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JP6858704B2 - Increased protein expression - Google Patents

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JP6858704B2 JP2017543825A JP2017543825A JP6858704B2 JP 6858704 B2 JP6858704 B2 JP 6858704B2 JP 2017543825 A JP2017543825 A JP 2017543825A JP 2017543825 A JP2017543825 A JP 2017543825A JP 6858704 B2 JP6858704 B2 JP 6858704B2
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Description

関連出願の相互参照
本願は、2015年2月19日に出願された現在係属中の米国仮特許出願第62/118,382号明細書の利益を主張するものである。
Cross-reference to related applications This application claims the benefit of the currently pending US Provisional Patent Application No. 62 / 118,382, filed February 19, 2015.

配列表の参照
「NB40178WOPCT−Sequence−Listing.txt」という名称のテキストファイル配列表の電子提出の内容は、2015年2月17日に作成され、サイズは27KBであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Reference to Sequence Listing The content of the electronic submission of the text file Sequence Listing named "NB40178WOPCT-Sequence-Listing.txt" was created on February 17, 2015 and is 27KB in size, the entire specification of which is referred to herein. Incorporated into the book.

本発明は、概して、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する細菌細胞、ならびにこうした細胞を作製および使用する方法に関する。本発明の態様は、目的タンパク質の増加した発現をもたらす遺伝子改変を有する、バチルス属(Bacillus)種などのグラム陽性微生物を含む。 The present invention generally relates to bacterial cells having a genetic modification that results in increased expression of the protein of interest, as well as methods of making and using such cells. Aspects of the invention include Gram-positive microorganisms such as Bacillus species that have a genetic modification that results in increased expression of the protein of interest.

遺伝子工学により、工業用バイオ反応器として、細胞工場として、および食品発酵において使用される微生物が改善されてきた。多くのバチルス属(Bacillus)種の菌を含むグラム陽性微生物が非常に多くの有用なタンパク質および代謝物の製造に使用されている(例えば、Zukowski,“Production of commercially valuable products,”:Doi and McGlouglin(eds.)Biology of Bacilli:Applications to Industry,Butterworth−Heinemann,Stoneham.Mass pp 311−337[1992]を参照)。工業で汎用されているバチルス属(Bacillus)種の菌としては、限定はしないが、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、およびバチルス・サブチリス(B.subtilis)が挙げられる。一般的な工業環境(とりわけ、例えば、洗剤用の酵素、バイオマス燃料生産)で使用される以外に、それらはGRAS(一般に安全と認められる)のステータスが与えられているため、これらのバチルス属(Bacillus)種の菌種は、食品および医薬品工業で使用するタンパク質を製造するための天然の候補である。グラム陽性微生物で産生されるタンパク質の例としては、限定はしないが、酵素、例えば、アミラーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ(またはセリン)プロテアーゼ、およびプルラナーゼが挙げられる。 Genetic engineering has improved the microorganisms used as industrial bioreactors, cell factories, and in food fermentation. Gram-positive microorganisms, including many Bacillus species, have been used to produce numerous useful proteins and biotransformers (eg, Zukowski, "Production of commercially variable products,": Doi and McGlo. (Eds.) Biotransform of Bacillus: Applications to Industry, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass pp 311-337 [1992]). Bacillus species commonly used in the industry are, but are not limited to, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, and Bacillus subtilis (B. licheniformis). Subtilis). Besides being used in general industrial environments (especially enzymes for detergents, biomass fuel production), these Bacillus (generally accepted as safe) status are given. The Bacillus species is a natural candidate for the production of proteins for use in the food and pharmaceutical industry. Examples of proteins produced by Gram-positive microorganisms include, but are not limited to, enzymes such as amylase, neutral protease, alkaline (or serine) protease, and pullulanase.

細菌宿主細胞でのタンパク質産生の理解が進んでいるとはいえ、目的タンパク質を高レベルで発現する新しい組み換え菌株の開発が要望されている。 Although the understanding of protein production in bacterial host cells is progressing, there is a demand for the development of new recombinant strains that express the target protein at high levels.

いくつかの実施形態では、本発明は、組み換え(すなわち、遺伝子改変された)細菌(宿主)細胞、および目的タンパク質をコードする目的の遺伝子の増加した発現のための方法に関する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、本開示の組み換え(修飾)細菌宿主細胞における1つまたは複数の目的タンパク質の増加した産生に関する。また別の実施形態では、本発明は、1つまたは複数の目的タンパク質を発現および/または産生する細菌宿主細胞を修飾する方法に関する。いくつかの他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載する驚くべき予想外の結果に関し、これらの結果は、特定の強力な5’UTRを目的の遺伝子と作動可能に組み合わせて使用することにより、目的の遺伝子のより高度な発現が達成されることを立証するものである。 In some embodiments, the invention relates to recombinant (ie, genetically modified) bacterial (host) cells, and methods for increased expression of the gene of interest encoding the protein of interest. In some other embodiments, the invention relates to increased production of one or more proteins of interest in recombinant (modified) bacterial host cells of the present disclosure. In yet another embodiment, the invention relates to a method of modifying a bacterial host cell that expresses and / or produces one or more proteins of interest. In some other embodiments, the invention relates to the surprising and unexpected results described herein, which use a particular potent 5'UTR in an operable combination with the gene of interest. By doing so, it is proved that a higher expression of the gene of interest is achieved.

従って、いくつかの実施形態では、本発明は、5’から3’方向に、5’非翻訳領域(5’UTR)および目的の異種遺伝子のコード領域を含むDNA分子に関する。他の実施形態では、本発明は、5’から3’方向に、5’非翻訳領域(5’UTR)と目的の異種遺伝子のコード領域とを含むDNA分子に関し、ここで、5’UTRは、バチルス属(Bacillus)種由来のaprEプロテアーゼ遺伝子から得られる。別の実施形態では、5’UTRは、バチルス・サブチリス(B.subtilis)由来のaprE遺伝子から得られる。 Thus, in some embodiments, the invention relates to a DNA molecule that comprises the 5'untranslated region (5'UTR) and the coding region of a heterologous gene of interest in the 5'to 3'direction. In another embodiment, the invention relates to a DNA molecule containing a 5'untranslated region (5'UTR) and a coding region of a heterologous gene of interest in the 5'to 3'direction, where the 5'UTR is. , Obtained from the aprE protease gene from the Bacillus species. In another embodiment, the 5'UTR is obtained from the aprE gene from Bacillus subtilis.

従って、いくつかの実施形態では、目的の遺伝子を発現するのに使用するための本開示の5’UTRは、バチルス・サブチリス(B.subtilis)aprE−5’UTRから得られる。いくつかの他の実施形態では、目的の遺伝子を発現するのに使用するための本開示の5’UTRは、配列番号2、配列番号9、配列番号10または配列番号17に示されるヌクレオチド配列を含む、バチルス・サブチリス(B.subtilis)aprE−5’UTRから得られる。いくつかの他の実施形態では、本開示の5’UTRは、配列番号2、配列番号9、配列番号10または配列番号17に示される核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。 Thus, in some embodiments, the 5'UTRs of the present disclosure for use in expressing the gene of interest are obtained from the Bacillus subtilis aprE-5'UTR. In some other embodiments, the 5'UTRs of the present disclosure for use in expressing the gene of interest have the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 17. Including, obtained from B. subtilis aprE-5'UTR. In some other embodiments, the 5'UTRs of the present disclosure have nucleotide sequences that have at least 90% sequence identity with the nucleic acid sequences set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 17. Including.

別の実施形態では、本発明は、上記DNA配列のいずれかを含むベクターに関する。 In another embodiment, the invention relates to a vector containing any of the above DNA sequences.

別の実施形態では、本発明は、上に開示したDNA配列のいずれかを含むベクターを含む宿主細胞に関する。別の態様では、宿主細胞は、バチルス属(Bacillus)種である。別の態様では、バチルス属(Bacillus)種は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サークランス(B.circulans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・クラウジイ(B.clausii)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)からなる群から選択される。別の態様では、バチルス属(Bacillus)種株は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)株である。別の態様では、バチルス属(Bacillus)種株は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)株である。 In another embodiment, the invention relates to a host cell comprising a vector containing any of the DNA sequences disclosed above. In another aspect, the host cell is of the Bacillus species. In another aspect, the Bacillus species are Bacillus licheniformis, B. lentus, Bacillus subtilis, Bacillus amylolicefaciens. ), Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus coagulans, Bacillus circlans ), Bacillus pumilus, Bacillus lautus, Bacillus clausii, Bacillus megaterium, and Bacillus turingiensis. It is selected from the group. In another aspect, the Bacillus strain is a Bacillus subtilis strain. In another aspect, the Bacillus strain is a Bacillus licheniformis strain.

一態様では、目的の遺伝子は、酵素をコードする。別の態様では、酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルヒドロラーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される。 In one aspect, the gene of interest encodes an enzyme. In another embodiment, the enzymes are acyltransferase, α-amylase, β-amylase, α-galactosidase, arabinosidase, arylesterase, β-galactosidase, caraginase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chondroitinase, cutinase, Endo-1,4-glucanase, endo-β-mannase, esterase, exo-mannase, galactanase, glucoamylase, hemicellulase, hyaluronidase, keratinase, lacquerase, lactase, ligninase, lipase, lipoxygenase, mannase, oxidase, pectin Acid lyase, pectinacetylesterase, pectinase, pentosanase, peroxidase, perhydrolase, phenoloxidase, phosphatase, phosphorlipase, phytase, polygalacturonase, protease, purulanase, reductase, lambnogalacturonase, β-glucanase, tannase, transglutaminase , Xylanacetyl-esterase, xylanase, xyloglucanase, and xylosidase.

本開示のいくつかの他の実施形態では、DNA分子は、実施例1に記載の核酸配列、配列番号3(すなわち、配列番号3は、ネイティブLATプロモータ、ネイティブLAT5’UTR、ネイティブLATシグナルペプチド配列およびネイティブLAT転写ターミネータと一緒に、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ(LAT)遺伝子を含むLAT発現カセットである)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In some other embodiments of the disclosure, the DNA molecule is the nucleic acid sequence set forth in Example 1, SEQ ID NO: 3 (ie, SEQ ID NO: 3 is the native LAT promoter, native LAT5'UTR, native LAT signal peptide sequence. And a sequence having 90% sequence identity with the LAT expression cassette containing the Bacillus licheniformis α-amylase (LAT) gene, along with a native LAT transcription terminator.

他の実施形態では、DNA分子は、実施例2に記載の核酸配列、配列番号11(すなわち、配列番号11は、バチルス・デラミフィカンス(Bacillus deramificans)プルラナーゼ(PUL)に作動可能に連結された配列番号2のaprE−5’UTRを含み、ここで、プルラナーゼのN−末端104アミノ酸は欠失されており、本明細書において「PULm104」と称する)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In another embodiment, the DNA molecule is the nucleic acid sequence set forth in Example 2, SEQ ID NO: 11 (ie, SEQ ID NO: 11 is a SEQ ID NO: operably linked to Bacillus deramificans pullulanase (PUL). It contains 2 aprE-5'UTRs, where the N-terminal 104 amino acids of pullulanase have been deleted and are referred to herein as "PULm104") and contain a sequence having 90% sequence identity.

また別の実施形態では、DNA分子は、実施例3に記載する核酸配列、配列番号12(すなわち、配列番号12は、5’から3’方向に、rrnlP2プロモータ(配列番号20)、これと作動可能に組み合わせたaprE−5’UTR(配列番号2)、これと作動可能に組み合わせた完全長LAT ORF(すなわち、LATシグナルペプチドおよび成熟LATポリペプチドをコードする)を含む)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In yet another embodiment, the DNA molecule operates with the nucleic acid sequence set forth in Example 3, SEQ ID NO: 12 (ie, SEQ ID NO: 12 is the rrnlP2 promoter (SEQ ID NO: 20) in the 5'to 3'direction. 90% sequence identical to the operably combined aprE-5'UTR (SEQ ID NO: 2), including the operably combined full-length LAT ORF (ie, encoding the LAT signal peptide and the mature LAT polypeptide). Includes sex sequences.

いくつかの他の実施形態では、DNA分子は、実施例3に記載の核酸配列、配列番号13(すなわち、配列番号13は、5’から3’方向に、rrnlP2プロモータ(配列番号20)、これと作動可能に組み合わせたaprE−5’UTR(配列番号2)、これと作動可能に組み合わせたLATシグナルペプチド、これと作動可能に組合せたPULm104をコードするORFを含む)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In some other embodiments, the DNA molecule is the nucleic acid sequence set forth in Example 3, SEQ ID NO: 13 (ie, SEQ ID NO: 13 in the 5'to 3'direction, rrnlP2 promoter (SEQ ID NO: 20), which 90% sequence identity with aprE-5'UTR (SEQ ID NO: 2) operably combined with, LAT signal peptide operably combined with it, and ORF encoding PULm104 operably combined with it. Includes sequences with.

いくつかの他の実施形態では、DNA分子は、実施例4に記載の核酸配列、配列番号14(すなわち、配列番号14は、5’から3’方向に、LATプロモータ、これと作動可能に組み合わせたaprE−5’UTR(配列番号2)、これと作動可能に組み合わせたLATシグナルペプチド、これと作動可能に組み合わせた成熟AmyS変異型ポリペプチドをコードするORFを含む)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In some other embodiments, the DNA molecule is operably combined with the nucleic acid sequence set forth in Example 4, SEQ ID NO: 14 (ie, SEQ ID NO: 14 in the 5'to 3'direction, the LAT promoter. 90% sequence identity with the aprE-5'UTR (SEQ ID NO: 2), including the LAT signal peptide operably combined with it, and the ORF encoding the mature AmyS mutant polypeptide operably combined with it). Includes sequences with.

いくつかの他の実施形態では、DNA分子は、実施例4に記載の核酸配列、配列番号15(すなわち、配列番号15は、5’から3’方向に、LATプロモータ、これと作動可能に組み合わせたaprE−5’UTR(配列番号9;「V2aprE−5’UTR」とも呼ばれる)、これと作動可能に組み合わせたLATシグナルペプチド、これと作動可能に組み合わせた成熟AmyS変異型ポリペプチドをコードするORFを含む)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In some other embodiments, the DNA molecule is operably combined with the nucleic acid sequence set forth in Example 4, SEQ ID NO: 15 (ie, SEQ ID NO: 15 in the 5'to 3'direction, the LAT promoter. The ORF encoding the aprE-5'UTR (SEQ ID NO: 9; also referred to as "V2apprE-5'UTR"), the LAT signal peptide operably combined with it, and the mature AmyS mutant polypeptide operably combined with it. Includes sequences with 90% sequence identity.

また別の実施形態では、DNA分子は、実施例4に記載の核酸配列、配列番号16(すなわち、配列番号16は、5’から3’方向に、LATプロモータ、これと作動可能に組み合わせたaprE−5’UTR(配列番号10;「V3aprE−5’UTR」とも呼ばれる)、これと作動可能に組み合わせたLATシグナルペプチド、これと作動可能に組み合わせた成熟AmyS変異型ポリペプチドをコードするORFを含む)と90%の配列同一性を有する配列を含む。 In yet another embodiment, the DNA molecule is the nucleic acid sequence set forth in Example 4, SEQ ID NO: 16 (ie, SEQ ID NO: 16 is the LAT promoter in the 5'to 3'direction, and aprE operably combined with it. Includes -5'UTR (SEQ ID NO: 10; also referred to as "V3apprE-5'UTR"), a LAT signal peptide operably combined with it, and an ORF encoding a mature AmyS variant polypeptide operably combined with it. ) And 90% sequence identity.

具体的な実施形態では、DNA分子は、配列番号11の核酸配列を含む。 In a specific embodiment, the DNA molecule comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11.

他の実施形態では、本発明は、バチルス属(Bacillus)種細菌において目的タンパク質の発現を増加させる方法に関し、これは、好適な培地中で形質転換バチルス属(Bacillus)種細菌を増殖させて目的タンパク質を発現させるステップを含み、ここで、バチルス属(Bacillus)種細菌は、目的タンパク質をコードするDNAと、バチルス属(Bacillus)種細菌のaprEプロテアーゼ遺伝子由来の5’UTRとを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、目的タンパク質の発現は、aprE−5’UTRを含まない発現カセットで形質転換されたバチルス属(Bacillus)種細菌からの目的タンパク質の発現と比較して増加する。別の態様では、目的タンパク質を培地から回収する。一態様では、目的タンパク質は、細胞外に分泌される。別の態様では、目的タンパク質は、細胞内に蓄積する。 In another embodiment, the invention relates to a method of increasing expression of a protein of interest in a Bacillus bacterium, which is the object of growing a transformed Bacillus bacterium in a suitable medium. It comprises the step of expressing the protein, wherein the Bacillus bacterium contains an expression cassette containing DNA encoding the protein of interest and a 5'UTR derived from the aprE protease gene of the Bacillus bacterium. Expression of the target protein is increased compared to expression of the target protein from a Bacillus bacterium transformed with a vector containing and transformed with an expression cassette containing no aprE-5'UTR. In another embodiment, the protein of interest is recovered from the medium. In one aspect, the protein of interest is secreted extracellularly. In another aspect, the protein of interest accumulates intracellularly.

別の態様では、DNA分子は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)由来のaprE−5’UTRを含む。 In another aspect, the DNA molecule comprises an aprE-5'UTR from Bacillus subtilis.

別の態様では、DNA分子は、リボソームRNA遺伝子由来のプロモータをさらに含む。別の態様では、リボソームRNA遺伝子プロモータは、P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnEおよびP3 rrnEからなる群から選択される。別の態様では、DNA分子は、リボソームタンパク質遺伝子由来のプロモータをさらに含む。別の態様では、リボソームタンパク質遺伝子プロモータは、rpsD、P1 rpsJ、P2 rpsJおよびシグマ因子プロモータrpoDからなる群から選択される。別の態様では、プロモータは、LAT遺伝子由来のプロモータを含む。 In another aspect, the DNA molecule further comprises a promoter derived from the ribosomal RNA gene. In another aspect, the ribosomal RNA gene promoter is selected from the group consisting of P1 rrnB, P1 rrnI, P2 rrnI, P1 rrnE, P2 rrnE and P3 rrnE. In another aspect, the DNA molecule further comprises a promoter derived from the ribosomal protein gene. In another aspect, the ribosomal protein gene promoter is selected from the group consisting of rpsD, P1 rpsJ, P2 rpsJ and the sigma factor promoter rpoD. In another aspect, the promoter comprises a promoter derived from the LAT gene.

いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、相同性タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、異種タンパク質である。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される。 In some embodiments, the protein of interest is a homologous protein. In some embodiments, the protein of interest is a heterologous protein. In some embodiments, the protein of interest is an enzyme. In some embodiments, the enzymes are acyltransferase, α-amylase, β-amylase, α-galactosidase, arabinosidase, arylesterase, β-galactosidase, caraginase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chondroitinase, Cutinase, endo-β-1,4-glucanase, endo-β-mannase, esterase, exo-mannase, galactanase, glucoamylase, hemicellulase, hyaluronidase, keratinase, lacquerase, lactase, ligninase, lipase, lipoxygenase, mannase, oxidase , Pectinate lyase, pectin acetyl cellulase, pectinase, pentosanase, peroxidase, phenol oxidase, phosphatase, phosphorlipase, phytase, polygalacturonase, protease, purulanase, reductase, lambnogalacturonase, β-glucanase, tannase, transglutaminase, It is selected from the group consisting of xsilaneacetyl-esterase, xylanase, xyloglucanase, and xylosidase.

いくつかの実施形態では、本方法は、目的タンパク質を回収するステップをさらに含む。 In some embodiments, the method further comprises the step of recovering the protein of interest.

いくつかの実施形態では、本方法は、目的タンパク質が改変グラム陽性菌細胞により発現されるような条件下で改変グラム陽性菌細胞を培養するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、目的タンパク質を回収するステップをさらに含む。 In some embodiments, the method further comprises culturing the modified Gram-positive cells under conditions such that the protein of interest is expressed by the modified Gram-positive cells. In some embodiments, the method further comprises the step of recovering the protein of interest.

本発明の態様は、前述した方法によって産生される改変グラム陽性菌細胞を含む。 Aspects of the invention include modified Gram-positive bacterial cells produced by the methods described above.

プラスミドpICatH−LATori1を示す。The plasmid pICatH-LATori1 is shown. ベクターpHPLT−Blich−int−カセットのマップを示す。A map of the vector pHPLT-Blich-int-cassette is shown. ベクターpKB360−AprE−WT−AmyS変異体のマップを示す。A map of the vector pKB360-AprE-WT-AmyS mutant is shown.

本発明の組成物および方法を詳細に説明する前に、以下の用語を明瞭化のために定義する。定義されていない用語および略語は、当該技術分野で用いられているその一般的な意味を付与すべきである。本明細書で別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。別段の記載がない限り、本開示の実施は、分子生物学、タンパク質工学、および微生物学で一般に使用されている普通の技術を含む。本明細書に記載するものと類似のまたは均等な任意の方法および材料が本開示の実施に有用であるが、一部の好適な方法および材料を本明細書に記載する。直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに詳しく説明される。 Before elaborating on the compositions and methods of the invention, the following terms are defined for clarity. Undefined terms and abbreviations should be given their general meaning as used in the art. Unless otherwise defined herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Unless otherwise stated, the practice of this disclosure includes common techniques commonly used in molecular biology, protein engineering, and microbiology. Any methods and materials similar or equivalent to those described herein are useful in the practice of the present disclosure, but some suitable methods and materials are described herein. The terms defined immediately after will be explained in more detail by reference to the present specification as a whole.

本明細書で使用されるとき、文脈中に明らかな別段の記載がない限り、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、複数形を含む。別段の記載がない限り、核酸配列は、5’から3’方向に、左から右に記載され;アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に、左から右に記載される。反対の記載がなければ、本開示が、本明細書に記載する特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されないことは理解されるであろう。 As used herein, the singular forms "one (a)", "one (an)" and "the" shall be plural unless otherwise stated in the context. Including. Unless otherwise stated, nucleic acid sequences are listed in the 5'to 3'direction, left to right; amino acid sequences are listed in the amino to carboxy direction, from left to right. Without the opposite statement, it will be understood that the present disclosure is not limited to the particular methods, protocols, and reagents described herein.

本明細書全体を通して与えられる全ての最大の数量的限界は、より小さい数量的限界が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、より小さい全ての数量的限界を含むことが意図される。本明細書全体を通して与えられる全ての最小の数量的限界は、より大きい数量的限界が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、より大きい全ての数量的限界を含む。本明細書全体を通して与えられる全ての数量的範囲は、より狭い数量的範囲が本明細書に明示的に記載されているのと同様に、より狭い全ての数量的限界を含む。 All maximum quantitative limits given throughout this specification are intended to include all smaller quantitative limits, just as smaller quantitative limits are expressly stated herein. Will be done. All minimum quantitative limits given throughout the specification include all larger quantitative limits, just as larger quantitative limits are explicitly stated herein. All quantitative ranges given throughout the specification include all narrower quantitative limits, just as a narrower quantitative range is explicitly stated herein.

数値に関して本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、文脈中に別段の具体的定義がなされていない限り、その数値の+/−0.5の範囲を指す。例えば、「約6のpH値」という語句は、そのpH値の別段の具体的定義がなされていない限り、5.5〜6.5のpH値を指す。 As used herein with respect to a number, the term "about" refers to the range of +/- 0.5 of that number, unless otherwise specifically defined in the context. For example, the phrase "pH value of about 6" refers to a pH value of 5.5 to 6.5, unless otherwise specifically defined for that pH value.

別段の定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本組成物および本方法が属する技術分野において、通常の知識を有する者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本組成物および本方法を実施または試験する際に、本明細書に記載のものに類似のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、ここで、代表的な、説明に役立つ方法および材料を記載する。 Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein are the same as those commonly understood by those of ordinary knowledge in the technical field to which the composition and the method belong. It has meaning. In carrying out or testing the composition and the methods, methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used, but here are representative, explanatory methods and methods. Describe the material.

本明細書中に引用する刊行物および特許は全て、個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれ、また、関連して刊行物が引用される方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も出願日前の開示に対するものであり、先行発明であるとの理由で、本組成物および本方法がそのような刊行物に先行する資格がないことを承認していると解釈されるべきではない。さらに、記載される公開日は、実際の公開日と異なる場合もあるため、個別に確認する必要があり得る。 All publications and patents cited herein are incorporated herein by reference in the same way that individual publications or patents are indicated to be incorporated by reference in a specific and individual manner. , Also incorporated herein by reference to disclose and explain the methods and / or materials in which the publication is cited in connection. Interpretation that citations of any publication are for disclosure prior to the filing date and acknowledge that the Composition and the Method are not eligible to precede such publications because they are prior inventions. Should not be done. Furthermore, the published dates listed may differ from the actual published dates and may need to be confirmed individually.

A.定義
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、新たに導入された核酸配列の宿主または発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。
A. Definitions As used herein, "host cell" refers to a cell capable of acting as a host or expression vehicle for a newly introduced nucleic acid sequence.

本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、グラム陽性宿主細胞バチルス属(Bacillus)種である。 In some embodiments of the invention, the host cell is a bacterial cell, eg, a Gram-positive host cell Bacillus species.

本明細書で使用される場合、「バチルス属(Bacillus)」または「バチルス属(Bacillus)種」は、当業者に周知の通りの「バチルス(Bacillus)」属に属する全ての種を含み、限定はしないが、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・クラウジイ(B.clausii)、バチルス・ハロデュランス(B.halodurans)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、バチルス・コアグランス(B.coagulans)、バチルス・サークランス(B.circulans)、バチルス・ラウツス(B.lautus)およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)が挙げられる。バチルス属(Bacillus)は、引き続き分類学的再構成を経ていることが認識されている。従って、この属は、再分類された種、例えば、限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)」と称される「バチルス・ステアロサーモフィルス(B.stearothermophilus)」などの生物を含む。酸素の存在下での耐性内生胞子の産生がバチルス属(Bacillus)の典型的な特徴とみなされるが、この特徴は、近年名付けられたアリサイクロバチルス属(Alicyclobacillus)、アンフィバチルス属(Amphibacillus)、アニューリニバチルス属(Aneurinibacillus)、アノキシバチルス属(Anoxybacillus)、ブレビバチルス属(Brevibacillus)、フィロバチルス属(Filobacillus)、グラシリバチルス属(Gracilibacillus)、ハロバチルス属(Halobacillus)、パエニバチルス(Paenibacillus)、サリバチルス属(Salibacillus)、サーモバチルス属(Thermobacillus)、ウレイバチルス属(Ureibacillus)、およびビルジバチルス属(Virgibacillus)にも適用される。 As used herein, "Bacillus" or "Bacillus species" includes and is limited to all species belonging to the "Bacillus" genus, as is well known to those skilled in the art. Not so, but Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus ), Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausiii, Bacillus halodurans, Bacillus megaterium Megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus circlans, Bacillus lautus and Bacillus turingiensis. It is recognized that the genus Bacillus continues to undergo taxonomic reconstruction. Thus, this genus is a reclassified species, such as "B. stearothermophilus," which is now referred to as, but not limited to, "Geobacillus stearomophilus." Including organisms such as. The production of resistant endospores in the presence of oxygen is considered a typical feature of the genus Bacillus, a feature recently named Alicyclobacillus, Amphivacillus. , Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobabillus, Gracillubasyllus, Gracillus, Gracillus, Gracillus, Gracillus, Gracillus, It also applies to the genus Salivacillus, the genus Thermobacillus, the genus Ureibacillus, and the genus Bacillus.

本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片もしくは部分、ならびにゲノムまたは合成起源のDNA、cDNA、およびRNAを指し、これらは、センスもしくはアンチセンス鎖のいずれにも関係なく、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。遺伝コードの同義性の結果として、様々なヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されるであろう。 As used herein, "nucleic acid" refers to a nucleotide or polynucleotide sequence and a fragment or portion thereof, as well as DNA, cDNA, and RNA of genomic or synthetic origin, which are sense or antisense strands. It may be either double-stranded or single-stranded regardless of any of the above. It will be appreciated that as a result of genetic code synonym, various nucleotide sequences can encode a given protein.

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、細胞中に複製することができ、新たな遺伝子もしくはDNAセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。従って、この用語は、様々な宿主細胞間の輸送のために設計された核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、外来細胞において異種DNA断片を組み込みかつ発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核および真核ベクターが市販されている。「ターゲティングベクター」は、それが形質転換される細胞の染色体内の領域と相同的であり、かつその領域で相同組換えを駆動することができるポリヌクレオチド配列を含むベクターである。ターゲティングベクターは、相同組換えにより細胞の染色体に突然変異を導入する上で有用である。一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同的配列を含み、これは、例えば末端に付加される(すなわち、スタッファー配列またはフランキング配列)。末端は、ターゲティングベクターが、閉じた環、例えばベクター内への挿入などを形成するように閉じていてもよい。適切なベクターの選択および/または構築は当業者の知識の範囲内である。 As used herein, the term "vector" refers to any nucleic acid that can replicate into a cell and carry a new gene or DNA segment into the cell. Thus, the term refers to nucleic acid constructs designed for transport between various host cells. "Expression vector" refers to a vector capable of incorporating and expressing a heterologous DNA fragment in a foreign cell. Many prokaryotic and eukaryotic vectors are commercially available. A "targeting vector" is a vector containing a polynucleotide sequence that is homologous to a region within the chromosome of the cell to which it is transformed and is capable of driving homologous recombination in that region. Targeting vectors are useful in introducing mutations into cellular chromosomes by homologous recombination. In some embodiments, the targeting vector comprises other non-homologous sequences, which are added, for example, to the ends (ie, stuffer or flanking sequences). The ends may be closed such that the targeting vector forms a closed ring, such as an insertion into the vector. The selection and / or construction of suitable vectors is within the knowledge of one of ordinary skill in the art.

本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」は、ベクターとして用いられ、多くの細菌および真核生物中で染色体外自己複製遺伝子エレメントを形成する環状二本鎖DNA構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。 As used herein, the term "plasmid" is used as a vector and refers to a circular double-stranded DNA construct that forms extrachromosomal self-replicating genetic elements in many bacteria and eukaryotes. In some embodiments, the plasmid can be integrated into the genome of the host cell.

本明細書で定義されるとき、「LATアミラーゼ」という用語は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ「AmyL」を指し、従って、これらの用語は置き換え可能に使用され得る。 As defined herein, the term "LAT amylase" refers to the Bacillus licheniformis α-amylase "AmyL", and thus these terms can be used interchangeably.

「精製された」または「単離された」または「濃縮された」は、生体分子(例えば、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド)が、それが天然で結合している天然の構成成分の一部または全部からそれを分離することにより、その天然の状態から改変されていることを意味する。こうした単離または精製は、最終組成物中の不要な全細胞、細胞残屑、不純物、外性タンパク質、または酵素を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿もしくはその他のタンパク質塩沈殿、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動または勾配による分離などの当該技術分野で認識される分離技術によって達成することができる。さらには、続いて別の利益を付与する成分、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、pHを調節するための化合物、またはその他の酵素もしくは化学物質を精製または単離された生体分子組成物に添加することも可能である。 "Purified" or "isolated" or "concentrated" is a biomolecule (eg, a polypeptide or polynucleotide) that is part or all of the natural constituents to which it is naturally bound. By separating it from, it means that it has been modified from its natural state. Such isolation or purification involves ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic separation, dialysis, protease to remove unwanted whole cells, cell debris, impurities, external proteins, or enzymes in the final composition. It can be achieved by separation techniques recognized in the art such as treatment, ammonium sulfate or other protein salt precipitation, centrifugation, size exclusion chromatography, filtration, precision filtration, gel electrophoresis or gradient separation. Furthermore, biomolecules that have been purified or isolated from components that subsequently confer another benefit, such as activators, anti-inhibitors, desirable ions, compounds for adjusting pH, or other enzymes or chemicals. It can also be added to the composition.

本明細書で使用されるとき、用語「増大した」、「向上した」および「増加した」は、目的の生体分子(例えば、目的タンパク質)の発現に関して言うとき、本明細書で置き換え可能に用いられ、生体分子の発現が、本明細書の教示に従って改変されてはいないが、ほぼ同じ増殖条件下で増殖させた対応する宿主株(例えば、野生型および/または親株)における発現レベルを上回ることを示す。 As used herein, the terms "increased," "improved," and "increased" are used interchangeably herein when referring to the expression of a biomolecule of interest (eg, protein of interest). And the expression of the biomolecule is above the expression level in the corresponding host strain (eg, wild-type and / or parent strain) grown under about the same growth conditions, although not modified according to the teachings herein. Is shown.

本明細書で使用されるとき、「発現」という用語は、タンパク質に適用されるとき、遺伝子の核酸配列に基づいてタンパク質が産生されるプロセスであり、従って転写および翻訳の両方を含む。 As used herein, the term "expression" is the process by which a protein is produced based on the nucleic acid sequence of the gene when applied to the protein, and thus includes both transcription and translation.

細胞へポリヌクレオチドの導入に関連して本明細書で使用される場合、用語「導入された」は、細胞にポリヌクレオチドを輸送するのに好適な任意の方法を指す。こうした導入のための方法として、限定はしないが、プロトプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、共役、および形質導入などが挙げられる(例えば、Ferrari et al.,“Genetics,”in Hardwood et al,(eds.),Bacillus,Plenum Publishing Corp.,pages 57−72,[1989]を参照)。 As used herein in connection with the introduction of a polynucleotide into a cell, the term "introduced" refers to any method suitable for transporting the polynucleotide into the cell. Methods for such introduction include, but are not limited to, protoplast fusion, transfection, transformation, conjugation, and transduction (eg, Ferrari et al., “Genetics,” in Hardwood et al, (eds). ), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72, [1989]).

本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「安定に形質転換された」という用語は、ポリヌクレオチド配列が人の介入により導入された細胞を指す。ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに組み込むことができるか、または少なくとも2つの世代にわたって維持されるエピソームプラスミドとして存在し得る。 As used herein, the terms "transformed" and "stable transformed" refer to cells in which the polynucleotide sequence has been introduced by human intervention. Polynucleotides can be integrated into the cell's genome or exist as episomal plasmids that are maintained for at least two generations.

本明細書で使用されるとき、「選択可能マーカー」または「選択マーカー」という用語は、宿主細胞で発現することができる核酸(例えば、遺伝子)を指し、その核酸を含む宿主の選択を容易にする。そのような選択可能マーカーの例としては、限定はされないが、抗微生物剤が挙げられる。従って、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が導入DNAを取りいれたか、または何らかの他の反応が起こったことを示す遺伝子を指す。通常、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性の配列を受け取っていない細胞から外来性DNAを含む細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性または代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。本発明に有用な他のマーカーとしては、限定はされないが、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、およびβ−ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられる。 As used herein, the term "selectable marker" or "selectable marker" refers to a nucleic acid (eg, a gene) that can be expressed in a host cell, facilitating the selection of a host containing that nucleic acid. To do. Examples of such selectable markers include, but are not limited to, antimicrobial agents. Thus, the term "selectable marker" refers to a gene that indicates that the host cell has taken up the introduced DNA or that some other reaction has occurred. Usually, selectable markers are genes that confer on host cells antimicrobial resistance or metabolic advantages that allow them to distinguish cells containing exogenous DNA from cells that have not received exogenous sequences during transformation. Is. Other markers useful in the present invention include, but are not limited to, auxotrophic markers such as tryptophan and detection markers such as β-galactosidase.

本明細書で使用される場合、用語「プロモータ」は、下流遺伝子の転写を指令するように機能する核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、プロモータは、標的遺伝子が発現される宿主細胞に対して適切である。プロモータは、他の転写および翻訳調節核酸配列(「制御配列」とも呼ばれる)と一緒に、所与の遺伝子を発現する必要がある。一般に、転写および翻訳調節配列として、限定はしないが、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、ならびにエンハンサーまたは活性化配列が挙げられる。 As used herein, the term "promoter" refers to a nucleic acid sequence that functions to direct transcription of a downstream gene. In some embodiments, the promoter is suitable for the host cell in which the target gene is expressed. Promoters need to express a given gene along with other transcriptional and translational regulatory nucleic acid sequences (also called "regulatory sequences"). In general, transcriptional and translational regulatory sequences include, but are not limited to, promoter sequences, ribosome binding sites, transcription initiation and termination sequences, translation initiation and termination sequences, and enhancer or activation sequences.

本明細書で使用される場合、「機能的に結合された」または「作動可能に連結された」は、既知もしくは所望の活性を有する調節領域または機能性ドメイン、例えば、プロモータ、ターミネータ、シグナル配列もしくはエンハンサー領域が標的(例えば、遺伝子もしくはポリペプチド)に、調節領域または機能性ドメインがその既知もしくは所望の活性に従って上記標的の発現、分泌もしくは機能を制御することができるように結合または連結されていることを意味する。 As used herein, "functionally linked" or "operably linked" is a regulatory region or functional domain with known or desired activity, such as a promoter, terminator, signal sequence. Alternatively, the enhancer region is bound or linked to the target (eg, a gene or polypeptide) such that the regulatory region or functional domain can control the expression, secretion or function of the target according to its known or desired activity. Means to be.

