JP6721665B2 - 目的遺伝子発現の線形結合を用いた細胞信号伝達経路活性の評価 - Google Patents

Description

本明細書に記載される主題は、主に、生物情報学、ゲノム処理技術、プロテオーム処理技術、及び関連する技術に関する。

ゲノム及びプロテオーム分析は、種々の癌がゲノム突然変異／変化及び／又は例えば細胞増殖及び転移等の癌の成長及び進化に役割を果たす固有の遺伝子に関する高い若しくは低い発現レベルの固有の組み合わせに関連することが知られている腫瘍学等の医療分野における臨床的応用にとり相当に実現され且つ潜在的な将来性を有している。例えば、Wnt信号伝達経路（Wntシグナル経路）は、細胞増殖の調節に影響し、高度に調節される。調整の喪失による高度のWnt経路活性は、癌、とりわけ悪性の結腸腫瘍と相関されている。如何なる特定の動作原理にも限定されるものではないが、悪性結腸細胞におけるWnt経路の脱調節（deregulation）は、高度のWnt経路活性につながり、その結果、該悪性結腸細胞の細胞増殖、即ち結腸癌の拡散を生じさせると信じられる。一方、異常に低い経路活性も、例えば骨粗鬆症の場合に関心のあるものであり得る。

ゲノム及びプロテオームデータを収集する技術は、臨床設備において既に利用可能になっている。例えば、マイクロアレイによる測定は、遺伝子発現レベル、タンパク質レベル及びメチル化レベル等を評価するために日常的に採用されている。自動遺伝子配列解析技術は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの遺伝子変化の費用効果的識別を可能にしている。遺伝子配列解析の間におけるｍＲＮＡレベルの量的評価は、未だ遺伝子発現レベルを評価するための他の臨床ツールとしての将来性を保持している。

これらの進展にも拘わらず（又は、恐らくは、それ故に）、ゲノム及びプロテオーム分析の臨床的応用は大きな困難（データオーバーロード）に直面している。例えば、単一の臨床サンプルにおける識別可能な突然変異の数は数十万又はそれ以上に達し得る。これらの突然変異の殆どは、癌の成長に対して特に貢献しない、所謂、バイスタンダ（脇役）突然変異であり、僅かなものだけが癌の成長及び機能進化に貢献し、これらが効果的治療のための目標を示す。単一のマイクロアレイは、数万の遺伝子に関して遺伝子発現レベルを発生することができる。例えば正しい治療法を選択する応用例におけるような臨床的に有用な情報を識別するために、これらの大量のデータを処理することは困難である。

１つの方法は、当該分析を、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された試験等の、僅かな標準的又は規格化された試験に限定することである。斯様な方法においては、固有の標識（indicator）又は標識の組み合わせ（例えば、突然変異及び／又は指定された高い又は低い遺伝子発現レベル）が、当該指示された疾病条件（例えば、特定のタイプの癌）に対する“陽性（positive）”を検査するために検出される。斯かる標準的試験は、疾病条件との又は治療効果との強い相関を示している臨床的研究によりサポートされている。この方法は、例えば疾病の固有の診断、又は特定のステージの特定の癌タイプにおける薬剤に対する反応の予測等の、標準的試験が開発された臨床的条件に対してのみ有効であり、斯かる標準的条件にしか適用可能でないので、柔軟性がない。

他の方法は、ゲノム又はプロテオーム標識の機能的に関係するグループの識別に基づくものである。例えば、Wnt経路はプロテオーム反応の連鎖（カスケード）を有する。この鎖の主要な要素は、（限定されるものではないが）当該細胞の縮れた表面受容体に対するWnt信号伝達タンパク質の結合を含み、このことはタンパク質の乱された族のタンパク質の活性を生じさせ、その結果、当該細胞核内のβカテニン／ＴＣＦ４基タンパク質複合体等の転写因子のレベルに影響を与える。これらの転写因子は、結果として、目標ｍＲＮＡ分子の転写を制御し、その結果、該分子はWnt経路の目標タンパク質に翻訳される。臨床的研究は、Wnt経路の調節タンパク質（regulatory proteins）と該Wnt経路の活性との間の幾らかの相関を示している。

しかしながら、このような臨床研究結果を特定の患者の診断及び臨床的評価に適用することは、信号伝達経路（例えば、Wnt経路）の複雑さにより困難である。簡単な例として、Wnt経路において“上流側”であるタンパク質の発現レベルの測定は、該Wnt経路において“下流側”であるタンパク質の異常な挙動を検出し損なう可能性がある。Wnt経路は多数のフィードバックメカニズムを含んでおり、“上流側”及び“下流側”という単純化された概念はWnt経路の相当の部分に対しては適用不能であり得ると信じられる。もっと一般的には、Wntカスケードの一部分における異常な挙動は、該タンパク質カスケードの他の部分に対して及びWnt経路の全体としての活性に対して多かれ少なかれ影響し得る。更に、幾つかの臨床研究において、信号伝達カスケードの調節タンパク質に関するタンパク質発現レベルは、該調節タンパク質に関してエンコードを行う遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することにより評価される。この方法は、調節タンパク質の発現レベルを正確に評価することができない間接的測定であり、活性タンパク質（リン酸化反応等の固有の翻訳後修飾の後の）の量を殆ど反映しない。

本発明の基となる課題は、ゲノム及びプロテオーム分析を実行するのに適した方法及び手段を提供することである。該基となる課題の固有の側面及び本発明に関連する他の目的は、例えば本明細書に提示された説明を精査すれば、特に添付請求項を精査すれば明らかになる。

本発明は、本明細書に開示された改善された方法及び装置を提供する。

本発明の主たる態様によれば、上記課題は細胞信号伝達経路の活性を目的遺伝子の発現の線形結合を用いて評価する固有の方法により解決され、該方法は
− 医療対象（患者）の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路（cellular signaling pathway）の活性を、少なくとも前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定された前記細胞信号伝達経路の１以上の目的遺伝子（target gene）の発現レベルに（特には、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質（活性）レベルに）基づいて推定するステップであって、
前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおける転写因子（ＴＦ）要素のレベルを決定するステップであって、前記ＴＦ要素は前記細胞信号伝達経路の前記１以上の目的遺伝子の転写を制御し、前記決定は前記細胞信号伝達経路の前記１以上の目的遺伝子の発現レベルを前記ＴＦ要素のレベルに関連させる数学的モデルを評価することに少なくとも部分的に基づくものであり、前記モデルが前記１以上の目的遺伝子の発現レベルの１以上の線形結合に少なくとも部分的に基づくものであるステップと、
前記医療対象の組織及び／又は細胞における前記細胞信号伝達経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおける前記ＴＦ要素の前記決定されたレベルに基づいて推定するステップと、
を有するステップと、
− 前記細胞信号伝達経路が前記医療対象の組織及び／又は細胞において異常に働いているかを、前記医療対象の組織及び／又は細胞における前記細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づいて決定するステップと、
を有し、
前記推定するステップは、デジタル処理装置により前記細胞信号伝達経路のモデルを使用して実行される。

上記医療対象は、人又は動物であり得る。更に、上記“目的遺伝子”は、“直接目的遺伝子”及び／又は“間接目的遺伝子”（本明細書で説明する）であり得る。

前記1以上の目的遺伝子の各々に関して前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定された１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合が前記1以上の目的遺伝子の各々に関して供給された前記１以上の発現レベルのうちの全ての発現レベルの線形結合を有する方法が、好ましい。

また、前記1以上の目的遺伝子の各々に関して前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定された１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合が、前記１以上の目的遺伝子の各々に関して、加重された項を含む線形結合を有し、各加重された項が、対応する目的遺伝子に関して供給された前記１以上の発現レベルのうちの１つのみの発現レベルに基づくものである方法が好ましい。

また、前記1以上の目的遺伝子の各々に関して前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定された１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合が、前記１以上の目的遺伝子の各々に関して、対応する目的遺伝子に関して供給された前記１以上の発現レベルの全ての発現レベルの第１線形結合を有し、前記モデルは前記１以上の目的遺伝子の各々に関して加重された項を含む他の線形結合に更に少なくとも部分的に基づくものであり、各加重された項が、対応する目的遺伝子に関する前記第１線形結合に基づくものである方法が好ましい。

前記細胞信号伝達経路は、Wnt経路、ＥＲ（エストロゲン受容体）経路、ＡＲ（アンドロゲン受容体）経路又はＨＨ（ヘッジホッグ）経路であり得る。

従って、好ましい実施態様によれば、前記細胞信号伝達経路は、Wnt経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路又はＨＨ経路を有する。

特に好適な目的遺伝子は、以下の文章において及び後に例（表１〜９参照）として記載する。

従って、好ましい実施態様によれば、目的遺伝子（又は複数の目的遺伝子）は、表１又は表６（Wnt経路に関するもの）に記載された目的遺伝子、表２、表５又は表７（ＥＲ経路に関するもの）に記載された目的遺伝子、表３又は表８（ＨＨ経路に関するもの）に記載された目的遺伝子、及び表４又は表９（ＡＲ経路に関するもの）に記載された目的遺伝子を有する又は斯かる目的遺伝子からなる群から選択される。

特に好ましいものは、前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるWnt経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたWnt経路の、KIAA1199、AXIN2、RNF43、TBX3、TDGF1、SOX9、ASCL2、IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6及びFZD7を有する（又は、からなる）群から選択される１以上の、好ましくは少なくとも３つの目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを有する方法である。

更に好ましいものは、上記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたWnt経路の、NKD1、OAT、FAT1、LEF1、GLUL、REG1B、TCF7L2、COL18A1、BMP7、SLC1A2、ADRA2C、PPARG、DKK1、HNF1A及びLECT2を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである方法である。

特に好ましいものは、前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＥＲ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたＥＲ経路の、CDH26、SGK3、PGR、GREB1、CAl2、XBP1、CELSR2、WISP2、DSCAM、ERBB2、CTSD、TFF1及びNRIP1を有する（又は、からなる）群から選択される１以上の、好ましくは少なくとも３つの目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを有する方法である。

更に好ましいものは、上記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたＥＲ経路の、AP1B1、ATP5J、COL18A1、COX7A2L、EBAG9、ESR1、HSPB1、IGFBP4、KRT19、MYC、NDUFV3、PISD、PRDM15、PTMA、RARA、SOD1及びTRIM25を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである方法である。

前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＨＨ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたＨＨ経路の、GLI1、PTCH1、PTCH2、IGFBP6、SPP1、CCND2、FST、FOXL1、CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、FOXM1、GLI3、TCEA2、FYN及びCTSL1を有する（又は、からなる）群から選択される１以上の、好ましくは少なくとも３つの目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを有する方法も、好ましい。

更に好ましいものは、上記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたＨＨ経路の、BCL2、FOXA2、FOXF1、H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、MYLK、NKX2.2、NKX2.8、PITRM1及びTOM1を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである方法である。

前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＡＲ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたＡＲ経路の、KLK2、PMEPA1、TMPRSS2、NKX3_1、ABCC4、KLK3、FKBP5、ELL2、UGT2B15、DHCR24、PPAP2A、NDRG1、LRIG1、CREB3L4、LCP1、GUCY1A3、AR及びEAF2を有する（又は、からなる）群から選択される１以上の、好ましくは少なくとも３つの目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを有する方法も好ましい。

更に好ましいものは、上記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の前記抽出されたサンプルにおいて測定されたＡＲ経路の、APP、NTS、PLAU、CDKN1A、DRG1、FGF8、IGF1、PRKACB、PTPN1、SGK1及びTACC2を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである方法である。

本発明の他の態様は、
前記医療対象に対する前記細胞信号伝達経路の異常な働きを補正する薬剤の処方を推奨するステップ、
を更に有する方法（本明細書に記載される）に関するものであり、
前記推奨は、前記細胞信号伝達経路が該細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づいて前記医療対象の組織及び／又は細胞において異常に働いていると判定された場合にのみ実行される。

また、本発明は、
医療対象の組織及び／又は細胞におけるWnt経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたWnt経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、
医療対象の組織及び／又は細胞におけるＥＲ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＥＲ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、
医療対象の組織及び／又は細胞におけるＨＨ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＨＨ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、及び／又は
医療対象の組織及び／又は細胞におけるＡＲ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＡＲ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、
を有する方法（本明細書に記載される）にも関するものである。

好ましくは、前記Wnt経路の前記一群の目的遺伝子は、KIAA1199、AXIN2、RNF43、TBX3、TDGF1、SOX9、ASCL2、IL8、SP5、ZNRF3、KLF6、CCND1、DEFA6及びFZD7を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも９つの、好ましくは全ての目的遺伝子を含み、
前記ＥＲ経路の前記一群の目的遺伝子は、CDH26、SGK3、PGR、GREB1、CAl2、XBP1、CELSR2、WISP2、DSCAM、ERBB2、CTSD、TFF1及びNRIP1を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも９つの、好ましくは全ての目的遺伝子を含み、
前記ＨＨ経路の前記一群の目的遺伝子は、GLI1、PTCH1、PTCH2、IGFBP6、SPP1、CCND2、FST、FOXL1、CFLAR、TSC22D1、RAB34、S100A9、S100A7、MYCN、FOXM1、GLI3、TCEA2、FYN及びCTSL1を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも９つの、好ましくは全ての目的遺伝子を含み、及び／又は
前記ＡＲ経路の前記一群の目的遺伝子は、KLK2、PMEPA1、TMPRSS2、NKX3_1、ABCC4、KLK3、FKBP5、ELL2、UGT2B15、DHCR24、PPAP2A、NDRG1、LRIG1、CREB3L4、LCP1、GUCY1A3、AR及びEAF2を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも９つの、好ましくは全ての目的遺伝子を含む。

