JP6869255B2 - 凍結医薬製剤およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、インターフェロンベータ−１ａの凍結乾燥医薬製剤およびその製剤の使用に関する。

インターフェロンベータ−１ａは、内皮のバリア機能を増強し、ＡＲＤＳの主な病理学的事象である脈管（vascular）漏出の予防をもたらす抗炎症性アデノシンを産生する分子であるＣＤ７３をアップレギュレートする能力を有するインターフェロンベータ１アゴニストである。ＡＲＤＳにおける脈管漏出は、生命に関わる恐れのある低酸素血症の原因となる肺胞腔への血漿滲出をゆるす。インターフェロンベータ−１ａは、脈管漏出を減少させることによりＡＲＤＳの影響を低減させる可能性を有するが、この例に限定されるものではない。

すべてのタンパク質医薬と同様に、治療剤としてインターフェロンベータ（ＩＦＮ−ベータ）の使用における克服しなければならない１つの主な障害は、医薬製剤中でのその不安定性に起因し得る薬剤有用性の損失である。医薬製剤におけるポリペプチド活性と有効性とを脅かす物理的不安定性は、変性および不溶性の凝集体の形成などであり、一方、化学的不安定性は、例えば、加水分解、酸化および脱アミド化などである。これらの変化のいくつかは、目的のタンパク質の薬剤生物活性の損失または減少を導くことが知られている。少量のホルモンペプチドが投与される場合には、患者が正しい投薬を受けることが保障されるということも重要である。ＩＦＮ−ベータは親油性アミノ酸残基含量が高いため、容器表面に吸着し、凝集体を形成し、結果として活性な医薬成分が失われる。

特にＡＲＤＳの治療に使用するための製剤に対するもう１つの要件は、製剤が緊急時に利用可能でなければならないことである。結論としては、長期の保存可能期間を有し、かつそれらの薬剤有用性を保護し、そして特に凍結乾燥される場合、投薬の注意深い制御と投与中の使用安定性を必要とする、ＩＦＮ−ベータ１ａを含む安定な凍結乾燥医薬製剤が求められている。この要件は、患者が薬物に曝されるとすぐに、静脈内に投与される化合物に必要である。

本発明の目的は、インターフェロンベータ−１ａを含む凍結乾燥形態の安定な医薬製剤を提供することである。

特に、インターフェロンベータ−１ａを含む凍結乾燥形態の医薬製剤であって、再構成後にインターフェロンベータ−１ａの良好な回復が可能な医薬製剤を提供することが本発明の目的である。

本発明のさらなる目的は、静脈内投与によりヒトにおける脈管−内皮疾患を予防および治療するための医薬製剤を提供することである。特に、本発明の目的は、この症状に限定されるものではないが、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の患者における脈管漏出を予防するための処置として使用するための医薬製剤を提供することである。

とりわけ、上述の目的を達成するために、本発明は、同封の独立請求項に示すものにより特徴付けられる。

本発明の典型的な医薬製剤は、凍結乾燥形態で、インターフェロンベータ−１ａを活性成分として単一投与形態に２．０〜１５μｇと、バルク剤としての二糖類と、非イオン性界面活性剤とを含む。

本発明によれば、インターフェロンベータ−１ａは、患者への送達のために薬理学的に有効で正確な量のインターフェロンベータ−１ａを有する水溶液を与えるように再構成できる凍結乾燥物として製剤化される。したがって、本発明は、凍結乾燥製剤を再構成することにより得られる水性医薬組成物も提供する。

薬理学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａを有する本発明の水性組成物は、特に静脈内投与に適している。

本発明はさらに、本発明の水性医薬組成物を含む送達デバイスに関する。

本発明はさらに、本発明の水性医薬組成物を含むプレフィルドシリンジに関する。

本発明はさらに、ヒトの脈管内皮疾患の予防および／または治療における使用のための本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物に関する。

より具体的には、本発明は、ヒトの脈管内皮疾患の予防および／または治療における静脈内投与での使用のための本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物であって、インターフェロンベータ−１ａが患者に２．０〜１５μｇ／用量で投与される凍結乾燥製剤または水性医薬組成物に関する。

本発明はさらに、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および他の外傷性症状における脈管漏出の予防における使用のための本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物に関する。

本発明はさらに、脈管または心臓の手術および臓器移植における虚血−再灌流傷害の予防および／または治療における使用のため、または主要な脈管または心臓の手術および臓器移植に先立つ虚血プレコンディショニングにおける使用のための本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物に関する。

本発明はさらに、急性膵炎および急性腎傷害の予防および／または治療における使用のための本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物に関する。

本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、ＥＢＯＬＡ、ＭＥＲＳ、鳥インフルエンザなどのインフルエンザなどの深刻な生命を脅かすウイルス感染、および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）や中心器官の機能不全などの原因となる他の同様の症状における使用にも好適である。

本発明はさらに、ＭＯＦの予防および／または治療における使用のための本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物に関する。さらに、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および多臓器不全（ＭＯＦ）の原因となる重篤な細菌性肺炎および敗血症における使用にも適している。

再構成されたＩＮＦ−ベータ１ａ凍結乾燥物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。実験の部の製剤試験Ａ参照。 再構成されたＩＮＦ−ベータ１ａ凍結乾燥物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。実験の部の製剤試験Ａ参照。 再構成されたＩＮＦ−ベータ１ａ凍結乾燥物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。実験の部の製剤試験Ａ参照。 再構成されたＩＮＦ−ベータ１ａ凍結乾燥物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。実験の部の製剤試験Ａ参照。 凍結乾燥物の再構成後のＩＮＦ−ベータ１ａの定量化を示す。実験の部の製剤試験Ａ参照。 製剤試験Ａの安定性試験中の４０℃での保管期間中の酸化されたＩＮＦ−ベータ１ａ種の増加を表す親水性ピークの相対ピーク面積の経過を示す。 ４０℃での保管期間中のタンパク質折り畳み構造の変化を意味するＩＮＦ−ベータ１ａ種の増加を表す疎水性ピークの相対ピーク面積の経過を示す。実験の部の製剤試験Ａ参照。 ４０℃で１２週間保管した後の製剤の再構成した凍結乾燥物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。製剤試験Ａを参照。 ４０℃で１２週間保管した後の製剤の再構成した凍結乾燥物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。製剤試験Ａを参照。 種々の材料の表面への吸着によるＩＮＦ−ベータ１ａの損失を示す。製剤試験Ａの最終部を参照。 １つのバイアルから他のバイアルへの試料移動のあいだのＩＮＦ−ベータ１ａの回復を示す。製剤試験Ｂ参照。 栓を繰り返し接触させた後のＩＮＦ−ベータの回復を示す。製剤試験Ｂ参照。 凍結乾燥試験の凍結−トライアルのデジタルデータ取得を示す。 凍結乾燥物の縦断面図を示す。凍結乾燥試験参照。 凍結乾燥物の端側からの透過光画像を示す。凍結乾燥試験参照。 安定性試験の結果の編集を示す。 安定性試験の結果の編集を示す。 安定性試験の結果の編集を示す。 安定性試験の結果の編集を示す。 安定性試験の結果の編集を示す。 生物学的効率試験のＭｘＡ濃度グラフを示す。

用語および定義
この出願において、用語「インターフェロンベータ−１ａ」、「ＩＮＦ−ベータ１ａ」および「ＩＮＦ−β１ａ」は、言い換え可能であり、それらは互いに同義語として使用される。

表現「薬学的に有効な量」は、所望の治療結果をもたらすのに十分であるインターフェロンベータ−１ａの任意の量を含めることを意味する。

用語「治療」または「治療すること」は、疾患の完全な治癒ならびにその疾患の緩和または軽減を含むということが理解されるべきである。

用語「予防」は、完全な予防、予防（prophylaxis）ならびにその疾患または障害に罹患する個体のリスクの低下を含むということが理解されるべきである。

用語「患者」または「個体」は、ヒトを意味する。

本発明の医薬製剤に関して用語「凍結乾燥する」は、製剤の水溶液の凍結乾燥を意味するものとする。用語「凍結乾燥物」は、凍結乾燥製品を意味する。用語「再構成」は、水溶液を実現するための凍結乾燥物の溶解を意味する。

