JP6788882B2

JP6788882B2 - 自然免疫活性化作用を有する多糖類及び該多糖類を含有する自然免疫活性化剤又は飲食品

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Inventors: 関水　和久; 和久関水; 誠浦井
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Description

本発明は、自然免疫活性化作用を有する多糖類、及び該多糖類を含有する自然免疫活性化剤又は飲食品に関する。

ヒト等の高等な脊椎動物は、自然免疫と獲得免疫の２種類の免疫機構（免疫系）を有し、双方の免疫機構が適切に作用することで感染源からの防御を行っている。一方で、昆虫類等の残りの多くの生物は、獲得免疫機構を有さず、自然免疫機構のみで感染源からの防御を行っている。
自然免疫機構は生物が共通に有する感染防御機構であり、非特異的であるために反応が素早く、多くの感染源に対して有効に機能することが特徴である。ヒト等の高等な脊椎動物においても、感染初期の抵抗性、癌や生活習慣病の予防、組織修復等の観点からは、感染源に特異的な感染免疫よりも、非特異的な自然免疫の方がより重要な位置を示していると考えられる。

したがって、自然免疫は感染症の初期における生体防御機構の重要な宿主因子であり、自然免疫の活性化が感染症の予防及び治療に有効であると考えられる。また、近年癌に対する医薬品開発の重要性も高まってきており、キノコ類に由来する多糖類のもつ抗腫瘍活性をはじめとした自然免疫活性化能が注目されている。

これまでに本発明者らにより、カイコの筋標本に真菌由来β-グルカンや細菌由来ペプチドグリカン等の自然免疫活性化物質を注射すると昆虫サイトカインである麻痺ペプチドが誘導され、自然免疫が活性化すると同時に、筋肉が収縮することを見出している（特許文献１、非特許文献１〜３）。また、この筋肉の収縮により体長が変化することを指標とした、簡便な自然免疫活性化物質の探索系を確立しており、これまでに緑茶等から抽出した多糖類に自然免疫活性化能を見出している（非特許文献４、５）。

野菜は人類の健康維持に必要な栄養素の摂取に重要であることが経験的に知られている一方で、伝統的な薬草としての利用も世界的に行われてきており、自然免疫活性化物質を含有している可能性が考えられているが、明確に自然免疫機能を活性化する作用を有するとされた物質は現在まで知られていない。

これまでに本発明者により、ブロッコリーの抽出物が自然免疫活性化作用を示すことが見出されているが（特許文献１）、具体的にブロッコリー中のどの成分が自然免疫活性化作用に直接関与しているかはこれまで判明していなかった。そうであるから当然、該成分（化合物）のどの部位（化学構造）が自然免疫活性化作用を有しているかも判明していなかった。

したがって、上記ブロッコリーの抽出物に限らず、生物からの抽出成分（化合物）の化学結合を分解等して有効部位（化学構造）だけを取り出して自然免疫活性化剤とする試みは殆どなされていなかった。言い換えれば、生物からの抽出成分（化合物）を原料に、自然免疫活性化に有効な化学構造を有する自然免疫活性化剤が調製（合成）されたことは殆どなかった。

国際公開第２００８／１２６９０５号

Activation of the silkworm cytokine by bacterial and fungal cell wall components via a reactive oxygen species-triggered mechanism. Ishii K, Hamamoto H, Kamimura M, Sekimizu K. J Biol Chem. 2008, 283(4), 2185-91. Insect cytokine paralytic peptide (PP) induces cellular and humoral immune responses in the silkworm Bombyx mori. Ishii K, Hamamoto H, Kamimura M, Nakamura Y, Noda H, Imamura K, Mita K, Sekimizu K. J Biol Chem. 2010, 285(37), 28635-42. Porphyromonas gingivalis peptidoglycans induce excessive activation of the innate immune system in silkworm larvae. Ishii K, Hamamoto H, Imamura K, Adachi T, Shoji M, Nakayama K, Sekimizu K. J Biol Chem. 2010, 285(43), 33338-47. Purification of innate immunostimulant from green tea using a silkworm muscle contraction assay. Dhital S, Hamamoto H, Urai M, Ishii K, Sekimizu K. Drug Discoveries & Therapeutics. 2011, 5(1), 18-15. Evaluation of innate immune stimulating activity of polysaccharides using a silkworm (Bombyx mori) muscle contraction assay. T. Fujiyuki, H. Hamamoto, K. Ishii, M. Urai, K. Kataoka, T. Takeda, S. Shibata and K. Sekimizu. Drug Discoveries & Therapeutics, 6(2), 88-93, 2012.

