[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP6876618B2 - 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート - Google Patents

治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート Download PDF

Info

Publication number
JP6876618B2
JP6876618B2 JP2017557508A JP2017557508A JP6876618B2 JP 6876618 B2 JP6876618 B2 JP 6876618B2 JP 2017557508 A JP2017557508 A JP 2017557508A JP 2017557508 A JP2017557508 A JP 2017557508A JP 6876618 B2 JP6876618 B2 JP 6876618B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
urease
antibody
conjugate
single domain
domain antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017557508A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018506581A (ja
Inventor
チャオ ヘマン
チャオ ヘマン
ヤウ ウオング ワフ
ヤウ ウオング ワフ
ティアン バオミン
ティアン バオミン
ジェイン ガスパル キンバリー
ジェイン ガスパル キンバリー
クマル プラベエン
クマル プラベエン
Original Assignee
へリックス バイオファーマ コープ．
へリックス バイオファーマ コープ．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by へリックス バイオファーマ コープ．, へリックス バイオファーマ コープ． filed Critical へリックス バイオファーマ コープ．
Publication of JP2018506581A publication Critical patent/JP2018506581A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6876618B2 publication Critical patent/JP6876618B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、2015年1月23日出願の米国仮特許出願第62/107,210号の出願日の利益を主張する。該出願は、本明細書に引用により組み込まれている。
(配列表)
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれている配列表を含んでいる。該ASCIIコピーは、2016年1月14日に作成され、105013-1610_SL.txtという名前であり、サイズが11,000バイトである。
(発明の分野)
本件開示は、治療的有用性を有する抗体-ウレアーゼコンジュゲートを提供する。より詳細には、本開示は、ウレアーゼにコンジュゲートした1以上の抗体を有する治療用コンジュゲート、その組成物、使用、及び調製物に関する。
(背景)
ウレアーゼは、尿素の二酸化炭素及びアンモニアへの加水分解を触媒する酵素である。具体的には、ウレアーゼは、尿素の加水分解を触媒して、アンモニア及びカルバメートを生成させ、生成したカルバメートは、それに続き、自発的加水分解により分解され、別のアンモニア及び炭酸を生成する。この点において、ウレアーゼ活性は、ウレアーゼが一般毒性を有する塩基性分子であるアンモニアを生成させる局所的環境のpHを増加させる傾向がある。
がんの治療において腫瘍関連抗原を標的とするよう抗体を用いる概念は、しばらくの間高く評価されている(Herlynらの文献(1980) Cancer Research 40, 717)。しかしながら、ウレアーゼに関しては、有毒な成分は、尿素の酵素分解によって生成するアルカリ性の環境であり、高親和性抗体断片が採用されている。
(発明の概要)
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを対象とする。本技術は、静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、ウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートとを含み、非コンジュゲート抗体を含まず、かつ/又は非水性HPLC溶媒を含まない医薬組成物を提供する。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上の平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記ウレアーゼは、タチナタマメウレアーゼである。
いくつかの態様において、前記抗体は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。いくつかの態様において、前記抗体の分子量は、約5kDa〜約200kDaである。いくつかの態様において、前記抗体の分子量は、約5kDa〜約50kDaである。いくつかの態様において、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体は、110アミノ酸残基を超えないか、又は約90〜130アミノ酸残基のサイズを有する。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体の分子量は、約10kDa〜約50kDaである。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体の分子量は、約12kDa〜約15kDaである。いくつかの態様において、前記抗体は、抗原、腫瘍細胞に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記抗体は、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。
いくつかの態様において、前記抗体は、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、Kd値が約1×10-8Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、Kd値が約1×10-10Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記IC50値は、約3nM〜約5nMである。いくつかの態様において、前記IC50値は、約3.22nMである。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約10μg/mL〜約30μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。
いくつかの態様において、前記抗体は、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、前記抗体は、前記配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも1つの改変を含むポリペプチドを含む。
本技術は、それを必要としている対象においてがんを治療する方法であって、該対象に、治療的有効量の本明細書において提供される組成物を投与することを含み、それにより、該対象におけるがんを治療する、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、又はそれらの組合せのうちの1つ以上である。いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌である。いくつかの態様において、前記対象は、ヒトである。
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含み、ウレアーゼを実質的に含まない組成物を調製する方法であって、活性化された抗体及びウレアーゼを約6.0〜7.0、例えば、約6.5のpHを有する水性緩衝液中で混ぜ合わせること、該pHを、8.0〜9.0、例えば、約8.3へと調整して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成させること、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを精製することを含み、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、固液吸着クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、逆相クロマトグラフィー(RPC)、及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などを含む、タンパク質精製のためによく使用されるクロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー精製工程を含まない、前記方法を提供する。いくつかの態様において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウルトラダイアフィルトレーションによって精製される。
いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8〜11個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、約6.5のpHを有する前記緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの態様において、前記pHは、ホウ酸ナトリウム溶液の添加を含む方法によって、約8.3へと調整される。
本技術は、腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該抗体分子を、1つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成させることを含み、該コンジュゲートが、前記非コンジュゲート抗体よりも少なくとも約100倍高い該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、前記抗体は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。いくつかの態様において、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、前記腫瘍抗原は、非小細胞性肺癌により発現されるものである。いくつかの態様において、前記抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。
本技術はさらに、本明細書において提供される組成物、及び該組成物の使用のための説明書を含むキットを提供する。
本開示のこれらの態様及び他の態様を、以下でさらに説明する。
(図面の簡単な説明)
図1A及び1Bは、がん細胞株におけるL-DOS47の例示的な結合及び細胞傷害性研究を示す。(A)5つのがん細胞株:BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T、及びMDA-MB231へのL-DOS47の直接的な結合。結合シグナルは、20mM尿素とのインキュベーション時に生じたアンモニアの量によって表された。BxPC-3(●)、Capan-1(▼)、及びZR-75-30(◆)細胞において良好なL-DOS47結合が観察されたのに対して、LS174T細胞(▲)においては中程度の結合が観察され、MDA-MB231細胞(■)においては結合は見られなかった。加えて、対応する細胞株(データは示していない)に対して非コンジュゲートDOS47対照を用いた場合には結合が観察されず、L-DOS47結合が特異的であり、抗体部分がそれに寄与していることを示唆した。(B)20mM尿素の添加時にがん細胞株に対しL-DOS47により胞傷害性が誘導された。MDA-MB231細胞(■)において効果は観察されず、結合研究と一致した。BxPC-3(●)及びZR-75-30(◆)が、L-DOS47に対する高い感受性を有するのに対し、Capan-1(▼)及びLS174T細胞(▲)では、中程度の効果のみが見られた。
図2A及び2Bは、BxPC-3細胞に対する、L-DOS47、DOS47、及びAFAIKL2抗体の例示的な直接的かつ競合的な結合を示す。(A)ルテニウムタグ化L-DOS47、AFAIKL2抗体、及び非コンジュゲートDOS47の、BxPC-3細胞への結合。電気化学発光アッセイは、BxPC-3細胞に結合するL-DOS47及びAFAIKL2抗体の直接的な測定を提供する。AFAIKL2抗体(▲)では弱い結合シグナルが観察されたのに対して、L-DOS47は、抗体コンジュゲート上に提示された複数のAFAIKL2抗体のアビディティーのために、それよりもかなり強力な結合シグナル(●)を示した。陰性対照DOS47(◇)では結合は観察されなかった。(B)BxPC-3細胞に対するL-DOS47-タグの結合を、L-DOS47、AFAIKL2抗体、又はDOS47のいずれかと競争させた。L-DOS47及びAFAIKL2抗体双方の見かけの結合親和性は、被験物のIC50(結合の50％の減少を引き起こすのに必要とされる競合剤の量)によって比較可能である。L-DOS47(●)及びAFAIKL2抗体(▲)のIC50は、それぞれ、2及び20μg/mL(又は3.22nM及び1.55μM)と推定された。このことは、L-DOS47の結合親和性が、AFAIKL2抗体のそれの約500倍であることを示している。陰性対照DOS47(◇)では、阻害は観察されなかった。結果は、代表的な実験の平均(n=3)を示す。
図3A〜図3Cは、CEACAM6遺伝子の例示的な過剰発現及びノックダウンを示す。(A)CEACAM6でトランスフェクトされたH23細胞に対するL-DOS47の結合。トランスフェクトされた細胞株の集団(▲)を、増加した量の選択用抗生物質と共に、FACS細胞選別によって濃縮した。天然のH23細胞(○)及びA549細胞(△)のものと比較した結合プロファイルでは、CEACAM6が、A549細胞でのものを下回るレベルで、トランスフェクトされた細胞において発現していたことが示された。(B)CEACAM6でトランスフェクトされたH23細胞に対するL-DOS47の細胞傷害性アッセイ。BxPC-3(●)、A549(△)、及び天然のH23(○)細胞と比較して、H23細胞におけるCEACAM6の過剰発現(▲)は、それらのL-DOS47細胞傷害性に対する感受性を大きく上昇させた。興味深いことに、トランスフェクトされたH23細胞は、(A)において観察されたL-DOS47結合がより弱いにもかかわらず、A549及びBxPC-3細胞の双方よりもL-DOS47細胞傷害性に対して高い感受性を有していた。(C)CEACAM6遺伝子がノックダウンされたBxPC-3細胞に対するL-DOS47の結合。天然(●)及び対照(HUSH-TR3▲)BxPC-3細胞において、良好な結合シグナルが観察された。しかしながら、CEACAM6遺伝子が、shRNA(HUSH#6▼及びHUSH#7△)によってサイレンシングされるにつれて、L-DOS47結合は失われた。このことは、CEACAM6が、抗体コンジュゲートによって認識されている表面抗原であることを示している。結果には、代表的な実験の平均(n=3)が示されている。標準偏差(SD)は、全ての値について10％未満であった。
図4は、ヒト結腸及び肺腺癌のL-DOS47での免疫組織化学的染色を示す。陽性染色を、暗色で示した。
図5は、AFAIKL2抗体のアミノ酸配列(配列番号:1)を示す。
図6は、2工程反応によるL-DOS47コンジュゲート産物の合成を例示する。工程1は、SIABを用いる抗体の活性化であり、工程2は、活性化された抗体のウレアーゼ酵素とのコンジュゲーションによるバイオコンジュゲートL-DOS47の形成を伴う。
図7は、製剤ブランク、AFAIKL2、高純度ウレアーゼ(HPU)、及びコンジュゲートL-DOS47の例示的なサイズ排除クロマトグラムを示す。各構成成分の二量体の非常に小さなピークが、各モノマーピークの前に出現する。製剤ブランクは、10mMヒスチジン、1％スクロース、0.2mM EDTAを含有し、pH6.8である。
図8は、製剤ブランク(A)、L-DOS47(B)、並びに2.4％(C)、4.8％(D)、及び7.2％(E)のHPウレアーゼ(HPU)でスパイクされたL-DOS47の例示的なイオン交換クロマトグラムを示す。製剤ブランクは、10mMヒスチジン、1％(w/v)スクロース、0.2mM EDTAを含有し、pH6.8である。
図9は、Experion SDSウィンドウの例示的なスナップショットを示す。パネル1:レーン2及び4の電気泳動図のオーバレイ。パネル2:レーンL、分子量(MW)ラダー;レーン1、2、7、及び8:追加のIEC精製を受けた活性化されたAFAIKL2を用いて製造されたL-DOS47;レーン3〜6:追加のIECを受けていないAFAIKL2を用いて製造されたL-DOS47;レーン9及び10、HPU。パネル1において、x軸上のパネル1における数2〜14は、レーンの1電気泳動図のピーク番号である;3*は、内部MW標準のための最低分子量マーカーピークを示し、14*は、内部MW標準のための最高MWマーカーピークを示す。
図10は、0〜4抗体分子と連結されたウレアーゼサブユニットの個々に分離したピークを示す、L-DOS47の例示的な電気泳動図(図9のレーン2)を示す。x軸上の番号1〜11は、ピーク番号である;3*は、内部MW標準のための最低分子量マーカーピークを示し、11*は、内部MW標準のための最高MWマーカーピークを示す。
図11は、L-DOS47の結合活性に対するコンジュゲーション比率の例示的な効果を示す。L-DOS47を、異なる抗体コンジュゲーション比率(1.8〜12)で調製した。固定化CEACAM6-A分子へのL-DOS47サンプルの直接的な結合を決定した。
図12は、AFAIKL2、ウレアーゼ、及びL-DOS47の例示的なウエスタンブロットを示す。左パネル:L-DOS47、ウレアーゼ、及びAFAIKL2のゲル電気泳動(クーマシーブルーで染色)。中央のパネル:抗AFAIKL2抗体で探索されたAFAIKL2、ウレアーゼ、及びL-DOS47のウエスタンブロット(標準的な負荷及び5倍の過負荷)。右パネル:抗ウレアーゼ抗体で探索されたAFAIKL2、ウレアーゼ、及びL-DOS47のウエスタンブロット(標準的な負荷及び5倍の過負荷)。差し込まれたボックス:L-DOS47の拡大図。
図13は、420nmでのAFAIKL2-Cys-FLのトリプシン消化物の例示的なRP-HPLCクロマトグラムを示す。同定されたコンジュゲートしたペプチド及びそれらのペプチド質量を、対応するHPLCピークに示した。
図14は、がん細胞株BxPC-3、A549、及びMCF7に対する例示的なL-DOS47の直接的な結合を示す。結合シグナルは、20mM尿素とのインキュベーション時に生じたアンモニアの量によって示した。上昇したL-DOS47結合が、BxPC-3(●)において観察されたのに対して、A549細胞(▲)では中程度の結合が観察され、MCF7細胞(▼)では結合は見られなかった。加えて、対応する細胞株(○、△、▽)における非コンジュゲートDOS47対照では、結合は見られず、L-DOS47結合が、BxPC-3及びA549細胞に対して特異的であったことを示唆している。
図15は、20mM尿素の添加時のBxPC-3及びA549細胞に対するL-DOS47誘導性細胞傷害性の例を示す。MCF7細胞(▼)において効果は観察されなかった。BxPC-3(●)は、L-DOS47に対する高い感受性を有しているのに対して、A549細胞(▲)においては中程度の効果のみが観察された。加えて、非コンジュゲートDOS47対照では対応する細胞株(○、△、▽)に対する結合は観察されなかった。グラフの結果は、代表的な実験の平均(n=3)を示す。標準偏差(SD)は、全ての値について10％未満であった。
(詳細な説明)
本開示は、記載された特定の態様や実施態様に限定されないと理解されるべきであり、そのために勿論変化し得る。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるので、本明細書で使用される術語は、特定態様や実施態様を説明するのみのためのものであり、限定を意図するものではないことも理解すべきである。
本開示の詳細な説明は、読み手の便益のみのために種々のセクションに分割されており、任意のセクションにみられる開示を、別のセクションのものと組み合わせてもよい。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野における通常の知識を有するものにより通常理解されるものと同じ意味を有する。
(定義)
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、及び「該(the)」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「1つの化合物(a compound)」への言及は、複数の化合物も含む。
本明細書で使用される用語「約」は、例えば、温度、時間、量、濃度などの、範囲を含む数値指定の前に用いられる場合、記載された値の(+)又は(-)10％、5％、又は1％変化し得る近似値を示す。
本明細書で使用される用語「投与」は、一回用量で、連続的にもしくは断続的に、又は全体として一回用量を提供するいくつかの副用量で達成することができる。投薬は、治療の過程の始めから終わりまで行うことができる。投与の最も効果的な手段及び投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、療法のために使用される組成物、該療法の目的、治療されている標的細胞、及び治療されている対象に応じて変化するものである。単回又は複数回の投与を、治療を行っている医師によって選択される用量レベル及びパターンで実施することができる。該薬剤を投与する適当な投薬製剤及び方法は、当技術分野において公知である。投与の経路も決定することができ、最も効果的な投与の経路を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、該治療の目的、治療されている対象の健康状態又は疾患のステージ、及び標的細胞又は組織に応じて変化するものである。投与の経路の非限定的な例としては、経口投与、経膣、経鼻投与、注射、外用、舌下、経肺、及び坐剤によるものが挙げられる。
本明細書で使用される用語「親和性」は、レセプターとそのリガンドとの間、例えば、抗体とその抗原との間の結合の強度を指す。用語「Kd」又は「解離定数」は、抗体と抗原との間の親和性、すなわち、抗体が、どの程度しっかりと特定の抗原に結合するかを指す。用語「IC50」又は「最大半量阻害濃度」は、試験物の結合を50％低減させるのに必要とされる競合剤の量を表す。
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、所望の機能的性質が、ポリペプチドによって維持される限り、天然アミノ酸及び合成アミノ酸の双方などを含むL-アミノ酸もしくはD-アミノ酸、又はそれらの混合物を指す。ペプチド配列の始めに用いられる場合、NH2は、ポリペプチドのアミノ末端(又はN-末端)に存在する遊離のアミノ基を指す。COOHは、ペプチド配列の最後に用いられる場合、ポリペプチドのカルボキシ末端(又はC-末端)に存在する遊離のカルボキシ基を指す。アミノ酸残基のための標準的なポリペプチド略号は以下のとおりである:A(Ala又はアラニン);C(Cys又はシステイン);D(Asp又はアスパラギン酸);E(Glu又はグルタミン酸);F(Phe又はフェニルアラニン);G(Gly又はグリシン);H(His又はヒスチジン);I(IIe又はイソロイシン);K(Lys又はリジン);L(Leu又はロイシン);M(Met又はメチオニン);N(Asn又はアスパラギン);P(Pro又はプロリン);Q(Gln又はグルタミン);R(Arg又はアルギニン);S(Ser又はセリン);T(Thr又はトレオニン);V(Val又はバリン);W(Trp又はトリプトファン);X(Xaa又は不明又はその他);Y(Tyr又はチロシン);Z(Glx/Gln/Glu又はグルタミン酸/グルタミン);及びDpr(2,3-ジアミノプロピオン酸)。本明細書中に式により示されるアミノ酸残基配列は全て、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向に、左から右への配向性を有する。アミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュは、1以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すか、又はNH2もしくはアセチルなどのアミノ末端基又はCOOHなどのカルボキシ末端基への共有結合を示す。
本明細書で使用される用語「を含む(comprising)」又は「を含む(comprises)」は、組成物及び方法が、記載された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するのに用いられた場合、記載された目的のための組合せに対し何らかの非常に重要な意義のある他の要素を排除することを意味するべきである。従って、本明細書において定義されるような要素から本質的になる組成物又はプロセスは、本開示の基礎的かつ新規の特徴に影響を実質的に及ぼさない他の材料も工程も排除しない。「からなる」は、微量要素を超える他の成分及び実質的な方法の工程を排除することを意味するものである。これらの移行句(transition term)の各々により定義される実施態様は、本件開示の範囲内である。
本明細書で使用される用語「活性薬剤」、「薬物」、及び「薬理学的に活性な薬剤」は、本明細書において互換的に使用され、対象に投与された場合に、所望の薬理的効果を誘導する化学的な材料又は化合物を指し、放射性核種、薬物、抗がん剤、毒素などを含む治療剤を含むことが意図される。例示的な活性薬剤は、抗体ウレアーゼコンジュゲートである。
本明細書で使用される用語「抗体」は、抗原に対する結合親和性を有するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。典型的な抗体構造ユニットは、テトラマーを含む。各々のテトラマーは、ポリペプチド鎖の同一の2つのペアから構成され、各々のペアは1本の「軽」鎖及び1本の「重」鎖を有する。各々の鎖のN-末端は、主に抗原認識を担当する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。「可変軽鎖」(VL)及び「可変重鎖」(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、又はそれ自体がジスルフィド結合によりVH-CH1に連結された軽鎖であるFabの二量体であるF(ab)’2、もしくはヒンジ領域におけるジスルフィドによる連結の破壊の結果生じるFab’モノマーなどの断片として存在する。Fab’モノマーは本質的に、ヒンジ領域の一部を伴うFabである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W. E. Paul編, Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。抗体断片は、例えば、種々のペプチダーゼ(peeptidases)によるインタクトな抗体の消化によって製造することができ、化学的にか又は組換えDNA方法体系を利用することによってかのいずれかで新たに合成することができる。従って、本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、抗体の修飾によって製造されたか、又は組換えDNA方法体系を用いて新たに合成されたかのいずれかの抗体断片を含む。抗体には、VH及びVLが一緒に(直接的に、又はペプチドリンカーを介して)連結されて連続するポリペプチドを形成している単鎖Fv(sFv)抗体を含む単鎖抗体が含まれる。
本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体」(sdAb又は「VHH」)は、この種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指し、かつ、いくつかの態様においては、生来軽鎖を欠くラクダ科の哺乳動物においてみられる。いくつかの態様において、該単一ドメイン抗体は、VH領域、VHH領域、又はVL領域に由来し得る。いくつかの態様において、該単一ドメイン抗体は、ヒト起源のものである。いくつかの態様において、該ヒト単一ドメイン抗体は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれているWO2006/099747、及びWO2009/079793、及びWO2012/100343に開示されている重鎖又は軽鎖配列を含む。一態様において、前記ヒト単一ドメイン抗体は、WO2012/100343に述べられているような、フレームワーク領域内にジスルフィド結合を有する重鎖又は軽鎖配列を含む。
本明細書で使用される用語「抗体断片」はまた、特異的抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する任意の合成の又は遺伝子操作されたタンパク質を含む。
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、共有結合的に連結されてより大きな構築体を形成している2つ以上の分子を指す。一態様において、この2つの分子は、直接的な連結によって連結されており、ここで、アスパラギン酸又はグルタミン酸のカルボキシル官能基に結合するリジンのアミノ官能基のように、ウレアーゼ上の反応性官能基が、抗体上の相補的な反応性官能基に結合する。このような反応には、カルボキシル基の従来の修飾によりそれをより反応性のものとすることが必要となり得ることが理解されよう。別の態様において、前記2つの分子は、リンカー部分を介して連結されている。
本明細書で使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、又は「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、互換的に言及される。タンパク質は、そのサブユニット配列によって表される一次構造を有しており、かつ2次的ならせん状又はひだ状の構造、及び全体的な三次元的構造を有し得る。一般的には、「タンパク質」は、比較的大きなポリペプチド、例えば、100個以上のアミノ酸を含有するものを指し、「ペプチド」は、より小さなポリペプチドを指すが、これらの用語は、本明細書においては互換的に使用される。即ち、「タンパク質」という用語が、より大きなポリペプチドを指すことも、より小さなペプチドを指すこともあり、逆もまた同じである。
本明細書で使用される用語「ターゲティング部分」は、規定された細胞集団又は選択された細胞型に結合する分子を指す。該ターゲティング部分は、該標的細胞または細胞集団上にか、又はそれらの内部に存在するレセプター、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、又は他の結合部位に結合し得る。例示的なターゲティング部分は、抗体である。発現された抗原を認識することができる抗体断片及び小ペプチド配列もまた、想定されるターゲティング部分である。
本明細書で使用される用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」又は「治療(treatment)」は、本明細書で使用される場合、疾患もしくは状態、又はその1つ以上の症状を軽減すること、やわらげること、又は改善すること、さらなる症状を予防すること、症状の根底にある代謝的な原因を改善すること又は予防すること、疾患又は状態を阻止すること、例えば、疾患又は状態の進展を停止させること又は抑制すること、疾患又は状態を緩和すること、疾患又は状態の退縮(regression)を引き起こすこと、疾患又は状態によって引き起こされた状態を緩和すること、又は疾患又は状態の症状を抑制することを含み、かつ予防法を含むことが意図される。この用語はまた、疾患又は状態を緩和すること、例えば、臨床症状の退縮を引き起こすことを含む。この用語はさらに、治療的利益及び/又は予防的利益を達成することを含む。治療的利益は、治療されている根底にある障害の根絶又は改善を意味する。また、治療的利益は、個体が、根底にある障害になおさいなまれているものの、該個体における向上が観察されるような、該根底にある障害に伴う生理学的な症状のうちの1つ以上の根絶又は改善とともに達成される。
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、本明細書において互換的に使用され、治療の任意の標的を指す。また、腫瘍細胞をインサイチュで、それらの通常の位置(position)もしくは場所(location)で、例えば、乳房腫瘍もしくは前立腺腫瘍の新生細胞で治療する方法が、本技術によって提供される。これらのインサイチュの腫瘍は、多様な宿主;例えば、ヒト宿主、イヌ宿主、ネコ宿主、ウマ宿主、ウシ宿主、ブタ宿主などの内部又はそれの表面に位置し得る。腫瘍又は腫瘍細胞がみられる任意の宿主を治療することができ、かつ本技術に従う。従って、対象には、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトが含まれる。
本明細書で使用される用語、粒子を「実質的に含まない」は、粒子を完全に欠くか、又は粒子をほとんど完全に欠いており、効果があたかも粒子を完全に欠いている場合のものと同じであるかのいずれかであり得る。言い換えれば、成分又は要素を「実質的に含まない」組成物は、測定可能なそれらの効果が存在しない限りは、実際にはそのような項目を含有していてもよい。特に記載しない限り、用語「実質的に」は、約90％超、約95％超、約96％超、約97％超、約98％超、又は約99％超を意味する。いくつかの実施態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含む組成物は、非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まず、これは、該組成物が、約90％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約95％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約96％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約97％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、約98％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、又は約99％超の抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含有することを意味する。言い換えれば、該組成物は、約0.1％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約0.5％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約1％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約2％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約3％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約4％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、約5％未満の非コンジュゲートウレアーゼ、又は約10％未満の非コンジュゲートウレアーゼを含有する。用語「非コンジュゲートウレアーゼ」は、抗体にコンジュゲートしていないウレアーゼを指す。
本明細書で使用される用語「ウレアーゼ」は、天然に存在するか、又は例えば、組換え核酸技術及び/もしくは化学合成によって得られるかのいずれかの、尿素アミドヒドラーゼ(E.C.3.5.1.5)の酵素活性を有する酵素を指す。ウレアーゼはまた、完全なウレアーゼ、そのサブユニット、もしくはその断片、及び/又はポリペプチドの尿素アミドヒドラーゼ活性を保存するアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を伴うウレアーゼを含む融合タンパク質を含む。
本明細書で使用される用語「DOS47」は、精製されたウレアーゼを指す。
(抗体-ウレアーゼコンジュゲーション)
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを対象とする。本技術は、静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、ウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートとを含み、非コンジュゲート抗体を含まず、かつ非水性HPLC溶媒を含まない医薬組成物を提供する。非水性HPLC溶媒としては、メタノール、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸などの、分取HPLC又はHPLC精製においてよく使用される有機溶媒が挙げられる。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、リン酸緩衝液由来のリン酸塩を実質的に含まない。いくつかの態様において、10mMのリン酸塩、50mMのNaClを含有しpHが7.0のリン酸緩衝液が、SEC精製のために使用される。いくつかの態様において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの工業的生産において、HPLC精製を行うことはない。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり抗体部分が約6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり抗体部分約8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上の平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8、9、10、又は11個である平均コンジュゲーション比率を有する。