用語「静脈内」または「ＩＶ」投与は、血管またはリンパ管内での投与を意味する。

本発明の実施形態
本発明は、安定性を増加させ、再構成後にインターフェロンベータ−１ａが実質的に完全に回復するインターフェロンベータ−１ａ医薬製剤に関する。本発明の凍結乾燥形態の医薬製剤は、活性成分として少なくとも薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａと、バルク剤としての二糖類または複数の二糖類と、非イオン性界面活性剤とを含む。

バルク剤としての複数の二糖類と、ポリソルベートまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤との組み合わせが、凍結乾燥および再構成後にインターフェロンベータ−１ａの実質的に完全な回復のために、および保管中に凍結乾燥状態で分解に対するインターフェロンベータ−１ａの安定性のために必要であるということが観察されている。本発明の凍結乾燥製剤は、２〜８℃で少なくとも２４ヵ月、好ましくは３０ヵ月、より好ましくは３６ヵ月の期間でさえ、安定である。また、凍結乾燥製剤のインターフェロンベータ−１ａは、室温（２５〜３０℃±２℃）で保管した場合でさえ、その活性を維持しているということも観察されている。結論として、本発明の凍結乾燥製剤は、室温で少なくとも６ヵ月、好ましくは少なくとも１２ヵ月、そしてより好ましくは２４ヵ月の保管安定性を有する。

ポリソルベートまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤は、表面吸着を防ぐため、またタンパク質凝集に対する安定剤として使用される。界面活性剤は、特に、凍結乾燥および再構成のあいだのＩＮＦ−ベータ１ａの損失を防ぐために必要とされる。凍結乾燥および再構成後のＩＮＦ−ベータ１ａの実質的に完全な回復は、界面活性剤としてポリソルベートまたはＰＥＧを用いることにより得ることができる。凍結乾燥物の再構成後、インターフェロンベータ−１ａ含量の回復は、８５％超、好ましくは９０％超、そしてより好ましくはまさに９５％であり得る。再構成後の実質的に完全な回復は、患者に投与されるインターフェロンベータ−１ａの単回静脈内用量が小さいため重要であり、したがって、患者が正しい投薬を受けることを保証されるということが重要である。

本発明の一つの実施形態によれば、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートまたはＰＥＧである。本発明の一つの好ましい実施形態によれば、界面活性剤はポリソルベートである。ポリソルベートは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０または任意の他のポリソルベートであってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、ポリソルベートは、Ｔｗｅｅｎ２０とも呼ばれるポリソルベート２０であってもよい。本発明の一つの実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、バイアル当たり、凍結乾燥製剤の総重量に対して０．９〜２重量％、好ましくは１〜１．５重量％、より好ましくは１．１〜１．３重量％の、ポリソルベートまたはＰＥＧ等の界面活性剤を含む。

製剤の成分の量は、本出願において１バイアル（単一バイアルは、凍結乾燥形態の本発明の医薬製剤の単回用量を含む）当たりで示される。

本発明の好ましい実施形態においては、二糖類は、トレハロース、スクロースおよびそれらの組み合わせから選択される。トレハロース・二水和物またはスクロースは、製剤に嵩を与えるため、また凍結乾燥状態での保管中の分解に対するＩＮＦ−ベータ１ａの安定化のために最も適切なバルク剤であるということが観察されている。一つの好ましい実施形態によれば、トレハロース・二水和物がバルク剤として使用される。本発明の一つの実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、バイアル当たり、凍結乾燥製剤の総重量に対して５０〜８０重量％、好ましくは６０〜７５重量％、およびより好ましくは６３〜６７重量％の二糖類を含む。

本発明の一つの好ましい実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、活性成分として薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａと、バルク剤として二糖類と、非イオン性界面活性剤と、凍結乾燥物の再構成後のｐＨを約５．５〜７．５に維持するための緩衝剤と、好ましくは抗酸化剤とを含む。

本発明の一つの実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、さらに、凍結乾燥物の再構成後のｐＨを約５．５〜７．５、好ましくは約６．０〜７．０、そしてより好ましくは約６．３〜６．７に維持するための好適な緩衝剤を含む。本発明の製剤の緩衝剤は、リン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物、クエン酸三ナトリウム・二水和物またはそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。製剤における緩衝剤は、目標ｐＨに基いて選択され得、個々の薬剤の組み合わせと比率は変えることができる。

本発明の一つの実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、さらに抗酸化剤を含む。本発明の一つの好ましい実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、製剤を酸化から保護するための抗酸化剤としてメチオニンを含む。メチオニンは、ＤＬ−メチオニンまたはＬ−メチオニンであり得る。本発明の一つの実施形態によれば、メチオニンは、すでにインターフェロンベータ−１ａ製剤原料に含まれていてもよい。

本発明の一つの実施形態によれば、凍結乾燥形態の医薬製剤は、
−活性成分として、少なくとも薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａと
−０．５〜１．０ｍｇ／バイアル、好ましくは０．６〜０．８ｍｇ／バイアルの、ポリソルベートまたはＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤と、
−３０〜５０ｍｇ／バイアル、好ましくは３５〜４０ｍｇ／バイアルのトレハロース・二水和物またはスクロースと、
−１５〜２８ｍｇ／バイアル、好ましくは１８〜２２ｍｇ／バイアルの緩衝剤の組み合わせと、
−０．１〜０．３ｍｇ／バイアル、好ましくは０．１７〜０．２３ｍｇ／バイアルの抗酸化剤と
を含む。

本発明の製剤は、薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａを含む。インターフェロンベータ−１ａは、好ましくは組換えヒトインターフェロンベータ−１ａである。組換えで産生されたＩＦＮ−ベータ１ａは、成熟した天然のＩＦＮ−ベータ１ａと同等な生物活性を有し、かつ組換えＤＮＡ技術により製造されるＩＦＮ−ベータ１ａを意図する。本発明の一つの実施形態によれば、インターフェロンベータ−１ａ製剤原料は不溶性凝集物を含んでいてもよく、その製剤原料は、製剤を配合する前にこれらの既存の不溶性凝集物を除去するために精製される。本発明の一つの好ましい実施形態によれば、９５〜１００％のＩＦＮ−ベータ１ａは、インターフェロンベータ−１ａの生物活性と再構成中の良好な溶解性を提供するため単量体の形態であろう。インターフェロンベータ−１ａの生物活性（効力）は、１５０ＭＩＵ／ｍｇ（ＭＩＵ＝１００万国際単位）より高いべきである。本発明の一つの実施形態によれば、本発明の製剤は、活性成分として、少なくとも１５０ＭＩＵ／ｍｇの生物活性を有するインターフェロンベータ−１ａを、単一静脈内投与形態に２．０〜１５μｇの量で含む。

本発明に包含される製剤において、単一静脈内投与形態におけるインターフェロンベータ−１ａの量は、好ましくは約２．０μｇと１５μｇとの間で変化する。１５〜２０μｇまたは２５μｇまでなど、単一の静脈内投与形態において１５μｇより多くのインターフェロンベータ−１ａの量を患者に投与することもできるが、副作用の目立った増加が観察される。単一の静脈内投与形態における２．０より少ないインターフェロンベータ−１ａの量は、何らかの観察可能な効果を与えるのに充分ではない。本発明の一つの実施形態によれば、単一の静脈内投与形態におけるインターフェロンベータ−１ａの量は、約１０μｇである。インターフェロンベータ−１ａの生物活性は、したがって、通常１．５〜３．４ＭＩＵ／１０μｇ投与形態の範囲にある。

本発明の凍結乾燥製剤の残留水分含量は、凍結乾燥製剤の保管安定性を促進するために５重量％以下とすることができる。一つの実施形態によれば、残留水分含量は、約１〜５重量％、好ましくは約１〜４重量％の範囲である。タンパク質を変性することなく遊離残留水の含有量を要求される限度内にするために、凍結乾燥サイクルを最適化すべきである。本発明の一つの実施形態によれば、実験の部に示されているように、約３０〜３５時間、好ましくは約３１時間の凍結乾燥サイクルが本発明の製剤のために最適であることが観測されている。

本発明の一つの実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、
−活性成分としてのインターフェロンベータ−１ａと、
−バルク剤としてのトレハロース・二水和物またはスクロースと、
−緩衝剤としてのリン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物、クエン酸三ナトリウム・二水和物またはそれらの組み合わせと、
−界面活性剤としてのポリソルベートまたはポリエチレングリコールと、
−抗酸化剤としてのメチオニンと
を含む。

