JP6850254B2 - 干渉を減少させるための方法 - Google Patents

Description

本発明は、分析物を含むと推測される試料において、該分析物を決定するための方法であって、ａ）試料と、分析物に関する少なくとも第一および第二の捕捉化合物を接触させ、ここで該第一および第二の捕捉化合物は、同一でない捕捉化合物であり、そして該捕捉化合物は、該分析物への結合において競合する；ｂ）該試料と接触させた該捕捉化合物を、特定剤（ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ）と接触させ、ここで該特定剤は、該捕捉化合物への結合において、該分析物と競合する；ｃ）該特定剤および捕捉化合物を含む複合体の量を決定し；そしてｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、試料における該分析物を決定する工程を含む、前記方法に関する。本発明はさらに、分析物を決定するための間接的イムノアッセイの特異性を改善するための方法であって、同一でない捕捉化合物によって捕捉化合物の少なくとも１０％を置換する工程を含む；ここで置換された捕捉化合物は、該分析物への結合において、導入された捕捉化合物と競合する、前記方法に関する。本発明はさらに、前述の方法に関連するキット、デバイス、および使用に関する。

背景技術
実験室試験、特に免疫学的試験は、疾患の診断において、貴重なツールとなってきている。イムノアッセイは、特に、複雑な混合物、例えば体液、例えば血液または血漿における単一の分析物または分析物群を特異的に検出する可能性を提供してきた。しかし、イムノアッセイにおける干渉のいくつかの原因、例えばいくつかを挙げると、捕捉化合物と干渉物質の交差反応性、固相への検出化合物（ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の非特異的結合、捕捉化合物および検出化合物の異好性抗体または特にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）による「架橋」結合が同定されてきている（例えば、Ｐａｒｋ ＆ Ｋｒｉｃｋａ（２０１３）， ５．３章− Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ中（第４版）， Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ監修， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｏｘｆｏｒｄ： ４０３； Ｓｃｈｉｅｔｔｅｃａｔｔｅ（２０１２）， Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｒ． Ｎｏｒｍａｎ Ｈ．Ｌ． Ｃｈｉｕ（監修）を参照されたい）。

競合的イムノアッセイにおいて、試料中に含まれる分析物は、捕捉化合物への結合に関して、標識分析物（特定剤）と競合し、該標識分析物は、しばしば抗体であるか、または血清試料において、例えば病原体に対する抗体の存在を試験しようとする場合、前記病原体の抗原である。試料中の分析物濃度が高い場合、強い競合があり、捕捉化合物への特定剤の結合減少が導かれ、シグナル減少を引き起こし、これが、試験形式に応じて、定量的または定性的試験結果を導く。捕捉化合物として用いる抗原がまた、試料由来の干渉化合物によっても結合されうることが、イムノアッセイの不都合な点であることが当該技術分野に知られる。これらの干渉化合物は、捕捉化合物の結合エピトープに関して特定剤と競合する。競合がどのくらい重度であるかに応じて、偽試験結果が生じる可能性があり、それぞれのイムノアッセイの特異性減少を引き起こす。特異性のこの減少は、潜在的に多数のコンホメーションエピトープを含むいくつかのサブユニットからなりさえする、複雑な捕捉化合物、例えばウイルスカプシドを用いる場合、特に顕著でありうる。こうした場合、干渉除去の古典的な方法、例えば干渉化合物に関する代替ターゲットの添加は非効率的でありうる。

非競合イムノアッセイにおいて、分析物に特異的に結合し、そしてそれ自体が標識を所持するか、または標識を所持する第二の分子のターゲットであるかいずれかである化合物に、分析物を接触させることによって、分析物を検出する。したがって、非競合イムノアッセイにおいて、分析物の量は、分析物、および標識を所持する検出化合物の間で形成される複合体の量を決定することによって、決定される。したがって、上述のように、類似の特異性の問題に直面しうる。

免疫学的にわずかにしか異ならない抗原（例えば異なる発現系における産生、異なるアミノ酸配列、グリコシル化の相違、精製および再フォールディング法における相違、ならびに緩衝剤および保存条件における相違）は、干渉の個々の範囲を有する。したがって、抗原Ｘ１とのイムノアッセイにおける偽結果を導く試料は、抗原Ｘ２での試験において正しい結果を提供する可能性もあり、そして逆もまたありうる。したがって、抗原を異なる抗原に関して交換しても、しばしば特異性の改善につながらず、偽結果を導く試料の範囲が変化するのみである。

したがって、上述のような問題を回避して、改善されたイムノアッセイを提供することが本発明の目的である。

これらの問題は、独立請求項の特徴を持つ方法、キット、デバイス、および組成物によって解決される。単独の方式または任意の恣意的な組み合わせで達成されうる典型的な態様を、従属請求項に列挙する。

したがって、本発明は、分析物を含むと推測される試料において、該分析物を決定するための方法であって、
ａ）試料と、分析物に関する少なくとも第一および第二の捕捉化合物を接触させ、ここで該第一および第二の捕捉化合物は、同一でない捕捉化合物であり、そして該捕捉化合物は、該分析物への結合において競合する；
ｂ）該試料と接触させた該捕捉化合物を、特定剤と接触させ、ここで該特定剤は、該捕捉化合物への結合において、該分析物と競合する；
ｃ）該特定剤および捕捉化合物を含む複合体の量を決定し；そして
ｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、試料における該分析物を決定する
工程を含む、前記方法に関する。

以下に使用されるような用語「有する」、「含む」または「含まれる」、あるいは任意の恣意的なその文法的変型は、非排他的方式で用いられる。したがって、これらの用語は、これらの用語によって紹介される特徴に加えて、この背景で記載される実体において、さらなる特徴が存在しない状況、および１またはそれより多いさらなる特徴が存在する状況の両方を指すことも可能である。例として、表現「ＡはＢを有する」、「ＡはＢを含む」および「ＡにはＢが含まれる」は、Ａには、Ｂに加えて、他の要素が存在しない状況（すなわち単独で、そして排他的にＢからなる状況）、ならびに実体Ａには、Ｂに加えて、１またはそれより多いさらなる要素、例えば要素Ｃ、要素ＣおよびＤ、またはさらなる要素さえ存在する状況の両方を指すことも可能である。

さらに、以下に使用するような用語「好ましくは」、「より好ましくは」、「最も好ましくは」、「具体的に」、「より具体的に」、「特異的に」、「より特異的に」、または類似の用語は、別の可能性を制限することなく、場合による特徴と組み合わせて用いられる。したがって、これらの用語によって紹介される特徴は、場合による特徴であり、そしていかなる意味でも、請求項の範囲を制限するようには意図されない。本発明は、当業者が認識するであろうように、別の特徴を用いることによっても実行可能である。同様に、「本発明の態様において」または類似の表現によって紹介される特徴は、本発明の別の態様に関するいかなる制限も伴わず、本発明の範囲に関するいかなる制限も伴わず、そして本発明の他の場合によるまたは場合によらない特徴でのように紹介される特徴を組み合わせる可能性に関するいかなる制限も伴わずに、場合による特徴であることが意図される。用語「約」は、本発明の特定の値または比の背景において、前記値または比＋／−３０％、＋／−２０％、＋／−１０％、または１つの態様において所定の値または比の＋／−５％を指す。

本発明の方法は、１つの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。さらに、特に言及したものに加えて工程を含むことも可能である。特に、工程ｂ）は、試料を提供する工程を含むことも可能であるし、または工程ｃ）は結合および検出を容易にするため、さらなる化合物の添加を含むことも可能である。さらに、いくつかまたはすべての工程を自動化装置によって補助することも可能である。

本明細書において、用語「決定すること」は、試料において、本発明の方法によって決定しようとする分析物の少なくとも１つの免疫学的特徴を決定することを指す。本発明にしたがった免疫学的特徴は、１つの態様において、免疫学的手段によって、試料において分析物の検出を容易にする、分析物の構造的特徴である。１つの態様において、前記免疫学的特徴は、免疫学的手段による、分析物の同定を容易にし、さらなる態様において、定量化を容易にする。したがって、典型的な免疫学的特徴は、該分析物の、試料中の他の化学的化合物からの区別を容易にする特徴である。１つの態様において、分析物の決定は、分析物が、方法の検出限界を超える濃度で試料中に存在するかまたは存在しないかを確立する。検出限界を決定する方法は、当業者に知られる。さらなる態様において、決定は、試料における分析物の量または濃度を半定量的または定量的に決定することである。定量的決定に関しては、分析物の絶対量または正確な量が決定されるか、あるいは分析物の相対量が決定される。相対量は、分析物の正確な量が決定不可能であるかまたは決定できない場合に決定可能である。前記の場合には、分析物が存在する量が、第二の量の該分析物を含む第二の試料に対して、増加しているかまたは減少しているかを決定してもよい。

当業者に理解されるであろうように、典型的には、第一の捕捉化合物／分析物および第二の捕捉化合物／分析物複合体を別個に決定する必要はないであろう。したがって、１つの態様において、第一の捕捉化合物および分析物の複合体、ならびに第二の捕捉化合物および分析物の複合体を一緒に、すなわち前記の第一および前記の第二の捕捉化合物の間を区別せずに決定する。したがって、１つの態様において、第一の捕捉化合物または第二の捕捉化合物のいずれかを含む複合体中に存在する分析物の総量を決定する。