いくつかの態様において、連結は、共有結合又は直接的な連結であり、ここで、例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のカルボキシル(COOH)官能基に結合する、例えば、リジンのアミノ(NH2)官能基、又はシステインのスルフヒドリル(SH)などの、ウレアーゼ上の反応性官能基が、抗体上の相補的な反応性官能基に結合する。このような反応には、カルボキシル基の従来の修飾によりそれをより反応性のものとすることが必要となり得ることが理解されよう。
前記反応性の官能基は、シュウ酸、コハク酸などの同じものとすることができるか、又はアミノ(これは、コンジュゲーション後NHとなる)及びカルボキシル(これは、コンジュゲーション後COもしくはCOOとなる)基などのオルソゴナルな(orthogonal)官能基とすることができる。あるいは、前記抗体及び/又はウレアーゼを誘導体化して、追加の反応性官能基を露出させるか又は取りつけてもよい。該誘導体化は、Pierce Chemical Company, Rockford Illから利用可能なものなどの、いくつかのリンカー分子のうちのいずれかの取り付けを伴い得る。
本明細書で使用される「リンカー」は、ターゲティング部分の活性薬剤への連結、例えば、抗体のウレアーゼへの連結に用いられる分子である。該リンカーは、ターゲティング部分及び活性薬剤の双方に対し共有結合を形成することができる。適当なリンカーは、当業者に周知されており、直鎖又は分岐鎖炭素リンカー、ヘテロ環状炭素リンカー、又はペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。ターゲティング部分及び活性薬剤分子がポリペプチドである場合には、前記リンカーは、それらの側基を介して構成アミノ酸に(例えば、ジスルフィドによる連結を介してシステインに)連結されていてもよい。好ましい態様において、前記リンカーは、末端アミノ酸のアルファ炭素アミノ基及びカルボキシル基に連結される。いくつかの態様において、前記連結は、前記ウレアーゼ及び前記抗体の双方と、それが反応することを可能とする、カルボキシ又はアミノなどの2つ以上の官能基を有するリンカーを介するものである。リンカーは、当技術分野において周知されており、典型的には、炭素、窒素、水素、酸素、硫黄などを含む1〜20個の原子を含む。
ウレアーゼ上の基との反応性を有する1つの官能基及び抗体との反応性を有する別の基を有する二官能性リンカーを用いて、所望のイムノコンジュゲートを形成してもよい。あるいは、誘導体化は、ターゲティング部分の化学的処理、例えば、遊離のアルデヒド基を生じさせる過ヨウ素酸塩を用いる糖タンパク質抗体の糖部分のグリコール開裂を伴っていてもよい。抗体上の該遊離のアルデヒド基を、薬剤上の遊離のアミン又はヒドラジン基と反応させて、該薬剤をそれに結合させてもよい(米国特許第4,671,958号を参照されたい)。抗体又は抗体断片などのポリペプチド上に遊離のスルフヒドリル基を生じさせる手順も公知である(米国特許第4,659,839号を参照されたい)。
他のリンカー分子及びその使用としては、例えば、欧州特許出願第188,256号;米国特許第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号;第4,680,338号;第4,569,789号;及び第4,589,071号;並びにBorlinghausらの文献(1987) Cancer Res. 47: 4071-4075)に記載されているものが挙げられる。
いくつかの態様において、前記連結は、標的部位においてか又はその近傍において開裂可能であり、前記コンジュゲート分子がその標的部位へと到達したときに、前記ウレアーゼが、ターゲティング部分から解放される。前記連結を開裂してターゲティング部分からウレアーゼを放出することは、酵素活性によってか、又は標的細胞の内部でか、もしくは標的部位の近傍でのいずれかで前記コンジュゲートが曝されている条件によって促され得る。いくつかの態様において、腫瘍部位に存在する条件下(例えば、腫瘍関連酵素又は酸性のpHに曝された場合に)で開裂可能なリンカーを用いてもよい。
開裂可能なリンカーとしては、例えば、米国特許第4,618,492号;第4,542,225号、及び第4,625,014号に記載されているものが挙げられる。これらのリンカー基からの活性薬剤の放出の機構としては、例えば、感光性の結合の照射及び酸を触媒とする加水分解が挙げられる。米国特許第4,671,958号は、例えば、患者の補体系のタンパク質分解酵素によって、インビボで標的部位において開裂されるリンカーを含むイムノコンジュゲートの記述を含む。いくつかの態様において、適当なリンカーは、アミノ酸の残基又は2個以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーである。
いくつかの態様において、適当なリンカーは、R1-L-R2であり、ここでR1及びR2は、同じ又は異なる官能基であり、そのうちの一方は前記抗体に結合しており、他方はウレアーゼに結合している。R1及びR2は、独立して-NH-、-CO-、-COO-、-O-、-S-、 NHNH-、-N=N-、=N-NH-などから選択することができるが、これらに限定されない。Lは、アルキル鎖などの直線状又は分岐鎖状の炭化水素鎖とすることができ、ここで1つ以上の炭素が、任意に、酸素、窒素、アミド、硫黄、スルホキシド、スルホン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリールなどと置き換えられている。いくつかの態様において、前記リンカーは、アミノ酸残基又はペプチドとすることができる。ある状況では、前記リンカーは、標的部位又はその近くで、酵素又はpHの変化によって開裂可能である。ある種のリンカー及びコンジュゲートを調製するのに適した手順は、米国特許第4,414,148号、第4,545,985号、第4,569,789号、第4,671,958号、第4,659,839号、第4,680,338号、第4,699,784号、第4,894,443号、及び第6,521,431号に記載されている。いくつかの態様において、前記リンカーは、以下のものである:
Figure 0006876618
 (式中、
Figure 0006876618
 は、前記抗体又はウレアーゼへの結合点を示す)。いくつかの態様において、
Figure 0006876618
 は、抗体のアミノ基への結合点を示し、
Figure 0006876618
 は、ウレアーゼのチオ基のS原子への結合点を示す。このリンカーは、前記抗体及びウレアーゼをコンジュゲートするのに連結剤SIAB(N-サクシニミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート)を用いた残基である。いくつかの態様において、ウルトラ精製(ultrapurification)が、クロスリンク剤としてSIABを用いるコンジュゲーション法に適した分離法である。
いくつかの態様において、前記リンカーは、以下の式の連結剤を用いた残基である:
Figure 0006876618
 (式中、Xは、ブロモ又はヨードであり、Lは、本明細書に記載されるようなリンカーである)。
いくつかの態様において、前記連結剤は、SBAP(サクシニミジル 3-［ブロモアセトアミノ］プロピオネート)又はSIA(N-サクシニミジル ヨードアセテート)であり、これらは、SIABの条件と類似の条件(例えば、HPLCクロマトグラフィー精製が必要ではなく、かつ限外濾過のみが必要とされ得る)下でコンジュゲーションに使用し得る。いくつかの態様において、SIABの連結アーム長(10.6アンストロング（Anstrong）)は、SBAP(6.2Å)及びSIA(1.5Å)のそれよりも、より適している/反射可能(reflexable)である。いくつかの態様において、前記連結剤は、コンジュゲーションに使用し得る、SPDP(サクシニミジル 3-(ピリジルジチオ)プロピオネート)、SMPT(サクシニミジルオキシカルボニル-メチル-(2-ピリジルジチオ)トルエン)、又はSMCC(サクシニミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-カルボキシレート)であるが、IEC及びエタノール分画などの2以上の分離法が、より低い収率でのコンジュゲーション反応溶液からの未反応のウレアーゼの分離に必要となる可能性がある。
さらに、これらに限定されないが、抗がん剤などの治療剤などの追加の成分を前記抗体に結合させて、治療効果をさらに強化することもできる。
(ウレアーゼ)
いくつかの研究により、進化的に多様な多くの細菌、植物、真菌、及びウイルス由来のウレアーゼの遺伝学に関する詳細な情報が提供されている(各々が引用により本明細書中に組み込まれている、Mobley, H. L. T.らの文献(1995) Microbiol. Rev. 59: 451-480; Eur J. Biochem., 175, 151-165 (1988); Labigne, A. (1990)、国際公報第WO90/04030号; Clayton, C. L.らの文献(1990) Nucleic Acid Res. 18, 362;並びに米国特許第6,248,330号及び第5,298,399号)。特に興味深いものは、植物にみられるウレアーゼである(Sirko, A.及びBrodzik, R.の文献(2000) Acta Biochim Pol 47(4): 1189-95)。例示的な植物ウレアーゼの1つは、タチナタマメウレアーゼである。他の有用なウレアーゼ配列を、公共のデータベース、例えば、Entrez(ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)で確認することもできる。
いくつかの態様において、前記ウレアーゼは、タチナタマメウレアーゼである。該タチナタマメウレアーゼは、以下に示す配列番号2のアミノ酸配列を有する:
Figure 0006876618
 。
有用なウレアーゼ配列を、公共のデータベース、例えば、Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)で確認することもできる。更に、多様な生物由来のウレアーゼを増幅するのに有用なプライマーを、Baker, K. M.及びCollier, J. L.(http://www.science.smith.edu/departments/Biology/lkatz/NEMEB_webpage/abstracts.html)により記載されているように利用することもでき、又はRoseらの文献(1998) Nucl. Acids Res. 26: 1628に記載されているように、CODEHOP(コンセンサス縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー)を用いることもできる。
ウレアーゼは、基質である尿素をアンモニア及びカルバメートへと変換することができる。この酵素活性は、pHを上昇させ環境をより塩基性とし得る。がん細胞周囲の環境は、典型的には酸性である(Webb、S.D.らの文献(2001) Novartis Found Symp 240: 169-81)。従って、このように細胞外の環境のpHを上昇させることにより、がん細胞の増殖が阻害される。従って、本技術のある態様における抗体-ウレアーゼコンジュゲートの添加は、間質液のpHを、約0.1pH単位、例えば、0.1〜0.5pH単位又はそれ以上上昇させる。
本技術のウレアーゼには、ウレアーゼの天然に存在する形態、及び機能的に活性なそのバリアントが含まれる。アミノ酸配列バリアントの2つの一般型が想定される。アミノ酸配列バリアントは、特定のアミノ酸において、ウレアーゼ活性を破壊しない1つ以上の置換を有するものである。これらのバリアントとしては、天然タンパク質と実質的に相同であり、かつ機能的に等価であるサイレントバリアント及び保存的に修飾されたバリアントが含まれる。天然タンパク質のバリアントは、そのアミノ酸配列の少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約90％、さらにより好ましくは少なくとも約95％、更により好ましくは98％、最も好ましくは少なくとも約99％が、天然タンパク質のアミノ酸配列と同一である場合に、天然タンパク質と「実質的に相同」である。バリアントは、1個もしくは最大で10個だけ、又はそれ以上のアミノ酸が異なり得る。
第2の種類のバリアントとしては、ウレアーゼの単離された活性な断片である、ウレアーゼのサイズバリアントが挙げられる。サイズバリアントは、例えば、化学的修飾により、タンパク質分解酵素による消化により、又はそれらの組合せにより、ウレアーゼを断片化させることによって形成してもよい。更に、遺伝子工学的技法、及びアミノ酸残基からポリペプチドを直接合成する方法を採用して、サイズバリアントを製造することができる。
「機能的に等価である」とは、バリアントの配列が、天然のウレアーゼと実質的に同じ生物活性を有するタンパク質を生じる鎖を規定することを意図している。実質的な配列のバリエーションを含むこのような機能的に等価であるバリアントも、本技術に包含される。従って、天然のウレアーゼタンパク質の機能的に等価であるバリアントは、治療的に有用となるのに十分な生物活性を有することとなる。機能的同等性を決定するための方法が、当該技術分野において利用可能である。生物活性は、天然のウレアーゼタンパク質の活性を測定するために特別に設計されたアッセイを用いて測定可能である。更に、生物活性天然タンパク質に対して産生された抗体を、機能的に等価であるバリアントに結合するそれらの能力について試験することができ、ここで、効果的な結合は、天然タンパク質のものと類似のコンホメーションを有するタンパク質を表す。
本技術のウレアーゼタンパク質配列は、保存的に置換された配列を含めて、該タンパク質の精製のための1以上のドメイン(例えば、ポリHisセグメント、FLAGタグセグメントなど)を付加させて生じるものなどのより大きなポリペプチド配列の一部として存在し得、ここで、該追加の機能的ドメインは、タンパク質のウレアーゼタンパク質部分の活性に対する作用をほとんど有しないか、もしくは全く有しないか、又はここで、該追加のドメインは、プロテアーゼを用いた処理によるものなどの、合成後加工工程によって除去することができる。
非機能性配列の付加などの本技術の核酸分子のコードされた活性を変化させない1以上の核酸又は配列の付加は、基礎となる核酸分子の保存的なバリエーションであり、本技術のポリペプチドの活性を変化させない1以上のアミノ酸残基の付加は、基礎となるポリペプチドの保存的なバリエーションである。このような種類の付加は双方とも、本技術の特徴である。当業者であれば、開示された核酸構築体の多くの保存的なバリエーションが、機能的に同一な構築体を生じることを認めるであろう。
マニュアルアラインメント、並びにコンピューター支援配列アラインメント及び分析を含む多様な配列の関係性を決定する方法を使用し得る。後者のアプローチは、コンピューター支援法によりもたらされる増加した処理量のために、本技術において好ましいアプローチである。配列アラインメントを行うための多様なコンピュータープログラムが利用可能であるか、又は当業者によって作成可能である。
上述のように、本技術において採用される核酸及びポリペプチド(並びにそれらの断片)の配列は、本技術のウレアーゼポリペプチドもしくは核酸分子(もしくはその断片)又は関連分子の対応する配列と同一である必要はないが、それと実質的に同一(又は実質的類似)とすることができる。例として、前記ポリペプチドに対し、例えば、そのような変化が、それらの使用において、例えば、それらの治療的用途又は投与用途においてある種の利点を提供する場合を含む、保存的又は非保存的のいずれかの、1個以上のアミノ酸又は核酸の挿入、欠失、及び置換のような種々の変化を行うことができる。
(ターゲティング部分)
ターゲティング部分は、本技術の化学的実体として想定され、がん細胞などの、規定された、選択された細胞型又は標的細胞集団に結合する。この点において有用であるターゲティング部分は、抗体及び抗体断片、ペプチド、並びにホルモンを含む。公知の細胞表面レセプター(低密度リポタンパク質、トランスフェリン、及びインスリンを含む)、線維素溶解酵素、アネキシンなどの血小板結合タンパク質、並びに生物学的応答調節剤(インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン、及びコロニー刺激因子を含む)に対応するタンパク質もまた、想定されるターゲティング部分である。オリゴヌクレオチド、例えば、標的細胞核酸の一部に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、本技術におけるターゲティング部分として用いてもよい。ターゲティング部分は、標的細胞表面に結合するオリゴヌクレオチドであってもよい。規定された標的細胞集団に結合する能力を保持している、上で列記したターゲティング部分の類縁体もまた、ターゲティング部分として用い得る。
上述のターゲティング部分の機能的均等物もまた、本技術のターゲティング部分として有用である。例示的なターゲティング部分の機能的均等物は、ターゲティング部分の標的細胞への結合に適切な立体配置及び/又は配向性を模倣するよう設計された有機化学的構築体である。ターゲティング部分の別の機能的均等物は、ターゲティング部分の結合親和性を示す短いポリペプチドである。
いくつかの態様において、本開示のターゲティング部分は、標的細胞の表面の抗原と反応性である抗体、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどである。商業的に利用可能であるか、文献に記載されているかのいずれかであるポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の双方を用い得る。該抗体は、全抗体又はそれらの断片であってもよい。モノクローナル抗体及び断片は、ハイブリドーマ合成、組換えDNA技術、及びタンパク質合成などの従来技術に従って製造してもよい。有用なモノクローナル抗体及び断片は、任意の種(ヒトを含む)に由来して得てもよく、2以上の種由来の配列を用いるキメラタンパク質として形成されてもよい。
いくつかの態様において、前記ターゲティング部分は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。いくつかの態様において、前記ターゲティング部分は、単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体(sdAb)又は「VHH」は、生来軽鎖を欠くラクダ科の哺乳動物にみられる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体は、VH領域、VHH領域、又はVL領域に由来し得る。いくつかの態様において、前記単一ドメイン抗体は、ヒト起源のものである。いくつかの態様において、前記ヒト単一ドメイン抗体は、引用によりその全体が本明細書中に組み込まれているWO2006/099747、及びWO2009/079793、及びWO2012/100343に開示されている重鎖又は軽鎖配列を含む。一態様において、前記ヒト単一ドメイン抗体は、WO2012/100343に述べられているように、フレームワーク領域内にジスルフィド結合を有する重鎖又は軽鎖配列を含む。
いくつかの態様において、前記ターゲティング部分(例えば、抗体)は、癌腫、白血病、リンパ腫、及び肉腫により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。癌腫は、肛門、胆道、膀胱、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿路、卵巣、結腸、非小細胞性肺癌、生殖器、内分泌腺、甲状腺、並びに皮膚のものであってもよい。いくつかの態様において、前記ターゲティング部分(例えば、抗体)は、カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、頭部及び頚部腫瘍、原発性腫瘍、血管腫、黒色腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、並びに脳、神経、眼、及び髄膜の腫瘍により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記ターゲティング部分(例えば、抗体)は、癌腫、乳がん、膵臓の、卵巣の、肺、及び結腸がんにより発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記ターゲティング部分(例えば、抗体)は、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。
いくつかの態様において、前記抗体は、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原は、CEACAM6(癌胎児性抗原関連細胞接着分子6)であり、かつ前記抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。非特異的交差反応性抗原(NCA)又はCD66cとしても知られるCEACAM6は、よくキャラクタリゼーションされたがん抗原である(11、12)。これは、CEACAM1、CEACAM7、及びCEACAM8などのヒト癌胎児性抗原と高い配列相同性を共有する。これは、グリコシルホスホイノシトール(GPI)連結型細胞表面タンパク質であるが、細胞質ドメインは知られていない。CEACAM6の発現は、乳房、膵臓、卵巣、肺、及び結腸がん組織において顕著に増加する。その増加した発現は、腫瘍細胞の浸潤性かつ転移性の挙動と関係している(13)。いくつかの態様において、前記抗体は、Kd値が、約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、Kd値が、約1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、又は1×10-20Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記抗体は、肺腺癌細胞上のCEACAM6を認識する単一ドメインのラクダ科動物抗体断片(AFAIKL2、配列番号1)である。いくつかの態様において、前記抗体は、図5に示されるような配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、前記抗体は、前記配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも1つの改変を含むポリペプチドを含む。いくつかの態様において、前記抗体は、前記配列番号1のアミノ酸配列に対し少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、及び99％の配列相同性を含むポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、Santa Cruz Biotechから入手可能な抗CEACAM6抗体(9A6):sc-59899である。CEACAM6抗体(9A6)は、200μg/mlで提供されるマウスモノクローナルIgG1であり、ヒト起源のCEACAM6発現腫瘍細胞株に対して産生されたものである。これは、ヒト起源のCEACAM6の検出用に推奨される。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、abcamから入手可能な抗CEACAM6抗体(ab56234)である。該抗CEACAM6抗体(ab56234)は、CEACAM6に対するウサギポリクローナル性のものである。これは、ヒトCEACAM6の内部配列アミノ酸217〜266に対応する合成ペプチド
Figure 0006876618
 内の領域に対して産生された。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、Novus Biologicalsから入手可能な抗CEACAM-6/CD66c抗体であり、これは、CEACAM6に対するウサギポリクローナル抗体であり、かつウエスタンブロット及び免疫組織化学-Pで検証された。これは、ヒトCEACAM6の中間領域(NP_002474)に対する合成ペプチド
Figure 0006876618
 に対して産生された。
いくつかの態様において、CEACAM6抗体は、OriGeneから入手可能な抗CEACAM6抗体EPR4403であり、これは、CEACAM6に対するウサギモノクローナル抗体(クローンEPR4403)である。これは、ヒトCEACAM6における残基に対する合成ペプチドに対して産生された。これは、マウス、ラット、及びヒトのCEACAM6に対する反応性を有する。
いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値が約10nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、IC50値が約4nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記IC50値は、約3.22nMである。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約10〜30μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。標的抗原に対する抗体又はコンジュゲートの結合親和性は、本明細書に記載される方法又は当技術分野において公知の方法によって決定することができる。いくつかの態様において、本技術は、この抗CEACAM6-ウレアーゼコンジュゲート(L-DOS47)を記載する。いくつかの態様において、本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲート、例えば、FAIKL2-ウレアーゼを記載する。ラマの重鎖抗体レパートリーに由来して得たファージライブラリーを用いて、非小細胞性肺腺癌A549に対してパンニングすることによって、単一ドメイン抗体(sdAb)を特定する。該sdAbを、AFAIと名付ける。AFAIの遺伝子配列は、コンジュゲーションの目的のために最適化され、AFAIKL2と再命名される。いくつかの態様において、該AFAIKL2抗体は、クローニングされ、大腸菌(E. coli)BL21 (DE3) pT7-7系において発現される。
ヒト化ターゲティング部分は、宿主レシピエントにおける抗体又はポリペプチドの免疫反応性を減少させることが可能であり、半減期の増加及び有害な免疫反応の減少を可能とする。マウスのモノクローナル抗体を、例えば、マウスのFv領域又はその相補性決定領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒト定常ドメイン領域及びFc領域をコードするヌクレオチド配列と遺伝的に組み換えることによってヒト化してもよい。マウスの残基をヒト可変領域フレームワークドメイン内に保持して、適切な標的部位結合特性を確保してもよい。種々の活性薬剤をがん細胞へと送達するための遺伝子操作された抗体は、Bodey, B.の文献(2001) Expert Opin Biol. Ther. 1(4):603-17に総説されている。
いくつかの態様において、前記ターゲティング部分は、標的細胞の表面上のレセプターと反応性のリガンドである。従って、該ターゲティング部分は、これらに限定するものではないが、細胞結合成分に対する親和性を有するホルモン、細胞結合成分によって認識される炭水化物部分を含有する任意の分子、及び細胞結合成分に結合する薬物又は小分子を含み得る。「結合成分」という句は、レセプター及びアクセプター分子の双方を含む。好ましくは、該結合成分は、細胞表面結合成分である。一態様において、前記ターゲティング部分は、インスリンなどの、標的部位に結合する天然に存在するタンパク質である。インターロイキン、並びに顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)及び腫瘍壊死因子(TNF)などの因子を含むサイトカインもまた、高レベルのそれらのレセプターを発現している特定の細胞に結合することが知られている具体的なターゲティング部分である(Terlikowski, SJの文献(2002) Toxicology 174(3):143-152)。
ウレアーゼ又は他の活性薬剤の非標的細胞又は組織への曝露を低減するために、ターゲティング部分をスクリーニングして、標的特異性及び反応性を保持しつつ、最小の非標的反応性を示すものを特定してもよい。非標的曝露(及び有害な非標的局在化及び/又は毒性)を減少することにより、増加したウレアーゼ又は他の活性薬剤の用量を投与し得る。このことは、許容し得ない非標的細胞毒性の閾値未満を維持しつつ標的細胞の曝露を最大化するための、可能な限り高い濃度のウレアーゼ又は他の治療剤の投与を可能とする。
いくつかの態様において、2つ以上の活性薬剤-ターゲティング部分コンジュゲートが採用され、ここで、各々のコンジュゲートは、異なるターゲティング部分として、例えば、異なる抗体種を含む。利用されるターゲティング部分の各々は、異なる標的部位領域に結合し、これは同じ又は異なる標的部位と関連し得る。投与されたコンジュゲートの各々の活性薬剤成分は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、各々が引用により本明細書に組み込まれている米国特許第4,867,962号及び第5,976,535号を参照されたい。いくつかの態様において、活性薬剤コンジュゲートの標的部位への標的部位付着は、各々のターゲティング部分、例えば、抗体種が、異なる標的部位領域(すなわち、エピトープ)を認識するために、向上する。この代替の標的部位領域アプローチは、より強力な標的部位結合点を、活性薬剤に提供する。その結果、例えば、エピトープ飽和及び/又は立体障害を介する実際の又は実効的な標的部位飽和が、回避され得る。従って、活性薬剤、例えば、ウレアーゼの相加的蓄積が達成され得る。代わりに、又は組み合わせで、追加のウレアーゼ特異的遺伝子産物を、例えば、標的部位において触媒として活性なホロ酵素の製造のための活性薬剤として採用してもよい。例示的なウレアーゼアポ酵素としては、細菌のureABC遺伝子(Burne, R.A.及びChen, Y.M.の文献(2000) Microbes and Infection 2:533-542)によってコードされるガンマ、ベータ、及びアルファサブユニットが挙げられる。
特定の標的部位に対するモノクローナル抗体の交差反応性のパターンを解析して、治療的応用における使用のための重なり合わない交差反応性を有する2つ以上の標的特異的モノクローナル抗体の組み合わせを特定可能である。「交差反応性の重なり合わないパターン」という句は、1つの抗体種により結合される非標的組織が、別の抗体種により結合される非標的組織とは実質的に異なることを示す。該交差反応性のパターンは、治療的応用のための活性薬剤の曝露をその分だけ減少させるのに必要な程度まで異なる。抗体ペア(又はより大きな抗体の組み合わせ)のより少ない重なり合いが好ましい。
抗体は、多様な方法によってスクリーニングし得る。免疫組織化学的分析を採用して、標的組織との反応性及び非標的組織との交差反応性を決定し得る。抗体種が結合する組織を、該組織を該抗体へと曝露すること;該組織を洗浄してすべての結合していない抗体を除去すること;及び結合した抗体の存在を検出することによって特定し得る。インビトロの組織化学的な手順は、当技術分野において公知である。例えば、Sanchez-Islas, E.及びLeon-Olea, M.の文献(2001) Nitric Oxide 5(4):302-16を参照されたい。
ターゲティング部分が比較的短い場合、それを標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成し得る。配列のC-末端アミノ酸を不溶性担体に取り付け、それに続き、配列内の残りのアミノ酸を逐次添加する固相合成が、ポリペプチドの化学合成のための方法の1態様として想定される。固相合成のための技術は、「ペプチド:分析、合成、生物学。第2巻:ペプチド合成における特別な方法、パートA（The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2::Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.)」内のBarany及びMerrifieldの文献、「固相ペプチド合成(Solid -Phase Peptide Synthesis)」;第3〜284頁:Merrifieldらの文献J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963)、並びにStewartらの文献「固相ペプチド合成、第２版(Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed.)」 Pierce Chem. Co., Rockford, III.(1984)に記載されている。
抗体又はウレアーゼをコードするDNAは、例えば、適切な配列のクローニング及び制限、又はNarangらの文献(1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99のホスホトリエステル法;Brownらの文献(1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151のホスホジエステル法;Beaucageらの文献(1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862のジエチルホスホロアミダイト法;及び米国特許第4,458,066号の固相担持法などの方法による直接的な化学合成を含む任意の適当な方法によって調製し得る。
化学合成では、一本鎖オリゴヌクレオチドが製造される。これを、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、又はDNAポリメラーゼを用い、該一本鎖をテンプレートとして用いるポリメリゼーションによって二本鎖DNAへと変換してもよい。DNAの化学合成は、約100塩基の配列に限定されるものの、より長い配列を、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを当業者は認識するものである。
あるいは、サブシーケンスをクローニングして、適切なサブシーケンスを適切な制限酵素を用いて切断することができる。その後、該断片をライゲーションして、所望のDNA配列を製造することができる。
(抗体-ウレアーゼコンジュゲートを調製する方法)
本技術は、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含み、かつ該抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準で約5％、4％、3％、2％、又は1％を超えないウレアーゼなどの、非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない組成物を調製する方法であって、(1)活性化された該抗体及び該ウレアーゼを、1時間あたり10％、5％、又は1％を超えない反応などの、該活性化された抗体及び該ウレアーゼが実質的に反応しない溶媒中で混ぜ合わせて、反応混合物を形成させることであって、該溶媒中の活性化された該抗体及び該ウレアーゼの分布が一様である、前記形成させること、及び(2)該活性化された抗体が、該ウレアーゼと容易に反応して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成するように、前記(1)の混合物の性質を変化させることを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、前記(1)の混合物の性質は、前記pH値である。いくつかの態様において、前記(1)の混合物の性質を変化させることは、前記pHを、前記活性化された抗体が、前記ウレアーゼと容易に反応して、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成する値まで上昇させることを含む。いくつかの態様において、活性化された該抗体は、容易に、例えば、少なくとも90％又は少なくとも95％の活性化された抗体は、前記混合物が、前記混合物の性質を変化させてから約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、又は約1時間後に非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない速度で、(2)において前記ウレアーゼと反応する。
いくつかの態様において、前記方法は、約6.0〜7.0、例えば、約6.5のpHを有する酸性の水性緩衝液中で活性化された抗体及びウレアーゼを混ぜ合わせること、該pHを、塩基性のpHである約8.0〜9.0、例えば、約8.3へと調整して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成させること、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを、ウルトラダイアフィルトレーションによって精製することを含み、ここで該方法は、クロマトグラフィー精製工程を含まない。いくつかの態様において、前記水性緩衝液は、約5〜8のpHを有する。いくつかの態様において、前記活性化された抗体及び前記ウレアーゼは、酸性の水性緩衝液中で組み合わされる。いくつかの態様において、活性化された抗体及びウレアーゼの比は、約3〜約12である。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり抗体部分が6〜15個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8〜11個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記pH調整剤は、緩衝剤又は緩衝剤溶液である。いくつかの態様において、前記pH調整剤は、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸、炭酸、重炭酸、グルコン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、クエン酸、モノエタノールアミン、乳酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、その塩、又はそれらの組み合わせのうちの1つ以上を含む。いくつかの態様において、前記緩衝剤は、グリシン、酢酸、クエン酸、ホウ酸、フタル酸、リン酸、コハク酸、乳酸、酒石酸、炭酸、塩酸、水酸化ナトリウム、その塩、又はそれらの組み合わせのうちの1つ以上を含む。いくつかの態様において、前記緩衝剤溶液は、塩酸グリシンバッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファー、乳酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸-リン酸バッファー、リン酸-酢酸-ホウ酸バッファー、フタル酸バッファー、又はそれらの組み合わせのうちの1つ以上を含む。いくつかの態様において、前記バッファーは、リン酸バッファーではない。いくつかの態様において、前記酸性のバッファーは、酢酸ナトリウムバッファーである。いくつかの態様において、前記pHは、ホウ酸ナトリウム溶液(例えば、0.1〜5M、又は1M)などの塩基の水溶液の添加を含む方法によって、前記塩基性のpHへと調整される。理論によって束縛されることは望まないが、酢酸ナトリウムバッファーは、低い緩衝能を有しており、かつpHが8.5の1Mホウ酸バッファーによって、pHを、8.3へと調整することに適している。いくつかの態様において、トリス-HClバッファー(例えば、1Mトリス-HCl)は、前記混合物を、pH8〜9、例えば、8.3へと調整するのに用いられる。