本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、自然免疫活性化作用を有する新規物質の提供である。

本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明者によって確立されたカイコ筋収縮活性測定法を用いて、ブロッコリー抽出物から自然免疫活性化物質を精製し構造解析を行った。更に、その活性に必要な構造についても検討した。
その結果、ブロッコリーの抽出物を精製することによって、今まで構造が知られていない多糖類中に自然免疫活性化作用を有するものがあることを見出した。

更に、上記多糖類の構成成分であるポリガラクツロン酸鎖が自然免疫活性化作用に対して重要な役割を担っていることを見出して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、自然免疫活性化作用を有する多糖類であって、
構成糖として、２５〜５０モル部のガラクツロン酸、１５〜５０モル部のガラクトース、０〜７モル部のグルコース、０〜３０モル部のアラビノース、０〜６モル部のキシロース、及び３〜１５モル部のラムノースを含有し、
主鎖として、α−１，４結合のガラクツロン酸を有するポリガラクツロン酸鎖を含有することを特徴とする多糖類を提供するものである。

また、上記多糖類を有効成分として含有することを特徴とする自然免疫活性化剤を提供するものである。

また、上記多糖類を含有することを特徴とする飲食品を提供するものである。

本発明によれば、新規の化学構造を有する、自然免疫活性化作用を有する多糖類を提供することができる。
また、該多糖類を有効成分として含有する自然免疫活性化剤や、該多糖類を含有する自然免疫活性化作用を有する飲食品を提供することができる。

また、本発明の多糖類は極めて安全で副作用もないものである。また、各種の剤形にすることも容易であり、飲食品に添加することも容易なので、安全な自然免疫活性化剤や機能性食品として、極めて効果的に自然免疫を活性化することができる。

ＤＥＡＥ−セルロース吸着画分をカイコに注射したときの比活性（Ｃ値）の測定結果を示すグラフである。（ａ）標準サンプル、（ｂ）ＤＥＡＥ−セルロース吸着画分の加水分解物、のＨＰＬＣ分析結果を示すスペクトルである。ＤＥＡＥ−セルロース吸着画分の、（ａ）５００ＭＨｚ^１ＨＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１２５ＭＨｚ^１３ＣＮＭＲスペクトルである。ＤＥＡＥ−セルロース吸着画分のアルジトールアセテート誘導体に対する、メチル化分析結果を示すスペクトルである。シュウ酸加水分解物の、（ａ）５００ＭＨｚ^１ＨＮＭＲスペクトル及び（ｂ）１２５ＭＨｚ^１３ＣＮＭＲスペクトルである。ペクチナーゼ処理物をゲルろ過クロマトグラフィーで分画した結果を示すグラフである。本発明の多糖類及び該多糖類処理物の化学構造の一例を示す模式図である。

以下、本発明について説明するが、本発明は以下の具体的形態に限定されるものではなく、本発明の技術的範囲内で任意に変形することができる。

＜多糖類＞
本発明の多糖類は、自然免疫活性化作用を有し、
構成糖として、２５〜５０モル部のガラクツロン酸、１５〜５０モル部のガラクトース、０〜７モル部のグルコース、０〜３０モル部のアラビノース、０〜６モル部のキシロース、及び３〜１５モル部のラムノースを含有し、
主鎖として、α−１，４結合のガラクツロン酸を有するポリガラクツロン酸鎖を含有することを特徴とする。