当業者によってさらに理解されるであろうように、分析物／捕捉化合物複合体の決定は、選択するアッセイ形式に応じるであろう。１つの態様において、アッセイは、競合的イムノアッセイ、典型的には競合的不均一イムノアッセイ、すなわち分析物が、固体表面に結合した捕捉化合物への結合に関して、該分析物の標識誘導体と競合し、そして該捕捉化合物に結合した該分析物の標識誘導体の量を決定するイムノアッセイである。１つの態様において、競合アッセイは、抗ＨＢｃ、抗ＨＡＶ（抗Ａ型肝炎ウイルス）、抗ＨＢｅ（抗Ｂ型肝炎ｅ抗原）、葉酸、葉酸ＲＢＣ（赤血球）、抗ＴＳＨ−Ｒ、全ビタミンＤ、ビタミンＢ１２、チロキシンＴ４、ＦＴ４（遊離チロキシン）、チロキシンＴ３、ＦＴ３（遊離トリヨードチロニン）、テストステロン、プロゲステロン、ジギトキシン、抗ＴＧ、抗ＴＰＯ（抗甲状腺ペルオキシダーゼ）、ＤＧＥＡ、またはエストラジオールに関するアッセイである。さらなる態様において、イムノアッセイは、二価分析物、例えば抗体が、固体表面に結合した捕捉化合物に結合し、そして分析物／捕捉化合物複合体への、本明細書において以下に明記するような検出化合物の結合によって、該分析物／捕捉化合物複合体の量を決定する、二重抗原サンドイッチアッセイ（「ＤＡＧＳ」）である。１つの態様において、ＤＡＧＳアッセイは、抗トキソプラズマＩｇＧ、抗風疹ＩｇＧ、抗ＨＢｓ １Ｇ、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎）、例えばＨＣＶＩＩ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ＩｇＧ、梅毒、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞リンパ増殖性ウイルス）、またはシャーガス（アメリカ・トリパノゾーマ症）に関するアッセイである。

用語「生物学的分子」は、当業者に知られ、そして典型的には、少なくとも１つの生物の代謝によって産生される分子に関する。したがって、用語「生物学的巨大分子」は、１つの態様において単量体前駆体から、生物によって産生されるポリマーに関する。典型的な生物学的巨大分子は、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは多糖である。

用語「分析物」は、本明細書において、分析物／捕捉化合物および／または検出化合物複合体の検出を可能にするために十分なアフィニティで、本発明の捕捉化合物および／または検出化合物に結合する化学的分子、１つの態様において、有機分子に関する。１つの態様において、分析物／リガンド複合体の解離定数（Ｋ_ｄ）は、最大１０^−７ｍｏｌ／Ｌ、さらなる態様において、最大１０^−８ｍｏｌ／Ｌ、さらなる態様において、最大１０^−９ｍｏｌ／Ｌである。１つの態様において、本発明の第一の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数、ならびに本発明の第二の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数は、５倍を超えては異ならず；１つの態様において、２倍を超えて異ならず；さらなる態様において１．５倍を超えて異ならない。１つの態様において、第一の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数は、第二の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数の７０％〜１３０％の値を有する。さらなる態様において、第一の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数は、第二の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数の８０％〜１２０％の値を有する。さらなる態様において、第一の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数は、第二の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数の９０％〜１１０％の値を有する。さらなる態様において、第一の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数、ならびに第二の捕捉化合物および分析物の間で形成される複合体の解離定数は、本質的に等しいかまたは等しい。１つの態様において、分析物は、少なくとも１００（１００原子質量単位、および１００Ｄａに対応し；１Ｄａは１．６６ｘ１０^−２７ｋｇに対応する）の分子量を有し、さらなる態様において、少なくとも２５０、さらなる態様において、少なくとも５００、またはさらなる態様において、少なくとも１０００の分子量を有する。１つの態様において、分析物は生物学的分子であり、さらなる態様において、分析物は生物学的巨大分子である。さらなる態様において、分析物はポリペプチドである。

１つの態様において、本発明の分析物がポリペプチドである場合、ポリペプチドは、感染性病原体、例えばウイルスまたは細菌によって産生される抗原、あるいは抗体、例えば感染性病原体によって産生される抗原に対して被験体によって産生される抗体である。１つの態様において、分析物はポリペプチド、さらなる態様において、ウイルス抗原に対する抗体、さらなる態様において、ウイルスポリペプチドに対する抗体、またはさらなる態様において、ウイルスカプシドポリペプチドに対する抗体である。１つの態様において、ウイルスカプシドポリペプチドは、肝炎ウイルスカプシドポリペプチド、１つの態様においてＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ）カプシドポリペプチド、またはさらなる態様において、ＨＢコア（ＨＢｃ）抗原である。したがって、分析物は、１つの態様において、肝炎ウイルスカプシドポリペプチドに対する、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ）カプシドポリペプチドに対する、典型的にはＨＢコア（ＨＢｃ）抗原またはＨＢｅ抗原に対する抗体である。１つの態様において、第一の捕捉化合物は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｑ１７ＵＴ２ ＧＩ：１２３８６７９４２（配列番号１）に示すようなＨＢｃ抗原である。さらなる態様において、第一の捕捉化合物は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｑ１７ＵＴ２ ＧＩ：１２３８６７９４２（Ｂ型肝炎ウイルスサブタイプａｄｗ２コア抗原、配列番号１）に示すようなＨＢｃ抗原であり、そして第二の捕捉化合物は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｐ０３１４７．１ ＧＩ：１１６９４７（Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ｄサブタイプａｄｗコア抗原、配列番号２）に示すようなＨＢｃ抗原である。さらなる態様において、第一および第二の捕捉化合物は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｐ０３１４８．３ ＧＩ：１６６２１５０７６、Ｐ０３１４９．１ ＧＩ：１１６９４５、ＮＰ＿６４７６０７．１ ＧＩ：２１３２６５８８、およびＡＹ１２３４２４．１ ＧＩ：２２２０３５１１によって同定されるＨＢｃＡｇタンパク質配列のような、当該技術分野に知られるＨＢｃ抗原配列より選択されるＨＢｃ抗原配列である。

１つの態様において、クローニングを容易にするため、各ＨＢＶコア抗原配列のＮおよび／またはＣ末端は、前記抗原配列のＮおよび／またはＣ末端アミノ酸を１〜５欠失させることによって短くされてもよい。さらなる態様において、ＨＢＶコア抗原の抗原特性に干渉することなく、２〜１５アミノ酸を含むタグを、抗原のＮ末端またはＣ末端のいずれかに、あるいは両端に付加することも可能である。

用語、ポリペプチドには、本明細書において、１つの態様において、特に示すポリペプチドの変異体および断片が含まれる。変異体には、特に示す、例えば配列番号１または２に示すアミノ酸配列に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。同一性パーセント値は、好ましくは、全アミノ酸配列領域に渡って計算される。多様なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、異なる配列を比較するため、当業者には利用可能である。この背景において、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈまたはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムは、特に信頼性がある結果を生じる。配列整列を実行するため、プログラムＰｉｌｅＵｐ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．， ２５， ３５１−３６０， １９８７、Ｈｉｇｇｉｎｓら， ＣＡＢＩＯＳ， ５ １９８９： １５１−１５３）またはプログラムＧａｐおよびＢｅｓｔＦｉｔ［ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８； ４４３−４５３ （１９７０））ならびにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２； ４８２−４８９ （１９８１））］が使用されるものとし、これらはＧＣＧソフトウェアパケットの一部である［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１ （１９９１）］。パーセント（％）で示す、上に言及する配列同一性値は、好ましくは、以下のセッティングで、全配列領域に渡って、プログラムＧＡＰを用いて決定されるものとする：ギャップ荷重：５０、長さ荷重：３、平均マッチ１０．０００および平均ミスマッチ：０．０００、これらは別に明記しない限り、配列整列に関して標準的なセッティングとして、常に用いられるものとする
任意の上述のポリペプチド配列の断片を含むポリペプチドもまた、１つの態様において、本発明のポリペプチドとして含まれる。断片は、なお上に明記するような捕捉化合物または検出化合物のものを有するポリペプチドであってもよい。したがって、ポリペプチドは、前記生物学的活性を与える、本発明のポリペプチドのドメインを含むかまたは該ドメインからなることも可能である。本明細書で意味するような断片は、好ましくは、前述のアミノ酸配列の任意の１つの少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも８０、少なくとも１００または少なくとも１５０の連続アミノ酸を含む、前述のアミノ酸配列の任意の１つの少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０または少なくとも５００の連続アミノ酸残基を含む。

本発明のポリペプチドは、前述のアミノ酸配列から本質的になるか、または前述のアミノ酸配列を含むかいずれかである。したがって、これらは、さらなるポリペプチド配列もまた含有してもよい。特に、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質の１つのパートナーが上に列挙するようなポリペプチドである、融合タンパク質であってもよい。こうした融合タンパク質は、さらなる部分として、脂肪酸または脂質生合成経路の他の酵素、発現を監視するためのポリペプチド（例えば緑色、黄色、青色または赤色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ等）あるいは検出可能なマーカーとして、または精製目的のための補助的基準として、または固体表面に前記ポリペプチドを結合させるために働きうる、いわゆる「タグ」を含んでもよい。異なる目的のためのタグが当該技術分野に周知であり、そしてＦＬＡＧタグ、６−ヒスチジンタグ、ＭＹＣタグ、ビオチン等を含む。

しかし、分析物が、例えばチロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、葉酸、葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ_１２、内因子等を含む捕捉化合物との複合体形成によって決定可能な低分子量化合物であることもまた想定される。

本明細書において、用語「捕捉化合物」は、本明細書において上に明記するような、本発明の分析物に直接または間接的に結合し、そして固体表面に結合しているかまたは固体表面に結合するよう適応している化学的分子に関する。

１つの態様において、捕捉化合物は有機分子、さらなる態様において、本明細書において上に明記するような生物学的巨大分子、例えば上に明記するようなポリペプチドである。１つの態様において、捕捉化合物は、分析物および捕捉化合物を含む複合体の検出を可能にするために十分なアフィニティで、本発明の分析物に間接的に結合し；すなわち、こうした場合、捕捉化合物は間接的リガンドである。用語「間接的に結合する」は、本明細書において、リガンドが分析物に直接接触せず、分析物に結合している化学的分子、１つの態様において分析物に特異的に結合している化学的分子に接触する結合に関し、１つの態様において、分析物に結合している前記分子は、分析物に直接結合している分子であり、すなわち直接リガンドである。したがって、１つの態様において、分析物、分析物に結合している化学的分子、および間接的リガンドは、上に示すような特性を持つ、特に示すような解離定数を持つ、複合体を形成する。当業者に理解されるであろうように、用語「結合において競合する」の定義は、変更すべきところは変更して、本発明の間接的リガンドに当てはまり、すなわち間接的リガンドは、１つの態様において、分析物に結合している前記分子に同時に結合することは不可能である特性を有する。さらなる態様において、捕捉化合物は、本明細書において上に明記するような、分析物／捕捉化合物複合体の検出を可能にするために十分なアフィニティで、本発明の分析物に直接結合する。したがって、１つの態様において、捕捉化合物は直接リガンドである。