いくつかの態様において、反応時間及び抗体/ウレアーゼ比は、定数として保たれている。いくつかの態様において、反応混合物中の抗体/ウレアーゼのモル比は、約25、又は約21、又は約1.8〜12抗体/ウレアーゼである。いくつかの態様において、抗体/ウレアーゼモル比は、4から25に調整される。いくつかの態様において、抗体/ウレアーゼモル比は、少なくとも6である。
いくつかの態様において、1％又は2％を超えない未反応抗体が、ウルトラダイアフィルトレーションなどの精製後に前記混合物中に存在する。いくつかの態様において、他の非HPLC精製法を使用し得る。例えば、エタノール晶析/分画を、より低い収率での精製に使用し得る。いくつかの態様において、前記抗体の分子量は、50kDaを超えず、例えば、約10〜20kDa、又は約13kDaであり、前記精製は、ウルトラダイアフィルトレーションである。いくつかの態様において、前記方法は、少なくとも総蛋白の約60重量％、総蛋白の約70重量％、総蛋白の約80重量％、又は少なくとも総蛋白の90重量％の収率で、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを提供する。総蛋白は、ウレアーゼ及びAFAIKL2抗体を組み合わせた量(重量)を意味する。いくつかの態様において、(総タンパク質重量で)10〜20％を超えない非コンジュゲート抗体が、精製前の反応混合物に残存している。
本技術は、酸性水性溶媒(上述のようなもの)中に活性化された抗体及びウレアーゼを含み、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを実質的に含まない、例えば、ウレアーゼの重量基準で抗体-ウレアーゼコンジュゲートが約5％、4％、3％、2％、又は1％を超えない、安定な組成物を提供する。本技術はさらに、水性溶媒中に、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含み、かつ非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない、例えば、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準でウレアーゼが約5％、4％、3％、2％、又は1％を超えない組成物であって、該水性溶媒が、約8〜9、例えば、8.3(上述のように)のpHを有する、前記組成物を提供する。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含む組成物は、総抗体(活性化された抗体及び未反応抗体)で、約40〜60％を超えない非コンジュゲート抗体をさらに含む。いくつかの態様において、前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含む組成物は、総蛋白で約10〜20％を超えない非コンジュゲート抗体をさらに含む。
ウレアーゼは、インビボで一般毒性を有するアンモニアの放出を引き起こし、かつそれ自体は腫瘍を標的としないため、非コンジュゲートウレアーゼの存在は、ウレアーゼが正常組織中に存在して正常組織に対する毒性を生じさせるリスクを増加させる。しかしながら、ウレアーゼのサイズ及び他の性質のために、特に大規模では、抗体のウレアーゼへのコンジュゲーションによって、クロマトグラフィー精製法による非コンジュゲートウレアーゼからの抗体-ウレアーゼコンジュゲートの迅速な分離を可能とするのに十分なサイズや他の相違がもたらされることはない。
本技術は、驚くべきことに、ウレアーゼと抗体との実質的に完全なコンジュゲーションを提供し、得られる生成物は、何らクロマトグラフィー精製を行わずとも、非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない。ウレアーゼを実質的に含まないことで、本明細書に記載される組成物は、全身投与によって、該組成物中の実質的に全てのウレアーゼの部分を、標的部位へと送達する。ウレアーゼの標的部位への標的送達は、ウレアーゼによって生成されるアンモニアの一般毒性を減少させるか、又は無くし、かつ治療効果を生じさせるために投与されるべきウレアーゼの量を減少させる。本技術は、大規模での、例えば、少なくとも約1g、10g、100g、又は1kgでの、臨床での使用のための、特に、ウレアーゼの局所投与によって治療することが難しい又は非実用的である転移性腫瘍を治療するための、ウレアーゼを実質的に含まない前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートの調製に特に適している。
本技術はまた、腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該抗体分子を、1つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成させることを含み、前記コンジュゲートが、非コンジュゲート抗体よりも少なくとも約100倍、例えば、約200倍、約300倍、約400倍、及び約500倍高い、該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法を提供する。いくつかの態様において、競合的結合アッセイは、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの結合親和性が、増加したアビディティーのために、天然の単一ドメイン抗体のそれよりも約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、及び約500倍強力であることを示す。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、又は11個であるコンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8、9、10、又は11個である平均コンジュゲーション比率を有する。いくつかの態様において、前記ウレアーゼは、タチナタマメウレアーゼである。いくつかの態様において、前記抗体は、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である。いくつかの態様において、前記抗体は、単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、前記腫瘍抗原は、非小細胞性肺癌により発現されるものである。いくつかの態様において、前記抗体は、CEACAM6に対する特異性を有する。いくつかの態様において、前記抗体は、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約1×10-8Mを超えないKd値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約1×10-10Mを超えないKd値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約5nMを超えないIC50値でCEACAM6に結合する。いくつかの態様において、前記IC50値は、約3.22nMである。いくつかの態様において、前記コンジュゲートは、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する。非特異的交差反応性抗原(NCA)又はCD66cとしても知られるCEACAM6は、よくキャラクタリゼーションされたがん抗原である。CEACAM6は、CEACAM1、CEACAM7、及びCEACAM8などの他のヒト癌胎児性抗原と高い配列相同性を共有する。CEACAM6は、グリコシルホスホイノシトール(GPI)連結型細胞表面タンパク質であるが、細胞質ドメインは知られていない。CEACAM6発現は、乳房、膵臓、卵巣、肺、及び結腸のがん組織において顕著に上昇する。
(組成物製剤)
本技術の組成物は、ウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含み、かつ任意に非水性HPLC溶媒を含まない。いくつかの態様において、前記組成物は、医薬として許容し得る組成物である。前記組成物は、生体適合性医薬担体、アジュバント、又はビヒクルをさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、前記組成物は、固体形態である。いくつかの態様において、前記組成物は、約0.1〜10mg/mL、約0.5〜5mg/mL、約1〜5mg/mL、又は約1.5〜2.0mg/mLのコンジュゲートを含む水性液剤中のものである。いくつかの態様において、前記水性液剤は、ヒスチジン、スクロース、及びEDTAのうちの1つ以上などの賦形剤をさらに含む。いくつかの態様において、前記水性液剤は、約1〜20mM、例えば、10mMのヒスチジン、約0.1〜5w/v％、例えば、1w/v％のスクロース、約0.1〜0.5mM、例えば、0.2mMのEDTAを含む。いくつかの態様において、前記水性液剤は、約6.5〜7、例えば、約6.8のpHを有する。いくつかの態様において、前記水性液剤は、リン酸塩を含有しない。いくつかの態様において、前記組成物は、前記水性液剤の凍結乾燥によって得られる固体形態である。いくつかの態様において、前記固体形態は、リン酸塩を含有しない。
前記組成物は、賦形剤(複数可)又は他の医薬として許容し得る担体と混合された他のヌクレオチド配列、ポリペプチド、薬物、又はホルモンも含んでいてもよい。医薬組成物以外の組成物は、任意に、液体、すなわち、水又は水ベースの液体を含む。
医薬組成物に添加される医薬として許容し得る賦形剤もまた、当業者に周知されており、容易に利用可能である。賦形剤の選択は、一つには前記生成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定されるものである。従って、本技術の文脈での使用に適した多様な製剤が存在する。
医薬組成物の製剤及び投与のための技術は、「Remingtonの薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」、第19版、Williams & Wilkins、1995に見出すことができ、当業者に周知されている。賦形剤の選択は、一つには本技術による生成物の投与に用いられる特定の方法によって決定されるものである。従って、本技術の文脈での使用に適した多様な製剤が存在する。以下の方法及び賦形剤は、単に例示的なものであり、決して限定するものではない。
本技術の医薬組成物は、任意の従来法、例えば、混合、溶解、造粒、湿式粉砕(levigating)、乳化、カプセル化、封入、融解紡糸、噴霧乾燥、又は凍結乾燥プロセスを用いて製造してもよい。しかしながら、最適な医薬製剤は、投与の経路及び所望の投薬量に応じて当業者によって決定されるものである。このような製剤は、投与された薬剤の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
前記医薬組成物は、適当な医薬として許容し得る担体を含有するよう製剤化され、かつ任意に、活性化合物の医薬として使用し得る調製物への加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含んでいてもよい。一般に、投与様式が担体の性質を決定するものである。例えば、非経口投与のための製剤は、水溶性形態の活性化合物の水性液剤を含んでいてもよい。非経口投与に適した担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、及び他の生理学的に適合性の溶液から選択することができる。非経口投与に好適な担体は、生理学的に適合性のバッファー、例えば、ハンクス液、リンゲル液、又は生理緩衝食塩水である。組織又は細胞投与のためには、透過されるべき特定のバリアーに適切な浸透剤が、前記製剤中に用いられる。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野において公知である。タンパク質を含む調製物については、前記製剤は、安定化材料、例えば、ポリオール(例えば、スクロース)及び/又は界面活性剤(例えば、非イオン性の界面活性剤)などを含んでいてもよい。
また、非経口での使用のための製剤は、適当な油性の注射懸濁液として調製された活性化合物の懸濁液を含んでいてもよい。適当な親油性の溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油及びオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランを含有していてもよい。任意に、前記懸濁液はまた、適当な安定化剤又は前記化合物の溶解性を増加させて高度に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。乳化剤又は分散剤(界面活性材料;界面活性剤)によって任意に安定化された、乳剤、例えば、水中油型及び油中水型分散剤も使用し得る。上述のように前記活性薬剤を含有するリポソームも、非経口投与に採用し得る。
また、前記薬剤を経口投与に適した投薬量で含む医薬組成物を、当技術分野において周知の医薬として許容し得る担体を用いて製剤化することができる。経口投与のために製剤化された調製物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、ロゼンジ錠、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液、又は散剤の形態であってもよい。例示のために、経口での使用のための医薬調製物は、前記活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、任意に得られた混合物を粉砕すること、及び望ましい場合適当な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して錠剤を得ることにより得ることができる。経口製剤は、非経口用途について説明したものと類似の種類の液体の担体、例えば、緩衝水溶液、懸濁液、などを採用してもよい。
これらの調製物は:a)ラクトース、ブドウ糖、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類などの希釈剤;b)ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモなど由来のデンプンなどの結合剤;c)メチルセルロース、ヒドロキシプロピルネチルセルロース(hydroxypropyhnethyl cellulose)、及びナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース材料、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム及びトラガカントガムなどのガム、並びにゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質;d)架橋ポリビニルピロリドン、デンプン、寒天、アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸又はその塩などの崩壊剤又は可溶化剤;又は発泡性の組成物;e)シリカ、タルク、ステアリン酸、もしくはそのマグネシウムもしくはカルシウム塩、及びポリエチレングリコールなどの滑沢剤;f)香料及び甘味料;g)例えば、製品を識別するため又は活性薬剤の量(投薬量)を表すための着色料又は色素;並びにh)防腐剤、安定化剤、膨張剤、乳化剤、溶液プロモーター(solution promoter)、浸透圧を調節するための塩、及びバッファーなどの他の成分があげられるが、これらに限定されない、1以上の賦形剤を含有していてもよい。
前記医薬組成物は、前記活性薬剤の塩として提供されてもよく、この塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるがこれらに限定されない多くの酸と形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性又は他のプロトン性溶媒により可溶性となる傾向にある。
前記コンジュゲートそれ自体及び該コンジュゲートの製剤の特性は、投与されたコンジュゲートの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を与えることができる。そのような薬物動態学的及び薬力学的な情報は、後に臨床試験の過程においてヒトで確認される前臨床インビトロ及びインビボ研究を通じて収集することができる。インビボでの動物データに基づいてヒト臨床試験を行うためのガイダンスは、例えば、http://www.clinicaltrials.govを含むいくつかのソースから得ることができる。従って、本技術の方法において用いられる任意の化合物について、哺乳動物、特にヒトにおいて治療に効果的な用量は、初めは、生化学的及び/又は細胞ベースのアッセイから推定することができる。その後、投薬量を動物モデルにおいて明確化して、コンジュゲート活性を調節する所望の循環濃度範囲を達成することができる。ヒトでの研究が行われるにつれ、種々の疾患についての適切な投薬量レベル及び治療期間、並びに条件に関するさらなる情報が明らかになるであろう。
前記コンジュゲートの毒性及び治療有効性を、細胞培養液又は実験的動物において、例えば、LD50(集団の50％に対して致死的な用量)及びED50(集団の50％において治療に効果的な用量)を決定するための標準的な医薬的手順によって決定することができる。
(追加の活性薬剤)
追加の活性薬剤も、本技術の組成物に含まれていてもよい。該追加の活性薬剤、例えば、抗腫瘍剤(増殖性の細胞に対して活性な薬剤)を、細胞を第1の活性薬剤に接触させる前にか、それと同時にか、又はそれの後に、前記組成物において利用してもよい。例えば、ウレアーゼが、腫瘍細胞に標的化された後に、それは、例えば、pH変化を介して腫瘍外部環境を調節又は調整する能力を有する可能性がある。そうすると、塩基性の環境を好む抗腫瘍剤などの活性薬剤は、より効果的となるであろう。
ある態様において、ウレアーゼによって酵素的に処理されることが可能である基質が、活性薬剤としての使用に想定される。いくつかの態様において、該活性薬剤は、ウレアーゼに利用されて、アンモニウムイオンが生じる基質、例えば、尿素である。
例示的な抗腫瘍剤としては、サイトカイン及び他の部分、例えば、インターロイキン(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12など)、トランスフォーミング増殖因子-ベータ、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、インターフェロン(例えば、ガンマ-インターフェロン)、コロニー刺激因子(例えば、GM-CSF、M-CSFなど)、血管透過性因子、レクチン炎症反応促進因子(セレクチン)、例えば、L-セレクチン、E-セレクチン、P-セレクチン、及びタンパク質性部分、例えば、C1q及びNKレセプタータンパク質が挙げられる。さらなる適切な抗腫瘍剤としては、血管新生を阻害し、従って、転移を阻害する化合物が挙げられる。そのような薬剤の例としては、プロタミンメドロキシプロゲステロン、ペントサンポリサルフェート、スラミン、タキソール、サリドマイド、アンギオスタチン、インターフェロン-アルファ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板第4因子、ソマトスタチン、トロモボスポンジン(thromobospondin)が挙げられる。本技術によって有用な活性薬剤他の代表的かつ非限定的な例としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ブスルファン、チオラムブシル(chiorambucil)、スピロプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、アラビノシルアデニン、メルカプトプリン、ミトタン、プロカルバジン、ダクチノマイシン(アンチノマイシンD)、ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、タキソール、プリカマイシン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、フルタミド、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、テストラクトン、トリロスタン、アムサクリン(m-AMSA)、アスパラギナーゼ(L-アスパラギナーゼ)、エトポシド、ヘマトポルフィリンなどの血液製剤、又は前述のものの誘導体が挙げられる。活性薬剤の他の例としては、遺伝子材料、例えば、組換えRNA及びDNAを含む、天然又は合成起源の核酸、RNA、及びDNAが挙げられる。あるタンパク質をコードするDNAを、多くの異なる種類の疾患の治療において用いてもよい。例えば、腫瘍壊死因子又はインターロイキン-2遺伝子が、進行したがんの治療のために提供されてもよく;チミジンキナーゼ遺伝子が、卵巣がん又は脳腫瘍の治療のために提供されてもよく;インターロイキン-2遺伝子が、神経芽腫、悪性のメラノーマ、又は腎臓がんの治療のために提供されてもよい。本技術における使用に想定される追加の活性薬剤は、その全体が、引用により本明細書に組み込まれている米国特許第6,261,537号に記載されている。抗腫瘍剤及びそのような薬剤を検出するためのスクリーニングは、Monga, M.及びSausville, E.A.の文献(2002) Leukemia 16(4): 520-6に総説されている。
いくつかの態様において、前記活性薬剤は、弱塩基性の抗腫瘍化合物であり、その有効性は、固形腫瘍における細胞内でより高い/細胞外でより低いpHグラジエントによって減少する。例示的な弱塩基性の抗腫瘍化合物としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン及びビンクリスチン、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド及び塩酸メクロレタミン、及び抗悪性腫瘍性のプリン及びピリミジン誘導体が挙げられる。
いくつかの態様において、前記組成物は、ウレアーゼを含み、かつ、任意のサイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子及び/又はインターフェロンを実質的に欠く。この態様において、ウレアーゼ単独でか、又はサイトカイン以外の活性薬剤と共に小分子抗腫瘍剤と組み合わせたものは、がん細胞増殖の阻害に効果的である。従って、この態様において、該組成物は、治療されている対象内に存在する内在性又は天然のサイトカインと協力して作用してもしなくてもよいが、投与される組成物は、追加の外来性のサイトカインを含有しない。
いくつかの態様において、前記追加の活性薬剤は、ペメトレキセド及び/又はカルボプラチンではない。いくつかの態様において、前記追加の活性薬剤は、葉酸代謝拮抗薬及び/又は白金剤ではない。
(送達及び投与の方法)
前記抗体-ウレアーゼコンジュゲート組成物は、当技術分野において公知のいくつかの方法によってがん細胞へ送達されてもよい。治療的応用において、前記組成物は、がん細胞(複数可)の増殖を阻害するのに十分な量で、がん細胞を有する患者に投与される。前記医薬組成物を、非経口的、経腸的、経上皮的、経粘膜的、経皮的、及び/又は外科的なものを含むが、これらに限定されないいくつかの経路による投与によってがん細胞に曝すことができる。
非経口投与様式としては、前記組成物が、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄内、筋肉内、関節内、くも膜下腔内、及び脳室内注射、皮下、性腺内、もしくは腫瘍内ニードルボーラス注入、又は長期連続的な、拍動性のもしくは計画的な灌流、又は適切なポンプ技術を用いるマイクロ注入によって投与されるものが挙げられる。経腸投与様式としては、例えば、経口(頬側及び舌下を含む)並びに直腸内投与が挙げられる。経上皮投与様式としては、例えば、経粘膜投与及び経皮投与が挙げられる。経粘膜投与としては、例えば、経腸投与、並びに経鼻、吸入、及び深肺投与(deep lung administration)、膣内投与、及び直腸内投与が挙げられる。経皮投与としては、例えば、パッチ及び及びイオン泳動装置、並びにペースト剤、軟膏剤(salve)、又は軟膏剤(ointment)の外用を含む、受動的な又は能動的な経皮(transdermal)又は経皮(transcutaneous)様式が挙げられる。外科的技術としては、デポ(リザーバー)組成物、浸透圧ポンプなどのインプラント術が挙げられる。
対象が必要としかつ耐容性を示すような投薬量及び頻度によって、前記活性薬剤の単回又は複数回の投与が実施され得る。いかなる場合でも、前記組成物は、該対象を効果的に治療するのに十分な量の前記活性薬剤を提供すべきである。
いくつかの態様において、本技術は、がん細胞への抗体-ウレアーゼコンジュゲートを含む医薬組成物の送達のための化学的実体としてのベシクル、例えば、リポソーム及び/又はナノカプセルの使用を企図する。そのような製剤は、本明細書において開示されるポリペプチド、医薬、及び/又は抗体の医薬として許容し得る製剤の導入に好適である可能性がある。リポソームの形成及び使用は、一般に当業者に公知である(例えば、Backer, M.V.らの文献(2002) Bioconjug Chem 13(3):462-7を参照されたい)。好適な態様において、開示される組成物は、リポソーム内に捕捉されていてもよい。
ナノカプセルは、一般に、化合物を安定かつ再現性のあるやり方で捕捉することができる(Whelan、J.の文献(2001) Drug Discov Today 6(23):1183-84)。細胞内での重合体の過負荷が原因の副作用を回避するために、そのような超微粒子(およそ0.1μmのサイズ)を、インビボで分解可能なポリマーを用いて設計してもよい。これらの要件を満たす生分解性ポリイソブチルシアノアクリレートナノ粒子は、本技術における使用に想定され、そのような粒子は、例えば、Lambert, G.らの文献(2001) Int J Pharm 214(1-2):13-6に記載されるように容易に作製され得る。生物活性物質を含有するポリアルキル-シアノ-アクリレートナノ粒子を調製する方法、及びそれらの使用は、米国特許第4,329,332号、第4,489,055号、及び第4,913,908号に記載されている。ナノカプセルは、Capsulution, Inc. (www.capsulution.com)などの供給者から商業的に利用可能である。
組成物の送達のためのナノカプセルを含有する医薬組成物は、米国特許第5,500,224号、第5,620,708号、及び第6,514,481号に記載されている。米国特許第5,500,224号には、その中に溶解した界面活性剤、及びその中に懸濁された500ナノメートル未満の直径を有する複数のナノカプセルを含有する油から本質的になる油性相を含むナノカプセルのコロイド懸濁液の形態の医薬組成物が記載されている。米国特許第5,620,708号には、組成物、並びに薬物及び他の活性薬剤の投与のための方法が記載されている。該組成物は、哺乳動物の腸細胞の表面に存在する標的分子に特異的に結合する結合部分に取り付けられた活性薬剤担体粒子を含む。該結合部分は、粒子状活性薬剤担体のエンドサイトーシス又はファゴサイトーシスを開始させるのに十分な結合親和性又はアビディティーで標的分子に結合して、該担体を腸細胞によって吸収させる。該活性薬剤はその後、前記担体から宿主の体循環へと放出されることとなる。このように、腸におけるポリペプチドなどの易分解性薬物の分解を、腸管からのタンパク質及びポリペプチドの吸収を増加させつつ回避することができる。あるいは、本技術は、標的細胞周囲の環境における前記活性薬剤の放出を企図する。例えば、一態様において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートは、ウレアーゼが標的細胞、例えば、腫瘍細胞の周囲のマイクロ環境内へと放出されるように、標的部分が標的細胞に結合した後にナノカプセルから放出される。米国特許第6,379,683号及び第6,303,150号には、ナノカプセルを作製する方法及びその使用が記載されており、これらは引用により本明細書中に組み込まれている。
使用される医薬組成物は、有効量で対象に投与される。一般に、有効量は:(1)治療することが求められる疾患の症状を減少させること;又は(2)治療することが求められる疾患を治療することと関連性のある薬理学的変化を誘導することのいずれかに効果的な量である。がんについては、有効量は:腫瘍のサイズを減少させること;腫瘍の成長を減速すること;転移を予防もしくは阻害すること;又は罹患対象の期待生存時間を増加させることに効果的な量を含んでいてもよい。接触させることは、細胞に、ターゲティング部分、及び選択された電荷と、第2の反対に荷電したコイル形成性ペプチドと相互作用して安定であるα-ヘリカルコイルドコイルヘテロ二量体(α-helical coiled-coil heterodimer)を形成する能力とを特徴とする第1のコイル形成性ペプチドを含むコンジュゲートを添加することを含む。それに続き、リポソームを該細胞に添加する。該リポソームは、外面及び内部コンパートメント;該リポソームの該内部コンパートメント内部に位置する活性薬剤、例えば、ウレアーゼ;及び複数の第2のペプチドであって、各々が該リポソームの該外面に接続されている、前記第2のペプチドを含む。
いくつかの態様において、前記接触させることは、リポソームを細胞に添加することを含み、ここで、該リポソームは、捕捉された形態の前記活性薬剤、例えば、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを有し、かつ該リポソームの外表面は、標的表面に特異的に結合するのに効果的な細胞ターゲティング部分、及びターゲティング部分を標的表面との相互作用から守るのに効果的な親水性ポリマーコーティングを含む。該親水性ポリマーコーティングは、前記リポソーム内の表面脂質成分に、解放可能な結合を介して共有結合的に連結されたポリマー鎖から形成されていてもよい。いくつかの態様において、解放剤が、添加されたリポソームの結合の相当な部分の解放を引き起こすのに効果的な量で腫瘍細胞に添加され、それにより、前記ターゲティング部分が、標的表面に曝される。前記解放可能な結合は、ジスルフィド、エステル、及びペプチド結合などの還元可能な化学結合としてもよい。
いくつかの態様において、哺乳動物対象のためのリポソームベースの療法の方法が想定される。該方法は、該対象に、表面結合ターゲティング部分及び親水性ポリマーコーティングを有するリポソームを全身投与すること、例えば、静脈内投与することを含む。解放可能に取り付けられたポリマー鎖から構成される該親水性ポリマーコーティングは、ターゲティング部分をその標的との相互作用から守るのに効果的である。投与されたリポソームを、該リポソームの所望の生体内分布が達成されるまで、全身に循環させる。投与されたリポソームの中の解放可能な結合のかなりの部分、例えば、約50％超、好ましくは約70％超、より好ましくは約90％超の切断を引き起こすのに効果的な量で、解放剤が前記対象に投与される。前記親水性ポリマー鎖が解放されると、前記ターゲティング部分は、その標的との相互作用のために露出される。
いくつかの態様において、前記リポソームは、固形腫瘍の治療のために使用される。該リポソームは、捕捉された形態の抗体-ウレアーゼコンジュゲート、及び任意に、追加の活性薬剤、例えば、抗腫瘍薬を含み、かつ腫瘍特異的抗原に特異的に結合するのに効果的であるターゲティング部分によって腫瘍領域を標的としている。例示的な方法において、リポソームは、増殖性の腫瘍内皮細胞上に発現するFlk-1,2レセプターへの選択的な付着のために、VEGFリガンドを該リポソームに含めることによって、腫瘍の血管内皮細胞を標的としている(Niederman, T.M.らの文献(2002) Proc Natl Aced Sci 99(10):7009-14)。
いくつかの態様において、前記リポソームは、約30〜400nmの間のサイズを有する。このサイズ範囲内のリポソームは、腫瘍血管系の内皮細胞ライニング内に存在する「ギャップ」を通じて腫瘍に入ることができることが示されている(Maruyama, Kらの文献(1999) Adv Drug Deliv Rev 40(1-2):89-102)。
前記リポソームの投与、例えば、静脈内投与の後、かつ該リポソームを前記対象全体に分布させ腫瘍に結合させるのに十分な時間が経過した後に、解放剤が前記対象に投与されて親水性表面コーティングが、該リポソームから解放される。前記表面コーティングの解放は、前記ターゲティング部分を露出させ、該リポソームを前記標的細胞に結合させるのに効果的である。一態様において、前記親水性表面コーティングは、pH感受性の結合によって前記リポソームに取り付けられる。該結合は、前記リポソームが、前記腫瘍に結合した後に解放される。
上述の態様のいずれかにおけるリポソームは、任意に、捕捉された抗腫瘍薬もしくはイメージング剤のうちの1つ以上、又は双方を含むことができる。該リポソームを添加して、分布させてもよく、その後に、解放剤を投与して親水性表面コーティングを解放して、取り付けられたターゲティング部分を露出させ、結合を開始させることができる。引用により本明細書中に組み込まれている米国特許第6,043,094号に記載されているように、リポソームを調製して投与してもよい。
その全体は参照によって本明細書に組み込まれている米国特許第6,180,114号に記載されているような小型の単層ベシクル(SUV)などの追加の送達剤を、本技術において採用してもよい。
高密度に血管形成されていないか、又は血流内に存在する巨大分子の侵入を減少又は予防する堅固な接合部によって連結された細胞及び/もしくは能動輸送機構によって保護されたある種の領域が存在することが当業者により理解される。従って、例えば、神経膠腫又は他の脳がんを治療する治療学の全身への実施は、巨大分子のくも膜下腔への侵入に抵抗する血液脳関門によって制約が加えられる可能性がある。これらの種類の腫瘍においては、治療組成物は、好ましくは、腫瘍部位に直接投与されてもよい。従って、例えば、脳腫瘍は、前記治療組成物を、例えば、ボーラス注入、マイクロ注入、又は外科的にインプラントされたカテーテルを介して腫瘍部位に直接投与することによって治療することができる。
(投薬量)
本技術の方法については、各用量のタイミング及び順序を調節する任意の効果的な投与計画を用いてもよい。ヒト対象についての例示的な投薬量レベルは、投与様式、腫瘍の程度(サイズ及び分布)、患者の大きさ、及びがんのウレアーゼ治療に対する応答性次第で決まるものである。
抗体-ウレアーゼコンジュゲート組成物が腫瘍に投与される場合、例えば腫瘍内に直接注射される場合には、例示的な用量は、約0.1〜1,00010μg/kg体重、例えば、約0.2〜5μg/kg、又は約0.5〜2μg/kgである。注射針の配置は、医師が、標的組織に対する針の位置を見ることができるように、従来の画像誘導技術、例えば、蛍光透視法によって誘導されてもよい。そのような誘導ツールとしては、超音波、蛍光透視法、CT、又はMRIを挙げることができる。
いくつかの態様において、投与された用量の抗体-ウレアーゼコンジュゲートの有効性又は分布を、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの腫瘍への投与の間又は後に、腫瘍組織を、対象のがん組織領域内のpHの変化を検出することができるツールでモニターすることによってモニターしてもよい。そのようなツールは、腫瘍内に直接挿入することができるpHプローブ、又は磁気共鳴画像法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(CT)、又は蛍光透視法などの可視化ツールを含んでいてもよい。追加の造影剤の非存在下で、単にpHの関数としての組織の磁気的性質の違いに基づくMRI調査(interrogation)を行ってもよい。CT又は蛍光透視イメージングは、不透明度が組織媒体のpHによって影響を受ける追加のpH感受性造影剤を必要とする可能性がある。そのような薬剤は、当業者に周知されている。
何らかの抗体-ウレアーゼコンジュゲート投与の前に、腫瘍組織を、その周囲の正常組織と比較してより低いpHによって可視化することができる。このように、正常組織は、約7.2の正常なpHを有する可能性があり、一方で腫瘍組織は、0.1〜0.4pH単位又はそれ以上低い可能性がある。即ち、何らかの抗体-ウレアーゼコンジュゲートを注射する前に、腫瘍組織の程度を、そのより低いpHによって定めることができる。ウレアーゼ投与の後で、ウレアーゼを有する腫瘍領域のpHは上昇し始め、得られる画像を以前の投薬前画像と比較することによって特定することができる。
このように組織を調査することによって、pHの変化の度合い、及び罹患組織の程度をモニターしてもよい。この調査に基づいて、医師は、追加の組成物を該部位に投与してもよく、かつ/又は組成物を腫瘍部位内の追加のエリアで投与してもよい。この手順を、所望の度合いの変化、例えば、0.2〜0.4pH単位が固形腫瘍の全領域にわたり達成されるまで繰り返してもよい。
直接的な注射によるものなどの投薬を、所望のエンドポイントが、好ましくは、腫瘍塊の実質的な又は完全な退縮が観察されるまで、適当な間隔で、例えば、毎週又は週2回繰り返してもよい。治療の有効性を、治療の過程で、治療された組織のpHの変化を可視化することによって、上述のようにモニターすることができる。従って、各々の追加の注射の前に、組織のpHを可視化して、現存している腫瘍の程度を決定することができ、その後、組織のpHの変化を使用して、新たな用量の抗体-ウレアーゼ組成物の該組織への投与をモニターすることができる。
前記抗体-ウレアーゼ組成物が、直接的な注射以外の方法によって非経口投与される場合には、例示的な該抗体-ウレアーゼ組成物の用量は、100〜100,000国際単位/kgウレアーゼ活性/kg対象体重である。本明細書において注記されるように、本方法における抗体-ウレアーゼ組成物は、がん細胞、例えば、固形腫瘍の部位にウレアーゼをターゲティングするためか、又は腫瘍部位において選択的に、例えば、リポソーム形態でウレアーゼを隔離するための抗体を含む。
組織pHの変化に対し高感度のイメージング技術を用いて、投与した用量の有効性をモニターしてもよい。このようなターゲティングには、数時間以上かかる可能性があるため、前記方法は、抗体-ウレアーゼ組成物の注射の前、及び投薬の数時間、例えば、12〜24時間後に、上述のように腫瘍pHをモニターして、腫瘍領域のpHの上昇が証拠となる腫瘍部位に適切に投与されていることを確認することを伴っていてもよい。調査の結果次第で、前記方法は、所望のpHの上昇、例えば、0.2〜0.4pH単位の上昇が観察されるまで、追加の投薬を指示してもよい。この用量がひとたび確立されれば、腫瘍サイズ又は状態の変化が達成されるまで、患者を、類似のウレアーゼ組成物の用量で、定期的に、例えば、毎週1回又は2回治療してもよい。
