JP6817135B2 - 糖化タンパク質の分析方法、分析試薬、分析キットおよび分析用試験片 - Google Patents
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Description
本発明は、糖化タンパク質の分析方法、分析試薬、分析キットおよび分析用試験片に関する。
短期間の血糖コントロールの指標として、血中の糖化タンパク質が利用されている。血中のタンパク質は、そのＮ末端または側鎖のアミノ基にグルコースのアルデヒド基が結合し、さらにアマドリ転移によってアマドリ化合物である糖化タンパク質が生成される。生成された糖化タンパク質は、側鎖がフルクトース構造を取るためにフルクトサミンとも称されている。フルクトサミンは血中に存在する糖化タンパク質の総称である。
糖化タンパク質は還元性物質であることから、還元性物質との反応により発色する基質（例えば、２−（４−インドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）等）を使用し、基質の発色の度合いによって糖化タンパク質が測定されている。しかし、前記基質は、糖化タンパク質以外の血中還元性物質（例えば、尿酸等）も測定するため、血中の糖化タンパク質の正確な値が得られないという問題がある。
糖化タンパク質は還元性物質であることから、還元性物質との反応により発色する基質（例えば、２−（４−インドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）等）を使用し、基質の発色の度合いによって糖化タンパク質が測定されている。しかし、前記基質は、糖化タンパク質以外の血中還元性物質（例えば、尿酸等）も測定するため、血中の糖化タンパク質の正確な値が得られないという問題がある。
そこで、糖化タンパク質以外の還元性物質の影響を回避するために、以下の方法が報告されている。第１の方法は、試料について、糖化タンパク質を含む血中還元性物質と反応する第１試薬を用いて吸光度変化量を測定し、他方、糖化タンパク質以外の血中還元性物質と反応する第２試薬を用いて吸光度変化量を測定し、前者から後者を引くことにより、糖化タンパク質の正味の吸光度変化を求める方法である（特許文献１）。第２の方法は、尿酸を分解するウリカーゼや不溶性担体であるグリコサミノグリカン等による試料の前処理によって、糖化タンパク質以外の血中還元性物質の影響を回避する方法である（特許文献２および３）。
しかしながら、第１の方法は、試料について、異なる試薬を用いた２種類の反応系（２反応系）が必要であり、手間がかかり、コスト高となる。また、第２の方法の場合、ウリカーゼの使用では、反応液に濁りが生じて、吸光度測定に影響を及ぼすという問題があり、また、前記不溶性担体であるグリコサミノグリカンの使用では、その固定化が必要であり、洗浄や反応停止等のために操作が煩雑となる。
そこで、本発明は、糖化タンパク質を、より簡便且つ正確に分析できる方法を提供することを目的とする。
本発明の糖化タンパク質の分析方法は、下記式（１）で表される発色剤と生体試料とを反応させる反応工程、および、前記発色剤の発色反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。
本発明の糖化タンパク質の分析試薬は、下記式（１）で表される発色剤を含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。
本発明の糖化タンパク質の分析キットは、前記本発明の分析試薬を含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。
本発明の糖化タンパク質の分析用試験片は、
基板を含み、
前記基板が、試料供給領域と、反応領域とを有し、
前記試料供給領域と前記反応領域とが、流路で連結され、
前記反応領域に、前記本発明の分析試薬が配置され、
前記基板における前記反応領域が、透明部材であることを特徴とする。
基板を含み、
前記基板が、試料供給領域と、反応領域とを有し、
前記試料供給領域と前記反応領域とが、流路で連結され、
前記反応領域に、前記本発明の分析試薬が配置され、
前記基板における前記反応領域が、透明部材であることを特徴とする。
本発明によれば、前記式（１）で表される発色剤を使用することにより、より簡便且つ正確に、糖化タンパク質を分析できる。
本発明の糖化タンパク質の分析方法は、例えば、前記生体試料が、血液試料である。
本発明の糖化タンパク質の分析方法は、例えば、前記血液試料が、血清試料または血漿試料である。
本発明の糖化タンパク質の分析方法は、例えば、前記反応工程において、乾燥状態の前記発色剤に、液体状態の前記生体試料を添加することにより、両者を反応させる。
本発明の糖化タンパク質の分析用試験片は、例えば、
前記基板が、上基板と下基板とを含む積層体であり、
前記積層体の内部が、第１空間、第２空間、および、前記第１空間と前記第２空間とを連通する前記流路を有し、
前記上基板は、前記第１空間に対応する箇所に開口部を有し、
前記上基板の前記開口部と前記第１空間とが、前記試料供給領域であり、
前記開口部が、試料供給口であり、
前記第２空間が、前記反応領域であり、
前記第２空間に対応する前記上基板の領域および前記下基板の領域の少なくとも一方に、前記本発明の分析試薬が配置されている。
前記基板が、上基板と下基板とを含む積層体であり、
前記積層体の内部が、第１空間、第２空間、および、前記第１空間と前記第２空間とを連通する前記流路を有し、
前記上基板は、前記第１空間に対応する箇所に開口部を有し、
前記上基板の前記開口部と前記第１空間とが、前記試料供給領域であり、
前記開口部が、試料供給口であり、
前記第２空間が、前記反応領域であり、
前記第２空間に対応する前記上基板の領域および前記下基板の領域の少なくとも一方に、前記本発明の分析試薬が配置されている。
（生体試料中の糖化タンパク質の分析方法）
本発明の糖化タンパク質の分析方法（以下、「本発明の分析方法」という。）は、前述のように、下記式（１）で表される発色剤と生体試料とを反応させる反応工程、および、前記発色剤の発色反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。