本発明の多糖類は、構成糖として、２５〜５０モル部のガラクツロン酸、１５〜５０モル部のガラクトース、０〜７モル部のグルコース、０〜３０モル部のアラビノース、０〜６モル部のキシロース、及び３〜１５モル部のラムノースを含有することを必須である。
好ましくは、構成糖として、２５〜４５モル部のガラクツロン酸、２０〜５０モル部のガラクトース、１〜７モル部のグルコース、０〜２０モル部のアラビノース、０〜６モル部のキシロース、及び４〜１４モル部のラムノースを含有することである。
より好ましくは、構成糖として、２５〜４０モル部のガラクツロン酸、３０〜５０モル部のガラクトース、３〜７モル部のグルコース、０〜１０モル部のアラビノース、０〜５モル部のキシロース、及び５〜１３モル部のラムノースを含有することである。
特に好ましくは、構成糖として、３０〜４０モル部のガラクツロン酸、３５〜４５モル部のガラクトース、５〜６モル部のグルコース、０〜５モル部のアラビノース、０〜５モル部のキシロース、及び６〜１２モル部のラムノースを含有することである。

本発明の多糖類には、本発明の効果を損なわない範囲内で、上記単糖以外の単糖が含まれていてもよい。

本発明の多糖類は、主鎖として、α−１，４結合のガラクツロン酸を有するポリガラクツロン酸鎖を含有する。ポリガラクツロン酸鎖中には、本発明の効果を損なわない範囲内で、ガラクツロン酸以外の単糖が含まれていてもよい。
該「ガラクツロン酸以外の単糖」としては、例えばラムノース等が挙げられる。
また、該「ポリガラクツロン酸鎖」中のガラクツロン酸（単位）の結合割合は、該「ポリガラクツロン酸鎖」全体に対して、２０モル％〜９９モル％が好ましく、３０モル％〜９７モル％がより好ましく、４０モル％〜９５モル％が特に好ましい。
主鎖である「ポリガラクツロン酸鎖」におけるガラクツロン酸（単位）の結合割合が少な過ぎると、前記多糖類の自然免疫活性化作用が低下する場合がある。一方、多過ぎると、前記本発明の多糖類が得られ難い。

本発明の多糖類には、ガラクツロン酸メチルエステルが存在しないことより、ペクチンとは異なり、新規構造を有する多糖類である。更に、天然物から自然免疫活性化作用を有する化学構造を取り出して「本発明の多糖類」としているので新規物質である。

本発明の多糖類は、ブロッコリー抽出物を精製することによって見出された。ブロッコリー抽出物は数多くの成分によって構成されている。その成分の中から、自然免疫活性化作用を有する成分を同定することは容易ではない。
本発明は、道義的問題が少なくかつ簡便なカイコ筋収縮活性測定法を何度も用いて、上記「ブロッコリー抽出物の数多くの成分」の自然免疫活性化作用を個々に測定することによって初めて完成した。更に、該成分から化学構造（単位）を分解して取り出して、同様にカイコ筋収縮活性測定法を何度も用いて、数多くの化学構造（単位）の中から、自然免疫活性化作用を有する化学構造（単位）を見出して完成した。

本発明の多糖類は、天然物から、精製、分解等によって得られた天然物由来のもの、天然物を原料にして化学修飾して得られたもの等であってもよいし、完全に合成されたものであってもよい。

＜自然免疫活性化剤＞
本発明の自然免疫活性化剤は、上記多糖類を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の自然免疫活性化剤に有効成分として含まれる多糖類は、天然のものであっても、合成されたものであってもよい。

本発明の自然免疫活性化剤中の有効成分である多糖類の、自然免疫活性化剤全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜決定することができる。自然免疫活性化剤全体を１００質量部としたときに、多糖類の合計量として、０．０１〜１００質量部の含有量が好ましく、より好ましくは０．１〜９９質量部、特に好ましくは１〜９５質量部、さらに好ましくは１０〜９０質量部の含有量である。

本発明の自然免疫活性化剤は、有効成分である上記多糖類に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
該「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。また、該自然免疫活性化剤中の該「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明の自然免疫活性化剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。