最終的な投薬計画は、担当の医師によって、優良医療規範(good medical practice)に鑑み、薬物の作用を変化させる種々の因子、例えば、薬剤の比活性、疾患状態の重症度、患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別、及び食事、何らかの感染症の重症度などを考慮して決定されるものである。考慮され得る追加の因子としては、投与の時間及び頻度、薬物組合せ(複数可)、反応感度、及び療法に対する耐性/反応が挙げられる。本明細書において言及された製剤のいずれかを伴う治療に適切な投薬量のさらなる改良は、熟練した実務家によって、特に、開示された投薬量情報及びアッセイ、並びに臨床試験において観察された薬物動態学的データを考慮してルーチンに行われる。適切な投薬量は、用量反応データと共に、体液中又は他のサンプルの薬剤の濃度を決定するための確立されたアッセイを使用することによって確認してもよい。
投薬の頻度は、薬剤の薬物動態学的パラメーター及び投与経路次第で決まるものである。投薬量及び投与は、十分なレベルの活性薬剤を提供するように、又は所望の効果を維持するように調整される。従って、前記医薬組成物は、単回投与、複数の個々に分離した用量、連続注入、持続放出デポ、又はそれらの組合せで、所望の最小限のレベルの薬剤を維持するのに必要とされるように投与することができる。
短時間作用型医薬組成物(すなわち、短い半減期)は、1日1回又は1日1回を超える回数、例えば、1日2、3、又は4回)投与することができる。長時間作用型医薬組成物は、3〜4日毎、毎週、2週毎に1回投与してもよい。連続注入のための、皮下、腹腔内、又は硬膜下ポンプなどのポンプ。
前記コンジュゲートを医薬として許容し得る担体中に含む組成物は、調製され、適切な容器に入れられ、適応となる状態の治療のためにラベルされてもよい。ラベル上に適応となることが示される状態としては、様々な種類のがんの治療を挙げることができるが、これらに限定されない。以下に示されるようなキットもまた想定され、ここで、該キットは、医薬組成物の剤形、及び医学的状態の治療における該組成物の使用のための説明書を含んだ添付文書を含む。
一般に、前記コンジュゲート組成物は、有効量で対象に投与される。一般に、有効量とは、(1)治療することが求められる疾患の症状を減少させること;又は(2)治療することが求められる疾患を治療することと関連性のある薬理学的変化を誘導することのいずれかに効果的な量である。がんについては、有効量は:腫瘍のサイズを減少させること;腫瘍の成長を減速すること;転移を予防もしくは阻害すること;又は罹患対象の期待生存時間を増加させることに効果的な量を含んでいてもよい。
(治療の方法)
本技術は、対象におけるがんを治療する方法であって、該対象に、治療的有効量の本明細書において提供される組成物を投与することを含み、それにより、該対象におけるがんを治療する、前記方法を提供する。本明細書における方法による治療に適したがんとしては、一般に、癌腫、白血病、リンパ腫、及び肉腫が挙げられる。癌腫は、肛門、胆道、膀胱、乳房、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、腎臓、胆嚢及び胆管、小腸、尿路、卵巣、結腸、非小細胞性肺癌、生殖器、内分泌腺、甲状腺、並びに皮膚のものであってもよい。他の適したがんとしては、カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、頭部及び頚部腫瘍、原発性腫瘍、血管腫、黒色腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、並びに脳、神経、眼、及び髄膜の腫瘍が挙げられる。
いくつかの態様において、治療されるがんは、固形腫瘍、例えば、癌腫、肉腫、黒色腫、及びリンパ腫を形成する。いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、又はそれらの組合せのうちの1つ以上である。いくつかの態様において、前記がんは、非小細胞性肺癌である。いくつかの態様において、前記対象は、ヒトである。
治療に効果的な用量は、当技術分野において周知の方法によって推定することができる。マウス腫瘍を有する免疫正常(immune- competent)マウスや、ヒト腫瘍異種移植片を有する免疫低下(immune-compromised)マウス(例えば、ヌードマウス)などのがん動物モデルは、当技術分野において周知されており、かつ本明細書に引用のために組み込まれている多くの引例に広く記載されている。そのような情報は、ヒトにおける安全でありかつ有用である可能性のある初期用量を決定するために、ラット、イヌ、及び/又は非ヒト霊長類における安全性研究と組み合わせて用いられる。生物の用量を推定するための追加の情報が、実際のヒトのがんにおける研究、報告された臨床試験から得られる可能性がある。
いくつかの態様において、前記がんの治療の方法は、がんの少なくとも1つの症状を治癒させる及び改善させることを包含することが意図される。該患者のがんが治癒した場合、がんが寛解に達した場合、生存時間が、統計学的に有意に延長された場合、腫瘍増悪までの時間が統計学的に有意に増加した場合、各々の種類のリンパ球性又は造血性の悪性病変に対して確立された標準基準に基づくリンパ球性の又は造血性の腫瘍負荷に減少が見られた場合、又は固形腫瘍負荷が、固形腫瘍における反応評価基準に定義されるように低減した場合(RECIST 1.0又はRECIST 1.1、Therasseらの文献J Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216, 2000、及びEisenhauerらの文献Eur. J. Cancer 45:228- 247, 2009)に、がん患者は治療されたこととなる。本明細書で使用される、「寛解」は、がんの証拠を以前には有していた患者において、成長するがん細胞が存在しないことを指す。従って、寛解のがん患者は、がんが治癒したか、又はがんが存在するが容易に検出可能ではないかのいずれかである。従って、がんは、腫瘍が、増大化も転移もしない場合に、寛解にある可能性がある。本明細書で使用される完全寛解は、イメージング、例えば、x線、MRI、CT、及びPET、又は血液もしくは骨髄生検などの診断法によって示される疾患の非存在である。がん患者が寛解となった場合、これに再発が続く可能性があり、その場合該がんが再出現する。
いくつかの態様において、前記治療が、ペメトレキセド及び/又はカルボプラチンと組み合わされることはない。いくつかの態様において、前記治療が、葉酸代謝拮抗薬化合物及び/又は白金剤と組み合わされることはない。
(キット)
いくつかの態様において、本技術は、本明細書に記載される方法を用いて腫瘍細胞の増殖を阻害するためのキットを提供する。該キットは、1つ以上の活性薬剤を含有する容器を含む。該キットは、本技術の方法の実践のための本明細書に記載される他の成分のうちの任意のものを更に含むことができる。
前記キットは、任意に、腫瘍細胞増殖を阻害するための活性薬剤の使用を開示する指示書(すなわち、プロトコール)を含んだ説明資料を含んでいてもよい。従って、一態様において、前記キットは、活性薬剤、好ましくはウレアーゼ酵素を含有する医薬組成物、及び対象におけるがんの治療のための、該対象への該組成物の投与を教示する説明資料を含む。一態様において、前記説明資料は、前記組成物が、直接的な注射によって腫瘍内に投与される場合には、腫瘍のサイズに依存し、かつ腫瘍1mm3あたり0.1〜100国際単位ウレアーゼ活性である量で、ウレアーゼ組成物が対象に投与されること、及び前記組成物が、腫瘍内に直接的な注射以外で対象に非経口投与される場合には、100〜100,000国際単位/kg国際単位ウレアーゼ活性/kg対象体重の量で、ウレアーゼ組成物が対象に投与されることを教示する。
別の態様において、前記説明資料は、ウレアーゼ組成物を、固形腫瘍における前記細胞内でより高く/細胞外でより低いpHグラジエントを減少又は反転させるのに効果的であるウレアーゼの量で、その有効性が固形腫瘍における細胞内でより高く/細胞外でより低いpHグラジエントによって減少する弱塩基性の抗腫瘍化合物も投与されている対象に投与することを教示する。
また、前記説明資料は、前記ウレアーゼを対象における固形腫瘍に局在化させるのに効果的な条件下で、前記ウレアーゼ組成物を、固形腫瘍を含有するか、又は含有することが疑われる対象に投与すること、該対象を、対象の組織における細胞外pHの変化を検出することができる診断ツールを用いて調査すること、及び前記投与することの後に細胞外pHの上昇を示す該対象内の組織領域を識別することを教示する。
前記説明資料は、典型的には、書かれた又は印刷された資料を含むが、これらはそのようなものに限定されない。そのような説明書を保存し、かつそれを末端利用者へと伝達することのできる任意の媒体が、本技術によって想定される。そのような媒体としては、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)などが挙げられるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような説明資料を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでいてもよい。
(実施例)
以下の実施例を、本開示の種々の態様の説明の目的のために記載する。これらは、いかなる形においても本開示を限定することを意味しない。当業者は、本開示が、対象を実施し、言及された目的及び利点を得るようによく適合されていることを認めるであろうし、本明細書に固有のいかなる対象、目的、及び利点についても同様である。本実施例は(本明細書に記載される方法と共に)、好適な態様の現時点での代表的なものである。これらは、例示的なものであり、本開示の範囲に対する制限として意図してはいない。特許請求の範囲により定義される本開示の主旨に包含される変形形態及び他の使用が、当業者の頭に浮かぶであろう。
(実施例1:L-DOS47:CEACAM6発現腫瘍を標的とする抗体-ウレアーゼコンジュゲート)
腫瘍のマイクロ環境は、多くの場合、正常組織と比較して酸性である。異常な血管系に由来する局所的な低酸素症に呼応する嫌気性解糖に由来する乳酸の蓄積が、直接の原因であるようである(1、2)。しかしながら、がん細胞は、酸素の存在下であっても、グルコースを嫌気的に代謝し続ける(3)。このことは、変化した代謝的な表現型及び結果として生じる酸性環境が、がん細胞に増殖優位性を与えることを示唆する(4)。
尿素をアンモニアへと変換し、溶液のpHを上昇させるタチナタマメウレアーゼが、がん細胞に対して細胞傷害性であることが示されている(8)。ヒト乳房及び肺異種移植片を有しているマウスにおける該酵素の腫瘍内注射もまた、腫瘍増殖を顕著に遅らせた(8)。しかしながら、臨床の現場でのがん治療の腫瘍内送達は、実践が困難である。進行しかつ著しい転移性の疾患を有する患者において、腫瘍内注射は、実行可能な選択肢ではない。より実践的なアプローチは、前記酵素を、静脈内注射で送達することである。しかしながら、ウレアーゼは、ターゲティングドメインを欠いており、かつ該酵素の全身送達は、オフターゲットの毒性をもたらし得る。腫瘍を特異的に標的とする抗体-酵素コンジュゲートを用いて、ウレアーゼががん部位へと送達される。該コンジュゲートにおいて用いられるこの抗体は、非小細胞性肺がん患者においてCEACAM6を特異的に認識する。
肺腺癌細胞上のCEACAM6を認識する単一ドメインラクダ科動物抗体断片(AFAIKL2、配列番号1)(17)が、タチナタマメウレアーゼ(DOS47)へのコンジュゲーションによりがん治療薬を作成するために選択された。本技術は、現在ヒト第I相臨床試験中のこの抗CEACAM6-ウレアーゼコンジュゲート(L-DOS47)に対して行った関係する前臨床研究のいくつかを記載する。
タチナタマメウレアーゼの抗腫瘍活性を、抗体-ウレアーゼコンジュゲート(L-DOS47)の形態で、抗CEACAM6単一ドメイン抗体の特異性と組み合わせた。L-DOS47は、CEACAM6発現がん細胞株に特異的に結合し、強力な細胞傷害性効果を発揮した。競合的結合アッセイでは、L-DOS47の結合親和性が、増加したアビディティーのために、天然の単一ドメイン抗体のそれよりも約500倍強力であったことが示された。L-DOS47の細胞傷害性は、インサイチュでの尿素のアベイラビリティ、及び標的細胞のアンモニア毒性への感受性に依存する。BxPC-3細胞は、CEACAM6遺伝子をサイレンシングすることによってL-DOS47の効果から保護されたが、CEACAM6の過剰発現は、トランスフェクトされたH23細胞を、L-DOS47の細胞傷害性に対し感受性のものとした。ヒトの正常組織及びがん組織の免疫化学的な染色では、L-DOS47が、肺腺癌に優先的に結合し、また、陽性ではあるがより弱い染色で結腸及び膵臓の腺癌に結合することが示された。マウスにおける肺腺癌A549細胞の転移研究においても、L-DOS47が10μg/mLの濃度で、肺におけるがん細胞数の減少に効果的であることが示された。
材料.タチナタマメ(Canavalia ensiformis)ウレアーゼは、BioVectra Inc.(PEI、Canada)から得て、酸析、アルコール分画、及びイオン交換クロマトグラフィーによって更に精製した。SDS-PAGE、HPLC、及び質量分析によって決定された酵素の純度は、＞97％であった。ウレアーゼの1単位は、25℃及びpH7.6で1マイクロモル/分のアンモニアの生成と定義される。
ラマの重鎖抗体レパートリーに由来して得たファージライブラリーを使用して、非小細胞性肺腺癌A549に対するパンニングによって単一ドメイン抗体(sdAb)を同定した。該sdAbを、AFAIと名付けた(17)。コンジュゲーションを目的としてAFAIの遺伝子配列を最適化して、AFAIKL2と新たに命名した。該AFAIKL2抗体をその後、クローニングして、大腸菌BL21 (DE3) pT7-7システムで発現させた。該抗体を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて封入体から精製した。該抗体のウレアーゼへのコンジュゲーションは、ヘテロ二官能性架橋剤であるN-サクシニミジル(4-ヨードアセチル)アミノ-ベンゾエート(SIAB)を用いて行った。該AFAIKL2抗体を、先ず、一級アミン基を介してSIABリンカーのNHSエステル部分で活性化した。該活性化された抗体を、前記架橋剤のヨードアセチル基を介してウレアーゼに結合させ、酵素上に存在するスルフヒドリル基を遊離させた。目標コンジュゲーション比率(1:6〜1:10、ウレアーゼ対抗体の比)は、高純度ウレアーゼ及び活性化された抗体を、2:1の質量比で混合することにより制御した。該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを、限外濾過によって精製した。
尿素、トリプシン(組織培養グレード)、フェナジンエトスルファート(PES)、ニトロプルシドナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム溶液、フェノール、NaCl、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、及びグルタルアルデヒドは、Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から購入した。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム(MTS)、及びトリプシン(ペプチド断片化及び質量分析法による分析における使用のためのもの)は、Promega Corp. (Madison, WI)から購入した。過酸化水素(30％)、SIAB、KCl、D-グルコース、HCl、Na2HPO4、及びNaH2PO4は、Fisher Scientific (Ottawa, ON)から購入した。ウシ血清アルブミン分画V(BSA)は、Roche (Indianapolis, IN)から購入した。塩化アンモニウム(0.100M)は、Ricca Chemical (Arlington, TX)から購入した。抗AFAIKL2-ペルオキシダーゼコンジュゲートは、Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA)によって製造された。細胞培養培地(RPMI)、ウシ胎仔血清、及び抗生物質は、Life Technologies (Burlington, ON)から得た。雌性CrTac:NCr-Foxn1nuヌードマウスは、Taconic (Hudson, NY)によって供給された。本実験において用いられた変法クレブス・リンゲル緩衝液(KRB)は、NaCl(98.3mM)、KCl(4.73mM)、KH2PO4(1.19mM)、MgSO4(1.19mM)、D-グルコース(11.7mM)、Na2HPO4(11.1mM)、及びNaH2PO4(2.77mM)を含有していた、pH7.2。
(インドフェノールアッセイ)
ウレアーゼ酵素反応によって生成するアンモニアの量を、改良インドフェノールアッセイを用いて決定した(18)。手短にいうと、165mgのフェノール及び132mgのNaOHペレットを10mLの水に溶解させ、それに続き66μLのニトロプルシドナトリウム溶液(10mg/mL)を添加することによって、溶液Aを新たに調製した。40μLの次亜塩素酸ナトリウムを5mLの水に加えることによって、溶液Bを調製した。ホールセル結合アッセイ(下記を参照されたい)からのサンプル溶液(各々30μL)を、50μL/ウェルの5N NaOH:H2O(3.3:46.7)及び20μL/ウェルの水を含有する新たな96ウェルプレートに移した。溶液A(50μL/ウェル)及び溶液B(50μL/ウェル)を加えて、該プレートをその後、37℃で30分間発色用のマイクロプレートリーダーに移した。ODを630nmで測定した。ウェル内で生成されたアンモニアの量を、塩化アンモニア(0〜150μM)を標準として用いた検量線から計算した。
(L-DOS47のホールセル結合アッセイ)
100μL/ウェルの腫瘍細胞(4×104細胞/ウェル)を96-ウェル培養プレート内に播種することによって細胞単層を調製し、37℃で1晩インキュベートした。培地を、プレートから取り除き、細胞単層を、100μL/ウェルの0.05％グルタルアルデヒド(リン酸緩衝生理食塩水PBS中)で、10分間室温で(RT)固定した。プレートをその後、PBSで洗浄し、120μL/ウェルのグリシン溶液(50mM)を加えて、37℃で20分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、120μL/ウェルの1％ BSA/PBSで37℃で30分間ブロックした。その後、プレートをバッファーA(PBS中0.05％ BSA)で3回洗浄し、80μL/ウェルの希釈されたL-DOS47又はDOS47溶液を加え、37℃で1.5時間インキュベートした。結合シグナルは、尿素法又は抗体法のいずれかによって発生させた:(1)尿素法では、プレートをバッファーAで4回洗浄し、80μL/ウェルの20mM尿素(0.1Mリン酸緩衝液中に調製、pH7.6)を加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、40μL/ウェルの1N HClを加えて反応を停止させた。各ウェル内で生成されたアンモニアの量を、インドフェノールアッセイを用いて決定した。(2)抗体法については、先ず、ブロッキング工程前に内在性ペルオキシダーゼを、100μL/ウェルの0.3％過酸化水素で30分間クエンチした。被験物とインキュベーションした後に、プレートをPBSで洗浄し、希釈された抗AFAIKL2-ペルオキシダーゼ抗体コンジュゲート(1:8000)を、0.05％のTween-20及び0.1％の粉乳を含有するバッファーA中に調製した。プレートを、バッファーAで3回洗浄し、100μL/ウェルの抗体-ペルオキシダーゼコンジュゲートをプレートに加えた。37℃で1時間インキュベーション後、プレートをバッファーAで3回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質を、0.03％のH2O2を含有するクエン酸ナトリウムバッファー中に、1mMで調製し、100μL/ウェルの前記基質溶液を加え、RTで30分間インキュベートした。プレートを、405nmでのOD測定のためにマイクロプレートリーダーに移した。
(L-DOS47の細胞傷害性アッセイ)
100μL/ウェルの腫瘍細胞(4×104細胞/ウェル)を、96-ウェル培養プレート内に播種することによって細胞単層を調製し、37℃で1晩インキュベートした。培地を、各ウェルから取り除き、80μL/ウェルのL-DOS47又はDOS47のいずれかを加え、37℃で2時間更にインキュベートした。インキュベーション後、プレートをバッファーAで3回洗浄した。その後、KRB中100μL/ウェルの尿素(20mM)を、プレートに加え、37℃で1晩インキュベートした。培地を取り除き、100μL/ウェルの単純培地(plain medium)と置き換えた。細胞生存率を、MTS/PES溶液の混合物(20:1 vol/vol; MTS、2mg/mL; PES、1mg/mL)を調製し、20μL/ウェルの該混合物を、プレートに加えるMTS細胞生存率アッセイを用いて決定した。プレートをその後、37℃で1〜2時間インキュベートし、ODを、490nmを参照として630nmで測定した。
(細胞ベースの電気化学発光(ECL)結合アッセイ)
L-DOS47、AFAIKL2抗体、及びDOS47を、製造業者の説明書に従いルテニウム-NHS-エステル(スルホタグ(Sulfo-Tag), Meso Scale Discovery MSD; Rockville, MD)で標識した。これらのルテニウムタグ化タンパク質は、L-DOS47及びAFAIKL2の標的抗原への結合の直接的な測定を可能とした。直接的な結合アッセイのために、BxPC-3細胞単層を、96-ウェルSECTOR PR High-Bindプレート(MSD)上に調製した。固定化及びブロッキング後に、種々の量のL-DOS47-タグ又はAFAIKL2-タグを加えた。プレートを、37℃で1.5時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、2回洗浄し、読み取りバッファー(Read Buffer)(MSD)で満たした。ECLシグナルを、その後SECTOR PR-100リーダー(MSD)を用いて直ちに読み取った。競合的結合アッセイについては、L-DOS47又はAFAIKL2抗体を用いて、L-DOS47-タグのBxPC-3細胞への結合を阻害した。1μg/mLのL-DOS47-タグを用いてBxPC-3細胞に結合させた。種々の濃度の競合剤(L-DOS47又はAFAIKL2)を用いて、タグ化L-DOS47の結合を競争させた。インキュベーション後、プレートを2回洗浄し、読み取りバッファーで満たした。その後、SECTOR PR-100リーダーを用いて、プレートを直ちに読み取った。
(BxPC-3細胞におけるCEACAM6遺伝子のノックダウン)
CEACAM6がL-DOS47によって認識される特異的抗原であることを確認するために、陽性細胞株BxPC-3のCEACAM6遺伝子を、OriGene (Rockville, MD)からのHuSH-29ヘアピン発現クローンを用いてサイレンシングさせた。これらのプラスミドは、RNA干渉を介して標的遺伝子の転写をブロックする短いヘアピンRNA(shRNA)配列を転写する。BxPC-3細胞を、HuSHプラスミドでトランスフェクトし、安定にトランスフェクトされた細胞を、ピューロマイシンを用いて選択した。異なるクローンを、
Figure 0006876618
 及び対照プラスミドHuSH-TRSのトランスフェクションから得た。2つの陽性安定細胞株(HUSH#6及びHUSH#7)並びに対照(HUSH-TRS)を、抗生物質選択によって得た。その後、これらのクローンを用いて、ホールセル結合アッセイを用いてL-DOS47との結合をチェックした。L-DOS47とインキュベーションした後、プレートをバッファーAで3回洗浄し、80μL/ウェルの20mM尿素(0.1Mリン酸緩衝中に調製、pH7.6)を加えた。プレートを、37℃で30分間インキュベートした。酵素反応を、40μL/ウェルの1N HClを加えることにより停止させた。生成されたアンモニアの量を、インドフェノールアッセイを用いて決定した。
C(EACAM6遺伝子のH23細胞へのトランスフェクション)
G418選択マーカーを含有する哺乳動物の発現ベクターを、PMP-GFP(形質膜タンパク質-緑色蛍光タンパク質)及びCEACAM6遺伝子とクローニングした。セルフェクチン(Cellfectin)試薬(Life Technologies)を用いて、発現ベクターをH23細胞内にトランスフェクトした。手短にいうと、2mLの完全RPMI培地(10％のウシ胎仔血清及び50U/mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシンを含有)中の2×106細胞/ウェルのH23細胞を、6-ウェル培養プレートに播種し、37℃で1晩インキュベートした。セルフェクチン試薬(10μL)及びDNA(1〜2μL)を、それぞれ、100μLの無血清RPMI培地に希釈した。その後、2つの希釈溶液を合わせて、穏やかに混合して、RTで30分間インキュベートした。プレートを、1.5mLの無血清RPMI培地で2回洗浄した。合わせた溶液を、0.8mLの無血清RPMI培地に希釈して、穏やかに混合し、細胞に加えた。細胞を、CO2インキュベーター内で37℃で1晩インキュベートした。翌日、培地を、2mLの完全RPMI培地と置き換えた。トランスフェクトされた細胞は、CEACAM6と同じmRNA由来のGFPを共発現した。トランスフェクトされた細胞を、400μg/mLのG418抗生物質を含有する培地中でのインキュベーションによって選択した。細胞を直接、又はCEACAM6の表面発現を示すcy5.5で標識したL-DOS47とのインキュベーション後に、ソーティングした。
(L-DOS47によるヒト腫瘍組織の免疫化学的染色)
42の癌性及び正常組織を代表する合計で400個の組織サンプルをスクリーニングした(Axel Wellmann, University Hospital Aachen, RWTH Aachen Germany)。初めに、スライドを、乾燥機内で62℃で1時間垂直の向きでインキュベートして、パラフィンを除去した。その後、スライドを、キシレン代替品中で、5×4分間脱ろうした。スライドを、100％、95％、及び75％エタノール中で、各々2×3分間水和して、その後水道水に5分間漬けた。内在性ペルオキシダーゼを、0.3％H2O2で30分間でクエンチした。ベクタステインElite ABCキット(Vector Labs, Burlington, ON)を用いて、スライド上のL-DOS47結合を検出した。手短にいうと、PBS中で3×5分間洗浄した後に、スライドを、ブロッキング血清中で4℃で1晩インキュベートした。その後、スライドを、L-DOS47溶液(バッファーA中20μg/mL)中で37℃で1.5時間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、スライドを、マウス抗ウレアーゼ抗体(Sigma, 1:1500)と37℃で1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、スライドを、ビオチン化された二次抗体溶液(Vector Labs)と30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、スライドを、ベクタステインElite ABC試薬と30分間インキュベートした。PBSで洗浄した後に、スライドを、新鮮なDAB(3、3’-ジアミノベンジジン)ペルオキシダーゼ基質溶液混合物(Vector Labs)中で、RTで2分間インキュベートした。反応を、水道水中5分間洗浄することにより停止させた。その後、スライドを、マイヤーヘマトキシリン中で10秒間対比染色した。スライドを、75％、80％、95％、及び100％エタノール中で脱水した。キシレン中で透明化した後に、スライドに、Clarion Mounting Mediumを載せた。
(A549転移研究)
A549腫瘍細胞(5×106)を播種し、低結合性(low binding)培養プレート中で成長させた。十分な数が得られたら、細胞を回収して、5×106細胞/mLの濃度で培養培地に再懸濁させた。その後、細胞を、6-ウェルの低結合性組織培養プレートに、1mL/ウェルで入れた。その後、終濃度が10又は15μg/mLのL-DOS47(1mL)を、各ウェルに加えた。アイソタイプ対照を、10μg/mLのV21-DOS47コンジュゲート(血管内皮増殖因子(VEGF)レセプターを標的とする抗体-ウレアーゼコンジュゲート)で処理した。細胞を、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、遠心分離して、無菌のPBSで3回洗浄し、無菌のPBS中に1×107細胞/mLで再懸濁した。その後、各々のマウスは、1×106の処理された細胞の接種を1回受けた。この研究は、4群の雌性のCrTac:NCr-Foxn1nuマウス(非処理、アイソタイプ、並びにL-DOS47(10及び15μg/mL))からなっていた。合計で40頭のマウス(各群あたり10頭)に、尾静脈を介してA549腫瘍細胞を静脈内接種した。
1群あたり5頭の動物を、第22日(3週)に安楽死させ、残りの動物は、第71日(10週)まで維持した。屠殺後、動物に墨汁(Calvert Labs; Olyphant, PA)を気管内注射して;その後、肺を切除し、それに続きFeketeの溶液(Calvert Labs)で固定した。腫瘍転移に対する被験物の効果を、解剖顕微鏡下で、各肺における転移性腫瘍(フォーカス)の数を数えることによって決定した。各群からの代表的な肺を、撮影した。
(L-DOS47の種々のがん細胞株への結合)
5つの腫瘍細胞株 - BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T、及びMDA-MB231の間で、L-DOS47の異なる結合プロファイルが観察された(図1A)。この結果は、L-DOS47が、2つの膵臓(BxPC-3及びCapan-1)及び乳房(ZR-75-30)細胞株によく結合していたことを示しており、CEACAM6抗原が、細胞表面に発現されていたことを示している。中程度の結合が結腸細胞株LS174Tにも観察されたが、乳房細胞株MDA-MB231では結合は見られなかった(陰性対照)。AFAIKL2抗体は、ウレアーゼ酵素にコンジュゲートされた場合、CEACAM6発現細胞に対する特異的なターゲティングを提供した。これは、DOS47で処理された細胞における結合シグナルの非存在によって確認された(データは示していない)。
(L-DOS47の細胞傷害性)
図1Bにおいて、BxPC-3及びZR-75-30の双方が、L-DOS47細胞傷害性に対して感受性であることが示された。細胞生存時間の急速な低下が、1μg/mL未満のL-DOS47で処理されたこれら2つの細胞株において観察された。中程度の効果が、Capan-1及びLS174T細胞において観察された。陰性対照細胞株MDA-MB231に対しては、L-DOS47は、何ら効果を有しない。より多くの細胞株からの結合及び細胞傷害性の結果の一覧を、表1に示した。L-DOS47細胞傷害性は、対応する細胞株上のL-DOS47の結合活性に直接的に依存する。A549及びCapan-1のより弱い細胞傷害性応答は、これら2つの細胞株がアンモニア毒性に対してより高い耐性があることが原因である(データは示していない)。一方で、H23細胞は、アンモニアに対し高い感受性を有する(データは示していない)。細胞表面にCEACAM6抗原が存在しないにもかかわらず、H23細胞はなお、恐らくウェルにおいて非特異的に結合したL-DOS47の存在が原因の、L-DOS47に対する幾分弱い細胞傷害性応答を示す。
表1. 9つのヒト腫瘍細胞株に対するL-DOS47の種々の結合及び細胞傷害性研究から得られた結果の概要
Figure 0006876618
 ここで:+、陽性(+の数は、活性の強度を示す);-、陰性
表1に示されるように、4つのヒト組織由来の5つの細胞株(BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、LS174T、及びA549)は、強力なL-DOS47結合性及びL-DOS47細胞傷害性に対する良好な感受性(A549を除く)を示した。L-DOS47の細胞傷害性効果は、がん細胞に対する相対結合強度に多かれ少なかれ依存している。グラフ中の結果は、代表的な実験の平均(n=3)を示す。全ての値について、標準偏差(SD)は、10％未満であった。
(BxPC-3細胞に対するL-DOS47の直接的及び競合的結合)
細胞ベースの電気化学発光結合アッセイは、腫瘍細胞に結合したルテニウムで標識された抗体コンジュゲートの直接的な検出を可能とする。図2Aにおいて、ルテニウムタグ化L-DOS47及びAFAIKL2抗体の双方は、BxPC-3細胞に結合することが分かった。一方、ルテニウムタグ化DOS47は、陰性対照として作用した。L-DOS47は、L-DOS47において呈されたより高い抗体アビディティー(6〜10抗体)に起因して、AFAIKL2抗体よりもかなり高い結合親和性を示した。この結果を、L-DOS47及びAFAIKL2抗体を競合剤として用いて、ルテニウムタグ化L-DOS47のBxPC-3細胞への結合を阻害してさらに確認した(図2B)。L-DOS47及びAFAIKL2抗体の双方は、ルテニウムタグ化L-DOS47のBxPC-3への結合を阻害し、かつ、予想通りに、L-DOS47は、AFAIKL2抗体よりもより良好な結合親和性、従ってそれよりもルテニウムタグ化L-DOS47のBxPC-3への結合のより強力な阻害を実証した。L-DOS47及びAFAIKL2抗体の双方の見かけの結合親和性は、該被験物のIC50(結合の50％の減少を引き起こすのに必要とされる競合剤の量)によって比較可能である。L-DOS47及びAFAIKL2抗体のIC50は、それぞれ2及び20μg/mLと推定され;即ち、L-DOS47については3.22nM(1個のウレアーゼに対して6個の抗体のコンジュゲーション比率でMW=622k)及びAFAIKL2について1.55μM(MW=12.9k)であった。この結果は、L-DOS47の結合親和性が、AFAIKL2抗体のそれの約500倍であることを示唆した。
(H23細胞におけるトランスフェクトされたCEACAM6遺伝子の過剰発現)
CEACAM6遺伝子をトランスフェクションした後に、陽性クローンH23-CC6 #7を特定した。A549細胞のCEACAM6レベルに近いCEACAM6レベルを有するクローンを、L-DOS47-cy5.5を用いてH23-CC6 #7クローンを再選別することによって得た。より多い量のG418抗生物質(800μg/mL)との該クローンのさらなるインキュベーションは、より高いレベルのCEACAM6発現を伴うものを選択するのに役立った。H23-CC6 #7は、A549及びBxPC-3細胞よりも少ないCEACAM6を細胞表面に発現していたが、このCEACAM6をトランスフェクトされたクローンは、アンモニア毒性に対するその高い感受性に起因して、L-DOS47細胞傷害性に対してBxPC-3細胞よりもいっそう高い感受性がある(図3B)(データは示していない)。
(BxPC-3細胞におけるCEACAM6遺伝子ノックダウン)
L-DOS47の2つのCEACAM6ノックダウンクローン(HUSH#6及びHUSH #7)に対する結合は、天然のBxPC-3細胞及び対照クローン(HUSH-TR3)のそれと比べて顕著に減少した(図3C)。この実験は、細胞表面におけるCEACAM6の存在が、L-DOS47結合にとって重要であることを明確に示した。該遺伝子をサイレンシングすると、L-DOS47の結合がまさに実質的に減少した。
(L-DOS47によるヒト腫瘍組織の免疫化学的染色)
正常組織及びがん組織のスクリーニングは、L-DOS47が、腺癌サブタイプをほとんど排他的に認識することを実証した(表2)。種々の癌組織及びマッチさせた正常組織からなる42群を代表するスクリーニングされた400を超える組織サンプルのうち、肺腺癌組織は、かなりの染色を示し、80％を超える細胞が認識された。対応する年齢をマッチさせた正常肺組織は陰性であり、いくつかの活性化肺細胞におけるわずかな局所的染色を伴っていた。いくらか陽性を示したが染色が弱かった他の組織は、結腸及び膵臓腺癌である。図4は、結腸及び肺腺癌のL-DOS47での免疫化学的染色を示す。
表2.L-DOS47結合のヒトの正常組織及びがん組織スクリーニング
Figure 0006876618
ヒト結腸及び肺腺癌のL-DOS47による免疫組織化学的染色は、図4に示す通りである。
(A549転移研究)
10及び15μg/mlのL-DOS47で処理されたA549細胞を受けたマウスは、3週目に、低減した肺腫瘍カウントを示し、非処理対照群と比較して有意な低減(p＜0.05)が実証された(表3)。しかしながら、10週目において、腫瘍細胞カウントの平均数に有意な低減は見られなかった。統計的に有意でないが、10μg/mlのL-DOS47による処理は、処理後3週目及び10週目双方で、非処理対照群と比較した場合、平均腫瘍細胞の数の一貫した低減を示した(表3)。興味深いことに、アイソタイプ対照(V21-DOS47)も、肺における腫瘍カウントの数に影響を及ぼし、減少させた。まとめると、A549細胞の10μg/mLのL-DOS47による処理は、処理後3週目で肺腫瘍の平均数を減少させたが、処理後10週までに平均腫瘍数には有意な低減が観察されなかったため、この効果は一過性であった。
表3. A549転移研究においてカウントされた肺腫瘍の平均数
Figure 0006876618
 #平均値±平均値の標準誤差;*非処理対照群と比較した場合、p＜0.05。
表3に示されるように、A549ヒト肺腺癌細胞を、インビトロでL-DOS47又はアイソタイプ対照(V21-DOS47)で処理した。37℃で4時間インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、PBS中に1×107細胞/mLで再懸濁した。その後、各々のマウスは、1×106個の処理された細胞の播種を1回受けた。1群あたり5頭の動物を、注射後3週後及び10週後に安楽死させた。腫瘍転移に対する被験物の効果を、解剖顕微鏡下各肺における転移性腫瘍の数をカウントすることによって決定した。L-DOS47処理群における転移性腫瘍増殖を、独立t検定によって非処理対照群と比較した。処理後3週目でのL-DOS47との共注射は、腫瘍カウントの数を顕著に減少させた。