本発明の糖化タンパク質の分析方法（以下、「本発明の分析方法」という。）は、前述のように、下記式（１）で表される発色剤と生体試料とを反応させる反応工程、および、前記発色剤の発色反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。
本発明によれば、理由は不明であるが、前記テトラゾリウム塩として前記発色剤を使用することにより、還元性物質である尿酸の影響を回避して、生体試料中の糖化タンパク質との反応を行うことができる。このため、例えば、生体試料中に糖化タンパク質の他に尿酸が共存する場合であっても、尿酸との反応により見掛けの発色が増加することを抑制でき、これによって、前記試料中に含まれる糖化タンパク質の量に対応した発色の度合いを測定できる。また、本発明は、例えば、尿酸の影響を排除するために、前述のような、２種類以上の試薬を用いた２反応系での測定が不要であり、少なくとも１反応系のみの測定で足りる（しかし、２種類以上の試薬を用いた二反応系での測定を本発明から除外する意図はない）。また、本発明は、例えば、前記発色剤の他に、尿酸の影響を回避するための前記ウリカーゼや前記不溶性担体を併用することも不要である。
血中の糖化タンパク質は、血中に含まれるタンパク質が体内を循環する間に血中のグルコースによって糖化されて生成するアマドリ化合物であり、前記発色剤の使用によって糖化タンパク質の還元力が測定される。つまり、前記発色剤を使用することにより測定できる糖化タンパク質には血中において糖化され得るすべてのタンパク質の糖化物が含まれている。このような糖化タンパク質としては、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンおよび糖化グロブリンなどが挙げられる。
本発明にかかる分析方法、分析試薬、分析キットおよび分析用試験片の分析の対象は、糖化タンパク質全量（つまり、フルクトサミン）だけではなく、個別のまたは特定の糖化タンパク質のグループを含む。例えば、試料を前処理することによって、分析対象以外の糖化タンパク質を試料から除くか、または前記発色剤と反応しないようにすることによって、目的とする特定の糖化タンパク質を測定することも、本発明の範囲に含まれる。
本発明にかかる分析方法、分析試薬、分析キットおよび分析用試験片の分析の対象は、糖化タンパク質全量（つまり、フルクトサミン）だけではなく、個別のまたは特定の糖化タンパク質のグループを含む。例えば、試料を前処理することによって、分析対象以外の糖化タンパク質を試料から除くか、または前記発色剤と反応しないようにすることによって、目的とする特定の糖化タンパク質を測定することも、本発明の範囲に含まれる。
本発明の分析方法は、前記反応工程において、前記発色剤と生体試料とを反応させることを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。
本発明の分析方法は、例えば、糖化タンパク質の有無を分析する定性分析でもよいし、糖化タンパク質の量を分析する定量分析でもよい。また、本発明の分析方法は、例えば、糖化タンパク質の測定方法ということもできる。
前記発色剤は、前述のように、Ｘが、アルカリ金属イオンである。前記アルカリ金属イオンは、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、フランシウムイオンがあげられるが、好ましくは、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）である。
前記発色剤の具体例は、例えば、下記式（２）で表される２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−３−〔４−（４−スルホフェニルアゾ）−２−スルホフェニル〕−２Ｈ−テトラゾリウム、ナトリウム塩（「ＷＳＴ−９」ともいう）があげられる。
前記反応工程において、前記生体試料に対する前記発色剤の添加割合は、特に制限されない。前記生体試料１μＬに対して、前記発色剤は、例えば、１〜２０ｎｍｏｌ、１〜１０ｎｍｏｌ、１〜７．５ｎｍｏｌである。
本発明の分析方法において、前記生体試料は、特に制限されず、例えば、糖化タンパク質の存在が予想される試料があげられ、糖化タンパク質含有の試料であってもよいし、糖化タンパク質非含有の試料であってもよい。前記生体試料は、例えば、血液試料等があげられる。前記血液試料は、例えば、赤血球、全血、血清、血漿等の試料があげられる。前記血液試料は、例えば、血球を含む場合、溶血試料でもよい。
前記反応工程において、前記発色剤と前記生体試料との反応系は、例えば、さらに、その他の添加成分を含んでもよい。前記添加成分は、例えば、緩衝剤、界面活性剤、賦形剤、酵素等があげられる。
前記反応系のｐＨは、特に制限されず、例えば、前記発色剤に応じて適宜決定できる。前記反応系のｐＨは、例えば、９．５〜１１．５であり、前記発色剤がＷＳＴ−９の場合、前記反応系のｐＨは、例えば、９．５〜１１．５である。前記反応系のｐＨは、例えば、前記緩衝剤によって調整できる。緩衝剤としては、従来知られている緩衝剤を適宜使用することができ、例えば、ＣＨＥＳ（N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ(N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)、炭酸ナトリウム緩衝剤などがあげられる。
前記酵素は、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化還元酵素があげられる。
