新たな焦点位置Ｆから画像AFを実行するので、Ｚ方向にスキャンする範囲は所定範囲に限定されるので、短時間に焦点位置の調節を行うことができる。

なお、顕微鏡装置において様々な実験条件における試料２の画像を取得し、取得した画像を解析する。これにより、試料２の反応の分析が行われる。この場合、一つのマイクロプレート３内のウェルの数は少ないものでは６個程であるが、多いものでは１０００個以上になる。従って、顕微鏡装置は多数の画像を取得する必要がある。また、顕微鏡装置が一つのウェルに対して複数の異なる視野の画像を取得する場合がある。また、顕微鏡装置が同じ視野であっても複数の波長チャネルの画像を取得する場合もある。このため、顕微鏡装置は１回に数万枚の画像を取得しなければならない事態も生じ得る。

このような場合、短時間に画像を取得することが重要となる。特に、細胞等を生きたまま観察する必要がある場合には、撮影中に試料２の状態が変化してしまう。従って、同一の実験条件で画像を取得するためには、すべての画像の取得時間を短縮する必要がある。また、高画質の画像を取得することも重要となる。高画質の画像を取得するためには、適正な焦点位置で試料２の撮像を行う必要がある。

上記特許文献１，２に記載された方法では、システムが反射面３ａの位置を検出し、検出した位置に一旦焦点位置を合わせ、その後、その焦点位置を一定距離だけＺ方向に移動させた後に、画像ＡＦ制御を行う。このような構成の場合、動作の段階数が多くなるとともに、Ｚ方向への移動距離も長くなる。このような操作を例えば１０００個のウェルがあり場合、少なくとも１０００回実施することになる。従って、個々のウェルにおいて短時間に焦点位置の調節を行うことは困難であり、マイクロプレート全体の観察を短時間で行うことも困難である。なお、一般に、焦点位置Ｆを試料面２ａに合わせる動作において時間がかかる要因としては、Ｚ方向への移動時間があげられる。精密なＡＦ動作を行うためには、Ｚ方向の位置制御を精密に行わなければならず、位置制御の精度と移動速度とを両立させることは容易ではないからである。

次に、上記した顕微鏡装置１の動作について説明する。

図５は、第１実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。図５に示す処理において、第１制御部７１ａは、まず、ＸＹステージ１０の位置を初期位置（第１制御部７１ａによるステージ駆動部１１の駆動制御の開始位置）に設定する（ステップＳ１）。具体的には、第１制御部７１ａは、ステージ駆動部１１に制御信号を出力して、ＸＹステージ１０をＸＹ平面内の初期位置に移動させる。

次に、第１制御部７１ａは、入力部７２を介してオフセット値ＯＳを入力する（ステップＳ２）。この処理で入力されるオフセット値ＯＳは、撮像対象の試料２に対して予め定められた規定値とされる。又は、使用者がコントローラなどを操作して手動でオフセットレンズ３２及び対物レンズ２１を移動させながら観察試料を目視で探索し、焦点が合った最適なオフセット値とされる。

次に、第１制御部７１ａは、界面検出部３０をオンにする（ステップＳ３）。第１制御部７１ａが界面検出部３０をオンにしたことにより、界面検出部３０が反射面３ａの位置を検出し、検出した反射面３ａの位置に応じた検出信号を第１制御部７１ａに出力する。第１制御部７１ａは、レンズ駆動部３４に制御信号を出力することで、結像位置Ａと焦点位置Ｆとの差がステップＳ２で入力したオフセット値ＯＳとなるようなオフセットレンズ３２の位置に移動させる（図３（ｂ）参照）。また、第１制御部７１ａは、光電変換器３５からの検出信号に基づいて反射面３ａの位置を認識する。そして、第１制御部７１ａは、認識した反射面３ａの位置に応じた制御信号をユニット駆動部３６に出力することで、光像の結像位置Ａが反射面３ａの位置となるような対物レンズ２１の位置に移動させる（図３（ｃ）参照）。

また、第１制御部７１ａは、ステージ駆動部１１に制御信号を出力して、ＸＹステージ１０をＸＹ平面内で移動させる（ステップＳ４）。具体的には、第１制御部７１ａは、ＸＹステージ１０が初期位置にある場合は、最初に撮像が行われるウェルの位置が初期位置から対物レンズ２１の対向位置に移動するようにＸＹステージ１０をＸＹ平面内で移動させる。また、第１制御部７１ａは、ＸＹステージ１０が初期位置にない場合は、次に撮像が行われるウェルの位置が対物レンズ２１の対向位置に移動するようにＸＹステージ１０をＸＹ平面内で移動させる。

ステップＳ４におけるＸＹステージ１０の移動中（観察位置の移動）は、撮像部６０による撮像が行われていないタイミングに相当する。このとき、界面検出部３０がオンの状態であるので、第１制御部７１ａは、反射面３ａのうねりに追従して、常に反射面３ａから一定距離（オフセット値ＯＳ）Ｚ方向に離れた位置に対物レンズ２１の焦点位置Ｆを維持するように、ユニット駆動部３６の駆動制御を実行する。なお、本実施形態においては、ＸＹステージ１０の移動中はオフセット値ＯＳが変更されないので、第１制御部７１ａはレンズ駆動部３４の駆動制御を実行しない。

そして、第１制御部７１ａは、ステップＳ４によるＸＹステージ１０の移動が終了すると、一旦、界面検出部３０をオフにする（ステップＳ５）。界面検出部３０がオフの状態になると、界面検出部３０は反射面３ａの位置の検出を停止する。界面検出部３０がオフになってから画像の取得が行われるまでのタイミング（すなわちステップＳ６〜Ｓ１１の処理が行われているタイミング）が撮像部６０による撮像タイミングに相当する。