用語「遺伝子改変」または「遺伝子変化」は、組換え細胞を記載するために使用されるとき、その細胞が親細胞と比較して少なくとも1つの遺伝的相違を有することを意味する。1つまたは複数の遺伝的相違は、染色体突然変異(例えば、別のものによる染色体領域の挿入、欠失、逆転、置換(例えば、異種プロモータによる染色体プロンプタの置換)など)および/または染色体外ポリヌクレオチド(例えば、プラスミド)の導入であってよい。一部の実施形態では、染色体外ポリヌクレオチドを宿主細胞の染色体に組み込むことにより、安定したトランスフェクタント/形質転換体を作製することができる。 The term "gene modification" or "gene alteration" means that when used to describe a recombinant cell, the cell has at least one genetic difference compared to the parent cell. One or more genetic differences include chromosomal mutations (eg, insertion, deletion, reversal, substitution of a chromosomal region by another (eg, replacement of a chromosomal plasmid by a heterologous promoter)) and / or extrachromosomal poly. It may be the introduction of a nucleotide (eg, a plasmid). In some embodiments, a stable transfectant / transformant can be made by incorporating an extrachromosomal polynucleotide into the chromosome of the host cell.

遺伝子の「不活化」は、遺伝子の発現、またはそのコードされる生体分子の活性が阻止されるか、またはそうでなければその既知の機能を発揮することができないことを意味する。不活化は、任意の好適な手段、例えば、前述した通りの遺伝子改変によって起こり得る。一実施形態では、不活化遺伝子の発現産物は、タンパク質の生物活性に相応の変化を伴う短縮タンパク質である。 "Inactivation" of a gene means that the expression of the gene, or the activity of its encoded biomolecule, is blocked or otherwise unable to perform its known function. Inactivation can occur by any suitable means, eg, genetic modification as described above. In one embodiment, the expression product of the inactivating gene is a shortened protein with corresponding changes in the biological activity of the protein.

いくつかの実施形態では、不活化は、欠失によって行われる。いくつかの実施形態では、欠失の標的とされた領域(例えば、遺伝子)は、相同組み換えによって欠失される。例えば、欠失の標的とされた領域に相同な配列が各側に存在する選択マーカーを有する入来(incoming)配列を含むDNAコンストラクトが使用される(ここで、これらの配列は、本明細書において、「相同ボックス」と呼ばれ得る)。DNAコンストラクトが宿主染色体の相同配列と並び、ダブルクロスオーバー事象で、欠失の標的とされた領域が宿主染色体から切り出される。 In some embodiments, inactivation is done by deletion. In some embodiments, the region targeted for deletion (eg, a gene) is deleted by homologous recombination. For example, a DNA construct containing incoming sequences with selectable markers with sequences homologous to the targeted region of the deletion on each side is used (where these sequences are described herein). In, can be called a "homologous box"). The DNA construct aligns with the homologous sequence of the host chromosome, and in a double crossover event, the region targeted for deletion is excised from the host chromosome.

「挿入」または「付加」は、天然に存在する配列、または親配列と比較して、それぞれ1つ以上のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基が付加されるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化である。 An "insertion" or "addition" is a change in a nucleotide or amino acid sequence to which one or more nucleotide or amino acid residues are added, respectively, as compared to a naturally occurring sequence or parental sequence.

本明細書で使用されるとき、「置換」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による1つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の置き換えによって生じる。 As used herein, "substitution" results from the replacement of one or more nucleotides or amino acids with different nucleotides or amino acids, respectively.

遺伝子を変異させる方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、限定はされないが、部位特異的変異、ランダム変異の生成、およびギャップ二本鎖法が挙げられる(例えば、米国特許第4,760,025号明細書;Moring et al.,Biotech.2:646[1984];およびKramer et al.,Nucleic Acids Res.,12:9441[1984]を参照)。 Methods of mutating genes are well known in the art and include, but are not limited to, site-specific mutations, random mutation generation, and gap double-stranded methods (eg, US Pat. No. 4). , 760, 025; Moring et al., Biotech. 2: 646 [1984]; and Kramer et al., Nucleic Acids Res., 12: 9441 [1984]).

本明細書で使用されるとき、「相同遺伝子」は、異なるものの、通常、関連する種の1対以上の遺伝子を指し、それらは、互いに対応し、かつ同一であるか、または非常に類似している。この用語は、種分化(すなわち、新しい種の開発)によって分離される遺伝子(例えば、オルソロガス遺伝子)、および遺伝子複製によって分離された遺伝子(例えば、パラロガス遺伝子)を包含する。 As used herein, "homologous genes", although different, usually refer to one or more pairs of genes of related species, which correspond to each other and are identical or very similar. ing. The term includes genes isolated by speciation (ie, development of a new species) (eg, orthologus gene), and genes isolated by gene replication (eg, paralogus gene).

本明細書で使用されるとき、「オルソログ」および「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子(すなわち、相同遺伝子)から生じた、異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。 As used herein, "ortholog" and "orthologus gene" refer to genes of different species resulting from a common ancestor gene (ie, a homologous gene) by speciation. Orthologs usually retain the same functionality during evolution. Ortholog identification is used for reliable prediction of gene function in newly sequenced genomes.

本明細書で使用されるとき、「パラログ」および「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子を指す。オルソログが進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログは、いくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの、新しい機能を生じる。パラログ遺伝子の例としては、限定はされないが、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼおよびトロンビン(これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する)をコードする遺伝子が挙げられる。 As used herein, "paralog" and "paralogus gene" refer to genes involved in replication within the genome. Orthologs retain the same functionality throughout evolution, while paralogs give rise to new functionality, although some features are often related to the original. Examples of paralog genes include, but are not limited to, genes encoding trypsin, chymotrypsin, elastase and thrombin, all of which are serine proteinases that occur simultaneously in the same species.

本明細書で使用されるとき、「相同性」は、配列の類似性または同一性を指し、好ましくは同一性である。この相同性は、当該技術分野で知られた標準的な手法によって決定される(例えば、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981];Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970];Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988];Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group,Madison,WI)におけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAなどのプログラム;ならびにDevereux et al.,Nucl.Acid Res.,12:387−395[1984]を参照)。 As used herein, "homology" refers to sequence similarity or identity, preferably identity. This homology is determined by standard techniques known in the art (eg, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. ., 48: 443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 [1988]; Programs such as; and Deverex et al., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 [1984]).

本明細書で使用されるとき、「アナログ配列」は、遺伝子の機能が、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)株168から示される遺伝子と実質的に同じ配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)株168遺伝子の配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を含む。あるいは、アナログ配列は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)168の領域で見られる70〜100%の遺伝子のアライメントを有し、かつ/またはバチルス・サブチリス(B.subtilis)168の染色体の遺伝子と一致する領域で見られる少なくとも5〜10の遺伝子を有する。さらなる実施形態では、上記特性の2つ以上が配列に当てはまる。アナログ配列は、既知のシーケンスアライメント法で決定される。一般に使用されるアライメント法はBLASTであるが、上記および下記に示すように、他の方法も配列の決定に使用される。 As used herein, an "analog sequence" is a sequence in which the function of the gene is substantially the same as the gene shown from Bacillus subtilis strain 168. In addition, the analog genes are at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, with the sequence of the Bacillus subtilis strain 168 gene. Contains 99% or 100% sequence identity. Alternatively, the analog sequence has 70-100% gene alignment found in the region of Bacillus subtilis (B. subtilis) 168 and / or matches the gene of the chromosome of Bacillus subtilis (B. subtilis) 168. It has at least 5-10 genes found in the region. In a further embodiment, two or more of the above properties apply to the sequence. The analog sequence is determined by a known sequence alignment method. A commonly used alignment method is BLAST, but other methods are also used to determine the sequence, as shown above and below.

有用なアルゴリズムの一例がPILEUPである。PILEUPは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連する配列の群からマルチプルシーケンスアライメントを作成する。それはまた、アライメントの作成に使用するクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。PILEUPは、FengおよびDoolittleのプログレッシブアライメント法の簡略化を用いる(Feng and Doolittle,J.Mol.Evol.,35:351−360[1987])。この方法はHigginsおよびSharpが記載したものと類似している(Higgins and Sharp,CABIOS 5:151−153[1989])。有用なPILEUPパラメータは、初期設定ギャップウエイト3.00、初期設定ギャップ長ウエイト0.10、および加重エンドギャップを含む。 An example of a useful algorithm is PILEUP. PILEUP uses progressive, pairwise alignment to create multiple sequence alignments from a group of related sequences. It can also plot a tree showing the clustering relationships used to create the alignment. PILEUP uses a simplification of the progressive alignment method of Feng and Dolottle (Feng and Dolottle, J. Mol. Evol., 35: 351-360 [1987]). This method is similar to that described by Higgins and Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 [1989]). Useful PILEUP parameters include a default gap weight of 3.00, a default gap length weight of 0.10, and a weighted end gap.

有用なアルゴリズムの別の例は、Atschulらにより記載されているBLASTアルゴリズム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,215:403−410,[1990];およびKarlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5787[1993])である。特に有用なBLASTプログラムは、WU−BLAST−2プログラム(Altschul et al.,Meth.Enzymol.266:460−480[1996]を参照)である。WU−BLAST−2は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほとんどがデフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは、下記の値に設定される:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11。HSP SおよびHSP S2パラメータは、動的値であり、具体的配列の構成および目的の配列を検索する具体的データベースの構成に応じて、プログラム自体により決定される。しかし、感度を高めるために値を調節してもよい。アミノ酸配列同一性の値(%)は、マッチする同一残基の数を、アラインメントした領域内で「より長い」配列の残基の総数で割ることにより決定される。「より長い」配列は、アラインメントした領域で最も多くの実際の残基を有するものである(アラインメントスコアを最大にするためにWU−Blast−2により導入されたギャップは無視する)。 Another example of a useful algorithm is the BLAST algorithm described by Atschul et al. (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, [1990]; and Karlin et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 90: 5873-5787 [1993]). A particularly useful BLAST program is the WU-BLAST-2 program (see Altschul et al., Meth. Enzymol. 266: 460-480 [1996]). WU-BLAST-2 uses several search parameters, most of which are set to default values. The adjustable parameters are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11. The HSP S and HSP S2 parameters are dynamic values and are determined by the program itself depending on the configuration of the specific sequence and the configuration of the specific database to search for the sequence of interest. However, the value may be adjusted to increase sensitivity. The value of amino acid sequence identity (%) is determined by dividing the number of matching identical residues by the total number of residues in the "longer" sequence within the aligned region. The "longer" sequence has the most actual residues in the aligned region (ignoring the gap introduced by WU-Blast-2 to maximize the alignment score).

本明細書で使用されるとき、本明細書において同定されているアミノ酸またはヌクレオチド配列に関する「配列同一性パーセント(%)」は、配列をアライメントし、最大パーセントの配列同一性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、目的配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義され、いかなる同類置換も配列同一性の一部として考慮しない。 As used herein, a "sequence identity percentage (%)" for an amino acid or nucleotide sequence identified herein is required to align the sequences and achieve the maximum percentage of sequence identity. Defined as the proportion of amino acid residues or nucleotides in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues or nucleotides of the target sequence after the gap is introduced, and does not consider any homologous substitutions as part of the sequence identity. ..

「ホモログ(homologue)」(または「ホモログ(homolog)」は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列と特定の同一性を有する実在物を意味するであろう。相同配列は、従来の配列アライメントツール(例えば、Clustal、BLASTなど)を使用して、対象配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み得る。別段の規定がなければ、ホモログは、通常、対象アミノ酸配列と同じ活性部位残基を含むであろう。 "Homologue" (or "homolog"" would mean a real entity having a particular identity with the target amino acid sequence and the target nucleotide sequence. Homology sequences may refer to conventional sequence alignment tools (eg, for example). , Crystal, BLAST, etc.) and at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% with the target sequence. , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% may contain amino acid sequences that are identical. Unless otherwise specified, homologs are usually the same as the amino acid sequence of interest. Will contain active site residues.

配列アライメントを行い、配列の同一性を決定する方法は、当業者に知られており、過度の実験をせずとも行うことができ、同一性の値を明確に算出することができる。例えば、Ausubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 19(Greene Publishing and Wiley−Interscience,New York);およびALIGN program(Dayhoff(1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.)を参照されたい。配列のアライメントおよび配列同一性の決定に多くのアルゴリズムを利用することができ、例えば、Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アライメントアルゴリズム;Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所相同性アルゴリズム;Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444の類似性探索法;Smith−Watermanアルゴリズム(Meth.Mol.Biol.70:173−187(1997);ならびにBLASTP,BLASTNおよびBLASTXアルゴリズム(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403−410を参照)が挙げられる。 Methods of performing sequence alignment and determining sequence identity are known to those of skill in the art and can be performed without undue experimentation, and identity values can be clearly calculated. For example, Ausubel et al. , Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York); and ALIGN program (Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Suppl.3 (National Biomedical Research Foundation, Washington , DC). Many algorithms are available for sequence alignment and determination of sequence identity, eg, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443. Homogeneity alignment algorithm; Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 local homology algorithm; Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 similarity search method. Smith-Waterman algorithm (Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997); and BLASTP, BLASTN and BLASTX algorithms (see Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410). Can be mentioned.

これらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラムも利用可能であり、限定はされないが、ALIGNもしくはMegalign(DNASTAR)ソフトウェア、またはWU−BLAST−2(Altschul et al.,Meth.Enzymol.,266:460−480(1996));あるいはGenetics Computing Group(GCG)パッケージ、Version 8(Madison,Wisconsin,USA)で利用可能なGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA;ならびにIntelligenetics(Mountain View,California)によるPC/GeneプログラムのCLUSTALが挙げられる。当業者は、アライメントを測定するために、比較する配列の長さ全体で最大限のアライメントを達成するのに必要なアルゴリズムも含めて、適切なパラメータを決定することができる。好ましくは、配列同一性は、プログラムにより決定されたデフォルトパラメータを用いて決定する。特に、配列同一性は、デフォルトパラメータと共に、Clustal W(Thompson J.D.et al.(1994)Nucleic Acids Res.22:4673−4680)を用いて決定することができる。 Computer programs using these algorithms are also available and, but not limited to, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software, or WU-BLAST-2 (Altschul et al., Meth. Enzymol., 266: 460-480). 1996)); or the Genetics Computing Group (GCG) package, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA, available in Version 8 (Madison, Wisconsin, USA); Clustal can be mentioned. One of ordinary skill in the art can determine the appropriate parameters to measure the alignment, including the algorithm required to achieve the maximum alignment over the lengths of the sequences being compared. Preferably, sequence identity is determined using programmatically determined default parameters. In particular, sequence identity can be determined using Clustal W (Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default parameters.

本明細書で使用されるとき、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られた塩基対合により、核酸鎖を相補鎖と接合させるプロセスを指す。 As used herein, the term "hybridization" refers to the process of joining a nucleic acid strand to a complementary strand by base pairing known in the art.

核酸配列は、2つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体またはプローブの融解温度(Tm)に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシーは、通常、約Tm−5℃(プローブのTmより5℃低い)で起こり、「高ストリンジェンシー」は、Tmより約5〜10℃低い温度で起こり;「中間ストリンジェンシー」は、プローブのTmより約10〜20℃低い温度で起こり;そして「低ストリンジェンシー」はTmより約20〜25℃低い温度で起こる。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間または低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列ホモログを同定または検出するために用いることができる。 Nucleic acid sequences are considered to be "selectively hybridizable" to control nucleic acid sequences if the two sequences specifically hybridize to each other under medium to high stringency hybridization and washing conditions. Hybridization conditions are based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid binding complex or probe. For example, "maximum stringency usually occurs at about Tm-5 ° C (5 ° C lower than probe Tm) and" high stringency "occurs at a temperature about 5-10 ° C below Tm;" intermediate stringency ". "" Occurs at a temperature about 10-20 ° C. below the Tm of the probe; and "low stringency" occurs at a temperature about 20-25 ° C. below the Tm. Functionally, maximum stringency conditions can be used to identify sequences that have exact or near exact identity to hybridization probes, while intermediate or low stringency hybridization is a polynucleotide sequence homologue. Can be used to identify or detect.

中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、50%ホルムアミド、5XSSC、5XDenhardt’s溶液、0.5%SDSおよび100μg/ml変性キャリアDNA中、約42℃でハイブリダイゼーションし、続いて2XSSCおよび0.5%SDS中、室温で2回洗浄し、さらに、0.1XSSCおよび0.5%SDS中、42℃で2回洗浄することが挙げられる。中ストリンジェント条件の例としては、20%ホルムアミド、5XSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸3ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5Xデンハルト溶液、10%硫酸デキストランおよび20mg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中、37℃で終夜インキュベートし、続いて1XSSC中、約37〜50℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節の仕方は、当業者であれば知っている。 Medium to high stringency hybridization conditions are well known in the art. Examples of high stringency conditions include hybridization in 50% formamide, 5XSSC, 5X Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 μg / ml denatured carrier DNA at about 42 ° C., followed by 2XSSC and 0.5%. It may be washed twice in SDS at room temperature and further twice in 0.1XSSC and 0.5% SDS at 42 ° C. Examples of medium stringent conditions are 20% formamide, 5XSSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5X Denhardt solution, 10% dextran sulfate and 20 mg / ml modified shear salmon. Incubate overnight at 37 ° C. in a solution containing sperm DNA, followed by washing the filter in 1XSSC at about 37-50 ° C. Those skilled in the art know how to adjust the temperature, ionic strength, etc. required to adapt factors such as probe length.

「組み換え体」という用語は、生物学的構成要素または組成物(例えば、細胞、核酸、ポリペプチド/酵素、ベクターなど)に関連して使用されるとき、それらの生物学的構成要素または組成物が天然では見られない状態のものであることを示す。換言すれば、生物学的構成要素または組成物は、人の介入によって天然状態が変えられている。例えば、組み換え細胞は、天然の親(すなわち、非組み換え)細胞中には存在しない1つ以上の遺伝子を発現する細胞、1つ以上の天然遺伝子を天然親細胞と異なる量で発現する細胞、および/または1つ以上の天然遺伝子を天然親細胞と異なる条件下で発現する細胞を包含する。組み換え核酸は、天然配列と1つ以上のヌクレオチドが異なっている、異種配列(例えば、異種プロモータ、非天然または変異シグナル配列をコードする配列など)に機能可能に結合している、イントロンを欠いている、および/または単離された形態にあり得る。組み換えポリペプチド/酵素は、天然配列と1つ以上のアミノ酸が異なっている、トランケートされるか、もしくはアミノ酸の内部欠失を有する、天然細胞に見られない態様で(例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組み換え細胞から)発現する、および/または単離された形態にあり得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド、またはポリペプチド/酵素が、その野生型の相手と同一の配列を有するが、非天然形態(例えば、単離、または富化された形態)であることが強調されている。 When the term "recombinant" is used in connection with biological components or compositions (eg, cells, nucleic acids, polypeptides / enzymes, vectors, etc.), those biological components or compositions. Indicates that is in a state not found in nature. In other words, biological components or compositions have been altered in their natural state by human intervention. For example, recombinant cells are cells that express one or more genes that are not present in a natural parent (ie, non-recombinant) cell, and cells that express one or more natural genes in a different amount than the natural parent cell, and / Or includes cells expressing one or more natural genes under conditions different from those of the natural parent cell. Recombinant nucleic acids lack introns that are operably linked to heterologous sequences (eg, heterologous promoters, sequences encoding unnatural or mutated signal sequences, etc.) that differ from the native sequence by one or more nucleotides. And / or can be in isolated form. Recombinant polypeptides / enzymes encode polypeptides in a manner not found in natural cells, where one or more amino acids differ from the natural sequence, are truncated, or have internal deletions of amino acids. The presence of the expression vector in the cell allows it to be in an expressed and / or isolated form (from recombinant cells that overexpress the polypeptide). In some embodiments, the recombinant polynucleotide, or polypeptide / enzyme, has the same sequence as its wild-type partner, but in unnatural form (eg, isolated or enriched form). Is emphasized.