前記Wnt経路の前記一群の目的遺伝子が、NKD1、OAT、FAT1、LEF1、GLUL、REG1B、TCF7L2、COL18A1、BMP7、SLC1A2、ADRA2C、PPARG、DKK1、HNF1A及びLECT2を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含み、
前記ＥＲ経路の前記一群の目的遺伝子が、AP1B1、ATP5J、COL18A1、COX7A2L、EBAG9、ESR1、HSPB1、IGFBP4、KRT19、MYC、NDUFV3、PISD、PRDM15、PTMA、RARA、SOD1及びTRIM25を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含み、
前記ＨＨ経路の前記一群の目的遺伝子が、BCL2、FOXA2、FOXF1、H19、HHIP、IL1R2、JAG2、JUP、MIF、MYLK、NKX2.2、NKX2.8、PITRM1及びTOM1を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含み、及び／又は
前記ＡＲ経路の前記一群の目的遺伝子が、APP、NTS、PLAU、CDKN1A、DRG1、FGF8、IGF1、PRKACB、PTPN1、SGK1及びTACC2を有する（又は、からなる）群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含む、
方法が特に好ましい。

本発明により使用されるべき前記サンプルは、例えば、好ましくは生検手順又は他のサンプル抽出手順を介して、乳房病変から、結腸癌を有すると分かっている若しくは疑われる医療対象の結腸から、又は肝臓癌を有することが分かっている若しくは疑われる医療対象の肝臓等々から取得されたサンプルとすることができる。サンプルが抽出される前記組織は、例えば、結腸、乳房、肝臓又は他の臓器の外側に拡散した該結腸、乳房、肝臓又は他の臓器に由来する（疑わしい）悪性組織等の転移性組織とすることもできる。サンプルが抽出される細胞は、血液悪性腫瘍（白血病等の）からの腫瘍性細胞とすることもできる。幾つかのケースにおいて、細胞サンプルは、循環腫瘍細胞、即ち血流に入った腫瘍細胞とすることもでき、適切な分離技術を用いて抽出された組織サンプルとして抽出することができる。本明細書で使用される“抽出されたサンプル”なる用語は、医療対象の組織及び／又は細胞が該医療対象から採取され、例えば顕微鏡スライド上に載置された場合、及び、請求項に記載された方法を実行するために、このサンプルの一部が例えばレーザキャプチャマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により又は当該スライドから関心細胞を掻き取ることにより抽出される場合も含む。

“細胞信号伝達経路が異常に働いている”なる語句は、当該経路の“活性”が期待されたものでない場合を示し、その場合において、“活性”なる用語は目的遺伝子を発現へと駆り立てる転写因子複合体の活動、即ち目的遺伝子が転写される速度を示し得る。正常とは、不活性であることが期待される場合に組織内で不活性であり、活性であることが期待される場合に活性である場合であり得る。更に、正常と考えられる特定のレベルの活性が存在し得、より高い又は低い如何なるものも異常と考えられ得る。

他の開示された態様によれば、装置は、ここに記載された本発明による方法を実行するように構成されたデジタルプロセッサを有する。

他の開示された態様によれば、非一時的記憶媒体は、ここに記載した本発明による方法を実行するためにデジタル処理装置により実行することが可能な命令を記憶する。該非一時的記憶媒体は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光ディスク若しくは他の光記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読出専用メモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、又は他の電子記憶媒体若しくはネットワークサーバ等のコンピュータ読取可能な記憶媒体とすることができる。上記デジタル処理装置は、携帯装置（例えば、パーソナル・デジタル・アシスタント又はスマートフォン等）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、又は遠隔ネットワークサーバ等であり得る。

他の開示された態様によれば、コンピュータプログラムは、デジタル処理装置に、ここに記載した本発明による方法を実行させるプログラムコード手段を有する。該デジタル処理装置は、携帯装置（例えば、パーソナル・デジタル・アシスタント又はスマートフォン等）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、又は遠隔ネットワークサーバ等であり得る。

１つの利点は、臨床的推奨例を、例えばWnt経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路及び／又はＨＨ経路の数学的モデルを用いる１以上の細胞信号伝達経路の数学的分析に基づいて提供する臨床意思決定支援（ＣＤＳ）システムに存在する。

他の利点は、１以上の線形結合に少なくとも部分的に基づいた数学的モデルの改善された透明性に存在する。

他の利点は、細胞信号伝達経路の調節の喪失に対する目的となる治療を推奨するＣＤＳシステムを提供することに存在する。

他の利点は、Wnt経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路又はＨＨ経路等の特定の細胞信号伝達経路に関する調節の喪失を検出するように設計されると共に、該特定の細胞信号伝達経路が源となる異なるタイプの癌に対する推奨例を提供するように容易に適応化されるＣＤＳシステムを提供することに存在する。

ここに記載された本発明は、例えば、
− 予測された（推定された）活性に基づく診断、
− 予測された（推定された）活性に基づく予後診断、
− 予測された（推定された）活性に基づく薬剤処方、
− 予測された（推定された）活性に基づく薬効の予測、
− 予測された（推定された）活性に基づく有害効果（副作用）の予測、
− 薬効の監視、
− 薬剤の開発、
− アッセイ（分析方法）の開発、
− 経路の研究、
− 癌進行度分類、
− 予測された（推定された）活性に基づく対象の臨床試験への加入、
− 実行されるべき後の試験の選択、及び／又は
− コンパニオン診断テストの選択、
に有利に使用することができる。

更なる利点は、当業者によれば、添付図面及び以下の説明を精読及び理解し、特に以下に示される例の詳細な説明を精読すれば明らかとなるであろう。

図１は、細胞信号伝達経路の一部を表す解説的モデルを示す。該細胞信号伝達経路は、転写因子（ＴＦ）複合体及び該転写因子複合体が細胞核内に存在する結果として生成される目的遺伝子により記号化されている。ｗ_１、ｗ_２及びｗ_３により示された、目的遺伝子の発現のノードとＴＦノードとを接続する重みは、例えば訓練データ又は専門家の知識に基づく転写因子が存在することと目的遺伝子の発現との間の相関の強さを示す。 図２は、図１におけるのと同様に、細胞信号伝達経路の一部を表す簡単なモデルを示す。この場合、転写因子複合体の目的遺伝子発現ノードは、この場合は例えばマイクロアレイ又は(q)PCR実験において特定の目的遺伝子と特に高度に相関された１つのプローブセットによる目的遺伝子の発現強度レベルの直接測定により置換されている。重みは、訓練データセットからの計算に基づくか又は専門家の知識の何れかに基づくものである。 図３は、経路の活性信号伝達の実験的決定を一層詳細に表す解説的２層モデルを示す。各目的遺伝子に関して、集約レベルが、関連するプローブセットの測定された強度に基づいて線形結合を用いて計算される。計算された集約値は、次いで、線形結合を用い当該経路の他の目的遺伝子の集約値と結合される。重みは、訓練データセットから学習されるか、専門家の知識に基づくか、又はこれらの組み合わせとすることができる。 図４は、本明細書に開示された１以上の細胞信号伝達経路を評価するように構成された臨床意思決定支援（ＣＤＳ）システムを概念的に示す（Wnt経路に関して例示的に示されている）。 図５は、GSE8671の連続した発現データ、表１に記載された“全てのプローブセット”並びに“黒及び白”重みを用いたWnt訓練結果である。左側のグループはWntが受動的な正常なサンプルの計算された線形結合を表示する一方、右側のグループは活性Wnt経路を有することが知られている腺腫サンプルの計算された活性スコアを示す。 図６は、GSE20916（連続データ）の結腸癌サンプルの検証結果である。当該モデルは、GSE8671の連続発現データ、表１に記載された“全プローブセット”及び“黒及び白”重みを用いて訓練された（図５の訓練結果参照）。該モデルは、僅かに受動的Wnt経路を有すると予測された１つの癌腫サンプルを除き、全サンプルが活性又は不活性Wnt経路を有すると正しく予測している。 図７は、髄芽腫サンプル（GSE10327、連続データ）の検査結果である。当該モデルは、GSE8671の連続発現データ、表１に記載された“全プローブセット”及び“黒及び白”重みを用いて訓練された（図５の訓練結果参照）。該モデルは、全てのWnt陽性髄芽腫サンプル（最後のグループ）が僅かに活性なWnt経路を有すると予測することができる。全てのWnt陽性サンプルは、全てのWnt陰性サンプルと比較して、相対的に低い正のWnt活性スコアを有する。このことは、髄芽腫サンプルにおいては、恐らくは遺伝子発現の組織固有の違いにより、閾値は結腸サンプルにおけるよりも低くなければならないとの暗示であり得る。 図８は、GSE7553の連続発現データ、表３に記載された全プローブセットを用いた遺伝子集約による“２層”モデル及び“log odds（対数オッズ）”重みを用いたＨＨ訓練結果である。１番目及び５番目のグループのサンプル（左から）が、各々、陽性及び陰性訓練サンプルとして使用された。 図９は、髄芽腫サンプル（GSE10327）の連続発現データを用いたＨＨ検査結果である。当該モデルは、GSE7553の連続発現データ、“２層”モデル、表３に記載された全プローブセット及び“対数オッズ”重みを用いて訓練された（図８の訓練結果参照）。ＨＨ陽性グループ（shhにより示される）におけるサンプルの約半分は当該モデルにより活性経路を有すると予測される。 図１０は、GSE8597の連続発現データ、 “最も判別的プローブセット”（表２における下線が付されたプローブセット）及び“対数オッズ”重みを用いたＥＲ訓練結果である。３番目及び４番目のグループのサンプル（左から）が、各々、陽性及び陰性訓練サンプルとして使用された。 図１１は、乳癌サンプル（GSE12276）の連続データを用いたＥＲ検査結果である。当該モデルは、GSE8597の連続発現データ、“最も判別的プローブセット”（表２における下線が付されたプローブセット）及び“対数オッズ”重みを用いて訓練される（図１０の訓練結果参照）。ＥＲ＋サンプルの約２５％は活性ＥＲ経路を有すると予測され、このことは、これらのタイプの乳癌における５０〜６０％の相対的に高い効果のないホルモン治療により部分的に説明することができる。当該ＥＲ経路は、当該ＥＲサンプルにおいて受動的ＥＲ経路を有すると正しく予測される。 図１２は、幾つかの処理間隔に関してＥＲ刺激剤（Ｅ２）により処理されたＭＣＦ７細胞又は対照の刺激応答データにおけるＥＲ経路予測である。当該モデルは、GSE8597の連続発現データ、“最も判別的プローブセット”（表２における下線が付されたプローブセット）及び“対数オッズ”重みを用いて訓練される（図１０の訓練結果参照）。当該ＥＲ経路活性は、ＥＲ刺激剤に対する一層長い暴露時間の場合は増加し、上記対照における延長された飢餓の場合に減少すると適切に予測される。 図１３は、GSE7868のファジー変換発現データ、表４に記載された“全プローブセット”及び“黒及び白”重みを用いたＡＲ訓練結果である。一番目及び２番目のグループのサンプル（左から）が、各々、陰性及び陽性訓練サンプルとして使用された。 図１４は、異なる状態のＡＲ刺激により処理され又は処理されない細胞系（GSE7708、ファジー変換）のＡＲ検査結果である。当該モデルは、GSE7868のファジー変換発現データ、表４に記載された“全プローブセット”及び“黒及び白”重みを用いて訓練された（図１３に示された訓練結果参照）。該モデルは、ＡＲ刺激剤により処理された細胞系が活性ＡＲ経路を有し、ＡＲ刺激剤により処理されなかった（第４グループのサンプル）並びに刺激剤及び抗男性ホルモン薬剤により処理された（第１グループのサンプル）他の細胞系が受動的ＡＲ経路を有すると正しく予測する。 図１５は、前立腺サンプル（GSE17951、ファジー変換）のＡＲ検査結果である。当該モデルは、GSE7868のファジー変換発現データ、表４に記載された“全プローブセット”及び“黒及び白”重みを用いて訓練された（図１３に示された訓練結果参照）。該モデルは、生検及び外科的に除去された腫瘍の両方において相対的に高い頻度の活性ＡＲ経路を、対照サンプルにおいて相対的に小さな数のＡＲ活性を予測する。 図１６は、経路活性に従ってグループ化されたGSE12276データセットからの患者のカプラ・マイヤー生存曲線である。該生存曲線は、活性ＥＲ経路を持つ患者は受動的ＥＲ経路を持つ患者と比較して一層良好な予後を有することを示し、これは臨床実践と合致している。加えて、活性ＨＨ又はWnt経路を持つと予測される患者は、より悪い予後を有すると予測され、このことは、科学文献によってもサポートされる。 図１７は、ＭＣＦ７細胞（GSE9253、連続データ）による刺激実験のＥＲ検証結果である。当該（擬）線形モデルは、GSE8597の連続発現データ、“最も判別的プローブセット”（表２における下線が付されたプローブセット）及び“対数オッズ”重みを用いて訓練された（図１０の訓練結果参照）。Ｅ２、即ちＥＲ刺激剤により刺激されたＭＣＦ７細胞から、定義された閾値は過度に高く設定されたことが明らかである。この不一致の理由は、異なる刺激状態（即ち、より高いＥ２濃度であるが、より短い刺激時間等）であり得る。それにも拘わらず、刺激された及び刺激されない細胞の計算されたＥＲ活性スコアの差が明らかである。陰性の対照は、ＥＲ経路が不活性であると適切に予測している。 図１８は、GSE12276の管腔ＡサンプルにおけるWnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路活性を示す。 図１９は、GSE12276の基底サンプルにおけるWnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路活性を示す。 図２０は、GSE21618からのＭＣＦ７及びタモシフェン耐性ＭＣＦ７細胞系における予測されたＥＲ経路活性を示す。当該ＥＲ（擬）線形モデルは、GSE8597の連続発現データ、“最も判別的プローブセット”（表２における下線が付されたプローブセット）及び“対数オッズ”重みを用いて訓練された（図１０の訓練結果参照）。異なるグループのサンプルで示される異なる刺激状態が適用され、ｍＲＮＡの発現が、マイクロアレイにより当該グループにおいて連続するサンプルにより示される０、１、２、３、６、１２、２４、４８時間において測定された。 図２１−１は、結腸サンプル（GSE20916）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２１−２は、結腸サンプル（GSE20916）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２２−１は、結腸サンプル（GSE4183）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２２−２は、結腸サンプル（GSE4183）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２３−１は、結腸サンプル（GSE15960）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２３−２は、結腸サンプル（GSE15960）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２４−１は、乳癌サンプル（GSE12777）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２４−２は、乳癌サンプル（GSE12777）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２５−１は、髄芽腫サンプル（GSE10327）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。 図２５−２は、髄芽腫サンプル（GSE10327）のデータセットにおいて本明細書で説明する“黒及び白”方法を用いて計算された重み及び広範囲文献リスト（表１１）の目的遺伝子と比較した証拠精選リスト（表１）の目的遺伝子を用いた（擬）線形モデルを用いて計算された予測されるWnt経路活性スコアを示す。