次に、第２制御部７１ｂは、画像ＡＦ制御を開始する。すなわち、第２制御部７１ｂは、ユニット駆動部３６に制御信号を出力して、対物レンズ２１及び界面検出部３０をＺ方向の所定範囲内において所定間隔ごとに移動させる（ステップＳ６）。そして、第２制御部７１ｂは、Ｚ方向の所定間隔の位置ごとに、観察試料を撮像し信号処理部６１によって生成されるコントラスト信号を取得する（ステップＳ７）。そして、第２制御部７１ｂは、所定範囲内のすべての位置のコントラスト信号を取得したか否かを判定する（ステップＳ８）。第２制御部７１ｂは、所定範囲内のすべての位置のコントラスト信号を取得していないと判定した場合は（ステップＳ８のＮＯ）、所定範囲内のすべてのコントラスト信号を取得したと判定するまでステップＳ６及びＳ７の処理を繰り返し実行する。ここで所定範囲内とは、反射面３ａから一定距離（オフセット値ＯＳ）Ｚ方向に離れた位置である対物レンズ２１の焦点位置Ｆを含む、予め定めた範囲であって、観察標品が存在すると仮定した範囲である。したがって、観察したい試料の位置が反射面３ａから一定距離（オフセット値ＯＳ）Ｚ方向に離れた位置に設定されている状態であり、この所定範囲には、反射面３aの位置を含ませる必要はない。

一方、第２制御部７１ｂは、所定範囲内のすべての位置のコントラスト信号を取得したと判定した場合は（ステップＳ８のＹＥＳ）、ステップＳ７で取得したコントラスト信号に基づいて、試料面２ａの位置として最適なＺ方向の位置を算出する（ステップＳ９）。例えば、第２制御部７１ｂは、試料２の像のコントラストが最大となるようなＺ方向の位置を試料面２ａの位置として算出する。そして、第２制御部７１ｂは、ユニット駆動部３６に制御信号を出力することで、焦点位置ＦがステップＳ９で算出した最適なＺ方向の位置（試料面２ａの位置）となるように対物レンズ２１及び界面検出部３０を移動させる（ステップＳ１０）。

第２制御部７１ｂは、焦点位置Ｆが試料面２ａの位置となっている状態で画像を取得する（ステップＳ１１）。例えば、第２制御部７１ｂは、信号処理部６１を介して撮像部６０に撮像を指示する。撮像部６０は、第２制御部７１ｂからの指示に基づいて試料２の撮像を行う。そして、信号処理部６１は、撮像部６０からの画像信号に基づいて画像データを生成し、生成した画像データを第２制御部７１ｂに出力する。なお、第２制御部７１ｂは、取得した画像データを記憶部７３に記憶する。

その後、第２制御部７１ｂは、すべての撮像対象のウェル（すなわち、すべての撮像対象の試料２）の撮像が終了したか否かを判定する（ステップＳ１２）。第２制御部７１ｂがすべての撮像対象のウェルの撮像が終了していないと判定した場合は（ステップＳ１２のＮＯ）、第１制御部７１ａ及び第２制御部７１ｂは、ステップＳ３〜Ｓ１１の処理を繰り返し実行する。一方、第２制御部７１ｂがすべての撮像対象のウェルの撮像を終了したと判定した場合は（ステップＳ１２のＹＥＳ）、処理を終了する。

なお、上記した第１実施形態においては、制御部７１は、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させていたが、制御部７１は、対物レンズ２１とＸＹステージ１０（つまり試料２）との少なくとも一方をＺ方向に移動させる構成であればよい。すなわち、制御部７１は、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよく、またＸＹステージ１０だけをＺ方向に移動させてもよく、また対物レンズ２１及びＸＹステージ１０の両方をＺ方向に移動させてもよい。

以上に説明したように、第１実施形態では、観察対象物２の界面３ａの位置を検出する界面検出部３０と、撮像部６０による撮像が行われていないときに、界面検出部３０で検出された界面３ａから第１光軸Ｏ１方向に一定距離（オフセット値ＯＳ）の基準位置に焦点位置Ｆを維持する焦点維持制御を実行する第１制御部７１ａと、撮像部６０による撮像タイミングにおいて、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させることで焦点位置Ｆを基準位置から観察対象物２の位置２ａに変更する第２制御部７１ｂとを備える。このような構成によれば、第２制御部７１ｂの制御（画像ＡＦ制御）において第１光軸Ｏ１方向にスキャンする範囲は所定範囲（基準位置の近傍の範囲）に限定されるので、短時間に焦点位置の調節を行うことができる。また、焦点位置Ｆを観察対象物２の位置２ａに正確に合わせることができるので、高画質の画像を取得することが可能となる。

一般的には、制御部が画像ＡＦ制御を実行する場合は、最低でもＺ方向に１０μｍ程度の範囲で対物レンズを移動させながら画像を取得しなければならないが、本実施形態における制御部７１は、上記の様に界面３ａから第１光軸Ｏ１方向に一定距離（オフセット値ＯＳ）の基準位置である焦点位置Ｆを中心に所定範囲のスキャンを行うことからプラスマイナス２μｍの移動で適正な焦点位置Ｆを検出することができ、著しく効率が向上した。

また、第１実施形態では、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させる第１駆動部３６を備え、第１制御部７１ａは、第１駆動部３６の駆動制御を実行することにより焦点維持制御を実行し、第２制御部７１ｂは、第１駆動部３６の駆動制御を実行することにより焦点位置Ｆを基準位置から観察対象物２の位置２ａに変更する。このような構成によれば、第１制御部７１ａによる焦点維持制御と第２制御部７１ｂによる焦点位置Ｆの変更制御（画像ＡＦ制御）とを同じ駆動部３６の駆動制御で実現することができる。