本明細書で使用されるとき、「標的配列」という用語は、入来配列が宿主細胞ゲノム内に挿入されることが望ましい配列をコードする宿主細胞中のDNA配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は野生型機能遺伝子またはオペロンをコードし、一方、他の実施形態では、標的配列は変異機能遺伝子またはオペロンまたは非機能遺伝子またはオペロンをコードする。 As used herein, the term "target sequence" refers to a DNA sequence in a host cell that encodes a sequence in which the incoming sequence should be inserted into the host cell genome. In some embodiments, the target sequence encodes a wild-type functional gene or operon, while in other embodiments, the target sequence encodes a mutant functional gene or operon or non-functional gene or operon.

本明細書で使用されるとき、「フランキング配列」は、対象配列の上流または下流にある配列を指す(例えば、遺伝子A−B−Cでは、遺伝子BがAおよびC遺伝子配列にフランキングされている)。一実施形態では、入来配列の両側に相同ボックスがフランキングしている。他の実施形態では、入来配列および相同ボックスは両側にスタッファー配列がフランキングしている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側(3’または5’)にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス属(Bacillus)染色体の配列に相同である。これらの配列は、バチルス(Bacillus)染色体に新しいコンストラクトが組み込まれ、バチルス(Bacillus)染色体の一部が入来配列により置換されることを目的とする。一実施形態において、選択マーカーの5’および3’末端は、不活化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側(3’または5’)にのみ存在するが、ある実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。 As used herein, "flanking sequence" refers to a sequence that is upstream or downstream of a sequence of interest (eg, in genes ABC, gene B is flanked into A and C gene sequences. ing). In one embodiment, homologous boxes are flanked on either side of the incoming sequence. In other embodiments, the incoming sequence and the homology box include units with stuffer sequences flanking on both sides. In some embodiments, the flanking sequence is present on only one side (3'or 5'), but in some embodiments, it is present on both sides of the flanking sequence. The sequence of each homology box is homologous to the sequence of the Bacillus chromosome. These sequences aim to integrate a new construct into the Bacillus chromosome and replace part of the Bacillus chromosome with an incoming sequence. In one embodiment, the 5'and 3'ends of the selectable marker are flanked by a polynucleotide sequence containing a portion of the inactivated chromosomal fragment. In some embodiments, the flanking sequence is present on only one side (3'or 5'), but in some embodiments, it is present on both sides of the flanking sequence.

本明細書で使用されるとき、「増幅性マーカー」、「増幅性遺伝子」および「増幅ベクター」という用語は、適当な増殖条件下で遺伝子の増幅を可能にする遺伝子をコードする遺伝子またはベクターを指す。 As used herein, the terms "amplifying marker," "amplifying gene," and "amplifying vector" refer to a gene or vector that encodes a gene that allows gene amplification under suitable growth conditions. Point.

「鋳型特異性」は、酵素を選択することにより、殆どの増幅技術において達成される。増幅酵素は、その使用条件下で、核酸の異種混合物中、核酸の特定の配列のみを処理する酵素である。例えば、Qβレプリカーゼの場合、MDV−1 RNAがレプリカーゼの特異的鋳型である(例えば、Kacian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:3038[1972]を参照)。その他の核酸は、この増幅酵素によっては複製されない。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自体のプロモータにストリンジェントな特異性を有する(Chamberlin et al.,Nature 228:227[1970]を参照)。T4 DNAリガーゼの場合、連結接合部分にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質とテンプレートとの間に不整合が存在すると、この酵素は2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない(Wu and Wallace,Genomics 4:560[1989]を参照)。最後に、TaqおよびPfuポリメラーゼは、高温で機能する能力を有するため、結合する配列に高い特異性を示すことが分かっており、そのため、プライマーにより確定され、高温が標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに有利に作用し、非標的配列とのハイブリダイゼーションには有利でない熱力学的条件を生じさせる。 "Template specificity" is achieved in most amplification techniques by selecting the enzyme. Amplifying enzymes are enzymes that process only specific sequences of nucleic acids in a heterologous mixture of nucleic acids under the conditions of their use. For example, in the case of Qβ replicase, MDV-1 RNA is a specific template for the replicase (see, eg, Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3038 [1972]). Other nucleic acids are not replicated by this amplification enzyme. Similarly, in the case of T7 RNA polymerase, this amplification enzyme has stringent specificity to its own promoter (see Chamberlin et al., Nature 228: 227 [1970]). In the case of T4 DNA ligase, if there is an inconsistency between the oligonucleotide or polynucleotide substrate and the template at the ligation junction, this enzyme will not ligate the two oligonucleotides or polynucleotides (Wand Wallace, Genomics 4: 560). [1989]). Finally, Taq and Pfu polymerases have been shown to exhibit high specificity for binding sequences due to their ability to function at high temperatures, so they are determined by primers and high temperatures are subject to primer hybridization with the target sequence. It acts favorably and creates thermodynamic conditions that are not favorable for hybridization with non-target sequences.

本明細書で使用されるとき、「増幅性核酸」という用語は、任意の増幅方法により増幅され得る核酸を指す。「増幅性核酸」は、通常、「サンプルテンプレート」を含むと考えられる。 As used herein, the term "amplifying nucleic acid" refers to a nucleic acid that can be amplified by any amplification method. The "amplifying nucleic acid" is usually considered to include a "sample template".

本明細書で使用されるとき、「サンプルテンプレート」という用語は、「標的」(下記に定義)の存在を分析するサンプルから生じる核酸を指す。一方、「バックグラウンドテンプレート」は、サンプルテンプレート以外の核酸に関して用いられ、サンプル内に存在していてもいなくてもよい。バックグラウンドテンプレートは、殆どの場合、故意のものではない。それは、キャリーオーバーの結果、またはサンプルから精製すべき核酸汚染物質の存在によるものであり得る。例えば、検出すべき生物以外の生物由来の核酸は試験サンプル内のバックグラウンドとして存在し得る。 As used herein, the term "sample template" refers to a nucleic acid that results from a sample that analyzes the presence of a "target" (defined below). On the other hand, the "background template" is used for nucleic acids other than the sample template and may or may not be present in the sample. Background templates are almost always unintentional. It may be the result of carryover or the presence of nucleic acid contaminants to be purified from the sample. For example, nucleic acids from organisms other than the organism to be detected may be present as background in the test sample.

本明細書で使用されるとき、「プライマー」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成的に生成されるかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれた場合(すなわち、ヌクレオチド、およびDNAポリメラーゼなどの誘発剤の存在下、適切な温度およびpHで)、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを指す。増幅効率を最大にするためには、プライマーは一本鎖であることが好ましいが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長生成物の生成に使用する前にまず、その鎖を分離する処理を行う。プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘発剤の存在下、伸長生成物の合成を開始するため、十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、および使用方法などの多くの因子に左右される。 As used herein, the term "primer" is a primer extension product that is complementary to a nucleic acid strand, whether naturally or synthetically produced, such as in a purification-restricted digestion. It refers to an oligonucleotide that can act as a starting point for synthesis when placed under conditions in which synthesis is induced (ie, in the presence of nucleotides and inducers such as DNA polymerase, at appropriate temperatures and pH). In order to maximize the amplification efficiency, the primer is preferably single-stranded, or may be double-stranded. In the case of double strands, the primers are first treated to separate the strands before being used to generate the extension product. The primer is preferably an oligodeoxyribonucleotide. The primer must be long enough to initiate the synthesis of the elongation product in the presence of the inducer. The exact length of the primer depends on many factors such as temperature, primer source, and usage.

本明細書で使用されるとき、「プローブ」という用語は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成、組み換え、またはPCR増幅により生成されるかにかかわらず、他の目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド(すなわちヌクレオチド配列)を指す。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明で使用されるプローブはいずれも任意の「レポーター分子」で標識されるため、任意の検出システム、例えば、限定はされないが、酵素(例えば、ELISA、および酵素をベースとした組織化学的分析)、蛍光、放射性および発光性システムなどにおいて検出されると考えられる。本発明を特定の検出システムまたは標識に限定することは意図されていない。 As used herein, the term "probe" is used for other purpose oligonucleotides, whether naturally produced, such as in a purification-restricted digestion, or by synthesis, recombination, or PCR amplification. Refers to an oligonucleotide (ie, a nucleotide sequence) that can hybridize to. The probe may be single-strand or double-stranded. Probes are useful for the detection, identification and isolation of specific gene sequences. Since all probes used in the present invention are labeled with any "reporter molecule", any detection system, such as, but not limited to, an enzyme (eg, ELISA, and enzyme-based histochemical analysis). ), Fluorescent, radioactive and luminescent systems, etc. It is not intended to limit the invention to any particular detection system or label.

本明細書で使用されるとき、「標的」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマーによって結合される核酸領域を指す。従って、「標的」は、他の核酸配列から選別されようとするものである。「断片」は、標的配列内の核酸領域と定義される。 As used herein, the term "target", when used with respect to the polymerase chain reaction, refers to the nucleic acid region bound by the primers used in the polymerase chain reaction. Therefore, the "target" is one that seeks to be screened from other nucleic acid sequences. A "fragment" is defined as a nucleic acid region within a target sequence.

本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ連鎖反応」(「PCR」)という用語は、とりわけ、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,683,195号明細書、同第4,683,202号明細書および同第4,965,188号明細書に記載の方法を指し、例えば、クローニングまたは精製することなくゲノムDNAの混合物において標的配列の断片濃度を増加させる方法が挙げられる。 As used herein, the term "polymerase chain reaction" ("PCR") is used, among other things, in US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683, which is incorporated herein by reference. , 202 and 4,965,188, including methods of increasing the fragment concentration of a target sequence in a mixture of genomic DNA without cloning or purification.

本明細書で使用されるとき、「遺伝子改変宿主株」(例えば、遺伝子改変バチルス属(Bacillus)株)は、遺伝子操作された宿主細胞を指し、組み換え宿主細胞とも呼ばれる。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ほぼ同じ増殖条件下で増殖した対応する非改変宿主株中の同じ目的タンパク質の発現および/または産生と比較して、目的タンパク質の発現が増大(増加)している。一部の実施形態では、改変株は、1つまたは複数の固有の染色体領域またはその断片の欠失を有する遺伝子操作バチルス属(Bacillus)種であり、ここで、目的タンパク質は、ほぼ同じ増殖条件下で増殖した対応する非改変バチルス属(Bacillus)宿主株と比較して、発現または産生のレベルが増大している。 As used herein, a "genetically modified host strain" (eg, a genetically modified Bacillus strain) refers to a genetically engineered host cell and is also referred to as a recombinant host cell. In some embodiments, the genetically modified host cell has increased expression of the protein of interest as compared to the expression and / or production of the same protein of interest in the corresponding unmodified host strain grown under substantially the same growth conditions ( It has increased. In some embodiments, the modified strain is a genetically engineered Bacillus species with a deletion of one or more unique chromosomal regions or fragments thereof, wherein the protein of interest is in about the same growth conditions. The level of expression or production is increased compared to the corresponding unmodified Bacillus host strain grown underneath.

本明細書で使用されるとき、「対応する非改変バチルス属(Bacillus)株」などは、記載される遺伝子改変を含まない宿主株(例えば、本来の(親)および/または野生型株)である。 As used herein, such as "corresponding unmodified Bacillus strain" is a host strain that does not contain the described genetic modification (eg, the original (parent) and / or wild-type strain). is there.

本明細書で使用されるとき、「染色体の組み込み」という用語は、入来配列が宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus))の染色体内に導入されるプロセスを指す。形質転換DNAのホモログ領域が、染色体の相同領域と整列する。続いて、相同ボックス間の配列がダブルクロスオーバーで入来配列により置換される(すなわち、相同組み換え)。いくつかの実施形態では、DNAコンストラクトの不活化染色体断片の相同部分が、バチルス属(Bacillus)染色体の固有染色体領域のフランキング相同領域と整列する。続いて、固有染色体領域が、ダブルクロスオーバーでDNA構築体により欠失される(すなわち、相同組換え)。 As used herein, the term "chromosomal integration" refers to the process by which an incoming sequence is introduced into the chromosome of a host cell (eg, Bacillus). The homologous region of the transformed DNA aligns with the homologous region of the chromosome. The sequences between the homologous boxes are then replaced by the incoming sequence with a double crossover (ie, homologous recombination). In some embodiments, the homologous portion of the inactivated chromosomal fragment of the DNA construct aligns with the flanking homologous region of the endemic chromosomal region of the Bacillus chromosome. Subsequently, the proper chromosomal region is deleted by the DNA construct at double crossover (ie, homologous recombination).

「相同組み換え」は、同一、またはほぼ同一のヌクレオチド配列部位における、2つのDNA分子間、または対の染色体間のDNAフラグメントの交換を意味する。一実施形態では、染色体組み込みは、相同組み換えである。 "Homologous recombination" means the exchange of DNA fragments between two DNA molecules or between pairs of chromosomes at the same or nearly identical nucleotide sequence sites. In one embodiment, chromosomal integration is homologous recombination.

本明細書で使用されるとき、「相同配列」は、比較のために最適に整列させた場合に、他の核酸またはポリペプチド配列に対して100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、85%、80%、75%または70%の配列同一性を有する核酸またはポリペプチド配列を意味する。いくつかの実施形態では、相同配列は85%〜100%の配列同一性を有し、一方、他の実施形態では、90%〜100%の配列同一性を有し、また、より多くの実施形態では、95%〜100%の配列同一性を有する。 As used herein, "homologous sequences" are 100%, 99%, 98%, 97%, 96 relative to other nucleic acid or polypeptide sequences when optimally aligned for comparison. %, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75% or 70% means a nucleic acid or polypeptide sequence having sequence identity. In some embodiments, the homologous sequence has 85% to 100% sequence identity, while in other embodiments it has 90% to 100% sequence identity and more embodiments. In morphology, it has 95% to 100% sequence identity.

本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」は、ペプチドまたはタンパク質配列、またはそれらの一部を指す。「タンパク質」、「ぺプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。 As used herein, "amino acid" refers to a peptide or protein sequence, or a portion thereof. The terms "protein", "peptide" and "polypeptide" are used interchangeably.

本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」および「目的のポリペプチド」は、所望のおよび/または評価対象のタンパク質/ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、目的タンパク質は細胞内タンパク質であり、別の実施形態では、これは分泌されるポリペプチドである。特に、ポリペプチドは酵素を含み、こうした酵素として、限定はしないが、デンプン分解酵素、タンパク質分解酵素、セルロース分解酵素、オキシドレダクターゼ酵素および植物細胞壁分解酵素から選択されるものがある。さらに具体的には、これらの酵素として、限定はしないが、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼが挙げられる。一部の実施形態では、目的タンパク質は、シグナルペプチド(すなわち、分泌させるタンパク質のアミノ末端伸長部)と融合した分泌ポリペプチドである。ほぼ全ての分泌タンパク質は、アミノ末端タンパク質伸長部を使用するが、これは、膜を介した前駆体タンパク質のターゲティングおよび転位に重要な役割を果たす。この伸長部は、膜移動中またはその後、シグナルペプチダーゼによるタンパク質分解によって除去してもよい。 As used herein, "protein of interest" and "polypeptide of interest" refer to the desired and / or protein / polypeptide to be evaluated. In some embodiments, the protein of interest is an intracellular protein, and in another embodiment, it is a secreted polypeptide. In particular, polypeptides include enzymes, and such enzymes are selected from, but not limited to, starch degrading enzymes, proteolytic enzymes, cellulose degrading enzymes, oxidoreductase enzymes and plant cell wall degrading enzymes. More specifically, these enzymes include, but are not limited to, acyltransferase, α-amylase, β-amylase, α-galactosidase, arabinosidase, arylesterase, β-galactosidase, caraginase, catalase, cellobiohydrolase, Cellulase, chondroitinase, cutinase, endo-β-1,4-glucanase, endo-β-mannase, esterase, exo-mannase, galactanase, glucoamylase, hemicellulase, hyaluronidase, keratinase, lacquerse, lactase, ligninase, lipase , Lipoxygenase, mannase, oxidase, pectinate lyase, pectinacetylesterase, pectinase, pentosanase, peroxidase, phenoloxidase, phosphatase, phospholipase, phytase, polygalacturonase, protease, purlanase, reductase, ramnogalacturonase, β-glucanase , Tannase, transglutaminase, xylanacetyl-esterase, xylanase, xyloglucanase, and xylosidase. In some embodiments, the protein of interest is a secreted polypeptide fused with a signal peptide (ie, the amino-terminal extension of the protein to be secreted). Almost all secretory proteins use the amino-terminal protein extension, which plays an important role in membrane-mediated targeting and translocation of precursor protein. This extension may be removed during or after membrane migration by proteolysis with a signal peptidase.

本発明のいくつかの実施形態では、目的ポリペプチドまたはタンパク質は、ホルモン、抗体、成長因子、受容体などから選択される。本発明に包含されるホルモンとしては、限定はされないが、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどが挙げられる。成長因子としては、限定はされないが、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、サイトカイン、例えばインターロイキン(例えば、IL−1〜IL−13)、インターフェロン、コロニー刺激因子などが挙げられる。抗体としては、限定はされないが、抗体を生成するのが望ましい任意の種から直接得られる免疫グロブリンが挙げられる。さらに、本発明は、修飾抗体を包含する。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体もまた、本発明に包含される。特に好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体である。 In some embodiments of the invention, the polypeptide or protein of interest is selected from hormones, antibodies, growth factors, receptors and the like. Hormones included in the present invention include, but are not limited to, follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, corticostimulating hormone-releasing factor, somatostatin, gonadotropin hormone, vasopressin, oxytocin, erythropoetin, insulin and the like. Growth factors include, but are not limited to, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, epithelial growth factor, nerve growth factor, fibroblast growth factor, transformed growth factor, cytokines such as interleukins (eg IL-1). ~ IL-13), interferon, colony stimulating factor and the like. Antibodies include, but are not limited to, immunoglobulins obtained directly from any species for which it is desirable to produce the antibody. Furthermore, the present invention includes modified antibodies. Polyclonal and monoclonal antibodies are also included in the present invention. In a particularly preferred embodiment, the antibody is a human antibody.