以下の例は、特に好ましい方法及び該方法に関連する選択された側面を単に解説するものである。本明細書で提供される教示内容は、例えば１以上の細胞信号伝達経路の異常な活動を検出、予測及び／又は診断ための幾つかの検査及び／又はキットを構築するために使用することができる。更に、本明細書に記載された方法を使用すれば、例えば実行されるべき後続の検査（又は複数の検査）（コンパニオン診断検査等の）を選択するために、薬剤耐性を予測及び監視することができ、薬剤予測及び薬効（及び／又は悪影響）の監視を行うことができ、薬剤処方が有利にも案内され得る。以下の例は、本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。

実施例１：数学的モデルの構築
本明細書に開示されるように、細胞信号伝達経路の１以上の目的遺伝子の発現レベルと転写因子（ＴＦ）要素のレベルとの間の関係を組み込んだ数学的モデル（例えば、図３に示された例示的な“２層”モデル）であって、上記ＴＦ要素が当該細胞信号伝達経路の１以上の目的遺伝子の転写を制御し、当該モデルが上記１以上の目的遺伝子の発現レベルの１以上の線形結合に少なくとも部分的に基づくものであるモデルを構築することにより、斯様なモデルを細胞信号伝達経路の活性を理解及び解釈し易い態様で決定するために使用することができる。

目的遺伝子の発現レベルは、好ましくはｍＲＮＡのレベルの（例えば、目的遺伝子のｍＲＮＡ配列に関連するプローブを用いた（ＲＴ）−ＰＣＲ及びマイクロアレイ技術の結果であり得る）及びＲＮＡ配列解析の測定値である。他の実施例において、目的遺伝子の発現レベルは、例えば当該目的遺伝子によりエンコードされたタンパク質の濃度等のタンパク質レベルにより測定することができる。

上述した発現レベルは、オプションとして、当該用途に一層良好に適するか又は適さないかも知れない多数の方法で変換することができる。ここでは、発現レベル（この場合は、マイクロアレイに基づくｍＲＮＡレベル）の４つの異なる変換を使用した：
− “連続データ”、即ち、MAS5.0及びfRMA等の良く知られたアルゴリズムを用いたマイクロアレイの前処理の後に得られる発現レベル；
− “ｚスコア”、即ち、全サンプルにわたる平均が０となり、標準偏差が１となるようにスケーリングされた連続的発現レベル；
− “離散”、即ち、特定の閾値より高い各発現は１に設定され、該閾値より低いものは０に設定される（例えば、プローブセットに対する閾値は、複数の陽性臨床サンプル及び同数の陰性臨床サンプルの組における値の中央値として選択することができる）；
− “ファジー”、即ち、連続発現レベルは、1/(1 + exp((thr − expr)/se))なるフォーマットのシグモイド関数を用いて０と１との間の値に変換され、ここで、exprは連続発現レベルであり、thrは上述した閾値であり、seは０と１との間の差に影響を与える軟化パラメータである。

図１は、細胞信号伝達経路（の一部）を表す解説上の数学的モデルを示す。該細胞信号伝達経路は、転写因子（ＴＦ）要素、及び該転写要素が細胞核内に存在する結果として生成される目的遺伝子により記号化されている。目的遺伝子の発現のノードとＴＦノードとを接続する、ｗ_１、ｗ_２及びｗ_３により示された重みは、転写因子が存在することと目的遺伝子の発現との間の相関の強度を、例えば訓練データ又は専門家の知識に基づいて示している。

構築することが可能な最も簡単なモデルの１つが、図２に示されている。ここでは、転写因子要素の目的遺伝子発現ノードは、この場合は特定の目的遺伝子に特別に高度に相関された１つのプローブセット（例えば、マイクロアレイ又は(q)PCR検査における）による目的遺伝子の発現強度レベルの直接測定により置換されている。上記重みは、訓練データセットからの計算に基づくか、又は専門家の知識に基づくかの何れかである。目的遺伝子当たり恐らくは複数の発現レベルが測定される場合（例えば、１つの目的遺伝子を複数のプローブセットで測定することができるマイクロアレイ実験の場合）、遺伝子当たり１つのみの発現レベルを使用する該方法は、特に簡単であるので、好ましいものである。特定の目的遺伝子に対して使用される上記１つの発現レベルを選択する１つの好ましい方法は、訓練データセットの活性及び受動サンプルを最良に分離することができるプローブセットからの発現を使用することである。このプローブセットを決定する１つの方法は、統計的検定（例えば、t-検定）を実行し、最も小さなｐ値を持つプローブセットを選択することである。最も小さなｐ値を持つプローブの訓練データセット発現レベルは、当然、（既知の）活性及び受動サンプルの発現レベルが重なる確率が最もありそうにないプローブである。他の選択方法は、オッズ比（odds ratio）に基づくものである（下記の節４も参照）。このようなモデルにおいて、１以上の発現レベルは前記１以上の目的遺伝子の各々に関して供給され、前記１以上の線形結合は上記１以上の目的遺伝子の各々に関して加重された項を含む線形結合を有し、各加重項は、対応する目的遺伝子に関して供給された１以上の発現レベルのうちの１つのみの発現レベルに基づくものである。上述したように、目的遺伝子当たり１つのみの発現レベルが選択される場合、当該方法は以下において“最も判別的プローブセット”と称される。

“最も判別的プローブセット”モデルの代替として、目的遺伝子当たり恐らく複数の発現レベルが測定される場合、目的遺伝子当たり供給される全ての発現レベルを使用することが可能である。このようなモデルにおいては、前記１以上の目的遺伝子の各々に関して１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合は、１以上の目的遺伝子に関して供給された１以上の発現レベルの全ての発現レベルの線形結合を有する。言い換えると、前記１以上の目的遺伝子の各々に関して、対応する目的遺伝子に関して供給された１以上の発現レベルの各々は、線形結合において、自身の（個々の）重みにより加重することができる。この変形例は、以下では“全プローブセット”モデルと称される。このモデルは、全ての供給される発現レベルを利用しながら、相対的に簡単であるという利点を有している。

上述した両モデルは、ＴＦ要素のレベルが発現レベルの線形結合により計算される“単層”モデルと考えられ得る点で共通している。

各モデルを評価することによりＴＦ要素のレベルが決定された後、該決定されたＴＦ要素は、細胞信号伝達経路の活性を推定するために閾処理することができる。このような適切な閾値を計算する１つの方法は、受動経路を有することが既知の訓練サンプル及び活性経路を持つ訓練サンプルの決定されたＴＦ要素レベルwlcを比較することによるものである。そのようにすると共に、これらのグループにおける分散も考慮に入れる方法は、
なる閾値を使用することにより与えられ、ここで、σ及びμは訓練サンプルの標準偏差及び平均である。活性及び受動訓練サンプルにおいて少数のサンプルしか利用可能でない場合、計算される分散に２つのグループの分散の平均に基づいて擬カウントを追加することができ：
ここで、νはグループの分散であり、ｘは正の擬カウントである。標準偏差は、次いで、分散νの平方根をとることにより得ることができる。

上記閾値は、解釈を容易にするために、ＴＦ要素wlcの決定されたレベルから減算することができ、その結果、経路の活性スコアが、負の値は受動経路に対応し、正の値は活性経路に対応するようにして得られる。

図３は、上述した“単層”モデルの代替として、経路の活性信号伝達の実験的決定を表す例示的な“２層”モデルを一層詳細に示している。各目的遺伝子に関して、関連するプローブセットの測定された強度に基づき線形結合を用いて集約的レベルが計算される（“第１の（底側の）層”）。該計算された集約的レベルは、次いで、当該経路の他の目的遺伝子の集約値と、更なる線形結合を用いて結合される（“第２の（上側の）層”）。重みは、訓練データセットから若しくは専門家の知識に基づいて、又はこれらの組み合わせの何れかに基づいて学習することができる。言い方を替えると、“２層”モデルでは、１以上の発現レベルが１以上の目的遺伝子の各々に関して形成され、１以上の線形結合は、１以上の目的遺伝子に関して、対応する目的遺伝子に関して形成された１以上の発現レベルの全ての発現レベル（“第１の（底側の）層”）の第１線形結合を有する。該モデルは、更に、１以上の目的遺伝子の各々に関して、加重された項を含む更なる線形結合に少なくとも基づくもので、各加重項は対応する目的遺伝子に関する第１線形結合（“第２の（上側の）層”）に基づくものである。

前記集約値の計算は、“２層”モデルの好ましいバージョンでは、各モデル遺伝子に関する閾値を、訓練データを用いて定めると共に、該閾値を計算された線形結合から減算し、遺伝子集約を生じさせるステップを含む。この場合、上記閾値は、負の遺伝子集約レベルが発現低下された（downregulated）に対応し、正の遺伝子集約レベルが発現上昇された目的遺伝子に対応するように選択することができる。また、遺伝子集約値は、“第２の（上側の）層”において結合される前に、例えば前述した変換（ファジー、離散等）の１つを用いて変換することもできる。

“２層”モデルを評価することによりＴＦ要素のレベルが決定された後、該決定されたＴＦ要素は、前述したように細胞信号伝達経路の活性を推定するために閾処理をすることができる。

以下では、上述したモデルを“（擬）線形モデル”と総称する。

実施例２：目的遺伝子の選択
転写因子（ＴＦ）は、固有のＤＮＡ配列に結合することにより目的遺伝子からの転写を調節することができるタンパク質複合体（即ち、固有の構造に一緒に結合されたタンパク質の組み合わせ）又はタンパク質であり、これによりＤＮＡからｍＲＮＡへの遺伝子情報の転写を制御する。この転写複合体の作用により直接生成されたｍＲＮＡは、ここでは、“直接目的遺伝子”と称する。経路活性の結果、それ以上の二次遺伝子転写も生じ得る（“間接目的遺伝子”と称する）。以下においては、経路活性とｍＲＮＡレベルとの間の直接的リンクとしての、直接目的遺伝子を有する又は直接目的遺伝子からなる（擬）線形モデルが好ましいが、直接目的遺伝子と間接目的遺伝子との間の違いは必ずしも明らかとは限らない。ここでは、利用可能な文献データに基づいた採点関数を用いて直接目的遺伝子を選択する方法が提示される。それにも拘わらず、間接目的遺伝子の突発的選択は、限られた情報及び生物学的変化及び不確定さにより除外することはできない。

固有の経路ｍＲＮＡ目的遺伝子が、特定の目的遺伝子に関する化学的証拠に、該証拠が蓄積された化学的実験のタイプに依存して等級が付与された等級法を使用することにより、科学文献から選択された。例えばＨＨ経路が活性であることが分かっている胚（embryo）のマイクロアレイ上でｍＲＮＡが増加する等のように、幾つかの実験的証拠は遺伝子が目的遺伝子であることを単に暗示するだけであるが、他の証拠は、識別された経路転写因子結合部位並びに細胞内の特定の経路の刺激の後のクロマチン免疫沈降（ChIP）解析（アッセイ）における該部位の回復及び細胞系（細胞株）における当該経路の特定の刺激後のｍＲＮＡの増加の組み合わせ等のように、非常に強いものであり得る。