本発明にしたがって、少なくとも第一および第二の捕捉化合物が提供され、ここで、該第一および第二の捕捉化合物は、同一でない捕捉化合物である。本明細書において、用語「同一でない」捕捉化合物は、少なくとも１つの化学的および／または物理的特性が測定可能に異なる、２つまたはそれより多い種の捕捉化合物分子に関する。典型的には、前記の少なくとも１つの化学的および／または物理的特性は、固体表面への該捕捉化合物の結合に関するインディケーターではなく、そしてそれに関する特性ではない。典型的な特性は、アミノ酸配列、グリコシル化、三次元フォールディングおよび／またはコンホメーション、ならびにポリペプチド鎖の長さである。しかし、同じ捕捉化合物の２つの調製物における不純物の濃度および／または同一性の相違もまた、本発明によって、意図される。したがって、１つの態様において、第二の捕捉化合物は、（ｉ）前記の第一の捕捉化合物のアミノ酸配列内に、少なくとも１つのアミノ酸交換を導入すること、（ｉｉ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる細胞バックグラウンドにおいて、前記の第二の捕捉化合物を産生すること、（ｉｉｉ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、前記の第二の捕捉化合物のグリコシル化を除去するかまたは防止すること、（ｉｖ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる手段によって、前記の第二の捕捉化合物を精製すること、（ｖ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる条件下で、前記の第二の捕捉化合物を変性させ、そして／または再フォールディングすること、および（ｖｉ）前記の第一の捕捉化合物と比較した際、異なる条件下で、前記の第二の捕捉化合物を保存することの少なくとも１つによって、第一の捕捉化合物から得られるかまたは得られうる。１つの態様において、該第一および第二の捕捉化合物は、本質的に同じエピトープを認識する抗体であり、そして前記の第二の捕捉化合物は、第一の捕捉化合物である抗体の変異体である。さらなる態様において、該第一および第二の捕捉化合物の少なくとも１つは、抗体ではない。別の態様において、該第一および第二の捕捉化合物は、抗体ではない。

本発明にしたがって、少なくとも第一および第二の捕捉化合物を提供し、ここで該捕捉化合物は、該分析物への結合において競合する。本明細書において、２つの化合物が、分析物への「結合において競合する」ことを示す用語は、前記化合物の分子が、該分析物の本質的に同じ結合部位に、同時に結合することが不可能である特性に関する。したがって、典型的には、２つの捕捉化合物が分析物への結合において競合する場合、および該分析物が該捕捉化合物に関する１つの結合部位を有する場合、各時点で、該捕捉化合物の１つの分子のみが該分析物に結合可能である。当業者は、上記が、変更すべきところは変更して、捕捉化合物に関する２またはそれより多くの結合部位を有する場合にも当てはまることを理解するであろう。当業者は、結合における競合をどのように決定するかを知っている。１つの態様において、分析物への結合における競合は、該分析物の同じかまたは本質的に同じ下位構造への結合である。さらなる態様において、分析物がポリペプチドである場合、第一の捕捉化合物が結合するエピトープおよび第二の捕捉化合物が結合するエピトープは、分析物の共通の少なくとも３つのアミノ酸、１つの態様において、３つの連続するアミノ酸を有する。典型的には、こうした場合、第一の捕捉化合物が結合するエピトープおよび第二の捕捉化合物が結合するエピトープは、分析物の共通の少なくとも４、５、６、または７アミノ酸を有する。

１つの態様において、第一および第二の捕捉化合物は、干渉化合物への結合において競合しない。用語「干渉化合物」は、本明細書において、イムノアッセイの特異性を減少させる化合物に関する。１つの態様において、干渉化合物は、本発明の捕捉化合物に結合する、分析物でない化合物である。

１つの態様において、１：５〜５：１、典型的には１：２〜２：１、約１：１、または１：１の比で、第一および第二の捕捉化合物を用いる。さらなる態様において、約２：１：１、１：２：１、または１：１：２、約１：１：１、または１：１：１の比で、３つの捕捉化合物を用いる。したがって、１つの態様において、第一および第二の捕捉化合物および潜在的に存在するさらなる捕捉化合物は、ほぼ同じ量で、さらなる態様において、同じ量で、反応混合物中に存在する。

生物学的分子、典型的にはポリペプチドを固体表面に結合させる方法は、当該技術分野に周知であり、そして例えば、疎水性相互作用、ビオチン化による結合、および固定ストレプトアビジン、共有結合、抗体−抗原相互作用を通じた結合等、またはこれらの相互作用の組み合わせ、例えば抗体および病原体ポリペプチド間の抗体−抗原相互作用を含み、ここで前記抗体はビオチン化され、そして固定ストレプトアビジンを通じて固体表面に結合している。したがって、捕捉化合物は、好ましくは、また、捕捉複合体であってもよい。１つの態様において、捕捉化合物は、分析物に直接結合する捕捉複合体の化合物である。当業者は、選択した固体表面に応じて、固体表面に捕捉化合物または複合体をどのように結合させるかを知っている。１つの態様において、捕捉化合物は、ウイルスポリペプチド、例えばウイルスカプシドポリペプチドである。１つの態様において、該捕捉化合物は、肝炎ウイルスカプシドポリペプチド、１つの態様において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）カプシドポリペプチド、例えばＨＢコア（ＨＢｃ）抗原またはＨＢｅ抗原である。しかし、捕捉化合物が抗体であることもまた想定される。

用語「抗体」には、本明細書において、モノクローナル抗体、少なくとも２つの損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および本明細書の別の箇所に明記するような望ましい結合活性を示す限り、抗体断片が含まれる。１つの態様において、抗体は、抗血清に含まれる抗体ではなく、典型的にはポリクローナル抗体またはポリクローナル血清ではない。したがって、１つの態様において、抗体は、混合物中に含まれる抗体であり、前記混合物中に含まれる抗体分子の少なくとも８０％、１つの態様において少なくとも９０％、さらなる態様において少なくとも９５％が、本発明の少なくとも１つの捕捉化合物または少なくとも１つの検出化合物である。１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。１つの態様において、抗体は全長抗体または抗体断片である。

重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当て可能である。５つの主なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そしてこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分割可能である。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は周知であり、そして一般的に、例えばＡｂｂａｓら， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第４版， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｃｏ．（２０００）にに記載される。抗体は、抗体と１またはそれより多い他のタンパク質またはペプチドの共有または非共有会合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってもよい。

用語「全長抗体」、「損なわれていない抗体」、および「全抗体」は、本明細書において、交換可能に用いられ、以下に定義するような抗体断片ではない、実質的に損なわれていない型の抗体を指す。該用語は特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖を含む抗体を指す。「抗体断片」は、損なわれていない抗体の部分を含み、１つの態様において、その抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ディアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、およびその名前が容易に結晶化する能力を反映する、残りの「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処理は、２つの抗原組み合わせ部位を有し、そしてなお抗原を架橋することが可能である、Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる。「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。１つの態様において、二鎖Ｆｖ種は、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインが緊密に非共有会合している二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造で会合可能であるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されうる。この立体配置において、各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）が、相互作用して、抗原結合部位を定義する。総合すると、６つのＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）は、全結合部位より低いアフィニティではあるが、抗原を認識しそしてこれに結合する能力を有する。用語「ディアボディ」は、２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補ドメインと対形成するよう強いられ、そして２つの抗原結合部位を生成する。ディアボディは二価または二重特異性であってもよい。ディアボディは、例えば、ＥＰ ０ ４０４ ０９７； ＷＯ １９９３／０１１６１； Ｈｕｄｓｏｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９ （２００３） １２９−１３４；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０ （１９９３） ６４４４−６４４８により完全に記載される。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９ （２００３） １２９−１３４に記載される。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在する可能性がある、ありうる突然変異、例えば天然存在突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特性が、別個の抗体の混合物ではないことを示す。特定の態様において、こうしたモノクローナル抗体には、典型的には、分析物に結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、ここで分析物結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの、単一の分析物結合性ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールからの、ユニークなクローンの選択であってもよい。選択されるターゲット結合配列をさらに改変して、例えばターゲットに対するアフィニティを改善し、ターゲット結合配列をヒト化し、細胞培養における産生を改善し、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫原性を減少させ、多重特異性抗体を生成する等が可能であり、そして改変されたターゲット結合配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定要因（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製とは対照的に、モノクローナル抗体調製の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定要因に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製は、典型的には他の免疫グロブリンが混入していない点が好都合である。

本明細書において、用語「固体表面」は、本発明の捕捉化合物が結合するために適応し、そして例えば物理的手段によって、試料から分離されるために適応している、任意の適切な固体表面に関する。１つの態様において、前記固体表面は、ビーズ、１つの態様においてマイクロビーズ、例えば磁気または常磁性マイクロビーズの表面である。１つの態様において、前記表面は、捕捉化合物の、捕捉化合物下位構造に結合する分子への、例えば付着による、共有的または非共有的な結合を改善するように適応している。捕捉化合物の下位構造に結合する典型的な分子は、例えば抗体、ストレプトアビジン、錯体化ニッケルイオン等である。さらなる態様において、固体表面は、共有または非共有結合によって、例えば疎水性相互作用によって、該捕捉化合物に結合する。したがって、１つの態様において、前記固体表面は、マルチクラスタープレートの表面である。１つの態様において、マルチクラスタープレートの表面を前処理して、捕捉化合物の結合に関するアフィニティおよび／または容量を増加させる。適切な前処理が当該技術分野に知られる。