より具体的には、一つの好ましい実施形態の凍結乾燥製剤は、
−活性成分としてのインターフェロンベータ−１ａ、好ましくは組換えヒトインターフェロンベータ−１ａと、
−バルク剤としてのトレハロース・二水和物と、
−緩衝剤としてのリン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物およびクエン酸三ナトリウム・二水和物の組み合わせと、
−界面活性剤としてのポリソルベート２０と、
−抗酸化剤としてのメチオニンと
を含む。

典型的には、本発明の凍結乾燥製剤は、５．５〜７．５のｐＨを有し、活性成分として薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａと、バルク剤として二糖類と、非イオン性界面活性剤とを含む水溶液から製造される。本発明の好ましい実施形態において、本発明の凍結乾燥製剤は、５．５〜７．５、好ましくは６．０〜７．０のｐＨを有し、かつ
−活性成分として、薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａ、好ましくは組換えヒトインターフェロンベータ−１ａと、
−バルク剤として、トレハロース・二水和物またはスクロースと、
−界面活性剤として、ポリソルベートまたはＰＥＧと、
−緩衝剤として、リン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物、クエン酸三ナトリウム・二水和物、およびそれらの組み合わせと、
−抗酸化剤としてメチオニンと
を含む水溶液から製造される。

本発明の一つの実施形態によれば、本発明の凍結乾燥製剤は、０．０５〜０．１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベートまたはポリエチレングリコール、好ましくはポリソルベート、および２〜６％（ｗ／ｖ）のトレハロース・二水和物またはスクロースを含む水溶液から製造される。本発明の一つの好ましい実施形態によれば、凍結乾燥製剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベートまたはＰＥＧ、好ましくはポリソルベートおよび約５％（ｗ／ｖ）のトレハロース・二水和物を含む水溶液から製造される。

本発明の凍結乾燥物を製造する方法は、少なくとも活性成分としてのインターフェロンベータ−１ａと、バルク剤としての二糖類と、ポリソルベートまたはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤と含む水溶液を製造する工程、ならびにその水溶液を凍結乾燥する工程を含む。上記凍結乾燥を行う凍結乾燥装置は、商業的に入手可能であり、当業者により容易に操作可能である。凍結乾燥プロセスは、通常、実験の部においてより詳細に説明されているように、凍結、一次乾燥および二次乾燥の三工程を含む。典型的には、水溶液は、バイアル中で凍結乾燥され、各バイアルは、本発明のインターフェロンベータ−１ａ製剤の単位用量を含む。結果として、バイアル内の凍結乾燥物は、本発明の単一投与形態である。本発明の製剤は、凍結乾燥中に可溶性凝集体の形成をもたらす。

凍結乾燥製剤を含むバイアルなどの容器は、好ましくは殺菌可能かつ不活性な材料で作られる。適切な材料は、例えば、ポリプロピレン、環状オレフィン共重合体、標準ガラスｔｙｐｅＩおよびシリコーン処理されたガラスｔｙｐｅＩである。好ましくは、シリコーン処理されたガラスｔｙｐｅＩバイアルが、インターフェロンベータ−１ａの初期の損失を回避するための包装材として使用される。ＩＮＦ−ベータ１ａの吸着は、ガラス表面の内表面のシリコーン処理により防ぐことができる。本発明の好ましい実施形態によれば、バイアルなどの容器の内表面は、凍結−乾燥後のＩＮＦ−ベータ１ａの初期の損失を回避するためにシリコーン処理される。界面活性剤としてのポリソルベートの使用は、シリコーン処理されたガラス表面上への吸着からタンパク質を保護するためにも使用することができる。

凍結乾燥物は、患者に投与される前、水性再構成剤で再構成されるべきである。この工程により、凍結乾燥物中のインターフェロンベータ−１ａおよびその他の成分は再溶解され、患者への静脈内注射に好適な水性医薬組成物を与える。典型的には、注射用水が凍結乾燥物を再構成するために使用される。典型的には、再構成された水性組成物の容量は、０．９〜１．１ｍＬのあいだ、好ましくは１ｍＬである。

インターフェロンベータ−１ａは、再構成された水性組成物において、２μｇ/ｍＬ〜１５μｇ／ｍＬの濃度で存在する。本発明の一つの実施形態の再構成された水性組成物は、さらに
−界面活性剤として、０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．６〜０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベートまたはＰＥＧ、
−バルク剤として、３０〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは３５〜４０ｍｇ／ｍＬのトレハロースまたはスクロースと、
−１５〜２８ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１８〜２２ｍｇ／ｍＬの緩衝剤の組み合わせであり、リン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物およびクエン酸三ナトリウム・二水和物を含む組み合わせと、
−抗酸化剤として、０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１７〜０．２３ｍｇ／ｍＬのメチオニンと
を含み、該水性組成物のｐＨは、５．５と７．５の間、好ましくは６．０と７．０の間である。

インターフェロンベータ−１ａ製剤がヒトに送達されるために使用される場合、水性溶液の等張性も検討される。したがって、本発明の一つの実施形態において、静脈内投与用の水性溶液は、患者の血清または体液の等張性と同じまたは同様の等張性を与えるであろう。再構成された水性組成物のオスモル濃度は、２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの範囲であってもよい。

本発明の水性医薬組成物は患者に投与することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、水性医薬組成物は静脈内投与に好適である。通常、投与はシリンジによるであろう。したがって、本発明はまた、本発明の水性医薬組成物を含む送達デバイスまたはプレフィルドシリンジを提供する。本発明の好ましい実施形態によれば、送達デバイスまたはプレフィルドシリンジの内表面は、送達デバイスまたはプレフィルドシリンジの表面へのＩＦＮ−ベータ１ａの吸着を防ぐためにシリコーン処理がなされ、それにより、本発明は、患者に静脈内で投与される際にインターフェロンベータ−１ａの正確な用量を提供する。好適な材料は、バイアルの材料として先に記載したものと同じである。典型的には、凍結乾燥物は１ｍＬシリンジを用いて再構成された。患者へのインターフェロンベータ−１ａの正確な投薬量は、本発明の製剤とシリコーン処理された送達デバイスまたはシリンジとの組み合わせを用いることにより達成することができる。再構成および患者への送達のあいだのインターフェロンベータ−１ａの観察される損失は、たった約１μｇ／用量、好ましくは１μｇ／用量未満である。それゆえ、本発明は、インターフェロンベータ−１ａの損失が多くとも１μｇ／用量であるようなインターフェロンベータ−１ａの患者への投与方法を提供する。

患者は、主な活性成分としてインターフェロンベータ−１ａの有効量、すなわち問題とする疾患または障害を治療、改善、または予防するのに十分な量を受けるであろう。任意の特定の対象のためのインターフェロンベータ−１ａの最適有効量および濃度は、患者の年齢、サイズ、健康および／または性別、症状の性質および程度等の種々の因子に依存し、またインターフェロンベータ−１ａと併用で投与される任意の可能なさらなる治療にも依存するであろう。与えられた状況に対して送達される有効量は、臨床医の判断において決定され得る。本発明の目的のため、インターフェロンベータ−１ａは、脈管内皮疾患の予防および／または治療における使用のため、静脈内投与により２〜１５μｇ／用量で患者に投与され得る。本発明の実施形態によれば、インターフェロンベータ−１ａは、静脈内投与により、成人患者における脈管内皮疾患の予防および／または治療における使用のために、例えば、７．５〜１２．５μｇ／用量で患者に投与され得る。本発明の別の実施形態によれば、インターフェロンベータ−１ａは、例えば、患者が子供の場合、静脈内投与により患者における脈管内皮疾患の予防および／または治療における使用のために２．０〜１２．５μｇ／用量で投与され得る。それゆえ、本発明はまた、患者に本発明の水性医薬組成物を投与する工程を含む、薬学的に有効な量のインターフェロンベータ−１ａを患者に送達する方法に関する。本発明はまた、正確な用量での患者へのインターフェロンベータの投与における送達デバイスまたはプレフィルドシリンジの使用に関する。