前記界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、タウロデオキシコール酸ナトリウム、3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナート、ラウリル酸アミドプロピルベタイン、オクチルフェノールエトキシレート、ドデシルジメチル(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド分子内塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテルおよびコール酸ナトリウム等があげられる。前記Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤は、例えば、商品名Tween−20（ナカライテスク社製）があげられ、前記タウロデオキシコール酸ナトリウムは、例えば、商品名タウロデオキシコール酸ナトリウム（ナカラテスク社製）があげられ、前記3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナートは、例えば、商品名CHAPS（同仁化学研究所社製）があげられ、前記ラウリル酸アミドプロピルベタインは、例えば、商品名AmphItol 20AB（花王社製）があげられ、前記オクチルフェノールエトキシレートは、例えば、商品名TrItonX−100（ナカライテスク社製）があげられ、前記ドデシルジメチル(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド分子内塩は、例えば、商品名カプリリルスルホベタイン（東京化成工業社製）があげられ、前記ポリオキシエチレンラウリルエーテルは、例えば、商品名BrIg35（和光純薬工業社製）があげられる。
前記賦形剤は、例えば、ソルビトール、スクロースおよびキシリトール等があげられる。
本発明の分析方法は、前述のように、前記ウリカーゼや前記不溶性担体（例えば、グルコサミノグルカン）が不要である。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記ウリカーゼの非存在下で行われ、具体的には、前記分析対象の生体試料に由来しない外部からのウリカーゼの非添加状態で、行われることが好ましい。また、本発明の分析方法は、例えば、前記不溶性担体（例えば、グルコサミノグルカン）の非存在下で行われることが好ましい。
本発明の分析方法は、前記反応工程における前記発色剤と前記生体試料との反応を、例えば、ウェット系で行ってもよいし、ドライ系で行ってもよい。前者は、例えば、前記発色剤を含む液中における反応であり、後者は、例えば、前記発色剤を配置した試験片における反応である。本発明の分析方法は、前述のように、１反応系での測定が可能であること、また、前記ウリカーゼや前記不溶性担体（例えば、グルコサミノグルカン）が不要であることから、特に、後者のドライ系に適している。
以下、本発明の分析方法について、ドライ系の形態を例示する。なお、本発明は、これには制限されない。また、本発明の分析方法がドライ系の場合、例えば、後述する本発明の分析用試験片を使用することができる。
本発明の分析方法がドライ系の場合、例えば、前記反応工程において、前記発色剤を含む乾燥試薬に、液体状態の前記生体試料を添加することにより、両者を反応させる。この形態によれば、例えば、前記乾燥試薬に前記生体試料を添加することで、両者が混合され、前記乾燥試薬中の前記発色剤と前記生体試料とを反応させることができる。
前記反応工程の前記乾燥試薬は、例えば、前記発色剤を含む１種類の乾燥試薬でもよいし、２種類以上の乾燥試薬の併用でもよい。例えば、２種類以上の乾燥試薬を併用する場合、前記発色剤を含む乾燥試薬と試料とを反応させる前に、他の乾燥試薬と試料とを接触させ、ｐＨの調整または酵素反応等の前処理を行うこともできる。
前記１種類の乾燥試薬の場合、前記乾燥試薬は、前記発色剤を含み、さらに、前記添加成分を含んでもよい。前記乾燥試薬は、例えば、前記発色剤と任意の前記添加成分とを含む液体試薬を調製し、前記液体試薬を乾燥することによって調製できる。前記液体試薬は、例えば、前記発色剤に適したｐＨに設定することが好ましく、前記ｐＨは、例えば、緩衝液によって調整できる。前記ｐＨは、例えば、９．５〜１１．５であり、前記緩衝液としては、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液が好ましい。
前記２種類以上の乾燥試薬を使用する場合、少なくとも１種類の乾燥試薬が、前記発色剤を含んでいればよい。例えば、前記２種類の乾燥試薬として、第１乾燥試薬および第２乾燥試薬を併用する場合、前記第１乾燥試薬は、例えば、少なくとも前記発色剤と、少なくとも１種類の前記添加成分とを含み、前記第２乾燥試薬は、例えば、少なくとも１種類の前記添加成分を含む。
前記第１乾燥試薬は、前記添加成分として、例えば、緩衝剤、前記界面活性剤、前記賦形剤、および前記酵素（例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ）の少なくとも１種類を含むことが好ましい。前記第１乾燥試薬は、例えば、前記発色剤と前記添加成分とを含む第１液体試薬を調製し、前記第１液体試薬を乾燥することによって調製できる。前記第１乾燥試薬における前記緩衝剤は、例えば、前記第１液体試薬に含まれる前記緩衝液が乾燥したものである。前記第１液体試薬は、例えば、前記発色剤に適したｐＨに設定でき、ｐＨは、例えば、５．５〜６．５である。ｐＨを５．５〜６．５の範囲とすることによって、前記第１液体試薬に含まれる成分の安定性を高めることができる。前記ｐＨは、例えば、緩衝液によって調整でき、前記緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ−ＫＯＨ緩衝液等が使用できる。
前記２種類以上の乾燥試薬を使用する場合、反応系において発色剤に適したｐＨ、例えば９．５〜１１．５になるように、緩衝剤を前記２種類以上の乾燥試薬に配合すればよい。当業者は、目標とするｐＨに応じて緩衝剤の種類及び濃度を選択することができる。
前記２種類以上の乾燥試薬を使用する場合、反応系において発色剤に適したｐＨ、例えば９．５〜１１．５になるように、緩衝剤を前記２種類以上の乾燥試薬に配合すればよい。当業者は、目標とするｐＨに応じて緩衝剤の種類及び濃度を選択することができる。
