JP6876988B2 - Method for predicting the risk of bloodstream infection of MRSA using single nucleotide polymorphism of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) cna gene - Google Patents
Method for predicting the risk of bloodstream infection of MRSA using single nucleotide polymorphism of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) cna gene Download PDFInfo
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Description
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の血流感染のリスクを予測する方法に関する。 The present invention relates to a method for predicting the risk of bloodstream infection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)は、1940年代に工業的に量産化に成功したペニシリンに対し、当時良好な感受性を示し、化膿傷や肺炎などの治療に奏効した。しかし、ペニシリンの普及と使用量の増加に伴い、ペニシリン耐性株が世界各地に広がっていった。これに対抗するためメチシリンが開発され、1960年頃より欧米で使用されるようになった。しかしながら、間もなくメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus）が確認され、1970年代後半より海外の医療現場で大きな関心事となった。現在では、臨床分離される黄色ブドウ球菌の6割程度がMRSAと判定される事態に至っている。 Staphylococcus aureus showed good susceptibility to penicillin, which was industrially mass-produced in the 1940s, and was effective in treating purulent wounds and pneumonia. However, with the spread of penicillin and the increase in its usage, penicillin-resistant strains have spread all over the world. To counter this, methicillin was developed and has been used in Europe and the United States since around 1960. However, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was soon confirmed and became a major concern in overseas medical practice from the latter half of the 1970s. At present, about 60% of clinically isolated Staphylococcus aureus is judged to be MRSA.
MRSAの病原性は通常の黄色ブドウ球菌と比較して特に強いわけではなく、それらと同等程度の各種感染症を引き起こす。したがって、通常の感染防御能力を有する人に対しては一般的に無害である。黄色ブドウ球菌と同様に常在菌のひとつと考えられ、健康な人の鼻腔、咽頭、皮膚などからも検出される。 The pathogenicity of MRSA is not particularly strong compared to normal Staphylococcus aureus and causes various infectious diseases to the same extent. Therefore, it is generally harmless to persons with normal infection defense capabilities. Like Staphylococcus aureus, it is considered to be one of the indigenous bacteria and is also detected in the nasal cavity, pharynx, and skin of healthy people.
一般的には内科系より外科系の疾患を有する患者で問題となる場合が多く、例えば開腹開胸手術後の術後感染などで治療困難な例も多い。特に透析等を必要とする血液疾患やガンなどの悪性疾患を基礎疾患に持つ患者ではリスクが高くなる。また、新生児や高齢者などもハイリスクグループとなる。 In general, it is often a problem in patients with surgical diseases rather than internal medicine, and there are many cases in which treatment is difficult due to postoperative infection after open chest surgery, for example. In particular, the risk is high in patients with underlying diseases such as blood diseases requiring dialysis and malignant diseases such as cancer. In addition, newborn babies and the elderly are also high-risk groups.
治療薬としては、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン等の抗MRSA薬が用いられている。しかし、安全域及び有効治療域が狭いため、その血中濃度が有効域に達しないことによる耐性菌出現や、血中濃度を大きく超えてしまうことによる副作用発現の危険性がある。 As a therapeutic agent, anti-MRSA agents such as vancomycin, teicoplanin, and arbekacin are used. However, since the safe range and the effective therapeutic range are narrow, there is a risk of the appearance of resistant bacteria due to the blood concentration not reaching the effective range and the occurrence of side effects due to the blood concentration being greatly exceeded.
MRSAはしばしば血流感染を起こし菌血症を誘発し、さらに重篤な感染症である敗血症を誘発する。MRSAの遺伝子を検出し、MRSA感染の有無を検出する方法は報告されていた（特許文献１及び２を参照）。しかし、感染に大きく関わる臨床症状とMRSAの遺伝子特異性との相関についてはこれまで検討されていなかった。
MRSA often causes bloodstream infections, inducing bloodstream infections, and more serious infections, sepsis. Methods for detecting the MRSA gene and detecting the presence or absence of MRSA infection have been reported (see
本発明は、MRSAの特定の遺伝子の一塩基多型を解析し、MRSAの血流感染のリスクを評価する方法の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for analyzing a single nucleotide polymorphism of a specific gene of MRSA and evaluating the risk of bloodstream infection of MRSA.
本発明者らは、MRSA感染症の発症/保菌とMRSAの遺伝子の関連を探るべく、MRSA株について網羅的遺伝子解析を行い、MRSAの接着やバイオフィルム形成に関与する遺伝子の１つであるcna遺伝子がMRSA感染症の発症/保菌と関連していることを見出した。類似のフェノタイプを有する遺伝子としてsdrC遺伝子、clfa遺伝子、clfb遺伝子、sdrD遺伝子、fnbA遺伝子等があるが、これらの遺伝子群と臨床像との間に関連はなかった。 In order to investigate the relationship between the onset / carriage of MRSA infection and the MRSA gene, the present inventors conducted a comprehensive gene analysis on MRSA strains and performed cna, which is one of the genes involved in MRSA adhesion and biofilm formation. We found that the gene was associated with the development / carriage of MRSA infections. Genes having similar phenotypes include the sdrC gene, clfa gene, clfb gene, sdrD gene, and fnbA gene, but there was no relationship between these genes and the clinical picture.
本発明者らは、クラスター解析により、血流感染を発症しやすいMRSA株群において、MRSAのcna遺伝子に一塩基多型が認められ、一塩基多型部位における変異を有するMRSA株において、血流感染を起こしやすいことを見出した。 The present inventors have found a single nucleotide polymorphism in the cna gene of MRSA in the MRSA strain group that is prone to develop bloodstream infection by cluster analysis, and blood flow in the MRSA strain having a mutation at the single nucleotide polymorphism site. We found that it was prone to infection.
本発明者らは、MRSA株のcna遺伝子の一塩基多型を分析することにより、該MRSA株が血流感染を誘発するリスクを評価、判定し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have found that the risk of inducing bloodstream infection can be evaluated and determined by analyzing a single nucleotide polymorphism of the cna gene of the MRSA strain, and have completed the present invention. It was.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] MRSA（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）のcna遺伝子の変異を検出することを含む、MRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法であって、
a）被験体からMRSAを単離し、該MRSAから核酸試料を調製する工程、
b）前記MRSAのcna遺伝子の変異を検出する工程、
を含み、cna遺伝子の変異が検出された場合にMRSAの血液感染のリスクが高いと評価する、MRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[２] 変異が一塩基多型部位における変異である、[１]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[３] 変異がcna遺伝子がコードするCnaタンパク質のアミノ酸の置換をもたらすものである、[１]又は[２]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[４] 変異がcna遺伝子がコードするCnaタンパク質の機能ドメインのアミノ酸の置換をもたらすものである、[３]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[５] 変異が以下の（１）〜（１７）の少なくとも１つの変異である、[１]又は[２]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基におけるCからAへの変異、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基におけるAからGへの変異、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基におけるGからAへの変異、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基におけるTからCへの変異、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基におけるTからCへの変異、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基におけるTからCへの変異。
That is, the present invention is as follows.
[1] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA, which comprises detecting a mutation in the cna gene of MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus).
a) A step of isolating MRSA from a subject and preparing a nucleic acid sample from the MRSA.
b) Steps to detect mutations in the MRSA cna gene,
A test method for determining the risk of MRSA blood infection, which is evaluated as having a high risk of MRSA blood infection when a mutation in the cna gene is detected.
[2] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to [1], wherein the mutation is a mutation at a single nucleotide polymorphism site.
[3] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to [1] or [2], wherein the mutation results in the substitution of an amino acid in the Cna protein encoded by the cna gene.
[4] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to [3], wherein the mutation results in the substitution of an amino acid in the functional domain of the Cna protein encoded by the cna gene.