本発明の製剤は、ヒトにおける種々の脈管内皮疾患を治療するために使用することができる。ＣＤ７３、すなわち、局部的なアデノシンを産生することができる内皮外酵素は、内皮バリアおよび肺機能を維持するための重要な分子である。インターフェロン−ベータはＣＤ７３発現を増加させ、結果、局部的なアデノシンを増加させる。多くの炎症性症状が、炎症／傷害内皮細胞の表面からのＤ７３の損失をもたらし、それにより利用可能なアデノシン含量を減少させることが知られている。アデノシンの抗炎症特性は、文献において周知であり、局部的なアデノシン作用の損失に起因することが知られている症状はいずれも、ＣＤ７３発現のアップレギュレーションから恩恵を受けるであろう。恒久的な支援が必要とされる場合、ＣＤ７３のアップレギュレーションはデノボ合成に基づくべきである。

結論として、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、ヒトにおける脈管内皮疾患の予防および／または治療における使用のために好適である。より具体的には、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、インターフェロンベータ−１ａを２．０〜１５μｇ／用量で患者に投与する、静脈内投与による患者における脈管内皮疾患の予防および／または治療における使用のために好適である。本発明の実施形態によれば、インターフェロンベータ−１ａは、７．５〜１２．５μｇ／用量または２．０〜１２．５μｇ／用量で患者に投与される。

本発明の実施形態によれば、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および他の外傷性症状における脈管漏出の予防および／または治療における使用に好適である。

本発明の別の実施形態によれば、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、脈管または心臓の手術および臓器移植における虚血−再灌流傷害の予防および／または治療における使用、または主要な脈管または心臓の手術および臓器移植前の虚血プレコンディショニングにおける使用に好適である。加えて、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、心筋梗塞および脳卒中における虚血−再灌流傷害の予防および／または治療における使用に好適である。

本発明の別の実施形態によれば、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、急性膵炎または急性腎傷害の予防および／または治療における使用に好適であるが、これらの例に限定されるものではない。

本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、ＥＢＯＬＡ、ＭＥＲＳ、鳥インフルエンザなどのインフルエンザなどの深刻な生命を脅かすウイルス感染、および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）や中心器官の機能不全などの原因となる他の同様の症状における使用にも好適である。

さらに、本発明の凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）および多臓器不全（ＭＯＦ）の原因となる重篤な細菌性肺炎および敗血症における使用にも適している。本発明の実施形態によれば、凍結乾燥製剤または水性医薬組成物は、ＭＯＦの予防および／または治療において使用される。

患者を治療する方法は、少なくとも以下の工程
−本発明の凍結乾燥製剤を提供する工程、
−その凍結乾燥製剤を再構成する工程、および
−再構成された水性組成物を患者に投与する工程
を含む。

本明細書において説明される患者を治療する方法の実施形態の一つにおいて、患者は、脈管内皮疾患または本出願において説明される他の症状を患う。ＩＮＦ−ベータ１ａの投与は、疾患の診断後、可能な限り早く開始されるべきであり、所望の用量の投与を毎日、最少６日間継続すべきである。本発明の実施形態によれば、インターフェロンベータ−１ａを２．０〜１５μｇの量含む少なくとも一用量が患者に毎日投与され、そして投与は少なくとも６日間続けられるべきである。

以下の実施例は、説明のために供されるものであり、制限のためのものではない。

実験の部
本発明は、以下の実験においてより詳細に説明される。本出願の実験の部は、種々の部に分けられる。第一部、「製剤試験Ａ」は、ＩＮＦ−ベータ１ａの安定性に関し種々の賦形剤を比較することに焦点を当てている。安定性試験は、凍結乾燥状態において、４０℃で４週間、ＩＮＦ−ベータ１ａの安定性を保証するために、凍結乾燥溶液（lyo solution）の組成を検討する。第二部、「製剤試験Ｂ」は製剤試験Ａの結果に基づき、選択された製剤が、賦形剤の有効比率を決定するためのさらなる研究に用いられた。第三部、「凍結乾燥試験」は、本発明の製剤に適した凍結乾燥サイクルに焦点を当てている。第四部、「安定性試験」は、本発明の凍結乾燥製剤と再構成および臨床適用に使用されるデバイスおよびプレフィルドＷＦＩシリンジとの適合性を調査する。第五部、「生物学的有効性試験」は、インターフェロンベータ−１ａの凍結乾燥品の有効性を決定する。

１．製剤試験Ａ
種々の製剤を再構成後のインターフェロンベータ−１ａの回復および凍結乾燥中の可溶性凝集体の形成に関して分析した。製剤は、実現可能性の検討をもとに構成した。加えて、試料を４０℃で１２週間を超えて保管し、保管中に最も安定な製剤を同定するために、インターフェロンベータ−１ａの含有量を、一定の時点で分析した。

ＩＮＦ−ベータ１ａの凍結乾燥溶液（lyophilisation solution）の処方
ＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料（Rentschler Biotechnologie社より提供）を、配合の開始前に遠心分離（１０分、４０００ｒｐｍ）および滅菌ろ過（０．２μｍ）により精製し、存在する不溶性凝集体を除去した。得られたインターフェロンベータ−１ａ濃度は、ＵＶ分光法（２８０ｎｍ；ＵＶ−分光器 Ｃａｒｒｙ５０、バリアン）により測定し、３種類の精製手法の後で２８５μｇ／ｍｌを得た。ＩＮＦ−ベータ１ａ濃度の計算値は、吸光係数に基いたものである（１．３５１ｍＬ^*μｇ^-1*ｃｍ^-1）。

賦形剤を、対応する標的濃度にしたがって液体製剤として使用したクエン酸緩衝液に添加した。表１は、使用された種々の製剤を示す。バルク剤は二糖類、アミノ酸および糖アルコールの化学的分類から選択し、それらの二つ（スクロースとマンニトール）をさらに組み合わせた。全ての賦形剤は、さらにＴｗｅｅｎ２０と組み合わせた。これらのストック溶液を精製したＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料と３０μｇ／ｍｌのＩＮＦ−ベータ１ａ濃度に到達するための比率で混合した。

滅菌ろ過後、対応する凍結乾燥溶液１ｍｌを１０ＲガラスｔｙｐｅＩバイアルに充填した。

凍結乾燥
充填したバイアルは、凍結乾燥機にロードされ、熱輻射から遮蔽された。表２に示す凍結乾燥サイクルを試料の製造のために使用した。

凍結乾燥物の再構成
１ｍｌのＷＦＩ（注射用水）を凍結乾燥物に添加し、それらを再構成した。完全に溶解した後、溶液をピペット操作により３回上下させて均質化し、反応管に移した。インターフェロンベータ−１ａの含有量を、ＲＰ−ＨＰＬＣ法を用いてメーカーの操作手順にしたがい再構成後に分析した。

Ｔｗｅｅｎを含まない全ての製剤は、再構成後、適用されたＩＮＦ−ベータ１ａのわずかな回復のみ、目標量の三分の一のみを生じた。Ｔｗｅｅｎ２０を含む製剤は、完全に反対の事実を示した。再構成後の回復は、使用した賦形剤にかかわらず目標量を生じた。したがって、Ｔｗｅｅｎ２０などの洗剤は、数分子のＩＮＦ−ベータ１ａの空間的隔離を達成し、凍結乾燥および再構成の間のＩＮＦ−ベータ１ａの損失を防ぐために必要であることは明らかである。

平行して、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法をメーカーの操作手順にしたがい、再構成された凍結乾燥物に対して行った。非還元状態に到達するために、還元剤を蒸留水により置換した。ウェル当たりの分量は、６μｇで一定に保った。定量化は行わなかった。図１〜４は、得られたゲルを表示する。図中の白数字は列を示し、黒数字は分子量を示す。

図１：列１＋９：ＭＷ−マーカー；列２＋３：５％スクロース、列４＋５：５％トレハロース；列６＋７：５％アルギニンリン酸；列８：製剤原料；列１０：参照材料。
図２：列１＋２：５％グリシン；列３＋９：ＭＷ−マーカー；列４＋５：５％マンニトール；列６＋７：２．５％スクロース＋２．５％マンニトール；列８：製剤原料；列１０：参照材料。
図３：列１＋２：５％スクロース＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列３＋４：５％トレハロース＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０;列５＋９：ＭＷ−マーカー；列６＋７：５％アルギニンリン酸＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列８：製剤原料；列１０：参照材料。
図４：列１＋６：ＭＷ−マーカー；列２＋３：５％グリシン＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列４＋５：５％マンニトール＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列７＋８：２．５％スクロース＋２．５％マンニトール＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列９：製剤原料；列１０：参照材料。