固有の経路目的遺伝子を見付けるための幾つかのタイプの実験を下記のような（これらに限定されるものではない）科学文献から特定することができる：
１．経路転写因子の自身の結合部位に対する直接結合が示されるChIP実験。例：クロマチン免疫沈降（ChIP）技術を用いることにより、次いで、活性Wnt経路を持つ又は持たない結腸細胞系のＤＮＡにおける推定機能ＴＣＦ４転写因子結合部位が、純粋にヌクレオチド配列に基づいて認識された結合部位の部分集合として識別された。推定機能性は、転写因子がＤＮＡ結合部位に結合することが見付かったというChIPで導出された証拠として識別された。
２．結合配列を含むＤＮＡの断片に対する転写因子のインビボ結合を示す電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）解析（アッセイ）。ChIPに基づく証拠と比較して、ＥＭＳＡに基づく証拠は、インビボ状態に翻訳することができないので、余り強くない。
３．経路の刺激及びマイクロアレイ上のｍＲＮＡプロファイルを測定すること又はＲＮＡ配列を使用し、経路誘導可能な細胞系を使用し、シクロヘキシミド（タンパク質への翻訳を抑制する）の存在の下で誘導後も幾つかの時点で測定されるｍＲＮＡプロファイルを測定することであり、かくして、誘導されたｍＲＮＡは直接目的遺伝子であると推測される。
４．３と類似するが、ｍＲＮＡの量を測定するために定量ＰＣＲを使用する。
５．生物情報学を用いたゲノムにおける転写因子結合部位の識別。Wnt経路に関する例：既知のＴＣＦ４βカテニン転写因子ＤＮＡ結合配列を用いて、人ゲノム配列に対してソフトウェアプログラムが実行され、遺伝子プロモータ領域及び他のゲノム領域の両方において潜在的結合部位が識別された。
６．３と類似するが、シクロヘキシミドの不存在下のみである。
７．４に類似するが、シクロヘキシミドの不存在下のみである。
８．適切な否定的制御条件がない場合であるが、経路が活性であることが分かっている特定の組織又は細胞サンプルのｍＲＮＡ発現のプロファイリング。

最も簡単な形において、これらの実験的方法（目標ｍＲＮＡが識別された）の各々に関して、各々の可能性のある目標ｍＲＮＡに１ポイントを付与することができる。

他の例として、ポイントを増加的に付与することができ、これは、或る技術に１ポイントが付与され、２番目の技術は第２のポイントを追加する等々を意味する。この相対的な順位付けストラテジを用いて、最も信頼性のある目的遺伝子のリストを作成することができる。

他の例として、インビボ直接目的遺伝子に関して最も多くの証拠を提供する技術に対して一層大きな数のポイントを付与することにより、最も直接目的遺伝子でありそうな目的遺伝子を識別するために他の方法による順位付けを用いることもでき、上述したリストにおいて、このことは、実験的方法１に対しては８ポイント、２に対しては７ポイント、そして順次減少して、実験的方法８に対しては１ポイントを意味し得る。このようなリストは“総合目的遺伝子リスト”と称することができる。

生物学的変化及び不確定さにも拘わらす、発明者は、直接目的遺伝子は、十中八九、組織依存的態様で誘導されると仮定した。これらの目的遺伝子のリストは“証拠精選目的遺伝子”と称することができる。これらの精選された目的リストは、異なる組織及び／又は細胞源から到来したサンプルに適用することが可能な計算モデルを構築するために使用された。

“総合目的遺伝子リスト”は、恐らくは一層組織固有な遺伝子を含み、乳癌サンプル等の固有の組織からのサンプルにおける応用のためのモデルの感度及び選択性を最適化及び増加させるために潜在的に使用することができる。

以下は、特に証拠精選目的遺伝子リストの選択例がＥＲ経路に関してどの様に構築されたかを例示的に説明する。

ここで説明する（擬）線形モデルに対する入力として使用されるＥＲ目的遺伝子を選択する目的で、下記の３つの評価基準が用いられた：
１．遺伝子プロモータ／エンハンサ領域が、エストロゲン反応エレメント（ＥＲＥ）モチーフを含む：
ａ．ＥＲＥモチーフは、例えば固有のＥＲＥモチーフがレポータ遺伝子に連結される一過性形質導入アッセイによりエストロゲンに応答することが証明されるべきであり、
ｂ．ＥＲＥモチーフの存在が、例えば遺伝子プロモータ／エンハンサ領域の強化されたモチーフ分析により確認されるべきである。
２．例えば、ChIP／CHIP実験又はクロマチン免疫沈降アッセイにより示されて、ＥＲは当該遺伝子のプロモータ／エンハンサ領域に生体内で（区別的に）結合する：
ａ．ＥＲは、ＥＲ経路が活性である場合に、遺伝子のプロモータ／エンハンサ領域に結合することが分かる、
ｂ．ＥＲ経路が活性でない場合、遺伝子の遺伝子プロモータ／エンハンサ領域に（好ましくは）結合しない（又は弱く結合する）。
３．ＥＲ経路が活性である場合に遺伝子が区別的に転写されることであり、これは
ａ．リアルタイムＰＣＲ又はマイクロアレイ実験を介しての当該遺伝子のｍＲＮＡの倍富化（fold enrichment）、又は
ｂ．免疫沈降アッセイを介しての、ＲＮＡ Pol IIが遺伝子のプロモータ領域に結合することの実証、
により示される。

当該選択は、ＥＲ目的遺伝子として、上述した３つの全基準が満たされたことを条件に十分で且つ良好に文書化された実験証拠が収集された遺伝子を定義することにより実行された。ＥＲの区別的結合の証拠を収集するために適した実験は、例えばエストロゲンに暴露され又は暴露されない場合の、エストロゲンに応答する癌細胞株（例えば、MCF-7細胞株）におけるChIP／CHIP実験の結果を比較することである。同じことが、ｍＲＮＡ転写の証拠を収集する場合にも当てはまる。

上記記載は、複数の目的遺伝子を上述した方法を用いて見付けられる証拠に基づいて選択するために採用された目的遺伝子選択手順の汎用的方法及び一層特定的な例を説明している。例示的経路、即ちWnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路のための（擬）線形モデルに使用される目的遺伝子のリストが、各々、表１、表２、表３及び表４に示されている。

ここに記載されるＥＲ経路の（擬）線形モデルのために使用されるＥＲ経路の目的遺伝子（表２に示される）は、文献の証拠スコアに基づく目的遺伝子の選択群を含む。即ち、この短小リストには最高の証拠スコアを持つ目的遺伝子（本発明による好ましい目的遺伝子）のみが追加された。より低いスコアの遺伝子も含む、ＥＲ目的遺伝子の完全リストは、表５に示されている。

表１、表２、表３及び表４に示されるWnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路の目的遺伝子の更なる部分選択又は順位付けは、文献証拠スコアと、プローブセットノードを対応する目的遺伝子ノードに連結する訓練データセットを使用して計算されたオッズ比との組み合わせに基づいて実行された。該オッズ比はカットオフ値（例えば、同数の活性及び受動訓練サンプルが使用される場合、全訓練サンプルの中央値）を用いて計算される。即ち、カットオフより上の各値は高い（high）と宣言され、カットオフより下の各値は低い（low）と宣言される。このことは、当該経路が活性（active）又は受動（passive）であることが分かっている訓練サンプルに対して実行される。次いで、特定の目的遺伝子又はプローブセットに関するオッズ比（odds ratio）を下記のように計算することができ：
ここで、n(active,low)は上記カットオフより低い発現レベルを持つことが検出された活性経路を持つことが分かった訓練サンプルの数、n(passive,low)は上記カットオフより低い発現レベルを持つことが検出された受動経路を持つことが分かった訓練サンプルの数、等々である。f(active,low)及びf(passive,low)は、上記カットオフより低い発現レベルを有することが検出され、且つ、サンプルのうちの、各々、活性及び受動経路を有することが分かった割合である。

他の例として、不定のオッズ比（零による除算）を回避するために、上記の割合計算に例えば：
のように、例えば擬カウントを追加することができる。

他の例として、測定設備における幾らかの不確定性（ノイズ）を仮定することにより証拠となる活性を示す絶対数のサンプルを置換し、各訓練サンプルに関して、例えば正規分布を仮定して“低い（low）”又は“高い（high）”の何れかである確率を計算することもできる（“ソフト証拠”と称される）。次いで、前記割合計算を上述した計算に従って計算することができ：
ここで、p(active,low)及びp(passive,low)は、各サンプルに関する観測がカットオフより低い確率であり、各訓練サンプルの測定された発現レベルに等しい平均の標準分布及び発現レベル測定に関連する不確定さの推定に等しい標準偏差を仮定する（例えば、log2目盛り上の０.２５）。これらの確率は全ての訓練サンプルにわたって合計され、次に、擬カウントが追加される。

オッズ比は、経路の活性を推測する際の目的遺伝子の重要度の評価である。一般的に、より高いオッズ比を持つ目的遺伝子の発現レベルは、より低いオッズ比を持つ目的遺伝子と比較して、経路の全体的活性に関して一層情報的でありそうなことが期待される。しかしながら、細胞信号伝達経路の複雑さ故に、目的遺伝子と経路活性との間には一層複雑な関係が存在し得ると理解されるべきである。例えば、低いオッズ比を持つ目的遺伝子の種々の組み合わせの発現レベルを考察することは、より高いオッズ比を持つ目的遺伝子を孤立して考察することより一層証拠性があり得る。ここに報告されるWnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲモデル化においては、表６、表７、表８及び表９に示される目的遺伝子が、より低い順位の目的遺伝子と比較して、Wnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路活性を予測するためには一層高い証拠的性質のものである（従って、表６〜９に示される目的遺伝子は本発明によれば特に好ましい）ことが分かった。それにも拘わらず、マイクロアレイ等の収集技術が大きな集合の遺伝子に関して発現レベルを収集することができる相対的容易さを前提とすれば、図１〜３に図示した（擬）線形モデルにおいて、表６、表７、表８及び表９の目的遺伝子の幾つか又は全てを利用すると共に、オプションとして表１、表２、表３及び表４に示される順位の追加の目的遺伝子の１つ、２つ、幾つか又は全てを追加して使用することが考えられる。

証拠精選リストと広範囲文献リストとの比較
本明細書で説明された手順に従い文献証拠に基づいて構築されたWnt遺伝子のリスト（表１）は、上述した手順に従わない目的遺伝子の他のリストと比較される。該代替リストは、分子生物学及びWnt経路の分野における専門知識で知られている有名な研究所による３つの公共情報源で公開された、種々の実験方法からの種々のデータによりWnt目的遺伝子であると示されている遺伝子の寄せ集めである。該代替リストは、Hatzis他(Hatzis P, 2008)の表S3、de Sousa e Melo (de Sousa E Melo F, 2011)の文章及び表S1A、並びにWnt信号伝達の分野でのパイオニアであるRoel Nusseにより収集及び維持された目的遺伝子のリスト(Nusse, 2012)の組み合わせである。これら３つの情報源の組み合わせは、１２４の遺伝子のリスト（＝広範囲リスト、表１０参照）となった。ここでは、この代替リストから導出されるアルゴリズムにより臨床サンプルにおいてWnt活性を予測する能力が、既存の遺伝子のリスト（＝証拠精選リスト、表１）に基づいて構築されるモデルと比較して同様に又は一層良好に機能するかの問題を議論する。

次のステップは、当該遺伝子に対応するAffymetrix（登録商標）GeneChip人ゲノムU133 Plus 2.0アレイのプローブセットを見付けることからなる。この処理は、BioconductorプラグインＲ及び本明細書で説明した（擬）線形モデルと同様のＵＣＳＣゲノムブラウザに基づくプローブセット関連性の手作業精選を用いて実行され、これにより、例えば逆鎖上の又は遺伝子エクソン領域外のプローブセットを除去した。当該１２４個の遺伝子のうちの２つに関しては、このマイクロアレイチップ上には利用可能なプローブセットは存在せず、従って、当該（擬）線形モデルには挿入することはできなかった。これらは、LOC283859及びWNT3Aである。合計で２８７のプローブセットが残りの１２２個の遺伝子に対応することが分かった（表１１）。

次いで、（擬）線形モデルが、本明細書で説明する重みパラメータを計算するための“黒及び白”方法を用いて図２と同様に構築された。証拠精選リストに基づくWnt（擬）線形モデルの説明と同様に、プローブセット及び対応する遺伝子（共に証拠精選リスト及び広範囲文献リスト）の間のエッジに関連する重みが、Gene Expression Omnibus（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/でアクセス可能である。最後にアクセスされたのは、２０１１年７月１３日）のデータセットGSE8671からの３２の正常結腸サンプル及び３２の腺腫サンプルの連続的ｆＲＭＡ処理データを用いて訓練された。

訓練された（擬）線形モデルは、次いで、Wnt経路の活性スコアを推測するために種々のデータセットに対して試験された。Wnt経路は、活性レベルが正である場合に、“オン”、即ち活性であると示される。訓練された広範囲文献モデル及び証拠精選モデルの集計結果が図２１〜２５に示されている。

明らかに、広範囲文献モデルはWntがオン又はオフであるかに関して概して一層極端な活性スコアを予測すると推論することができる。更に、該代替モデルは、結腸癌データセット（GSE20916, GSE4183, GSE15960）に関しては同様の結果を予想するが、乳癌（GSE12777）及び髄芽腫サンプル（GSE10327）データセットにおいて予測される活性Wnt経路に対しては期待されるより多くのサンプルを予測する。