ウレアーゼによって媒介されるアンモニア生成及び局所的pH上昇に基づく有望ながん治療薬としての該酵素の使用が実証された(8)。しかしながら、該酵素が、正常細胞と比較した腫瘍細胞に対する選択性を欠いていることは、がん治療薬としてのその応用を制限してきた。抗体-薬物コンジュゲート(ADC)、より詳細には、本技術の抗体指示型酵素プロドラッグ療法(ADEPT; antibody-directed enzyme prodrug therapy)の適用によって、この制限を回避することができる。本実施例において、抗体-ウレアーゼコンジュゲートの特定の形態(L-DOS47)を、CEACAM6特異的ラマ単一ドメイン抗体(AFAIKL2)をウレアーゼ(DOS47)にコンジュゲートさせることによって作製した。該コンジュゲートしたAFAIKL2抗体は、特異性を提供し、従って、ウレアーゼ酵素のCEACAM6発現腫瘍に対する有効性を強化する。細胞表面にCEACAM6を発現するがん細胞へのL-DOS47の特異性を、インビトロ結合研究によって評価した(図1及び図2)。これらの研究の結果は、L-DOS47が、CEACAM6発現細胞株(BxPC-3、Capan-1、ZR-75-30、及びLS174T)に結合したが、非発現細胞株(MDA-MB231)には結合しなかったことを実証した。加えて、CEACAM6の機能的役割を、がん細胞におけるCEACAM6のノックダウン実験及び過剰発現実験によって確認した(図3)。CEACAM6を、CEACAM6にコードされたプラスミドをH23細胞中にトランスフェクトさせることによって過剰発現させる一方、遺伝子ノックダウンを、BxPC-3細胞においてCEACAM6の低分子ヘアピン型RNA介在性除去によって行った。結合研究において、L-DOS47が、天然のBxPC-3細胞に高い親和性で結合したが、CEACAM6遺伝子がノックダウンされたBxPC-3細胞には結合しないことが示された(図3C)。対照的に、H23細胞におけるCEACAM6の過剰発現は、該細胞をL-DOS47結合及び細胞傷害性に対して感受性なものとした(図3A及び図3B)。これらの結果は、L-DOS47のCEACAM6抗原に対する特異的結合が、該抗体コンジュゲートが腫瘍細胞傷害性を誘導するのに重要であることを示した。個々の抗体と比較した抗体をウレアーゼへコンジュゲートさせることの別の利益は、アビディティーの総合的な増加である。ECL結合アッセイにおいては、1個のウレアーゼに対して抗体が6〜10個のモルコンジュゲーション比率を有するL-DOS47は、BxPC-3細胞に、単一の抗体よりも500倍良く結合したことが示された(図2B)。さらなる結合研究によって、6:1を超える抗体対酵素のコンジュゲーション比率が、CEACAM6に結合するL-DOS47に最適であることが示唆されている(データは示していない)。
作用機序を、インビトロ及びインビボでの研究によって調査した。ウレアーゼは、L-DOS47の活性成分であり、以前の研究により、ウレアーゼが、インビトロでヒト腫瘍細胞に対して細胞傷害性であることが実証されている(8)。ヌードマウスにおけるA549(肺)及びMCF-7(乳房)腫瘍に対するウレアーゼの腫瘍内投与は、腫瘍増殖を顕著に阻害した(8)。しかしながら、ウレアーゼ又はL-DOS47の細胞傷害性の有効性もまた、腫瘍細胞株のアンモニアに対する感受性に依存する。例えば、図1Aにおいて、L-DOS47は、BxPC-3、ZR-75-30、及びCapan-1に対してほぼ等しく良好に結合したが、Capan-1は、他の2つの細胞株と比較して中程度の細胞傷害性応答を示した(図1B)。Capan-1は、BxPC-3及びZR-75-30と比較して、アンモニア細胞傷害性効果に対する感受性が低い(データは示していない)。同様に、ヒト肺腺癌H23細胞は、アンモニアの存在に対して感受性である;ひとたびCEACAM6遺伝子でトランスフェクトされると、該細胞株は、BxPC-3(データは示していない)及びA549細胞(図3A)と比較してより少ないCEACAM6抗原が細胞表面に提示されていたにもかかわらず、L-DOS47細胞傷害性に対して感受性となった(図3B)。結論として、L-DOS47が腫瘍に対して細胞傷害性効果を発揮するためには、細胞表面におけるCEACAM6の発現及びアンモニアに対する感受性が、2つの重要な要件である。
ヒトがん組織の免疫組織化学的スクリーニングによって、L-DOS47が、肺、結腸、及び膵臓腺癌に対して特異的であったことが示された(表2)が、対応する正常組織に対してはそうではなかった。ウレアーゼの表面での複数の抗体のコンジュゲーションは、CEACAM6抗原に対する特異性を大いに強化しており(図1A及び2)、該酵素の非特異的な結合の性質を減少させている(データは示していない)。インビボでの研究により、腫瘍異種移植片に対するL-DOS47の有効性がさらに確認された。腫瘍成長阻害が、ヌードマウス腫瘍異種移植片へのL-DOS47のIV投与(データは示していない)及びA549肺腺癌の転移研究(表3)において観察された。肺のフォーカスの有意な減少が、10又は15μg/mLのL-DOS47で処理されたA549細胞において注射後3週間観察された(表3)。しかしながら、恐らく、L-DOS47の動物からのクリアランスが原因で、10週後には有意差は見られなかった。アイソタイプ対照(V21-DOS47、抗VEGFR2-DOS47コンジュゲート)もまた、A549細胞は通常の条件でVEGFR2を発現しないという事実にもかかわらず、ある程度の肺のフォーカスの減少を引き起こした。Ohwadaらの文献(19)は、A549細胞において、50mMのHClへの曝露後にVEGFRの機能性が誘導されることを報告している。この傷つけられているA549細胞の抑制された増殖は、外来性のVEGF投与によって回復させることができた一方で、中和抗VEGFR1及び抗VEGFR2抗体の添加は、細胞増殖を再抑制した。しかしながら、VEGF及び抗VEGFR抗体の双方は、対照細胞に対する効果を有さなかった。理論によって束縛されることは望まないが、A549細胞におけるVEGFR2の機能性が、この転移研究における細胞調製プロセスの間に誘導されている可能性がある。このことは、何故細胞数の減少がアイソタイプ対照群において観察されたのかを説明する。インビトロ及びインビボ双方での研究の結果により、ウレアーゼ上の抗体コンジュゲーションが、良好な選択性及び有効性で該抗体-コンジュゲートが、CEACAM6発現腫瘍を特異的に標的とすることを可能としたことが実証されており、このことはL-DOS47の臨床開発のための概念実証を提供する。
(実施例2.再発性又は転移性の非扁平上皮NSCLC(非小細胞性肺がん)におけるL-DOS47の用量漸増試験)
本研究の主要な目的は、ステージIV(TNM M1a及びM1b)再発性又は転移性非扁平上皮非小細胞性肺がんの患者において、ペメトレキセド/カルボプラチンの標準的なダブレット療法と組み合わせたL-DOS47のある範囲の用量が、どの程度安全であるのか、どの程度良好な耐容性を示すのか、及びどの程度効果的であるのかを評価することである。
主要な評価項目は、以下のとおりである。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療におけるL-DOS47の測定安全性及び認容性としての有害事象を伴う患者の数は、参加者が12週間追跡されることである。これを、安全性論点に指定する。AE報告期間は、第1サイクルの第1日に開始され、最後の研究来診まで続く。2次的な評価項目は、以下のとおりである。RECIST 1.1による組合せ治療を受けた患者の奏効率(objective response rate)は、12週までであり、これは安全性論点には指定されない。客観的腫瘍応答は、少なくとも2サイクルの研究治療を完了し、少なくとも1つの処理後疾患評価を受けた患者において、RECISTバージョン1.1によって評価されるものとする。持続性の臨床的利益を受けた患者の数を12週まで追跡し、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47+ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療後、完全奏効、部分奏効、及び安定となった患者の百分率として定義される。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療における投薬後のL-DOS47の最高観察血漿濃度(Cmax)は、12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療における投薬後の、L-DOS47の最高観察血漿濃度までの時間(Tmax)は12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。L-DOS47の濃度時間曲線下面積(AUC)は、ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療における投薬後の12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。L-DOS47の最終消失半減期は、ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療における投薬後の12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。ペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療においてL-DOS47を投与された患者についての抗L-DOS47抗体の存在は12週までであり、これは安全性論点に指定される。血清サンプルを、L-DOS47を投与された全ての患者から採取し分析することとする。
ペメトレキセド及びカルボプラチンとL-DOS47とを伴う実験を行うこととする。患者は、1つのコホートあたり最小で3名、最大で6名としたL DOS47の漸増用量のコホートにリクルートされるものとする。L DOS47の初期用量は、0.59μg/kgとし;評価される可能性のあるさらに用い得る用量レベルは0.78、1.04、1.38、及び1.84μg/kgである。それぞれ、L-DOS47と組み合わせて投与されるべきペメトレキセド［500mg/m2］及びカルボプラチン［AUC6］の標準治療用量は、コホート間で一定のままとする。1治療サイクルは21日とし、患者は、L DOS47をサイクルの第1日、第8日、及び第15日に受け、ペメトレキセド/カルボプラチンを各治療サイクルの第1日に受ける。患者が、L-DOS47とペメトレキセド/カルボプラチンとの組合せ治療を4サイクル受けることが計画される。組合せ治療の4サイクルの後に進行が見られず、かつ許容し得ない毒性を経験していない患者には、臨床的利益が存在し、それに良好な耐容性が示されている限りは、治験責任医師の意見によってL-DOS47治療を疾患の進行まで受け続ける機会があたえられるものとする。ペメトレキセド/カルボプラチンの毒性が原因で4サイクルのL-DOS47+ペメトレキセド/カルボプラチン組合せ治療を完了することができない患者には、臨床的利益が存在し、それに良好な耐容性が示されている限りは、治験責任医師の意見によって、ペメトレキセド/カルボプラチンの中断後に、L-DOS47治療を疾患の進行まで受け続ける機会が与えられるものとする。
(実施例3.非小細胞性肺がんを治療するためのイムノコンジュゲートL-DOS47の第I/II相非盲検非無作為化用量漸増試験)
本研究の主要な目的は、L-DOS47のある範囲の用量が単剤療法として与えられた場合に、非扁平上皮の非小細胞性肺がんの患者において、どの程度安全であるのか、どの程度良好な耐容性を示すのか、及びどの程度効果的であるのかを評価することである。
主要な評価項目は、以下の通りである。L-DOS47の安全性及び認容性の尺度としての薬物関連有害事象の発生率及び重症度は、12週までであり、これは安全性論点に指定される。これらは、第1サイクルの第1日に始まり最後の研究来診まで続くAE報告期間の間評価される。
2次的な評価項目は、以下の通りである。注入後の初めの2時間のL-DOS47関連毒性は、注入後の初めの2時間のものであり、これは安全性論点に指定される。これらは、AE及びSAEの発生率及び重症度、並びにバイタルサインの変化によって評価される。報告された全ての有害事象及び重篤な有害事象の発生率及び重症度は、12週間及び30日間の追跡期間参加者が従うタイムフレーム下にある。これらは、安全性論点に指定され、第1サイクルの第1日に始まり最後の研究来診まで続くAE報告期間の間評価される。追加の安全性パラメーター(臨床検査評価、バイタルサイン、体重、酸素要求量及び12誘導ECG)のベースラインからの変化は、12週までのタイムフレーム下であり、これは安全性論点に指定される。安全性パラメーターとしては、臨床検査評価、バイタルサイン、体重、酸素要求量、及び12誘導ECGが挙げられる。該経時的な抗L-DOS47抗体の評価は、12週までであり、これは安全性論点に指定される。血清サンプルは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取され、分析されるものとする。
他の評価項目は、以下の通りである。各々の用量レベルでのL-DOS47の最高観察血漿濃度(Cmax)は、12週までのタイムフレーム下であり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。各々の用量レベルでのL-DOS47の最高観察血漿濃度(Tmax)までの時間は12週までであり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。各々の用量レベルでのL-DOS47の濃度時間曲線下面積(AUC)は、12週まで測定され、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。各々の用量レベルでのL-DOS47の最終消失半減期は、12週までのタイムフレーム下であり、これは安全性論点には指定されない。L-DOS47の薬物動態学的パラメーターは、L-DOS47を投与された全ての患者から採取された血漿サンプルから決定されるものとする。患者は、1つのコホートあたり最小で3名最大で6名としたL-DOS47の漸増用量のコホートにリクルートされるものとする。L-DOS47の初期用量は、0.12μg/kgとし;さらに用い得る用量レベルとしては、0.21、0.33、0.46、0.59、0.78、1.04、1.38、1.84、2.45、3.26、及び4.33μg/kgが挙げられる。1治療サイクルは、21日とし、患者は、L-DOS47をサイクルの第1日及び第8日に受けるものとする。
患者は、1つのコホートあたり最小で3名最大で6名としたコホートにリクルートされるものとする。後続の患者において漸増を許可する前に、所与の用量レベルの全ての患者が、第1サイクル(3週間)を完了しなければならない。用量の漸増を次の用量レベルとする決定は、安全性及び利用可能な薬物動態学的(PK)データが、治験運営委員会(TSC)によって精査された後に行うものとする。L-DOS47の漸増は、最大耐用量(MTD)に達するまで続けられるものとする。第I相においてL-DOS47のMTDが決定された後に、最大で20名の患者が、登録され(第I相からその先に進められ)、予備的なL-DOS47の有効性(すなわち、固体腫瘍における反応評価基準［the Response Evaluation Criteria in Solid Tumours; RECIST］バージョン1.1の基準を用いた奏効率、疾患の進行、及び生存時間)が評価されるものとする;モニタリングは、2サイクルおきの放射線学的な評価を含むものとする。L-DOS47の安全性及び認容性も、さらに評価するものとする。薬物動態学的情報を、L-DOS47の活性に対する関連性のある観察と共に収集するものとする。
全ての患者について、L-DOS47での治療を、患者が疾患の進行、許容し得ない毒性を経験するか、患者が同意を撤回するか、又は4回の治療サイクルを完了して、かつ追加のサイクルを継続することを望まないかのいずれか早い方まで継続するものとする。4回のサイクルの後に、患者は、持続性の臨床的利益が存在し、それが良好な耐容性を示す限りは、治験責任医師の意見の下で、L-DOS47を受け続けてもよい。
(実施例4:非小細胞性肺がん(NSCLC)の治療のためのラクダ科動物単一ドメイン抗体-ウレアーゼ酵素コンジュゲートの製造及びキャラクタリゼーション)
最もよく使用されるがん化学療法薬の有効性は、それらの狭い治療係数及び腫瘍細胞に対する選択的効果の欠如によって限定される。抗体指示型酵素プロドラッグ療法(ADEPT)は、抗体-酵素コンジュゲートを、それらが腫瘍関連抗原に結合する場である腫瘍部位へと送達することによって選択性を向上する一方で、残りの非結合コンジュゲートは、血流から除去される［20］。ひとたび抗体-酵素コンジュゲートが蓄積されると、プロドラッグが投与され、腫瘍部位で、該抗体-酵素コンジュゲートの酵素部分によってその活性な細胞傷害性形態へと変換され、それによって、選択的な腫瘍細胞死が達成される。ADEPT概念が、Bagshaweによって1987年に導入されて以来［20-22］、研究者らは、この概念の変形を応用してより強力なかつ特異的な抗がん薬を開発してきた［22-24］。異なる世代のガラクトシドプロドラッグ及び抗体-ガラクトシダーゼコンジュゲートが、活性化された薬物の細胞傷害性を増加させつつ全身毒性を減少するために開発された［25］。ヒトプリンヌクレオシドホスホリラーゼの変異型を操作して、基質としてのアデノシンベースのプロドラッグに対する特異性が強化された［26］。加えて、異なる種類の免疫酵素インフュージョンタンパク質が開発され、酵素活性及び抗体アビディティーが向上されている［27-29］。
コンジュゲーション比率が、天然のウレアーゼ1分子あたり約10個の抗体である単一ドメイン組換え抗体及びタチナタマメウレアーゼの化学的コンジュゲートであるL-DOS47の生産及びキャラクタリゼーションが記載される。L-DOS47イムノコンジュゲートは、腫瘍組織において天然に大量に存在する尿素を、アンモニアを生成させるためのプロドラッグとして使用する。標的腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原CEACAM6［33］へのAFAIKL2抗体の選択的結合は、ウレアーゼの蓄積、及びその結果として生じる細胞外尿素の加水分解をもたらし、それが細胞傷害性であり、がん細胞にとって好ましくないアルカリ性の環境を生み出すアンモニアが生成する［34］。最大で680kDaの分子量を有し得るコンジュゲートの複雑性及びサイズのために、コンジュゲーション化学、反応、及び分離手順が、大スケール製造における課題に対処するために開発された。ウレアーゼは、選択された抗体にとって複数の可能なコンジュゲーション部位を有しているので、薬物の効力に重要であるL-DOS47のコンジュゲーション比率を、Experion SDSマイクロチャンネルゲル電気泳動システムを用いてキャラクタリゼーションした［31,32］。L-DOS47コンジュゲート純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。L-DOS47の化学的素性は、質量分析ペプチドマッピング及びウエスタンブロットによってによってキャラクタリゼーションした。一級アミン(K32)が単一ドメイン抗体のCDR3領域に存在するために、抗体側でのコンジュゲーション部位の分布は、RP-HPLC及びMALDI質量分析によって決定された。抗体側及びウレアーゼ側双方のコンジュゲーション部位もまた、ESI質量分析によってキャラクタリゼーションした。L-DOS47結合のCEACAM6に対する親和性に対するコンジュゲーション比率の効果を、ELISAによって評価した。インビトロ研究を行い、L-DOS47結合及びそのCEACAM6発現がん細胞株において細胞傷害性を引き起こす能力を確認した。
イムノコンジュゲート(L-DOS47)を、CEACAM6を発現する腫瘍のための治療剤として開発しキャラクタリゼーションした。CEACAM6を標的とする単一ドメイン抗体AFAIKL2を、大腸菌 BL21 (DE3) pT7-7系で発現させた。高純度ウレアーゼ(HPU)を、タチナタマメミル(jack bean mill)から抽出し精製した。AFAIKL2を、N-サクシニミジル［4-ヨードアセチル］ベンゾエート(SIAB)を架橋剤として用いて活性化して、その後ウレアーゼにコンジュゲートした。活性化及びコンジュゲーション反応を、pHを変化させることによって制御した。これらの条件下、材料比はウレアーゼ1分子あたり8〜11個の抗体のコンジュゲーション比率を達成し、残留遊離ウレアーゼ含量はほとんど無視できるほどであり(＜2％)、かつ高純度(＞95％)L-DOS47コンジュゲートをウルトラダイアフィルトレーションのみを用いて未反応抗体及び加水分解された架橋剤を除去することによって製造することができた。L-DOS47は、SEC、IEC、ウエスタンブロット、ELISA、及びLC-MSEペプチドマッピングを含む一連の分析技術によってキャラクタリゼーションした。抗体-ウレアーゼコンジュゲート比が増加するにつれて、よい高い結合シグナルが観察された。しかしながら、この効果は、1ウレアーゼあたり6個の抗体を超えるコンジュゲーション比率では、それほど明白ではなかった。L-DOS47の特異性及び細胞傷害性を、3つの細胞株(BxPC-3、A549、及びMCF7)におけるスクリーニングによって確認した。CEACAM6発現細胞株であるBxPC-3は、L-DOS47に対して最も感受性が高いことが分かった。L-DOS47は、非小細胞性肺がん(NSCLC)のヒト第I相臨床研究において有望な治療剤として試験されている。
高純度ウレアーゼ中間体ウレアーゼ(以下粗ウレアーゼ又はDOS47と称する)の製造は、BioVectra Inc. (Charlottetown, PE Canada)から調達した。コンジュゲーションにおける使用の前に、粗ウレアーゼを精製して、カナバリン及びコンカナバリンAなどのタチナタマメマトリックスタンパク質夾雑物を除去した。粗ウレアーゼを、高純度水に溶解し、pHを10mM酢酸、0.2mM EDTA(酢酸-EDTAバッファー)で5.15とした後に、セライト503のスラリーを用いて真空下濾過した。ケーキを、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、pH5.15で洗浄し、真空乾燥した。ウレアーゼを含有する濾液を0〜4℃に冷却し、冷却したエタノールを25％(v/v)の終濃度まで加えることにより分画した。混合物を15分間撹拌し、その後、洗浄したセライト503を用いて真空下濾過した。ケーキを25％(v/v)のエタノールを含有する酢酸-EDTAバッファーで洗浄し、その後、真空乾燥した。
ケーキを酢酸-EDTAバッファーに再懸濁させ、スラリーを真空下セライト濾過して、濾液を採取した。結果として得られたケーキを、酢酸-EDTAバッファーで洗浄し、真空乾燥した。洗浄液と初めの濾液を、0.65μmのカプセルで濾過した。このエタノール分画されたウレアーゼ濾液を、2枚のSartorius Sartocon 100000 Da MWCOポリエーテルスルホン膜を用いて〜2倍濃縮し、それに続き酢酸-EDTAバッファーにバッファー交換した。
イミダゾール及びTCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)を、それぞれ20mM及び1mMの終濃度でこの中純度ウレアーゼに加え、pHを6.5へと調整した。このタンパク質溶液を、20mMイミダゾール、1mMTCEP、pH6.5(イミダゾール-TCEPバッファー)で前もって平衡化させておいたDEAE-セファロースファストフローカラムに載せた。全ての工程は、500mL/分の流速で行った。カラムを、イミダゾール-TCEPバッファーで洗浄し、それに続き、80mMのNaClを含有するイミダゾール-TCEPバッファーで洗浄し非結合不純物を除去した。ウレアーゼを、180mMのNaClを含有するイミダゾール-TCEPバッファーで溶出した。A280＞0.1かつSECによる純度が≧90〜97％の画分をプールした。
プールされた画分を、2枚のSartorious Sartocon 100 000 Da MWCO PESU膜を用いて6〜8mg/mLの目標タンパク質濃度まで濃縮し、その後、10mM酢酸ナトリウム、1mM EDTA、pH6.5を含有する酢酸-EDTAバッファーに対して透析濾過した。本工程からの収率は、典型的には出発活性の＞55％である。AFAIKL2薬物中間体の発現及び精製、AFAIKL2抗体のアミノ酸配列を、図5に示した(配列番号1)。
前記抗体遺伝子を、大腸菌BL21 (DE3) pT7-7系において発現させた。1バイアルのマスター細胞バンクを、500L発酵槽中の、50mg/Lのカナマイシン、1g/Lのセレロース、0.02g/LのMgSO4、及び0.01％のBiospumex消泡剤薬を追加した350 L Luria HiVeg(20g/L)に、3つの播種工程で無菌的に接種した。このプロセスは、＞20％の溶存酸素、37℃±2℃の温度、5〜20psiの背圧、7.0±0.2のpH、0.5〜40のOD600、及び1〜3g/Lのグルコース濃度を維持するように制御された。培養物が7〜10のOD600に達したら、1mMの終濃度までのIPTGのの添加によって抗体発現を誘導し、6〜8時間継続させた。細胞を遠心分離によって回収し、洗浄し、溶解して封入体を放出させ、その後、10体積の50mMイミダゾールpH6.8に再懸濁した。細胞懸濁液を、バッチに分けて均質化して、ホモジネートを先ず75ミクロンステンレス鋼の衛生的な篩に通し、その後、温度を10℃未満に維持しつつ、合計で3回10,000psiの最低圧力でマイクロ流体化装置に通した。細胞可溶化物を遠心分離して、不溶物質をプールして、ペレットを、5mMのDTTを含む10体積の1％Triton X-100における均質化で再懸濁した。洗浄したペレットを、遠心分離によって回収した。この洗浄を繰り返し、それに続き、5mMのDTTを含有する25mMの酢酸ナトリウム、pH4.0で2回洗浄して、残留するTriton X-100を除去し、該ペレットをpH4に緩衝した。
洗浄した封入体を含有するペレットを、8M尿素、25mM DTT、125mM酢酸ナトリウム、pH4.0に再懸濁し、その後、目視での外観にそれ以上の変化がなくなるまで、Rossホモジナイザー、次いで、オーバーヘッドミキサーで交互に可溶化し、その後、オーバーヘッドミキサーのみで合計時間で3時間混合した。可溶化された封入体を遠心分離して、清澄化された上清を、125mM酢酸ナトリウム、pH4.0中の8M尿素(SP平衡化バッファー)で前もって平衡化させておいたSP-セファロースXLカラムに550mL/分で載せた。清澄化された上清を載せた後に、カラムを、溶出液のA280が0.05未満に低下するまで平衡化バッファーで洗浄し、それに続き、溶出液A280が0.05未満に低下するまで50mM NaClを含む酢酸ナトリウム中の8M尿素、pH4.0で洗浄した。ポンプ速度を275mL/分まで低下させ、3cvの8M尿素含有25mM酢酸ナトリウム、180mMNaCl、pH4.0をカラムに用いてAFAIKL2を溶出させた。A280が＞0.4、かつA280/A260比が＞1.5の画分をプールして、純度及びタンパク質含量を分析した。本工程からのパーセント収率は、典型的には35〜45％である。プールされた材料を、SP平衡化バッファーで≦2.5g/Lまで希釈し、pHを、2Mトリス-Cl、pH8.0で8.0へと調整し、DTTを、2.5mMまで加え、該調整済みプールを、60分間混合して、変性タンパク質を完全に還元した。変性タンパク質溶液を、その後、25mMトリス-Clを含有するリフォールディングバッファー、pH8.5に、0.1mg/mL未満の最終タンパク質濃度まで希釈した。リフォールディングは、2〜8℃で行い、遊離のスルフヒドリルのレベルが＜0.75μmとなり、完全に酸化されたタンパク質のみが検出できるまで、Ellmanのアッセイ及びC18逆相HPLCによって追跡した。
リフォールドされたタンパク質溶液を、25mMイミダゾール、pH6.8で前もって平衡化させておいたQ-セファロースXLカラムに載せ、A280が＜0.05となるまで該カラムを平衡化バッファーで洗浄し、それに続き、A280が＜0.01となるまで50mM NaClを含有する25mMイミダゾール、pH6.8で洗浄した。その後、タンパク質を、150mM NaClを含有する25mMイミダゾール、pH6.8で溶出し、A280が≦0.3となるまで画分を採取した。画分を合わせて、97％以上の純度かつ45％以上の収率で、標的プールを作製した。プールをその後、Hydrosart再生セルロース5000 MWCOカートリッジを備えたUF/DFシステムを用いて3〜5g/Lまで濃縮し、それに続き、10mMリン酸バッファー、pH7.0を用いてバッファー交換して凍結乾燥した。
(コンジュゲーション化学)
コンジュゲーションは、2工程で行った(図6)。第1工程では、AFAIKL2上の一級アミン基を、SIABのNHSエステル部分との反応によって活性化した。第2工程では、活性化されたAFAIK2を、SIABのヨードアセトアミド末端を介してウレアーゼ上のチオール基にカップリングさせた。図6に示されるように、L-DOS47コンジュゲート産物の合成は、2工程反応である。工程1は、SIABを用いる抗体の活性化であり、工程2は、活性化された抗体のウレアーゼ酵素とのコンジュゲーションによるバイオコンジュゲートL-DOS47の形成を伴う。
AFAIKL2抗体の活性化。凍結乾燥したAFAIKL2(25g)を、注射用水(WFI)に溶解した。SIAB(2.00g)を、無水のDMFに溶解し、3等分してAFAIKL2溶液に加え、各添加の後に60分間撹拌した。SIABの最後の添加の1時間後、全ての残存する未反応NHS基を、添加したSIABの元の量の10×モル過剰のグリシンの添加によってクエンチした。加水分解された及びグリシンでクエンチされたSIABを除去し、反応溶液を、Sartorious Sartocon 5000 Da MWCOを用いて10mg/mL AFAIKL2まで濃縮し、それに続き、10mM酢酸ナトリウム、pH6.5、1mM EDTAにバッファー交換した。
活性化された抗体のウレアーゼへのコンジュゲーション。高純度ウレアーゼ(50g)を、10mM酢酸ナトリウム、pH6.5、1mM EDTA中で、活性化されたAFAIKL2と混合した。その後、1M ホウ酸ナトリウム、pH8.5の添加によってpHを8.3とした。これにより、活性化された抗体上のヨードアセチル基が、ウレアーゼ上の利用可能なシステイン残基と反応することが可能となる。反応を、撹拌しながら90分間進行させた。未反応のヨードアセチル基を、その後、添加したSIABの元の量に対して10×モル過剰のシステインの添加によってクエンチし、溶液を60分間混合した。非コンジュゲートAFAIKL2を除去するために、L-DOS47を、100000 Da MWCO Sartorious Sartoconを用いて6mg/mLの目標値まで濃縮し、それに続き、10mM L-ヒスチジン、pH6.8、0.2mM EDTAにバッファー交換した。スクロースを、1％w/vの終濃度まで加え、L-DOS47を、10mM L-ヒスチジン、pH6.8、0.2mM EDTAで1.8g/Lの目標濃度まで希釈した。
純度評価のためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)。996 PADを備えたWaters 2695 HPLCシステムを、データ取得及びデータ処理のためのEmpower 2ソフトウェアと共に採用した。クロマトグラムは、210〜400±4nmにわたり記録し、280nmのシグナルを処理のために抽出した。分離は、Superose 6 100/300 GL カラム(GE)で行った。タンパク質を、10mM リン酸塩、50mM NaCl、0.2mM EDTA、pH7.2に溶出させた。分離は、100μlのニートサンプル注入後に、0.5mL/分の一定組成流で行った。カラムは、室温で実施し、サンプル温度は、5±2℃に制御した。
残留ウレアーゼのためのイオン交換クロマトグラフィー(IEC)。996 PAD及びEmpower ソフトウェアを備えたWaters 2695 HPLC システムを採用した。クロマトグラムは、210〜400nm±4nmにわたり取得して、280nmのシグナルを、処理のために抽出した。カラム(Mono-Q 5/50 GL, GE)を室温で使用し、サンプル温度は、5±2℃に制御した。溶出バッファーは、50mMアセテート、0.025％ポリソルベート 80(超高純度, HX2, NOF Corporation, Tokyo)を含有するとともに、0.70M NaCl、pH5.50を含有していた(バッファーB)か、又はしていなかった(バッファーA)。サンプルを注入する前に、カラムを、15％のバッファーB及び85％のバッファーAで、6分間、1mL/分の流速(6CV)で平衡化させた。洗浄サイクル(15％のバッファーB、1.0mL/分で6分間)の後に、タンパク質を、15〜60％のバッファーBのグラジエントで、0.5mL/分の流速で20分間溶出させた。次のサンプルの注入の前に、100％のバッファーBで1.0mL/分で6分間洗浄後、カラムを、15％のバッファーBで再度平衡化させた。800μlのニートのL-DOS47サンプルを、HPウレアーゼ参照標準品で0〜8％w/wの最終百分率までスパイクし、50μl/サンプルを注入した。ピーク高さを使用して、標準的な添加を検量法として用いて、残留ウレアーゼ含量を計算した。
Experion SDSマイクロチャネルゲル電気泳動を、コンジュゲーション比率の決定のために使用する。BioRad Experion自動電気泳動システム及びBioRad SDS ゲル電気泳動キット(Pro260キット)を採用して、L-DOS47コンジュゲーション比率を分析した。サンプルを、トリス-HClバッファー(10mM、0.2mM EDTA、pH7.0)で、0.5 mg/mlの目標タンパク質濃度まで希釈し、その後、4μlの希釈サンプル又は分子量マーカー(molecular weight ladder)を、2μlのサンプルバッファーと混合し、手短に遠心分離した。サンプルを70℃で10分間加熱し、その後、システム及びチャネルをゲル-ステイン溶液で準備してから、サンプルをマイクロチャンネルチップに載せた。電気泳動図は、Experionソフトウェアによって自動的に記録された。
素性のキャラクタリゼーションのためのウエスタンブロット。L-DOS47試験サンプル及びAFAIKL2/HPU対照を、SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離し、その後、Invitrogen iBlotシステムを用いてニトロセルロースメンブレンに移した。2連のブロットを、並行して実施したゲルから作製した。AFAIKL2であることの確認には、ウサギ抗AFAIKL2 IgG一次抗体(Rockland)を用いた検出と、アルカリホスファターゼ(AP)にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG(Sigma)を用いた二次検出とが必要である。ウレアーゼであることの確認には、ウサギ抗ウレアーゼIgG一次抗体(Rockland)を用いた検出と、APにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG(Sigma)を用いた二次検出が必要である。抗AFAIKL2 IgGを用いた検出のためには、L-DOS47サンプルを、0.1mg/mL BSAを含有する1×TBS中に0.002mg/mLとなるまで希釈し、その後、1:1でタンパク質ゲルローディングバッファーと混合し、70℃に10分間加熱し、1レーンあたり0.01μgのL-DOS47を載せる。抗ウレアーゼIgGを用いた検出のためには、L-DOS47サンプルを、0.1mg/mL BSAを含有する1×TBS中に、0.02mg/mLとなるまで希釈し、その後、1:1でタンパク質ゲルローディングバッファーと混合し、70℃に10分間加熱し、1レーンあたり0.1μgのL-DOS47を載せた。ウエスタンブロットの最後の展開は、NBT/BCIPを含有するAPバッファーで行った。
(異なるコンジュゲーション比率を有するL-DOS47のELISA)
標的抗原であるCEACAM6へ結合するL-DOS47の親和性に対するコンジュゲーション比率の効果を研究するために、異なるコンジュゲーション比率を有するL-DOS47コンジュゲートを、コンジュゲーションの際にAFAIKL2/HPUモル比を調整することによってベンチスケールで製造した。結果として得られたコンジュゲートのコンジュゲーション比率を、SDS-Experionによって決定し、タンパク質濃度を、Total Protein Kit(Sigma, TP0200)を用いるマイクロLowryによって決定した。マイクロタイタープレートを、100μL/ウェルのCEACAM6-A(全CEACAM6抗原のドメイン-A)(PBS中2.5μg/ml)でコートして、室温で6時間インキュベートした。プレートを、バッファーA(PBS中0.05％ BSA)で2回洗浄し、150μL/ウェルの3％ BSA/PBSで4℃で1晩ブロックし、その後、バッファーAで2回洗浄した。後続の工程は全て、穏やかに振盪しながら室温で行った。L-DOS47(100μL/ウェル)を加え、2時間インキュベートし、プレートをバッファーAで3回洗浄し、その後100μL/ウェルの抗ウレアーゼIgG(1:12000、Rockland)を加え、1時間インキュベートした。バッファーAで3回洗浄した後に、100μL/ウェルのヤギ抗ウサギIgG-AP(1:6000, Sigma)を加えて、1時間インキュベートした。バッファーAで3回洗浄後、100μL/ウェルのAP基質溶液を加え、25分間インキュベートした。吸光度を、405nmで決定した。
(AFAIKL2抗体上の活性化部位の決定)
フルオレセイン標識システイン(Cys-FL)を調製するために、システインを過剰に、NHS-エステルフルオレセイン(Pierce)と、1Mホウ酸塩、pH8.0中で室温で60分間反応させた。反応溶液を、C8カラムを用いたRP-HPLCによって分離した。Cys-FLピーク画分を、MALDI質量分析によって特定し、その濃度を、493nm及びpH7でのその吸光係数に応じて分光分析によって決定した。ピーク画分分割量を凍結乾燥し、-20℃で暗所に保管した。AFAIKL2抗体は、先ず、ベンチスケールでSIAB架橋剤で活性化され、加水分解されたSIABを、自社で調製したG25脱塩カラムで取り除いた。活性化された抗体を、100mMホウ酸バッファー、pH8.3中で、フルオレセイン標識システイン(Cys-FL)と室温で90分間反応させた。反応溶液を、G25脱塩カラムにより30mM炭酸水素アンモニウムとバッファー交換し、結果として得られたAFAIKL2-Cys-FLを、20％アセトニトリルを含有する30mM炭酸水素アンモニウム中に、0.5〜0.8mg/mLとなるまで希釈した。トリプシン(Promega)を、最終のタンパク質対トリプシン比が20:1となるまで加え、37℃で36時間消化を行った。結果として得られたトリプシン消化物を、0.1M TCEPを2mMの終濃度まで加えることにより減少させ、その後、逆相HPLC(Zobax 300SB-C18カラム、5μm、4.6×150mmを備えたAgilent 1100システム、アセトニトリルが0〜45％のグラジエント、0.025％TFA、55分)で分離し、420nmの吸収を記録した。AFAIKL2上のSIABで活性化されたリジンは、フルオレセイン標識システインに連結されていたため、それにトリプシンが近づくことができる可能性は低く、ペプチド(XnKXm)-Cys-FLが、生じたはずである。フルオレセイン修飾ペプチドを含有するピーク画分を採取し、リフレクトロン(Reflectron)モードのMALDI質量分析(2eのマイクロ質量T)を適用した。対応するペプチドのHPLCピーク面積を用いて、各活性化部位の分布百分率を計算した。