ゲル１（図１参照）およびゲル２（図２参照）は、Ｔｗｅｅｎ２０を欠く製剤をロードした。個々の試料のバンド強度は、ＩＮＦ−ベータ１ａの様々な回復により異なる（表３参照）。ゲル１上の製剤（スクロース、トレハロースおよびアルギニンリン酸）は、ＩＮＦ−ベータ１ａの主要バンドとは別に、二量化ＩＮＦ−ベータ１ａの分子量を示す弱いバンドを示す。このバンドはまた製剤原料にも現れた（図１の列８参照）。したがって、可溶性凝集体は、凍結乾燥の間これらの賦形剤の存在下でさらには産生されなかった。同様の事実はゲル２においても見られた。グリシンとスクロースおよびマンニトールの混合物とを有する製剤は、二量体バンドをわずかしか示さない（図２の列１＋２および６＋７参照）。しかしながら、それはＩＮＦ−ベータ１ａの回復が乏しいため、これらの列にロードされた低タンパク質が原因とされる。マンニトール製剤は二量化バンドを示した。その強度は、製剤原料のものと同等である（図２の列４＋５参照）。したがって、可溶性凝集体は、凍結乾燥のあいだこれらの賦形剤の存在下ではさらに産生されなかった。

ゲル３（図３参照）およびゲル４（図４参照）は、Ｔｗｅｅｎ２０を含む製剤を備えていた。すべての試料のバンド強度は、ＩＮＦ−ベータ１ａの完全な回復のため一定である。ゲル３およびゲル４上のすべての製剤は、二量化バンドを示し、その強度は製剤原料の二量化バンドと同等である。凍結乾燥のあいだ、これらの製剤において可溶性凝集体は産生されなかった。

凍結乾燥物の安定性
表４に挙げる製剤を、上述の凍結乾燥実現可能性試験の結果に基づき、先と同じ凍結乾燥サイクル（表２に説明されている）を用いて製造した。

スクロースおよびトレハロースは二糖類の分類を代表し、アルギニンリン酸およびグリシンは、よく使用されるアミノ酸であり、そしてマンニトールは糖アルコールの分類からよく適用される賦形剤である。これらの化学的グループ由来の物質は、水素結合により凍結−ケーキ内部のタンパク質を安定化することができる。すべての製剤はＴｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０のいずれかを含む。ＩＮＦ−ベータ１ａの液体製剤においても存在するメチオニンの濃度は、酸化に対する保護を維持するため一定を保った。

４０℃での安定性試験のあいだのＩＮＦ−ベータ１ａのＲＰ−ＨＰＬＣ分析
ＲＰ−ＨＰＬＣ法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、安定性試験の間、ＩＮＦ−ベータ１ａの分析に適用された。ＲＰ−ＨＰＬＣ法は、酸化産物などの分解産物、凝集産物、およびタンパク質の折り畳み構造の変化の測定のみならず、ＩＮＦ−ベータ１ａの定量化を可能とする。試料は、凍結乾燥および４０℃での２週間、４週間、８週間および１２週間の保管期間の後分析した。

図５は、凍結乾燥物の再構成後のＩＮＦ−ベータ１ａの定量化を示す。定量化は、分解産物を含む総ピーク面積に基づき行った。黒線は、１００％限界を表す凍結乾燥前の凍結乾燥溶液の上限および下限を示す。

ほとんどの製剤の再溶解ＩＮＦ−ベータ１ａ含量は、凍結乾燥の直後、約８０％回復（６μｇの損失）の範囲であった。最良の回復は、スクロース／Ｔｗｅｅｎ２０およびスクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ８０製剤で得られた（約９０％回復）。スクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０に加えてトレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０、アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０、グリシン／Ｔｗｅｅｎ２０およびマンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０、製剤を含む製剤クラスターは、約８０％の値の二番目に最良の回復を与える。最低の回復（７０％未満）は、アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ８０およびスクロース／アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０製剤で得られた。

４０℃で１週間保管後、個々の製剤の回復は顕著に異なり始めた。スクロース／Ｔｗｅｅｎ２０製剤の回復は、９０％で一定のままであった。トレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０およびグリシン／Ｔｗｅｅｎ２０も、それらの開始時点と同等の回復値を示した。すべての他の製剤の回復は、多かれ少なかれ減少した。大きな損失は、アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０（約５０％）およびアルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ８０（４０％未満）製剤で観察された。他のすべての製剤は、約６５％の回復の範囲であった。

写真は２週間保管後ほぼ一定のままであった。再度、スクロース／Ｔｗｅｅｎ２０およびトレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０製剤は一定の回復を示したが、ここで、グリシン／Ｔｗｅｅｎ２０製剤の回復は減少し始めた（先の時点と比較して約５％）。他のすべての製剤の回復は、約１０％に下落した。

４０℃で１２週間保管後、スクロース／Ｔｗｅｅｎ２０およびトレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０製剤は、なお一定値で最良の回復を明らかに示した。それで、活性剤の損失は、４０℃で１２週間の期間を超える保管の間、これらの製剤において観察されなかった。他のすべての製剤において、ＩＮＦ−ベータ１ａの回復は多かれ少なかれ減少を示した。

図６は、４０℃で保管された間の酸化されたＩＮＦ−ベータ１ａ種の増加を表す親水性ピークの相対ピーク面積の経過を示す。黒線は、参照材料のクロマトグラフからの親水性ピークの相対ピーク面積の上限および下限を示す。

参照材料のレベルで、酸化されたＩＮＦ−ベータ１ａの相対ピーク面積は、凍結乾燥直後すべての製剤において一定のままであった。したがって、凍結乾燥製造工程は、ＩＮＦ−ベータ１ａの酸化を誘導しなかった。

保管中、これらの分解産物の相対ピーク面積は、存在する賦形剤によって多かれ少なかれ増加した。４０℃で２週間保管した後、アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０、スクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０、アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ８０およびスクロース／アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０製剤は、相対ピーク面積の明らかな増加（約８％）を示した。他の製剤の相対親水性ピーク面積は一定を維持した。２週間の保管期間後、酸化種の相対ピーク面積のさらなる増加は、スクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ８０製剤（４０℃での保管８週間まで親水性分解産物の相対ピーク面積の着実な増加を示した）以外、いずれの製剤においても観察されなかった。この事実は、１２週間の時点に到達するまで有効であった。したがって、スクロース／Ｔｗｅｅｎ２０、トレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０、グリシン／Ｔｗｅｅｎ２０およびマンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０を有する製剤が、４０℃で１２週間の保管期間まで酸化に対してＩＮＦ−ベータ１ａを保護できることを想定することができる。加えて、酸化に対する主な安定化効果は、メチオニンが存在することに起因する。しかし、すべての製剤が同量のメチオニンを含んでいるため、いくつかの賦形剤がメチオニンの安定化効果に追加されると思われる。

図７は、４０℃での保管の間のタンパク質の折り畳み構造の変化を意味するＩＮＦ−ベータ１ａ種の増加を表す疎水性ピークの相対ピーク面積の経過を示す。黒線は参照材料のクロマトグラム由来の疎水性ピークの相対ピーク面積の上限および下限を示す。

疎水性分解産物のみが安定性試験中に観察され、それは、変化した折り畳み構造状態を有するＩＮＦ−ベータ１ａ種が原因である。可溶性凝集体の形成は、いずれの試料においても観察されなかった。したがって、問題を表すＩＮＦ−ベータ１ａの凝集はない。凍結乾燥直後に疎水性分解産物の何らかの増加を示す製剤はなかった。したがって、凍結乾燥のみではＩＮＦ−ベータ１ａ折り畳み構造に変化を引き起こさなかった。スクロース／Ｔｗｅｅｎ２０およびトレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０の２つの製剤は、そのような保管中の分解産物に対する最良の安定化効果を示した。他のすべての製剤は、１２週間の安定性試験を通して多かれ少なかれこれらの分解産物の増加を示した。疎水性分解産物の考慮すべき増加は、スクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０およびスクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ８０製剤において見られた。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、スクロースおよびトレハロースが、凍結乾燥状態におけるＩＮＦ−ベータ１ａの安定化に対する最も好適な賦形剤であることが分かった。