結論として、広範囲文献目的遺伝子リストは、一方においては、結腸癌におけるWnt活性の大凡同等に良好な予測を生じさせるが、他方においては、他の癌タイプにおいて一層悪い（より多くの誤った陽性）予測を生じさせる。このことは、該目的遺伝子の代替リストが、結腸細胞に向かって固有に過度にバイアスされ、かくして過度に組織固有なものとなっている結果であり得る。即ち、de Sousa E Meloその他及びHatzisその他の両方にとり、非結腸固有のWnt目的遺伝子は含まれるかも知れないが、主な関心は結腸直腸癌であった。更に、これらのリストに恐らくは含まれている非Wnt固有の目的遺伝子は、他の癌タイプにおけるWnt活性の悪化された予測の原因であり得る。該代替リストは、一層多くの間接的に調節される目的遺伝子を含みそうであり、このことは該リストを恐らくは一層組織固有のものにさせる。オリジナルのリストは、全ての組織においてWntに敏感な遺伝子を最も表しそうな直接目的遺伝子を含む方向に調整されており、かくして、組織特異性を低減させる。

数学的モデルを訓練及び使用
本明細書で例示的に説明される（擬）線形モデルを試験サンプルにおいて経路活性を推定するために使用することができる前に、ノードの間の相関の符号及び大きさを示す重み及びノードが“存在しない”又は“存在する”かの何れかを判定するための閾値を決定する必要がある。重み及び閾値を事前に記入するために専門知識を用いることができるが、典型的には、好ましくはグラウンドトルースが分かっている訓練サンプルの代表的組を使用してモデルが訓練される。例えば、既知の存在転写因子複合体（＝活性経路）又は不存在転写因子複合体（＝受動経路）を持つサンプルにおけるプローブセットの発現データである。しかしながら、何の活性化状態がモデル化されるべき経路のものであるかが分かっている多数の異なる種類の癌から訓練サンプルを得ることは現実的でない。結果として、利用可能な訓練セットは、限られた数のサンプル、典型的には１つのタイプの癌のみからのサンプルからなる。ここでは、試験サンプルを活性又は受動経路を持つとして分類するために必要なパラメータを決定する方法が説明される。

当該分野で既知のものは、モデルトポロジを考慮に入れると共にモデルパラメータ（ここでは、重み及び閾値）をモデル出力（ここでは、加重された線形スコア）が最適化されるように変化させる多数の訓練アルゴリズム（例えば、回帰）である。ここでは、最適化アルゴリズムを必要とせずに、重みを発現レベルから直接計算するために使用することができる２つの例示的方法を示す。

好ましくは、Wnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路の（擬）線形モデルの訓練は、Gene Expression Omnibus（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/でアクセス可能である。前記参照）で利用可能な公開データを使用して実行される。

ここでは“黒及び白”方法と定義される第１方法は、｛-1,0,1｝なる成分である重み係数を持つ三成分系に要約される。これを、生物学的前後関係に投入すると、−１及び１は、各々、経路活性の場合においてダウンレギュレート（下方制御）される及びアップレギュレート（上方制御）される遺伝子又はプローブに対応する。プローブ又は遺伝子がアップレギュレートされ又はダウンレギュレートされたと統計的に証明することができない場合、該プローブ又は遺伝子は０なる重みを受ける。ここでは、使用される訓練データを前提にプローブ又は遺伝子がアップレギュレートされるか又はダウンレギュレートされるかを決定するために、活性経路サンプルの発現レベル対受動経路を持つサンプルの発現レベルの左側及び右側の２サンプルｔ検定を使用した。活性サンプルの平均が受動サンプルよりも統計的に大きい場合、即ち、ｐ値が例えば０.３等の特定の閾値より低い場合、該プローブセット又は目的遺伝子はアップレギュレートされたと判定される。逆に、活性サンプルの平均が受動サンプルよりも統計的に低い場合、このプローブセット又は目的遺伝子は、当該経路の活性に際してダウンレギュレートされると判定される。最も低いｐ値（左又は右側の）が上述した閾値を超える場合、このプローブ又は遺伝子の重みは０であると定義する。

他の好ましい実施態様では、重み及び閾値（又は複数の閾値）に到達する他の方法が用いられる。この代替方法は、前記オッズ比の対数（例えば、底ｅの）に基づくもので、従って、“対数オッズ”重みと称される。各プローブ又は遺伝子に関するオッズ比が、プローブ／遺伝子レベルが対応する閾値（例えば全訓練サンプルの中央値）より高い又は低い正及び負の訓練サンプルの数に基づいて計算される（式（３））。零による除算を回避するために、擬カウントを加えることができる（式（４））。更なる改良は、プローブ／遺伝子レベルが例えば観測値の周囲で或る特定の標準偏差（例えば、2-log目盛り上の０.２５）で正規分布すると仮定すると共に、閾値より高い及び低い確率質量を計数することにより、閾値より高い／低いサンプルを幾らか一層確率的態様で計数することである。

他の例として、本明細書で説明される（擬）線形モデルの重み及び閾値（又は複数の閾値）を決定するために、回帰等の当該分野で既知の最適化アルゴリズムを採用することもできる。

十分に一般化させるために、（擬）線形モデルに関してパラメータが決定される方法には特別な注意を払わなければならない。他の例として、訓練手順の間に特別な対策をとることによって十分に一般化することができるように、当該分野で既知のベイジアンネットワーク等の他のマシン学習方法を使用することもできる。

好ましくは、Wnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路の（擬）線形モデルの訓練は、Gene Expression Omnibus（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/でアクセス可能である）で利用可能な公開データを使用して実行される。

図５は、Wnt経路に関して図２に示され、表１に記載された“全プローブセット”を含む（擬）線形モデルを使用して訓練データセットGSE8671に対して計算された（擬）線形結合を示す。該（擬）線形モデルに適用された重みは、本明細書で説明した“黒及び白”方法を用いて計算された。左側のグループはWntが受動的であることが分かっているサンプルを表す一方、右側のグループは活性Wnt経路を有することが分かっている腺腫サンプルの計算された活性スコアを示している。

図８を参照すると、第１及び第２の層の各々に対して表３に記載された全てのプローブセット及び目的遺伝子を使用するＨＨ経路の“２層”モデルが、ＨＨ活性を表すことが分かっている基底細胞癌腫サンプル（第１グループ）及び受動ＨＨ経路を有することが分かっている正常な皮膚細胞の連続発現レベルデータを用いて訓練された。該訓練は、本明細書で説明した“対数オッズ”方法を使用して目的遺伝子発現レベル（ここでは、プローブセット強度により表される）と目的遺伝子ノードとの間の接続の重みを計算することを含み、次いで、転写因子複合体の活性スコアが、アップレギュレートされた又はダウンレギュレートされた目的遺伝子に関して１又は−１により各々乗算された計算された目的遺伝子発現スコアの総和により計算された。

図１０は、MCF7細胞株における刺激実験で測定された連続発現レベルを用いたＥＲ経路の単純（擬）線形モデルの訓練結果を示す。該モデルは、表２に示された目的遺伝子当たり“最も区別的（判別的）プローブセット”のみを含んだ。縦軸上にプロットされるＥＲ活性スコアを計算するために要する重みに到達するために、“対数オッズ”方法が活性ＥＲ経路サンプル（左から３番目のグループ、Ｅ２により刺激されたMCF7細胞、強いＥＲアクチベータ）及び受動ＥＲ経路サンプル（４番目のグループ、対照により処理されたMCF7細胞）との組み合わせで使用された。

図１３を参照すると、ＡＲ経路の図２に示した（擬）線形モデルが、前記“黒及び白”方法により、正のＡＲ活性を持つ３つのサンプル、強いＡＲ経路アクチベータであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）により刺激されたLNCaP細胞株、及び不活性ＡＲ経路のケースを表す３つの刺激されていないLNCaP細胞株を用いて例示的に訓練された。これらの刺激実験の発現データは、本明細書に記載したようにファジー変換されたGSE7868データセットにおいて公に利用可能である。この特別な例では、表４に記載された選択されたＡＲ目的遺伝子の“全プローブセット”が使用された。該訓練の結果が図１３に示されている。左から１番目及び２番目のサンプルグループは、各々、負及び正の訓練サンプルとして使用された。期待されたように、４時間にわたるＤＨＴによるLNCaPの刺激である当該実験内の対照は、１６時間にわたり刺激された細胞より低い活性レベルであるが、ＡＲ活性を示している。

図６及び図１７を参照すると、Wnt及びＥＲ経路の訓練された（擬）線形モデルが、本明細書で説明される訓練手順では使用されない（ＨＨ及びＡＲ（擬）線形モデルのための適切なデータセットが利用可能でなかった）同様のサンプル（Wnt及びＥＲベイジアンネットワークの各々に対する結腸サンプル及びMCF7乳癌細胞株）における経路活性を予測するために使用された。サンプルのうちの圧倒的多数の予測された経路活性が、認証されるべきモデルに関して臨床的に予測される経路活性と一致しなければならない。

図６は、GSE20916データセットにおいて分類（棒グラフの色により示される）によりグループ化された結腸サンプルにおけるサンプル（水平軸上に棒グラフとして示される）のWnt活性（垂直軸上に計算された活性スコアとして示される）を示す。健康な組織のサンプルであることに基づいて、全ての正常な結腸サンプルは不活性経路を有すると（スコア＜０）正しく予測されている。活性経路を有するとされる最後のグループにおける癌腫サンプルは、１つを除く全部が活性Wnt経路を有すると予測されている。

図１７には、訓練されたＥＲ（擬）線形モデルの検証結果が、GSE9253データセットに由来するMCF7乳癌細胞株サンプルを用いて測定された２つのマイクロアレイ（一方はエストラジオール（Ｅ２）により刺激され、他方は負の対照（EtOH）により刺激される）に関して示されている。図１７から、ＥＲ活性スコアの差は明らかである。しかしながら、Ｅ２により刺激されたサンプルは、僅かに負の活性スコアを有すると予測された。これは、この特定の実験対して、活性又は受動状態を定義する閾値が過度に高く設定された結果である。この矛盾の原因は、この実験では異なる刺激状態が適用されたことであり得る。即ち、訓練データセット（GSE8597）では、サンプルはＥ２の４倍低い濃度で（１００ｎＭ対２５ｎＭ）、８倍長く処理された（３時間の代わりに２４時間）。当業技術からは、一般的に目的遺伝子の発現は、僅か３時間後よりも、刺激剤による処理の２４時間後に一層最適になることが知られており、このことが、このデータセットにおける刺激されたMCF4サンプルの一層低いＥＲ活性スコアを説明し得る。負の対照は、ＥＲ経路が不活性であることを適切に予測している。

訓練された（擬）線形モデル（例えば、Wnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路の）を、対応する経路活性を予測するために使用することに関する他の詳細及び例は、後の実施例６において説明する。

上述した訓練処理は臨床的応用の他の（擬）線形モデルに対して利用することができる。ここでは、ここに開示された細胞信号伝達経路（更に詳細には、Wnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路）を表す方法を用いて構築された例示的（擬）線形モデルに関して動作することが示され、証明される。

（異常）経路活性の診断
以下は、細胞信号伝達経路の活性を診断するために例えば（擬）線形モデルをどの様に使用するかを例示的に説明する。経路活性に関して例示的に選択された読み出しである転写因子複合体を表すノード、及び該転写因子複合体ノードに入る表１に記載された“全プローブセット”が本明細書に記載されるように訓練されることからなるWntの例示的（擬）線形モデルが、訓練された（擬）線形モデルが如何に良好に動作するかを推測するために、種々の以前に訓練に使用されなかったデータセットにおいてWnt経路活性スコア及びその状態（活性又は受動）を予測するために使用された。一群の髄芽腫癌サンプル（GSE10327、図７参照）に関して計算された予測経路活性スコア及び関連する活性判定が、臨床サンプルに関して既知の臨床知識と相関された。該例示的な訓練された（擬）線形モデルは、全てのWnt陽性髄芽腫サンプルが僅かに活性なWnt経路を有すると予測することができる。全てのWnt陽性サンプルは全ての他の陰性サンプルと比較して相対的に低いWntスコアを有し、このことは、髄芽腫サンプルにおいては、結腸組織サンプルで定義された閾値が、恐らくは遺伝子発現の組織固有の違いにより、結腸サンプルにおけるよりも低くなければならないことの暗示であり得る。

第１及び第２層に、各々、表３に示された全てのプローブセット及び目的遺伝子を備える２層からなるＨＨ経路の例示的な訓練された（擬）線形モデルが、一群の髄芽腫癌サンプル（GSE10327、図９参照）においてＨＨ活性を予測するために使用された。該ＨＨ活性スコアは、本明細書で説明した方法に基づく目的遺伝子発現スコアに基づいて計算される。図９においてshhにより示されたＨＨ陽性グループにおけるサンプルの半分は、当該モデルにより活性ＨＨ経路を有すると正しく予測されている。他の全てのサンプルは、不活性ＨＨ経路を有すると正しく予測された。