本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの「誘導体」または「変異体」は、1つ以上のアミノ酸のC末端およびN末端の一方または両方への付加、アミノ酸配列における1つまたは多くの異なる部位での1つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの一端もしくは両端での、またはアミノ酸配列の1つ以上の部位での1つ以上のアミノ酸の欠失、アミノ酸配列の1つ以上の部位での1つ以上のアミノ酸の挿入、およびこれらの任意の組み合わせにより、前駆体ポリペプチド(例えば、天然ポリペプチド)から誘導されるポリペプチドを意味する。ポリペプチドの誘導体または変異体の作製は、任意の都合の良い方法で、例えば、天然ポリペプチドをコードするDNA配列を変更して誘導/変異ポリペプチドを生成することにより、そのようなDNA配列を適切な宿主へ形質転換して誘導/変異ポリペプチドを生成することにより、および改変DNA配列を発現させて誘導/変異ポリペプチドを生成することにより、行うことができる。誘導体または変異体としては、さらに、化学的に改変したポリペプチドが挙げられる。 As used herein, a "derivative" or "variant" of a polypeptide is the addition of one or more amino acids to one or both of the C-terminus and N-terminus, one or many differences in the amino acid sequence. Substitution of one or more amino acids at a site, deletion of one or more amino acids at one or both ends of a polypeptide, or at one or more sites of an amino acid sequence, at one or more sites of an amino acid sequence. It means a polypeptide derived from a precursor polypeptide (eg, a native polypeptide) by the insertion of one or more amino acids, and any combination thereof. The production of a derivative or variant of a polypeptide can be made in any convenient way, eg, by altering the DNA sequence encoding the native polypeptide to produce an induced / mutated polypeptide. This can be done by transforming into a suitable host to produce an induced / mutated polypeptide, and by expressing a modified DNA sequence to produce an induced / mutated polypeptide. Derivatives or variants also include chemically modified polypeptides.

本明細書で使用されるとき、「異種タンパク質」という用語は、宿主細胞内に天然では存在しないタンパク質またはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、タンパク質をコードする遺伝子は、天然に存在する遺伝子であるが、別の実施形態では、突然変異および/または合成遺伝子を用いてもよい。一部の実施形態では、異種タンパク質をコードするDNAは、天然では異種である5’UTRと連結しており、これは、5’UTRと、目的タンパク質をコードするDNAとが、異なる遺伝子または異なる生物学に由来することを意味する。従って、異種という用語は、2つの要素が同じ起源(例えば、種、細胞、核酸など)に由来しないというその最も広い意味で用いられる。 As used herein, the term "heterologous protein" refers to a protein or polypeptide that does not naturally exist in the host cell. In some embodiments, the gene encoding the protein is a naturally occurring gene, but in other embodiments, a mutant and / or synthetic gene may be used. In some embodiments, the DNA encoding the heterologous protein is linked to a naturally heterologous 5'UTR, which means that the 5'UTR and the DNA encoding the protein of interest are different genes or different. It means that it is derived from biology. Therefore, the term heterologous is used in its broadest sense that the two elements do not come from the same origin (eg, species, cells, nucleic acids, etc.).

本明細書で使用されるとき、「相同タンパク質」は、細胞内の天然の、すなわち、細胞内に天然に存在するタンパク質またはポリペプチドを指す。実施形態において、その細胞はグラム陽性細胞であり、一方、特定の実施形態では、細胞はバチルス属(Bacillus)宿主細胞である。代替の実施形態において、相同タンパク質は、他の生物、例えば、限定はされないが、大腸菌(E.coli)などにより生成された天然タンパク質である。本発明は、組み換えDNA技術により相同タンパク質を産生する宿主細胞を包含する。 As used herein, "homologous protein" refers to a protein or polypeptide that is naturally occurring in the cell, i.e., naturally occurring in the cell. In embodiments, the cells are Gram-positive cells, while in certain embodiments, the cells are Bacillus host cells. In an alternative embodiment, the homologous protein is a native protein produced by another organism, such as, but not limited to, E. coli. The present invention includes host cells that produce homologous proteins by recombinant DNA technology.

B.非翻訳領域(UTR)
非翻訳領域または「UTR」は、一般に翻訳されていない、mRNAの配列または対応するDNAの配列である。UTRは、mRNAの5’または3’末端にあってよい。5’非翻訳領域(5’UTR)(リーダ配列またはリーダRNAとしても知られる)は、開始コドンから上流にあるmRNAの領域である。この領域は、ウイルス、原核生物および真核生物で異なる機構による転写物の翻訳の調節に重要である。非翻訳と呼ばれるが、5’UTRまたはその一部がタンパク質産物に翻訳されることもある。その後、この産物は、mRNAの主要コード配列の翻訳を調節し得る。しかし、他の多くの生物では、5’UTRは、翻訳を調節する複雑な二次構造を形成するのではなく、非翻訳である。対応するDNA配列は、一般に、5’または3’UTR配列とも呼ばれる。
B. Untranslated Region (UTR)
An untranslated region or "UTR" is a sequence of mRNA or corresponding DNA that is generally untranslated. The UTR may be at the 5'or 3'end of the mRNA. The 5'untranslated region (5'UTR) (also known as leader sequence or leader RNA) is the region of mRNA upstream from the start codon. This region is important for the regulation of transcription translation by different mechanisms in viruses, prokaryotes and eukaryotes. Although called untranslated, 5'UTRs or parts thereof may be translated into protein products. This product can then regulate the translation of the major coding sequence of mRNA. However, in many other organisms, the 5'UTR is untranslated rather than forming complex secondary structures that regulate translation. The corresponding DNA sequence is also commonly referred to as a 5'or 3'UTR sequence.

5’UTRは、転写開始部位で開始してよく、また、翻訳開始部位もしくはコード領域の第1コドンでまたはその付近で終結してもよい。5’UTRは、3〜10ヌクレオチド〜数千ヌクレオチド超で長さが変動する。5’UTRは、一般に、リボソーム結合部位、シス作用調節エレメント、および他の調節エレメントを含有する。 The 5'UTR may start at the transcription initiation site and may terminate at or near the translation initiation site or the first codon of the coding region. The 5'UTR varies in length from 3 to 10 nucleotides to over several thousand nucleotides. The 5'UTR generally contains a ribosome binding site, a cis-action regulatory element, and other regulatory elements.

バチルス属(Bacillus)細菌由来の様々な遺伝子が5’UTRを含有する。バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)由来のLAT(α−アミラーゼ)遺伝子は、次の5’UTR:
GTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATC(配列番号8)
を含み、バチルス・サブチリス(B.subtilis)由来のaprE遺伝子は、次の5’UTR:
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGA(配列番号2)
を含む。
Various genes from Bacillus bacteria contain 5'UTRs. The LAT (α-amylase) gene derived from Bacillus licheniformis is the following 5'UTR:
GTTTCACATTGAAGGGAGGGAGAATC (SEQ ID NO: 8)
The aprE gene derived from Bacillus subtilis (B. subtilis) contains the following 5'UTR:
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCACTACTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGGTAAAGA (SEQ ID NO: 2)
including.

Hambraeusらは、バチルス・サブチリス(B.subtilis)由来のaprE遺伝子の58ヌクレオチド長リーダ配列(5’UTR)がmRNA安定性の決定因子であることを明らかにした(Hambraeus et al.Microbiology(2002)148:1795−1803)。Hambraeusらは、この領域が5’末端でステム−ループ構造を形成し、インタクトなリボソーム結合部位(RBS)と一緒にmRNAの安定性増大をもたらすことを示した。しかし、Hambraeusらは、発現ベクターでの強力な5’UTRの使用により、目的タンパク質のより高度の発現がもたらされ得ることを研究、教示または示唆しておらず、さらには理解していないため、当業者にそれを説明もしていない。本発明者らは、発現ベクターにおける強力な5’UTRが修飾宿主細胞での目的タンパク質のより高度な発現を達成することを見出した。 Hambraeus et al. Revealed that the 58 nucleotide long leader sequence (5'UTR) of the aprE gene from Bacillus subtilis (B. subtilis) is a determinant of mRNA stability (Hambraeus et al. Microbiology (2002)). 148: 1795-1803). Hambraeus et al. Showed that this region forms a stem-loop structure at the 5'end, leading to increased mRNA stability along with the intact ribosome binding site (RBS). However, Hambraeus et al. Have not studied, taught or suggested, and even understood, that the use of potent 5'UTRs in expression vectors could result in higher expression of the protein of interest. , I haven't even explained it to those skilled in the art. We have found that potent 5'UTRs in expression vectors achieve higher expression of the protein of interest in modified host cells.

C.プロモータ
特に、細菌宿主細胞での使用のための好適なプロモータの例として、限定はしないが、例えば、PamyE、PamyQ、PamyL、PpstS、PsacB、PSPAC、PAprE、PVeg、PHpaIIプロモータ、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)マルトース生成アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)(BAN)アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス(B.subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウジイ(B.clausii)アルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミリス(B.pumilis)キシロシダーゼ遺伝子、バチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)cryIIIA、およびバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子のプロモータが挙げられる。別のプロモータとして、限定はしないが、A4プロモータ、ならびにファージλPRまたはPLプロモータ、および大腸菌(E.coli)lac、trpもしくはtacプロモータがある。さらには、リボソームタンパク質およびRNAプロモータは、異種タンパク質産生に有用であることが判明している(例えば、国際公開第2013/086219号パンフレットを参照されたい;その開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる)。以下のプロモータが考慮される。
C. Promoters In particular, examples of suitable promoters for use in bacterial host cells include, but are not limited to, for example, PamyE, PamyQ, PamyL, PpstS, PsacB, PSPAC, PAprE, PVeg, PHpaII promoter, Bacillus stearotelmo. B. stereothermophilus maltose-producing amylases gene, Bacillus amyloliquefaciens (BAN) amylases gene, Bacillus subtilis alkaline protease gene, Bacillus claudius. Examples include the gene, the Bacillus pumilis xylosidase gene, the Bacillus turingiensis cryIIIA, and the promoter of the Bacillus licheniformis α-amylase gene. Other promoters include, but are not limited to, A4 promoters, as well as phage λPR or PL promoters, and E. coli lac, trp or tac promoters. Furthermore, ribosome proteins and RNA promoters have been found to be useful for heterologous protein production (see, eg, WO 2013/08621; the disclosure of which is described herein by reference in its entirety. Incorporated into the book). The following promoters are considered.

Figure 0006858704
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Figure 0006858704
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リボソームプロモータを用いたとき、目的の異種タンパク質をコードする核酸配列の予想外に高い発現のレベルは、いくつかの利点を有する。一実施形態では、リボソームプロモータを用いた目的のコード配列の発現により、そのネイティブプロモータからの目的のコード配列の発現と比較して、目的のコード配列の発現レベルの増加が可能になる。より高い発現レベルは、不安定な転写物に特に有用である。 The unexpectedly high level of expression of the nucleic acid sequence encoding the heterologous protein of interest when using the ribosome promoter has several advantages. In one embodiment, expression of the desired coding sequence using the ribosome promoter allows an increase in the expression level of the desired coding sequence as compared to the expression of the desired coding sequence from its native promoter. Higher expression levels are particularly useful for unstable transcripts.

別の実施形態では、リボソームプロモータを用いた目的のコード配列の発現により、リボソームプロモータを含む発現構築物を増幅せずに、目的のコード配列の発現レベルの増加が可能になる。目的のコード配列の高い発現レベルを達成するために、当該技術分野の他の発現構築物を用いた場合、発現構築物の増幅が必要になることが多い。しかしながら、本明細書に記載のリボソームプロモータを用いて達成される発現レベルは、発現構築物の増幅を必要としないことができる(しかし、目的タンパク質のより高度の発現を達成するために増幅を用いてもよい)ほど十分に高い。これはいくつかの利点をもたらす。第1に、宿主株が増幅発現構築物の喪失を被らないために安定する。また、発現構築物を増幅する必要がなければ、株の構築がより効率的である。従って、時間、費用および材料が節約される。 In another embodiment, expression of the coding sequence of interest using the ribosome promoter allows an increase in the expression level of the coding sequence of interest without amplifying the expression construct containing the ribosome promoter. Amplification of expression constructs is often required when other expression constructs in the art are used to achieve high expression levels of the coding sequence of interest. However, the expression levels achieved using the ribosome promoters described herein may not require amplification of the expression construct (but with amplification to achieve higher expression of the protein of interest). It's good enough). This brings several advantages. First, the host strain is stable because it does not suffer loss of amplified expression constructs. Also, strain construction is more efficient if there is no need to amplify the expression construct. Therefore, time, cost and materials are saved.

D.目的のコード配列
本発明により包含されるプロモータは、目的タンパク質をコードする核酸(すなわち、目的のコード配列)に作動可能に連結される。コード配列によりコードされるポリペプチドは、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質もしくはその部分、受容体もしくはその部分、受容体遺伝子(例えば、緑色蛍光タンパク質)またはその他の二次代謝物であってよい。
D. Code of interest sequence The promoter included in the present invention is operably linked to the nucleic acid encoding the protein of interest (ie, the coding sequence of interest). Polypeptides encoded by the coding sequence are enzymes, hormones, growth factors, cytokines, antibiotics or parts thereof, receptors or parts thereof, receptor genes (eg, green fluorescent protein) or other secondary metabolites. It's okay.

一部の実施形態では、酵素は、細菌または真菌由来のプロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、エステラーゼ、マンナーゼ、カルボヒドラーゼ、ヒドロラーゼ、オシキダーゼ、ペルメアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、エピメラーゼ、タウトメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼなどである。 In some embodiments, the enzyme is a bacterial or fungal-derived protease, cellulase, hemicellulase, xylanase, amylase, glucanase, cutinase, phytase, lacquerase, lipase, isomerase, esterase, mannase, carbohydrase, hydrolase, osicidase, permease, Pullulanase, reductase, epimerase, toutomerase, transferase, kinase, phosphatase and the like.

他の実施形態では、酵素は、セリン、メタロ、チオールまたは酸性プロテアーゼなどのプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ(例えば、スブチリシン)である。セリンプロテアーゼは、以下の文献に記載されている:Markland,et al.(1983)Honne−Seyler’s Z Physiol.Chem 364:1537−1540;Drenth,J. et al.(1972)Eur.J.Biochem.26:177−181;米国特許第4,760,025号明細書(RE 34,606)、同第5,182,204号明細書および同第6,312,936号明細書ならびに欧州特許第0 323,299号明細書に記載されている。アルカリプロテアーゼの例として、スブチリシン、特に、バチルス属(Bacillus)由来のもの(例えば、スブチリシン、レンツス、アミロリケファシエンス、スブチリシンカールスバーグ(Carlsberg)、スブチリシン309、スブチリシン147およびスブチリシン168)が挙げられる。また、本発明で用いることができるプロテアーゼは、例えば、米国特許出願公開第2010/0152088号明細書および国際公開第2010/056635号パンフレットにも記載されている。タンパク質分解活性を測定するための手段は、K.M.Kalisz,“Microbial Proteinases”ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY,A.Fiecht Ed.1988に開示されている。 In other embodiments, the enzyme is a protease such as serine, metallo, thiol or acidic protease. In some embodiments, the protease is a serine protease (eg, subtilisin). Serine proteases are described in the following literature: Markland, et al. (1983) Honne-Seyler's Z Physiol. Chem 364: 1537-1540; Drenth, J. et al. et al. (1972) Euro. J. Biochem. 26: 177-181; U.S. Pat. Nos. 4,760,025 (RE 34,606), 5,182,204 and 6,312,936 and European Patent No. 0. It is described in the specification of 323,299. Examples of alkaline proteases include those derived from subtilisin, in particular Bacillus (eg, subtilisin, lentus, amyloliquefaciens, carlsberg, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168). .. Proteases that can be used in the present invention are also described, for example, in US Patent Application Publication No. 2010/0152088 and International Publication No. 2010/506635 Pamphlet. The means for measuring proteolytic activity is K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases" ADVANCES IN BIOCHEMICAL ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY, A.M. Fiecht Ed. It is disclosed in 1988.

他の実施形態では、酵素は、アミラーゼ、例えば、バチルス属(Bacillus)由来のアミラーゼ(例えば、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)LATアミラーゼ)、ゲオバチルス属(Geobacillus)(例えば、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(G.stearothermophilus))またはトリコデルマ属(例えば、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei))由来のアミラーゼである。細菌および真菌アミラーゼは、例えば、米国特許第8,058,033号明細書、米国特許出願公開第2010/0015686号明細書、米国特許出願公開第2009/0314286号明細書、英国出願英国特許第1011513.7号明細書、および国際出願番号PCT/IB2011/053018号明細書に記載されている。これらの参照文献の各々の明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。 In other embodiments, the enzyme is an amylase, eg, an amylase from the genus Bacillus (eg, B. licheniformis LAT amylase), a genus Geobacillus (eg, Geobacillus stearothermophilus). (G. theatermorphillus)) or amylase from the genus Trichoderma (eg, Trichoderma reesei). Bacterial and fungal amylases are described, for example, in US Patent No. 8,058,033, US Patent Application Publication No. 2010/0015686, US Patent Application Publication No. 2009/0314286, UK Application UK Patent No. 1011513. .7 and International Application No. PCT / IB2011 / 053018. Each specification of these references is incorporated herein by reference in its entirety.

他の実施形態では、酵素は、キシラナーゼである。いくつかの実施形態では、キシラナーゼは、トリコデルマ属(Trichoderma)(例えば、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei))に由来する。細菌および真菌キシラナーゼは、例えば、国際公開第2001/027252号パンフレットおよび米国特許第7,718,411号明細書に記載されている。これらの参照文献の各々の明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。 In other embodiments, the enzyme is xylanase. In some embodiments, the xylanase is derived from the genus Trichoderma (eg, Trichoderma reesei). Bacterial and fungal xylanases are described, for example, in WO 2001/027252 and US Pat. No. 7,718,411. Each specification of these references is incorporated herein by reference in its entirety.

他の実施形態では、酵素は、フィターゼである。特定の実施形態では、フィターゼは、シトロバクター属(Citrobacter)(例えば、シトロバクター・フロインディ(C.freundii))または大腸菌(E.coli)に由来する。他の実施形態では、フィターゼは、ブティアウクセラ(Buttiauxella)フィターゼ、例えば、ブティアウクセラ・アグレスティス(Buttiauxella agrestis)フィターゼであってよい。フィターゼは、例えば、国際公開第2006/043178号パンフレット、同第2006/038062号パンフレット、同第2008/097619号パンフレット、同第2009/129489号パンフレット、同第2006/038128号パンフレット、同第2008/092901号パンフレット、同第2009/129489号パンフレット、および同第2010/122532号パンフレットに記載されている。これらの参照文献の各々の明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。 In other embodiments, the enzyme is phytase. In certain embodiments, the phytase is from the genus Citrobacter (eg, Citrobacter freundii) or E. coli. In other embodiments, the phytase may be Buttiauxella phytase, such as Buttiauxella phytase. For phytase, for example, International Publication No. 2006/043178 Pamphlet, 2006/038062 Pamphlet, 2008/097619 Pamphlet, 2009/129489 Pamphlet, 2006/038128 Pamphlet, 2008/ It is described in Pamphlet 092901, Pamphlet 2009/12948, and Pamphlet 2010/122532. Each specification of these references is incorporated herein by reference in its entirety.