前記第１乾燥試薬において、前記界面活性剤は、例えば、乾燥時における平滑性を向上させる観点から、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、タウロデオキシコール酸ナトリウム、n−オクタノイル−N−メチル−D−グルカミン、オクチルフェノールエトキシレートおよび3−〔（3−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕プロパンスルホナート等があげられる。前記Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤は、例えば、商品名Tween−20（ナカライテスク社製）があげられ、前記タウロデオキシコール酸ナトリウムは、例えば、商品名タウロデオキシコール酸ナトリウム（ナカラテスク社製）があげられ、前記n−オクタノイル−N−メチル−D−グルカミンは、例えば、商品名MEGA8(同仁化学研究所社製)があげられ、前記オクチルフェノールエトキシレートは、例えば、商品名TrItonX−100（ナカライテスク社製）があげられ、前記3−〔3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナートは、例えば、商品名CHAPS（同仁化学研究所社製）があげられる。前記第１試薬において、前記賦形剤は、例えば、ソルビトール、スクロースおよびキシリトール等があげられる。
前記第２乾燥試薬は、前記添加成分として、例えば、緩衝剤、前記界面活性剤、前記賦形剤の少なくとも１種類を含むことが好ましい。前記第２乾燥試薬は、前記第１乾燥試薬と同様に、例えば、前記添加成分を含む第２液体試薬を調製し、前記第２液体試薬を乾燥することによって調製できる。前記第２乾燥試薬における前記緩衝剤は、例えば、前記第２液体試薬に含まれる前記緩衝液が乾燥したものである。前記第２液体試薬のｐＨは、特に制限されず、例えば、９．５〜１１．５である。前記ｐＨは、例えば、緩衝液によって調整でき、前記緩衝液としては、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液等が使用できる。
前記第２乾燥試薬において、前記界面活性剤は、例えば、乾燥時における平滑性および反応の特異性を向上させる観点から、n-オクタノイル-N-メチル-D-グルカミン、ラウリル酸アミドプロピルベタイン、タウロデオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、3−〔（3−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ドデシルジメチル(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド分子内塩およびポリオキシエチレン ソルビタン アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）等があげられる。前記n-オクタノイル-N-メチル-D-グルカミンは、例えば、商品名MEGA−8（同仁化学研究所社製）があげられ、前記ラウリル酸アミドプロピルベタインは、例えば、商品名AmphItol 20AB（花王社製）があげられ、前記タウロデオキシコール酸ナトリウムは、例えば、商品名タウロデオキシコール酸ナトリウム（ナカラテスク社製）があげられ、前記3−〔3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホナートは、例えば、CHAPS（同仁化学研究所社製）があげられ、前記ポリオキシエチレンラウリルエーテルは、例えば、BrIg35（和光純薬工業社製）があげられ、前記ドデシルジメチル(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド分子内塩は、例えば、商品名カプリリルスルホベタイン（東京化成工業社製）があげられ、前記Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等は、例えば、Tween−20（ナカライテスク社製）があげられる。前記第２乾燥試薬において、前記賦形剤は、例えば、ソルビトール、スクロースおよびキシリトール等があげられる。
前記乾燥試薬は、例えば、担体に配置されていることが好ましく、前記担体としては、例えば、後述するような基板があげられる。前記２種類以上の乾燥試薬を使用する場合、前記基板の同じ部位に、前記２種類以上の乾燥試薬を配置してもよいし、前記基板の異なる部位に、前記２種類以上の乾燥試薬を配置してもよい。後者の場合、前記生体試料の添加により、前記生体試料と前記全乾燥試薬とが混合されるように、前記２種類以上の乾燥試薬が配置されることが好ましい。
前記測定工程において、前記発色反応の測定とは、例えば、前記発色反応により生じた前記発色剤の発色の測定である。前記発色は、例えば、光学シグナルとして測定することができる。前記光学シグナルは、特に制限されず、例えば、吸光度、反射率、透過率等があげられ、好ましくは、吸光度である。
前記測定工程において、前記発色反応の測定は、例えば、前記発色剤の発色がピークを示す波長範囲で行うことが好ましい。前記波長範囲は、例えば、前記発色剤の種類に応じて、適宜決定できる。前記発色剤がＷＳＴ−９である場合、測定波長は、例えば、４００〜７００ｎｍ、４５０〜６６０ｎｍ、５００〜６１０ｎｍの範囲である。
本発明の測定方法において、前記測定工程において測定した前記発色反応の測定値は、前記生体試料中における糖化タンパク質と相対関係にあるといえる。このため、前記測定
工程における測定結果を、そのまま、前記生体試料における糖化タンパク質量または糖化タンパク質濃度を間接的に示す値としてもよいし、前記測定工程における測定結果から前記生体試料における糖化タンパク質量または糖化タンパク質濃度を算出してもよい。後者の場合、例えば、前記発色反応の測定結果（例えば、光学シグナルの測定値）と前記生体試料中の糖化タンパク質濃度との相関関係に基づき、算出できる。