また、第１実施形態では、第２制御部７１ｂは、観察対象物２の位置２ａを検出し、検出した観察対象物２の位置２ａに焦点位置Ｆを変更する。このような構成によれば、確実に焦点位置Ｆを観察対象物２の位置２ａに変更することができ、その結果、高画質の画像を確実に取得することができる。

また、第１実施形態では、第２制御部７１ｂは、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方の移動中に撮像部６０で取得された信号に基づいて観察対象物２の位置２ａを検出する。このような構成によれば、観察対象物２の位置２ａの検出の精度が担保される。

また、第１実施形態では、観察対象物２を第１光軸Ｏ１方向に対して垂直平面（ＸＹ平面）内に移動させる第２駆動部１１を備え、第１制御部７１ａは、第２駆動部１１による観察対象物２の移動中に焦点維持制御を実行し、第２制御部７１ｂは、第２駆動部１１による観察対象物２の移動が停止しているときに焦点位置Ｆを基準位置から観察対象物２の位置２ａに変更する。このような構成によれば、観察対象物２の移動に追従させて焦点維持制御を実行することができるとともに、観察対象物２の移動の停止中において確実に観察対象物２の位置２ａを検出し、検出した位置２ａに焦点位置Ｆを移動させることができる。

また、第１実施形態では、第２制御部７１ｂは、界面検出部３０による界面３ａの検出の停止中に対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させる。このような構成によれば、レンズ３２を移動させることなく、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を移動させるだけで焦点位置Ｆを観察対象物２の位置２ａに変更することができる。

また、第１実施形態では、一定距離の値（オフセット値ＯＳ）を入力する入力部７２を備え、第１制御部７１ａは、入力部７２により入力された値に基づいて焦点維持制御を実行する。このような構成によれば、簡易な処理により一定距離の値を設定することができる。

なお、上記した第１実施形態において、第２制御部７１ｂがコントラスト信号を取得する際に（ステップＳ６、Ｓ７参照）、第２光源４０は照明光としてＵＶ光（ultraviolet）を細胞核に照射し、撮像部６０はＵＶ光により励起された蛍光を信号光として受光し、信号処理部６１は細胞核の像のコントラストを表すコントラスト信号を生成してもよい。また、第２制御部７１ｂが画像を取得する際に（ステップＳ１１参照）、第２光源４０は照明光としてＵＶ光を細胞核に照射し、撮像部６０はＵＶ光により励起された蛍光を信号光として受光し、信号処理部６１は細胞核の画像データを生成してもよい。次に、第２光源４０は照明光として青色光をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で染色された細胞骨格に照射し、撮像部６０は青色光により励起された蛍光を信号光として受光し、信号処理部６１は細胞骨格の画像データを生成してもよい。

＜第２実施形態＞
上記した第１実施形態では、第２制御部７１ｂは、界面検出部３０をオフにした状態で（ステップＳ５参照）画像ＡＦ制御（ステップＳ６〜Ｓ１０）を行っていた。これに対して、第２実施形態では、第２制御部７１ｂは、界面検出部３０をオンにしたまま（つまり、界面検出部３０による反射面３ａの検出を実行したまま）画像ＡＦ制御を行う。なお、第２実施形態における顕微鏡装置１の構成は、図１及び図２に示した構成と同様である。

図６は、第２実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。なお、図６において、ステップＳ１〜Ｓ４、ステップＳ１１、及びステップＳ１２の処理は図５に示した処理と同様であるため、同一処理には同一符号を付して重複する説明を省略する。

図６に示す処理において、第２制御部７１ｂは、ステップＳ４の処理の実行後、界面検出部３０をオン状態のまま画像ＡＦ制御（ステップＳ２１〜Ｓ２６）を開始する。この場合、第２制御部７１ｂは、ステップＳ４におけるＸＹステージ１０の移動が停止した後、レンズ駆動部３４に対して制御信号を出力して、オフセットレンズ３２を移動させてオフセット値ＯＳを変更する（ステップＳ２１）。また、第２制御部７１ｂは、ユニット駆動部３６に対して制御信号を出力して、光像の結像位置Ａが反射面３ａの位置に合った状態を維持しつつ、オフセット値ＯＳの変更に連動させて対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させる（ステップＳ２２）。例えば、図３（ｂ）に示したように、第２制御部７１ｂは、凹レンズ３２ｂを第２光軸Ｏ２方向に移動させると、結像位置Ａが対物レンズ２１に近づく。このとき、第２制御部７１ｂは、結像位置Ａが反射面３ａの位置に合った状態を維持しようとすれば、対物レンズ２１を反射面３ａに近づくように移動させることになる。

次に、第２制御部７１ｂは、Ｚ方向の所定間隔の位置ごとに、信号処理部６１によって生成されるコントラスト信号を取得する（ステップＳ２３）。そして、第２制御部７１ｂは、所定範囲内のすべての位置のコントラスト信号を取得したか否かを判定する（ステップＳ２４）。第２制御部７１ｂは、所定範囲内のすべての位置のコントラスト信号を取得していないと判定した場合は（ステップＳ２４のＮＯ）、所定範囲内のすべてのコントラスト信号を取得したと判定するまでステップＳ２１〜Ｓ２３の処理を繰り返し実行する。

一方、第２制御部７１ｂは、所定範囲内のすべての位置のコントラスト信号を取得したと判定した場合は（ステップＳ２４のＹＥＳ）、ステップＳ２３で取得したコントラスト信号に基づいて、試料面２ａの位置として最適なオフセット値ＯＳを算出する（ステップＳ２５）。例えば、第２制御部７１ｂは、試料２の像のコントラストが最大となるようなオフセット値ＯＳを試料面２ａの位置として算出する。そして、第２制御部７１ｂは、レンズ駆動部３４及びユニット駆動部３６に制御信号を出力することで、焦点位置ＦがステップＳ２５で算出した最適なオフセット値ＯＳとなるようにオフセットレンズ３２及び対物レンズ２１を移動させる（ステップＳ１０）。その後、第２制御部７１ｂは、ステップＳ１１及びＳ１２の処理を実行する。

