JP6725513B2 - ヘルパー株媒介型真菌ゲノム改変用の組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、全体が参照により本明細書に援用される米国仮出願第62/092,444号明細書(2014年12月16日に出願されている)に対する優先権を主張する。
(37C.F.R.§1.52(e)に従って)EFSを介して提出した配列表を参照により本明細書に援用する。EFSを介して提出した配列表テキストファイルには、2015年12月11日に作成したファイル「40692−WO−PCT−4_2015−579 final_ST25.txt」(100キロバイトのサイズである)が含まれている。
用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」、「機能的に等価な断片」および同類のものは互換的に使用され、親ポリペプチドの定性的な酵素活性を保持する親ポリペプチドの一部または部分配列を意味する。機能的断片は親ポリペプチドと比較して定量的な酵素活性が変更されている場合があることに本明細書では留意されたい。
上記でまとめたように、本開示は、真菌宿主細胞(例えば糸状真菌宿主細胞)中での遺伝子変更を促進するためにヘルパー株システムを用いるための組成物および方法を提供する。
1.真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーDNAとの相同組換えの方法であって、
(a)ヘルパー真菌株と標的真菌株との間で異核共存体を生じさせることであって、前記ヘルパー真菌株が、非相同末端結合(NHEJ)メカニズムを沈黙させる発現構築物を含む、生じさせること、
(b)前記異核共存体にドナーDNAを導入することであって、前記ドナーDNAが、前記標的株中におけるゲノム遺伝子座での相同組換えに十分な前記ゲノム遺伝子座に対する相同領域を含む、導入すること、
(c)前記(b)の異核共存体細胞から胞子を生じさせてプレーティングすること、ならびに
(d)前記プレーティングした胞子から、(i)前記ドナーDNAが前記ゲノム遺伝子座での相同組換えによりゲノムに組み込まれているおよび(ii)前記非相同末端結合(NHEJ)メカニズムを沈黙させる前記発現構築物が存在しない細胞を同定すること
を含む方法。
2.前記発現構築物がku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4およびxrsの内の1種または複数種を沈黙させる、実施形態1に記載の方法。
3.前記発現構築物がku80、ku70または両方を沈黙させる、実施形態2に記載の方法。
4.前記異核共存体に機能的Cas/ガイドRNA複合体を導入することであって、前記Cas/ガイドRNA複合体が前記ゲノム遺伝子座内で標的部位を有する、導入することを更に含む実施形態1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5.前記CasがCasニッカーゼである、実施形態4に記載の方法。
6.前記ドナーDNAが目的のポリヌクレオチド配列を含み、前記ゲノム遺伝子座での相同組換えにより前記ゲノム遺伝子座中で前記目的のポリヌクレオチド配列が挿入される、実施形態1〜5のいずれか一つに記載の方法。
7.前記CasエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体である、実施形態1〜6のいずれか一つに記載の方法。
8.前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの変異体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、C.ジェジュニ(C.jejuni)、ナイセリア(Neisseria)種、N.メニンジティデス(N.meningitides)、フランシセラ(Francisella)種、F.ノビシダ(F.novicida)およびパスツレラ(Pasteurella)種、P.ムルトシダ(P.multocida)からなる群から選択される種由来の完全長Cas9またはこの機能的断片を含む、実施形態7に記載の方法。
9.前記異核共存体に前記機能的Cas/ガイドRNA複合体を導入することが、前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態4〜8のいずれか一つに記載の方法。
10.前記異核共存体に前記機能的Cas/ガイドRNA複合体を導入することが、前記ガイドRNA用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、実施形態4〜9のいずれか一つに記載の方法。
11.前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Casエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、実施形態4〜8のいずれか一つまたは実施形態10に記載の方法。
12.前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドRNAを直接導入することを含む、実施形態4〜9のいずれか一つまたは実施形態11に記載の方法。