[5] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to [1] or [2], wherein the mutation is at least one of the following mutations (1) to (17):
(1) Mutation from C to A at the 2840th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(2) Mutation from G to T at the 2272th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(3) Mutation from G to A at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(4) Mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(5) Mutation from C to A at the 1988th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(6) Mutation from G to T at the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(7) Mutation from G to T at the 194th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(8) Mutation from A to G at the 191st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(9) Mutation from T to A at the 136th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(10) Mutation from C to A at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(11) Mutation from C to T at the 2253th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(12) Mutation from A to G at the 1983th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(13) Mutation from C to T at the 1941th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(14) Mutation from G to A at the 1842th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(15) Mutation from T to C at the 1716th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(16) Mutation from T to C at the 1530th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (17) Mutation from T to C at the 12th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
[６] 変異が以下の（１）〜（１０）の少なくとも１つの変異である、[３]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてA947Dの置換をもたらす変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてG65Vの置換をもたらす変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてN64Sの置換をもたらす変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてS46Tの置換をもたらす変異、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における、CからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてD26Eの置換をもたらす変異。
[6] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to [3], wherein the mutation is at least one of the following mutations (1) to (10):
(1) A mutation from C to A in the 2840th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of A947D in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(2) A mutation from G to T in the 2272th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V758L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A mutation from G to A in the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of E756K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(4) A mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V746I in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(5) A mutation from C to A in the 1988th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of T663K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(6) A mutation from G to T in the 1711th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V571L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(7) A mutation from G to T in the 194th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of G65V in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(8) A mutation from A to G in the 191st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of N64S in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(9) A mutation from T to A in the 136th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of S46T in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2, and (10) sequence. A mutation from C to A at the 78th base of the nucleotide sequence shown by No. 1 that results in a substitution of D26E in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
[７] 変異が以下の（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）の少なくとも１つの変異である、[４]のMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異。
[８] シークエンス解析により変異を検出する、[１]〜[７]のいずれかのMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[９] MRSAが血流感染のリスクが高いと評価された場合に、該MRSAは敗血症を引き起こすリスクが高いと判定する、[１]〜[８]のいずれかのMRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法。
[7] A test for determining the risk of blood infection of MRSA in [4], wherein the mutation is at least one of the following mutations (2), (3), (4), (5) and (6). Method:
(2) A mutation from G to T in the 2272th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V758L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A mutation from G to A in the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of E756K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(4) A mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V746I in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
(5) A mutation from C to A in the 1988th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of T663K in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2, and (6) Sequence. A mutation from G to T at the 1711th base of the nucleotide sequence shown by No. 1 that results in a substitution of V571L in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2.
[8] A test method for determining the risk of blood infection of MRSA according to any one of [1] to [7], which detects mutations by sequence analysis.
[9] When MRSA is evaluated as having a high risk of bloodstream infection, it is determined that the MRSA has a high risk of causing sepsis, and the risk of blood infection of MRSA according to any one of [1] to [8] is determined. Inspection method for judgment.
[１０] 配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の(１)〜(１７)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブ：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における一塩基多型部位、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における一塩基多型部位、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における一塩基多型部位、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における一塩基多型部位、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における一塩基多型部位、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における一塩基多型部位。
[１１] 配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の(１)〜(１０)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブ：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位。
[１２] 配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブ：
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位。
[１３] [１０]〜[１２]のいずれかのプローブ又はその標識物を標識した固定化基板からなるDNAチップ。
[10] An oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site of the following (1) to (17) of the nucleotide sequence of the cna gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Bloodstream infection of MRSA consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the above, a sequence complementary to the partial sequence, or an oligonucleotide consisting of a sequence capable of hybridizing with those sequences under stringent conditions or a label thereof. Probes for performing tests to determine the risk of
(1) Single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(3) Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(5) Single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(6) Single nucleotide polymorphism site in the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(7) Single nucleotide polymorphism site at the 194th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(8) Single nucleotide polymorphism site in the 191st base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(9) Single nucleotide polymorphism site at the 136th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(10) Single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(11) Single nucleotide polymorphism site at the 2253th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(12) Single nucleotide polymorphism site at the 1983th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(13) Single nucleotide polymorphism site in the 1941th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(14) Single nucleotide polymorphism site in the 1842th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(15) Single nucleotide polymorphism site in the 1716th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(16) Single nucleotide polymorphism site at the 1530th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (17) Single nucleotide polymorphism site at the 12th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
[11] An oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site of the following (1) to (10) of the nucleotide sequence of the cna gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Bloodstream infection of MRSA consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the above, a sequence complementary to the partial sequence, or an oligonucleotide consisting of a sequence capable of hybridizing with those sequences under stringent conditions or a label thereof. Probes for performing tests to determine the risk of
(1) Single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(3) Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(5) Single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(6) Single nucleotide polymorphism site in the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(7) Single nucleotide polymorphism site at the 194th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(8) Single nucleotide polymorphism site in the 191st base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(9) Single nucleotide polymorphism site at the 136th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (10) Single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
[12] Includes at least one single nucleotide polymorphism site of (2), (3), (4), (5) and (6) below in the nucleotide sequence of the cna gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1. An oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a sequence complementary to the partial sequence, or a sequence capable of hybridizing with those sequences under stringent conditions. Or a probe consisting of the label for conducting a test to determine the risk of bloodstream infection of MRSA:
(2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(3) Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(5) Single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (6) Single nucleotide polymorphism site at the 1711th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
[13] A DNA chip comprising an immobilized substrate labeled with any of the probes [10] to [12] or a labeled substance thereof.
MRSAのcna遺伝子は、MRSAの接着やバイオフィルム形成に関与する遺伝子であり、cna遺伝子の一塩基多型部位における変異が、MRSAの血流感染の起こしやすさに関連している。従って、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型を分析することにより、MRSAの血流感染を起こすリスクを評価、判定することができる。 The MRSA cna gene is a gene involved in MRSA adhesion and biofilm formation, and mutations in the single nucleotide polymorphism site of the cna gene are associated with the likelihood of MRSA bloodstream infection. Therefore, by analyzing the single nucleotide polymorphism of the cna gene of MRSA, the risk of causing bloodstream infection of MRSA can be evaluated and determined.
特定の被験体から単離したMRSAが血流感染を起こすリスクがあると判定された場合、厳格な除菌を行ったり、あるいは、効果的な抗MRSA薬の投与計画を設計し、未然にMRSAの血流感染を防ぐことが可能になる。 If MRSA isolated from a particular subject is determined to be at risk of developing a bloodstream infection, rigorous eradication or an effective anti-MRSA drug administration plan should be used to prevent MRSA. It becomes possible to prevent bloodstream infection.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、MRSA（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）のcna遺伝子の一塩基多型を検出することにより、MRSAが血流感染を起こすリスクを評価判定する方法である。MRSAの血流感染とは、MRSAが血管内に侵入することをいい、MRSAが血液中に存在している状態を菌血症という。MRSAの血流感染は、カテーテルを介して起こることが多く、カテーテルを介して感染することをカテーテル関連血流感染（CRBSI)という。血流感染したMRSAによる感染症を敗血症といい、敗血症に罹患した患者の死亡率は高い。すなわち、MRSAが血流感染を起こした場合、敗血症を発症するリスクが高まる。本発明により、MRSAが血流感染するリスク、MRSA菌血症となるリスク、及びMRSAが敗血症を誘発するリスクを評価判定することができる。さらに、本発明において、敗血症の重症化のリスクの評価、判定も行うことができる。 The present invention is a method for evaluating and determining the risk of MRSA causing bloodstream infection by detecting a single nucleotide polymorphism of the cna gene of MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Bloodstream infection of MRSA means that MRSA invades blood vessels, and the state in which MRSA is present in blood is called bloodstream disease. Bloodstream infection of MRSA often occurs via a catheter, and infection via a catheter is called catheter-related bloodstream infection (CRBSI). Infection caused by MRSA that is transmitted through the bloodstream is called sepsis, and the mortality rate of patients with sepsis is high. That is, when MRSA causes a bloodstream infection, the risk of developing sepsis increases. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, the risk of MRSA infection in the bloodstream, the risk of MRSA bloodstream, and the risk of MRSA inducing sepsis can be evaluated and determined. Further, in the present invention, it is possible to evaluate and determine the risk of aggravation of sepsis.
cna遺伝子領域は，細菌の接着・バイオフィルム形成に関与する遺伝子のひとつである。MRSAは株によっては、cna遺伝子領域を欠失しており、cna遺伝子領域を有するMRSAについてcna遺伝子の一塩基多型を調べればよい。 The cna gene region is one of the genes involved in bacterial adhesion and biofilm formation. Some strains of MRSA lack the cna gene region, and single nucleotide polymorphisms of the cna gene may be examined for MRSA having the cna gene region.
本発明においては、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型（SNPs）を分析し一塩基多型部位におけるcna遺伝子の変異を検出し、MRSAが血流感染を起こすリスク、MRSA菌血症となるリスク、又はMRSAが敗血症を誘発するリスクを評価判定するための検査を行い、MRSAが血流感染を起こすリスク、MRSA菌血症となるリスク、又はMRSAが敗血症を誘発するリスクを予測、評価、判定するための補助的データを取得する。評価、判定とは予測ともいう。 In the present invention, the monobase polymorphisms (SNPs) of the cna gene of MRSA are analyzed to detect the mutation of the cna gene at the site of the monobasic polymorphism, and the risk of MRSA causing bloodstream infection and the risk of MRSA bacteremia. , Or, perform tests to assess and determine the risk of MRSA inducing sepsis to predict, assess, and determine the risk of MRSA causing bloodstream infections, MRSA mycemia, or MRSA inducing sepsis. Get auxiliary data to do. Evaluation and judgment are also called prediction.