工程における測定結果を、そのまま、前記生体試料における糖化タンパク質量または糖化タンパク質濃度を間接的に示す値としてもよいし、前記測定工程における測定結果から前記生体試料における糖化タンパク質量または糖化タンパク質濃度を算出してもよい。後者の場合、例えば、前記発色反応の測定結果（例えば、光学シグナルの測定値）と前記生体試料中の糖化タンパク質濃度との相関関係に基づき、算出できる。
前記発色反応の測定は、例えば、乾式臨床化学分析装置（商品名：スポットケムＥＺ、スポットケムＤ−Ｃｏｎｃｅｐｔ、スポットケムＩＩ 糖化タンパク質単項目測定装置、アークレイ社製）等を使用できる。前記装置は、例えば、ドライ系において前記分析用試験片を使用する場合に利用できる。
本発明の分析方法が、ウェット系の場合、前記乾燥試薬に代えて前記液体試薬を使用する以外は、前記ドライ系の方法および条件を援用し、同様にして行うことができる。
（糖化タンパク質の分析試薬）
本発明の糖化タンパク質の分析試薬（以下、「本発明の分析試薬」という。）は、前記発色剤を含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析試薬は、前記発色剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。例えば、後述する糖化タンパク質の分析用試験片の構造とは異なる構造を有する試験片も、前記発色剤を含んでいれば本発明の分析試薬に包含される。本発明の分析試薬は、例えば、前記本発明の分析方法における前記乾燥試薬または前記液体試薬であり、前述の記載を援用できる。
本発明の糖化タンパク質の分析試薬（以下、「本発明の分析試薬」という。）は、前記発色剤を含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析試薬は、前記発色剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。例えば、後述する糖化タンパク質の分析用試験片の構造とは異なる構造を有する試験片も、前記発色剤を含んでいれば本発明の分析試薬に包含される。本発明の分析試薬は、例えば、前記本発明の分析方法における前記乾燥試薬または前記液体試薬であり、前述の記載を援用できる。
（糖化タンパク質の分析キット）
本発明の生体試料中の糖化タンパク質の分析キット（以下、「本発明の分析キット」という。）は、前記本発明の分析試薬を含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析キットは、前記分析試薬を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の分析キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。本発明の分析キットは、例えば、前記本発明の分析方法における前記乾燥試薬および前記液体試薬の記載を援用できる。
本発明の生体試料中の糖化タンパク質の分析キット（以下、「本発明の分析キット」という。）は、前記本発明の分析試薬を含み、前記本発明の分析方法に使用することを特徴とする。本発明の分析キットは、前記分析試薬を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の分析キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。本発明の分析キットは、例えば、前記本発明の分析方法における前記乾燥試薬および前記液体試薬の記載を援用できる。
（糖化タンパク質の分析用試験片）
本発明の糖化タンパク質の分析用試験片（以下、「本発明の分析用試験片」という。）は、
基板を含み、
前記基板が、試料供給領域と、反応領域とを有し、
前記試料供給領域と前記反応領域とが、流路で連結され、
前記反応領域に、前記本発明の分析試薬が配置され、
前記基板における前記反応領域が、透明部材であることを特徴とする。
本発明の糖化タンパク質の分析用試験片（以下、「本発明の分析用試験片」という。）は、
基板を含み、
前記基板が、試料供給領域と、反応領域とを有し、
前記試料供給領域と前記反応領域とが、流路で連結され、
前記反応領域に、前記本発明の分析試薬が配置され、
前記基板における前記反応領域が、透明部材であることを特徴とする。
本発明の分析用試験片は、前記本発明の分析試薬が前記反応領域に配置されていることが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。
本発明の分析用試験片の一例を、図１に示す。図１（Ａ）は、分析用試験片１の平面図であり、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＩ−Ｉ方向から見た断面図である。
図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、分析用試験片１は、上基板２ａと下基板２ｂとが積層した基板２、および、本発明の分析試薬を有する。基板２の内部は、第１空間３ｂ、第２空間４、および、第１空間３ｂと第２空間４とを連通する流路５ａを有する。上基板２ａは、第１空間３ｂに対応する箇所に開口部３ａを有し、上基板２ａの開口部３ａと第１空間３ｂとが、試料供給領域３であり、開口部３ａが、試料供給口である。第２空間４が、反応領域４であり、反応領域４に対応する基板２の領域が、検出領域を兼ねる。また、基板２は、開口部５ｃ、および、第２空間４と開口部５ｃとを連通する流路５ｂを有し、開口部５ｃは、空気口となる。
分析用試験片１において、前記本発明の分析試薬は、例えば、前記乾燥試薬である。前記分析試薬の配置部位は、例えば、反応領域４であり、第２空間４に対応する上基板２ａの領域および下基板２ｂの領域の少なくとも一方に配置されている。本発明の分析試薬が、前述のように、２種類以上の乾燥試薬の場合、例えば、第２空間４に対応する上基板２ａの領域および下基板２ｂの領域に、各乾燥試薬が、それぞれ配置されることが好ましい。