４０℃での安定性試験中のＩＮＦ−ベータ１ａのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
ゲルは、安定性試験の各時点でＳＤＳ−ＰＡＧＥで得た。非還元状態は、全ての時点で維持され、一方、還元状態は８週間および１２週間の時点で適用したのみである。８週間後、アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０およびアルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ８０を有する製剤は、これらの製剤の回復がＲＰ−ＨＰＬＣ測定により示されたように充足していなかったので分析しなかった。

ＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料または参照材料と比較した場合、いずれの試料においてもバンドパターンに変化は、凍結乾燥直後にも保管期間の最初の４週間以内にも生じなかった。いくつかの試料は、１つのゲルにおいて次のゲルよりも弱い二量化バンドを示したが、二量化バンド強度を増加させる傾向は継続中の保管期間では見られなかった。４０℃で８週間保管後、製剤、マンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０、スクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ２０、スクロース／アルギニンリン酸／Ｔｗｅｅｎ２０およびスクロース／マンニトール／Ｔｗｅｅｎ８０は、非還元条件下、二量化バンドの増加を示した。すべての他の製剤は、それらのバンドパターンに変化を示さなかった。４０℃で１２週間保管後、４０℃で８週間の保管後のピークパターンと比較した場合、いずれの製剤においてもピークパターンにさらなる変化は観察されなかった。

図８は、４０℃で１２週間保管後の、表４の製剤１、２、４、５、７、８および９の再構成された凍結乾燥物の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。白色数字は列を示し、黒色数字は分子量を示す。列１＋９：ＭＷ−マーカー；列２：５％スクロース＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列３：５％トレハロース＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列４：列５：５％グリシン＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列５：５％マンニトール＋１％Ｔｗｅｅｎ２０；列６：２．５％スクロース＋２．５％マンニトール＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列７：１％スクロース＋４％アルギニンリン酸＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列８：２．５％スクロース＋２．５％マンニトール＋０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；列１０：製剤原料。

図９は、４０℃で１２週間保管後の、表４の製剤１、２、４、５、７、８および１０の再構成された凍結乾燥物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。白色数字は列を示し、黒色数字は分子量を示す。列１＋１０：ＭＷ−マーカー；列２：５％スクロース＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列３：５％トレハロース＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列４：列５：５％グリシン＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列５：５％マンニトール＋１％Ｔｗｅｅｎ２０；列６：２．５％スクロース＋２．５％マンニトール＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列７：１％スクロース＋４％アルギニンリン酸＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；列８：２．５％スクロース＋２．５％マンニトール＋０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；列９：製剤原料。

すべてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果のすべては、ＩＮＦ−ベータ１ａの最も安定なピークパターンがトレハロース／Ｔｗｅｅｎ２０およびスクロース／Ｔｗｅｅｎ２０製剤で得られたことを示した。

ガラス表面上への吸着
実験は、液体状態においてＩＮＦ−ベータ１ａの種々の材料の表面への吸着量を調査することを目的とする。凍結乾燥品の一次包装材料として使用されるバイアル材料の選択は、材料が滅菌可能で不活性でなければならないために制限される。これらの必須条件に基づけば、以下の材料：ポリプロピレン（ＰＰ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）、標準ガラスｔｙｐｅ１およびシリコーン処理ガラスｔｙｐｅ１が適切である。場合によっては、ガラスｔｙｐｅ１の熱処理が表面上へのタンパク質の吸着挙動への影響を示す。したがって、未処理ガラスバイアルと加熱滅菌ガラスバイアルとを次の実験に使用した。吸着量はＴｗｅｅｎのみの存在下で測定した。結果を図１０において説明する。

ＣＯＣバイアル、ＰＰバイアル、ならびにシリコーン処理ガラスｔｙｐｅ１バイアルに充填した試料の回復は、４番目の容器変更までは一定のままであった。未処理試料および加熱滅菌ガラスｔｙｐｅ１バイアルに充填された試料は、約１０％の回復の減少を示した（図１０参照）。この実験は、ＩＮＦ−ベータ１ａの吸着が、Ｔｗｅｅｎの存在下、より疎水性表面で排除することができたということを明らかに証明している。したがって、一次包装材料としてシリコーン処理ガラスｔｙｐｅ１を使用することが推奨される。

２．製剤試験Ｂ
この製剤試験は、製剤試験Ａの結果に基づき、選択された製剤は、賦形剤の有効比率を決定するための更なる試験に用いられる。

ＩＮＦ−ベータ１ａ凍結乾燥溶液の配合
ＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料（Rentschler Biotechnologie社より提供）を、配合の開始前に遠心分離（１０分、４０００ｒｐｍ）および滅菌ろ過（０．２μｍ）により精製し、存在する不溶性凝集体を除去した。得られたインターフェロンベータ−１ａ濃度は、ＵＶ分光法（２８０ｎｍ；ＵＶ−分光器 Ｃａｒｒｙ５０、バリアン）により測定した。ＩＮＦ−ベータ１ａ濃度の計算値は、吸光係数に基いたものである（１．３５１ｍＬ^*μｇ^-1*ｃｍ^-1）。

賦形剤ならびに緩衝成分を、対応する比率でＷＦＩ（注射用水）に溶解した。試験Ｂの種々の製剤を表５に示す。各製剤の１つのバイアルの正確な含有量を表６に示す。精製したＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料を、最終凍結乾燥溶液でおおよそ２４μｇ／ｍＬのＩＮＦ−ベータ１ａ濃度を達成するために添加した。最終的には、種々の凍結乾燥溶液を、凍結乾燥溶液の密度に基づき算出した目標重量までＷＦＩで満たした。

滅菌ろ過後、１ｍＬの対応する凍結乾燥溶液をシリコーン処理１０Ｒガラスｔｙｐｅ１バイアルに充填した。

５％スクロースおよび５％トレハロースを含む凍結乾燥溶液の密度は、２５℃で１．０３４ｇ／ｍｌであり、７．５％スクロースおよび７．５％トレハロースを含む凍結乾燥溶液の測定密度は、２５℃で１．０４３ｇ／ｍｌであった。

凍結乾燥
充填したバイアルを凍結乾燥機にかけ、熱輻射を遮蔽した。表７に示す凍結乾燥サイクルを試料の調製のために使用した。

得られた凍結乾燥物はすべて、何らの欠陥や崩壊もない良好な微視的な外観を示した。

凍結乾燥物の再構成
１ｍｌのＷＦＩを凍結乾燥物に添加し、それらを再構成した。完全に溶解した後、溶液をピペット操作により３回上下させて均質化し、ＨＰＬＣバイアルに移した。ＩＮＦ−ベータ１ａの含有量を、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定した。ＲＰ−ＨＰＬＣ法は、メーカーの操作手順にしたがい行った。

凍結乾燥溶液および凍結乾燥物のＩＮＦ−ベータ１ａの含有量
凍結乾燥溶液および再構成された凍結乾燥物のＩＮＦ−ベータ１ａの含有量は、凍結乾燥直後にＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定した。表８は凍結乾燥溶液のＩＮＦ−ベータ１ａの含有量を示す。

凍結乾燥物の再構成後のＩＮＦ−ベータ１ａの回復は、凍結乾燥直後に測定した。結果を表９に示す。すべての製剤は、凍結乾燥溶液の標準偏差内のＩＮＦ−ベータ１ａの完全な回復を示した。

凍結乾燥物の残留水含量
凍結乾燥物の最適な保存安定性を促進するために、凍結ケーキの残留（ここでは：結合水は含まず遊離のみ）水は、カール・フィッシャー滴定により測定した。凍結乾燥直後の凍結乾燥物において測定される遊離の残留水含量の値を表１０に示す。すべての製剤は、約１％の遊離の残留水を含んでいた。

カール・フィッシャー滴定の密閉バイアルを、注射針が栓に貫通したカール・フィッシャー電量計のオーブン（８０℃）に移した。８０℃で生じた水蒸気を、乾燥窒素を用いてカール・フィッシャー電量計の注射針を通じて直接滴定チャンバーに移した。残留水含量の計算は、凍結ケーキの理論重量に基づいた。