本発明者らは、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型（SNPs)が血流感染の起こしやすさと関連していることを見出し、本発明を完成させたが、ここで血流感染の起こしやすさと関連しているとは、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型部位の変異とMRSAの血流感染のしやすさとが統計学的に関連していることをいう。 The present inventors have found that single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the cna gene of MRSA are associated with the susceptibility to bloodstream infection, and completed the present invention. When it is associated with, it means that the mutation of the single nucleotide polymorphism site of the cna gene of MRSA is statistically related to the susceptibility to bloodstream infection of MRSA.
一塩基多型の分析は、一塩基多型部位の塩基の種類、すなわちアレルを決定することをいい、１対の染色体上の一方の染色体について検出する場合も、両方の染色体について検出する場合も包含され、両方の染色体について検出する場合にも、一塩基多型部位においてホモ接合性かヘテロ接合性かの検出を含む。MRSA株から単離した試料に含まれる特定のアレルに対立する各々のアレルを検出し、遺伝子型を決定することができる。あるアレルのみが検出された場合は当該アレルをホモに有するホモ接合性であり、２つのアレルが検出された場合には該２つのアレルをヘテロに有するヘテロ接合性である。 Analysis of single nucleotide polymorphism refers to determining the type of base of a single nucleotide polymorphism site, that is, an allele, and may detect one chromosome on a pair of chromosomes or both chromosomes. Included and detected for both chromosomes also includes detection of homozygous or heterozygous for single nucleotide polymorphism sites. Each allele that opposes a particular allele contained in a sample isolated from the MRSA strain can be detected and genotyped. When only a certain allele is detected, it is homozygous having the allele homozygous, and when two alleles are detected, it is heterozygous having the two alleles heterozygously.
本発明の方法においては、被験体からMRSAを単離し、該MRSAのcna遺伝子における一塩基多型部位の変異の有無を検出する。被験体から採取した菌がMRSAであるか否かは、公知の薬剤感受性を測定する方法、PBP2'（penicillin binding protein 2'）を検出する方法又はmecA遺伝子を検出する方法により判断することができる。薬剤感受性測定は、ディスク拡散法、Etest、微量液体希釈法等により行うことができる。 In the method of the present invention, MRSA is isolated from a subject and the presence or absence of a mutation in a single nucleotide polymorphism site in the cna gene of the MRSA is detected. Whether or not the bacterium collected from the subject is MRSA can be determined by a known method for measuring drug susceptibility, a method for detecting PBP2'(penicillin binding protein 2'), or a method for detecting the mecA gene. .. The drug susceptibility measurement can be performed by a disc diffusion method, an Etest, a trace liquid dilution method, or the like.
具体的には、cna遺伝子の以下の（１）〜（１７）の一塩基多型の少なくとも１つの一塩基多型を分析する。cna遺伝子の塩基配列を配列番号１に、cna遺伝子がコードするCnaタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に表す。cna遺伝子のセンス鎖の塩基配列は、MRSAゲノムのアンチセンス鎖の塩基配列の2809884番目の塩基から2812874番目の塩基配列に相当する。以下の（１）〜（１７）において「2810035：G>T」等の記載は、MRSAゲノムのアンチセンス鎖の配列中の塩基番号を示すとともに、アンチセンス鎖のGがTに変異していることを示す。cna遺伝子のセンス鎖においては、例えば、「2810035：G>T」で表される一塩基多型部位の変異は配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における多型であり、CのAへの変異になる。図２においても同様に「2810035：G>T」等で一塩基多型部位の変異を示しているが、図２の各変異は下の（１）〜（１７）の変異である。 Specifically, at least one single nucleotide polymorphism of the following (1) to (17) single nucleotide polymorphisms of the cna gene is analyzed. The nucleotide sequence of the cna gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the Cna protein encoded by the cna gene is shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence of the sense strand of the cna gene corresponds to the base sequence of positions 2809884 to 2812874 of the base sequence of the antisense strand of the MRSA genome. In the following (1) to (17), the description such as "2810035: G> T" indicates the base number in the sequence of the antisense strand of the MRSA genome, and the G of the antisense strand is mutated to T. Show that. In the sense strand of the cna gene, for example, the mutation at the single nucleotide polymorphism site represented by "2810035: G> T" is the polymorphism at the 2840th base of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1, and is C. It becomes a mutation to A. Similarly, in FIG. 2, mutations in the single nucleotide polymorphism site are shown by “2810035: G> T” and the like, but each mutation in FIG. 2 is a mutation in (1) to (17) below.
（１）2810035:G>T
配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はA（変異型）である。
（２）2810603:C>A
配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はT（変異型）である。
（３）2810609:C>T
配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はA（変異型）である。
（４）2810639:C>T
配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はA（変異型）である。
（５）2810887:G>T
配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はA（変異型）である。
（６）2811164:C>A
配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はT（変異型）である。
（７）2812681:C>A
配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はT（変異型）である。
（８）2812684:T>C
配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における多型をいい、A（野生型）又はG（変異型）である。
（９）2812739:A>T
配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はA（変異型）である。
（１０）2812797:G>T
配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はA（変異型）である。
（１１）2810622:G>A
配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はT（変異型）である。
（１２）2810892:T>C
配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における多型をいい、A（野生型）又はG（変異型）である。
（１３）2810934:G>A
配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における多型をいい、C（野生型）又はT（変異型）である。
（１４）2811033:C>T
配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における多型をいい、G（野生型）又はA（変異型）である。
（１５）2811159:A>G
配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はC（変異型）である。
（１６）2811345:A>G
配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はC（変異型）である。
（１７）2812863:A>G
配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における多型をいい、T（野生型）又はC（変異型）である。
(1) 2810035: G> T
It refers to a polymorphism at the 2840th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is C (wild type) or A (mutant type).
(2) 2810603: C> A
It refers to a polymorphism at the 2272th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or T (mutant type).
(3) 2810609: C> T
It refers to a polymorphism at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or A (mutant type).
(4) 2810639: C> T
It refers to a polymorphism at the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or A (mutant type).
(5) 2810887: G> T
It refers to a polymorphism at the 1988th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is C (wild type) or A (mutant type).
(6) 2811164: C> A
It refers to a polymorphism at the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or T (mutant type).
(7) 2812681: C> A
It refers to a polymorphism at the 194th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or T (mutant type).
(8) 2812684: T> C
It refers to a polymorphism at the 191st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is A (wild type) or G (mutant type).
(9) 2812739: A> T
It refers to a polymorphism at the 136th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, and is T (wild type) or A (mutant type).
(10) 2812797: G> T
It refers to a polymorphism at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is C (wild type) or A (mutant type).
(11) 2810622: G> A
It refers to a polymorphism in the 2253th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is C (wild type) or T (mutant type).
(12) 2810892: T> C
It refers to a polymorphism at the 1983th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is A (wild type) or G (mutant type).
(13) 2810934: G> A
It refers to a polymorphism in the 1941th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, and is C (wild type) or T (mutant type).
(14) 2811033: C> T
It refers to a polymorphism in the 1842th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is G (wild type) or A (mutant type).
(15) 2811159: A> G
It refers to a polymorphism at the 1716th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is T (wild type) or C (mutant type).
(16) 2811345: A> G
It refers to a polymorphism at the 1530th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is T (wild type) or C (mutant type).
(17) 2812863: A> G
It refers to a polymorphism at the 12th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1, and is T (wild type) or C (mutant type).
上記一塩基多型部位における塩基の変異を検出すればよい。
これら17の一塩基多型のうち、（１）〜（１０）の変異は以下のCnaタンパク質のアミノ酸変異を伴うミスセンス変異である（図９〜１１）。
It suffices to detect the mutation of the base in the above single nucleotide polymorphism site.
Of these 17 single nucleotide polymorphisms, the mutations (1) to (10) are missense mutations accompanied by the following amino acid mutations in the Cna protein (FIGS. 9 to 11).