なお、上記した第２実施形態においても、制御部７１は、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させていたが、制御部７１は、対物レンズ２１とＸＹステージ１０（つまり試料２）との少なくとも一方をＺ方向に移動させる構成であればよい。すなわち、制御部７１は、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよく、またＸＹステージ１０だけをＺ方向に移動させてもよく、また対物レンズ２１及びＸＹステージ１０の両方をＺ方向に移動させてもよい。

以上に説明したように、第２実施形態では、第２制御部７１ｂは、界面検出部３０による界面３ａの検出の実行中に対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させる。このような構成によれば、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方の移動中に、界面検出部３０が界面３ａの検出を行っているので、界面３ａの検出に基づいて対物レンズ２１と観察対象物２（ＸＹステージ１０）との間の距離に制限を設けることができる。従って、対物レンズ２１と観察対象物２（ＸＹステージ１０）とが移動によってぶつかってしまうことを回避させることができる。

また、第２実施形態では、界面検出部３０は、光源３１と、光源３１からの光に基づく光像を対物レンズ２１を介して界面３ａ上に結像させ、界面３ａからの光像の反射光を対物レンズ２１を介して受光して光像の反射像を結像させるフォーカス用光学系３０Ａと、フォーカス用光学系３０Ａによる反射像の結像位置に設けられ、反射像を検出する光電変換器３５と、を含み、フォーカス用光学系３０Ａは、該光学系３０Ａの第２光軸Ｏ２方向に移動可能なレンズ３２を含み、第２制御部７１ｂは、光電変換器３５からの信号に基づき界面検出部３０に界面３ａの検出を実行させつつレンズ３２を第２光軸Ｏ２方向に移動させることで一定距離を変更し、一定距離の変更に連動させて対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させる。このような構成によれば、界面検出部３０が界面３ａの検出を行いつつ、レンズ３２を移動させることで焦点位置Ｆの変更を行うことができる。

＜第３実施形態＞
上記した第１実施形態では、第１制御部７１ａはＸＹステージ１０の移動中に焦点維持制御を実行していた（ステップＳ３，Ｓ４参照）。これに対して、第３実施形態では、タイムラプス観察（一定時間ごとに撮影することで長時間の変化を観察する手法）における撮影の待機中に焦点維持制御を実行する。なお、タイムラプス観察のことをインターバル観察ともいう。

図７は、第３実施形態に係る顕微鏡装置１の制御系の構成を示すブロック図である。図７に示すように、制御部７１Ａは撮像制御部７１ｃを備えている点で図２に示す構成と異なる。撮像制御部７１ｃは、撮像部６０に対して所定の規定時間ごとに試料２の撮像を実行させる処理部である。本実施形態では、第１制御部７１ａは、撮像制御部７１ｃが撮像部６０に撮像を実行されていないときに焦点維持制御を実行し、第２制御部７１ｂは、撮像制御部７１ｃが撮像部６０に撮像を実行させるタイミングにおいて焦点位置Ｆを基準位置から試料面２ａの位置に変更する。図７において、その他の構成については図２に示した構成と同様であるので、同一構成については同一符号を付して重複する説明を省略する。

図８は、第３実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。なお、図８において、ステップＳ１〜Ｓ３、及びステップＳ５〜Ｓ１１の処理は図５に示した処理と同様であるため、同一処理には同一符号を付して重複する説明を省略する。

図８に示す処理において、ステップＳ３の処理の実行後、撮像制御部７１ｃは、タイムラプス観察において規定された規定時間（例えば数分や数時間）だけ画像ＡＦ制御の実行を待機する（ステップＳ３１）。ステップＳ３１における規定時間の待機中は、撮像部６０による撮像が行われていないタイミングに相当する。このとき、界面検出部３０がオンの状態であるので（ステップＳ３参照）、第１制御部７１ａは、常に反射面３ａから一定距離（オフセット値ＯＳ）Ｚ方向に離れた位置に対物レンズ２１の焦点位置Ｆを維持するように、ユニット駆動部３６の駆動制御を実行する。これにより、長時間観察によるＸＹステージ１０の膨張などが原因で試料２の位置が変化しても、リアルタイムに対物レンズ２１のＺ方向の位置を変更してＸＹステージ１０の膨張などによる位置変化に追従させることができる。なお、本実施形態においては、規定時間の待機中はオフセット値ＯＳが変更されないので、第１制御部７１ａはレンズ駆動部３４の駆動制御を実行しない。

そして、第１制御部７１ａは、ステップＳ３１による規定時間が経過すると、一旦、界面検出部３０をオフにする（ステップＳ５）。その後、第２制御部７１ｂは、画像ＡＦ制御（ステップＳ６〜Ｓ１０）を実行する。タイムラプス観察においては、時間経過に伴って試料２（例えば細胞核）の位置が上下に変化することが起こり得る。従って、今回の観察時の試料２の位置が前回の観察時の試料２の位置からずれている可能性がある。このため、第２制御部７１ｂは、規定時間の経過後に画像ＡＦ制御を行う。その後、第２制御部７１ｂは、焦点位置Ｆが試料面２ａの位置となっている状態で画像を取得する（ステップＳ１１）。

第２制御部７１ｂは、すべての規定時間の撮像が終了したか否かを判定する（ステップＳ３２）。第２制御部７１ｂがすべての規定時間の撮像が終了していないと判定した場合は（ステップＳ３２のＮＯ）、第１制御部７１ａ及び第２制御部７１ｂは、ステップＳ３、ステップＳ３１、及びステップＳ５〜Ｓ１１の処理を繰り返し実行する。一方、第２制御部７１ｂがすべての規定時間の撮像を終了したと判定した場合は（ステップＳ３２のＹＥＳ）、処理を終了する。