コンジュゲートしたペプチドのペプチドマッピング及び同定は、ESI質量分析によって行った。Waters Xevo G2 QTOF質量分析計及びBEH300 C18カラム(1.7μm, 2.1×150mm)を備えたAcquity UPLCシステムHクラスを採用した。各L-DOS47サンプル(1.5〜2.0mg/mL, 50.0μl)を、0.063±0.003gのグアニジン-HClと混合した。この塩を完全に溶解させた後に、1.50μLの0.7M DTTを加え、溶液を60℃で30分間インキュベートした。10.0μLの0.20Mヨードアセトアミド(IAA)を加え、pHを、飽和Tris-Base溶液で8.0〜8.5へ調整した。サンプルを37℃で60分間インキュベートした。50.0μLの各アルキル化サンプルを、15.0μLの0.1M CaCl2及び80.0μLのトリスバッファー(50mMトリス-HCl, pH8.0)と混合し、その後、3.00μLの0.5mg/mlトリプシン溶液を加えた。トリプシン消化は、37℃で20〜24時間行った。トリプシン消化の後に、50.0μLの消化物を、LC-MS分析のために0.50μLのニートのギ酸と混合した。カラム温度は、60℃に設定し、溶媒A(水中0.075％v/vギ酸)及び溶媒B(アセトニトリル0.075％ギ酸)を、UPLC分離のために使用した。UPLCは、溶媒Bが0〜55％のグラジエントを用いて0.15mL/分の流速で80分間で行った。
LC-MS分析は、Masslynx V4.1ソフトウェアで制御した。LC-MSE TIC(総イオンカウント)データ取得は、0.3/sの走査速度、キャピラリー電圧3.0kV、サンプルコーン電圧25V、抽出コーン電圧4.0kVで、レゾリューションモードにおいて、50〜2000DaのM/Z範囲で行った。高エネルギー衝突誘起フラグメンテーションTICデータの取得は、衝突エネルギーを20Vから40Vまで上昇させて行った。イオン源温度は、100℃に設定し、脱溶媒温度は、300℃に設定した。脱溶媒ガス流は、600L/時間である。リアルタイムロック質量TIC生データセット(スキャン/20秒)を、3.0μl/分の流速で、100fmol/μLのGlu-Fib Bを用いて取得した。
質量分析生データを、BioPharmalynx(v1.2)を用いて、ペプチドマップモードで、20000の分解能で処理した。785.8426Daのロック質量を、リアルタイム2点間質量較正(real time point to point mass calibration)に適用した。低エネルギーMSイオン強度閾値は、3000カウントに設定し、MSE高エネルギーイオン強度閾値は、300カウントに設定した。質量一致許容度(mass match tolerance)は、MS及びMSE データセットの双方に対し15ppmに設定した。AFAIKL2及びウレアーゼアミノ酸配列を、ペプチドマッチング/同定のための配列ライブラリーに入力した。脱アミド化N、脱アミド化コハク酸イミドN、酸化M、酸化2×M、+K、+Naを含む可変修飾因子(variable modifier)、及びカルバミドメチル(アルキル化システインに対するもの)の固定修飾因子(fixed modifier)を、ペプチドマップ分析に適用した。AFAIKL2側でコンジュゲートしたペプチドを同定するために、ウレアーゼのシステイン含有ペプチド＋架橋剤SIAB(C9H7O2N, 161.0477Da)連結セクションを、可変修飾因子として作成し、可変修飾因子ライブラリーに含めた。この場合、カルバミドメチルを、可変修飾因子として含めた。ウレアーゼ側でコンジュゲートしたペプチドを同定するために、AFAIKL2のリジンを中間に含むペプチド(lysine-in-middle peptide)XnKXm＋SIABの連結セクションを可変修飾因子として作成し、可変修飾因子ライブラリーに含めた。
(L-DOS47のホールセル結合アッセイ)
細胞単層を、100μL/ウェルのMCF-7、BxPC-3、及びA549細胞(4×104細胞/ウェル)を、96-ウェル培養プレート内に播種して、37℃で1晩インキュベートすることによって調製した。その後、培地をプレートから除去し、細胞単層を、100μL/ウェルのPBS中の0.05％グルタルアルデヒドで室温で(RT)10分間固定した。その後、プレートを、PBSで洗浄し、120μL/ウェルの50mMグリシンを加えた。37℃で20分間インキュベーション後、プレートを、120μL/ウェルの1％BSA/PBSで37℃で30分間ブロックした。その後、プレートをバッファーA(PBS中0.05％BSA)で3回洗浄し、80μL/ウェルの希釈されたL-DOS47又はDOS47を加え、37℃で1.5時間インキュベートした。プレートをバッファーAで4回洗浄し、80μL/ウェルの0.1M PBS中の20mM尿素、pH7.6を加え、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、40μL/ウェルの1N HClを加えて、反応を停止した。各ウェル内で生成されたアンモニアの量を、改良インドフェノールアッセイを用いて決定した。手短にいうと、165mgのフェノール及び132mgのNaOHを、10mLの水に溶解させて、それに続き、66μLのニトロプルシドナトリウム溶液(10mg/mL)を添加することで溶液Aを新たに調製した。溶液Bは、40μLの次亜塩素酸ナトリウムを5mLの水に加えることにより調製した。ホールセル結合アッセイからのサンプル溶液(各30μL)を、50μL/ウェルの5N NaOH:H2O(3.3:46.7)及び20μL/ウェルの水を含有する新たな96ウェルプレートに移した。溶液A(50μL/ウェル)及び溶液B(50μL/ウェル)を加え、その後、プレートを37℃で30分間の発色のためにマイクロプレートリーダーに移した。ODを630nmで測定した。ウェル内に生成したアンモニアの量を、0〜150mMの塩化アンモニウムを標準として用いた検量線から計算した。
L-DOS47の細胞傷害性アッセイ細胞単層を、100μL/ウェルのMCF-7、BxPC-3、及びA549細胞(4×104細胞/ウェル)を96-ウェル培養プレート内に播種し、37℃で1晩インキュベートすることによって調製した。その後、培地をプレートから除去し、80μL/ウェルの希釈されたL-DOS47又はDOS47を加え、さらに37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをKR-IIバッファー/0.05％ BSAで3回洗浄し、100μl/ウェルの20mM尿素溶液を加えた。プレートを、37℃で1晩インキュベートし、その後、培地を取り除き、100μL/ウェルの単純培地と交換した。細胞生存率を、MTS細胞生存率アッセイ用いて決定した。該MTS細胞生存率アッセイでは、MTS/PES(MTS, 2mg/mL; PES, 1mg/mL)の21:1v/v溶液を調製し、20μL/ウェルの混合物を、プレートに加えた。その後、プレートを37℃で1時間インキュベートし、ODを、490nmを参照とし630nmで測定した。
タチナタマメウレアーゼは、各サブユニットあたり15個の結合していないシステイン残基を有する、約91kDaの6個の同一サブユニットからなる六量体の酵素である。AFAIKL2抗体は、7個の一級アミン及び1個のジスルフィド結合を含有する。抗体上の一級アミン及びウレアーゼ上のシステイン残基は、ヘテロ二官能性架橋剤を介する化学的コンジュゲーションのためのベースである。しかしながら、コンジュゲートの分子サイズ及び2つのタンパク質の性質が、コンジュゲート生成物のスケールアップ製造、精製、及びキャラクタリゼーションにおける課題を生み出した。イムノコンジュゲートは、非経口薬物としての使用のための生理学的なpHに近い水性媒体中で可溶性かつ安定でなければならない;故に、組換え抗体の等電点(pI)は、ウレアーゼが植物源から抽出され、かつそのpI(観察されるpI 4.8〜5.1)を変化させることができなかったという理由で、注意深い配列設計を必要とした。反応均一性並びに残留する反応物質及び副生成物の除去を確実とするための最適化は、コンジュゲーション化学に重大な意味を持っていた。いくつかの架橋剤［24,30］が、タンパク質コンジュゲーションに広く用いられており、開発の間にスクリーニングされたが、2つの架橋反応の至適pHが異なるという理由で、N-サクシニミジル［4-ヨードアセチル］ベンゾエート(SIAB)がL-DOS47コンジュゲート製造に選択された。製造の間、抗体は、pH7.0で架橋剤を用いて活性化され、その後、pH6.5にバッファー交換され、ウレアーゼを混合される。その後、反応媒体のpHを8.3へと上昇させることによって、抗体がウレアーゼに連結される。活性化されたAFAIKL2をウレアーゼに連結する反応速度は、pH6.5では非常に低いため、大型の反応容器内の材料の均一性は、pH6.5で予備混合することで確実なものとされる。故に、残存する遊離のウレアーゼ及びウレアーゼ-(Ab)xの亜種の分布は、確率及び材料モル比によってもっぱら決定されている。8〜11抗体/ウレアーゼのコンジュゲーション比率では、残留ウレアーゼ含量は、理論上は無視できるほどであり、ウルトラダイアフィルトレーションを用いて未反応抗体及び加水分解された架橋剤を除去することで、L-DOS47コンジュゲートを精製することができる。L-DOS47コンジュゲート、遊離のAFAIKL2、及び遊離のウレアーゼのサイズ排除クロマトグラムを、図7に示す。
L-DOS47コンジュゲートは、〜24.6分で溶出し、二量体(おそらく、ジスルフィド結合によってか又は2つのSIABで活性化されたAFAIKL2分子によって連結されているもの)は、小さい分離されていないピークとして20.5分に溶出し、ポリマーは、微量ピークとしてボイド時間(〜15分)に溶出する。〜40分の微量ピークは、バッファー成分を示す。L-DOS47コンジュゲートピーク幅は、遊離のウレアーゼのそれよりもわずかに大きいが同程度であり、均一に分布したコンジュゲーション反応を示唆している。遊離の抗体は、37分に溶出する。抗体ピークの前の小さい分離されていないピークは、非共有結合性二量体を示す。通常は、抗体の高い純度(＞95％)が、製造ロットにおいて観察され、その高分子量種は、5％を超えない二量体を含んでいる。HPUは、通常、〜26.9分の主要ピーク、24分の小さい二量体ピーク、及び15分の微量のポリマーピークを伴い溶出する。粗ウレアーゼのHPUへの精製は、結果として〜97％のモノマーをもたらした一方で、二量体及びポリマーの和は、3％を超えない。95％を超えるL-DOS47純度は、通常、ウルトラダイアフィルトレーションのみを用いる単純な精製によって達成された。SECが自然の条件下で行われるために、タンパク質四次構造の分解及び解離が原因の有効分子量の変化を決定することができ;従って、本方法も、L-DOS47の安定性を示すアッセイとして用いられる。L-DOS47中の残存する遊離のウレアーゼの存在を、イオン交換クロマトグラフィーを用いて評価した(図8)。
残存する遊離のウレアーゼは、15.33分に溶出し、これは、スパイクしたウレアーゼピーク(15.42分)に非常に近い。HPUピークは、大きいL-DOS47ピーク(1.48のRs)からかなり良く分離される。図8の差し込み部分に示されるように、残留ウレアーゼ含量を決定する標準的な添加方法(2.4％、4.8％、及び7.2％w/wのHPUでスパイクされたL-DOS47)は、良好な直線性(0.9995のR2)を示す。本サンプルの計算された残留ウレアーゼ含量は、0.72％であり、残留ウレアーゼは、現在まで全ての製造ロットで2％を超えたことが無く、これらの条件下で、残留ウレアーゼがほとんど無視できるほどであり、生産プロセスが、L-DOS47コンジュゲートを非コンジュゲートウレアーゼから分離する追加の工程を必要としないことを実証している。
L-DOS47の製造の間、6個のモノマー性ウレアーゼサブユニットの各々を、0、1、2、3、又は4分子のAFAIKL2とコンジュゲートすることができる;従って、変性させる条件下では、L-DOS47のSDS-Experionは、〜90から155kDaまでの複数の個々に分離したピーク/バンドのパターンを生じる。更に、抗体活性化反応の間には、抗体のごく一部を、抗体1分子あたり2つのSIABでランダムに活性化することができ(AFAIKL2-(SIAB)2)、これは、結果として、これら抗体分子の各々のウレアーゼの2つのサブユニットへのコンジュゲーションをもたらす。この1抗体-2サブユニット(one-antibody-two-subunits)は、その結果、200〜260kDaの範囲のよく分離されないピーク/バンドのより小さな第2のセットを生じさせる。
図9において、パネル2は仮想のゲル画像を示し、パネル1はレーン1及び4からの電気泳動図のオーバレイを含む。レーン1及び2並びに7及び8のL-DOS47ベンチスケールサンプルは、コンジュゲーションの第2の反応の前にイオン交換クロマトグラフィーによって精製された活性化AFAIKL2を用いて製造された。AFAIKL2-(SIAB)2種を取り除いたために、結果として得られたコンジュゲートは、サブユニット間で架橋されたサブユニット(inter-cross-linked subunit)を欠いており、一組のピーク/バンドのみが観察された。レーン3〜6のL-DOS47サンプルでは、AFAIKL2が、活性化工程の後に追加の精製をすることなく直接コンジュゲーションに用いられたため、その結果、小さい第2の組のピーク/バンドが存在する。レーン9及び10は、HPUサンプルで過剰に負荷をかけられている。
ピーク面積(図9、パネル1)及びバンド強度(図9、パネル2)は、対応する数の抗体分子と連結されたウレアーゼサブユニットの相対的な存在量に依存する。ピーク面積は、ベースライン補正後にソフトウェアによって積分し、L-DOS47コンジュゲーション比率(CR)を以下のように計算する(図9のゲルのレーン2を示している図10を参照されたい):
CR=6*(PK1*0+PK2*1+PK3*2+PK4*3+PK5*4)/(PK1+PK2+PK3+PK4+PK5)
(式中、
PKi (i=1〜5)は、i-1個の抗体分子と連結されたウレアーゼサブユニットのピーク面積である。
活性化された抗体は、L-DOS47の大量生産の間にイオン交換クロマトグラフィー精製を受けないために、第2の良く分離されないピークの組が、これらのサンプルの電気泳動図に出現する。しかしながら、活性化部位分布が、確率及び抗体のSIABに対するモル比によって決定されるために、2組のピークは、類似の強度パターンを有するものと期待される。この第2のピークの組は、従って、バンドが良く分離されず、260kDaの分子量マーカーと重なっているために、コンジュゲーション比率の計算には用いない。AFAIKL2-(SIAB)2種は、理論上は、異なる天然のウレアーゼ分子由来の2つのサブユニットに連結することにより二量体コンジュゲート又はポリマーコンジュゲートを生成し得るが、L-DOS47サンプルのサイズ排除クロマトグラムに観察される最小レベル(3％未満)の二量体及びポリマー合計ピーク面積(図7)は、大部分のAFAIKL2-(SIAB)2種が、モノマーL-DOS47を生成する単一の天然のウレアーゼ分子のサブユニット間の連結に寄与し、二量体コンジュゲート及びポリマーコンジュゲートを生成する分子間の連結には寄与しないことを示唆する。加えて、SECクロマトグラムにおけるこれらの二量体及びポリマーピークの存在は、類似のピークがHPウレアーゼのサイズ排除クロマトグラムにも出現したために、ジスルフィドによる連結に論理的に帰属し得る。従って、電気泳動図における第2のピークの組は、品質管理のためのパラメーターとして採用されない。
L-DOS47のコンジュゲーション比率は、該抗体の標的とされる腫瘍抗原であるCEACAM6に対する、L-DOS47の親和性に対して重大な意味を有する。異なるコンジュゲーション比率(1ウレアーゼあたり1.8〜12のAFAIK)を有するL-DOS47を、AFAIKL2/HPウレアーゼモル比と調整することによって製造し、結合親和性に対するコンジュゲーション比率の効果を評価した。固定化CEACAM6-Aに対するL-DOS47の結合親和性は、ウレアーゼにコンジュゲートした抗体の数に直接比例することが分かった(図11)。より多くの抗体がコンジュゲートするほど、より高い結合シグナルが観察された。しかしながら、この効果は、6以上のコンジュゲーション比率では、それほど大きくなかった。
デュアルウエスタンブロット法によるL-DOS47の分析(図12)により、SDS-Experionによって観察されるバンドパターンを確認する。挿入された四角は、主要ブロットの四角で囲った領域の拡大を示し、ここでは、ウレアーゼ及びコンジュゲートした種(それぞれ、1〜4個のコンジュゲートしたAFAIKL2を有するウレアーゼに対応するN1〜N4)に表示されている。抗ウレアーゼ抗体で探索する場合、91kDaのウレアーゼバンドが、最も強く可視化され、より高分子量のバンド(より高度にコンジュゲートした種に対応する)の強度は減少する。対照的に、抗AFAIKL2抗体で探索するする場合、91kDaのバンドは、ほとんど見えず、次の2本のより高分子量のバンドが、最も強い(N1及びN2)。これは、これらがコンジュゲートにおいて支配的なバンドであるという事実に起因する。L-DOS47の、抗AFAIKL2及び抗ウレアーゼ抗体の双方によって可視化される能力は、コンジュゲートにおける双方の種の存在を実証し、該抗体の特異性が、抗AFAIKL2抗体が、ウレアーゼに結合せず、抗ウレアーゼ抗体が、AFAIKL2に結合しないという事実によって確認される。
L-DOS47は、AFAIKL2の及びウレアーゼの化学的コンジュゲートであるために、該抗体及びウレアーゼ酵素双方由来のトリプシンペプチド、及び双方のタンパク質の共有結合的に架橋されたペプチドが、該コンジュゲートのトリプシン消化物から検出されるはずである。ESI LC-MSEペプチドマッピングを行って、コンジュゲートのキャラクタリゼーションを行った。関連する内容に示されるように、AFAIKL2由来のペプチドが、L-DOS47スペクトルには出現したが、HPウレアーゼスペクトルには出現しなかった。L-DOS47のトリプシン消化物からは、AFAIKL2及びウレアーゼアミノ酸配列双方のペプチドカバレッジは、6ppm未満の典型的な質量誤差で100％であり、各ペプチドは、その高エネルギーMS/MS b/yフラグメントイオンにより、±15ppm未満の質量誤差で確認された。
AFAIKL2の活性化部位を同定するため及び各コンジュゲーション部位の分布を決定するために、AFAIKL2を、SIABを用いて活性化し、その後、フルオレセイン標識システイン(Cys-FL)にコンジュゲートした。結果として得られたAFAIKL2-Cys-FLトリプシン消化及びRP-HPLCクロマトグラフィーによる分離後に、ピーク画分をMALDI-MSのために採取し、Cys-FL連結抗体トリプシンペプチドを同定した。SIABに活性化された部位のみが、0.025％TFA中での最大吸収波長が420nmであるCys-フルオレセインに連結され得るために、活性化されたペプチドのピークのみが420nmで検出されるはずである。例えば、AFAIKL2のリジン#32がSIABによって活性化された場合、それは、Cys-FLに連結されるはずであり、かつこのトリプシン消化部位は、トリプシン消化の間にみられなくなるであろう;従って、L2K32-Cys-FLと名付けられた、Cys-FLで連結されたリジンが中間に含まれるペプチド
Figure 0006876618
 を示す2768.113Daの分子量のピークが観察されるはずである。AFAIKL2-Cys-FLのトリプシン消化物のRP-HPLCクロマトグラムを、図13に示す。
検出された質量値であると同定されたコンジュゲートしたペプチドも、図13中の対応するHPLCピークに表示した。抗体のアミノ酸配列によれば、6個のリジン残基及びN-末端アミン由来の一級アミンは、理論上は活性化反応に利用可能である。しかしながら、実際には、それらのうちの4個のみが実質的に活性化された。これは、表面上のこれら4個の一級アミンを露出させる一方で、その他を該天然の構造の内部に埋め込んでいる、抗体の三次構造が原因である可能性が最も高い。各活性化部位の分布(表4)は、図13におけるそれのピーク面積及び同定されたHPLCピーク面積全ての和により計算した。
表4.AFAIKL2上の各活性化部位のHPLCピーク面積及び分布百分率
Figure 0006876618
表4に示されるように、架橋剤に対して抗体の最も活性な部位は、L2K76であり、それにL2M1が続き、その後L2K44が続く。L2K32は、抗体結合に必須であり、また最も低活性な部位でもあるが、それでもなお、全体反応性の〜18％に寄与している。L-DOS47については、架橋剤により活性化されたAFAIKL2は、ウレアーゼ四次構造の表面に露出したシステイン残基に共有結合的に連結されていた。従って、共有結合的に架橋されたペプチドは、L-DOS47のトリプシン消化物のペプチドスペクトルから検出されるはずである。
これらの共有結合的に架橋されたペプチドを特定するために、L-DOS47サンプル由来のトリプシン消化物のESI LC-MSE生データをBioPharmaLynxによって処理したが、ウレアーゼ側の15個のシステイン残基全てに対するユーザー作成の修飾因子の組み合わせを含有する可変修飾因子ライブラリーを用いて検索した。表4の活性化分布にしたがい、これらのユーザー作成修飾因子は、3つのリジンが中間に含まれるペプチド＋SIABの連結部分(C9H5O2N, 159.0320Da)(L2K76、L2K44、及びL2K32と名付ける)、及びN-末端のメチオニン＋該連結(L2M1と名付ける)であった。この結果(詳細は関連する内容中)は、各ウレアーゼサブユニットの15個のシステイン残基のうち、6個のみが実質的にコンジュゲートしたことを実証した。最も利用しやすいシステインは、UC824であり、UC663、UC59、UC207、UC329、及びUC268が順に続く。ウレアーゼ酵素活性に必須であるシステイン残基Cys592は、実質的にコンジュゲートしなかった。ウレアーゼ側の6個のシステイン残基の各々にとっての4つの架橋剤により活性化されたAFAIKL2部位の相対的な利用しやすさもまた異なっていた。例えば、UC329は、L2M1にとってのみ利用可能であった。これらの実質的なコンジュゲーション部位もまた、それらのMS/MSフラグメントプロファイルによって確認された。一例として、
Figure 0006876618
 の配列を有し、3517.4873のペプチド質量を有するコンジュゲートしたペプチドであるL2K32UC663を、それを、修飾因子としての、AFAIKL2側由来の
Figure 0006876618
 で修飾された
Figure 0006876618
 ウレアーゼペプチド(配列番号:9)として検索することによって、2.1ppmの質量一致誤差(mass match error)で同定した。また、同じペプチドを、それを修飾因子としての、ウレアーゼ側由来の
Figure 0006876618
 で修飾された
Figure 0006876618
 AFAIKL2ペプチドとして検索することによって、2.1ppmの質量一致誤差で同定した。このコンジュゲートしたペプチドの高エネルギー衝突誘起MS/MSスペクトルを、それをAFAIKL2側由来の前記修飾因子で修飾されたウレアーゼペプチドとして検索することによって、ウレアーゼ側由来の9 b/yフラグメントイオンでマッピングした。また、AFAIKL2側由来の14 b/yイオン同じスペクトルを、それを、ウレアーゼ側由来の前記修飾因子を伴うAFAIKL2ペプチドとして検索することによってもマッピングした。
BxPC-3、A549、及びMCF7細胞株の間で異なるL-DOS47結合プロファイルが観察された(図14)。この結果により、L-DOS47が、膵臓の細胞株BxPC-3によく結合したことが示され、CEACAM6抗原が細胞表面に発現されていたことを示している。中程度の結合が、肺細胞株A549で観察されたが、乳房細胞株MCF7では結合はみられなかった。ウレアーゼ酵素(DOS47)にコンジュゲートした場合、AFAIKL2抗体は、CEACAM6発現細胞に対する特異的ターゲティングを提供した。このことは、非コンジュゲートDOS47対照で処理された3つの細胞株における結合シグナルの非存在によって確認された。
BxPC-3細胞は、細胞を1μg/mL未満のL-DOS47で処理した場合に観察された細胞生存時間の急速な低下によって示されるように、L-DOS47細胞傷害性に対して非常に感受性が高かった(図15)。中程度の細胞傷害性が、A549細胞において観察された一方で、MCF7においては効果が観察されず、前記結合研究の結果と一致していた。加えて、陰性対照であるDOS47は、どの細胞株に対しても細胞傷害性効果を有しなかった。
L-DOS47イムノコンジュゲートのコンジュゲーション及び精製のために開発された手順を、その大スケール製造に採用することに成功した。この確立されたコンジュゲーション化学及び反応条件を用いて、良好な均一性が、架橋剤により活性化された抗体を、HPウレアーゼ中間体と予備混合し、その後pHを調整して、コンジュゲーション反応を活性化することによって達成された。ウレアーゼ1分子あたり8〜11個の抗体のコンジュゲーション比率では、残留ウレアーゼ含量は、ほとんど無視できるほどであり、L-DOS47コンジュゲートをウルトラダイアフィルトレーションのみを用いて未反応抗体及び加水分解された架橋剤を除去することによって精製することができ、残留ウレアーゼを最終のイムノコンジュゲートから分離する難工程が回避された。この手順により、遊離のウレアーゼが2％未満である高純度L-DOS47生成物(＞95％)が得られた。ELISAによって評価されたL-DOS47の固定化CEACAM6-Aに対する結合親和性は、ウレアーゼにコンジュゲートした抗体の数に直接比率しており、コンジュゲーション比率が6を超えた場合は横ばいとなった。大スケールバッチのすべてについて、コンジュゲーション比率は、ウレアーゼ1分子あたり9〜11個の抗体の範囲であり、最適なコンジュゲーションがこれらの条件下で達成されていたことを実証している。デュアル抗体ウエスタンブロットアッセイにより、コンジュゲートの化学的素性が確認された。ESI LC-MSEペプチドマッピング分析において、L-DOS47イムノコンジュゲート由来の抗体及びウレアーゼ双方について100％の配列回収率(sequence recovery)が達成された。AFAIKL2及びウレアーゼ双方の、C-末端及びN-末端配列を含む3個を超えるアミノ酸残基を有するペプチド配列を、対応するペプチドのMS/MS b/yフラグメントマップによって確認した。有効なコンジュゲーション部位(AFAIKL2側に4個及びウレアーゼ側に6個)を、L-DOS47サンプルのESI LC-MSEペプチドマッピング分析によって特定した。これらの架橋されたペプチドは、抗体側及びウレアーゼ側双方由来の関連ペプチドのMS/MS b/yフラグメントマップによって確認された。
2つのCEACAM6発現細胞株BxPC-3及びA549に対するL-DOS47の特異性が、抗体にコンジュゲートしたL-DOS47対応品と比較してDOS47の結合及び細胞傷害性活性が存在しないことによって例証された。試験した3つの細胞株のうち、BxPC-3が、最も強力な結合シグナルを示した一方で、A549は、中程度の結合を示すのみであった。BxPC-3の結合シグナルは、A549のそれの約5倍であった。この結果は、細胞傷害性アッセイにおいて観察されたものと一致していた。L-DOS47は、A549に対してよりもBxPC-3に対してかなり高い細胞傷害性効果を誘導した。L-DOS47結合の欠如のために、MCF-7において細胞傷害性応答は観察されなかった。L-DOS47は、有望な治療剤として、非小細胞性肺がんのためのヒト第I相臨床研究において調査中である。
本開示は、上記の態様に関連して記載されているが、前述の説明及び実施例が本開示の範囲を説明することを意図しており、限定することは意図していないことを理解すべきである。本開示の範囲内の他の態様、利点、及び変更形態が、本開示が属する分野の通常の知識を有する者には明らかとなるであろう。
本開示は、本開示の個々の態様の個々の実例として意図されている記載された具体的な態様によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に等価であるいかなる組成物又は方法も、本件開示の範囲内である。本開示の方法及び組成物において、本開示の主旨又は範囲から離れることなく種々の改変及び変形を行うことができることが当業者には明らかであろう。このように、本件開示の改変及び変形が添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内である限りは、本開示が、それらにも及ぶことが意図される。
本明細書において言及された刊行物及び特許出願は全て、各個の刊行物又は特許出願が、具体的にかつ個別に引用により組み込まれていると示されているのと同じ程度に、本明細書に引用により組み込まれている。
参考文献
Figure 0006876618
Figure 0006876618
Figure 0006876618
Figure 0006876618
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない抗体-ウレアーゼコンジュゲートとを含む医薬組成物。
（構成２）
前記非コンジュゲートウレアーゼが、5％未満である、構成1記載の医薬組成物。
（構成３）
非水性HPLC溶媒を含まない、構成1記載の医薬組成物。
（構成４）
pHが、約6.8である、構成1記載の医薬組成物。
（構成５）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成６）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成5記載の医薬組成物。
（構成７）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成6記載の医薬組成物。
（構成８）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上の平均コンジュゲーション比率を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成９）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コンジュゲーション比率を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成１０）
前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、構成1記載の医薬組成物。
（構成１１）
前記抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、構成1〜10のいずれか1項記載の医薬組成物。
（構成１２）
前記抗体が、単一ドメイン抗体である、構成1〜11のいずれか1項記載の医薬組成物。
（構成１３）
前記抗体が、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成１４）
前記抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、構成1〜13のいずれか1項記載の医薬組成物。
（構成１５）
前記抗体が、K d 値が約1×10 -6 Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成1〜14のいずれか1項記載の医薬組成物。
（構成１６）
前記コンジュゲートが、K d 値が約1×10 -8 Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成15記載の医薬組成物。
（構成１７）
前記コンジュゲートが、K d 値が約1×10 -10 Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成16記載の医薬組成物。
（構成１８）
前記コンジュゲートが、IC 50 値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成1記載の医薬組成物。
（構成１９）
前記IC 50 値が、約3.22nMである、構成18記載の医薬組成物。
（構成２０）
前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC 50 値でCEACAM6に結合する、構成1記載の医薬組成物。
（構成２１）
前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、構成1記載の医薬組成物。
（構成２２）
前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも1つの改変を含むポリペプチドを含む、構成1記載の医薬組成物。
（構成２３）
対象におけるがんを治療する方法であって、該対象に、治療的有効量の構成1〜22のいずれか1項記載の組成物を投与することを含み、それにより、該対象におけるがんを治療する、前記方法。
（構成２４）
前記がんが、非小細胞性肺癌、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、又はそれらの組合せのうちの1つ以上である、構成23記載の方法。
（構成２５）
前記がんが、非小細胞性肺癌である、構成24記載の方法。
（構成２６）
前記対象が、ヒトである、構成24記載の方法。
（構成２７）
抗体-ウレアーゼコンジュゲート、及び該抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準で約5％を超えないウレアーゼを含む組成物を調製する方法であって、(1)活性化された抗体及びウレアーゼを、該活性化された抗体及び該ウレアーゼが実質的に反応しない溶媒中で混ぜ合わせて、反応混合物を形成させることであって、該溶媒中の活性化された該抗体及び該ウレアーゼの分布が一様である、前記形成させること、及び(2)該活性化された抗体が、該ウレアーゼと容易に反応して、該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成するように、前記(1)の混合物のpHを上昇させること、及び(3)任意に、精製工程によって該抗体-ウレアーゼコンジュゲートを精製すること、を含み、クロマトグラフィー精製工程を含まない、前記方法。
（構成２８）
前記精製工程が、ウルトラダイアフィルトレーションである、構成27記載の方法。
（構成２９）
前記抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8〜11個であるコンジュゲーション比率を有する、構成27記載の方法。
（構成３０）
工程(1)における前記溶媒が、酢酸ナトリウムバッファーなどの、約6.0〜7.0のpHを有する酸性の水性バッファーである、構成27記載の方法。
（構成３１）
工程(2)において前記pHを上昇させることが、該pHを約8〜9へと調整するホウ酸ナトリウム溶液などの塩基性バッファーの添加を含む、構成27記載の方法。
（構成３２）
前記組成物が、前記精製工程の前に、総タンパク質重量で約10〜20％の非コンジュゲート抗体を含む、構成27〜31のいずれか1項記載の方法。
（構成３３）
前記組成物が、前記精製工程の後に、総タンパク質重量で約1％未満の非コンジュゲート抗体を含む、構成27〜31のいずれか1項記載の方法。
（構成３４）
腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の該抗体分子を、1つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、抗体-ウレアーゼコンジュゲートを形成させることを含み、ここで、該コンジュゲートが、非コンジュゲート抗体よりも少なくとも約100倍高い該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法。
（構成３５）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成34記載の方法。
（構成３６）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約6個以上であるコンジュゲーション比率を有する、構成34記載の方法。
（構成３７）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する、構成36記載の方法。
（構成３８）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8、9、10、又は11個であるコンジュゲーション比率を有する、構成36記載の方法。
（構成３９）
前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が約8〜11個である平均コンジュゲーション比率を有する、構成34記載の方法。
（構成４０）
前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、構成34記載の方法。
（構成４１）
前記抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、構成34〜40のいずれか1項記載の方法。
（構成４２）
前記抗体が、単一ドメイン抗体である、構成34〜41のいずれか1項記載の方法。
（構成４３）
前記腫瘍抗原が、非小細胞性肺癌により発現されるものである、構成34記載の方法。
（構成４４）
前記抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、構成34〜43のいずれか1項記載の方法。
（構成４５）
前記抗体が、K d 値が約1×10 -6 Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、構成34〜44のいずれか1項記載の方法。
（構成４６）
前記コンジュゲートが、約1×10 -8 Mを超えないK d 値でCEACAM6に結合する、構成45記載の方法。
（構成４７）
前記コンジュゲートが、約1×10 -10 Mを超えないK d 値でCEACAM6に結合する、構成46記載の方法。
（構成４８）
前記コンジュゲートが、約5nMを超えないIC 50 値でCEACAM6に結合する、構成34〜47のいずれか1項記載の方法。
（構成４９）
前記IC 50 値が、約3.22nMである、構成48記載の方法。
（構成５０）
前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC 50 値でCEACAM6に結合する、構成34〜47のいずれか1項記載の方法。
（構成５１）
構成1〜22のいずれか1項記載の組成物、及び該組成物の使用のための説明書を含むキット。