シリコーン処理ガラスバイアルへのおよび栓へのＩＮＦ−ベータ１ａの吸着
異なる供給元（ゲレスハイマー（Gerresheimer）社、スコット社）からの２つの種類のシリコーン処理ガラスバイアルをこの試験に用いた。両供給元のバイアルを水溶液からのＩＮＦ−ベータ１ａの吸着について試験した。

精製したＩＮＦ−ベータ１ａＤＳを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むクエン酸緩衝液で３０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。Ｔｗｅｅｎ２０濃度は０．１％（ｗ／ｖ）に設定した。溶液を異なる製造業者からのシリコーン処理バイアルに充填した。試料を短時間のインキュベーション後に採取し、残りの溶液を対応する種類の新しいバイアルに移した。この手順を４回繰り返した。試料中のＩＮＦ−ベータ１ａ含量をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。図１１はこの試験の結果を示す。ＩＮＦ−ベータ１ａの濃度は、使用されたバイアルに関わりなく、４回の移送工程すべてにわたって一定のままである。したがって、ＩＮＦ−ベータ１ａのガラス表面への吸着は、両ケースにおいて無視できる。

ＩＮＦ−ベータ１ａの栓（単一弁凍結乾燥栓２０ｍｍ；ウェスト ファーマシューティカル サービス）への吸着を、シリコーン処理ガラスバイアルでの調査と同様に調べた。溶液をシリコーン処理バイアルに充填し、バイアルを２つの異なる種類の栓を用いて密閉した。密閉したバイアルをひっくり返し、栓と液体との直接接触を達成した。バイアルを、短時間のインキュベーション後に反転させ、試料を採取した。この手順を４回繰り返した。試料のＩＮＦ−ベータ１ａ含量をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。結果を図１２に示す。ＩＮＦ−ベータ１ａの濃度は、両栓への繰り返し接触後、一定のままである。したがって、シリコーン処理栓を用いることにより、ＩＮＦ−ベータ１ａの栓への吸着は防ぐことができる。

３．凍結乾燥試験
この試験において、凍結乾燥溶液の製剤のための約３１時間の凍結乾燥サイクルの実行可能性を検証した。

凍結乾燥溶液の処方
ＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料（Rentschler Biotechnologie社より提供）を、配合の開始前に遠心分離（１０分、４０００ｒｐｍ）および滅菌ろ過（０．２μｍ）により精製し、存在する不溶性凝集体を除去した。得られたＩＮＦ−ベータ１ａ濃度は、ＵＶ分光法（２８０ｎｍ）により測定した。ＩＮＦ−ベータ１ａ濃度の計算は、吸光係数に基いたものである（１．３５１ｍＬ^*μｇ^-1*ｃｍ^-1）。賦形剤ならびに緩衝成分を、対応する比率でＷＦＩに溶解した（表１１参照）。精製したＩＮＦ−ベータ１ａ製剤原料を、最終凍結乾燥溶液でおおよそ１７．５μｇ／ｍＬのＩＮＦ−ベータ１ａ濃度を達成するために添加した。最終的には、凍結乾燥溶液を、凍結乾燥溶液の密度（１．０３４ｇ／ｍＬ）に基づき算出した目標重量までＷＦＩで満たした。親水性のＰＶＤＦ膜を用いた滅菌ろ過後、０．６５、それぞれ０．７２５ｍＬの凍結乾燥溶液を手でシリコーン処理２Ｒガラスｔｙｐｅ１バイアルに充填した。

凍結乾燥サイクル
凍結乾燥溶液を、表１２に示される凍結乾燥サイクルを用いて凍結乾燥した。アニーリング有りと無しとの試料を互いに比較した。アニーリング無しの試料はアニーリング工程後にロードした。

図１３は、凍結乾燥サイクルの主な凍結乾燥パラメータのデジタルデータ収集を示す。

棚温度およびチャンバー圧データは、凍結乾燥中の条件がプリセット仕様に従っていたことを証明する。製品温度は、凍結およびアニーリングのあいだ棚温度に密接に追従し、熱処理のための明確に定義された条件を示した。アニーリング有りおよび無しの試料の製品温度の経過は、全凍結乾燥プロセスにわたって同等であった。一次乾燥の終わりは、容量センサーにより測定される圧力の上昇により示され、一次乾燥のおおよそ４．２時間後に終わった（ランプなし）。

イメージング
ガラスバイアルを破壊し、凍結乾燥物をガラスの断片から分離した。凍結乾燥物の内側のイメージングのためにランセットを用いて凍結乾燥物を垂直に切断した。凍結乾燥物の上面、底面および切断面の写真を撮影した。加えて、凍結乾燥物を破壊することなく、凍結乾燥物の崩壊した構造を同定するために透過光画像を作成した。

図１４のアニーリング有り（右）ならびにアニーリング無し（左）の試料の垂直断面は、崩壊の兆候を示さなかった。両試料の結晶構造は、非常に均質でコンパクトであった。

図１５のアニーリング有りの試料の透過光画像（左）も、アニーリング無しの試料の透過光画像（右）も、何ら崩壊の兆候を表さなかった。

凍結乾燥物の熱分析
図１３は、アニーリング有りの試料とアニーリング無しの試料とのガラス転移温度を比較する。

アニーリング有りの凍結乾燥物は、アニーリング無しの凍結乾燥物よりも約１０℃高いガラス転移を示した。アニーリング工程は、凍結ケーキの空隙率を増加させる。したがって、吸着水は二次乾燥のあいだにより容易に除去される。可塑剤としての水が通常ガラス転移温度を減少させるので、残留水はガラス転移温度を低下させる。

溶解試験
凍結乾燥物は、１ｍＬシリンジを用いて再構成した。凍結乾燥物の完全な溶解に必要とされる時間を測定した。表１４はアニーリング有りおよび無しの凍結乾燥物の溶解時間を示す。

再構成挙動は、アニーリング工程により明らかに最適化された。アニーリング有りの試料の平均溶解時間は、アニーリング無しの試料と比較しておおよそ２０秒速かった。

この３１時間の凍結乾燥サイクルの凍結および一次乾燥に関するパラメータは、本発明の凍結乾燥物の凍結乾燥について最適な設定を表示した。

４．安定性試験
安定性試験は、先の製剤試験Ｂにより凍結乾燥された製剤と、再構成および臨床適用に用いられるデバイスおよびプレフィルドＷＦＩシリンジとの適合性を調べた。

適合性試験において、ＭＩＸＪＥＣＴ（商標）移送デバイスおよびプレフィルドＷＦＩシリンジを、２Ｒバイアルで提供された凍結乾燥された製剤の再構成に用いた。試験は、再構成された製剤の、バイアルとの、適用したＭＩＸＪＥＣＴ（商標）移送デバイスおよびプレフィルドＷＦＩシリンジとの適合性に関するデータを提供する。再構成された製剤の安定性の調査は、バイアル中で０および２４時間保管後と、光防護下の室温（ＲＴ）で、バイアル中およびシリンジ中の両方で２４時間保管後に行った。加えて、製剤の溶液の容量および密度を、製剤の再構成から、シリンジからの薬物溶液の投与までにＩＦＮ−ベータ１ａの損失があるかどうかを評価するために測定した。

一次包装材料を表１５に示し、再構成および臨床使用に使用した材料を表１６に説明する。

適合性データは、次の分析から得られた：異なる時点での、清澄性、色、可視粒子、ペプチドマッピング、ＲＰ−ＨＰＬＣ、バイオアッセイ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、脱アミド化、ｐＨ−値、オスモル濃度、肉眼で見えない粒子ならびに再構成された製剤の密度および容量。製剤としての許容基準は表１７に示す。

図１６〜１８に表す表は、バイアル中で０時間および２４時間、ならびにシリンジ中での２４時間後にさらにシリンジ中で２４時間（４８時間値）にわたって室温で保存した分析結果の編集を示す。