基板２の材料は、特に制限されず、例えば、ガラス製、樹脂製等の基板があげられる。基板２における、具体的には、基板２（上基板２ａおよび下基板２ｂ）における反応領域に対応する部位が、検出領域を兼ねることから、透明部材で形成されていることが好ましい。前記透明部材としては、例えば、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＭＭＡ（ポリアクリル樹脂）等があげられる。上基板２ａおよび下基板２ｂの材料は、同じであってもよいし異っていてもよい。
本発明の分析用試験片において、例えば、前記本発明の分析試薬の配置方法は、特に制限されず、本発明の分析方法におけるドライ系の説明を援用できる。すなわち、本発明における前記液体試薬を、前記基板の所望の位置に点着した後、乾燥させることにより、前記乾燥試薬を配置できる。
本発明の分析用試験片は、例えば、以下のように用いることができる。まず、開口部３ａから第一空間３ｂに、前記生体試料を供給する。前記生体試料は、第一空間３ｂから、流路５ａを通って第２空間４（反応領域）に到達する。そして、第２空間４において、前記生体試料と前記配置された前記本発明の分析試薬とが混合され、前記生体試料と前記分析試薬とが反応し、前記発色剤の発色反応が生じる。この発色を、反応領域４に対応する上基板２ａ側から、または、反応領域４に対応する下基板２ｂ側から、測定する。
本発明の分析用試験片の大きさは、特に制限されず、例えば、以下の条件が例示できる。なお、以下、長手方向とは、前記試料供給領域から前記反応領域に向かう方向であり、幅方向とは、前記長手方向に垂直な方向であり、厚み方向とは、上基板から下基板に向かう方向である。
長手方向の長さ（全長）：５〜２０ｍｍ（１０ｍｍ）
幅方向の長さ（幅）：３〜１０ｍｍ（５．１ｍｍ）
厚み方向の長さ（厚み）：０．２５〜３ｍｍ（１ｍｍ）
試料供給領域３の大きさ：
直径１〜８ｍｍ（２．５ｍｍ） 深さ０．１〜１．０ｍｍ（０．２５ｍｍ）
反応領域４の大きさ：
直径１〜８ｍｍ（２．５ｍｍ） 深さ０．１〜１．０ｍｍ（０．２５ｍｍ）
流路５ａの長手方向の長さ：０．２〜１０ｍｍ
長手方向の長さ（全長）：５〜２０ｍｍ（１０ｍｍ）
幅方向の長さ（幅）：３〜１０ｍｍ（５．１ｍｍ）
厚み方向の長さ（厚み）：０．２５〜３ｍｍ（１ｍｍ）
試料供給領域３の大きさ：
直径１〜８ｍｍ（２．５ｍｍ） 深さ０．１〜１．０ｍｍ（０．２５ｍｍ）
反応領域４の大きさ：
直径１〜８ｍｍ（２．５ｍｍ） 深さ０．１〜１．０ｍｍ（０．２５ｍｍ）
流路５ａの長手方向の長さ：０．２〜１０ｍｍ
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
本発明の糖化タンパク質の分析方法について、血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、糖化タンパク質濃度を測定可能であることをフルクトサミンの測定によって確認した。
本発明の糖化タンパク質の分析方法について、血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、糖化タンパク質濃度を測定可能であることをフルクトサミンの測定によって確認した。
（１）試料
フルクトサミン濃度１９８．５μｍｏｌ／Ｌの血清１（尿酸未添加−）およびフルクトサミン濃度５０３μｍｏｌ／Ｌの血清２（尿酸未添加−）と、前記血清１および前記血清２に、それぞれ、２０ｍｇ／１００ｍＬとなるように尿酸を添加した血清１（尿酸添加＋）および血清２（尿酸添加＋）を、血清試料として準備した。
フルクトサミン濃度１９８．５μｍｏｌ／Ｌの血清１（尿酸未添加−）およびフルクトサミン濃度５０３μｍｏｌ／Ｌの血清２（尿酸未添加−）と、前記血清１および前記血清２に、それぞれ、２０ｍｇ／１００ｍＬとなるように尿酸を添加した血清１（尿酸添加＋）および血清２（尿酸添加＋）を、血清試料として準備した。
（２）分析用試薬片の作製
下記組成の第１液体試薬および第２液体試薬を用いて、以下に示すように、前記図１に示す実施例の分析用試験片を作製した。
下記組成の第１液体試薬および第２液体試薬を用いて、以下に示すように、前記図１に示す実施例の分析用試験片を作製した。
＜第１試薬＞
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０） ５００ｍｍｏｌ／Ｌ
（和光純薬工業社製）
ソルビトール １５％（ｗ／Ｖ）
ラウリル酸アミドプロピルベタイン ０．００５％（ｗ／Ｖ）
（商品名：Ａｍｐｈｉｔｏｌ ２０ＡＢ、花王社製）
ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン ０．２５％（ｗ／Ｖ）
（商品名：ＭＥＧＡ−８、同仁化学研究所社製）
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０） ５００ｍｍｏｌ／Ｌ
（和光純薬工業社製）
ソルビトール １５％（ｗ／Ｖ）
ラウリル酸アミドプロピルベタイン ０．００５％（ｗ／Ｖ）
（商品名：Ａｍｐｈｉｔｏｌ ２０ＡＢ、花王社製）
ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン ０．２５％（ｗ／Ｖ）
（商品名：ＭＥＧＡ−８、同仁化学研究所社製）
＜第２試薬＞
ＭＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
（ナカライテスク社製）
発色剤 ５ｍｍｏｌ／Ｌ
（商品名：ＷＳＴ−９、同仁化学研究所社製）
ソルビトール １０％（ｗ／ｖ）
スクロース ５％（ｗ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤 ０．０２％（ｗ／ｖ）
（商品名：Ｔｗｅｅｎ−２０、ナカライテスク社製）
タウロデオキシコール酸ナトリウム ０．５％（ｗ／ｖ）
（商品名：タウロデオキシコール酸ナトリウム、ナカライテスク社製）
アスコルビン酸オキシダーゼ ２００Ｕ／ｍＬ
（商品名：Ａｓｃｏｒｂａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ、ロシュ社製）
ＭＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