Claims (39)

  1. 静脈内注射に適した医薬として許容し得る水性液剤と、単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートとを含む医薬組成物であって、該コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり単一ドメイン抗体部分が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有し、かつ非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まない、前記医薬組成物。
  2. 前記非コンジュゲートウレアーゼが、5重量％未満である、請求項1記載の医薬組成物。
  3. 非水性HPLC溶媒を含まない、請求項1記載の医薬組成物。
  4. pHが、約6.8である、請求項1記載の医薬組成物。
  5. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、単一ドメイン抗体部分が約6個以上のコンジュゲーション比率を有する、請求項1〜4のいずれか1項記載の医薬組成物。
  6. 前記コンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、単一ドメイン抗体部分が約8〜11個である平均コンジュゲーション比率を有する、請求項1〜4のいずれか1項記載の医薬組成物。
  7. 前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、請求項1〜6のいずれか1項記載の医薬組成物。
  8. 前記単一ドメイン抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、請求項1〜7のいずれか1項記載の医薬組成物。
  9. 前記単一ドメイン抗体が、非小細胞性肺癌により発現される腫瘍抗原に対する特異性を有する、請求項1〜8のいずれか1項記載の医薬組成物。
  10. 前記単一ドメイン抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、請求項1〜9のいずれか1項記載の医薬組成物。
  11. 前記単一ドメイン抗体が、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項1〜10のいずれか1項記載の医薬組成物。
  12. 前記コンジュゲートが、Kd値が約1×10-8Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項11記載の医薬組成物。
  13. 前記コンジュゲートが、Kd値が約1×10-10Mを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項11記載の医薬組成物。
  14. 前記コンジュゲートが、IC50値が約5nMを超えないCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項1〜13のいずれか1項記載の医薬組成物。
  15. 前記IC50値が、約3.22nMである、請求項14記載の医薬組成物。
  16. 前記コンジュゲートが、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する、請求項1〜15のいずれか1項記載の医薬組成物。
  17. 前記単一ドメイン抗体が、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項1〜16のいずれか1項記載の医薬組成物。
  18. 前記単一ドメイン抗体が、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも1つのアミノ酸の改変を含むポリペプチドを含み、該アミノ酸の改変が、前記ポリペプチドの機能的特性を維持するものである、請求項1〜17のいずれか1項記載の医薬組成物。
  19. 単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲート、及び該単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートの重量基準で約5重量％を超えない非コンジュゲートウレアーゼを含む組成物を調製する方法であって、
    (1)活性化された単一ドメイン抗体とウレアーゼとを、該活性化された単一ドメイン抗体及び該ウレアーゼが実質的に反応しない溶媒中で混ぜ合わせて、反応混合物を形成させる工程であって、ここで、該溶媒中の該活性化された単一ドメイン抗体及び該ウレアーゼの分布が一様である、前記工程、及び
    (2)該活性化された単一ドメイン抗体が該ウレアーゼと容易に反応して、該単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートであって、ウレアーゼ部分1個あたり3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個の単一ドメイン抗体部分を有する該コンジュゲートを形成するように、工程(1)の混合物のpHを上昇させる工程、及び
    (3)任意に、精製工程によって該単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートを精製する工程を含み、非コンジュゲートウレアーゼを実質的に含まず、クロマトグラフィー精製工程を含まない、前記方法。
  20. 前記精製工程が、ウルトラダイアフィルトレーションである、請求項19記載の方法。
  21. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、ウレアーゼ部分1個あたり、抗体部分が8〜11個であるコンジュゲーション比率を有する、請求項19又は20記載の方法。
  22. 工程(1)における前記溶媒が、酢酸ナトリウムバッファーなどの、約6.0〜7.0のpHを有する酸性の水性バッファーである、請求項19記載の方法。
  23. 工程(2)において前記pHを上昇させることが、該pHを約8〜9へと調整するホウ酸ナトリウム溶液などの塩基性バッファーの添加を含む、請求項19〜22のいずれか1項記載の方法。
  24. 前記組成物が、前記精製工程の前に、総タンパク質重量で約10〜20％の非コンジュゲート抗体を含む、請求項19〜23のいずれか1項記載の方法。
  25. 前記組成物が、前記精製工程の後に、総タンパク質重量で約1％未満の非コンジュゲート抗体を含む、請求項24項記載の方法。
  26. 腫瘍抗原に対する抗体結合親和性を上昇させる方法であって、複数の単一ドメイン抗体分子を1つのウレアーゼ分子にコンジュゲートさせて、単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートであって、ウレアーゼ分子1個あたり単一ドメイン抗体分子が3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12個であるコンジュゲーション比率を有する該コンジュゲートを形成させることを含み、ここで、該単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、非コンジュゲート抗体よりも少なくとも約100倍高い該腫瘍抗原に対する結合親和性を有する、前記方法。
  27. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、ウレアーゼ分子1個あたり、単一ドメイン抗体分子が約6個以上であるコンジュゲーション比率を有する、請求項26記載の方法。
  28. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、ウレアーゼ分子1個あたり、単一ドメイン抗体分子が約8〜11個である平均コンジュゲーション比率を有する、請求項26記載の方法。
  29. 前記ウレアーゼが、タチナタマメウレアーゼである、請求項26〜28のいずれか1項記載の方法。
  30. 前記単一ドメイン抗体が、ヒト化抗体又は非ヒト抗体である、請求項26〜29のいずれか1項記載の方法。
  31. 前記腫瘍抗原が、非小細胞性肺癌により発現されるものである、請求項26〜30のいずれか1項記載の方法。
  32. 前記単一ドメイン抗体が、CEACAM6に対する特異性を有する、請求項26〜31のいずれか1項記載の方法。
  33. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、Kd値が約1×10-6Mを超えるCEACAM6に対する結合親和性を有する、請求項26〜32のいずれか1項記載の方法。
  34. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、約1×10-8Mを超えないKd値でCEACAM6に結合する、請求項33記載の方法。
  35. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、約1×10-10Mを超えないKd値でCEACAM6に結合する、請求項34記載の方法。
  36. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、約5nMを超えないIC50値でCEACAM6に結合する、請求項26〜35のいずれか1項記載の方法。
  37. 前記IC50値が、約3.22nMである、請求項36記載の方法。
  38. 前記単一ドメイン抗体-ウレアーゼコンジュゲートが、約20μg/mLのIC50値でCEACAM6に結合する、請求項26〜37のいずれか1項記載の方法。
  39. 請求項1〜18のいずれか1項記載の組成物、及び該組成物の使用のための説明書を含むキット。
JP2017557508A 2015-01-23 2016-01-22 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート Active JP6876618B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562107210P 2015-01-23 2015-01-23
US62/107,210 2015-01-23
PCT/IB2016/050342 WO2016116907A1 (en) 2015-01-23 2016-01-22 Antibody-urease conjugates for therapeutic purposes