用語「試料」は、本明細書において、本発明の分析物を含むと推測される試料に関する。１つの態様において、試料は、体液試料、組織または臓器由来の試料、あるいは外部または内部体表面から得られる洗浄／リンス液またはスワブもしくはスメア試料であるかまたはこうした試料を含む。試料は、１つの態様において、本明細書の別の箇所に明記するような少なくとも１つの分析物を含む。血液、血漿、血清、尿、唾液、または涙液の試料が、本発明の方法によって含まれる。試料は、ブラシ、（コットン）スワブ、スパチュラ、リンス／洗浄液、パンチ生検デバイス、針またはランセットでの腔の穿刺の使用、あるいは外科的器具類によって得られてもよい。しかし、１つの態様において、泌尿生殖器管、肛門周囲領域、肛門管、口腔、気道消化器管および上皮からの掻爬、スワブまたは生検を含む、周知の技術によって得られる試料もまた、本発明の試料として含まれる。ホモジナイズなどの溶解技術によって、そして／または濾過または遠心分離などの分離技術によって、体液または組織または臓器から、細胞不含液を得てもよい。１つの態様において、ＨＢウイルスポリペプチドまたは／および少なくとも１つのＨＢウイルスポリペプチドに対する抗体を含むことが知られる体液、すなわち１つの態様において、血液、血漿、血清、唾液等から、試料を得る。本発明の方法を実行するため、試料をさらにプロセシングしてもよいことが理解されるものとする。特に、当該技術分野に知られる方法および手段によって、試料から細胞を除去してもよい。さらに、当該技術分野に知られる方法および手段によって、試料から少なくとも１つの分析物を抽出しそして／または精製してもよい。したがって、用語、試料はまた、試料から希釈し、濃縮し、精製し、そして／または抽出した少なくとも１つの分析物を含むかまたは含むと推測される調製物に関することも可能である。

１つの態様において、本発明の方法は競合イムノアッセイである。したがって、該方法はさらに、試料に特定剤を混合する工程を含む。１つの態様において、本発明の方法は、不均一競合イムノアッセイであり、そして分析物および２つの同一でない捕捉化合物の間で形成される複合体の量を、該特定剤および前記の同一でない捕捉化合物の間で形成される複合体の量を決定することによって、間接的に決定する工程を含む。

用語「接触する」は、本発明の方法の背景において、当業者によって理解される。１つの態様において、該用語は、本発明の化合物を試料と、またはさらなる化合物と物理的に接触させ、そしてそれによって、例えば試料および化合物が相互作用することを可能にすることに関する。

用語「特定剤」は、当業者に知られ、そしてインディケーターに結合した捕捉化合物への結合に関して、分析物と競合する化合物に関する。典型的には、特定剤は、分析物に構造的に類似である。典型的には、特定剤は、インディケーターに結合した捕捉化合物が結合する、分析物の下位構造を含む。１つの態様において、特定剤は、構造要素として分析物およびインディケーターを含む化合物であるか、または特定剤は、インディケーターに共有結合した分析物からなる。

用語「インディケーター」は、本明細書において、前記インディケーターを含む分子または複合体の存在を検出可能にするために適応した化合物である。典型的には、インディケーターは、検出可能特性、典型的には光学的または／および酵素的特性を有する。しかし、前記検出可能特性が、放射能を放出する特性であることもまた想定される。

用語「光学的特性」は、本明細書において、光学的装置によって検出可能である任意の特性に関する。具体的には、光学的に決定可能な特性は：反射特性、透過特性、放出特性、散乱特性、蛍光特性、リン光特性、回折特性、および偏光特性からなる群より選択される少なくとも１つの特性であるかまたはこうした特性を含むことも可能である。本発明によって想定されるさらなる光学特性は、色、蛍光、発光、または屈折である。１つの態様において、本明細書に言及するような光学的に決定可能な特性は、光学的に検出可能な化学的化合物の特性、例えば、光吸収、光放出、光軽減（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）、またはそれに関連する特性を指す。本明細書で用いるような、光学的に決定可能な特性を検出することは、以前は検出不能であった特性の存在の検出、以前は検出されていた特性の非存在の検出、および特性の定量的な変化の検出、すなわち少なくとも１つの光学的特性の変化の度合いに相関するシグナル強度の変化の検出を含むことが理解されるであろう。用語「光学的に検出可能な特性」は、１つの態様において、また、電気生成化学発光としてもまた知られる、電気化学発光にも関することが理解される。

用語「酵素的特性」は、本明細書において、生物学的触媒によって、基質から検出可能産物を産生するインディケーターの特性に関する。したがって、酵素的特性は、典型的には、前記インディケーターにおける、前記酵素的特性を有するポリペプチドの存在によって与えられる。典型的には、酵素的特性は：ホスファターゼ活性（例えばアルカリホスファターゼにおけるもの）、ペルオキシダーゼ活性（例えばセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）・ペルオキシダーゼにおけるもの）、およびグリコシダーゼ活性（例えばベータ−ガラクトシダーゼにおけるもの）からなる群より選択される少なくとも１つの酵素活性である。酵素活性に関する典型的な基質は、当該技術分野に周知である。典型的には、前記酵素活性は、本明細書において上に明記するような決定可能な光学特性を有する産物を産生し、または／そして前記酵素活性は、電気装置によって決定可能である産物を産生する。

１つの態様において、本発明の方法は、二重抗原サンドイッチアッセイ（「ＤＡＧＳ」）である。したがって、該方法は、（ｉ）前記複合体を少なくとも１つの検出化合物と接触させ、そして（ｉｉ）該分析物、該捕捉化合物、および前記検出化合物を含む三元複合体の量を決定することによって、該分析物および該捕捉化合物の間で形成される複合体を検出する工程をさらに含む。

ＤＡＧＳアッセイの態様において、検出化合物を用いる。用語「検出化合物」は、本明細書において、本明細書において上に明記するように、本発明の分析物に直接または間接的に結合し、そして本明細書に別に明記するようにインディケーターに結合している化学的分子に関する。１つの態様において、検出化合物は固体表面に結合しておらず、そして固体表面に結合するよう適応していない。当業者によって理解されるであろうように、検出化合物は、間接的検出化合物、すなわち本発明のリガンドに関して、本明細書において上に明記するように、分析物に直接接触しない検出化合物であってもよい。１つの態様において、検出化合物は、直接検出化合物である。したがって、１つの態様において、本発明の捕捉化合物に関して上に提供する定義は、これらが固体表面への化合物の結合に関連しない限り、変更すべきところは変更して、本発明の検出化合物に当てはまる。

当業者が認識するであろうように、用語「特異的」は、試料中に存在する他の化合物、典型的には生体分子が、本発明のリガンド（捕捉化合物または検出化合物）に有意には結合しないことを示すために用いられ；当業者が理解するであろうように、これは、分析物、特定剤または固相への結合を緩和する機能部分として働くタグとの相互作用に関与しない捕捉化合物または検出化合物分子の領域への化学的化合物の結合を排除しない。

さらに、本発明は、
（ｉ）捕捉化合物の少なくとも１０％、１つの態様において、少なくとも２５％、さらなる態様において、少なくとも４０％、さらなる態様において、少なくとも４５％、さらなる態様において、約５０％を、同一でない捕捉化合物によって置換する工程を含み、置換された捕捉化合物が、該分析物への結合において、導入された捕捉化合物と競合する、分析物を決定するための間接的イムノアッセイの；あるいは
（ｉｉ）捕捉化合物の少なくとも５０％、１つの態様において、少なくとも７５％、さらなる態様において、少なくとも９０％、さらなる態様において、約１００％を、同一でない捕捉化合物によって置換する工程を含み、置換された捕捉化合物が、該分析物への結合において、導入された捕捉化合物と競合し、そして前記の少なくとも１つの捕捉化合物および少なくとも１つの検出化合物が該分析物の同一でないリガンドである、または
検出化合物の少なくとも５０％、１つの態様において、少なくとも７５％、さらなる態様において、少なくとも９０％、さらなる態様において、約１００％を、同一でない検出化合物によって置換する工程を含み、置換された検出化合物が、該分析物への結合において、導入された検出化合物と競合し、そして前記の少なくとも１つの捕捉化合物および少なくとも１つの検出化合物が該分析物の同一でないリガンドである、
分析物を決定するための二重抗原サンドイッチイムノアッセイの、
特異性を改善するための方法に関する。

典型的には、置換の測定可能な効果が理論的に予期されうるように、置換された捕捉化合物または検出化合物の割合を選択するであろう。当業者によって理解されるように、測定可能な効果の期待値は、置換に用いた同一でないリガンドの数に応じるであろう。例えば、改善後のアッセイにおいて、１つの捕捉剤化合物の代わりに３つが用いられる場合、例えば最初の捕捉化合物の６６％が置換されることが好ましい。一般的な規則として、所定の捕捉化合物または検出化合物の割合は、（１００％／ｎ）±５０％であり、ｎ＝（アッセイに用いる同一でない捕捉化合物または検出化合物の数）であることが想定される。別の態様において、（１００％／ｎ）±２０％の割合を用いる。当業者に理解されるであろうように、用いる割合の合計は、１００％であろう。したがって、１つの態様において、置換される捕捉化合物または検出化合物の割合は、１０％〜９０％、１つの態様において、２５％〜７５％、さらなる態様において、４０％〜６０％、さらなる態様において、約５０％である。

さらに、本発明は、試料中の分析物を検出するためのキットであって、
（ｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；または
（ｉｉ）該分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物
を含む、前記キットに関する。

さらなる態様において、本発明は、試料中の分析物を検出するためのキットであって、
（ｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物、および
（ｉｉ）特定剤であって、該捕捉化合物への結合において該分析物と競合する、該特定剤
を含む、前記キットに関する。