前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。

前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。

前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。

前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。

前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シート等が挙げられる。

本発明の自然免疫活性化剤は、例えば、自然免疫機構の活性化を必要とする個体（例えば、健康維持や疲労回復を必要とする個体；癌や生活習慣病の予防や治療を必要とする個体；細菌、真菌、ウイルス等に感染した個体；等）に投与することにより使用することができる。

本発明の自然免疫活性化剤の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。

また、前記自然免疫活性化剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記自然免疫活性化剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
また、前記自然免疫活性化剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分である前記多糖類全体の量として、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、前記自然免疫活性化剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。

＜飲食品＞
本発明の飲食品は、上記多糖類又は上記本発明の自然免疫活性化剤を含有することを特徴とする。
本発明の飲食品は、自然免疫活性化作用を有する。

上記多糖類又は上記自然免疫活性化剤を含有する飲食品（以下、「本発明の飲食品」と略記する場合がある）中の、多糖類又は自然免疫活性化剤の含有量は、特に制限がなく、目的や飲食品の態様（種類）に応じて、適宜選択することができるが、飲食品全体を１００質量部としたときに、上記自然免疫活性化剤の合計量で、０．００１〜１００質量部で含有することが好ましく、より好ましくは０．０１〜１００質量部、特に好ましくは０．１〜１００質量部の含量である。

また、多糖類又は自然免疫活性化剤の何れか１種を単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合の、前記飲食品中の各々の物質の含有量比には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明の飲食品は、上記多糖類又は上記本発明の自然免疫活性化剤に加えて、更に、「その他の成分」を含有することができる。
かかる自然免疫活性化作用を有する本発明の飲食品における、前記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種食品原料等が挙げられる。また、「その他の成分」の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

前記飲食品の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼリー、キャンディー、チョコレート、ビスケット等の菓子類；緑茶、紅茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料；発酵乳、ヨーグルト、アイスクリーム等の乳製品；野菜飲料、果実飲料、ジャム類等の野菜・果実加工品；スープ等の液体食品；パン類、麺類等の穀物加工品；各種調味料；等が挙げられる。
これらの飲食品の製造方法としては、特に制限はなく、例えば、通常の各種飲食品の製造方法に応じて、適宜製造することができる。

また、前記飲食品は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口固形剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口液剤として製造されたものであってもよい。前記経口固形剤、経口液剤の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記した薬剤の経口固形剤、経口液剤の製造方法にならい、製造することができる。

前記飲食品は、自然免疫機構の活性化を目的とした、機能性食品、健康食品等として、特に有用であると考えられる。

本発明の多糖類又は自然免疫活性化剤を飲食品の製造に使用する場合、製造方法は当業者に周知の方法によって行うことができる。当業者であれば、本発明の多糖類を他の成分と混合する工程、成形工程、殺菌工程、発酵工程、焼成工程、乾燥工程、冷却工程、造粒工程、包装工程等を適宜組み合わせ、目的の飲食品を作ることが可能である。

以下、実施例、比較例、試験例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例等に限定されるものではない。

＜熱水抽出＞
各種野菜を裁断後、水を加えてオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）した。放冷後遠心（８０００ｒｐｍ、１０分）し、上澄みを「熱水抽出物」とした。

＜カイコ筋収縮活性測定法＞
サンプルをバッファーに溶解後、カイコの筋標本に１００μＬ注射し、筋肉の収縮を計測した。注射前後の筋標本の長さの差を注射前の長さで除した値（比活性又はＣ値（Contraction value））が０．１５以上を示した場合に自然免疫活性化能があると判定した。

＜ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の精製＞
ブロッコリーの熱水抽出物に対してエタノール沈殿を行った。熱水抽出方法は、特許文献１に記載されている方法に従った。得られた沈殿をミリＱ水に溶解し、ミリＱ水に対して透析を行った後、凍結乾燥した。これをＤＥＡＥ−セルロース（DEAE-cellulose）カラムクロマトグラフィーに供し、各画分についてフェノール−硫酸法による還元糖量の測定を行った。糖質の溶出したピークを集め、透析を行った後、凍結乾燥した。