（１）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の947番目のアラニン（A）のアスパラギン酸（D)への置換（A947D)
（２）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の758番目のバリン（V）のロイシン（L)への置換（V758L)
（３）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の756番目のグルタミン酸（E）のリジン（K)への置換（E756K)
（４）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の746番目のバリン（V）のイソロイシン（I)への置換（V746I)
（５）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の663番目のトレオニン（T）のリジン（K)への置換（T663K)
（６）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列の571番目のバリン（V）のロイシン（I)への置換（V571L)
（７）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の65番目のグリシン（G）のバリン（V)への置換（G65V)
（８）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の64番目のアスパラギン（N）のセリン（S)への置換（N64S)
（９）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の46番目のセリン（S）のトレオニン（T)への置換（S46T)
（１０）配列番号２に表すCnaタンパク質のアミノ酸配列のCnaタンパク質の26番目のアスパラギン酸（D）のグルタミン酸（E)への置換（D26E)
(1) Substitution of alanine (A) at position 947 with aspartic acid (D) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (A947D)
(2) Substitution of valine (V) at position 758 with leucine (L) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (V758L)
(3) Substitution of glutamic acid (E) at position 756 with lysine (K) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (E756K)
(4) Substitution of valine (V) at position 746 with isoleucine (I) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (V746I)
(5) Substitution of threonine (T) at position 663 with lysine (K) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (T663K)
(6) Substitution of valine (V) at position 571 with leucine (I) in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 (V571L)
(7) Substitution of the 65th glycine (G) of the Cna protein in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with valine (V) (G65V)
(8) Substitution of the 64th asparagine (N) of the Cna protein in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with serine (S) (N64S)
(9) Substitution of serine (S) at position 46 of the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with threonine (T) (S46T)
(10) Substitution of the 26th aspartic acid (D) of the Cna protein in the amino acid sequence of the Cna protein represented by SEQ ID NO: 2 with glutamic acid (E) (D26E)
このうち、（２）V758L、（３）E756K、（４）V746I、（５）T663K及び（６）V571Lの５つの変異は、配列番号２に表されるアミノ酸配列の第533番目から905番目の配列からなるCnaタンパク質の機能ドメインにおける変異である（図１１）。 Of these, the five mutations (2) V758L, (3) E756K, (4) V746I, (5) T663K and (6) V571L are the 533rd to 905th amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2. It is a mutation in the functional domain of the Cna protein consisting of a sequence (Fig. 11).
MRSAのcna遺伝子において、上記（１）〜（１７）の一塩基多型部位における少なくとも１つの塩基の野生型から変異型への変異を検出すればよい。特に、Cnaタンパク質のアミノ酸の置換を伴う（１）〜（１０）の変異を検出することが好ましく、さらに、Cnaタンパク質の機能ドメインに存在するアミノ酸の置換を伴う（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）の変異を検出すればよい。すなわち、（１）〜（１７）の一塩基多型部位における、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個若しくは又は17個の部位における変異を検出すればよく、あるいは、（１）〜（１０）の一塩基多型部位における、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは10個の部位における変異を検出すればよく、あるいは、（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）の一塩基多型部位における、１個、２個、３個、４個若しくは５個の部位における変異を検出すればよい。 In the cna gene of MRSA, the mutation of at least one base from the wild type to the mutant type at the single nucleotide polymorphism sites (1) to (17) above may be detected. In particular, it is preferable to detect mutations (1) to (10) associated with amino acid substitutions of the Cna protein, and further, with amino acid substitutions present in the functional domain of the Cna protein (2), (3), ( 4), (5) or (6) mutation may be detected. That is, in the single nucleotide polymorphism sites (1) to (17), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 11, Mutations at 12, 13, 14, 15, 16 or 17 sites may be detected, or 1, 2 at single nucleotide polymorphism sites (1) to (10). Mutations at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 sites may be detected, or (2), (3), (4), (5). ) Or (6), mutations at 1, 2, 3, 4, or 5 sites in the single nucleotide polymorphism site may be detected.
また、MRSAのcna遺伝子がコードするCnaタンパク質における（１）〜（１０）の一塩基多型により生じるアミノ酸の変異を検出してもよく、好ましくは（２）、（３）、（４）、（５）又は（６）の一塩基多型により生じるアミノ酸変異を検出すればよい。 In addition, mutations in amino acids caused by single nucleotide polymorphisms (1) to (10) in the Cna protein encoded by the cna gene of MRSA may be detected, preferably (2), (3), (4), and so on. The amino acid mutation caused by the single nucleotide polymorphism of (5) or (6) may be detected.
上記のcna遺伝子の一塩基多型部位に変異がある場合、MRSAは血流感染を起こすリスクが高く、菌血症を誘発するリスクが高く、さらに敗血症を誘発するリスクが高いと評価判定することができる。 If there is a mutation in the single nucleotide polymorphism site of the above cna gene, MRSA has a high risk of causing bloodstream infection, a high risk of inducing bloodstream infections, and a high risk of inducing sepsis. Can be done.
また、上記一塩基多型の代わりに、上記一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を分析してもよい。上記一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型とは、上記遺伝子多型と関連性のある遺伝子多型であり、具体的には、上記遺伝子多型がＸである場合には、常に別の遺伝子多型がＹとなるという関係が成立するものである。 Further, instead of the single nucleotide polymorphism, a single nucleotide polymorphism that is in linkage disequilibrium with the single nucleotide polymorphism may be analyzed. The single nucleotide polymorphism that is in a chain imbalance with the single nucleotide polymorphism is a gene polymorphism that is related to the gene polymorphism. Specifically, when the gene polymorphism is X, The relationship that another gene polymorphism is always Y is established.
本発明において、上記の（１）〜（１７）の一塩基多型は、被験体に感染したMRSAが血流感染するリスク、MRSA菌血症となるリスク、及びMRSAが敗血症を誘発するリスクを判定するための遺伝子マーカーということができる。 In the present invention, the single nucleotide polymorphisms (1) to (17) above pose a risk of bloodstream infection of MRSA infected with a subject, a risk of MRSA bloodstream, and a risk of MRSA inducing sepsis. It can be said to be a genetic marker for determination.
本発明の方法においては、最初に被験体から試料を採取し、該試料中のMRSAの存在を確認する。試料としては、咽頭若しくは鼻腔ぬぐい液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、便、便懸濁液、尿、痰等が挙げられる。単離したMRSA株のcna遺伝子の上記の一塩基多型を分析する。cna遺伝子の一塩基多型の分析の前に、単離したMRSAがcna遺伝子領域を有しているか否かを検出してもよい。MRSAがcna遺伝子領域を有していない場合、以後の一塩基多型の分析を行う必要はない。 In the method of the present invention, a sample is first taken from a subject and the presence of MRSA in the sample is confirmed. Examples of the sample include pharyngeal or nasal swab, pharyngeal or nasal lavage fluid, nasal suction fluid, saliva, stool, stool suspension, urine, sputum and the like. The above single nucleotide polymorphism of the cna gene of the isolated MRSA strain is analyzed. Prior to analysis of single nucleotide polymorphisms in the cna gene, it may be detected whether the isolated MRSA has a cna gene region. If MRSA does not have a cna gene region, it is not necessary to perform subsequent single nucleotide polymorphism analysis.
MRSAのcna遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、サンガー法、ジデオキシ法、サイクルシークエンス法、Maxam-Gilbert法（化学分解法）等の公知の方法により直接配列決定するシークエンス解析による解析法、遺伝子多型に特異的なプローブや該プローブを固定化したマイクロアレイ（DNAチップ）などを用いるハイブリダイゼーション法、遺伝子多型に特異的なプライマーを用いる種々の方法があげられ、さらに具体的に、PCR法、LAMP法、制限断片長多型（RFLP）を利用する方法、NASBA法、LCR法、SDA法、変性勾配ゲル電気泳動法（DGGE）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（CCM）、プライマー伸長法（TaqMan（登録商標）法）、PCR-SSCP法、SNaPshot法、MassArray法、一本鎖コンフォメーション多型解析（SSCP;single strand conformation polymorphism）、Invader法、シングルヌクレオチドプライマー法、Pyrosequncing法、SNP-IT法、BeadArray法、Scorpion法、MADI-TOF/MS法等が挙げられる。 Analysis of single nucleotide polymorphisms in the cna gene of MRSA can be performed by ordinary gene polymorphism analysis methods. For example, an analysis method by sequence analysis in which direct sequencing is performed by a known method such as the Sanger method, the dideoxy method, the cycle sequence method, or the Maxam-Gilbert method (chemical decomposition method), a probe specific to a gene polymorphism, or a probe thereof is fixed. Examples include a hybridization method using a single-strand conformation (DNA chip), and various methods using primers specific for gene polymorphism. More specifically, PCR method, LAMP method, and restricted fragment length polymorphism (RFLP). Method using, NASBA method, LCR method, SDA method, modified gradient gel electrophoresis method (DGGE), method using chemical cleavage of mismatch site (CCM), primer extension method (TaqMan® method), PCR-SSCP method, SNaPshot method, MassArray method, single-strand conformation polymorphism (SSCP), Invader method, single-nucleotide primer method, Pyrosequncing method, SNP-IT method, BeadArray method, Scorpion method, The MADI-TOF / MS method, etc. can be mentioned.