13.前記真菌細胞が糸状真菌細胞である、実施形態1〜12のいずれか一つに記載の方法。
14.前記真菌細胞がユウミコチニア(Eumycotina)真菌細胞またはペジゾミコチニア(Pezizomycotina)真菌細胞である、実施形態1〜13のいずれか一つに記載の方法。
15.前記糸状真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される、実施形態1〜14のいずれか一つに記載の方法。
16.前記真菌細胞がトリコデルマ(Trichoderma)種の細胞である、実施形態1〜15のいずれか一つに記載の方法。
17.前記トリコデルマ(Trichoderma)種がトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)である、実施形態16に記載の方法。
18.前記ドナーDNAが前記ゲノム遺伝座で前記ゲノムに部分的に組み込まれている、実施形態1〜17のいずれか一つに記載の方法。
19.前記ドナーDNAの組込みにより前記ゲノム遺伝子座が改変される、実施形態1〜18のいずれか一つに記載の方法。
20.前記改変が、1個または複数個のヌクレオチドの欠失、1個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、1個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態19に記載の方法。
21.前記同定する工程が、前記ゲノム遺伝子座での前記ドナーDNAの組込みまたは前記ゲノム遺伝子座の改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程(c)からの胞子から成長した細胞を培養することを含む、実施形態1〜20のいずれか一つに記載の方法。
22.実施形態1〜21のいずれか一つに記載の方法により製造されている組換え真菌細胞。
コロニー増殖を補完するためにおよび対立遺伝子の優性を決定するためにヘルパー株を使用する実験を実施した。そのような実験の内の一つのワークフローおよび結果を図7に示す。実験の工程は下記を含む。
1)ヘルパー株(HS)と標的株(CS、または図7中のコロニー株)とを融合させて異核共存体にする、
2)この異核共存体から分生子を生じさせる、
3)分生子を回収して適切な濃度まで希釈する、
4)選択培地上で分生子をプレーティングし、コロニーを計数して表現型および栄養要求性に印を付ける、
5)得られた株を確認する。
構築物
ku80を沈黙させるためのpAVTrku80sil構築物(図2A)は、イントロン配列で中断されているセンスku80 DNA配列およびアンチセンスku80 DNA配列を含み、分岐プロモーター(divergent promoter)により駆動される。この分岐プロモーターはまた、プチロサルカス(Ptilosarcus)種の緑色蛍光タンパク質(PtGFP)の発現も駆動させ、緑色蛍光タンパク質はアンチセンスカセット発現の指標と機能する。この構築物はamdS選択マーカーも含む。
T.リーゼイ(T.reesei)株(RL−P37 Δcbh1 Δcbh2 Δegl1 Δegl2)を、T.リーゼイ(T.reesei)ku80遺伝子サイレンシング構築物(図2A)で形質転換した。強力なGFPシグナルを有する6個の安定した候補を選択し、検証し、胞子精製した。6個の候補それぞれからの4個の胞子精製済単離株を24ウェルプレート中で増殖させ、サイレンシングのレベルを示すGFPシグナルの強度を評価した。最高のGFPシグナルを有する各候補からの1個の胞子精製済単離株を、Δhis3::hph欠失構築物による形質転換用に選択した。
最高レベルのGFP発現を有するサイレンシング構築物を含む上記からの胞子精製済株を、hph選択マーカーを含む線状his3欠失カセット(図3)による形質転換での相同組込みの効率に関して試験した。最高レベルのNHEJサイレンシングを示すΔhis3欠失(60%)を含む形質転換体の割合が最も高いサイレンシング株を選択し、ヘルパー株として使用することができる。ヘルパー株を、機能していないpyr2遺伝子座(栄養マーカー)および任意選択でコロニー形態の変化(劣性の特徴)を有する宿主株と融させることができる。次いで、最少培地上で増殖した強制型異核共存体を、選択マーカーとして機能的pyr2マーカー(このマーカーは栄養マーカーでもある)を含む線状の遺伝子置換構築物(図4)でのPEG形質転換により形質転換し、最少培地上でプレーティングした。分生子を回収し、連続希釈物を最少培地上でプレーティングすることができる。最少培地上で増殖するコロニー(および、コロニー形態の変化という特徴が含まれた場合にはこの変化を有する)を欠失構築物の相同組換えに関して評価することができ、相同組換えの効率を決定することができる。
一実施形態では、使用者は、ヘルパー株中でcreリコンビナーゼを発現させて、loxP部位が隣接している標的細胞中の任意のDNA断片の除去に使用することができる。