一部の実施形態では、酵素は、セルラーゼである。セルラーゼは、セルロース中のβ−D−グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的に3つの主要クラス:エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼに分けられている(Knowles,J.et al.,TIBTECH 5:255−261(1987))。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、これらは当業者に周知である。 In some embodiments, the enzyme is cellulase. Cellulase is an enzyme that hydrolyzes β-D-glucosidic bonds in cellulose. Cellulolytic enzymes are traditionally divided into three major classes: endoglucanase, exoglucanase or cellobiohydrolase and β-glucosidase (Knowles, J. et al., TIBTECH 5: 255-261 (1987)). .. Numerous cellulases have been described in the scientific literature and are well known to those of skill in the art.

一部の実施形態では、ホルモンは、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ソマトスタチン、ゴナドトロピンホルモン、バソプレッシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリンなどである。 In some embodiments, the hormone is follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, corticotropin-releasing factor, somatostatin, gonadotropin hormone, vasopressin, oxytocin, erythropoietin, insulin and the like.

一部の実施形態では、増殖因子は、細胞表面上の受容体に結合して、主に細胞増殖および/または分化を活性化する結果をもたらすタンパク質であり、このような因子として、血小板由来増殖因子、表皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、インスリン様成長因子、トランスフォーミング増殖因子などがある。 In some embodiments, growth factors are proteins that bind to receptors on the cell surface, resulting in predominantly activating cell proliferation and / or differentiation, and as such factors, platelet-derived proliferation. Factors, epidermal growth factor, nerve growth factor, fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, transforming growth factor, etc.

一部の実施形態では、増殖因子は、サイトカインである。サイトカインとして、限定はしないが、コロニー刺激因子、インターロイキン(IL−1(αおよびβ)、IL−2〜IL−13)ならびにインターフェロン(α、βおよびγ)が挙げられる。 In some embodiments, the growth factor is a cytokine. Cytokines include, but are not limited to, colony stimulating factors, interleukins (IL-1 (α and β), IL-2 to IL-13) and interferons (α, β and γ).

一部の実施形態では、抗体として、限定はしないが、大量に生産することが望ましい任意の種由来の免疫グロブリンが挙げられ、特に、抗体は、ヒト抗体であるのが好ましい。免疫グロブリンは、任意のクラス、すなわち、G、A、M、EまたはDのものであってよい。 In some embodiments, the antibody includes immunoglobulins from any species that are desirable, but not limited to, to be produced in large quantities, and in particular, the antibody is preferably a human antibody. The immunoglobulin may be of any class, i.e. G, A, M, E or D.

コード配列は、宿主細胞に対してネイティブまたは異種のいずれであってもよい。さらに、コード配列は、完全長タンパク質、または完全長タンパク質の短縮形態をコードし得る。本発明は、特定のコード配列に限定されないが、多数のコード配列を含み、これらは本発明のプロモータに作動可能に連結されている。 The coding sequence may be native or heterologous to the host cell. In addition, the coding sequence may encode a full-length protein, or a shortened form of the full-length protein. The present invention includes, but is not limited to, a number of coding sequences, which are operably linked to the promoter of the present invention.

E.シグナル配列
一部の実施形態では、特に目的のコード配列がセルラーゼ、プロテアーゼまたはデンプン分解酵素などの細胞外酵素をコードする場合、シグナル配列をコード配列のN−末端部分に連結してもよい。シグナルを用いてDNA配列の分泌を促進してもよい。シグナル配列は、宿主生物に対して内在性または外性のいずれであってもよい。シグナル配列は、コードされたポリペプチドと正常に結合しているものであってよい。一部の実施形態では、シグナル配列は、国際公開第2011/014278号パンフレットおよび同第2010/123754号パンフレットに記載されているように、改変または修飾してもよく、これらの明細書は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、シグナル配列は、ストレプトマイセス(Streptomyces)セルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列を含む。一実施形態では、好ましいシグナル配列は、ストレプトマイセス・リビダンス(S.lividans)セルラーゼ、celAである(Bently et al.,(2002)Nature 417:141−147)。しかしながら、当業者であれば、宿主生物に発現および分泌させようとするタンパク質に応じて使用することができる多数のシグナル配列(例えば、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)アミラーゼシグナルペプチド)について知っている。
E. Signal Sequence In some embodiments, the signal sequence may be linked to the N-terminal portion of the coding sequence, especially if the coding sequence of interest encodes an extracellular enzyme such as a cellulase, protease or starch degrading enzyme. Signals may be used to stimulate the secretion of DNA sequences. The signal sequence may be either endogenous or extrinsic to the host organism. The signal sequence may be one that is normally bound to the encoded polypeptide. In some embodiments, the signal sequence may be modified or modified as described in WO 2011/014278 and 2010/123754, and these specifications are in whole. Incorporated herein by reference as. In some embodiments, the signal sequence comprises a signal sequence derived from the Streptomyces cellulase gene. In one embodiment, the preferred signal sequence is Streptomyces libidans cellulase, celA (Bentley et al., (2002) Nature 417: 141-147). However, those skilled in the art are aware of a number of signal sequences that can be used depending on the protein to be expressed and secreted by the host organism (eg, the Bacillus licheniformis amylase signal peptide). ..

F.DNA構築物およびベクター
目的のコード領域を含む本発明の核酸構築物は、確立された標準的方法、例えば、Beaucage and Caruthers,(1981)Tetrahedron Letters 22:1859−1869により記載のホスホロアミダイト法、またはMatthes et al.,(1984)EMBO Journal 3:801−805により記載の方法により、合成的に調製することができる。核酸構築物は、混合合成およびゲノム起源であってもよく、合成またはゲノムDNAの断片を連結することにより調製してもよい。核酸構築物はまた、例えば、米国特許第4,683,202号明細書またはSaiki et al.,Science 239(1988),487−491に記載されているような特定のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により調製してもよい。
F. DNA Constructs and Vectors Nucleic acid constructs of the invention comprising coding regions of interest are described by established standard methods such as BEAUCAGE and Carriers, (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869, or the phosphoramidite method, or Mattes. et al. , (1984) EMBO Journal 3: 801-805 can be prepared synthetically by the method described. Nucleic acid constructs may be of mixed synthesis and genomic origin, or may be prepared by ligation of synthetic or genomic DNA fragments. Nucleic acid constructs are also described, for example, in US Pat. No. 4,683,202 or Saiki et al. , Science 239 (1988), 487-491, and may be prepared by a polymerase chain reaction using specific primers.

本発明のDNA構築物は、発現ベクターなどのベクターに挿入してもよい。真菌、酵母および細菌におけるポリペプチドのクローニング、形質転換および発現に好適な様々なベクターが当業者に周知である。典型的に、ベクターまたはカセットは、本発明のプロモータ、任意選択でシグナル配列、目的のコード領域およびターミネータ配列を含む。好ましい実施形態では、ベクターは、シグナル配列とターミネータ配列との間に位置する1つまたは複数のクローニング部位を含む。 The DNA construct of the present invention may be inserted into a vector such as an expression vector. Various vectors suitable for cloning, transformation and expression of polypeptides in fungi, yeasts and bacteria are well known to those of skill in the art. Typically, the vector or cassette comprises the promoter of the invention, optionally a signal sequence, a coding region of interest and a terminator sequence. In a preferred embodiment, the vector comprises one or more cloning sites located between the signal sequence and the terminator sequence.

G.形質転換
本発明のベクターは、宿主細胞に形質転換する。一般的形質転換技術は、当該技術分野において公知である(Ausubel et al.,1994, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYおよびCampbell et al.,1989 Curr.Genet 16:53−56)。これらの一般的技術のいくつかは、限定はしないが、粒子もしくは遺伝子ガン(微粒子銃)の使用、形質転換プロセス前の糸状真菌細胞壁の透過化(例えば、高濃度のアルカリ、例えば、0.05M〜0.4M CaClもしくは酢酸リチウムの使用により)、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、またはアグロバクテリウム(agrobacterium)媒介形質転換(米国特許第6,255,115号明細書)を含み、また、ポリエチレングリコールおよびCaCl.sub.2によるプロトプラストもしくはスフェロプラストの処理がCampbell,et al.,(1989)Curr.Genet.16:53−56,1989およびPenttila,M.et al.,(1988)Gene,63:11−22に記載されている。
G. Transformation The vector of the present invention transforms into a host cell. General transformation techniques are known in the art (Ausube et al., 1994, CURRETT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY and Campbell et al., 1989 Curr. Genet 16: 53-56). Some of these common techniques, but are not limited to, the use of particles or gene guns (fine particle guns), permeation of the filamentous fungal cell wall prior to the transformation process (eg, high concentrations of alkali, eg 0.05 M). Includes ~ 0.4M CaCl 2 or lithium acetate), protoplast fusion, electroporation, or Agrobacterium-mediated transformation (US Pat. No. 6,255,115) and polyethylene. Glycol and CaCl. sub. Treatment of protoplasts or spheroplasts according to 2 is performed by Campbell, et al. , (1989) Curr. Genet. 16: 53-56, 1989 and Pentilla, M. et al. et al. , (1988) Gene, 63: 11-22.

細菌のための形質転換および発現方法は、Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi and Matteuzzi,(1990),FEMS Microbiol.Lett.55:135−138に開示されている。プロテアーゼ欠失バチルス属(Bacillus)株についての好ましい一般的形質転換および発現プロトコルは、Ferrariら、米国特許第5,264,366号明細書に提供されている。 Transformation and expression methods for bacteria are described in Brigiti, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzi, (1990), FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138. Preferred general transformation and expression protocols for protease-deficient Bacillus strains are provided by Ferrari et al., US Pat. No. 5,264,366.

ストレプトマイセス属(Streptomyces)における形質転換および発現は、Hopwood et al.,GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES:A LABORATORY MANUAL,(1985)John Innis Foundation,Norwich UKに見出すことができる。 Transformation and expression in the genus Streptomyces can be found in Hopwood et al. , GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES: A LABORATORY MANUAL, (1985) John Innes Foundation, Norwich UK.

他の実施形態において、アスペルギルス属(Aspergillus)およびトリコデルマ属(Trichoderma)における形質転換および発現は、例えば、米国特許第5,364,770号明細書;米国特許第6,022,725号明細書;およびNevalainen et al.,1992,The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes,in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY,Eds.Leon and Berka,Marcel Dekker,Inc.pp.129−148に記載されている。 In other embodiments, transformation and expression in Aspergillus and Trichoderma are described, for example, in US Pat. No. 5,364,770; US Pat. No. 6,022,725; And Neverainen et al. , 1992, The Molecular Biology of Trichoderma and it Applications to the Expression of Both Homology and Heterologous Genes, in MOLECULAR IND. Leon and Berka, Marcel Dekker, Inc. pp. 129-148.

H.宿主細胞
本発明に従って使用することができる宿主細胞は、細菌および真菌細胞の両方を含む。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス属(Aspergillus)およびトリコデルマ属(Trichoderma)細胞などの糸状真菌細胞が挙げられる。好ましい細菌宿主細胞は、グラム陽性およびグラム陰性細胞の両方を含み、例えば、バチルス属(Bacillus)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、アクチノマイセス属(Actinomyces)およびストレプトマイセス属(Streptomyces)細胞が挙げられる。宿主細胞は、限定はしないが、大腸菌(E.coli)、シュードモナス属(Pseudomonas)種(例えば、緑膿菌(P.aeruginosa)およびシュードモナス・アルカリゲネス(P.alcaligenes))、ストレプトマイセス属(Streptomyces)種(例えば、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans))、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サーキュランス(B.circulans)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)も含む。
H. Host cells Host cells that can be used in accordance with the present invention include both bacterial and fungal cells. Preferred fungal host cells include filamentous fungal cells such as Aspergillus and Trichoderma cells. Preferred bacterial host cells include both Gram-positive and Gram-negative cells, such as Bacillus, Mycobacterium, Actinomyces and Streptomyces cells. Can be mentioned. Host cells include, but are not limited to, E. coli, Bacillus Pseudomonas species (eg, Bacillus P. aeruginosa and Bacillus Psudomonas), Streptomyces. ) Species (eg, Streptomyces libidans), Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis. ), Bacillus stearothermofilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus coagulans, Bacillus coagulans. Also includes (B. circulans), Bacillus lautus, Bacillus megaterium, and Bacillus turingiensis.

I.細胞培養物
宿主細胞および形質転換細胞を従来の栄養培地で培養することができる。形質転換宿主細胞の培地は、プロモータを活性化し、形質転換体を選択するために、必要に応じて修飾してもよい。温度、pHなどの具体的な培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に使用されるものであってよく、当業者に明らかであろう。さらに、好ましい培養条件は、Sambrook,(1982)前掲;Kieser,T,M J.Bibb,M J.Buttner,K F Chater,and D.A.Hopwood(2000)PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS.John Innes Foundation,Norwich UK;Harwood,et al.,(1990)MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS,John Wileyなどの科学文献で、および/またはAmerican Type Culture Collection(ATCC;“http://www.atcc.org/”)から見出すことができる。トリコデルマ属(Trichoderma)細胞などの真菌宿主細胞の安定な形質転換体は、概して、その高速の増殖速度、または固体培地上にでこぼこではなく、滑らかな輪郭を有する円状コロニーの形成によって不安定な形質転換体から識別することができる。
I. Cell culture Host cells and transformed cells can be cultured in conventional nutrient media. The medium of the transformed host cell may optionally be modified to activate the promoter and select transformants. Specific culture conditions such as temperature, pH, etc. may be those used for the host cell selected for expression and will be apparent to those of skill in the art. Further preferred culture conditions are Sambrook, (1982), supra; Kieser, T, M. J. et al. Bibb, MJ. Buttner, K F Chatter, and D. A. Hopwood (2000) PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS. John Innes Foundation, Norwich UK; Harwood, et al. , (1990) in scientific literature such as MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS, John Wiley, and / or from the American Type Culture Collection (ATCC; "http://www.atcc.org/"). Stable transformants of fungal host cells, such as Trichoderma cells, are generally unstable due to their fast growth rate or the formation of circular colonies with smooth contours rather than bumps on solid medium. It can be identified from the transformant.

J.発現されたポリペプチドの回収
形質転換宿主細胞により産生されるポリペプチドは、遠心分離もしくは濾過により培地から宿主細胞を分離する、または必要であれば、細胞を破壊し、細胞画分および残屑から上清を取り出すなどの従来の方法によって培地から回収することができる。典型的には、清澄化後、上清または濾過物のタンパク質成分を塩、例えば、硫酸アンモニウムを用いて沈殿させる。次に、沈殿したタンパク質を可溶化した後、様々なクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびその他の当該技術分野で承認されている方法によって精製してもよい。
J. Recovery of Expressed Polypeptides Polypeptides produced by transformed host cells separate the host cells from the medium by centrifugation or filtration, or, if necessary, disrupt the cells and from the cell fraction and debris. It can be recovered from the medium by a conventional method such as taking out the supernatant. Typically, after clarification, the protein component of the supernatant or filtrate is precipitated with a salt, such as ammonium sulphate. The precipitated protein is then solubilized and then purified by various chromatography methods, such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, and other techniques approved in the art. May be good.

K.構築物アセンブリー
1つの一般的実施形態では、本発明は、DNA構築物をin vitroでアセンブリングするステップを含み、続いて、構築物が宿主ゲノムに組み込まれるように、この構築物をコンピテント宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus)宿主細胞)に直接クローニングする。例えば、いくつかの実施形態では、PCR融合および/または連結を使用してDNA構築物をin vitroでアセンブリングする。好ましい実施形態では、DNA構築物は、非プラスミドDNA構築物である。別の実施形態では、DNA構築物は、突然変異が導入されているDNAを含む。次に、この構築物を用いて宿主細胞を形質転換する。これに関して、宿主細胞(例えば、バチルス属(Bacillus))の高度にコンピテントな突然変異体を用いて細胞への構築物の直接クローニングを促進するのが好ましい。例えば、キシロース誘導性プロモータ(Pxyl−comK)の制御下でcomK遺伝子を担持するバチルス属(Bacillus)は、本明細書に記載するように、極めて高い効率で確実に形質転換することができる。細胞の形質転換には、当該技術分野で公知のいずれの好適な方法を用いてもよい。形質転換前にDNA構築物をベクター(すなわち、プラスミド)に挿入することができる。一部の好ましい実施形態では、適切な制限酵素(すなわち、DNA構築物を破壊しないもの)を用いて環状プラスミドを切断する。従って、一部の実施形態では、環状プラスミドは、本発明で用途が見出される。しかしながら、代替の実施形態では、線状プラスミドを用いる。一部の実施形態では、DNA構築物(すなわち、PCR産物)は、プラスミドDNAの存在なしに使用されている。
K. Construct Assembly In one general embodiment, the invention comprises assembling a DNA construct in vitro, followed by constructing the construct into a competent host cell (eg, for example) so that the construct is integrated into the host genome. It is cloned directly into the Bacillus host cell. For example, in some embodiments, PCR fusion and / or ligation is used to assemble DNA constructs in vitro. In a preferred embodiment, the DNA construct is a non-plasmid DNA construct. In another embodiment, the DNA construct comprises the DNA into which the mutation has been introduced. The host cell is then transformed with this construct. In this regard, it is preferred to facilitate direct cloning of the construct into the cell using highly competent mutants of the host cell (eg, Bacillus). For example, Bacillus, which carries the comK gene under the control of a xylose-induced promoter (Pxyl-comK), can be reliably transformed with extremely high efficiency, as described herein. Any suitable method known in the art may be used for cell transformation. The DNA construct can be inserted into a vector (ie, a plasmid) prior to transformation. In some preferred embodiments, the cyclic plasmid is cleaved with a suitable restriction enzyme (ie, one that does not destroy the DNA construct). Therefore, in some embodiments, the circular plasmid will find use in the present invention. However, in an alternative embodiment, a linear plasmid is used. In some embodiments, the DNA construct (ie, the PCR product) is used in the absence of plasmid DNA.

本発明およびその利点を詳しく説明するために、以下に具体的な実施例を記載するが、これらが本発明を説明するために提供され、その範囲を限定するものとして何ら解釈すべきではないことは理解されるであろう。 Specific examples are described below to illustrate the invention and its advantages, but they are provided to illustrate the invention and should not be construed as limiting its scope. Will be understood.

DNAコンストラクトがベクターに組み込まれようと、あるいはプラスミドDNAの非存在下に使用されようと、それは微生物を形質転換させるために使用される。適切ないかなる形質転換方法も、本発明で使用されると考えられる。実施形態では、DNAコンストラクトの少なくとも1つのコピーは、宿主バチルス属(Bacillus)の染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明の1種以上のDNAコンストラクトが、宿主細胞の形質転換に使用される。 Whether the DNA construct is integrated into the vector or used in the absence of plasmid DNA, it is used to transform microorganisms. Any suitable transformation method is believed to be used in the present invention. In embodiments, at least one copy of the DNA construct is integrated into the chromosome of the host Bacillus. In some embodiments, one or more DNA constructs of the invention are used for transformation of host cells.