また、シークエンス解析による解析法の１つとして、数千万のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定することができる次世代シーケンサー（第２世代シーケンサー）を用いた方法も利用できる。次世代シーケンサーとしては、Genome Sequencer FLX(GD FLX）（Roche社）、Illumina HiSeq/MiSeq（Illumina社）、Genome Analyzer IIx(GAIIx)（Illumina社）等を用いることができる。 Further, as one of the analysis methods by sequence analysis, a method using a next-generation sequencer (second-generation sequencer) capable of determining the base sequences of tens of millions of DNA fragments in parallel can also be used. As the next-generation sequencer, Genome Sequencer FLX (GD FLX) (Roche), Illumina HiSeq / MiSeq (Illumina), Genome Analyzer IIx (GAIIx) (Illumina) and the like can be used.
シークエンス解析による解析法は公知の方法で行えばよく、具体的には、一塩基多型部位の５’側の数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、一塩基多型部位の塩基を決定すればよい。 The analysis method by sequence analysis may be performed by a known method. Specifically, a sequence reaction is performed using a primer set at a position of several tens of bases on the 5'side of the single nucleotide polymorphism site, and the analysis result is obtained. Therefore, the base of the single nucleotide polymorphism site may be determined.
プローブやマイクロアレイを用いる方法は、一塩基多型部位を含むcna遺伝子配列の一部配列に対応するオリゴヌクレオチド又はその相補的配列、或いはそれらの配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いて行うことができる。すなわち、MRSAから単離した核酸試料、あるいは単離核酸試料をPCR等の公知の方法により増幅した核酸試料とプローブとをハイブリダイゼーションさせ分析すればよい。ハイブリダイゼーションの条件は、一塩基多型を区別するのに足りる条件である。例えば遺伝子多型部位が特定の塩基の場合にはハイブリダイズするが、他の塩基の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件が挙げられる。このような条件は当業者ならば適宜設定することができる。一例として、ストリンジェントな条件としては、約5〜6×SSC中において、約60℃以上、好ましくは約65℃以上、さらに好ましくは約70℃以上でハイブリダイゼーションを行う条件をいう。また、ストリンジェントな条件は、約0.1〜1×SSC中において、約40〜70℃、好ましくは約50〜67℃、さらに好ましくは約60〜65℃で洗浄処理を行うことを含むものであってもよい。 The method using a probe or a microarray is an oligonucleotide consisting of an oligonucleotide corresponding to a partial sequence of the cna gene sequence containing a single nucleotide polymorphism site or a complementary sequence thereof, or a sequence that hybridizes to those sequences under stringent conditions. This can be done using a probe consisting of nucleotides. That is, the nucleic acid sample isolated from MRSA or the nucleic acid sample obtained by amplifying the isolated nucleic acid sample by a known method such as PCR may be hybridized and analyzed. Hybridization conditions are sufficient to distinguish single nucleotide polymorphisms. For example, when the gene polymorphism site is a specific base, it hybridizes, but when it is another base, it does not hybridize, for example, a stringent condition. Such conditions can be appropriately set by those skilled in the art. As an example, a stringent condition refers to a condition in which hybridization is performed in about 5 to 6 × SSC at about 60 ° C. or higher, preferably about 65 ° C. or higher, and more preferably about 70 ° C. or higher. Further, the stringent condition includes performing the cleaning treatment in about 0.1 to 1 × SSC at about 40 to 70 ° C., preferably about 50 to 67 ° C., and more preferably about 60 to 65 ° C. You may.
プローブの一端を基板に固定することによりDNAチップ（マイクロアレイ）を作製し、該DNAチップを用いてもよい。この場合、DNAチップには、１つの遺伝子多型部位に対応するプローブのみが固定されていても、複数の遺伝子多型部位に対応するプローブが固定されていてもよい。プローブを固定化する基板としては、ニトロセルロース膜、スライドガラス、マイクロビーズ等が挙げられる。DNAチップを作製する際、プローブとなるオリゴヌクレオチドは基板上で合成してもよく、あるいは合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化することもできる。市販のアレイヤー等を用いることによりプローブであるオリゴヌクレオチドを吸着や共有結合を利用して固定化することできる。このようなDNAチップを用いた遺伝子多型の検出は、例えば「DNAマイクロアレイと最新PCR法」、村松正明及び那波浩之監修、秀潤社、2000年、第10章などに記載されている。一塩基多型を検出するためのプローブは、蛍光物質、酵素、化学発光物質、放射性同位体等で標識されていてもよい。標識は、フルオレセイン、Cy3、Cy5、ローダミン等の公知の標識物質を用い、公知の方法で行うことができる。 A DNA chip (microarray) may be prepared by fixing one end of the probe to a substrate, and the DNA chip may be used. In this case, the DNA chip may have only a probe corresponding to one gene polymorphism site fixed, or a probe corresponding to a plurality of gene polymorphism sites may be fixed. Examples of the substrate on which the probe is immobilized include a nitrocellulose membrane, a slide glass, microbeads, and the like. When producing a DNA chip, the oligonucleotide used as a probe may be synthesized on a substrate, or the synthesized oligonucleotide may be immobilized on the substrate. By using a commercially available layerer or the like, the oligonucleotide which is a probe can be immobilized by utilizing adsorption or covalent bond. Detection of gene polymorphisms using such DNA chips is described in, for example, "DNA Microarray and Latest PCR Method", supervised by Masaaki Muramatsu and Hiroyuki Nawa, Shujunsha, 2000, Chapter 10. The probe for detecting a single nucleotide polymorphism may be labeled with a fluorescent substance, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radioisotope or the like. Labeling can be performed by a known method using a known labeling substance such as fluorescein, Cy3, Cy5, or rhodamine.
cna遺伝子の一塩基多型を検出するためのプローブは、一塩基多型の配列情報に基づいて適宜設計することができる。プローブとしては、cna遺伝子の一塩基多型部位を含む塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列、あるいはそれらの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列からなる、塩基長が5〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは10〜25のヌクレオチドを用いることができる。 A probe for detecting a single nucleotide polymorphism of the cna gene can be appropriately designed based on the sequence information of the single nucleotide polymorphism. The probe consists of a base sequence containing a single nucleotide polymorphism site of the cna gene, a base sequence complementary to the base sequence, or a sequence capable of hybridizing to those sequences under stringent conditions, and has a base length of 5. ~ 50, preferably 10-30, more preferably 10-25 nucleotides can be used.
本発明の方法で用いるプローブとして、配列番号１で表されるMRSAのcna遺伝子の塩基配列の以下の(１)〜(１７)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブが挙げられる。 The probe used in the method of the present invention is an oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site (1) to (17) below in the nucleotide sequence of the cna gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1. It consists of an oligonucleotide consisting of a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, a sequence complementary to the partial sequence, or an oligonucleotide or a label thereof consisting of a sequence capable of hybridizing with those sequences under stringent conditions. , Probes for performing tests to determine the risk of bloodstream infection of MRSA.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における一塩基多型部位
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における一塩基多型部位
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における一塩基多型部位
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における一塩基多型部位
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における一塩基多型部位
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における一塩基多型部位
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における一塩基多型部位
(1) Single-base polymorphic site at the 2840th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (2) Single-base polymorphic site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (3) SEQ ID NO: 1 Single-base polymorphic site at the 2266th base of the base sequence shown by (4) Single-base polymorphic site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (5) Single-base polymorphic site at the 1988th base (6) Single-base polymorphic site at the 1711th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (7) One at the 194th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1. Base polymorphic site (8) Single-base polymorphic site at the 191st base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (9) Single-base polymorphic site at the 136th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (10) ) Single-base polymorphic site at the 78th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (11) Single-base polymorphic site at the 2253th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (12) Shown by SEQ ID NO: 1. Single-base polymorphic site at the 1983th base of the base sequence (13) Single-base polymorphic site at the 1941th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (14) 1842th of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1. (15) Single-base polymorphic site at the 1716th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 (16) Single-base polymorphic site at the 1530th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1. Type site (17) Single-base polymorphic site at the 12th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
この中でも、(１)〜(１０)の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブが好ましく、（２）、（３）、（４）、（５）及び（６）の少なくとも１つの一塩基多型部位を含むオリゴヌクレオチドであって、配列番号１の塩基配列の５〜30塩基からなる部分配列又はその部分配列に相補的な配列、或いはそれらの配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る配列からなるオリゴヌクレオチド又はその標識物からなる、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査を行うためのプローブがさらに好ましい。 Among these, an oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site of (1) to (10), which is complementary to a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof. Probes consisting of sequences, or oligonucleotides consisting of sequences capable of hybridizing with those sequences under stringent conditions, or labeling thereof, for performing tests to determine the risk of bloodstream infection of MRSA are preferred ( An oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site according to 2), (3), (4), (5) and (6), which is a partial sequence consisting of 5 to 30 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 1. Or a test for determining the risk of bloodstream infection of MRSA, which consists of an oligonucleotide consisting of a sequence complementary to the partial sequence thereof, or a sequence capable of hybridizing with those sequences under stringent conditions, or a label thereof. Probes for doing so are more preferred.