＜ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の構造解析＞
[[１．単糖組成分析]]
ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分をトリフルオロ酢酸により加水分解し、加水分解産物に対してアミノ安息香酸エチルエステル標識して、ＯＤＳカラムによるＨＰＬＣ分析を行った。標準単糖としてＬ−アラビノース（Ａｒａ）、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ−マンノース（Ｍａｎ）、Ｌ−ラムノース（Ｒｈａ）、Ｄ−リボース（Ｒｉｂ）、Ｄ−キシロース（Ｘｙｌ）、Ｄ−ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を混合した試料についても同様の処理を行い、保持時間の比較を行った。

[[２．ＮＭＲ分析]]
２７ｍｇのＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分を重水（Ｄ_２Ｏ）に４０℃で溶解し、^１Ｈ、^１３ＣＮＭＲ及びＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ分析を行った。

[[３．メチル化分析]]
ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分に対してメチル化後、トリフルオロ酢酸により加水分解した。これをアセチル化後、アルジトールアセテートとし、ＧＣＭＳにより分析した。

＜ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の選択的分解＞
[[１．シュウ酸加水分解によるアラビノースの選択的分解]]
ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分についてシュウ酸加水分解を行い、中和後、透析、凍結乾燥した。

[[２．ペクチナーゼによるポリガラクツロン酸鎖の分解]]
ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分に対してペクチナーゼ（Sigma社）処理した。加熱により酵素を失活させた後、Bio-gel P4ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供し、各画分についてフェノール−硫酸法による還元糖量の測定を行った。Bio-gel P4ゲルろ過カラムは１１５０ｎｍ×１５ｍｍφのものを使用し、溶出液として０．２Ｍ酢酸を使用した。糖質の溶出したピークを集め、減圧乾燥した。

実施例１
［自然免疫活性化物質を含む野菜の探索］
１７種の野菜（ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、ピーマン、羅漢果、ホウレンソウ、ニンニク、カボチャ、ショウガ、ミニトマト、ダイコン、トウミョウ、パセリ、キュウリ、ナス、ネギ、ハクサイ）の熱水抽出物について、カイコ筋収縮活性測定法を用いた自然免疫活性化能の比較を行った。

表１は、１７種の野菜の熱水抽出物について、カイコ筋収縮活性測定法を用いて得られた比活性（Ｃ値）の結果である。比活性（Ｃ値）が０．１５以上を示した場合に自然免疫活性化能があると判定される。表１の結果より、ブロッコリーの熱水抽出物に強い自然免疫活性化能が認められた。

実施例２
［ブロッコリーからの自然免疫活性化物質の精製］
ブロッコリーの熱水抽出物から、カイコ筋収縮活性を指標に自然免疫活性化物質を精製した。表２は、各精製段階での比活性（Ｃ値）の結果である。

熱水抽出物に対してエタノール沈殿を行った結果、沈殿物に活性が回収されたことから（表２）、活性物質は多糖類であることが示唆された。続いてＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーを行った結果、ＮａＣｌのグラジエントにより均一な糖質のピークが溶出し、この画分で比活性の上昇が認められた（表２）。

次に、この画分について用量反応性を検討した。その結果を図１に示す。図１中、縦軸は比活性（Ｃ値）を示し、横軸はＤＥＡＥ−セルロース吸着画分（μｇ）を示す。
Ｃ値（Contraction value）が０．１５を示す活性を１ｕｎｉｔと定義すると、６７ｕｎｉｔ／ｍｇの比活性を示した（図１）。本実施例ではこの画分を精製画分としてさらに分析を試みた。

実施例３
[ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の構造解析]
得られたＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の単糖組成を明らかにするため、トリフルオロ酢酸加水分解物をＨＰＬＣで分析した。分析結果を図２に示す。図２ａは標準サンプル、図２ｂはＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分に対するＨＰＬＣ分析の結果である。
図２中、１はＤ−グルクロン酸、２はＤ−ガラクツロン酸、３はＤ−ガラクトース、４はＤ−マンノース、５はＤ−グルコース、６はＬ−アラビノース、７はＤ−リボース、８はＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、９はＤ−キシロース、１０はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、１１はＬ−フコース、１２はＬ−ラムノース、及び１３はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを示す。