用語「キット」は、本明細書において、ともにパッケージングされていてもまたはいなくてもよい、本発明の前述の化合物、手段または試薬の集合を指す。キットの構成要素は、別個のバイアルによって（すなわち別個の部分のキットとして）含まれてもよいし、または単一のバイアル中で提供されてもよい。さらに、本発明のキットは、本明細書において上に言及する方法を実行するために用いられることが理解されるものとする。１つの態様において、すべての構成要素は、上に言及する方法を実施するためにすぐ使用可能な方式で提供されることが想定される。さらに、１つの態様において、キットは、前記方法を実行するための使用説明書を含有する。使用説明書は、紙または電子形式の使用者マニュアルによって提供されうる。例えば、マニュアルは、本発明のキットを用いて前述の方法を実行する際に得られる結果を解釈するための指示を含むことも可能である。１つの態様において、本発明の少なくとも２つの同一でない捕捉化合物を含む、試料中の分析物を検出するためのキットは、少なくとも２つの同一でない検出化合物をさらに含み、ここで前記検出化合物は、該分析物への結合において競合し、そして該捕捉化合物は、該分析物への結合において、前記検出化合物と競合しない。さらなる態様において、キットは、該捕捉化合物を固定するための、または分析物を固定するための固体支持体をさらに含む。

１つの態様において、該分析物に関する２〜１０の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の捕捉化合物が、前記キット中に含まれる。さらなる態様において、該分析物に関する２〜１０の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の検出化合物が、前記キット中に含まれる。

また、本発明は、試料中の分析物を決定するためのデバイスであって
（ｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；または
（ｉｉ）該分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物、ならびに場合によって、前記検出化合物中に含まれるインディケーターの光学的および／または酵素的特性を決定するための手段
を含む、前記デバイスに関する。

用語「デバイス」は、本明細書において、決定を可能にするように、互いに機能可能であるように連結された、少なくとも前述の手段を含む手段のシステムに関する。分析物の量を決定するための典型的な手段、および決定を実行するための手段は、本発明の方法と関連して、上に開示される。操作する方式で、手段をどのように連結するかは、デバイスに含まれる手段のタイプに応じるであろう。１つの態様において、手段は、単一のデバイスによって含まれる。前記デバイスには、したがって、（ｉ）適用される試料中の分析物の量の測定のための分析ユニット、および（ｉｉ）評価のために生じたデータをプロセシングするためのコンピュータユニットが含まれてもよい。検出のための典型的な手段は、上記の本発明の方法に関連する態様と関連して開示される。こうした場合、システムの使用者が、マニュアルに提供される指示および解説によって、インディケーターのおよび分析物の光学的または／および電気化学的に決定可能な特性の決定結果をまとめられるように、手段は機能可能であるように連結されるか、あるいは、決定結果として、適用した試料中の分析物の量または濃度が、使用者に出力されるように、前記指示および解説が、デバイスに含まれる実行可能なプログラムコード中に含まれる。当業者は、さらなる面倒を伴わずに、手段をどのように連結するかを知っているであろう。典型的なデバイスは、特別な技術者の特定の知識を伴わずに適用可能なもの、例えば単に試料を装填することが必要である、試験片または電子デバイスである。結果は、技術者による解釈を必要とする生データの出力として提供されてもよい。しかし、１つの態様において、デバイスの出力は、プロセシングされた、すなわち評価された生データであり、その解釈に技術者を必要としない。さらなる典型的なデバイスは、本発明の方法にしたがって、上に言及されるような、分析ユニット／デバイス（例えばバイオセンサー、アレイ、ペプチドを特異的に認識するリガンドにカップリングされた固体支持体、プラズモン表面共鳴デバイス、ＮＭＲ分光計、質量分析装置等）または評価ユニット／デバイスを含む。

１つの態様において、該分析物に関する２〜１０の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の捕捉化合物が、前記デバイス中に含まれる。さらなる態様において、該分析物に関する２〜１０の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の検出化合物が、前記デバイス中に含まれる。

さらに、本発明は、診断に使用するための、（ｉ）疾患の指標となる分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；または（ｉｉ）疾患の指標となる分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物を含む、組成物に関する。

用語「組成物」は、本明細書において、固体、液体または気体型で配合される任意の組成物を指す。前記組成物は、本発明の化合物を、場合によって適切な補助化合物、例えば希釈剤またはキャリアーまたはさらなる成分とともに含む。適切な希釈剤および／またはキャリアーは、組成物を用いようとする目的および他の成分に応じる。当業者は、さらなる面倒を伴わずに、こうした適切な希釈剤および／またはキャリアーを決定可能である。１つの態様において、本発明の少なくとも２つの同一でない捕捉化合物を含む、診断において使用するための組成物は、少なくとも２つの同一でない検出化合物をさらに含み、前記検出化合物は、該分析物への結合において競合し、そして該捕捉化合物は、該分析物への結合において前記検出化合物と競合しない。

用語「診断」は、本明細書において、被験体が疾患または状態に罹患しているかまたは罹患するであろう可能性の評価を指す。当業者に理解されるであろうように、こうした評価は通常、被験体の１００％が正しく診断されるようには意図されない。該用語は、しかし、被験体の統計的に有意な部分が、疾患または状態に罹患していると正しく診断されうることを必要とする。部分が統計的に有意であるかどうかは、さらなる面倒を伴わずに、多様な周知の統計評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントのｔ検定、マン−ホイットニー検定等を用いて、当業者によって決定可能である。詳細は、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。ｐ値は、好ましくは、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、または０．０００１である。好ましくは、本発明に想定される可能性は、所定のコホートまたは集団の被験体の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％に関して、診断が正しいことを可能にする。診断される典型的な状態は、例えば生殖能力状態または妊娠である。診断される典型的な疾患は、例えば病原体、例えばウイルスでの流行性のまたは以前の感染、甲状腺機能亢進症または機能低下症、ビタミン欠乏等である。

さらに、本発明は、試料中の分析物を決定するための、（ｉ）第一および第二の捕捉化合物であって、同一でない捕捉化合物であり、そして該分析物に対する結合において競合する、該捕捉化合物、または（ｉｉ）第一および第二の検出化合物であって、同一でない検出化合物であり、そして該分析物に対する結合において競合する、前記検出化合物の使用に関する。

本発明の知見を要約して、以下の態様を開示する：
態様１． 分析物を含むと推測される試料において、該分析物を決定するための方法であって
ａ）試料と、分析物に関する少なくとも第一および第二の捕捉化合物を接触させ、ここで該第一および第二の捕捉化合物は、同一でない捕捉化合物であり、そして該分析物への結合において競合する；
ｂ）該試料と接触させた該捕捉化合物を、
（ｉ）検出化合物と接触させ、ここで前記検出化合物は、該分析物への結合において該捕捉化合物と競合する；または
（ｉｉ）特定剤と接触させ、ここで該特定剤は、該捕捉化合物への結合において、該分析物と競合する；
ｃ）
（ｉ）前記検出化合物および捕捉化合物、または
（ｉｉ）該特定剤および捕捉化合物
を含む複合体の量を決定し；そして
ｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、試料における該分析物を決定する
工程を含む、前記方法。

態様２． 分子への結合における競合が、前記分子の本質的に同じまたは同じ下位構造への結合であり、１つの態様において、該分析物への結合における競合が、該分析物と本質的に同じまたは同じ下位構造への結合であり、１つの態様において、該捕捉化合物への結合における競合が、前記の少なくとも１つの、１つの態様においてすべての捕捉化合物の、本質的に同じまたは同じ下位構造への結合である、態様１の方法。

態様３． 前記の同一でない捕捉化合物が、生物学的分子、１つの態様において、生物学的巨大分子、さらなる態様において、ポリペプチドである、態様１または２の方法。
態様４． 前記の２つの同一でない捕捉化合物が、ウイルスポリペプチドの、１つの態様において、ウイルスカプシドポリペプチドの変異体である、態様１〜３のいずれか一の方法。

態様５． 前記の２つの同一でない捕捉化合物が、肝炎ウイルスカプシドポリペプチドの、１つの態様において、Ｂ型肝炎（ＨＢ）カプシドポリペプチドの、さらなる態様において、ＨＢコア（ＨＢｃ）抗原の変異体である、請求項１〜４のいずれか一の方法。

態様６． 前記の第二の化合物が、第一の捕捉化合物である抗体の変異体であるか；または前記の第一および第二の捕捉化合物が、本質的に同じエピトープを認識する抗体である、態様１〜２のいずれか一の方法。

態様７． 前記の第二の捕捉化合物が、以下の少なくとも１つ：
（ｉ）前記の第一の捕捉化合物のアミノ酸配列内に、少なくとも１つのアミノ酸交換を導入すること、
（ｉｉ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる細胞バックグラウンドにおいて、前記の第二の捕捉化合物を産生すること、
（ｉｉｉ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、前記の第二の捕捉化合物のグリコシル化を除去するかまたは防止すること、
（ｉｖ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる手段によって、そして／または異なる方法によって、前記の第二の捕捉化合物を精製すること、
（ｖ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる条件下で、前記の第二の捕捉化合物を変性させ、そして／または再フォールディングすること、および
（ｖｉ）前記の第一の捕捉化合物と比較した際、異なる条件下で、前記の第二の捕捉化合物を保存すること
によって、前記の第一の捕捉化合物に由来するかまたは由来可能である、態様１〜６のいずれか一の方法。

態様８． 前記分析物が生物学的巨大分子である、態様１〜７のいずれか一の方法。
態様９． 前記分析物がポリペプチドである、態様１〜８のいずれか一の方法。
態様１０． 前記分析物が、ウイルス抗原に対する、１つの態様において、ウイルスポリペプチドに対する、さらなる態様において、ウイルスカプシドポリペプチドに対する抗体である、態様１〜９のいずれか一の方法。

態様１１． 前記分析物が、肝炎ウイルスカプシドポリペプチドに対する、１つの態様において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）カプシドポリペプチドに対する、さらなる態様において、ＨＢコア（ＨＢｃ）抗原に対する抗体である、態様１〜１０のいずれか一の方法。