プライマーを用いる方法は、一塩基多型部位を含むMRSAのcna遺伝子配列の一部にアニーリングするプライマーを用いて、被験体から単離したMRSAの核酸を増幅させて行う。プライマーは、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型部位の塩基を同定できるプライマーであり、cna遺伝子の一塩基多型部位を含む配列を有する領域を増幅することのできる配列である。このようなプライマーは、一塩基多型部位を含む配列を含んでいてもよく、また一塩基多型部位を含む領域の3’側と5’側の両端に設定されたフォワードプライマーとリバースプライマーのプライマー対であってもよい。プライマーとしては、cna遺伝子の一塩基多型部位を含む塩基配列又は該塩基配列に相補的な塩基配列或いはストリンジェント条件下でそれらの配列にハイブリダイズし得る塩基長5〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは15〜25であるヌクレオチドを用いることができる。 The method using a primer is performed by amplifying the nucleic acid of MRSA isolated from a subject by using a primer that anneals a part of the cna gene sequence of MRSA containing a single nucleotide polymorphism site. The primer is a primer capable of identifying the base of the single nucleotide polymorphism site of the cna gene of MRSA, and is a sequence capable of amplifying a region having a sequence containing the single nucleotide polymorphism site of the cna gene. Such a primer may contain a sequence containing a single nucleotide polymorphism site, and may be a forward primer and a reverse primer set at both ends on the 3'side and 5'side of the region containing the single nucleotide polymorphism site. It may be a primer pair. As a primer, a base sequence containing a single nucleotide polymorphism site of the cna gene, a base sequence complementary to the base sequence, or a base length of 5 to 50, preferably 10 to 10, which can hybridize to those sequences under stringent conditions. Nucleotides of 30, more preferably 15-25 can be used.
上記のプローブ又はプライマーはMRSAのcna遺伝子の塩基配列の一塩基多型部位を含む連続した塩基配列において、数個、好ましくは１個又は２個、特に好ましくは１個のミスマッチを有していてもよい。 The above probe or primer has several, preferably one or two, and particularly preferably one, mismatches in a continuous base sequence containing a single nucleotide polymorphism site in the base sequence of the MRSA cna gene. May be good.
本発明は、MRSAのcna遺伝子の一塩基多型を分析するために用いるプローブ及び一塩基多型を分析するために一塩基多型部位を含むDNA断片の増幅に用いるプライマー、好ましくは、少なくとも一対のプライマーセットを包含する。また、本発明はプローブを固定化したDNAチップをも包含する。さらに、プローブ、DNAチップ、プライマー等を含むcna遺伝子の一塩基多型部位を解析するためのキットも包含する。該キットは、他に一塩基多型の解析に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、核酸標識分子、緩衝液、該キットの取扱説明書等を含んでいてもよい。 The present invention relates to a probe used to analyze a single nucleotide polymorphism in the cna gene of MRSA and a primer used to amplify a DNA fragment containing a single nucleotide polymorphism site to analyze a single nucleotide polymorphism, preferably at least a pair. Includes the primer set of. The present invention also includes a DNA chip on which a probe is immobilized. It also includes a kit for analyzing single nucleotide polymorphism sites of the cna gene, including probes, DNA chips, primers and the like. The kit may also include restriction enzymes, polymerases, nucleoside triphosphates, nucleic acid-labeled molecules, buffers, instruction manuals and the like used for analysis of single nucleotide polymorphisms.
Cnaタンパク質の変異の検出は、被験体から単離したMRSAよりタンパク質を抽出し、該タンパク質中にアミノ酸の変異を有するCnaタンパク質が存在するか否かを調べればよい。例えば、変異アミノ酸を有するCnaタンパク質とは結合するが、変異を有しない野生型のCnaタンパク質と結合しない抗Cnaタンパク質抗体を用いて抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ法により変異タンパク質を検出することができる。抗原抗体反応を利用したイムノアッセイとしては、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、イムノドットブロット、イムノクロマトグラフィー、ラテックス等の粒子を利用した凝集法、ウエスタンブロット等が挙げられる。また、Cnaタンパク質を単離し、アミノ酸配列を決定し、変異アミノ酸を有するか否かを調べてもよい。 To detect a mutation in a Cna protein, a protein may be extracted from MRSA isolated from a subject, and it may be examined whether or not a Cna protein having an amino acid mutation is present in the protein. For example, a mutant protein can be detected by an immunoassay method utilizing an antigen-antibody reaction using an anti-Cna protein antibody that binds to a Cna protein having a mutant amino acid but does not bind to a wild-type Cna protein that does not have a mutation. .. Examples of the immunoassay using the antigen-antibody reaction include ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), immunodot blot, immunochromatography, agglutination method using particles such as latex, and Western blotting. Alternatively, the Cna protein may be isolated, the amino acid sequence determined, and whether or not it has a mutated amino acid.
特定の被験体から単離したMRSAが血流感染を起こすリスクがあると判定された場合、厳格な除菌を行うことにより未然にMRSAの血流感染を防ぐことができる。特にカテーテルを介した血流感染がしばしば起こることに鑑み、カテーテルの除菌は効果的である。さらに、効果的な抗MRSA薬の投与計画を設計し、未然にMRSAの血流感染を防ぐことも可能になる。 When MRSA isolated from a specific subject is determined to be at risk of developing bloodstream infection, strict eradication can prevent MRSA from bloodstream infection. Eradication of catheters is effective, especially in view of the frequent occurrence of catheter-mediated bloodstream infections. In addition, it will be possible to design effective anti-MRSA drug dosing regimens and prevent MRSA bloodstream infections.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
対象と方法
患者背景およびMRSA採取
MRSAは1998年から2003年までに金沢大学附属病院にて加療を受けた患者より分離・培養された96株を用いた。グラム染色およびスタフィスライドテストを用いたコアグラーゼ産生試験によりMRSAを同定した。薬剤感受性はMicroScan WalkAway 96Plus (SIEMENS, Munich)を用いて計測した。毒素の同定には、SET-RPLA, EXT-RPLA及びTST-RPLA (DENKA, Tokyo)を用いた。それぞれ、使用説明書通りに操作した。
Subjects and methods Patient background and MRSA collection
MRSA used 96 strains isolated and cultured from patients treated at Kanazawa University Hospital from 1998 to 2003. MRSA was identified by a coagulase production test using Gram stain and Stafy slide test. Drug susceptibility was measured using a MicroScan WalkAway 96Plus (SIEMENS, Munich). SET-RPLA, EXT-RPLA and TST-RPLA (DENKA, Tokyo) were used to identify toxins. Each was operated according to the instruction manual.
患者の基礎検査値はMRSAが培養された時点、あるいはそれ以前のものを用いた。MRSA感染症発症中の検査値は、抗MRSA薬を投与中の値を用いた。また、MRSA感染症により死亡した患者の検査値は、除いて解析を行った。MRSAの感染発症は、抗MRSA薬(バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、ダプトマイシン、リネゾリド)の使用、あるいは無菌検体からのMRSA培養陽性とした。 The patient's basic laboratory test values were used at the time of MRSA culture or earlier. As the test values during the onset of MRSA infection, the values during administration of anti-MRSA drugs were used. In addition, the test values of patients who died from MRSA infection were excluded from the analysis. The onset of MRSA infection was determined by the use of anti-MRSA drugs (vancomycin, teicoplanin, arbekacin, daptomycin, linezolid) or MRSA culture positive from sterile specimens.