図２の結果、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、アラビノース（Ａｒａ）及びラムノース（Ｒｈａ）が検出され、そのモル比は、ＧａｌＡ：Ｇａｌ：Ｇｌｃ：Ａｒａ：Ｒｈａ＝１２．４：４．９：１．０：７．３：１．２であった。

次に、ＮＭＲ分析による糖鎖構造の解析を試みた。結果を図３に示す。
１ＤＮＭＲ分析の結果、タンパク質及び脂質に特徴的なシグナルは検出されず、糖質に特徴的なパターンを示した（図３）。

次に、各種２ＤＮＭＲ分析を行い、検出されたシグナルの帰属を行い、表３にまとめた。

主要構成成分であるＧａｌＡ（ガラクツロン酸）のシグナル強度は強く、α−１，４結合のポリガラクツロン酸鎖を形成していると決定できた。２番目に含量の高いＡｒａ（アラビノース）に関しては一部のシグナルを帰属することができ、そのケミカルシフト値からα−１，５結合していることが示唆されたが、単糖組成分析で検出された、その他のマイナーな糖残基のシグナル強度は弱く、全シグナルの帰属はできなかった。

そこで、メチル化分析による糖結合位置の決定を試みた。結果を図４に示す。図４中、１はＴ−Ａｒａｆ、２はＴ−Ｒｈａｐ、３は３−Ａｒａｆ、４は５−Ａｒａｆ、５はＴ−Ｇｌｃｐ、６はＴ−Ｇａｌｐ、７は３，５−Ａｒａｆ、８は２，４−Ｒｈａｐ、９は４−ＧａｌｐＡ、１０は４−Ｇａｌｐ、１１は３−Ｇａｌｐ、１２は６−Ｇａｌｐ、及び１３は３，６−Ｇａｌｐを示す。

図４の結果、１３種の部分メチル化アルジトールアセテートのピークを検出した。各ピークの保持時間とＭＳフラグメンテーションパターンから糖種と結合位置を決定し、表４にまとめた。
表４中、例えば、「Ｔ−Ａｒａｆ」は非還元末端アラビノース、「３−Ｇａｌｐ」は、３−結合ガラクトース、「３，５−Ａｒａｆ」は３，５−結合アラビノースを示す。

メチル化分析により、主要構成成分として１→４結合したガラクツロン酸（ＧａｌＡ）及び１→５結合したアラビノース（Ａｒａ）が検出され、ＮＭＲ分析での結果を支持した。また、単糖組成分析で検出された、その他のマイナーな糖残基についても結合位置を決定することができた。

実施例４
［自然免疫活性化能に必要なＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の構造］
自然免疫活性化能に必要なＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の構造を決定するため、主要構成成分であるアラビノース及びガラクツロン酸を選択的に分解した構造修飾物を調製し、カイコ筋収縮活性測定により自然免疫活性化能を評価した。その結果を表５に示す。

まず、シュウ酸加水分解によるアラビノース（Ａｒａ）の選択的分解、除去を試みた。単糖組成分析の結果、Ａｒａ含量が顕著に減少した（表５）。

また、上記シュウ酸加水分解物を７０℃で重水（Ｄ_２Ｏ）に溶解し、ＮＭＲ分析を行った。結果を図５に示す。

１ＤＮＭＲ分析の結果、アラビノースのシグナルが消失した（図５）。また、このサンプル（シュウ酸加水分解物）についてカイコ筋収縮活性測定を行った結果、自然免疫活性化能は失われなかった（表５）。

次に、ペクチナーゼ処理によりポリガラクツロン酸の分解を試みた。分解産物をBio-gel P4ゲルろ過カラムクロマトグラフィーで分画した結果を図６に示す。図６中の１〜４は、表５中の「Ｐｅａｋ１」〜「Ｐｅａｋ４」とそれぞれ対応している。