態様１２． 前記捕捉化合物によって結合されるエピトープが、少なくとも３アミノ酸を共通で有する、態様９〜１１のいずれか一の方法。
態様１３． 分析物の前記決定が、該分析物の量の定性的または定量的決定である、態様１〜１２のいずれか一の方法。

態様１４． 工程ａ）が、前記分析物に関する２〜１０の捕捉化合物、１つの態様において前記分析物に関する２〜５の捕捉化合物、１つの態様において前記分析物に関する２〜４の捕捉化合物、１つの態様において前記分析物に関する２〜３の捕捉化合物を前記試料と接触させる工程を含む、態様１〜１３のいずれか一の方法。

態様１５． 前記特定剤が、インディケーターに結合した捕捉化合物によって結合される分析物の下位構造を含む、態様１〜１４のいずれか一の方法。
態様１６． 前記特定剤が、分析物およびインディケーターを含む化合物である、態様１〜１５のいずれか一の方法。

態様１７． 前記特定剤がインディケーターに共有結合した分析物からなる、態様１〜１６のいずれか一の方法。
態様１８． 前記捕捉化合物が、ポリクローナル抗血清中に含まれず、１つの態様においてポリクローナル抗体ではない、態様１〜１７のいずれか一の方法。

態様１９． 前記の第一および第二の捕捉化合物が、干渉化合物への結合において競合しない、態様１〜１８のいずれか一の方法。
態様２０．
ａ）試料と、分析物に関する少なくとも第一および第二の捕捉化合物を接触させ、ここで該第一および第二の捕捉化合物は、同一でない捕捉化合物であり、そして該捕捉化合物は該分析物への結合において競合する；
ｂ）該試料と接触させた該捕捉化合物を、特定剤と接触させ、ここで該特定剤は、該捕捉化合物への結合において、該分析物と競合する；
ｃ）該特定剤および捕捉化合物を含む複合体の量を決定し；そして
ｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、試料における該分析物を決定する
工程を含む、態様１〜１９のいずれか一の方法。

態様２１． 前記分析物を含むと推測される試料において、分析物を決定するための方法であって
ａ）試料と、分析物に関する少なくとも第一および第二の検出化合物を接触させ、ここで前記の第一および第二の検出化合物は、同一でない検出化合物であり、そして前記検出化合物は該分析物への結合において競合する；
ｂ）少なくとも該分析物を含む該試料の構成要素を、固体表面に結合させ、
ｃ）前記固体表面に結合した検出化合物を含む複合体の量を決定し；そして
ｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、試料における該分析物を決定する
工程を含む、前記方法。

態様２２． 前記分析物が抗体を含み、１つの態様において抗体である、態様２２の方法。
態様２３． 前記検出化合物がさらにインディケーターを含む、態様２１〜２２のいずれか一の方法。

態様２４． 前記インディケーターが検出可能な特性、１つの態様において、光学的または／および酵素的特性を有する化合物である、態様１５〜１７または２３のいずれか一の方法。

態様２５． 前記の第一および第二の検出化合物が、干渉化合物への結合において競合しない、態様２０〜２４のいずれか一の方法。
態様２６． 工程ａ）を工程ｂ）の後に実行する、態様２０〜２５のいずれか一の方法。

態様２７．
（ａ）捕捉化合物の少なくとも１０％、１つの態様において、少なくとも２５％、さらなる態様において、少なくとも４０％、さらなる態様において、少なくとも４５％、さらなる態様において、約５０％を、同一でない捕捉化合物によって置換する工程を含み、置換された捕捉化合物が、該分析物への結合において、導入された捕捉化合物と競合する、
（ｉ）分析物を決定するための間接的イムノアッセイまたは（ｉｉ）分析物を決定するための二重抗原サンドイッチイムノアッセイの；あるいは
（ｂ）検出化合物の少なくとも２５％、１つの態様において、少なくとも４０％、さらなる態様において、少なくとも４５％、さらなる態様において、約５０％を、同一でない検出化合物によって置換する工程を含み、置換された検出化合物が、導入された検出化合物と該分析物の結合において競合し、そして前記の少なくとも１つの捕捉化合物および少なくとも１つの検出化合物が該分析物の同一でない捕捉化合物である
分析物を決定するための二重抗原サンドイッチイムノアッセイの、
特異性を改善するための方法。

態様２８． 前記分析物に結合する該捕捉化合物および／または前記検出化合物中の化学構造が、前記の同一でない捕捉化合物すべておよび／または前記の同一でない検出化合物すべてにおいて同一である、態様１〜２７のいずれか一の方法。

態様２９．
（ｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜１０の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；または
（ｉｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜１０の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物
を含む、試料中の分析物を検出するためのキット。

態様３０． 前記捕捉化合物、または少なくとも該分析物を含む前記試料の構成要素を固定するための固体支持体をさらに含む、態様２９のキット。
態様３１．
（ｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜１０の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の捕捉化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；または
（ｉｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜１０の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜５の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜４の検出化合物、１つの態様において、該分析物に関する２〜３の検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物、ならびに場合によって、前記検出化合物中に含まれるインディケーターの光学的または／および酵素的特性を決定するための手段
を含む、試料中の分析物を検出するためのデバイス。

態様３２． 疾患の診断において使用するための
（ｉ）疾患の指標となる分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物、または
（ｉｉ）疾患の指標となる分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物
を含む、組成物。

態様３３． 診断組成物または診断デバイスの製造のための
（ｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない捕捉化合物であって、該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；および／または
（ｉｉ）分析物に関する少なくとも２つの同一でない検出化合物であって、該分析物への結合において競合する、前記検出化合物
の使用。

態様３４． 前記疾患がウイルス性肝炎である、態様３２の使用のための組成物または態様３３の使用。
態様３５． 試料において、分析物を決定するための、（ｉ）第一および第二の捕捉化合物であって、同一でない捕捉化合物であり、そして該分析物への結合において競合する、該捕捉化合物；または（ｉｉ）第一および第二の検出化合物であって、同一でない検出化合物であり、そして該分析物への結合において競合する、前記検出化合物
を含む、組成物の使用。