別の実施形態では、使用者は、好ましくはNHEJが沈黙しているヘルパー株中でCasRNA誘導型エンドヌクレアーゼを発現させて、このCasRNA誘導型エンドヌクレアーゼを使用して標的細胞中において標的とする二本鎖DNA切断を生じさせることができる。1つの利点は、標的部位での相同組換えによるドナーDNA断片の組込みを二本鎖DNA切断が刺激するということである。NHEJを沈黙させることにより、NHEJ経路を介してドナーDNA断片が組み込まれる頻度が最小限に抑えられる。一実験では、実施例2で説明したNHEJサイレンシングDNA構築物を含むおよび効率的な相同組換えを示しているヘルパー株を、PCT出願第PCT/CN2014/093914号(2014年12月16日に出願された、参照により本明細書に援用される)で開示されているものと類似したCas9発現ベクター(図8)で形質転換する。このベクターは、選択可能マーカーとしてのクロリムロンエチルに対する耐性を付与するT.リーゼイ(T.reesei)als1遺伝子の変異バージョンを使用し、このベクターが染色体DNAに安定的に組み込まれている形質転換体を新規のヘルパー株として選択する。このヘルパー株を標的株(機能していないpyr2遺伝子を有する)と融合させて、ヒスチジンおよびウリジンを欠いている選択培地上で強制型異核共存体を作製する。次いで、この異核共存体を、sgRNA(単一ガイドRNA)と標的細胞のゲノム内の定義された標的部位での組込みが望ましいドナーDNA断片との混合物で共形質転換する。sgRNAを、前記定義された標的部位にcas9エンドヌクレアーゼを誘導するように設計し、PCT出願第PCT/CN2014/093916号(2014年12月16日に出願された、参照により本明細書に援用される)で説明されているin vitroでの転写反応を使用して生成する。T.リーゼイ(T.reesei)のad3A遺伝子、グルコアミラーゼ(TrGA)遺伝子またはpyr2遺伝子にCas9を誘導するにように設計されているsgRNAの配列の例を下記に示す。
sgRNA:gAd3A TS1;配列番号17
配列番号1
コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子;N末端NLS配列およびC末端NLS配列あり
配列番号1によりコードされるストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9、N末端NLS配列およびC末端NLS配列あり
完全なU6遺伝子プロモーター配列(転写開始部位を含まない)
トランケートされた/短いU6遺伝子プロモーター配列(転写開始部位を含まない)
U6遺伝子のイントロン
U6遺伝子の転写ターミネーター配列
TTTTTTTTCTCTT
配列番号7
糸状真菌細胞コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9コーディング遺伝子、NLSなし
配列番号7によりコードされるストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9、NLSなし
SV40 NLS
PKKKRKV
配列番号10
T.リーゼイ(T.reesei)blr2(青色光制御因子2)遺伝子のNLS
KKKKLKL
配列番号11
ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)LMD−9 Cas9
ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)UA159 Cas9
カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)Cas9
ナイセリア・メニンジティデス(Neisseria meningitides)Cas9
フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)亜種ノビシダ(novicida)Cas9
パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)Cas9
sgRNA:gAd3A TS1
sgRNA:gTrGA TS2
sgRNA:gTrGA TS11
sgRNA:gPyr2 TS6
Claims (20)
- 真菌細胞中でのゲノム遺伝子座とドナーDNAとの相同組換えの方法であって、
(a)ヘルパー真菌株と標的真菌株との間で異核共存体を生じさせることであって、前記ヘルパー真菌株が、非相同末端結合(NHEJ)メカニズムを沈黙させる発現構築物を含む、生じさせること、
(b)前記異核共存体にドナーDNAを導入することであって、前記ドナーDNAが、前記標的株中におけるゲノム遺伝子座での相同組換えに十分な前記ゲノム遺伝子座に対する相同領域を含む、導入すること、
(c)前記(b)の異核共存体細胞から胞子を生じさせてプレーティングすること、ならびに
(d)前記プレーティングした胞子から、(i)前記ドナーDNAが前記ゲノム遺伝子座での相同組換えによりゲノムに組み込まれているおよび(ii)前記非相同末端結合(NHEJ)メカニズムを沈黙させる前記発現構築物が存在しない細胞を同定すること
を含むとともに、前記発現構築物がku80、ku70、およびlig4の内の1種または複数種を沈黙させる、
方法。 - 前記発現構築物がku80、ku70の両方を沈黙させる、請求項1に記載の方法。
- 前記異核共存体に機能的Cas/ガイドRNA複合体を導入することであって、前記Cas/ガイドRNA複合体が前記ゲノム遺伝子座内で標的部位を有する、導入することを更に含む請求項1または2に記載の方法。