以下の実施例は、本発明の特定の実施例および態様を実証し、かつさらに詳しく説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。 The following examples are provided to demonstrate and further illustrate specific examples and embodiments of the invention and should not be construed as limiting their scope.

以下の実験の開示において、次の略語のいくつかが用いられる:℃(摂氏温度);rpm(毎分の回転数);μg(マイクログラム);mg(ミリグラム);μl(マイクロリットル);ml(ミリリットル);mM(ミリモル);μM(マイクロモル);sec(秒);min(分);hr(時間);OD280(280nmにおける光学濃度);OD600(600nmにおける光学濃度);PCR(ポリメラーゼ連鎖反応);RT−PCR(逆転写PCR);SDS(ドデシル硫酸ナトリウム):Abs(吸光度)。 In the disclosure of the following experiments, some of the following abbreviations are used: ° C. (temperature in degrees Celsius); rpm (rotations per minute); μg (micrograms); mg (milligrams); μl (microliters); ml (Milliliter); mM (mmol); μM (micromol); sec (seconds); min (minutes); hr (hours); OD 280 (optical density at 280 nm); OD 600 (optical density at 600 nm); PCR ( Polymerase chain reaction); RT-PCR (reverse transcription PCR); SDS (sodium dodecyl sulfate): Abs (absorbency).

実施例1
aprE5’UTRによるバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ(LAT)の産生向上
ネイティブLATプロモータ、LAT5’UTR、LATシグナルペプチド配列およびLAT転写ターミネータと共に、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)α−アミラーゼ(LAT)遺伝子を含有する発現構築物を、米国特許第7968691号明細書に記載される通りにpICatHベクターのXhoI部位にクローニングした。LAT発現カセット(XhoI断片)を配列番号1に示す。
Example 1
Improved production of Bacillus licheniformis α-amylase (LAT) by aprE5'UTR Bacillus licheniformis α-amylase with native LAT promoter, LAT5'UTR, LAT signal peptide sequence and LAT transcription terminator The expression construct containing the (LAT) gene was cloned into the XhoI site of the pICatH vector as described in US Pat. No. 7,968691. The LAT expression cassette (XhoI fragment) is shown in SEQ ID NO: 1.

LAT前駆体遺伝子は斜体で示し、LAT5’UTRは太字で示す(配列番号1)。

Figure 0006858704
The LAT precursor gene is shown in italics and the LAT5'UTR is shown in bold (SEQ ID NO: 1).
Figure 0006858704

米国特許第7,968,691号明細書に記載の通り、pICatH−LATori1プラスミド(図1を参照)をバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)株BML780のゲノムに形質転換した。切除した後、最大50ppmクロラムフェニコールまでの発現カセットの増幅が、LAT5’UTR株におけるLAT産生に最適であることが証明された。 As described in US Pat. No. 7,968,691, the pICatH-LATori1 plasmid (see FIG. 1) was transformed into the genome of Bacillus licheniformis strain BML780. After excision, amplification of the expression cassette up to 50 ppm chloramphenicol proved optimal for LAT production in the LAT5'UTR strain.

融合PCR技術により、pICatH−LATori1中のLAT5’UTRをバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)aprE5’UTRで置換した。5’末端に別のグアニンを有するバチルス・サブチリス(B.subtilis)aprE5’UTRのヌクレオチド配列を配列番号2に記載する。
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGA
The LAT5'UTR in pICatH-LATori1 was replaced with Bacillus subtilis aprE5'UTR by fusion PCR technology. The nucleotide sequence of Bacillus subtilis aprE5'UTR with another guanine at the 5'end is set forth in SEQ ID NO: 2.
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCACTACTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGGTAAAGA

aprE5’UTR(XhoI−NotI断片)を含むLAT発現カセットを配列番号3に示す。LAT前駆体遺伝子は斜体で示し、aprE−5’UTRは太字で示す。

Figure 0006858704
The LAT expression cassette containing the aprE5'UTR (XhoI-NotI fragment) is shown in SEQ ID NO: 3. The LAT precursor gene is shown in italics and the aprE-5'UTR is shown in bold.
Figure 0006858704

aprE−5’UTRに融合したLAT(すなわち、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)AmyL)遺伝子を含有するpICatHプラスミドを形質転換し、前述したように、株BML780のゲノムに組み込んだ。切除後、最大25ppmクロラムフェニコールまでの増幅が、aprE−5’UTR株におけるLAT産生に最適であることが証明された。 A pICatH plasmid containing the LAT (ie, Bacillus licheniformis AmyL) gene fused to the aprE-5'UTR was transformed and integrated into the genome of strain BML780 as described above. After resection, amplification up to 25 ppm chloramphenicol proved optimal for LAT production in the aprE-5'UTR strain.

生産培地(1リットル当たり:10gのデンプン、10gのソイトン(soytone)、10gの大豆粉、20gのグルコース、3.6gの尿素、0.75gのCaCl.2HO、21.75gのKHPO、17gのKHPO、MOPSバッファー、微量栄養素;pH6.8)で両方の株を増殖させることにより、株BML780−LAT−CAP50(LAT5’UTR)によるLATの産生をBML780−[aprE−5’UTR]−LAT−CAP25(aprE5’UTR)の産生と比較した。Inforsインキュベータ(37℃、300rpm)内で68時間の増殖後、上清中のLAT活性を、基質としてCeralphaを用いるMegazymeのα−アミラーゼアッセイキットにより、供給業者(Megazyme International,Ireland)の指示に従って決定した。活性、すなわち、生産性の相対数を表3に示す。 Production medium (per liter: 10 g of starch, 10 g of soytone (Soytone), 10 g of soy flour, glucose 20g, urea 3.6g, CaCl 2 .2H 2 O in 0.75 g, of 21.75 g K 2 BML780- [apprE] produced LAT by strain BML780-LAT-CAP50 (LAT5'UTR) by growing both strains with HPO 4 , 17 g KH 2 PO 4, MOPS buffer, micronutrients; pH 6.8). It was compared with the production of -5'UTR] -LAT-CAP25 (aprE5'UTR). After 68 hours of growth in an Infos incubator (37 ° C., 300 rpm), LAT activity in the supernatant is determined by Megazyme's α-amylase assay kit using Celalpha as a substrate, as directed by the supplier (Megazyme International, Ireland). did. The relative numbers of activity, i.e. productivity, are shown in Table 3.

Figure 0006858704
Figure 0006858704

実施例2
aprE5’UTRによるプルラナーゼPULm104の産生向上
PULm104は、N−末端104アミノ酸が欠失したバチルス・デラミフィカンス(Bacillus deramificans)プルラナーゼである。PULm104を産生するバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)株の構築は、米国特許第8354101号明細書に記載されている。米国特許第8354101号明細書に記載されている最良の産生株は、amyL(LAT)5’UTRを含有するBML780−PULm104−Ori1−CAP75であった。
Example 2
Improved production of pullulanase PULm104 by aprE5'UTR PULm104 is a Bacillus deramificans pullulanase lacking the N-terminal 104 amino acid. Construction of a Bacillus licheniformis strain that produces PULm104 is described in US Pat. No. 8,354,101. The best producing strain described in US Pat. No. 8354101 was BML780-PULm104-Ori1-CAP75 containing amyL (LAT) 5'UTR.

amyL(LAT)5’UTRは、以下に概説するように、aprE5’UTRで置換した。まず、プラスミドpHPLT−Blich−int−カセットをDNA2.0.Inc.(Menlo Park,CA,USA)によって合成により構築した。このプラスミドの設計は、ベクターpHPLT(米国特許第5871550号明細書)、ベクターpICatH(米国特許第8354101号明細書)およびバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)由来のaprE5’UTR、UTR V2またはUTR V3に基づいた(配列については以下の表))。ベクターpHPLT−Blich−int−カセットのマップは、図2に示す。 The amyL (LAT) 5'UTR was replaced with an aprE5'UTR as outlined below. First, the plasmid pHPLT-Blich-int-cassette was converted to DNA 2.0. Inc. (Menlo Park, CA, USA) constructed synthetically. The design of this plasmid is based on the vector pHPLT (US Pat. No. 5,871,550), the vector pICatH (US Pat. No. 8,354,101) and the aprE5'UTR, UTR V2 or UTR V3 from Bacillus subtilis. (The table below shows the sequence). A map of the vector pHPLT-Blich-int-cassette is shown in FIG.

5’aprE UTR−PULm104発現カセットのDNA配列を以下に示す(5’UTRは下線で示す)(配列番号11)。

Figure 0006858704
The DNA sequence of the 5'aprE UTR-PULm104 expression cassette is shown below (5'UTR is underlined) (SEQ ID NO: 11).
Figure 0006858704

Figure 0006858704
Figure 0006858704

次に、鋳型としてpHPLT−Blich−int−カセット(1ng/μl)を用いて、プライマーPULm104−Vector−RV(CGGTTTAGCAGCTGCGCTAGCTGCAGAATGAGGC(配列番号4)およびPULm104−Vector−FW(CGGCAAAAAATGAAAGCTTCTCGAGGTTAACAGAGG(配列番号5))でPCRを実施した。2回目のPCRは、鋳型としてBML780−PULm104−Ori1−CAP75の細胞材料を用いて、プライマーPulM104−Assbl.−FW(CAGCTAGCGCAGCTGCTAAACCGGCAGTCAGCAAC(配列番号6))およびPulM104−Assbl.−RV(CGAGAAGCTTTCATTTTTTGCCGTGGTCCGGGCTG(配列番号7))で実施した。いずれのPCRもNEB Q5標準プロトコル、26サイクルに従って実施した。 Next, using the pHPLT-Blicch-int-cassette (1 ng / μl) as a template, the primers PULm104-Vector-RV (CGGTTTAGCAGCTGCGCTAGCTGGCAGAATGAGGC (SEQ ID NO: 4) and PULm104-Vector-FW (CGGCAAAAAAGTAC) SEQ ID NO. In the second PCR, the cell material of BML780-PULm104-Ori1-CAP75 was used as a template, and the primers PulM104-Assbl. (SEQ ID NO: 7)). All PCRs were performed according to the NEB Q5 standard protocol, 26 cycles.

PULm104断片をカラム精製し、まず、HindIII(NEB)で完全に消化し、次にNheI(NEB)で部分的に消化した。ベクター断片もカラム精製し、NheIおよびHindIIIで完全に消化した。ベクターおよびPULm104消化混合物の両方を再度精製した後、RocheT4ラピッドライゲーションキット(♯11635379001)を用いて連結した。RCA増幅(GE Healthcare Life SciencesからのTempliPhi DNA Amplification Kit)後、RCA産物をコンピテントバチルス・サブチリス(B.subtilis)細胞に形質転換し、5ppmクロラムフェニコールと10ppmネオマイシンとを含有するHeart Infution寒天(Difco)上に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、形質転換プレートからの24cfuを、5ppmクロラムフェニコールと10ppmネオマイシンとを含有する新鮮なHeart Infution寒天プレート上で2回反復して複製し、一晩インキュベートした。翌朝、100mM NaAc pH5中の0.1%AZCL−プルランを含有する1%寒天の層でプレートを被覆した。プレートを37℃で3時間インキュベートし、ハロ陽性(プルラナーゼ陽性)をレプリカプレートから採取し、5ppmクロラムフェニコールと10ppmネオマイシンとを含有する10mlのTSBに増殖させた。2mlの培養物を用いてプラスミドDNAを調製し、30μlのDNAプレップをNotIおよびApaIにより消化した。5’反復配列−catH−PULm104発現カセットを含有する4kb断片をゲルから精製し、自己連結させ(T4リガーゼRoche)、RCA増幅した後、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)株BML780に形質転換した。7.5ppmのクロラムフェニコールを含有するHeart Infution寒天上での選択後、前述したように、AZCL−プルラン被覆法を用いてプルラナーゼ活性について形質転換体を確認した。4プルラナーゼ陽性クローン中の発現カセットの配列をDNA配列決定により確認した(BaseClear,The Netherlands)。発現カセットは、米国特許第8354101号明細書に記載のように増幅した。25ppmクロラムフェニコールまでの増幅は、aprE5’UTR株におけるプルラナーゼ生産に最適であることが証明され、BML780−[aprE−5’UTR]−PULm104−Ori1−CAP25株をさらなる試験で使用した。 The PULm104 fragment was column purified and first completely digested with HindIII (NEB) and then partially digested with NheI (NEB). Vector fragments were also column purified and completely digested with NheI and HindIII. Both the vector and the PULm104 digestion mixture were repurified and then ligated using the RocheT4 rapid ligation kit (# 11635379001). After RCA amplification (Templiphi DNA Amplification Kit from GE Healthcare Life Sciences), the RCA product is transformed into competent Bacillus subtilis (B. subtilis) cells, containing 5 ppm chloramphenicol and 10 ppm neomycin. It was applied on (Difco) and incubated overnight at 37 ° C. The next day, 24 cfu from the transforming plate was replicated twice on a fresh Heart Information agar plate containing 5 ppm chloramphenicol and 10 ppm neomycin and incubated overnight. The next morning, the plate was coated with a layer of 1% agar containing 0.1% AZCL-pullulan in 100 mM NaAc pH 5. The plates were incubated at 37 ° C. for 3 hours and halo positives (pullanase positive) were harvested from replica plates and grown on 10 ml TSBs containing 5 ppm chloramphenicol and 10 ppm neomycin. Plasmid DNA was prepared using 2 ml of culture and 30 μl of DNA prep was digested with NotI and ApaI. A 4 kb fragment containing the 5'repeated sequence-catH-PULm104 expression cassette was purified from the gel, self-ligated (T4 ligase Roche), RCA amplified and then transformed into the Bacillus licheniformis strain BML780. After selection on Heart Information agar containing 7.5 ppm chloramphenicol, transformants were confirmed for pullulanase activity using the AZCL-pullulan coating method as described above. The sequence of the expression cassette in the 4-pullulanase-positive clone was confirmed by DNA sequencing (BaseClear, The Netherlands). The expression cassette was amplified as described in US Pat. No. 8,354,101. Amplification up to 25 ppm chloramphenicol proved optimal for pullulanase production in the aprE5'UTR strain, and the BML780- [aprE-5'UTR] -PULm104-Ori1-CAP25 strain was used in further testing.

生産培地(実施例1を参照)で両方の株を増殖させることにより、株BML780−PULm104−Ori1−CAP75(LAT5’UTR)によるPULm104の産生をBML780−[aprE−5’UTR]−PULm104−Ori1−CAP25(aprE5’UTR)の産生と比較した。Inforsインキュベーションシェーカでの68時間の増殖(300ppm、37℃)後、上清中のプルラナーゼ活性を、基質としてレッド−プルランを用いるMegazymeのプルラナーゼアッセイにより、供給業者(Megazyme International,Ireland)の指示に従って決定した。活性、すなわち生産性の相対数を表4に示す。5’aprE UTRのバージョン2および3は、同等のタンパク質産生を示した。 BML780- [aprE-5'UTR] -PULm104-Ori1 produced PULm104 by strain BML780-PULm104-Ori1-CAP75 (LAT5'UTR) by growing both strains in production medium (see Example 1). -Compared to the production of CAP25 (aprE5'UTR). After 68 hours of growth in an Infos Incubation Shaker (300 ppm, 37 ° C.), pullulanase activity in the supernatant is determined by Megazyme pullulanase assay using red-pullulan as a substrate according to the instructions of the supplier (Megazyme International, Ireland). did. The relative numbers of activity, i.e. productivity, are shown in Table 4. Versions 2 and 3 of the 5'aprE UTR showed comparable protein production.

Figure 0006858704
Figure 0006858704

実施例3
リボソームRNAプロモータと共にaprE5’UTRを用いる目的タンパク質の産生向上
リボソームRNAプロモータ(例えば、P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnEまたはP3 rrnE)またはリボソームタンパク質プロモータ(例えば、PrpsD、P1 rpsJ、P2 rpsJ)またはシグマ因子プロモータ(例えば、PrpoD)、aprE5’UTR、本明細書に記載する好適なシグナル配列(例えば、LAT、aprE、CBH1、ストレプトマイセス(Streptomyces)セルラーゼ遺伝子シグナル配列)、本明細書に記載する目的の好適な遺伝子ならびに転写ターミネータを含む発現構築物は、好適なベクター(例えば、pICatH)の好適な制限部位(例えば、XhoI)にクローニングする。発現カセットを配列番号12および13に示す。
Example 3
Improving production of target protein using aprE5'UTR with ribosomal RNA promoter Ribosomal RNA promoter (eg, P1 rrnB, P1 rrnI, P2 rrnI, P1 rrnE, P2 rrnE or P3 rrnE) or ribosomal protein promoter (eg, PrpsD, P1 rpsD, P1 P2 rpsJ) or sigma factor promoter (eg, PrpoD), aprE5'UTR, suitable signal sequences described herein (eg, LAT, aprE, CBH1, Streptomyces cellulase gene signal sequence), the present specification. An expression construct containing a suitable gene of interest as described herein as well as a transcription terminator is cloned into a suitable restriction site (eg, XhoI) of a suitable vector (eg, pICatH). Expression cassettes are shown in SEQ ID NOs: 12 and 13.

目的の遺伝子を含有するプラスミドベクターを好適な細菌株(例えば、前述した株BML780)のゲノムに形質転換して組み込む。 A plasmid vector containing the gene of interest is transformed and integrated into the genome of a suitable bacterial strain (eg, strain BML780 described above).