なお、上記した第３実施形態においても、制御部７１は、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させていたが、制御部７１は、対物レンズ２１とＸＹステージ１０（つまり試料２）との少なくとも一方をＺ方向に移動させる構成であればよい。すなわち、制御部７１は、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよく、またＸＹステージ１０だけをＺ方向に移動させてもよく、また対物レンズ２１及びＸＹステージ１０の両方をＺ方向に移動させてもよい。

以上のように、第３実施形態では、撮像部６０に対して所定時間ごとに観察対象物２の撮像を実行させる撮像制御部７１ｃを備え、第１制御部７１ａは、撮像制御部７１ｃが撮像部６０に撮像を実行させていないときに焦点維持制御を実行し、第２制御部７１ｂは、撮像制御部７１ｃが撮像部６０に撮像を実行させる撮像タイミングにおいて焦点位置Ｆを基準位置から観察対象物２の位置２ａに変更する。このような構成によれば、タイムラプス観察の待機中に焦点位置Ｆが維持されているので、第２制御部７１ｂが待機の終了後に直ちに基準位置から焦点位置Ｆの変更を行うことができる。

＜第４実施形態＞
上記した第１実施形態、第２実施形態、及び第３実施形態では、第１制御部７１ａが入力部７２を介してオフセット値ＯＳを入力していた。これに対して、第４実施形態では、制御部が自動的にオフセット値ＯＳを探索して設定する。

図９は、第４実施形態に係る顕微鏡装置１の制御系の構成を示すブロック図である。図９に示すように、制御部７１Ｂは第１探索部７１ｄを備えている点で図２及び図７に示す構成と異なる。第１探索部７１ｄは、対物レンズ２１と試料２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させて試料面２ａの位置を検出し、界面検出部３０に界面３ａを検出させ、試料面２ａの位置と界面３ａの位置とに基づいて一定距離の値（オフセット値ＯＳ）を求める処理部である。本実施形態では、第１制御部７１ａは、第１探索部７１ｄにより求められた値（オフセット値ＯＳ）に基づいて焦点維持制御を実行する。図９において、その他の構成については図２及び図７に示した構成と同様であるので、同一構成については同一符号を付して重複する説明を省略する。

図１０は、第４実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。なお、図１０において、ステップＳ４〜Ｓ１２の処理は図５に示した処理と同様であるため、同一処理には同一符号を付して重複する説明を省略する。

図１０に示す処理において、第１制御部７１ａは、ステージ駆動部１１に制御信号を出力して、ＸＹステージ１０をＸＹ平面内の初期位置に移動させる（ステップＳ４１）。次に、第１探索部７１ｄは、界面検出部３０をオフにする（ステップＳ４２）。界面検出部３０がオフの状態になると、界面検出部３０は反射面３ａの位置の検出を停止する。

次に、第１探索部７１ｄは、ユニット駆動部３６に制御信号を出力して、対物レンズ２１及び界面検出部３０を所定間隔ごとにＺ方向に移動させる（ステップＳ４３）。そして、第１探索部７１ｄは、Ｚ方向の所定間隔の位置ごとに、信号処理部６１によって生成されるコントラスト信号を取得する（ステップＳ４４）。そして、第１探索部７１ｄは、すべての位置のコントラスト信号を取得したか否かを判定する（ステップＳ４５）。第１探索部７１ｄは、すべての位置のコントラスト信号を取得していないと判定した場合は（ステップＳ４５のＮＯ）、すべてのコントラスト信号を取得したと判定するまでステップＳ４３及びＳ４４の処理を繰り返し実行する。

一方、第１探索部７１ｄは、すべての位置のコントラスト信号を取得したと判定した場合は（ステップＳ４５のＹＥＳ）、ステップＳ４４で取得したコントラスト信号に基づいて、試料面２ａの位置として最適（コントラスト値が最も高い）なＺ方向の位置を算出する（ステップＳ４６）。そして、第１探索部７１ｄは、ユニット駆動部３６に制御信号を出力することで、焦点位置ＦがステップＳ４６で算出した最適なＺ方向の位置（試料面２ａの位置）となるように対物レンズ２１及び界面検出部３０を移動させる（ステップＳ４７）。

その後、第１探索部７１ｄは、界面検出部３０をオンにすると（ステップＳ４８）、界面検出部３０が反射面３ａの位置を検出し、第１探索部７１ｄは、界面検出部３０からの検出信号に基づいてレンズ駆動部３４に制御信号を出力することで、結像位置Ａが反射面３ａの位置となるようにオフセットレンズ３２を移動させる（ステップＳ４９）。そして、第１探索部７１ｄは、結像位置Ａと焦点位置Ｆとの差をオフセット値ＯＳとして設定し、第１制御部７１ａへ出力する。その後、第１制御部７１ａ及び第２制御部７１ｂは、ステップＳ４〜Ｓ１２の処理を実行する。

なお、上記した第４実施形態においても、制御部７１は、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させていたが、制御部７１は、対物レンズ２１とＸＹステージ１０（つまり試料２）との少なくとも一方をＺ方向に移動させる構成であればよい。すなわち、制御部７１は、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよく、またＸＹステージ１０だけをＺ方向に移動させてもよく、また対物レンズ２１及びＸＹステージ１０の両方をＺ方向に移動させてもよい。