- 前記CasがCasニッカーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記ドナーDNAが目的のポリヌクレオチド配列を含み、前記ゲノム遺伝子座での相同組換えにより前記ゲノム遺伝子座中で前記目的のポリヌクレオチド配列が挿入される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- CasエンドヌクレアーゼがCas9エンドヌクレアーゼまたはこの多様体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Cas9エンドヌクレアーゼまたはこの多様体が、ストレプトコッカス(Streptococcus)種、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.ミュータンス(S.mutans)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、カンピロバクター(Campylobacter)種、C.ジェジュニ(C.jejuni)、ナイセリア(Neisseria)種、N.メニンジティデス(N.meningitides)、フランシセラ(Francisella)種、F.ノビシダ(F.novicida)およびパスツレラ(Pasteurella)種、P.ムルトシダ(P.multocida)からなる群から選択される種由来の完全長Cas9またはこの機能的断片を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記異核共存体に前記機能的Cas/ガイドRNA複合体を導入することが、前記Casエンドヌクレアーゼ用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項3〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異核共存体に前記機能的Cas/ガイドRNA複合体を導入することが、前記ガイドRNA用の発現カセットを含むDNA構築物を前記真菌細胞に導入することを含む、請求項3〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記Casエンドヌクレアーゼを直接導入することを含む、請求項3〜7または請求項9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記導入する工程が、前記真菌細胞に前記ガイドRNAを直接導入することを含む、請求項3〜8または請求項10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真菌細胞が糸状真菌細胞である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真菌細胞がユウミコチニア(Eumycotina)真菌細胞またはペジゾミコチニア(Pezizomycotina)真菌細胞である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 糸状真菌細胞が、トリコデルマ(Trichoderma)、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)、フミコーラ(Humicola)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フサリウム(Fusarium)、マイセリオフトラ(Myceliophthora)、ニューロスポラ(Neurospora)、ヒポクレア(Hypocrea)およびエメリセラ(Emericella)からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真菌細胞がトリコデルマ(Trichoderma)種の細胞である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トリコデルマ(Trichoderma)種がトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)である、請求項15に記載の方法。
- 前記ドナーDNAが前記ゲノム遺伝座で前記ゲノムに部分的に組み込まれている、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナーDNAの組込みにより前記ゲノム遺伝子座が改変される、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変が、1個または複数個のヌクレオチドの欠失、1個または複数個のヌクレオチドの挿入、目的のタンパク質をコードする発現カセットの挿入、1個または複数個のヌクレオチドの置換およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記同定する工程が、前記ゲノム遺伝子座での前記ドナーDNAの組込みまたは前記ゲノム遺伝子座の改変を選択するためのまたはスクリーニングするための条件下で前記工程(c)からの胞子から成長した細胞を培養することを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
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