本発明のさらなる場合による特徴および態様は、１つの態様において従属請求項と組み合わせて、態様の続く説明に、より詳細に開示されるであろう。ここで、それぞれの場合による特徴は、当業者が認識するであろうように、単離された方式で、ならびに任意の恣意的なありうる組み合わせで達成可能である。本発明の範囲は、開示する態様によって制限されない。態様は、図に模式的に示される。ここで、これらの図の同一の参照番号は、同一のまたは機能的に匹敵する要素を指す。
競合アッセイに適用されるような、本発明の原理を模式的に示す；ａ：分析物、ｓ：特定剤、ｃ１：捕捉化合物１、ｃ２：捕捉化合物２、ｉ１：干渉剤１、ｉ２：干渉剤２。Ａ）分析物の非存在下で、特定剤は、捕捉化合物１に結合する。Ｂ）分析物の存在下で、分析物は、捕捉化合物１に結合し、そして特定剤が捕捉化合物１に結合することを防止する。Ｃ）捕捉化合物１にアフィニティを有する（が、捕捉化合物２にはアフィニティを持たない）干渉剤１の存在下で、干渉剤１が捕捉化合物１に結合し、したがって、特定剤が結合することを防止する。Ｄ）捕捉化合物２に対するアフィニティを有する（が、捕捉化合物１にはアフィニティを持たない）干渉剤２の存在下で、干渉剤２は捕捉化合物１に結合せず、したがって、特定剤が捕捉化合物１に結合することが許可される。逆に、Ｅ）捕捉化合物１にアフィニティを有する（が、捕捉化合物２にはアフィニティを持たない）干渉剤１は、捕捉化合物２に結合せず、したがって、特定剤が捕捉化合物２に結合することを許可し；そしてＦ）干渉剤２は捕捉化合物２に結合し、したがって特定剤が結合することを防止する。Ｇ）およびＨ）捕捉化合物１および２を、例えば１：１比で用いる場合、干渉剤１または干渉剤２によって誘導される偽シグナル減少は、およそ５０％まで減少するであろう。 競合アッセイに適用されるような、本発明の原理を模式的に示す；ａ：分析物、ｓ：特定剤、ｃ１：捕捉化合物１、ｃ２：捕捉化合物２、ｉ１：干渉剤１、ｉ２：干渉剤２。Ａ）分析物の非存在下で、特定剤は、捕捉化合物１に結合する。Ｂ）分析物の存在下で、分析物は、捕捉化合物１に結合し、そして特定剤が捕捉化合物１に結合することを防止する。Ｃ）捕捉化合物１にアフィニティを有する（が、捕捉化合物２にはアフィニティを持たない）干渉剤１の存在下で、干渉剤１が捕捉化合物１に結合し、したがって、特定剤が結合することを防止する。Ｄ）捕捉化合物２に対するアフィニティを有する（が、捕捉化合物１にはアフィニティを持たない）干渉剤２の存在下で、干渉剤２は捕捉化合物１に結合せず、したがって、特定剤が捕捉化合物１に結合することが許可される。逆に、Ｅ）捕捉化合物１にアフィニティを有する（が、捕捉化合物２にはアフィニティを持たない）干渉剤１は、捕捉化合物２に結合せず、したがって、特定剤が捕捉化合物２に結合することを許可し；そしてＦ）干渉剤２は捕捉化合物２に結合し、したがって特定剤が結合することを防止する。Ｇ）およびＨ）捕捉化合物１および２を、例えば１：１比で用いる場合、干渉剤１または干渉剤２によって誘導される偽シグナル減少は、およそ５０％まで減少するであろう。 抗肝炎コア（ＨＢｃ）抗原抗体に関する競合試験の試験原理を示す。ＨＢｃ：Ｂ型肝炎コア抗原；α−ＨＢｃ：抗ＨＢｃ抗原抗体；二重外周で示す非コンジュゲート化α−ＨＢｃ抗体は、患者由来の試料中に潜在的に存在する抗体であり、単一外周で示すコンジュゲート化抗体は、アッセイ中に添加されるα−ＨＢｃ抗体である；コンジュゲート化は、Ｒｕ：ルテニウム複合体、またはｂｉｏ：ビオチンのいずれかであり：ｓｔｒｐ：固体支持体のストレプトアビジンコーティングである。Ａ）分析物（α−ＨＢｃ抗体）の非存在下で、Ｒｕコンジュゲート化およびｂｉｏコンジュゲート化α−ＨＢｃ抗体はどちらも、アッセイ混合物に添加されたＨＢｃに結合可能である。ｂｉｏ−ｓｔｒｐ相互作用を通じて、複合体は固体支持体に結合し、そして洗浄後、Ｒｕコンジュゲート化から生じるシグナルを測定可能である。Ｂ）分析物（α−ＨＢｃ抗体）の存在下で、αＨＢｃ−ｂｉｏ抗体およびＲｕコンジュゲート化抗体は、アッセイ混合物に添加されたＨＢｃに結合することを妨げられ、したがって、固体支持体への複合体の結合が妨げられる。したがって、洗浄後、Ｒｕ複合体は洗い流されてしまうであろうため、Ｒｕ複合体からのシグナルは生じえない。図２において、ＨＢｃならびにα−ＨＢｃ−ｂｉｏコンジュゲートは、捕捉化合物複合体の部分である。 抗肝炎コア（ＨＢｃ）抗原抗体に関する競合試験の試験原理を示す。ＨＢｃ：Ｂ型肝炎コア抗原；α−ＨＢｃ：抗ＨＢｃ抗原抗体；二重外周で示す非コンジュゲート化α−ＨＢｃ抗体は、患者由来の試料中に潜在的に存在する抗体であり、単一外周で示すコンジュゲート化抗体は、アッセイ中に添加されるα−ＨＢｃ抗体である；コンジュゲート化は、Ｒｕ：ルテニウム複合体、またはｂｉｏ：ビオチンのいずれかであり：ｓｔｒｐ：固体支持体のストレプトアビジンコーティングである。Ａ）分析物（α−ＨＢｃ抗体）の非存在下で、Ｒｕコンジュゲート化およびｂｉｏコンジュゲート化α−ＨＢｃ抗体はどちらも、アッセイ混合物に添加されたＨＢｃに結合可能である。ｂｉｏ−ｓｔｒｐ相互作用を通じて、複合体は固体支持体に結合し、そして洗浄後、Ｒｕコンジュゲート化から生じるシグナルを測定可能である。Ｂ）分析物（α−ＨＢｃ抗体）の存在下で、αＨＢｃ−ｂｉｏ抗体およびＲｕコンジュゲート化抗体は、アッセイ混合物に添加されたＨＢｃに結合することを妨げられ、したがって、固体支持体への複合体の結合が妨げられる。したがって、洗浄後、Ｒｕ複合体は洗い流されてしまうであろうため、Ｒｕ複合体からのシグナルは生じえない。図２において、ＨＢｃならびにα−ＨＢｃ−ｂｉｏコンジュゲートは、捕捉化合物複合体の部分である。 二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）形式に適用されるような、本発明の原理を模式的に示す。ａ：分析物、ｄ：検出化合物、ｃ１：捕捉化合物１、ｃ２：捕捉化合物２、ｉ１：干渉剤１、ｉ２：干渉剤２。Ａ）分析物の非存在下で、分析物は、固体支持体上に固定された捕捉化合物１（または２）に結合せず、そしてしたがって、検出化合物は、洗浄工程で洗い流されるであろう。Ｂ）分析物、例えば抗体の存在下で、分析物は、捕捉化合物１に、そして検出化合物に結合し、したがって、固体表面への検出化合物の結合を仲介する。Ｃ）捕捉化合物１および検出化合物に結合するが、捕捉化合物２に結合しない、干渉剤１の存在下で、検出化合物は、干渉剤１との相互作用を通じて、固体支持体に固定されるようになる。Ｄ）捕捉化合物２および検出化合物に結合するが、捕捉化合物１に結合しない、干渉剤２の存在下で、検出化合物は、干渉剤１を通じて固体支持体に固定されない。逆に、Ｅ）干渉剤１の存在下で、検出化合物は、干渉剤２との相互作用を通じて、固体支持体に固定されず；そしてＦ）干渉剤２の存在下で、検出化合物は、捕捉化合物２を通じて固体支持体に固定されるであろう。Ｇ）およびＨ）捕捉化合物１および２を、例えば１：１比で用いる場合、干渉剤１または干渉剤２によって誘導される偽シグナル増加は、およそ５０％まで減少するであろう。スキームは、変更すべきところは変更して、２つの同一でない検出化合物の使用に関して描くことも可能である。 二重抗原サンドイッチ（ＤＡＧＳ）形式に適用されるような、本発明の原理を模式的に示す。ａ：分析物、ｄ：検出化合物、ｃ１：捕捉化合物１、ｃ２：捕捉化合物２、ｉ１：干渉剤１、ｉ２：干渉剤２。Ａ）分析物の非存在下で、分析物は、固体支持体上に固定された捕捉化合物１（または２）に結合せず、そしてしたがって、検出化合物は、洗浄工程で洗い流されるであろう。Ｂ）分析物、例えば抗体の存在下で、分析物は、捕捉化合物１に、そして検出化合物に結合し、したがって、固体表面への検出化合物の結合を仲介する。Ｃ）捕捉化合物１および検出化合物に結合するが、捕捉化合物２に結合しない、干渉剤１の存在下で、検出化合物は、干渉剤１との相互作用を通じて、固体支持体に固定されるようになる。Ｄ）捕捉化合物２および検出化合物に結合するが、捕捉化合物１に結合しない、干渉剤２の存在下で、検出化合物は、干渉剤１を通じて固体支持体に固定されない。逆に、Ｅ）干渉剤１の存在下で、検出化合物は、干渉剤２との相互作用を通じて、固体支持体に固定されず；そしてＦ）干渉剤２の存在下で、検出化合物は、捕捉化合物２を通じて固体支持体に固定されるであろう。Ｇ）およびＨ）捕捉化合物１および２を、例えば１：１比で用いる場合、干渉剤１または干渉剤２によって誘導される偽シグナル増加は、およそ５０％まで減少するであろう。スキームは、変更すべきところは変更して、２つの同一でない検出化合物の使用に関して描くことも可能である。

実施例１
組換えＢ型肝炎コア抗原のクローニングおよび精製
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードする合成遺伝子を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（ドイツ・エーバースベルク）より購入した。Ｎｏｖａｇｅｎ（米国ウィスコンシン州マディソン）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドに基づいて、以下のクローニング工程を行った。ベクターをＢａｍＨ１およびＸｈｏ１で消化し、そしてＨＢｃＡｇを含むカセットを挿入した。生じたプラスミドの挿入物を配列決定し、そして望ましいタンパク質がコードされることを見出した。生じたタンパク質のアミノ酸配列を、本発明の配列プロトコル中に示す。組換えＨＢｃＡｇは、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを含有しなかった。

以下のプロトコルにしたがって、組換えＨＢｃＡｇを精製した。発現プラスミドを宿する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地中でＯＤ６００が１になるまで増殖させ、そして３７℃の増殖温度で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭまで添加することによって、細胞質性過剰発現を誘導した。４時間インキュベーションした後、遠心分離（５０００ｘｇで２０分間）によって細胞を採取し、凍結し、そして−２０℃で保存した。細胞溶解のため、凍結ペレットを、２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．５、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、緩衝剤５０ｍｌあたり１錠剤のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）および１錠剤のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含（プロテアーゼ阻害剤カクテル）中に再懸濁し、そして生じた懸濁物を、高圧ホモジナイズによって溶解した。未精製溶解物を遠心分離し、そして上清中のＨＢｃＡｇを硫酸アンモニウム（３５％ｗ／ｖ）で沈殿させた。さらに遠心分離した後、沈殿物を再懸濁し、そしてリン酸緩衝液に対して透析した後、加熱工程（７０℃で３０分間）を行った。遠心分離後、透明な上清を、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ７であらかじめ平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ ６５０−１１カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上に適用した。次いで、５００ｍＭの塩化カリウム濃度まで、勾配を適用することによって、タンパク質を溶出させた。最後に、タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィ（Ｓ４００）に供し、そしてタンパク質含有分画をプールした。

実施例２
競合試験形式で抗ＨＢｃ抗体を検出するためのイムノアッセイ
健康な血液ドナーパネル由来の血清試料を、自動化Ｃｏｂａｓ ｅ（登録商標）分析計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）において、抗ＨＢｃ抗体の存在に関して、競合的抗ＨＢｃ ＥＣＬＩＡ（電気化学発光イムノアッセイ）において分析した。Ｃｏｂａｓ ｅ（登録商標）およびＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）は、Ｒｏｃｈｅグループの登録商標である。試料は少なくとも１回のＣＥマーク抗ＨＢｃアッセイで抗ＨＢｃに関して陰性と試験され、該アッセイは、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）抗ＨＢｃアッセイとは異なり、そして商業的に入手可能である。

アッセイにおいて、血清をＨＢｃと反応させる。どちらもＨＢｃＡｇに特異的であるビオチン化抗体およびルテニウム複合体（Ｔｒｉｓ（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）複合体；（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋）標識抗体を、ストレプトアビジンコーティング微粒子とともに添加した後、ＨＢｃ抗原上のなおフリーであった結合部位が占有される。全複合体は、ビオチンおよびストレプトアビジンの相互作用を通じて、固相に結合する。未結合物質を除去した後、電圧を電極に適用し、そして白金電極での励起後、６２０ｎｍの化学発光を誘導し、これを光電子倍増管によって測定する。

高い測定値は、添加したビオチン化抗体およびルテニウム複合体標識抗体の結合を示し、そしてしたがって、試料中に抗ＨＢｃ抗体が存在しないことを示す。試料中に抗ＨＢｃ抗体が存在すると、これらの抗体は、抗原ＨＢｃＡＧへの結合に関して、アッセイ特異的抗体の両方のタイプと競合し、白金電極での励起後、６２０ｎｍの光放出の減少が導かれる。シグナル出力は、恣意的な光単位である。