以上のように、第４実施形態では、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させて観察対象物２の位置２ａを検出し、界面検出部３０に界面３ａを検出させ、観察対象物２の位置２ａと界面３ａの位置とに基づいて一定距離の値（オフセット値ＯＳ）を求める第１探索部７１ｄを備え、第１制御部７１ａは、第１探索部７１ｄにより求められた値に基づいて焦点維持制御を実行する。このような構成によれば、第１探索部７１ｄが自動的にオフセット値ＯＳを探索して設定するので、使用者によるオフセット値ＯＳの入力の手間を省くことができる。

また、第４実施形態では、第１探索部７１ｄは、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方の移動中に撮像部６０で撮像された画像に基づいて観察対象物２の位置２ａを検出する。このような構成によれば、画像に基づいて正確な観察対象物２の位置２ａを検出することができ、その結果、一定距離の値の精度も向上する。

なお、上記した第４実施形態の構成によれば、第１探索部７１ｄは、状況によっては１０００μｍ近くの範囲において最初の位置２ａの探索を行う必要がある。この場合、位置２ａの探索に時間がかかってしまうため、結果的にオフセット値ＯＳの探索に時間がかかってしまう。しかし、オフセット値ＯＳの探索に必要な時間は最初の１回だけであるので、すべての試料２の撮像時間は短縮される。また、通常、このような位置２ａの探索は２段階のスキャン（走査）で行われる。第１段階は、第１探索部７１ｄは、１０００μｍの範囲において２０μｍの間隔でコントラスト信号を取得する。この場合、撮像部６０による５００枚の画像取得が必要となる。次に、第１探索部７１ｄは、最大コントラストの位置の前後４０μｍの範囲において２μｍの間隔でコントラスト信号を取得する。この場合、撮像部６０による２０枚の画像取得が行われる。第１探索部７１ｄは、２０枚の画像の中で最大コントラストが得られた画像の位置を最適なＺ方向の位置に採用する。

＜第５実施形態＞
第５実施形態においても、上記した第４実施形態と同様に、制御部が自動的にオフセット値ＯＳを探索して設定する。しかし、上記した第４実施形態では、第１探索部７１ｄは界面検出部３０をオフ状態にした後にオフセット値ＯＳの探索を行っていたのに対し、第５実施形態では、第２探索部は界面検出部３０をオン状態にしたままオフセット値ＯＳの探索を行う。

図１１は、第５実施形態に係る顕微鏡装置１の制御系の構成を示すブロック図である。図１１に示すように、制御部７１Ｃは第２探索部７１ｅを備えている点で図２、図７及び図９に示す構成と異なる。第２探索部７１ｅは、界面検出部３０に界面３ａの検出を実行させつつ対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させて観察対象物２の位置２ａを検出し、観察対象物２の位置２ａと界面３ａの位置とに基づいて一定距離の値（オフセット値ＯＳ）を求める。本実施形態では、第１制御部７１ａは、第２探索部７１ｅにより求められた値（オフセット値ＯＳ）に基づいて焦点維持制御を実行する。図１１において、その他の構成については図２、図７及び図９に示した構成と同様であるので、同一構成については同一符号を付して重複する説明を省略する。

図１２は、第５実施形態に係る焦点調節方法を説明するためのフローチャートである。なお、図１２において、ステップＳ４〜Ｓ１２の処理は図５に示した処理と同様であるため、同一処理には同一符号を付して重複する説明を省略する。

図１２に示す処理において、第１制御部７１ａは、ステージ駆動部１１に制御信号を出力して、ＸＹステージ１０をＸＹ平面内の初期位置に移動させる（ステップＳ５１）。次に、第２探索部７１ｅは、界面検出部３０をオンにする（ステップＳ５２）。界面検出部３０がオンの状態になると、界面検出部３０は反射面３ａの位置を検出する。

次に、第２探索部７１ｅは、界面検出部３０をオン状態のまま、レンズ駆動部３４に対して制御信号を出力して、オフセットレンズ３２を移動させてオフセット値ＯＳを変更して初期値にする（ステップＳ５３）。この際、オフセット値ＯＳの初期値は０が適当である。また、第２探索部７１ｅは、ユニット駆動部３６に対して制御信号を出力して、光像の結像位置Ａが反射面３ａの位置に合った状態を維持しつつ、オフセット値ＯＳの変更に連動させて対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させる（ステップＳ５４）。

次に、第２探索部７１ｅは、Ｚ方向の所定間隔の位置ごとに、信号処理部６１によって生成されるコントラスト信号を取得する（ステップＳ５５）。そして、第２探索部７１ｅは、すべての位置のコントラスト信号を取得したか否かを判定する（ステップＳ５６）。第２探索部７１ｅは、すべての位置のコントラスト信号を取得していないと判定した場合は（ステップＳ５６のＮＯ）、すべてのコントラスト信号を取得したと判定するまでステップＳ５３〜Ｓ５５の処理を繰り返し実行する。

一方、第２探索部７１ｅは、すべての位置のコントラスト信号を取得したと判定した場合は（ステップＳ５６のＹＥＳ）、ステップＳ５５で取得したコントラスト信号に基づいて、試料面２ａの位置として最適なオフセット値ＯＳを算出する（ステップＳ５７）。例えば、第２探索部７１ｅは、試料２の像のコントラストが最大となるようなオフセット値ＯＳを試料面２ａの位置として算出する。そして、第２探索部７１ｅは、レンズ駆動部３４及びユニット駆動部３６に制御信号を出力することで、焦点位置ＦがステップＳ５７で算出した最適なオフセット値ＯＳとなるようにオフセットレンズ３２及び対物レンズ２１を移動させる（ステップＳ５８）。その後、第１制御部７１ａ及び第２制御部７１ｂは、ステップＳ４〜Ｓ１２の処理を実行する。