バイオフィルムアッセイ
バイオフィルム形成能は96穴プレートへの接着にて測定した。既定の濃度に希釈したMRSAを96穴プレートへ播種し、一晩インキュベーションした。翌日、PBSにて洗浄後、接着した菌を100％エタノールにて固定した。クリスタルバイオレットを用いて染色後、プレートリーダーにて595nmの波長で計測し、接着菌を測定した。
Biofilm Assay The biofilm forming ability was measured by adhesion to a 96-well plate. MRSA diluted to a predetermined concentration was seeded on a 96-well plate and incubated overnight. The next day, after washing with PBS, the adhered bacteria were fixed with 100% ethanol. After staining with crystal violet, it was measured with a plate reader at a wavelength of 595 nm to measure adhesive bacteria.
DNAシーケンス
MRSAのDNAはNucleo Spin Tissue kit (MACHREY-NAGEL, Duren)を用いて抽出した。抽出したDNAよりTruSeq DNA HT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA)を用いてライブラリを作成後、Hiseq (Illumina)により網羅的遺伝子解析を行った。遺伝子の変異はレファレンスゲノム(HO 5096 0412)を用いて検討した。
DNA sequence
MRSA DNA was extracted using the Nucleo Spin Tissue kit (MACHREY-NAGEL, Duren). A library was prepared from the extracted DNA using the TruSeq DNA HT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA), and then comprehensive gene analysis was performed using Hiseq (Illumina). Gene mutations were examined using the reference genome (HO 5096 0412).
統計解析
統計ソフトはStatViewを用いた。統計解析にはANOVA, Kruskal-Wallis,およびカイ2乗検定を用いた。
Statistical analysis StatView was used as the statistical software. ANOVA, Kruskal-Wallis, and chi-square tests were used for statistical analysis.
結果
接着・バイオフィルム関連遺伝子領域の遺伝子変異がMRSA感染症の発症/保菌と相関した
96株の網羅的遺伝子解析により、1871か所の遺伝子挿入・欠失(indel)、89091か所の一塩基変異(SNPs)が認められた。これらの変異と、MRSA感染症発症/保菌との相関を検討した。図１−１及び図１−２にはMRSA感染症発症と相関係数の高いおよび低いindel とその遺伝子領域を、それぞれ50変異ずつ示す。それらのうち21か所がaで示す、接着・バイオフィルム関連分子をコードする遺伝子領域であった。bの4か所は毒素関連領域、cの1か所は薬剤耐性関連領域であった。図２−１及び図２−２には、同様にMRSA感染症発症と相関係数の高いおよび低いSNPs その遺伝子領域を、それぞれ50変異ずつ示す。それらのうち17か所がaで示す、接着・バイオフィルム関連分子をコードする遺伝子領域であり、bの2か所は毒素関連領域、cの1か所は薬剤耐性関連領域であった。なお今回、検討した接着・バイオフィルム関連分子（Adhesion/biofilm)、薬剤感受性関連分子(Anti-micorbial resistance)、毒素関連分子(Toxin)を図３に示した。
Results Mutations in adhesive / biofilm-related gene regions correlated with the onset / carriage of MRSA infections
Comprehensive genetic analysis of 96 strains revealed 1871 gene insertions / deletions (indels) and 89091 single nucleotide polymorphisms (SNPs). We investigated the correlation between these mutations and the onset / carriage of MRSA infections. Figures 1-1 and 1-2 show indels with high and low correlation coefficients with the onset of MRSA infection and their gene regions, 50 mutations each. Twenty-one of them were the gene regions encoding adhesion / biofilm-related molecules indicated by a. Four areas in b were toxin-related areas and one area in c was drug resistance-related areas. Similarly, FIGS. 2-1 and 2-2 show the gene regions of SNPs having a high correlation coefficient and a low correlation coefficient with the onset of MRSA infection, 50 mutations each. Of these, 17 were gene regions encoding adhesion / biofilm-related molecules indicated by a, 2 of b were toxin-related regions, and 1 of c was drug resistance-related regions. The adhesion / biofilm-related molecules (Adhesion / biofilm), drug susceptibility-related molecules (Anti-micorbial resistance), and toxin-related molecules (Toxin) examined this time are shown in FIG.
クラスター解析による群分けはcna遺伝子領域の有無と一致した
96株を遺伝子配列の相同性によりクラスター解析を行った。これらのクラスター分類と接着・バイオフィルム関連分子であるcna領域の有無が一致し、主に4つのクラスターに分類された(図４)。他、図３に示す接着・バイオフィルム関連分子遺伝子領域の有無とクラスター分類は一致しなかった。各クラスターの患者背景を図５に示す。クラスターＡで平均年齢が低く、クラスターＢではアルブミン値が低い結果であった。
Grouping by cluster analysis was consistent with the presence or absence of the cna gene region
Cluster analysis was performed on 96 strains based on the homology of gene sequences. These cluster classifications matched the presence or absence of the cna region, which is an adhesion / biofilm-related molecule, and were mainly classified into four clusters (Fig. 4). In addition, the presence or absence of the adhesion / biofilm-related molecular gene region shown in FIG. 3 did not match the cluster classification. The patient background of each cluster is shown in FIG. The result was that the average age was low in cluster A and the albumin level was low in cluster B.
血流感染を発症しやすい一群が認められ、この群にはcna領域が認められた
ついで、これらの群における臨床病態について検討を行った。cna領域を認めるクラスターC群で、有意に血流感染の発症率が高かった(図４及び図６)。その原因としてカテーテル感染によるものが多かった。また、同群は、抗MRSA薬を使用する率が高かった。一方、死亡率、死亡あるいは感染症のためにICU入室する率はほぼ同等であった(図６)。感染症発症中の検査データを図７に示す。クラスターCでは発症中の血小板がクラスターＢに比較し低値であった。
A group that was prone to develop bloodstream infection was found, and a cna region was found in this group, and then the clinical pathology in these groups was investigated. The incidence of bloodstream infection was significantly higher in cluster C group with cna region (Figs. 4 and 6). Most of the causes were catheter infections. The group also had a higher rate of using anti-MRSA drugs. On the other hand, the mortality rate and the rate of admission to the ICU due to death or infectious disease were about the same (Fig. 6). The test data during the onset of infectious disease is shown in FIG. In cluster C, the number of developing platelets was lower than that in cluster B.
クラスターＣのMRSA株の特徴
プレートバイオフィルムアッセイにより測定した各クラスターの接着・バイオフィルム形成能を図８に示す。クラスターＣは高い接着能を示した。一方、クラスターＡの株もcna遺伝子領域を持つが、接着能は低かった。そこで、クラスターＡとクラスターＣのcna遺伝子領域について検討を進めた。クラスターＣの全株に存在し、クラスターＡには存在しないcna遺伝子領域のSNPsが17か所認められた(図９)。図９の右の数字はMRSAのゲノム配列のアンチセンス鎖における塩基番号である。そのうち、10か所はアミノ酸変異を伴う、ミスセンスバリアントであった。また、これらのミスセンスバリアントのうち5か所は、cna遺伝子領域の機能コドン上に存在していた(図１０)。さらに、タンパク構造予測に基づく構造分析では、これらの変異が一部集中しており、ホットスポットを形成していた(図１１)。一方、毒素産生能試験では、クラスターＣ株が特異的にエンテロトキシンＡを産生していた(図１２)。また、薬剤耐性試験では、クラスターＣ株はゲンタマイシンに対する耐性が低い一方、レボフロキサシン、エリスロマイシンに対しては高い耐性を示した(図１３)。
Characteristics of MRSA strain of cluster C Figure 8 shows the adhesion and biofilm formation ability of each cluster measured by the plate biofilm assay. Cluster C showed high adhesiveness. On the other hand, the cluster A strain also had a cna gene region, but its adhesive ability was low. Therefore, we proceeded with the study of the cna gene regions of cluster A and cluster C. There were 17 SNPs in the cna gene region that were present in all strains of cluster C and not in cluster A (Fig. 9). The number on the right in FIG. 9 is the base number in the antisense strand of the MRSA genome sequence. Of these, 10 were missense variants with amino acid mutations. In addition, five of these missense variants were located on the functional codons of the cna gene region (Fig. 10). Furthermore, in the structural analysis based on protein structure prediction, these mutations were partially concentrated and formed hot spots (Fig. 11). On the other hand, in the toxin production ability test, the cluster C strain specifically produced enterotoxin A (Fig. 12). In the drug resistance test, the cluster C strain showed low resistance to gentamicin, but high resistance to levofloxacin and erythromycin (Fig. 13).
本発明により、MRSAの血流感染を未然に防止することができ、MRSAの感染の拡大を防ぐことができる。 According to the present invention, bloodstream infection of MRSA can be prevented, and the spread of MRSA infection can be prevented.