本明細書で説明した表２に示す“最も区別的なプローブセット”及び“対数オッズ”に基づくＥＲ経路の例示的な訓練された（擬）線形モデルが、GSE12276データセットの一群の乳癌サンプルにおけるＥＲ経路活性スコアを予測するために使用された。結果としてのＥＲ経路活性スコアは、図１１に示されている。該乳癌サンプルは、発現ＥＲ（ＥＲ＋）又は非発現ＥＲ（ＥＲ−）に一緒にグループ化されている。ＥＲ状態は、マイクロアレイ実験により測定されたＥＲの発現レベルに基づいて決定されている。臨床サンプルは高いレベルのＥＲを発現し得るが、これはＥＲ経路が活性であることを必ずしも意味するものではない。このことは、５０〜６０％のＥＲ＋乳癌における相対的に高い効果のないホルモン治療によってもサポートされる。一方、当該分野からは、臨床サンプルがＥＲを発現しない場合、ＥＲ経路は活性であり得ないことも知られている。ＥＲ＋サンプルの約２５％は当該（擬）線形モデルにより活性ＥＲ経路を有すると予測され、このことは、これらのタイプの５０〜６０％の乳癌における相対的に高い効果のないホルモン治療により部分的に説明することができる。ＥＲ経路は、該ＥＲ−サンプルにおいて受動ＥＲ経路を有すると正しく予測されている。

本明細書で説明した表４に示された“全てのプローブセット”及び“黒及び白”方法を用いて計算された重み並びにLNCaP細胞（GSE7868）のファジー変換された発現データに基づく例示的な訓練されたＡＲ（擬）線形モデルが、前立腺サンプル（GSE17951、ファジー変換された）におけるＡＲ経路の活性を予測するために使用された。３つのグループのサンプル（左から右に、生検、対照及び腫瘍）に関する計算されたＡＲ活性スコアが、図１５に示されている。生検及び腫瘍サンプルの圧倒的多数が高いＡＲ活性を有することが分かった（このことは、既知の臨床状態と相関すると思われる）。一方、対照グループにおける相対的に少ない数のサンプルは、予測された通り、当該モデルの予測に従いＡＲ活性を示す。

経路活性に基づく予後診断
Wnt及びＨＨ等の初期発生経路は、癌幹細胞と呼ばれる一層幹細胞的表現型に戻された癌細胞に起因する転移に役割を果たすと考えられる。確かなことに、Wnt経路等の初期発生経路が癌転移に役割を果たし、転移性癌細胞が他の臓器又は組織における播種位置で分割を開始することを可能にする十分な証拠がある。転移は悪い予後に関連するので、癌細胞におけるWnt及びＨＨ経路等の初期発生経路の活性は、悪い予後に関して予測性があると期待される。このことは、本明細書で説明された（擬）線形モデルを使用して活性ＥＲ経路は有するが、活性Wnt又はＨＨ経路は有さないと識別されたGSE12276データセットからの乳癌患者が、図１６のカプラン・マイヤーのグラフにより示されるように、活性ＨＨ若しくはWnt経路又は両方の何れかを持つと識別された患者よりも良好な予後を有するという事実によりサポートされる。

治療計画、薬効の予測、有害効果の予測及び薬効の監視
以下は、細胞信号伝達経路の（擬）線形モデルを治療計画、薬効の予測、薬効の監視及び関連する行動にどの様に使用するかを例示的に解説する。

ＥＲ経路の目的遺伝子に関連するプローブセット（表２）の層及び転写因子存在に関するノードを用いて構築され（本明細書で説明された図２と同様の）、本明細書で説明したように訓練されたＥＲ経路の（擬）線形モデルが、ＥＲ経路活性スコアを計算するために使用された。該経路活性スコアは、次いで、薬効又は薬効の監視に相関されることが示される。結果の要約は、図２０及び図１２に示される。

図２０を参照すると、タモキシフェンは、ＥＲ＋（エストロゲン受容体陽性）乳癌の治療のために現在使用されている薬剤である。該薬剤は、ＥＲ信号伝達により誘導されると考えられる無制御な細胞増殖を抑制する、エストロゲン受容体の部分拮抗薬として作用する。残念ながら、癌組織スライドの日常的組織病理分析による癌細胞内のＥＲタンパク質の存在の実証にも拘わらず、全ての乳癌がタモキシフェンによる治療に応答するとは限らない。多くの研究が、この所謂タモキシフェン耐性を調べるために実行されている。公に利用可能なGSE21618データセットは、斯様な研究の１つの結果であり、異なる治療状態の下でのタモキシフェン耐性で野生型のMCF7細胞株のマイクロアレイデータを含んでいる。本明細書で説明されたように構築及び訓練されたＥＲ（擬）線形モデルが、異なる治療状態の下でのタモキシフェン耐性で野生型のMCF7細胞株を分析するために使用され、その結果が図２０に示されている。

TamR.Ctrlにより示された対照のタモキシフェン耐性細胞株は、タモキシフェン添加後の全ての時点（１、２、３、６、１２、２４及び４８ｈ）に関して不活性ＥＲ経路を有すると予測されている。TamR.E2_Tamにより示されたＥ２により刺激され、タモキシフェンにより処理されたタモキシフェン耐性細胞株（４番目のグループ）の治療が無効果であることは、驚くべきことではなく、このことは、このグループに関するＥＲ経路の同じ時点にわたる予測された不活性によっても示されている。タモキシフェン耐性細胞株（TamR.Ctrl）の分析によれば、無制御な細胞増殖の原動力は活性ＥＲ信号伝達によるものではなく、従って、ＥＲ拮抗薬により治療することは細胞増殖を抑制することはないであろう。このことは、陰性に予測されたＥＲ経路活性の場合、タモキシフェンによる治療は推奨されないことを示す。

一方、１７βエストラジオールにより処理された、タモキシフェン感応性であることが分かっている野生型MCF7細胞株（wtl.E2、１１番目のグループ）は、ホルモン治療にゆっくりと応答し、これは、増加するＥＲの正の活性予測に見られる。このような細胞株をタモキシフェン等のＥＲ抑制剤により処理することはＥＲ経路を抑制し、これが、Ｅ２により刺激されタモキシフェンにより処理されたMCF7サンプル（wt2.E2_Tam、１２番目のグループ）の時間内の減少するＥＲ経路活性スコアにより示されている。

他の例において、ＥＲ刺激剤（Ｅ２）により刺激され又はＥＲ刺激剤が除去され、刺激又は除去を開始した後の１２時間、２４時間及び４８時間において測定された発現レベルを持つMCF7細胞株の公に利用可能なデータセット（GSE11352）が、本明細書で説明した訓練されたＥＲ（擬）線形モデルを使用してＥＲ活性スコアを計算するために使用された。ＥＲ経路活性スコアは、ＥＲ刺激剤に対する一層長い暴露時間の場合は増加し（最初の３つのグループ）、対照における長い欠乏の場合は減少する（最後の３つのグループ）。もっとも、長い欠乏は４８時間後に再び僅かに増加する。４８時間の欠乏を例外として、予測されたＥＲ活性スコアは、長い刺激は一層高いＥＲ活性を生じさせ、その逆も成り立つという知識に良く相関する。逆に、この例は、ＥＲ活性スコアをＥＲ活性の刺激及び抑制治療の薬効又は無効化を監視するために使用することができることを暗示している。

薬剤開発
治療応答の監視と同様に、経路モデルを薬剤開発において種々の想定される化合物の有効性を評価するために使用することができる。例えば、癌細胞株における特定の経路に対する可能性のある効果に関して多数の化合物を選別する場合、各経路モデルを、当該化合物の適用の後に当該経路の活性が上がる又は下がるか否かを判定するために使用することができる。しばしば、このチェックは、当該治療効果の役立たない監視の機会を増加させる当該経路の活性の想定されるマーカのうちの１つのみ又は少しだけを使用して実行される。更に、動物又は患者に対する追跡調査において、該経路モデルは候補薬剤の有効性を評価すると共に、経路活性に最大に影響を与える最適投与量を決定するために同様に使用することができる。

薬剤化合物の役立たない監視の一例が、図１４に示されるようにGSE7708サンプルにおける予測されたＡＲ経路活性により示されている。この研究では、ポリアミド１及びポリアミド２により示された、ＡＲ経路活性を抑圧するための２つの可能性のある薬剤化合物が開発された。これらの２つのポリアミドは、ＡＲ経路の良く知られた目的遺伝子／マーカであるKLK3（＝ＰＳＡ）の発現及びＤＨＴ刺激（ＡＲ経路の既知のアクチベータ）に際して誘導された転写の約３５％を抑圧することができることが示されている。対照的に、ＡＲ経路の（擬）線形モデルは、最初に刺激剤ＤＨＴにより次いでポリアミド１（図１４における２番目のグループ）及びポリアミド２（図１４における３番目のグループ）により処理されたサンプルが活性なＡＲ経路を依然として有することを予測した。推測されたＡＲ活性スコア及び目的遺伝子の測定された発現レベルを調べることは、他の目的遺伝子とは対照的にKLK3は調査結果によればダウンレギュレートされたが、全ての他の目的遺伝子（ポリアミド１の場合はＡＲ、GUCY1A3及びTMPRSS2を除く）はポリアミド１及びポリアミド２で処理されたサンプルにおいて明らかに異なって発現されたことを示した。言い換えると、ＡＲ活性に関しては限られた数の目的遺伝子（特に、これらの薬効マーカKLK3）のみがダウンレギュレートされる一方、識別された目的遺伝子の大多数は依然としてアップレギュレートされ、ＡＲ経路が依然として多くはそのままであり、従って活性であった。文献証拠に基づく多数の目的遺伝子を考慮に入れることにより、発明者は、ポリアミドのＡＲ活性の抑圧は限られたものであり、KLK3発現のみが、これらのポリアミドを用いて明らかにダウンレギュレートされることを示すことができた。更に、このことは、薬剤開発における還元主義的方法と比較した場合の複数目的遺伝子（擬）線形モデルを用いる体系的方法の価値を示している。

アッセイ（分析法）の開発
マイクロアレイ又はＲＮＡ配列解析に由来するｍＲＮＡ入力データに上述した（擬）線形モデルを適用する代わりに、臨床的用途において、例えば目的遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定するためにqPCRを用いて集積化されたプラットフォーム上でサンプル測定を実行するための専用のアッセイを開発することが有益であり得る。この場合、開示された目的遺伝子のＲＮＡ／ＤＮＡ配列を、斯様なプラットフォーム上で何のプライマ及びプローブを選択すべきかを決定するために使用することができる。

このような専用のアッセイの検証は、マイクロアレイに基づく（擬）線形モデルを基準モデルとして使用すると共に、開発されたアッセイが一群の検証サンプル上で同様の結果を生じるかを検証することにより実施することができる。専用のアッセイに次いで、このことは、ｍＲＮＡ配列解析データを入力測定値として用いて同様の（擬）線形モデルを構築及び校正するために実行することもできる。

経路の研究及び癌病態生理学の研究
以下は、（擬）線形モデルを如何にして（臨床的）経路研究に、即ち何の経路が特定の疾病に関係するかを見付けることに関心のある研究に採用することができるかを示し、斯かる研究は例えば信号伝達タンパク質における突然変位を経路活性の変化（該モデルにより測定される）にリンクさせるための一層詳細な研究のために追跡調査され得る。このことは、特定の癌のイニシエーション（起始）、増殖、進化及び転移を調査することに関係する（病態生理学）。

本明細書で説明した図２及び３と同様の、少なくとも転写因子存在に関するノード及び関連するプローブセット（表１、表２、表３及び表４）により測定された目的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを表すノードの層を用いて構築され、本明細書で説明されるように訓練されたWnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ経路の（擬）線形モデルが、乳癌サンプルからなるデータセット（GSE12276）の経路活性を予測するために使用された。

当該研究者は、無制御な細胞増殖を促進させる固有の脱調節（deregulation）及び細胞信号伝達経路又は複数の経路を調べることに関心があると仮定する。該研究者は、何の経路が推定として無制御な細胞増殖の原因であるかを見付けるために上述した（擬）線形モデルを使用してマイクロアレイデータを分析することができる。図１８及び図１９に示されるように、Wnt、ＥＲ、ＨＨ及びＡＲ活性スコアの場合に関する斯様な分析の図解を見ることができる（GSE12276データセットの基底及び管腔Ａ型サンプル）。次いで、該研究者は経路脱調節の正確な原因を見付けるために一層詳細に探査することができる。

図１９を参照すると、基底サンプルは３種の負の受容体状態（ＥＲ、ＰＲ及びHER2）を有することが知られており、従って、全てのサンプルが不活性ＥＲ経路を有すると予測されることが分かることは驚くことではない（図１１も参照）。一方、当該サンプルのうちの幾つかは、図１９に示されるようにWnt経路活性を有すると予測される。これらの予測されたWnt経路の活性は、当該研究者が、これらサンプルを例えばWnt経路における既知の突然変異又は他の既知の脱調節に関して一層詳細に調べることを促す。この手法は、ＨＨ及びＡＲ経路等の他の細胞信号伝達経路に適用することもできる。

他のサンプルが図１８に示され、該図にはGSE12276データセットの管腔Ａ型サンプルにおけるWnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ活性スコアが示されている。管腔Ａ型サンプルはＥＲを発現することが分かっているが、このことは、癌性特性が活性ＥＲ信号伝達によることを必ずしも意味するものではない。予測される経路活性から、全てのＥＲ＋サンプルが活性ＥＲ信号伝達を有するというものではないと推定することができる。しかしながら、当該サンプルのうちの活性ＥＲ信号伝達を有さない幾つかは、活性Wnt、ＡＲ及び／又はＨＨ経路を有することが分かる。このことは、研究者に、これらのサンプルをWnt、ＡＲ及び／又はＨＨ信号伝達経路の各々における欠陥に関して一層詳細に調査させ得る。当該サンプルのうちの幾つかは、誘導された４つの経路の何れも活性であることを予測しない。即ち、恐らくは、他の経路が無制御な細胞増殖の原因となっている。また、このことは、研究者に他の経路において欠陥を探査するための追加の情報を与える。