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020080945A Division JP2020143084A (ja) 2015-01-23 2020-05-01 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018506581A JP2018506581A (ja) 2018-03-08
JP6876618B2 true JP6876618B2 (ja) 2021-06-02

Family

ID=56416507

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017557508A Active JP6876618B2 (ja) 2015-01-23 2016-01-22 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
JP2020080945A Pending JP2020143084A (ja) 2015-01-23 2020-05-01 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020080945A Pending JP2020143084A (ja) 2015-01-23 2020-05-01 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート

Country Status (18)

Country Link
US (2) US11931422B2 (ja)
EP (1) EP3261678B8 (ja)
JP (2) JP6876618B2 (ja)
KR (1) KR102318994B1 (ja)
CN (2) CN107206103A (ja)
AU (1) AU2016210551B2 (ja)
BR (1) BR112017015582A2 (ja)
CA (1) CA2973538C (ja)
ES (1) ES2852001T3 (ja)
IL (1) IL253549B (ja)
MX (1) MX2017009537A (ja)
NZ (1) NZ733669A (ja)
PL (1) PL238187B1 (ja)
RU (1) RU2689689C2 (ja)
SG (1) SG11201705982PA (ja)
UA (1) UA121881C2 (ja)
WO (1) WO2016116907A1 (ja)
ZA (1) ZA201704709B (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2852001T3 (es) 2015-01-23 2021-09-10 Helix Biopharma Corp Conjugados de anticuerpo-ureasa para propósitos terapéuticos
US10640806B2 (en) 2016-09-24 2020-05-05 Helix Biopharma Corp. Restoring function of tumour acidified T cells
CA3049272A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-12 Helix Biopharma Corporation Anti-vegfr-2 urease conjugates
CA3049274A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-12 Helix Biopharma Corporation Vegfr-2 antibodies
JP6899560B2 (ja) * 2017-05-23 2021-07-07 株式会社島津製作所 質量分析データ解析装置及び質量分析データ解析用プログラム
US20210221908A1 (en) 2018-06-03 2021-07-22 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
KR102260478B1 (ko) 2019-08-19 2021-06-02 연세대학교 산학협력단 일나트륨 요소화물 결정 용해용 조성물
WO2021053587A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Klaus Strein Bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2965725D1 (en) 1978-07-19 1983-07-28 Patrick Couvreur Biodegradable nanoparticles, pharmaceutical compositions containing them and process for their preparation
US4489055A (en) 1978-07-19 1984-12-18 N.V. Sopar S.A. Process for preparing biodegradable submicroscopic particles containing a biologically active substance and their use
FR2504408B1 (fr) 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2523445A1 (fr) * 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
US4867962A (en) 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
FR2637612B1 (fr) 1988-10-06 1993-09-10 Pasteur Institut Sequences de nucleotides codant pour une proteine a activite ureasique
ZA912490B (en) 1990-04-19 1992-12-30 Res Dev Foundation Antibody conjugates for treatment of neoplastic disease
US5298399A (en) 1990-08-10 1994-03-29 Sapporo Breweries Limited Gene and process for producing a thermostable urease
FR2683159B1 (fr) 1991-10-31 1994-02-25 Coletica Procede de fabrication de nanocapsules a paroi a base de proteines reticulees; nanocapsules ainsi obtenues et compositions cosmetiques, pharmaceutiques et alimentaires en comportant application.
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
GB9300875D0 (en) 1993-01-18 1993-03-10 Ucb Sa Nanocapsule containing pharmaceutical compositions
DE69411154T2 (de) 1993-02-22 1998-10-22 Alza Corp., Palo Alto, Calif. Mittel zur oralen gabe von wirkstoffen
WO1995014093A1 (en) 1993-05-19 1995-05-26 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
CA2130072C (en) * 1994-08-12 2003-02-18 John W. Cherwonogrodzky Method of detecting a pathogen using a virus
AU7468196A (en) * 1995-10-27 1997-05-15 Merck & Co., Inc. Conjugates of gonadotropin releasing hormone
EP0824019B1 (en) * 1996-08-13 2002-11-20 Quest International B.V. Inhibition or reduction of oral malodour
EP0932390A1 (en) 1996-10-11 1999-08-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method
US6261537B1 (en) 1996-10-28 2001-07-17 Nycomed Imaging As Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors
US6180114B1 (en) 1996-11-21 2001-01-30 University Of Washington Therapeutic delivery using compounds self-assembled into high axial ratio microstructures
FR2790405B1 (fr) 1999-03-02 2001-04-20 Oreal Nanocapsules a base de polymeres dendritiques
AU4305101A (en) 1999-11-22 2001-06-04 Research Foundation Of The State University Of New York, The Magnetic nanoparticles for selective therapy
KR101352826B1 (ko) * 2002-07-18 2014-01-17 헬릭스 바이오파마 코포레이션 암세포 성장의 저해를 위한 우레아제의 사용
EP1694845B8 (en) * 2003-11-28 2017-12-20 National Research Council of Canada Anticarcinoma antibodies and uses thereof
US20070292354A1 (en) 2004-09-23 2007-12-20 Guerbet Contrast Agents Encapsulating Systems for Cest Imaging
EP2338999A3 (en) 2005-03-25 2012-05-23 National Research Council Of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
WO2009079793A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 National Research Council Of Canada Non-aggregating human vh domains
CN102428101B (zh) 2009-03-18 2016-03-02 Ac免疫有限公司 用于治疗用途的方法
AU2011331208B2 (en) 2010-11-16 2016-12-01 Octapharma Ag A process for reduction and/or removal of FXI and FXIa from solutions containing said coagulation factors
SG194472A1 (en) 2011-01-28 2013-12-30 Ca Nat Research Council Engineering of immunoglobulin domains
WO2013185215A1 (en) * 2012-06-12 2013-12-19 Amorfix Life Sciences Ltd. Antibodies and conjugates that target misfolded prion protein
JP2016524459A (ja) * 2013-04-08 2016-08-18 へリックス バイオファーマ コーポレイション 診断および治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲートの使用
ES2852001T3 (es) 2015-01-23 2021-09-10 Helix Biopharma Corp Conjugados de anticuerpo-ureasa para propósitos terapéuticos

Also Published As

Publication number Publication date
ES2852001T3 (es) 2021-09-10
CA2973538C (en) 2021-01-12
IL253549A (en) 2019-08-29
CN107206103A (zh) 2017-09-26
RU2689689C2 (ru) 2019-05-28
IL253549B (en) 2021-07-29
US11931422B2 (en) 2024-03-19
PL423259A1 (pl) 2018-03-26
US20240277863A1 (en) 2024-08-22
JP2020143084A (ja) 2020-09-10
WO2016116907A1 (en) 2016-07-28
ZA201704709B (en) 2019-11-27
EP3261678A1 (en) 2018-01-03
NZ733669A (en) 2019-03-29
AU2016210551B2 (en) 2019-03-07
CN118873680A (zh) 2024-11-01
JP2018506581A (ja) 2018-03-08
EP3261678B8 (en) 2021-03-17
UA121881C2 (uk) 2020-08-10
SG11201705982PA (en) 2017-08-30
MX2017009537A (es) 2018-04-10
RU2017129729A (ru) 2019-02-25
BR112017015582A2 (pt) 2018-03-13
US20180000963A1 (en) 2018-01-04
CA2973538A1 (en) 2016-07-28
KR20170131365A (ko) 2017-11-29
PL238187B1 (pl) 2021-07-19
KR102318994B1 (ko) 2021-10-29
EP3261678B1 (en) 2020-11-11
AU2016210551A1 (en) 2017-07-27
RU2017129729A3 (ja) 2019-02-25
EP3261678A4 (en) 2018-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6876618B2 (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
US11911434B2 (en) Stable antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and use thereof
KR102451080B1 (ko) 효소적 방법을 통한 균일한 항체 약물 접합체
US20170281787A1 (en) Conjugates including an antibody moiety, a polypeptide that traverses the blood-brain barrier, and a cytotoxin
CA2967077A1 (en) Conjugates including an antibody moiety, a polypeptide that traverses the blood-brain barrier, and a cytotoxin
US20210061916A1 (en) Anti-prlr antibody-drug conjugates (adc) and uses thereof
CN108066772A (zh) 靶向tacstd2的抗体与药物偶联体(adc)分子
Jin et al. An anti-EGFR× cotinine bispecific antibody complexed with cotinine-conjugated duocarmycin inhibits growth of EGFR-positive cancer cells with KRAS mutations
JP2024056808A (ja) 胆道癌の治療のための、ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合構築物の使用方法
WO2017216620A1 (en) Human fibroblast growth factor 2 (fgf2) - cytotoxic drug conjugates for targeted therapy of fgfr-related cancers
Tekewe et al. Proteins and peptides as targeting carriers in anticancer drug delivery: a review
CN115811990A (zh) 新型核仁素结合肽及其应用
CN113842467A (zh) 用于抗体与药物偶联体（adc）制备的中间体及其制备方法和应用
US12076400B2 (en) Methods of using a bispecific antigen-binding construct targeting HER2 in combination with CDK4/6 inhibitors for the treatment of breast cancer
RU2819802C2 (ru) Способы применения биспецифической антигенсвязывающей конструкции, нацеленной на her2, для лечения онкологического заболевания желчных протоков

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170919

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170919

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180515

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20180727

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181114

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190416

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200107

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20200501

C116 Written invitation by the chief administrative judge to file amendments

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C116

Effective date: 20200526

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20200526

C22 Notice of designation (change) of administrative judge

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22

Effective date: 20210119

C23 Notice of termination of proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23

Effective date: 20210302

C03 Trial/appeal decision taken

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03

Effective date: 20210330

C30A Notification sent

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012

Effective date: 20210330

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210426

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6876618

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250