なお、上記した第５実施形態においても、制御部７１は、対物レンズ２１（及び界面検出部３０）をＺ方向に移動させていたが、制御部７１は、対物レンズ２１とＸＹステージ１０（つまり試料２）との少なくとも一方をＺ方向に移動させる構成であればよい。すなわち、制御部７１は、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよく、またＸＹステージ１０だけをＺ方向に移動させてもよく、また対物レンズ２１及びＸＹステージ１０の両方をＺ方向に移動させてもよい。

以上のように、第５実施形態では、界面検出部３０に界面３ａの検出を実行させつつ対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方を第１光軸Ｏ１方向に移動させて観察対象物２の位置２ａを検出し、観察対象物２の位置２ａと界面３ａの位置とに基づいて一定距離の値を求める第２探索部７１ｅを備え、第１制御部７１ａは、第２探索部７１ｅにより求められた値に基づいて焦点維持制御を実行する。このような構成によれば、第２探索部７１ｅが自動的にオフセット値ＯＳを探索して設定するので、使用者によるオフセット値ＯＳの入力の手間を省くことができる。また、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方の移動中に、界面検出部３０が界面３ａの検出を行っているので、界面３ａの検出に基づいて対物レンズ２１と観察対象物２（ＸＹステージ１０）との間の距離に制限を設けることができる。従って、対物レンズ２１と観察対象物２（ＸＹステージ１０）とが移動によってぶつかってしまうことを回避させることができる。

また、第５実施形態では、第２探索部７１ｅは、対物レンズ２１と観察対象物２との少なくとも一方の移動中に撮像部６０で撮像された画像に基づいて観察対象物２の位置２ａを検出する。このような構成によれば、画像に基づいて正確な観察対象物２の位置２ａを検出することができ、その結果、一定距離の値の精度も向上する。

以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は、上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能である。また、上記の実施の形態で説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。そのような変更または改良、省略した形態も本発明の技術的範囲に含まれる。また、上記した実施の形態や変形例の構成を適宜組み合わせて適用することも可能である。

上記した第１実施形態から第５実施形態までの各々の構成の組み合わせ方としては、次のようなものがある。まず、オフセット値ＯＳを求める方式として、（１）入力部７２からのオフセット値ＯＳの入力（ステップＳ２参照）、（２）界面検出部３０がオフ状態における画像ＡＦ制御の実行（ステップＳ４２〜Ｓ４９参照）、（３）界面検出部３０がオン状態における画像ＡＦ制御の実行（ステップＳ５２〜Ｓ５８参照）、の３種類の方式がある。また、焦点維持制御を実行するタイミングとして、（４）ＸＹステージ１０の移動時（ステップＳ３，Ｓ４参照）、（５）タイムラプス観察の待機時（ステップＳ３，Ｓ３１参照）、の２種類がある。また、画像ＡＦ制御の方式として、（６）界面検出部３０のオフ状態での画像ＡＦ制御、（７）界面検出部３０のオン状態での画像ＡＦ制御、の２種類がある。これらの構成を適宜組み合わせて適用することが可能である。

また、図１に示した光学顕微鏡は倒立型顕微鏡であったが、このような顕微鏡に限定されず、上記した実施の形態や変形例の構成は正立型顕微鏡などにも適用することが可能である。また、図１に示した光学顕微鏡の照明装置として反射式照明を利用していたが、透過式照明を利用してもよい。

また、試料２を収容する容器はマイクロプレート３を用いていたが、このような構成に限らず、例えば試料２をカバーガラスとスライドガラスとで挟み込む構成でもよい。また、界面３ａはマイクロプレート３の底部の底面としていたが、赤外光の反射が強ければマイクロプレート３の底部の上面であってもよい。

また、フォーカス光学系３０Ａにおいて光路上にスリット板を設けることにより、反射面３ａに照射する光像をスリット像としてもよい。この場合、制御部は界面検出部３０からの検出信号に基づいてスリット像を検出し、検出したスリット像により結像位置Ａを認識する。また、第１光源３１は赤外光を照射する赤外線ＬＥＤとしていたが、赤外光以外の波長の光（例えば赤外光以外の長波長の光）を照射する光源であってもよい。また、光電変換器３５はラインＣＣＤセンサを用いていたが、ラインＣＭＯＳセンサ（ＣＭＯＳ：Complementary Metal Oxide Semiconductor：相補性金属酸化膜半導体）を用いてもよい。

また、オフセットレンズ３２は、凹レンズ３２ｂを第２光軸Ｏ２に沿って移動させて結像位置Ａを変更するように構成していたが、凸レンズ３２ａを第２光軸Ｏ２に沿って移動させて結像位置Ａを変更してもよく、また凸レンズ３２ａ及び凹レンズ３２ｂの両方を第２光軸Ｏ２に沿って移動させて結像位置Ａを変更してもよい。

また、焦点調節装置のすべての構成が顕微鏡装置１に設けられていない構成でもよい。例えば、制御部７１，７１Ａ，７１Ｂ，７１Ｃ、入力部７２、記憶部７３などの構成が顕微鏡装置１とは別のコンピュータなどの装置に設けられてもよい。また、顕微鏡装置１は画像解析装置や画像解析用の制御プログラムを備えたコンピュータなどと接続されてもよい。また、制御部７１，７１Ａ，７１Ｂ，７１Ｃに制御・処理を実行させる制御プログラムは記憶部７３に記憶されていたが、制御プログラムは記憶媒体に記憶させてもよい。

また、撮像部６０によって１回に撮像される試料２（サンプル）の数は１つに限らず、２つ以上であってもよい。また、撮像部６０はＣＣＤセンサを用いていたが、ＣＣＤセンサに代えてＣＭＯＳセンサを用いてもよい。