要約すると、ここに記載した解説は、訓練された（擬）線形モデル（前述した）の、無制御な細胞増殖の原因を一層方向性のある方法で見付ける処理をサポートする能力を示している。経路活性に関してサンプルを選別するために当該（擬）線形モデルを採用することにより、予測された経路活性は無制御な細胞増殖に関する可能性のある経路を正確に示すことができ、このことは、例えば信号伝達タンパク質における突然変異又は他の脱調節を活性の変化（当該モデルにより測定された）にリンクさせるための更に詳細な研究のために追跡調査することができる。

ここに記載したように、細胞信号伝達経路の（擬）線形モデルを開発及び訓練する該処理は、本発明に関連して採用することもできる他の経路のための（擬）線形モデルを構築するために使用することができる。

予測される活性に基づいた臨床試験への被験者の加入
例えば腫瘍の成長を促進する特定の経路の活性を阻止するための薬剤候補が開発され、この薬剤が臨床試験へと進む場合、該薬剤の潜在的有効性を証明するために斯かる試験に参加する被験者の適切な選択が必須である。このような場合において、自身の腫瘍において活性化された対応する経路を有さない患者は当該試験から除外されるべきである。というのは、当該経路が活性化されていないなら、そもそも、該薬剤が有効であり得ないことは明らかであるからである。従って、本明細書で説明した（擬）線形モデル等の経路活性を予測することができる経路モデルを、対応する経路が活性化されていると予測される患者のみを選択するために選択ツールとして使用することができる。

実行されるべき後の試験の選択
腫瘍が異なる経路モデルを用いて分析され、これらモデルが特定の経路の脱調節を予測する場合、このことは、実行されるべき後続の試験の選択をガイドし得る。例えば、対応する転写複合体の存在を確認するために近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を実行することができる（Soderberg O, 2006）。このようなＰＬＡは、ＴＦ複合体における２つのキータンパク質（例えば、Wnt経路のＴＦ複合体におけるβカテニン及びＴＣＦ４）が確かに結合した場合に肯定結果を生じるように設計することができる。

他の方法は、脱調節されたと予測される経路が、信号伝達連鎖に関して一層詳細に分析されることである。例えば、対応する遺伝子のためにエンコードするＤＮＡ領域に突然変異が存在するかを決定するために、この経路におけるキータンパク質を分析することができ、又は正常より高いか又は低いかを知るために、これらのタンパク質の豊富さを試験することができる。このような試験は、当該経路の脱調節の背後にどんな根本原因があるかを示すことができると共に、該経路の活性を減じるためにどの様な入手可能な薬剤を使用することができるかについての洞察を与えることができる。

これらの試験は、当該（擬）線形モデルを用いて識別された経路の活性を確認するために選択される。しかしながら、コンパニオン診断テストの選択も可能である。該経路を用いた経路の識別の後に、標的療法の選択のためには、識別された経路に適用可能なコンパニオン診断テストのみが実行されねばならない（選択）。

コンパニオン診断テストの選択
前例と同様に、腫瘍が分析され、経路モデルが特定の経路の脱調節を予測する一方、オプションとして脱調節の原因を調べるために複数の追加の試験が実行された場合、癌専門医は患者を治療するために複数の候補薬剤を選択することができる。しかしながら、このような薬剤による治療は、例えば臨床指針に従うため、治療費用の返還を保証するため、又は規制により当該薬剤を投与する前にコンパニオン診断テストを実行することが要求されるために、先ずコンパニオン診断テストが実行されることを必要とし得る。このようなコンパニオン診断テストの一例は、薬剤ハーセプチン（トラスツズマブ）による乳癌患者の治療のためのHer2検査である。従って、当該経路モデルを、候補薬剤及び実行されるべき対応するコンパニオン診断テストを選択するために使用することができる。

ＣＤＳ応用例
図４（本明細書に開示された１以上の細胞信号伝達経路（例示的に、Wnt経路に関して示されている）を評価するように構成された臨床意思決定支援（ＣＤＳ）システムを概念的に示す）を参照すると、臨床意思決定支援（ＣＤＳ）システム１０が適切に構成されたコンピュータ１２として実施化されている。コンピュータ１２は、ハードドライブ若しくは他の磁気記憶媒体、光ディスク若しくは他の光記憶媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読出専用メモリ（ＲＯＭ）、フラッシュメモリ、又は他の電子記憶媒体若しくはネットワークサーバ等に記憶された適切なソフトウェア、ファームウエア又は他の命令を実行することによりＣＤＳシステム１０として動作するよう構成することができる。例示的ＣＤＳシステム１０は例示的なコンピュータ１２により具現化されているが、もっと一般的には、該ＣＤＳシステムは本明細書に記載される臨床意思決定支援方法を実行するように構成されたデジタルプロセッサを有するデジタル処理デバイス又は装置により具現化することができる。例えば、該デジタル処理デバイスは、携帯装置（例えば、ＣＤＳアプリケーションを実行するパーソナル・デジタル・アシスタント又はスマートフォン等）、ノートブックコンピュータ、デスクトップコンピュータ、タブレットコンピュータ若しくはデバイス、又は遠隔ネットワークサーバ等であり得る。また、コンピュータ１２又は他のデジタル処理デバイスは、典型的に、臨床意思決定支援推奨例を含む情報が医療関係者に対して表示される表示装置１４を含み、又は斯かる表示装置に動作的に接続される。コンピュータ１２又は他のデジタル処理デバイスは、典型的に、医療関係者が当該ＣＤＳシステム１０を制御するための操作コマンド又は該ＣＤＳシステム１０により使用するためのデータ等の情報を入力することができる例示的キーボード１６又はマウス、トラックボール、タッチスクリーン（恐らくは、表示装置１４に統合される）若しくは他のポインタ型ユーザ入力装置等の１以上のユーザ入力装置を含み又は斯かる入力装置に動作的に接続される。

ＣＤＳシステム１０は、医療対象（例えば、病院の患者、腫瘍専門医、医師若しくは他の医療関係者により治療されている外来患者、又は結腸癌、乳癌若しくは肝臓癌等の特定のタイプの癌を患っていることが分かっている又は疑わしい、癌のスクリーニング若しくは何らかの他の医療診断を受けている人）に関する入力情報を受信する。ＣＤＳシステム１０は、この入力情報に対して種々のデータ分析アルゴリズムを適用して臨床意思決定支援推奨例を作成し、該推奨例は表示装置１４を介して（又は音声合成器若しくは人が知覚可能な出力を供給する他の装置を介して）医療関係者に提示される。幾つかの実施態様において、これらのアルゴリズムは当該患者に臨床指針を適用するステップを含むことができる。臨床指針は、典型的には医療専門家の委員会の推奨に基づいて構築され、オプションとして当該医療指針による誘導（ナビゲーション）を容易化するための臨床“フローチャート”の形にフォーマットされた一群の記憶された標準的又は“基準的”治療推奨例である。種々の実施態様において、ＣＤＳシステム１０のデータ処理アルゴリズムは、付加的に又は代替的に、本明細書に開示されたマシン学習方法等の、臨床意思決定推奨例を抽出するために入力情報に対して実行される種々の診断又は臨床試験アルゴリズムを含むことができる。

本明細書に開示された例示的なＣＤＳシステム（例えば、ＣＤＳシステム１０）において、ＣＤＳデータ分析アルゴリズムは、１以上の医療研究室（検査室）１８により収集された入力ゲノム及び／又はプロテオーム情報に対して実行される１以上の診断又は臨床試験アルゴリズムを含む。これらの研究室は、様々に配置された“オンサイト”のもの、即ち当該病院又は当該医療対象が医療検査及び／又は治療を受けている他の場所におけるもの、又は“オフサイト”のもの、例えば、（郵便又は他の配送サービスを介して）当該医療対象から抽出された該医療対象の組織及び／又は細胞のサンプル（生検手順又は他の抽出手順を介して、乳房病変から、結腸癌を有すると分かっている若しくは疑われる医療対象の結腸から、又は肝臓癌を有することが分かっている若しくは疑われる医療対象の肝臓等々から取得されたサンプル）を受け取る専門の集中型研究室であり得る。サンプルが抽出される組織は、例えば、結腸、乳房、肝臓又は他の臓器の外側に拡散した該結腸、乳房、肝臓又は他の臓器に由来する（疑わしい）悪性組織等の転移性組織とすることもできる。サンプルが抽出される細胞は、血液悪性腫瘍（白血病等の）からの腫瘍性細胞とすることもできる。幾つかのケースにおいて、細胞サンプルは、循環腫瘍細胞、即ち血流に入った腫瘍細胞とすることもでき、適切な分離技術を用いて抽出された組織サンプルとして抽出することができる。抽出されたサンプルは、研究室によりゲノム又はプロテオーム情報を発生するように処理される。抽出されたサンプルは、例えば当該遺伝子から転写されたメッセンジャリボ核酸（ｍＲＮＡ）のレベル、又は当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルの形態で、関心遺伝子の発現レベル等の証拠となるゲノム又はプロテオーム情報を測定するためにマイクロアレイ（当該分野において遺伝子チップ、ＤＮＡチップ又はバイオチップ等と種々称される）を用いて又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）処理により処理することができる。他の例として、抽出されたサンプルは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に関する配列を発生するために、又はＲＮＡ配列又はコピー数多型等を発生するために遺伝子配列解析研究室により処理することもできる。他の考えられる測定方法は、病理スライド上で実行される免疫組織化学（ＩＨＣ）法、細胞学法、蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法又は近接ライゲーションアッセイ等を含む。マイクロアレイ処理、質量分析、遺伝子配列解析又は他の研究室技術により発生することができる情報は、メチル化情報を含む。このようなゲノム及び／又はプロテオーム測定の種々の組み合わせも実行することができる。

幾つかの実施態様において、医療研究室１８は医療対象の組織及び／又は細胞の抽出サンプルに対して複数の標準化されたデータ収集を実行し、大量のゲノム及び／又はプロテオームデータを発生する。例えば、該標準化されたデータ収集技術は、当該組織及び／又は細胞の全体のゲノムに関する、又は１以上の染色体若しくは染色体部分に関する（オプションとして整列された）ＤＮＡ配列を発生させることができる。標準的マイクロアレイを適用することは、多数の遺伝子に関する発現レベル及び種々のメチル化データ等の数千又は数万のデータ項目を発生させることができる。この大量のゲノム及び／又はプロテオームデータ又はその選択された部分は、臨床意思決定支援推奨例を策定するための臨床的に有用な情報を発生させるように処理されるべくＣＤＳシステム１０に入力される。

開示されたＣＤＳシステム及び関連する方法は、種々の細胞信号伝達経路の活性を評価するためのゲノム及び／又はプロテオームデータの処理に関するものである。しかしながら、開示されたＣＤＳシステム（例えば、ＣＤＳシステム１０）は、オプションとして、バイタルサイン監視データ、患者履歴データ、患者の人口統計的データ（例えば、性別、年齢等）、又は患者の医療画像データ等の種々の患者データに基づく記憶された臨床指針に従って臨床意思決定支援推奨例を発生させる等の種々の付加的能力も更に含むことができると理解されるべきである。他の例として、幾つかの実施態様では、ＣＤＳシステム１０の能力は、本明細書で開示された細胞信号伝達経路を評価するためにゲノム及び／又はプロテオームデータ分析を実行することのみに限定することもできる。

図４を続けて参照すると、ＣＤＳシステム１０は、医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の活性を、（これらに限られるものではないが）少なくとも抽出されたサンプルにおいて測定された細胞信号伝達経路の目的遺伝子の発現レベルに基づいて推定すると共に、該細胞信号伝達経路が当該医療対象の組織及び／又は細胞において異常に働いているかを、この推定された活性に基づいて決定する。ここに開示される例は、例示的細胞信号伝達経路としてのWnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路に関するものである。これらの経路は、経路の調節の喪失が癌の増殖の原因となり得るので、腫瘍学の種々の領域において関心のあるものである。約１０〜１５の関連のある信号伝達経路が存在し、各癌は原則的に１つの経路が脱調節状態になることにより促進される。如何なる特定の動作原理にも限定されることなく、これらの経路は細胞増殖を調節し、従って、これらの経路の調節の癌細胞における喪失は、当該経路が“常にオン”となることにつながり、従って癌細胞の増殖を加速させ、これが当該癌の成長、浸潤又は転移（拡散）として現れる。

細胞信号伝達経路を形成するタンパク質カスケードの一部である中間タンパク質等の、当該細胞信号伝達経路の調節タンパク質に関してエンコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの測定は、該調節タンパク質の発現レベルの間接的尺度であり、実際の調節タンパク質発現レベルと強く相関し得るか又は相関しない（当該細胞信号伝達経路の全体の活性に対しては大幅に少ない）。細胞信号伝達経路は目的遺伝子の転写を直に調節し、従って、目的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの発現レベルは、この調節活動の直接的結果である。従って、ＣＤＳシステム１０は、細胞信号伝達経路（例えば、Wnt、ＥＲ、ＡＲ及びＨＨ経路）の活性を、少なくとも該細胞信号伝達経路の目的遺伝子の発現レベル（代替測定値としてのｍＲＮＡ又はタンパク質レベル）に基づいて推定する。このことは、当該ＣＤＳシステム１０が経路の活性を目的遺伝子の測定された発現レベルにより供給される直接的情報に基づいて推定することを確かなものとする。