図６の結果、４つのピークが検出された。これら各ピークについて単糖組成分析を行った結果（表５）、Ｐｅａｋ１及び２からはＧａｌＡ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、Ａｒａ、Ｒｈａ及びＸｙｌが検出された。Ｐｅａｋ３からはＧａｌＡが検出されず、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、Ａｒａ、Ｒｈａ及びＸｙｌが検出された。Ｐｅａｋ４からはペクチナーゼ処理により遊離したＧａｌＡモノマーが検出された。各ピークについてカイコ筋収縮活性測定を行った結果（表５）、低分子化に伴って自然免疫活性化能は低下し、Ｐｅａｋ３及びＰｅａｋ４からは活性は検出されなかった。

＜実施例の総括と考察＞
カイコ筋収縮活性測定法を用いて、１７種の野菜の熱水抽出物について自然免疫活性化物質の探索を試みた結果、ブロッコリーに高い活性が認められた。そして、本実施例によって、ブロッコリーから自然免疫活性化能をもつＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分を精製した。
ＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の構造解析を試みた結果、ＧａｌＡ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、Ａｒａ及びＲｈａを含む酸性多糖類であり、主要な構造としてα−１，４結合のポリガラクツロン酸鎖を主鎖として、α−１，５結合したアラビナン鎖を側鎖としてもつ構造であることが示唆された。

上記の結果からＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分は植物細胞壁成分であるペクチンの一種であると考えられたが、ＮＭＲ分析の結果、一般的にペクチンに含まれているＧａｌＡメチルエステルのシグナルは殆ど検出されず、これまでに報告のあるペクチンとは異なる構造であることが示唆された。

自然免疫活性化能に必要なＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分の構造を決定するため、主要構成成分であるアラビノース及びガラクツロン酸を選択的に分解した結果、ペクチナーゼ処理によりポリガラクツロン酸鎖を分解することで、低分子化に伴って自然免疫活性化能が低下、消失した。

実施例の結果から予想される、本発明の多糖類の構造及び該多糖類の処理物の構造の一例に関する模式図を図７に示す。本発明の多糖類の構造は、図７の模式図に示される構造には限定されない。

これまでに、薬草等の様々な植物から抽出したペクチンが免疫活性化能をもつことが多数報告されている。一方、免疫活性と構造との関係に言及した報告は少なく、ペクチンに含まれるガラクタン構造が活性に必要であるという報告がある。
しかしながら、本実施例で精製したＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分は、ポリガラクツロン酸構造が活性に必要であったことから、これまでに報告のあるペクチンの免疫活性化能とは異なる作用機序をもつことが示唆された。

本発明によれば、自然免疫機能を活性化する効果が高い多糖類が得られるので、各種の飲食品、錠剤、顆粒、チュアブルタブレット等に、広く利用することができる。また、本発明の多糖類は、生体内で自然免疫機能活性化作用を有する機能性食品、特定保健用食品、免疫機能低下が問題となる病人食や介護食等の素材として特に好適に利用することができる。更に、医薬品の原材料としても広く利用することが可能である。

Claims

ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、アラビノース（Ａｒａ）及びラムノース（Ｒｈａ）を、モル比で、ＧａｌＡ：Ｇａｌ：Ｇｌｃ：Ａｒａ：Ｒｈａ＝１２．４：４．９：１．０：７．３：１．２で含有し、
α−１，４結合のポリガラクツロン酸鎖を主鎖とし、α−１，５結合のポリアラビノース鎖を側鎖とする構造を有する多糖類であることを特徴とする自然免疫活性化作用を有する多糖類。
ブロッコリーの熱水抽出物に対してエタノール沈殿を行って得られる沈殿物のＤＥＡＥ−セルロースカラム吸着画分である請求項１に記載の自然免疫活性化作用を有する多糖類。
請求項１又は請求項２に記載の自然免疫活性化作用を有する多糖類であることを特徴とする自然免疫活性化剤。