生産培地(例えば、1リットル当たり:10gのデンプン、10gのソイトン(soytone)、10gの大豆粉、20gのグルコース、3.6gの尿素、0.75gのCaCl.2HO、21.75gのKHPO、17gのKHPO、MOPSバッファー、微量栄養素;pH6.8)で株を増殖させることにより、細菌株による目的タンパク質の産生を様々な対照株と比較する。Inforsインキュベータ(37℃、300rpm)内で68時間の増殖後、上清中のタンパク質活性を決定する。 Production medium (e.g., per liter: 10 g of starch, 10 g of soytone (Soytone), 10 g of soy flour, glucose 20g, urea 3.6g, CaCl 2 .2H 2 O in 0.75 g, of 21.75g By growing the strain with K 2 HPO 4 , 17 g of KH 2 PO 4 , MOPS buffer, micronutrients; pH 6.8), the production of the target protein by the bacterial strain is compared to various control strains. After 68 hours of growth in an Infos incubator (37 ° C., 300 rpm), protein activity in the supernatant is determined.

rrnI P2プロモータ(バチルス・サブチリス(B.subtilis)由来)は小文字で示す。aprE5’UTRは太字かつ下線で示す。成熟コード鎖は斜体で示す。ストップ(STOP)コドンは太字で示す。転写ターミネータを保持する配列は下線で示す。 The rrnI P2 promoter (derived from Bacillus subtilis) is shown in lowercase. aprE5'UTR is shown in bold and underlined. The mature coding strand is shown in italics. Stop (STOP) codons are shown in bold. The sequence holding the transfer terminator is underlined.

rrnI P2プロモータ−aprE5’UTR−LATシグナルペプチド−成熟LAT発現構築物を以下に示す(配列番号12)。

Figure 0006858704
The rrnI P2 promoter-aprE5'UTR-LAT signal peptide-mature LAT expression construct is shown below (SEQ ID NO: 12).
Figure 0006858704

rrnI P2プロモータ−aprE5’UTR−LATシグナルペプチド−成熟PULm104発現構築物を以下に示す(配列番号13)。

Figure 0006858704
Figure 0006858704
The rrnI P2 promoter-aprE5'UTR-LAT signal peptide-mature PULm104 expression construct is shown below (SEQ ID NO: 13).
Figure 0006858704
Figure 0006858704

実施例4
aprE5’UTRおよびその変異体を用いたゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(G.stearothermophilus)アミラーゼ変異体の産生向上
標準的バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)組込みベクター、すなわち、LAT(バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)AmyL)プロモータの下流にゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(G.stearothermophilus)(AmyS)変異体遺伝子を含有するpKB360−CatHにおいて、LAT5’−UTR配列をAprE−WT 5’−UTRおよびAprE−V2−5’−UTRまたはAprE−V3−5’−UTRにより置換した(概略的プラスミドマップについては図3を参照)。発現カセットの配列を以下に示す。
Example 4
Improvement of production of Geobacillus stearomophilus amylase mutant using aprE5'UTR and its variants A standard Bacillus licheniformis integrated vector, that is, LAT (Bacillus licheniformis). ) AmyL) In pKB360-CatH containing the Geobacillus stearomophilus (AmyS) mutant gene downstream of the promoter, the LAT5'-UTR sequence was aprE-WT 5'-UTR and ApprE-V2-. Substituted with 5'-UTR or ApprE-V3-5'-UTR (see Figure 3 for a schematic plasmid map). The sequence of the expression cassette is shown below.

LATプロモータは小文字で示し;aprE5’UTRは太字かつ下線で示し;LATシグナルペプチドは小文字かつ下線で示し;AmyS変異体の成熟鎖は斜体で示し;ストップ(STOP)コドンは太字で示し;転写ターミネータを保持する配列は下線で示す。 LAT promoters are shown in lowercase; aprE5'UTR is shown in bold and underlined; LAT signal peptides are shown in lowercase and underlined; mature chains of AmyS variants are shown in italics; stop (STOP) codons are shown in bold; transcription terminators The sequence holding is underlined.

LATプロモータ−aprE5’UTR−LATシグナルペプチド−成熟AmyS変異体(配列番号14):

Figure 0006858704
LAT Promoter-aprE5'UTR-LAT Signal Peptide-Mature AmyS Mutant (SEQ ID NO: 14):
Figure 0006858704

LATプロモータ−V2_5’UTR−LATシグナルペプチド−成熟AmyS変異体(配列番号15):

Figure 0006858704
LAT Promoter-V2_5'UTR-LAT Signal Peptide-Mature AmyS Mutant (SEQ ID NO: 15):
Figure 0006858704

LATプロモータ−V3_5’UTR−LATシグナルペプチド−成熟AmyS変異体(配列番号16):

Figure 0006858704
LAT Promoter-V3_5'UTR-LAT Signal Peptide-Mature AmyS Mutant (SEQ ID NO: 16):
Figure 0006858704

形質転換後、プラスミドをバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)染色体上のcat遺伝子座に組み込んだ。続いて、ベクター配列の切除により、染色体中に組み込まれたcat−LAT−5’UTR−AmyS変異体発現カセットのみを残すことにより、「ループアウト(loop−out)」株を取得した。次に、これらの株にクロラムフェニコール濃度の段階的な増加(cap5、cap25、cap50、cap75μg/ml)に付すことにより、発現カセットを増幅した。分泌されたアミラーゼ活性を測定し、表5に示す。 After transformation, the plasmid was integrated into the cat locus on the Bacillus licheniformis chromosome. Subsequently, excision of the vector sequence yielded a "loop-out" strain by leaving only the cat-LAT-5'UTR-AmyS mutant expression cassette integrated into the chromosome. The expression cassette was then amplified by subjecting these strains to a gradual increase in chloramphenicol concentration (cap5, cap25, cap50, cap75 μg / ml). The secreted amylase activity was measured and shown in Table 5.

Figure 0006858704
Figure 0006858704

さらに、増幅後に発現カセットのコピー数を測定し、アミラーゼ産生と比較し、それらを表6にまとめる。 In addition, the copy number of the expression cassette is measured after amplification and compared to amylase production, which are summarized in Table 6.

Figure 0006858704
Figure 0006858704

このように、aprE5’UTRまたはその変異体を含む発現カセットは、LAT5’UTRと比較して、アミラーゼの同等の産生および分泌を達成するのにより少量のクロラムフェニコール濃度を必要とすることを認めることができる。換言すれば、より高い発現力価を達成するためにより少ない増幅が必要とされる。 Thus, expression cassettes containing the aprE5'UTR or variants thereof require lower amounts of chloramphenicol concentration to achieve equivalent production and secretion of amylase compared to LAT5'UTR. Can be admitted. In other words, less amplification is needed to achieve higher expression titers.

上述の組成物および方法は、明瞭な理解のために図面および実施例を通していくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、一定の変更形態および修正形態がなされ得ることは、本明細書に記載の教示に照らせば当業者に容易に明らかである。 The compositions and methods described above have been described in some detail through drawings and examples for clarity, but certain modifications and modifications without departing from the spirit or scope of the appended claims. It is readily apparent to those skilled in the art in light of the teachings described herein that this can be done.

従って、先の記述は単に本組成物および方法の原理を説明したものである。本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の組成物および方法の原理を具体化し、かつ本発明の趣旨および範囲に含まれる各種配置を当業者が考案できるであろうことは認識されるであろう。さらに、本明細書に記載の実施例および条件付き文言は全て、本組成物および本方法の原理、ならびに本発明者らによって技術の進展に寄与する概念について読者の理解を促進することを主に意図しており、またそのような具体的に記載された実施例および条件に限定されないと解されるべきである。さらに、本組成物および本方法の原理、態様および実施形態、ならびにそれらの具体的実施例を述べている本明細書中の全ての記述は、それらの構造的均等物および機能的均等物の両方を包含するものとする。さらに、そのような均等物には、現在知られている均等物、および将来開発される均等物、すなわち、構造に関わりなく同じ機能を有するように開発されるあらゆる要素がいずれも含まれるものとする。従って、本組成物および本方法の範囲は、本明細書に示され、記載されている例示の実施形態に限定されるものではない。 Therefore, the above description merely describes the principles of the composition and method. Although not expressly described or shown herein, those skilled in the art will be able to devise various arrangements that embody the principles of the compositions and methods of the invention and that fall within the spirit and scope of the invention. Will be recognized. Moreover, all of the examples and conditional language described herein are primarily intended to facilitate the reader's understanding of the composition and principles of the method, as well as concepts that contribute to the advancement of the art by the inventors. It should be understood that it is intended and is not limited to such specifically described examples and conditions. In addition, all descriptions herein that describe the principles, embodiments and embodiments of the composition and methods, as well as specific examples thereof, are both structural and functional equivalents thereof. Shall be included. Moreover, such equivalents include both currently known equivalents and future developed equivalents, that is, any element developed to have the same function regardless of structure. To do. Therefore, the scope of the composition and the method is not limited to the exemplary embodiments shown and described herein.

Claims (30)

5’から3’方向に、目的の遺伝子(GOI)をコードする核酸配列に作動可能に連結された5’非翻訳領域(5’UTR)核酸配列を含むDNA分子であって、5’UTRは、バチルス属(Bacillus)種aprEプロテアーゼ遺伝子から得られ、前記5’UTRは、前記5’UTRが作動可能に連結される前記GOIに対して異種であり、前記5’UTRは、配列番号9または10と少なくとも90%の配列同一性を有する配列からなり、前記DNA分子は、前記5’UTRと、前記目的の遺伝子(GOI)をコードする核酸配列と、を含む発現カセットを含むベクターで形質転換された修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞から発現された目的タンパク質の発現が、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結された前記5’UTRを含まない親バチルス属(Bacillus)宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも5%増加される活性をもたらす、DNA分子。 A DNA molecule containing a 5'untranslated region (5'UTR) nucleic acid sequence operably linked to a nucleic acid sequence encoding the gene of interest (GOI) in the 5'to 3'direction, where the 5'UTR is , The 5'UTR, obtained from the Bacillus species aprE protease gene, is heterologous to the GOI to which the 5'UTR is operably linked, and the 5'UTR is SEQ ID NO: 9 or 10 and Ri Do from sequence having at least 90% sequence identity, wherein the DNA molecule is transformed with a vector comprising an expression cassette comprising said 5'UTR, a nucleic acid sequence that encodes a gene (GOI) of the target, the The expression of the target protein expressed from the converted modified Bacillus host cell is operably linked to the nucleic acid sequence encoding the target protein, and the 5'UTR-free parent Bacillus is operably linked. A DNA molecule that results in an activity that is at least 5% increased relative to the expression of the same target protein expressed from the host cell. 前記5’UTRは、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)由来のaprE遺伝子から得られる、請求項1に記載のDNA分子。 The DNA molecule according to claim 1, wherein the 5'UTR is obtained from the aprE gene derived from Bacillus subtilis. 前記5’UTRは、配列番号9または10と少なくとも95%の配列同一性を有する配列からなる、請求項1または2に記載のDNA分子。 The DNA molecule of claim 1 or 2, wherein the 5'UTR comprises a sequence having at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 9 or 10. 請求項1〜のいずれか一項に記載のDNA分子を含む発現カセット。 An expression cassette containing the DNA molecule according to any one of claims 1 to 3. 請求項に記載の発現カセットを含む宿主細胞。 A host cell containing the expression cassette according to claim 4. 請求項1〜のいずれか一項に記載のDNA分子を含むベクター。 A vector containing the DNA molecule according to any one of claims 1 to 3. 請求項に記載のベクターを含む宿主細胞。 A host cell comprising the vector according to claim 6. 請求項1〜のいずれか一項に記載のDNA分子を含む宿主細胞。 A host cell containing the DNA molecule according to any one of claims 1 to 3. 前記宿主細胞は、バチルス属(Bacillus)種である、請求項またはのいずれか一項に記載の宿主細胞。 The host cell according to any one of claims 5 , 7 or 8 , wherein the host cell is a Bacillus species. 前記バチルス属(Bacillus)種は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・コアギュランス(B.coagulans)、バチルス・サークランス(B.circulans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・クラウジイ(B.clausii)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)からなる群から選択される、請求項に記載の宿主細胞。 The Bacillus species are Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus bacillis. B. brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, B. coagulans, Bacillus circulans, Bacillus Select from the group consisting of B. pumilus, Bacillus lautus, Bacillus clausii, Bacillus megaterium, and Bacillus turingiensis. The host cell according to claim 9. 前記バチルス属(Bacillus)種は、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)である、請求項10に記載の宿主細胞。 The host cell according to claim 10 , wherein the Bacillus species is B. licheniformis. 前記目的の遺伝子は、酵素をコードする、請求項1〜のいずれか一項に記載のDNA分子。 The DNA molecule according to any one of claims 1 to 3 , wherein the gene of interest encodes an enzyme. 前記目的の遺伝子は、野生型バチルス属(Bacillus)種酵素または変異型バチルス属(Bacillus)種酵素をコードする、請求項1に記載のDNA分子。 Gene of interest encodes a wild-type Bacillus (Bacillus) species enzyme or mutant Bacillus (Bacillus) species enzymes, DNA molecule of claim 1 2. 前記酵素は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される、請求項1に記載のDNA分子。 The enzymes include acyltransferase, α-amylase, β-amylase, α-galactosidase, arabinosidase, arylesterase, β-galactosidase, caraginase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chondroitinase, cutinase, endo-β-. 1,4-Glucanase, endo-β-mannase, esterase, exo-mannase, galactanase, glucoamylase, hemicellulase, hyaluronidase, keratinase, lacquerase, lactase, ligninase, lipase, lipoxygenase, mannase, oxidase, pectinate lyase, pectin Acetylesterase, pectinase, pentosanase, peroxidase, phenoloxidase, phosphatase, phospholipase, phytase, polygalacturonase, protease, pluranase, reductase, ramnogalacturonase, β-glucanase, tanase, transglutaminase, xylanacetyl-esterase, xylanase , xyloglucanase, and is selected from the group consisting of xylosidase, DNA molecule of claim 1 2. 前記酵素は、アミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項1に記載のDNA分子。 The enzyme is amylase or pullulanase, DNA molecule of claim 1 2. バチルス属(Bacillus)宿主細胞において目的タンパク質の発現を増加させる方法であって、好適な培地中で修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞を増殖させて前記目的タンパク質を発現させるステップを含み、前記修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞は、5’から3’方向に、少なくとも(i)バチルス属(Bacillus)種由来のaprE−5’UTR、と(ii)前記目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、前記aprE−5’UTRは、配列番号9または10と少なくとも90%の配列同一性を有する配列からなり、前記目的タンパク質の前記発現は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたaprE−5’UTRを含まない親バチルス属(Bacillus)宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも5%増加される、方法。 A method of increasing the expression of a protein of interest in a Bacillus host cell, comprising the step of growing a modified Bacillus host cell in a suitable medium to express the protein of interest. A genus (Bacillus) host cell expresses in a 5'to 3'direction, comprising at least (i) an aprE-5'UTR from a Bacillus species, and (ii) a nucleic acid sequence encoding the protein of interest. Transformed with a vector containing a cassette, the aprE-5'UTR consists of a sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 9 or 10, and the expression of the protein of interest encodes the protein of interest. the nucleic parent Bacillus that does not contain an operably linked aprE-5'UTR in sequence (Bacillus) is at least 5% increase pressure against the same target protein expressed from host cell expression method. 増幅のために50ppm以下のクロラムフェニコールを用いて、修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞で目的タンパク質の発現を増加させる方法であって、好適な培地中で修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞を増殖させて前記目的タンパク質を発現させるステップを含み、前記修飾バチルス属(Bacillus)宿主細胞は、5’から3’方向に、(i)バチルス属(Bacillus)種由来のaprE−5’UTRと、(ii)前記目的タンパク質をコードする核酸配列とを含む発現カセットを含むベクターで形質転換され、前記aprE−5’UTRは、配列番号9または10と少なくとも90%の配列同一性を有する配列からなり、前記目的タンパク質の前記発現は、前記目的タンパク質をコードする前記核酸配列に作動可能に連結されたaprE−5’UTRを含まない親バチルス属(Bacillus)宿主細胞から発現された同じ目的タンパク質の発現に対して少なくとも5%増加される、方法。 A method of increasing the expression of a protein of interest in a modified Bacillus host cell using 50 ppm or less of chloramphenicol for amplification, wherein the modified Bacillus host cell is used in a suitable medium. Including the step of proliferating to express the target protein, the modified Bacillus host cell is arranged in the 5'to 3'direction with (i) an aprE-5'UTR derived from the Bacillus species. (Ii) Transformed with a vector containing an expression cassette containing the nucleic acid sequence encoding the protein of interest, the aprE-5'UTR comprises a sequence having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 9 or 10. , The expression of the protein of interest is the expression of the same protein of interest expressed from a parent Bacillus host cell operably linked to the nucleic acid sequence encoding the protein of interest. A method that is increased by at least 5% against. 前記aprE−5’UTRは、バチルス・サブチリス(B.subtilis)に由来する、請求項1または1に記載の方法。 The method according to claim 16 or 17 , wherein the aprE-5'UTR is derived from Bacillus subtilis. 前記aprE−5’UTRは、配列番号9または10と少なくとも95%の配列同一性を有する配列からなる、請求項1〜1のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 18 , wherein the aprE-5'UTR comprises a sequence having at least 95% sequence identity with SEQ ID NO: 9 or 10. リボソームRNA遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , further comprising a promoter derived from the ribosomal RNA gene. 前記リボソームRNA遺伝子プロモータは、P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnEおよびP3 rrnEからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。 The ribosomal RNA gene promoter, P1 rrnB, P1 rrnI, P2 rrnI, P1 rrnE, P2 is selected from the group consisting of rrnE and P3 rrnE, The method of claim 2 0. リボソームタンパク質遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , further comprising a promoter derived from a ribosomal protein gene. 前記リボソームタンパク質遺伝子プロモータは、PrpsD、P1 rpsJ、P2 rpsJおよびPrpoDからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。 The ribosomal protein gene promoter, PrpsD, P1 rpsJ, P2 rpsJ and is selected from the group consisting of PrpoD, The method of claim 2 2. LAT(AmyL)遺伝子由来のプロモータをさらに含む、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , further comprising a promoter derived from the LAT (AmyL) gene. 前記目的タンパク質を前記培地から回収するステップをさらに含む、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , further comprising the step of recovering the target protein from the medium. 前記目的タンパク質は、前記細菌から分泌される、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , wherein the target protein is secreted from the bacterium. 前記目的タンパク質は、前記細菌内に蓄積する、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , wherein the target protein accumulates in the bacterium. 前記目的タンパク質は、野生型バチルス属(Bacillus)種酵素または変異型バチルス属(Bacillus)種酵素である、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 16 to 19 , wherein the target protein is a wild-type Bacillus seed enzyme or a mutant Bacillus seed enzyme. 前記目的タンパク質は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−1,4−グルカナーゼ、エンド−β−マンナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、およびキシロシダーゼからなる群から選択される酵素である、請求項119のいずれか一項に記載の方法。 The target proteins are acyltransferase, α-amylase, β-amylase, α-galactosidase, arabinosidase, arylesterase, β-galactosidase, caraginase, catalase, cellobiohydrolase, cellulase, chondroitinase, cutinase, endo-β. -1,4-glucanase, endo-β-mannase, esterase, exo-mannase, galactanase, glucoamylase, hemicellulase, hyaluronidase, keratinase, lacquerase, lactase, ligninase, lipase, lipoxygenase, mannase, oxidase, pectinase, lyase, Pectinacetylesterase, pectinase, pentosanase, peroxidase, phenoloxidase, phosphatase, phosphorlipase, phytase, polygalacturonase, protease, purlanase, reductase, ramnogalacturonase, β-glucanase, tannase, transglutaminase, xylanacetyl-esterase, The method according to any one of claims 16 to 19 , which is an enzyme selected from the group consisting of xylanase, xyloguelucanase, and xylosidase. 前記酵素は、アミラーゼまたはプルラナーゼである、請求項2又は29に記載の方法。 The enzyme is amylase or pullulanase method of claim 2 8, or 29.
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