しかしながら、ここで開示されるように全体の経路の活性を評価するためには効果的であるが、経路の目的遺伝子の測定された発現レベル２０は、当該経路が何故異常に働いているか（確かに、それが当てはまる場合）に関しては特別に情報的であるものではない。言い換えると、経路の目的遺伝子の測定された発現レベル２０は、当該経路が異常に働いているということを示すことはできるが、当該経路のタンパク質が経路全体を異常に働かせるために機能不全になっている（例えば、十分な調節に欠けている）ことを示すものではない。

従って、ＣＤＳシステム１０が特定の経路の異常な活性を検出した場合、該ＣＤＳシステム１０は、オプションとして、経路２４の１以上の調節遺伝子に関する測定された発現レベル（又は複数のレベル）及び／又は整列された遺伝子配列２２等の、抽出されたサンプルに関して医療研究室１８により供給される他の情報を利用するか、又は当該経路のどの部分が機能不全であるかを評価するために次に実行されるべき診断テストを選択する。効率を最大にするために、幾つかの実施態様では、当該経路が何故機能不全であるかについての該オプションとしての評価は、該経路の目的遺伝子の測定された発現レベル２０の分析が、該経路が異常に働いていることを示す場合にのみ実行される。他の実施態様では、この評価は、本明細書に記載された細胞信号伝達経路の分析に組み込まれる。

ＣＤＳシステム１０が当該経路の何の部分が機能不全であるかを評価すると共に、そのようにすることに成功する実施態様において、上記付加的情報は、該ＣＤＳシステム１０が特定の不全を目標とする薬剤を処方することを推奨することを可能にする（図４に示される推奨２６）。特定の経路の機能不全が識別されない場合（上記オプションとしての追加の評価が実行されない故に、又は該評価が機能不全である経路の如何なる特定の部分も識別することができない故に）、ＣＤＳシステム１０は、この特定の経路のための一般的抑制薬剤の処方を推奨するデフォルトの推奨２８を提供することができる（当該異常経路活性が過度に高い活性であると仮定する）。

経路活性を測定するためのキット及び分析ツール
当該（擬）線形モデルを使用したマイクロアレイ／ＲＮＡ配列解析ベースの調査に基づいて特定の経路活性を最も良く示すことが分かった一群の目的遺伝子は、組織又は細胞サンプルに対して実行されるべき多重定量ＰＣＲアッセイに変換することができる。経路活性に関する斯様なＦＤＡ認証試験を開発するためには、標準化された検査キットの開発が必要であり、斯かるキットは規制認可を取得するために臨床試験で臨床的に認証されねばならない。

一般的に、前記Wnt、ＥＲ、ＡＲ及び／又はＨＨ経路に関する例は例示的例として提示されているが、本明細書で開示された細胞信号伝達経路分析のための方法は、細胞膜内の受容体による細胞間信号伝達経路（前記参照）及び細胞内の受容体による細胞内信号伝達経路（前記参照）等の、これら経路に加えて他の細胞信号伝達経路にも容易に適用されると理解されるべきである。更に、本出願は幾つかの好ましい実施態様を説明したものである。当業者によれば、以上の詳細な説明を精読し理解すれば、変形例及び代替例を思い付くことができる。本出願は、添付請求項又はその均等物の範囲内に入る限りにおいて、全ての斯様な変形例及び代替例を含むものと見なされるべきである。

［文献］
de Sousa E Melo F, C. S. (2011). Methylation of cancer-stem-cell-associated Wnt target genes predicts poor prognosis in colorectal cancer patients. Cell Stem Cell., 476-485;
Hatzis P, v. d. (2008). Genome-wide pattern of TCF7L2/TCF4 chromatin occupancy in colorectal cancer cells. Mol Cell Biol., 2732-2744；
Nusse, R. (2012, May 1). Wnt target genes. Retrieved from The Wnt homepage: http://www.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/target_genes；
Soderberg 0, G. M. (2006). Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods., 995-1000；
van de Wetering M, S. E.-P.-F. (2002). The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell, 241-250。

Claims (21)

1. 医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の活性を、少なくとも前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定された前記細胞信号伝達経路の１以上の目的遺伝子の発現レベルに基づいて推定するステップであり、当該推定するステップは、
   前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおける転写因子（ＴＦ）要素のレベルを決定するステップであり、前記ＴＦ要素は前記細胞信号伝達経路の１以上の目的遺伝子の転写を制御し、前記決定は前記細胞信号伝達経路の１以上の目的遺伝子の発現レベルを前記ＴＦ要素のレベルに関連させる数学的モデルを評価することに少なくとも部分的に基づくものであり、前記モデルが前記１以上の目的遺伝子の発現レベルの１以上の線形結合に少なくとも部分的に基づくものである、ステップと、
   前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおける前記ＴＦ要素の決定されたレベルに基づいて推定するステップと、
   を含むステップ、
   を含む方法であって、
   前記推定するステップが、デジタル処理装置により前記細胞信号伝達経路のモデルを使用して実行される、方法。
2. 前記１以上の目的遺伝子の各々に関して前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定された１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合が前記１以上の目的遺伝子の各々に関して供給された前記１以上の発現レベルのうちの全ての発現レベルの線形結合を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記１以上の目的遺伝子の各々に関して前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定された１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合が、前記１以上の目的遺伝子の各々に関して、加重された項を含む線形結合を含み、各加重された項が、対応する目的遺伝子に関して供給された前記１以上の発現レベルのうちの１つのみの発現レベルに基づくものである、請求項１に記載の方法。
4. 前記１以上の目的遺伝子の各々に関して前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定された１以上の発現レベルが供給され、前記１以上の線形結合が、前記１以上の目的遺伝子の各々に関して、対応する目的遺伝子に関して供給された前記１以上の発現レベルの全ての発現レベルの第１線形結合を含み、前記モデルは前記１以上の目的遺伝子の各々に関して加重された項を含む他の線形結合に更に少なくとも部分的に基づくものであり、各加重された項が、対応する目的遺伝子に関する前記第１線形結合に基づくものである、請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞信号伝達経路が、Ｗｎｔ経路、ＥＲ経路、ＡＲ経路又はＨＨ経路を含む、請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＷｎｔ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＷｎｔ経路の、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６及びＦＺＤ７を含む群から選択される１以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＥＲ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＥＲ経路の、ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１及びＮＲＩＰ１を含む群から選択される１以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
8. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＨＨ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＨＨ経路の、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ及びＣＴＳＬ１を含む群から選択される１以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
9. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞におけるＡＲ経路の活性を、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＡＲ経路の、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２を含む群から選択される１以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
10. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＷｎｔ経路の、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ及びＬＥＣＴ２を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである、請求項６に記載の方法。
11. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＥＲ経路の、ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲ１、ＨＳＰＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＫＲＴ１９、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＶ３、ＰＩＳＤ、ＰＲＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤ１及びＴＲＩＭ２５を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである、請求項７に記載の方法。
12. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＨＨ経路の、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１及びＴＯＭ１を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである、請求項８に記載の方法。
13. 前記推定するステップが、前記医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＡＲ経路の、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１及びＴＡＣＣ２を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子の発現レベルに更に基づくものである、請求項９に記載の方法。
14. 当該方法が、
    前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づく薬剤処方、
    前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づく薬効の予測、
    前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づく有害効果の予測、
    薬効の監視、
    薬剤の開発、
    アッセイの開発、
    経路の研究、
    癌進行度分類、
    前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づく該医療対象の臨床試験への加入、
    前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づく実行されるべき後の試験の選択、及び
    前記医療対象の組織及び／又は細胞における細胞信号伝達経路の前記推定された活性に基づくコンパニオン診断テストの選択、
    のうちの少なくとも１つに使用される、請求項１乃至１３の何れか一項に記載の方法。
15. 医療対象の組織及び／又は細胞におけるＷｎｔ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＷｎｔ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、
    医療対象の組織及び／又は細胞におけるＥＲ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＥＲ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、
    医療対象の組織及び／又は細胞におけるＨＨ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＨＨ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、及び／又は
    医療対象の組織及び／又は細胞におけるＡＲ経路の活性を、該医療対象の組織及び／又は細胞の抽出されたサンプルにおいて測定されたＡＲ経路の一群の目的遺伝子のうちの２つ、３つ又はそれ以上の目的遺伝子の発現レベルに少なくとも基づいて推定するステップ、
    を含む、請求項１乃至１４の何れか一項に記載の方法。
16. 前記Ｗｎｔ経路の一群の目的遺伝子が、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６及びＦＺＤ７を含む群から選択される少なくとも９つの目的遺伝子を含み、
    前記ＥＲ経路の一群の目的遺伝子が、ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１及びＮＲＩＰ１を含む群から選択される少なくとも９つの目的遺伝子を含み、
    前記ＨＨ経路の一群の目的遺伝子が、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ及びＣＴＳＬ１を含む群から選択される少なくとも９つの目的遺伝子を含み、及び／又は
    前記ＡＲ経路の一群の目的遺伝子が、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２を含む群から選択される少なくとも９つの目的遺伝子を含む、
    請求項１５に記載の方法。
17. 前記Ｗｎｔ経路の一群の目的遺伝子が、ＮＫＤ１、ＯＡＴ、ＦＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＬＵＬ、ＲＥＧ１Ｂ、ＴＣＦ７Ｌ２、ＣＯＬ１８Ａ１、ＢＭＰ７、ＳＬＣ１Ａ２、ＡＤＲＡ２Ｃ、ＰＰＡＲＧ、ＤＫＫ１、ＨＮＦ１Ａ及びＬＥＣＴ２を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含み、
    前記ＥＲ経路の一群の目的遺伝子が、ＡＰ１Ｂ１、ＡＴＰ５Ｊ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＸ７Ａ２Ｌ、ＥＢＡＧ９、ＥＳＲ１、ＨＳＰＢ１、ＩＧＦＢＰ４、ＫＲＴ１９、ＭＹＣ、ＮＤＵＦＶ３、ＰＩＳＤ、ＰＲＤＭ１５、ＰＴＭＡ、ＲＡＲＡ、ＳＯＤ１及びＴＲＩＭ２５を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含み、
    前記ＨＨ経路の一群の目的遺伝子が、ＢＣＬ２、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＦ１、Ｈ１９、ＨＨＩＰ、ＩＬ１Ｒ２、ＪＡＧ２、ＪＵＰ、ＭＩＦ、ＭＹＬＫ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ２．８、ＰＩＴＲＭ１及びＴＯＭ１を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含み、及び／又は
    前記ＡＲ経路の一群の目的遺伝子が、ＡＰＰ、ＮＴＳ、ＰＬＡＵ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＲＧ１、ＦＧＦ８、ＩＧＦ１、ＰＲＫＡＣＢ、ＰＴＰＮ１、ＳＧＫ１及びＴＡＣＣ２を含む群から選択される少なくとも１つの目的遺伝子を更に含む、
    請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法を実行するためにデジタル処理装置により実行することが可能な命令を記憶した、非一時的記憶媒体。
19. デジタル処理装置に請求項１乃至１７の何れか一項に記載の方法を実行させるプログラムコード手段を含む、コンピュータプログラム。
20. 前記１以上の目的遺伝子は、少なくとも３つの目的遺伝子である、請求項６乃至９の何れか一項に記載の方法。
21. 前記Ｗｎｔ経路の一群の目的遺伝子が、ＫＩＡＡ１１９９、ＡＸＩＮ２、ＲＮＦ４３、ＴＢＸ３、ＴＤＧＦ１、ＳＯＸ９、ＡＳＣＬ２、ＩＬ８、ＳＰ５、ＺＮＲＦ３、ＫＬＦ６、ＣＣＮＤ１、ＤＥＦＡ６及びＦＺＤ７を含み、
    前記ＥＲ経路の一群の目的遺伝子が、ＣＤＨ２６、ＳＧＫ３、ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、ＣＡ１２、ＸＢＰ１、ＣＥＬＳＲ２、ＷＩＳＰ２、ＤＳＣＡＭ、ＥＲＢＢ２、ＣＴＳＤ、ＴＦＦ１及びＮＲＩＰ１を含み、
    前記ＨＨ経路の一群の目的遺伝子が、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＩＧＦＢＰ６、ＳＰＰ１、ＣＣＮＤ２、ＦＳＴ、ＦＯＸＬ１、ＣＦＬＡＲ、ＴＳＣ２２Ｄ１、ＲＡＢ３４、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ７、ＭＹＣＮ、ＦＯＸＭ１、ＧＬＩ３、ＴＣＥＡ２、ＦＹＮ及びＣＴＳＬ１を含み、及び／又は
    前記ＡＲ経路の一群の目的遺伝子が、ＫＬＫ２、ＰＭＥＰＡ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＮＫＸ３＿１、ＡＢＣＣ４、ＫＬＫ３、ＦＫＢＰ５、ＥＬＬ２、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＤＨＣＲ２４、ＰＰＡＰ２Ａ、ＮＤＲＧ１、ＬＲＩＧ１、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＬＣＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＡＲ及びＥＡＦ２を含む、
    請求項１６に記載の方法。