また、画像ＡＦ制御において、制御部は、信号処理部６１によって生成されるコントラスト信号に基づいて焦点位置Ｆを決定していたが、信号処理部６１によって生成される画像データに基づいて焦点位置Ｆを決定してもよい。また、画像ＡＦ制御において蛍光画像を使用していたが、透過像の明視野又は位相差像を使用してもよい。また、撮像部６０は、画像の取得（ステップＳ１１参照）を行うとともに画像ＡＦ制御用の画像も取得していたが（ステップＳ７等参照）、撮像部６０とは別に、画像ＡＦ制御用の撮像装置を設けてもよい。この場合、画像ＡＦ制御用の撮像装置と撮像部６０とは同じ焦点位置が設定される。この場合、画像取得の時間が短い高感度の撮像装置を用いることが好ましい。

また、信号処理部６１は、撮像部６０が取得する２次元の画像信号に基づいてコントラスト信号を生成するのではなく、１次元の画像信号に基づいてコントラスト信号を生成してもよい。この場合、画像信号を取得する撮像部は１次元画像センサを用いることができる。また、制御部は、コントラストが最大となる位置を焦点位置として決定していたが、信号強度が最大となる位置を焦点位置として決定してもよい。

また、ユニット駆動部３６は、対物レンズ２１と界面検出部３０とが結合されたユニットをＺ方向に移動させていたが、対物レンズ２１だけをＺ方向に移動させてもよい。また、ステージ駆動部１１、レンズ駆動部３４、及びユニット駆動部３６の駆動方法は、電動モータの回転させる方法が想定される。しかし、このような駆動方法に限定されず、例えばピエゾ素子をＸＹステージ１０、オフセットレンズ３２の保持部、及び対物レンズ２１の取り付け部に取り付けて、ピエゾ素子により移動させてもよい。

また、制御部は、オフセット値の履歴を参照してオフセット値を設定してもよい。例えば、制御部は、以前に行った実験条件の中から今回の実験条件と同じ実験条件を検索し、同じ実験条件におけるオフセット値を今回の実験条件におけるオフセット値としてもよい。また、制御部は、ＸＹステージ１０の移動があるときは常に焦点維持制御を行っていたが、所定番目のＸＹステージ１０の移動についてだけ（例えば１回おきのＸＹステージ１０の移動についてだけ）焦点維持制御を行ってもよい。また、制御部は、タイムラプス観察における規定時間の間隔が短い場合は、規定時間の待機中に常に焦点維持制御を行うのではなく、所定番目の規定時間の待機においてだけ焦点維持制御を行ってもよい。

また、制御部は、ＸＹステージ１０の移動や規定時間の待機があるごとにオフセット値を更新してもよい。すなわち、制御部は、前回の試料２の撮像時にオフセット値の変更があった場合は、変更されたオフセット値を今回の試料２の撮像時における焦点維持制御において用いるようにしてもよい。

１…顕微鏡装置、２…試料（観察対象物）、３…マイクロプレート（容器）、１０…ＸＹステージ、１１…ステージ駆動部（第２駆動部）、２１…対物レンズ、３０…界面検出部、３０Ａ…フォーカス光学系、３１…第１光源（光源）、３２…オフセットレンズ（レンズ）、３４…レンズ駆動部、３５…光電変換器、３６…ユニット駆動部（第１駆動部）、６０…撮像部、６１…信号処理部、７１…制御部、７１ａ…第１制御部、７１ｂ…第２制御部、７１ｃ…撮像制御部、７１ｄ…第１探索部、７１ｅ…第２探索部、７２…入力部、ＯＳ…オフセット値（一定距離）、Ａ…結像位置、Ｆ…焦点位置、Ｏ１…第１光軸、Ｏ２…第２光軸

Claims (5)

1. 観察対象物の所定の位置に第１の光を集光する第１光学系と、
   前記観察対象物を収容する容器の所定の位置に第２の光を集光する第２光学系と、
   前記容器で反射した前記第２の光を検出する検出部と、
   制御部と、
   撮像部と、
   を有し、
   前記制御部は、
   前記観察対象物の撮像を所定の時間待機した後に実行する手法において前記所定の時間待機する間に、前記検出部からの光に基づいて対物レンズとステージとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させることにより、前記第１の光の集光位置を前記容器の所定の位置から第１の距離離れた位置に維持する焦点維持制御を実行し、
   前記所定の時間待機した後、前記ステージと前記対物レンズとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させて前記第１の光の集光位置を複数の位置に移動させ、各位置で前記撮像部に前記観察対象物を撮像させて複数の画像を取得し、前記複数の画像に基づいて前記ステージと前記対物レンズとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させて前記観察対象物を前記容器の所定の位置から第２の距離離れた位置で前記撮像部に撮像させる、顕微鏡。
2. 前記制御部は、前記複数の画像に基づいて前記観察対象物の最適撮像位置を検出し、前記ステージと前記対物レンズとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させて前記観察対象物を前記容器の所定の位置から第２の距離離れた最適撮像位置で前記撮像部に撮像させる、請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記焦点維持制御の実行を中断した後、前記ステージと前記対物レンズとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させて前記第１の光の集光位置を前記複数の位置に移動させ、各位置で前記撮像部に前記観察対象物を撮像させて前記複数の画像を取得する、請求項１又は２に記載の顕微鏡。
4. 前記第２光学系は、オフセット光学系を有し、
   前記制御部は、前記焦点維持制御を実行中に前記オフセット光学系の少なくとも一部を移動させることにより前記ステージと前記対物レンズとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させて前記第１の光の集光位置を前記複数の位置に移動させ、各位置で前記撮像部に前記観察対象物を撮像させて前記複数の画像を取得する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
5. 前記制御部は、前記複数の画像のコントラストに基づいて前記ステージと前記対物レンズとの少なくとも一方を前記対物レンズの光軸方向に移動させて前記観察対象物を前記容器の所定の位置から第２の距離離れた位置で前記撮像部に撮像させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡。

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