したがって、カットオフ指数１．０よりも高い測定値を有する試料を非反応性と見なす一方、カットオフ指数１．０より低いかまたはこれに等しい測定値を有する試料を反応性と見なす。

競合Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）抗ＨＢｃアッセイ形式に基づいて３つの異なるＨＢｃＡｇセッティングを試験した。「ＨＢｃＡｇ Ｘ」は、配列番号２を含む抗原を指し；「ＨＢｃＡｇ Ｙ」は、配列番号１を含む抗原を指す。抗原セッティングのみを修飾し、すべての他の試薬および条件は不変にした。真の陽性（感染）試料の結果は、第一および第二の捕捉化合物として、ＨＢｃＡｇ ＸおよびＹの組み合わせを適用することによっては影響を受けなかった（データ未提示）。表１は、試料パネルの矛盾する（＝偽）陽性結果のみに関する。３つの異なるセッティングは以下の通りであった。
Ａ）ＨＢｃＡｇ Ｘを競合的抗ＨＢｃアッセイにおいてターゲットとして用いる。
Ｂ）ＨＢｃＡｇ Ｙ（ＨＢｃＡｇ Ｘとわずかに異なる）を競合的抗ＨＢｃアッセイにおいてターゲットとして用いる。
Ｃ）ＨＢｃＡｇ ＸおよびＨＢｃＡｇ Ｙの組み合わせを、競合的抗ＨＢｃアッセイにおいてターゲットとして用いる。

表１は、競合的抗ＨＢｃ−ＥＣＬＩＡ（電気化学発光イムノアッセイ）の結果を示す。ＨＢｃ抗原に対する抗体に関して陰性である商業的に入手可能な血清（Ｂａｖａｒｉａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ）を、試料として用いた。表１は、矛盾した知見を伴う結果のみを列挙する。異なるＨＢｃＡＧは、矛盾した陽性抗ＨＢｃ結果の個々のパターンを示した。ＨＢｃ抗原（ＨＢｃＡＧ）の２つの異なる調製物を用いた際、ＨＢｃＡＧ Ｘを用いた際は、１１の試料が（偽）陽性（反応性）結果であり、第二のＨＢｃＡＧ Ｙを用いた場合のみ、７つの試料が（偽）陽性結果であり、そしてＨＢｃＡＧ ＸおよびＨＢｃＡＧ Ｙの両方を用いた場合、２つの試料が（偽）陽性結果であった。対照的に、両方の抗原、すなわちＨＢｃＡＧ ＸおよびＨＢｃＡＧ Ｙの１：１混合物を用いた際、これらの１８試料のうち、５つのみが陽性結果であり、偽陽性試験数が３倍以上減少した。詳細には、両方の抗原（ＨＢｃＡＧ ＸおよびＨＢｃＡＧ Ｙ）の前記の１：１混合物を用いた場合、ＨＢｃＡＧＸのみを用いて偽陽性結果であった試料の数は１１から３に減少し、そしてＨＢｃＡＧＹのみを用いて偽陽性結果であった試料の数は、９から５に減少した。予期されるように、両方の抗原で偽陽性結果であった２つの試料（試料番号２９４２および３６５７）はまた、混合物でも偽陽性結果であった。

結論として、この競合的イムノアッセイの特異性は、少なくとも２つのわずかに異なるＨＢｃ抗原を混合物として適用した際、増加した。
競合試験形式に基づく方法において、分析物に関する２つのわずかに異なる第一および第二の捕捉化合物を用いる原理を適用することによって、特異性はかなり増加し、すなわち偽陽性結果を、かなりの度合いで回避可能である。

表１：競合的抗ＨＢｃ ＥＣＬＩＡ（電気化学発光イムノアッセイ）の結果
ＣＯＩ：カットオフ指数

Claims (19)

1. 分析物を含むと推測される試料において、該分析物を決定するための方法であって
   ａ）試料と、分析物に関する少なくとも第一および第二の捕捉化合物を接触させ、ここで該第一および第二の捕捉化合物は、少なくとも１つの化学的および／または物理的特性において測定可能に異なる、同一でない捕捉化合物であり、該捕捉化合物は該分析物への結合において競合し、そして該捕捉化合物はポリペプチドである；
   ｂ）該試料と接触させた該捕捉化合物を、インディケーターに結合した特定剤と接触させ、ここで該特定剤は、該捕捉化合物への結合において、該分析物と競合する；
   ｃ）該特定剤および捕捉化合物を含む複合体の量を決定し；そして
   ｄ）工程ｃ）の結果に基づいて、試料における該分析物を決定する
   工程を含む、前記方法。
2. 前記捕捉化合物の前記分析物への結合における競合が、該分析物の本質的に同じまたは同じ下位構造への結合であり、および／または前記分析物と前記特定剤の前記捕捉化合物への結合における競合が、該捕捉化合物の本質的に同じまたは同じ下位構造への結合である、請求項１の方法。
3. 前記の同一でない捕捉化合物がポリペプチドである、請求項１または２の方法。
4. 前記の同一でない捕捉化合物がＨＢコア（ＨＢｃ）抗原である、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
5. 前記の第二の捕捉化合物が、以下の少なくとも１つ：
   （ｉ）前記の第一の捕捉化合物のアミノ酸配列内に、少なくとも１つのアミノ酸交換を導入すること、
   （ｉｉ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる細胞バックグラウンドにおいて、前記の第二の捕捉化合物を産生すること、
   （ｉｉｉ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、前記の第二の捕捉化合物のグリコシル化を除去するかまたは防止すること、
   （ｉｖ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる手段によって、そして／または異なる方法によって、前記の第二の捕捉化合物を精製すること、
   （ｖ）前記の第一の捕捉化合物に比較した際、異なる条件下で、前記の第二の捕捉化合物を変性させ、そして／または再フォールディングすること、および
   （ｖｉ）前記の第一の捕捉化合物と比較した際、異なる条件下で、前記の第二の捕捉化合物を保存すること
   によって、前記の第一の捕捉化合物に由来するかまたは由来可能である、請求項１〜４のいずれか一項の方法。
6. 前記分析物が、ウイルス抗原に対する抗体である、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
7. 工程ａ）が、
   前記分析物に関する前記第一及び前記第二の捕捉化合物を前記試料と接触させる工程を含む、または
   前記分析物に関する前記第一、前記第二、及び第三の捕捉化合物を前記試料と接触させる工程を含む、ここで、該第一、該第二、及び該第三の捕捉化合物は少なくとも１つの化学的および／または物理的特性が測定可能に異なる同一でない捕捉化合物であり、該第一、該第二、及び該第三の捕捉化合物は前記分析物への結合において競合し、そして該第一、該第二、及び該第三の捕捉化合物はポリペプチドである、
   請求項１〜６のいずれか一項の方法。
8. 前記分析物に結合する前記捕捉化合物中の化学構造が、前記の同一でない捕捉化合物すべてにおいて同一である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
9. 前記インディケーターは、光学的、酵素的特性、および放射能を放出する特性から選ばれる検出可能特性を有する、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
10. 少なくとも１つの化学的および／または物理的特性が測定可能に異なる、少なくとも２つの同一でない捕捉化合物、ならびにインディケーターに結合した特定剤を含む、試料中の分析物を検出するためのキットであって、ここで、該捕捉化合物は該分析物への結合において競合し、そして該捕捉化合物はポリペプチドである、ならびに該特定剤は該捕捉化合物への結合において該分析物と競合する、前記キット。
11. 前記捕捉化合物、または少なくとも前記分析物を含む前記試料の構成要素を固定するための固体支持体をさらに含む、請求項１０のキット。
12. 前記インディケーターは、光学的、酵素的特性、および放射能を放出する特性から選ばれる検出可能特性を有する、請求項１０または１１のキット。
13. （ｉ）試料中の分析物の量の測定のための分析ユニット、および（ｉｉ）評価のために、生じたデータをプロセシングするためのコンピュータユニットを含む、試料中の分析物を決定するためのデバイスであって、
    該デバイスは、少なくとも１つの化学的および／または物理的特性が測定可能に異なる、少なくとも２つの同一でない捕捉化合物、ならびにインディケーターに結合した特定剤を含む、ここで、該捕捉化合物は該分析物への結合において競合し、そして該捕捉化合物はポリペプチドである、ならびに該特定剤は該捕捉化合物への結合において該分析物と競合する、前記デバイス。
14. 前記インディケーターは、光学的、酵素的特性、および放射能を放出する特性から選ばれる検出可能特性を有する、請求項１３のデバイス。
15. 疾患診断に使用するための、少なくとも１つの化学的および／または物理的特性が測定可能に異なる、少なくとも２つの同一でない捕捉化合物、ならびにインディケーターに結合した特定剤を含む組成物であって、
    該捕捉化合物は試料中の分析物への結合において競合し、そして該捕捉化合物はポリペプチドである、ならびに該特定剤は該捕捉化合物への結合において該分析物と競合する、前記組成物。
16. 前記疾患がウイルス性肝炎である、請求項１５の組成物。
17. 前記インディケーターは、光学的、酵素的特性、および放射能を放出する特性から選ばれる検出可能特性を有する、請求項１５または１６の組成物。
18. 試料において分析物を決定するための、（ｉ）第一および第二の捕捉化合物を含む組成物、ならびに（ｉｉ）インディケーターに結合した特定剤の使用であって、該第一および第二の捕捉化合物は、少なくとも１つの化学的および／または物理的特性において測定可能に異なる、同一でない捕捉化合物であり、該捕捉化合物は該分析物への結合において競合し、該捕捉化合物はポリペプチドであり、そして該特定剤は、該捕捉化合物への結合において該分析物と競合する、前記使用。
19. 前記インディケーターは、光学的、酵素的特性、および放射能を放出する特性から選ばれる検出可能特性を有する、請求項１８の使用。

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