図１６〜１８の表に示されるように、適合性試験の結果は、すべての許容基準を満たした。保管期間において、清澄性、色および可視粒子について許容基準および目標値は満たされた。製剤の同定は、ペプチドマッピングを適用する対応する参照標準との比較において確認した。溶出プロファイルは、全保管期間にわたって参照標準のものと一致した。ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した製剤のタンパク質含量、およびバイオアッセイにより分析した効力は、目標値および許容基準を満たした。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、凝集体の相対ピーク面積は、＜０．８％と測定された（報告レベルより低い）。製剤における酸化されたＩＦＮベータ−１ａの程度は、ペプチドマッピングにより測定されたように試験期間を通して目標値を満たしていた。脱アミド化分析により、製剤における脱アミド化ＩＦＮ−ベータ−１ａの程度は、４１．２面積−％〜４８．７面積−％まで増加したことを示した。ｐＨ、オスモル濃度の結果は、目標値を満たした。肉眼で見えない粒子の結果も許容基準を満たした。

要約すれば、適合性試験は、本発明の凍結乾燥製剤が、ＷＦＩで再構成後、一次包装材料中で室温（ＲＴ）で４８時間まで安定であり、使用された一次包装材料中室温で２４時間にわたって、ならびにシリンジ中さらに２４時間にわたって、ＭＩＸＪＥＣＴ（商標）移送デバイスおよびプレフィルドＷＦＩシリンジを用いて安定であるということを示す。

再構成中の溶液の容量の測定
再構成の３つの異なる工程のあいだの溶液の容量を測定する意図は、臨床適用のあいだのタンパク質の損失［μｇ］の決定である（製剤の再構成からシリンジからの溶液の送達までの損失）。再構成中の損失は、充填容器と空容器との異なる重量測定により決定した。溶液の密度結果とあわせて、対応する容量を算出した。これらの結果を図１９および２０に示す表にまとめる。再構成された製剤の容量および密度決定は、ＭＩＸＪＥＣＴ（商標）移送デバイス有りと無しで行った。

適用中の溶液の容量の測定は、結果として以下の値となった。１．０２０ｍＬ ＷＦＩ（密度：０．９９８１ｇ／ｍＬ）がプレフィルドシリンジから送達される。再構成後の試料溶液の総容量は、１．０２６ｍＬ（密度：１．０２６６ｇ／ｍＬ）である。１．０１１ｍＬ（密度：１．０２４７ｇ／ｍＬ）の再構成された製剤をＭＩＸＪＥＣＴ（商標）移送デバイスを使用しないでシリンジから送達し、ＭＩＸＪＥＣＴ（商標）移送デバイスを用いる場合、０．９８９ｍＬ（密度：１．０２５２ｇ／ｍＬ）を送達する。測定されたこれらの値と含有量の値と併せて、１μｇのＩＦＮベータ−１ａの損失が、製剤の再構成の時点からシリンジからの溶液の送達までに測定された。

５．生物学的有効性試験
この試験の目的は、カニクイザルに少なくとも２８日間、静脈内ボーラス注射を与えた場合のインターフェロンベータ−１ａの凍結乾燥製品の生物学的有効性を測定すること、およびヒトにおけるインターフェロンベータ−１ａの凍結乾燥品の使用をサポートするためのデータを提供することであった。試験計画を表１８に示す。

注射用水を対照品として使用した。

次のパラメータおよび評価項目をこの試験において評価した：ＦＰ−１２０１の種々の用量での薬物動態活性、臨床兆候、体重、体重変化、眼科、心電図記録法、体温、臨床病理学パラメータ（血液学、凝固、臨床化学、および尿検査）、免疫原性分析、肉眼的剖検所見、臓器重量、および組織病理学検査）。

治療に起因する臨床観察はなかった。

治療に関連する眼科的知見はなく、また心電図や体温は変化しなかった。

治療に起因する尿組成の変化はなかった。

ミクソウイルス耐性タンパク質Ａ（ＭｘＡ）は、ＩＦＮベータ生物活性の最良のマーカーの一つであり、多発性硬化症の患者におけるＩＦＮ−ベータ治療の有効性を検出するための臨床環境において広く使用されている。したがって、治療した動物において、ＭｘＡを追跡した。ＭｘＡ濃度は、期待したように、ＩＦＮベータ−１ａで治療したすべての動物において誘導された。ＩＦＮベータ−１の３つの用量レベルのすべては、用量応答的に数倍のＭｘＡ誘導を誘導した。ＭｘＡ濃度は、６日目から１６日目まで高いままであり、その後、図２１に示すように徐々に減少した（群１（ひし形）、群２（四角）、群３（三角）および群４（円））。この漸減は、これらの動物におけるＩＦＮベータ−１中和抗体の発達による可能性が最も高い。ＩＦＮ−ベータに対する中和抗体の発達は、多発性硬化症のＩＦＮ−ベータ治療数ヵ月後または数年後にもヒトにおいて観察される。対照動物は、ＭｘＡの誘導を示さず、値は治療期間を通して基準濃度のままであった。ＩＦＮベータ−１用量が高くなればＭｘＡ発現レベルは高くなるが、明確な生物学的応答は、最も低い用量を用いても見られた。

臓器重量の変化はなく、また治療に起因する剖検または組織病理所見もなかった。

結論として、カニクイザルへの０．２５、１．０または３．０ ＭＩＵ／ｋｇ／日の用量レベルでのＦＰ−１２０１（本発明のインターフェロンベータ−１ａ製剤）の２８日間の毎日の静脈内投与は、ＭｘＡ誘導の予想される増加を伴い、良好に耐容した。血液学や臨床化学パラメータの小さな変化および中和抗体活性の増加は、特に３．０ ＭＩＵ／ｋｇ／日での治療の終了時に観察された。

Claims (16)

1. 活性成分としてインターフェロンベータ−１ａを２．０〜１５μｇと、バルク剤として二糖類と、非イオン性界面活性剤と、６．０〜７．５のｐＨを維持するための緩衝剤とを含み、二糖類がトレハロース・二水和物、またはトレハロース・二水和物とスクロースとの混合物であり、インターフェロンベータ−１ａの生物活性が少なくとも１５０ＭＩＵ／ｍｇである、単回静脈内投与のための凍結乾燥形態の医薬製剤。
2. 抗酸化剤をさらに含む請求項１記載の製剤。
3. 二糖類がトレハロース・二水和物である請求項１または２記載の製剤。
4. 非イオン性界面活性剤がポリソルベートである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
5. 緩衝剤として、リン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物、クエン酸三ナトリウム・二水和物またはそれらの組み合わせを含む請求項１〜４記載のいずれか１項に記載の製剤。
6. 抗酸化剤がメチオニンである請求項２〜５のいずれか１項に記載の製剤。
7. インターフェロンベータ−１ａが組換えヒトインターフェロンベータ−１ａである請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
8. 凍結乾燥製剤の残留水分含量が５重量％以下、好ましくは１〜５重量％の範囲である請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
9. 製剤が、６．０〜７．５のｐＨを有し、かつ
   （ｉ）活性成分として、組換えヒトインターフェロンベータ−１ａ、
   （ii）バルク剤として、トレハロース・二水和物、
   （iii）界面活性剤として、ポリソルベート、
   （iv）緩衝剤として、リン酸二ナトリウム・二水和物、リン酸二水素ナトリウム・二水和物およびクエン酸三ナトリウム・二水和物の組み合わせ、ならびに
   （ｖ）抗酸化剤としてメチオニン
   を含む水溶液から製造される請求項１〜９のいずれか１項に記載の製剤。
10. 水溶液が、０．０５〜０．１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベートまたは、好ましくはポリソルベート、および２〜６％（ｗ／ｖ）のトレハロース・二水和物またはスクロースを含む請求項９記載の製剤。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤を再構成することにより得られる水性医薬組成物。
12. 静脈内投与のための請求項１１記載の水性医薬組成物。
13. 請求項１１記載の水性医薬組成物を含む送達デバイス。
14. 請求項１１記載の水性医薬組成物を含むプレフィルドシリンジ。
15. 送達デバイスまたはプレフィルドシリンジの内表面がシリコーン処理されている請求項１３記載の送達デバイスまたは請求項１４記載のプレフィルドシリンジ。
16. −脈管内皮疾患、
    −急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）における脈管漏出、
    −脈管または心臓の手術および臓器移植における虚血−再灌流傷害、
    −主要な脈管または心臓の手術および臓器移植前の虚血プレコンディショニング、
    −急性膵炎または急性腎傷害、ならびに
    −多臓器不全（ＭＯＦ）
    から選択される疾患または障害の予防および／または治療における使用のための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の凍結乾燥製剤または請求項１１記載の水性医薬組成物。

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