（ナカライテスク社製）
発色剤 ５ｍｍｏｌ／Ｌ
（商品名：ＷＳＴ−９、同仁化学研究所社製）
ソルビトール １０％（ｗ／ｖ）
スクロース ５％（ｗ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤 ０．０２％（ｗ／ｖ）
（商品名：Ｔｗｅｅｎ−２０、ナカライテスク社製）
タウロデオキシコール酸ナトリウム ０．５％（ｗ／ｖ）
（商品名：タウロデオキシコール酸ナトリウム、ナカライテスク社製）
アスコルビン酸オキシダーゼ ２００Ｕ／ｍＬ
（商品名：Ａｓｃｏｒｂａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ、ロシュ社製）
上基板２ａの下基板２ｂへの対向面であって、反応領域４に対応する領域に、前記第２試薬１．５μＬを点着した。また、下基板２ｂの上基板２ａへの対向面であって、反応領域４に対応する領域に、前記第１試薬１．５μＬを点着した。そして、上基板２ａおよび下基板２ｂを、２０℃、相対湿度１%の条件下、２０時間乾燥処理を施した。この乾燥処理によって、上基板２ａに、第２乾燥試薬を、下基板２ｂに、第１乾燥試薬を、それぞれ配置した。そして、上基板２ａと下基板２ｂとを積層し、両者を貼り合わせ、図１に示す分析用試験片１を作製した。
分析用試験片１の大きさおよび材質は、以下の通りとした。
上基板および下基板の材質：ポリスチレン（透明部材）
長手方向の長さ（全長）：１０ｍｍ
幅方向の長さ（幅）：５．１ｍｍ
厚み方向の長さ（厚み）：１．２ｍｍ
試料供給領域３の大きさ：直径２．５ｍｍ×深さ０．２５ｍｍ
反応領域４の大きさ：直径２．５ｍｍ×深さ０．２５ｍｍ
流路５ａの長手方向の長さ：１ｍｍ
上基板および下基板の材質：ポリスチレン（透明部材）
長手方向の長さ（全長）：１０ｍｍ
幅方向の長さ（幅）：５．１ｍｍ
厚み方向の長さ（厚み）：１．２ｍｍ
試料供給領域３の大きさ：直径２．５ｍｍ×深さ０．２５ｍｍ
反応領域４の大きさ：直径２．５ｍｍ×深さ０．２５ｍｍ
流路５ａの長手方向の長さ：１ｍｍ
（３）フルクトサミン濃度の測定
前記血清試料を、分析用試験片１の試料供給領域３に添加し、分析用試験片１を乾式臨床化学分析装置（商品名スポットケムＥＺ、アークレイ社製）にセットした。そして、前記試料の添加から４８０秒後を測定開始として、分析用試験片１における反応領域４について、測定波長５５０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。さらに、単位時間あたりの吸光度の変化量を、測定時間ｘの吸光度（Ａｘ）から測定時間ｙの吸光度の差分（Ａｙ−Ａｘ）により算出した。なお、同条件で吸光度を二回測定した場合は、前記差分の平均値を、単位時間当たりの吸光度の変化量として算出した。
前記血清試料を、分析用試験片１の試料供給領域３に添加し、分析用試験片１を乾式臨床化学分析装置（商品名スポットケムＥＺ、アークレイ社製）にセットした。そして、前記試料の添加から４８０秒後を測定開始として、分析用試験片１における反応領域４について、測定波長５５０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。さらに、単位時間あたりの吸光度の変化量を、測定時間ｘの吸光度（Ａｘ）から測定時間ｙの吸光度の差分（Ａｙ−Ａｘ）により算出した。なお、同条件で吸光度を二回測定した場合は、前記差分の平均値を、単位時間当たりの吸光度の変化量として算出した。
他方、比較例１として、発色剤ＷＳＴ−９に代えて、２−（４−インドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ、同仁化学研究所社製）を使用した以外は、同様にして、分析用試験片１を作製した。比較例２として、発色剤ＷＳＴ−９に代えて、２−(２−メトキシ−４−ニトロフェニル)−３−(４−ニトロフェニル)−５−(２,４−ジスルホフェニル)−２H−テトラゾリウム（ＷＳＴ−８、同仁化学研究所製）を使用した以外は、同様にして、分析用試験片１を作製した。また、比較例１に対しては、フルクトサミン濃度１９８．５μｍｏｌ／Ｌの血清１（尿酸未添加−）およびフルクトサミン濃度７８６μｍｏｌ／Ｌの血清３（尿酸未添加−）と、前記血清１および前記血清３に、それぞれ、２０ｍｇ／１００ｍＬとなるように尿酸を添加した血清１（尿酸添加＋）および血清３（尿酸添加＋）を、血清試料として準備した。比較例２に対しては、前記（１）と同様の血清を、血清試料として準備した。そして、比較例１および比較例２の分析用試験片１と、前記各血清試料とを用いて、同様にして、吸光度の測定を行った。比較例１の分析用試験片１については、測定波長を５５０ｎｍとし、比較例２の分析用試験片１については、測定波長を４５０ｎｍとした。
これらの結果を、図２〜図４に示す。図２〜図４は、各分析用試験片を用いた前記発色反応の吸光度の結果を示すグラフである。図２は、実施例１の分析用試験片を用いた結果であり、図３および４は、それぞれ、比較例１および２の分析用試験片を用いた結果を示す。各図において、左列のグラフが、経時的な吸光度を示すグラフであり、右列のグラフが、単位時間当たりの吸光度変化量を示すグラフである。
図２において、（Ａ）は、実施例１の分析用試験片を用いて血清１を分析した結果であり、（Ｂ）は、実施例１の分析用試験片を用いて血清２を分析した結果である。図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＷＳＴ−９を使用した実施例１の場合、尿酸を添加しても、尿酸未添加と同様に、左のグラフにおいて、経過時間と高い相関を示す吸光度の増加が確認でき、また、右のグラフにおいて、単位時間あたりの吸光度変化量にも変動がないことが確認できた。
他方、図３において、（Ａ）は、比較例１の分析用試験片を用いて血清１を分析した結果であり、（Ｂ）は、比較例１の分析用試験片を用いて血清３を分析した結果である。また、図４において、（Ａ）は、比較例２の分析用試験片を用いて血清１を分析した結果であり、（Ｂ）は、比較例２の分析用試験片を用いて血清２を分析した結果である。図３および４に示すように、左のグラフにおいて、尿酸添加の血清試料は、尿酸未添加の血清試料よりも高い吸光度を示し、また、右のグラフにおいて、尿酸添加の血清試料は、尿酸未添加の血清試料よりも、単位時間あたりの吸光度変化量が減少していくという変動が確認された。