Claims (9)
a）被験体から単離されたMRSAから核酸試料を調製する工程、
b）前記MRSAのコラーゲン付着因子（cna）遺伝子の変異を検出する工程、
を含み、コラーゲン付着因子（cna）遺伝子の変異が検出された場合にMRSAの血流感染のリスクが高いと評価する、MRSAの血流感染のリスクを判定するための検査方法であって、変異が以下の（１）〜（１７）の少なくとも１つの一塩基多型部位における変異であって、cna遺伝子がコードするコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸の置換をもたらす変異である、MRSAの血液感染のリスクを判定するための検査方法：
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基におけるCからAへの変異、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基におけるAからGへの変異、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基におけるCからTへの変異、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基におけるGからAへの変異、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基におけるTからCへの変異、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基におけるTからCへの変異、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基におけるTからCへの変異。 A test method for determining the risk of bloodstream infection of MRSA, including the detection of mutations in the collagen attachment factor (cna) gene of MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus).
a) preparing a nucleic acid sample from the subject or we isolated been MRSA,
b) A step of detecting a mutation in the collagen attachment factor (cna) gene of MRSA,
This is a test method for determining the risk of MRSA bloodstream infection, which evaluates the risk of MRSA bloodstream infection when a mutation in the collagen attachment factor (cna) gene is detected. Is a mutation at at least one single-base polymorphic site of (1) to (17) below, which is a mutation that results in a substitution of an amino acid in the collagen attachment factor (cna) protein encoded by the cna gene. Testing methods to determine the risk of infection:
(1) Mutation from C to A at the 2840th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(2) Mutation from G to T at the 2272th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(3) Mutation from G to A at the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(4) Mutation from G to A at the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(5) Mutation from C to A at the 1988th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(6) Mutation from G to T at the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(7) Mutation from G to T at the 194th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(8) Mutation from A to G at the 191st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(9) Mutation from T to A at the 136th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(10) Mutation from C to A at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(11) Mutation from C to T at the 2253th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(12) Mutation from A to G at the 1983th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(13) Mutation from C to T at the 1941th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(14) Mutation from G to A at the 1842th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(15) Mutation from T to C at the 1716th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(16) Mutation from T to C at the 1530th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (17) Mutation from T to C at the 12th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてA947Dの置換をもたらす変異、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてG65Vの置換をもたらす変異、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基におけるAからGへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてN64Sの置換をもたらす変異、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基におけるTからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてS46Tの置換をもたらす変異、及び
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における、CからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてD26Eの置換をもたらす変異。 A test method for determining the risk of bloodstream infection of MRSA according to claim 1, wherein the mutation is at least one of the following mutations (1) to (10):
(1) A mutation from C to A in the 2840th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of A947D in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(2) A mutation from G to T in the 2272th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V758L in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A mutation from G to A in the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which results in a substitution of E756K in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(4) A mutation from G to A in the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V746I in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(5) A mutation from C to A in the 1988th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which results in a substitution of T663K in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(6) A mutation from G to T in the 1711th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V571L in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(7) A mutation from G to T in the 194th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of G65V in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(8) A mutation from A to G in the 191st base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of N64S in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(9) A mutation from T to A in the 136th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of S46T in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2. And (10) A mutation from C to A in the 78th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which results in the substitution of D26E in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2. Mutation.
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてV758Lの置換をもたらす変異、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてE756Kの置換をもたらす変異、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基におけるGからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてV746Iの置換をもたらす変異、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基におけるCからAへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてT663Kの置換をもたらす変異、及び
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基におけるGからTへの変異であって、配列番号２に表すコラーゲン付着因子（cna）タンパク質のアミノ酸配列においてV571Lの置換をもたらす変異。 The test method for determining the risk of bloodstream infection of MRSA according to claim 2, wherein the mutation is at least one mutation of (2), (3), (4), (5) and (6) below. :
(2) A mutation from G to T in the 2272th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V758L in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(3) A mutation from G to A in the 2266th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which results in a substitution of E756K in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(4) A mutation from G to A in the 2236th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of V746I in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2.
(5) A mutation from C to A in the 1988th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which causes a substitution of T663K in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2. And (6) A mutation from G to T in the 1711th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, which results in a substitution of V571L in the amino acid sequence of the collagen attachment factor (cna) protein represented by SEQ ID NO: 2. ..
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、
（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位、
（１１） 配列番号１で示される塩基配列の2253番目の塩基における一塩基多型部位、
（１２） 配列番号１で示される塩基配列の1983番目の塩基における一塩基多型部位、
（１３） 配列番号１で示される塩基配列の1941番目の塩基における一塩基多型部位、
（１４） 配列番号１で示される塩基配列の1842番目の塩基における一塩基多型部位、
（１５） 配列番号１で示される塩基配列の1716番目の塩基における一塩基多型部位、
（１６） 配列番号１で示される塩基配列の1530番目の塩基における一塩基多型部位、及び
（１７） 配列番号１で示される塩基配列の12番目の塩基における一塩基多型部位。 An oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site (1) to (17) below in the nucleotide sequence of the collagen attachment factor (cna) gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1 and comprising the nucleotide polymorphism site of SEQ ID NO: 1. A probe consisting of a partial sequence consisting of 30 bases of a base sequence or an oligonucleotide consisting of a sequence complementary to the partial sequence or a label thereof for performing a test for determining the risk of bloodstream infection of MRSA:
(1) Single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(3) Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(5) Single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(6) Single nucleotide polymorphism site in the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(7) Single nucleotide polymorphism site at the 194th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(8) Single nucleotide polymorphism site in the 191st base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(9) Single nucleotide polymorphism site at the 136th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(10) Single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(11) Single nucleotide polymorphism site at the 2253th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(12) Single nucleotide polymorphism site at the 1983th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(13) Single nucleotide polymorphism site in the 1941th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(14) Single nucleotide polymorphism site in the 1842th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(15) Single nucleotide polymorphism site in the 1716th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(16) Single nucleotide polymorphism site at the 1530th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (17) Single nucleotide polymorphism site at the 12th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
（１） 配列番号１で示される塩基配列の2840番目の塩基における一塩基多型部位、
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、
（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位、
（７） 配列番号１で示される塩基配列の194番目の塩基における一塩基多型部位、
（８） 配列番号１で示される塩基配列の191番目の塩基における一塩基多型部位、
（９） 配列番号１で示される塩基配列の136番目の塩基における一塩基多型部位、及び（１０） 配列番号１で示される塩基配列の78番目の塩基における一塩基多型部位。 An oligonucleotide containing at least one single nucleotide polymorphism site (1) to (10) below in the nucleotide sequence of the collagen attachment factor (cna) gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1 and comprising the nucleotide polymorphism site of SEQ ID NO: 1. A probe consisting of a partial sequence consisting of 30 bases of a base sequence or an oligonucleotide consisting of a sequence complementary to the partial sequence or a label thereof for performing a test for determining the risk of bloodstream infection of MRSA:
(1) Single nucleotide polymorphism site at the 2840th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(3) Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(5) Single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(6) Single nucleotide polymorphism site in the 1711th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(7) Single nucleotide polymorphism site at the 194th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(8) Single nucleotide polymorphism site in the 191st base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(9) Single nucleotide polymorphism site at the 136th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (10) Single nucleotide polymorphism site at the 78th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
（２） 配列番号１で示される塩基配列の2272番目の塩基における一塩基多型部位、
（３） 配列番号１で示される塩基配列の2266番目の塩基における一塩基多型部位、
（４） 配列番号１で示される塩基配列の2236番目の塩基における一塩基多型部位、
（５） 配列番号１で示される塩基配列の1988番目の塩基における一塩基多型部位、及び（６） 配列番号１で示される塩基配列の1711番目の塩基における一塩基多型部位。 At least one single nucleotide polymorphism site of (2), (3), (4), (5) and (6) below in the nucleotide sequence of the collagen attachment factor (cna) gene of MRSA represented by SEQ ID NO: 1. Determines the risk of bloodstream infection of MRSA, which is an oligonucleotide containing the above, and consists of a partial sequence consisting of 30 bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or an oligonucleotide having a sequence complementary to the partial sequence or a label thereof. Probes for performing tests to
(2) Single nucleotide polymorphism site at the 2272th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(3) Single nucleotide polymorphism site at the 2266th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(4) Single nucleotide polymorphism site at the 2236th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(5) Single nucleotide polymorphism site at the 1988th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1 and (6) Single nucleotide polymorphism site at the 1711th base of the base sequence shown by SEQ ID NO: 1.
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