これらの結果から、発色剤として、ＷＳＴ−９を使用することによって、尿酸の影響を回避して、優れた精度でフルクトサミンを分析できることがわかった。
［実施例２］
本発明の糖化タンパク質の分析方法について、複数のＷＳＴ−９濃度において、血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、糖化タンパク質濃度を測定可能であることをフルクトサミンの測定によって確認した。
本発明の糖化タンパク質の分析方法について、複数のＷＳＴ−９濃度において、血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、糖化タンパク質濃度を測定可能であることをフルクトサミンの測定によって確認した。
実施例２として、前記第２液体試薬中における発色剤ＷＳＴ−９の濃度を、それぞれ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、７．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび２０ｍｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、それぞれ、ＷＳＴ−９濃度が異なる６種類の分析用試験片１を作製した。また、血清試料として、フルクトサミン濃度２２０．３μｍｏｌ／Ｌの血清４（尿酸未添加−）およびフルクトサミン濃度４８６．５μｍｏｌ／Ｌの血清５（尿酸未添加−）と、前記血清４および前記血清５に、それぞれ、２０ｍｇ／１００ｍＬとなるように尿酸を添加した血清４（尿酸添加＋）および血清５（尿酸添加＋）を準備した。そして、前記ＷＳＴ−９濃度が異なる６種類の分析用試験１と、前記各血清試料とを用いて、前記実施例１と同様にして、吸光度の測定を行った。
これらの結果を、図５および図６に示す。図５Ａおよび図５Ｂは、血清４について、各ＷＳＴ−９濃度における経時的な吸光度を示し、図６Ａおよび図６Ｂは、血清５について、各ＷＳＴ−９濃度における経時的な吸光度を示す。
図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａおよび図６Ｂに示すように、いずれのＷＳＴ−９濃度においても、尿酸を添加しても、尿酸未添加と同様に、経過時間と高い相関を示す吸光度の増加が確認できた。
これらの結果から、複数のＷＳＴ−９濃度において、血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、フルクトサミン濃度を測定可能であることがわかった。
同じように、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンおよび糖化グロブリン等の糖化タンパク質においても血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、濃度を測定可能である。
以上のように、本発明によれば、前記発色剤を含むことにより、血中還元性物質である尿酸の影響を受けずに、糖化タンパク質濃度を測定できる。このため、本発明は、医薬、診断薬、測定等の分野において、極めて有用と言える。
１ 分析用試験片
２ 基板
２ａ 上基板
２ｂ 下基板
３ 試料供給領域
３ａ、５ｃ 開口部
３ｂ 第１空間
４ 第２空間
５ａ、５ｂ 流路
２ 基板
２ａ 上基板
２ｂ 下基板
３ 試料供給領域
３ａ、５ｃ 開口部
３ｂ 第１空間
４ 第２空間
５ａ、５ｂ 流路
Claims (9)
- 下記式（１）で表される発色剤と生体試料とを反応させる反応工程、および、
前記発色剤の発色反応を測定する測定工程を含むことを特徴とする、糖化タンパク質の分析方法。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。 - 前記生体試料が、血液試料である、請求項１記載の分析方法。
- 前記血液試料が、血清試料または血漿試料である、請求項２記載の分析方法。
- 前記反応工程において、乾燥状態の前記発色剤に、液体状態の前記生体試料を添加することにより、両者を反応させる、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記糖化タンパク質はフルクトサミンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
- 下記式（１）で表される発色剤を含み、
請求項１から５のいずれか一項に記載の生体試料中の糖化タンパク質の分析方法に使用することを特徴とする、糖化タンパク質の分析試薬。
前記式（１）中、
Ｘは、アルカリ金属イオンである。 - 請求項６記載の分析試薬を含み、
請求項１から５のいずれか一項に記載の生体試料中の糖化タンパク質の分析方法に使用することを特徴とする、糖化タンパク質の分析キット。 - 基板を含み、
前記基板が、試料供給領域と、反応領域とを有し、
前記試料供給領域と前記反応領域とが、流路で連結され、
前記反応領域に、請求項６記載の分析試薬が配置され、
前記基板における前記反応領域が、透明部材であることを特徴とする、糖化タンパク質の分析用試験片。 - 前記基板が、上基板と下基板とを含む積層体であり、
前記積層体の内部が、第１空間、第２空間、および、前記第１空間と前記第２空間とを連通する前記流路を有し、
前記上基板は、前記第１空間に対応する箇所に開口部を有し、
前記上基板の前記開口部と前記第１空間とが、前記試料供給領域であり、
前記開口部が、試料供給口であり、
前記第２空間が、前記反応領域であり、
前記第２空間に対応する前記上基板の領域および前記下基板の領域の少なくとも一方に、
前記分析試薬が配置されている、請求項８記載の分析用試験片。
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