JP6778848B2 - Anti-cancer agent - Google Patents
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Description
本発明は、新規抗がん剤、及び抗がん剤のスクリーニング方法に関し、より詳細には、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤、及びMICAL3過剰発現細胞系を用いたスフィア形成能の阻害等を指標とするスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a novel anticancer agent and a screening method for an anticancer agent, and more particularly, an anticancer agent characterized by inhibiting sphere formation of cancer stem cells, and a MICAL3 overexpressing cell system. The present invention relates to a screening method using the inhibition of sphere forming ability as an index.
増殖因子のシグナル伝達は、生命現象の様々な局面で重要な役割を果たすのみならず、がんをはじめとする疾病の発症と進展においても重要な役割を担っていることはよく知られている。近年、がん幹細胞説が唱えられ、乳がんなど固形がんにおいても、がん幹細胞様の細胞からがん組織が構築されていると考えられるようになった。そして、ヒトES細胞やiPS細胞ならびに正常の神経幹細胞などの組織幹細胞の増殖や維持のみならず、がん幹細胞の維持にも増殖因子が重要であることがわかってきた。 It is well known that growth factor signaling plays an important role not only in various aspects of life phenomena, but also in the onset and progression of diseases such as cancer. .. In recent years, the cancer stem cell theory has been advocated, and it has come to be considered that cancer tissue is constructed from cancer stem cell-like cells even in solid cancers such as breast cancer. It has become clear that growth factors are important not only for the proliferation and maintenance of tissue stem cells such as human ES cells, iPS cells and normal neural stem cells, but also for the maintenance of cancer stem cells.
正常の組織幹細胞を解析する際、培養皿中で幹細胞の性質を保ったまま培養できる手法として、スフィア培養が広く用いられている（非特許文献１）。通常、神経組織や乳腺組織などの上皮組織の細胞を一定以下の密度にすると、ほとんどの分化した細胞は死滅するが、幹細胞とその娘細胞である一部の前駆細胞は生きながらえる。これを増殖因子の入った培地で培養すると、一個の幹細胞から分裂した細胞塊「スフィア」を形成してくる。通常、幹細胞の培養は、増殖因子として上皮成長因子(EGF)と塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)に、いくつかのホルモンを加えたカクテルを添加して行われている。例えば乳がん幹細胞によるスフィア（マンモスフィア）の形成・培養のためには、EGF、bFGF、及びB27（登録商標）サプリメントを含む培地が適しているとして用いられている（非特許文献２及び３）。
When analyzing normal tissue stem cells, sphere culture is widely used as a method for culturing while maintaining the properties of stem cells in a culture dish (Non-Patent Document 1). Normally, when cells in epithelial tissues such as nerve tissue and mammary tissue are reduced to a certain density or less, most differentiated cells die, but stem cells and some progenitor cells, which are daughter cells thereof, survive. When this is cultured in a medium containing a growth factor, a cell division "sphere" is formed from a single stem cell. Usually, stem cells are cultured by adding a cocktail of epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) as growth factors to some hormones. For example, for the formation and culture of spheres (mammoth spheres) by breast cancer stem cells, a medium containing EGF, bFGF, and B27 (registered trademark) supplement is used as being suitable (Non-Patent
本発明者等のグループは、ヒト乳がんの臨床検体由来のがん細胞を用いて、増殖因子のカクテルではなく、単独の増殖因子によって、スフィア培養可能な系を確立している。この方法は、EGF受容体(EGFR)/HER/ErbBファミリー分子のうち、HER3/ErbB3に結合する増殖因子であるヘレグリン（Heregulin：HRG）を用い、これ単独でスフィア培養ができるというものである。そして、がん幹細胞様の性質をもつ細胞のみが、スフィアを形成するということが示された（非特許文献４）。 The group of the present inventors has established a system in which spheres can be cultured using cancer cells derived from clinical specimens of human breast cancer, not by a cocktail of growth factors but by a single growth factor. In this method, among the EGF receptor (EGFR) / HER / ErbB family molecules, heregulin (HRG), which is a growth factor that binds to HER3 / ErbB3, is used, and sphere culture can be performed by itself. Then, it was shown that only cells having cancer stem cell-like properties form spheres (Non-Patent Document 4).
一方、がんの治療において、近年では分子標的治療という考え方が広がってきている。例えば、成人女性に多くみられる乳がんは、現在では細胞表面の受容体の有無等に基づいて、いくつかのサブタイプに分類され、それによって治療の選択も異なるようになってきている。このうち、HER2（Human epidermal growth factor receptor 2）陽性の乳がんは、抗HER2抗体であるトラスツズマブ等の投与により、良好な治療効果があることが報告されている。従って、乳がんの治療には、その患者の乳がんのサブタイプによって、外科的手術、放射線治療の他に、ホルモン療法、抗がん剤療法、トラスツズマブ等の抗HER2療法等が選択されている。 On the other hand, in the treatment of cancer, the idea of molecular-targeted therapy has spread in recent years. For example, breast cancer, which is often seen in adult women, is now classified into several subtypes based on the presence or absence of receptors on the cell surface, and treatment options are different accordingly. Of these, it has been reported that HER2- (Human epidermal growth factor receptor 2) -positive breast cancer has a good therapeutic effect by administration of trastuzumab, which is an anti-HER2 antibody. Therefore, for the treatment of breast cancer, hormone therapy, anticancer drug therapy, anti-HER2 therapy such as trastuzumab, etc. are selected in addition to surgical operation and radiotherapy, depending on the subtype of breast cancer of the patient.
医学の発展により、早期に発見された乳がんでは生存率は非常に高くなっているが、乳がんはリンパ節等に転移しやすく、また再発の可能性もある。 Due to the development of medicine, the survival rate of breast cancer detected early is very high, but breast cancer easily metastasizes to lymph nodes and the like, and there is a possibility of recurrence.
また、乳がんのサブタイプによって、その増殖能力に違いがあるため、またがん幹細胞自体は増殖能が低いため、増殖能の高い細胞を標的とする療法では効果が十分でない場合があり、その結果再発につながる可能性が高くなる。 In addition, because different breast cancer subtypes have different proliferative abilities, and because cancer stem cells themselves have low proliferative potential, therapy targeting highly proliferative cells may not be effective, resulting in It is more likely to lead to recurrence.
従って、初発がんの治療だけでなく、がんの転移・再発を防ぎ、根治するためには、がん幹細胞を標的とし、がん幹細胞を死滅させる治療を行わなければならない。しかし、このような治療のために有効な治療薬は、現時点ではまだ得られていない。 Therefore, in order to prevent and cure the metastasis / recurrence of cancer as well as the treatment of the initial cancer, it is necessary to perform the treatment targeting the cancer stem cells and killing the cancer stem cells. However, no effective therapeutic agent for such treatment has been obtained at this time.
上記した通り、本発明者等は、乳がん培養細胞系であるMCF7細胞を使用して、ヘレグリンの刺激によってスフィア形成させる系を確立している。この系において、重要な転写因子としてNFκBに着目し、それによって発現が制御されると考えられるタンパク質を網羅的に解析した。 As described above, the present inventors have established a system for forming spheres by stimulating heregrine using MCF7 cells, which are breast cancer cultured cell lines. In this system, we focused on NFκB as an important transcription factor, and comprehensively analyzed proteins whose expression is thought to be regulated by it.
その結果、これまでがん幹細胞との関連については報告されていないMICAL3タンパク質の発現が上昇することを確認した。この結果に基づき、本発明者等は、神経細胞においてセマフォリン3Aをリガンドとするパスウェイにおける役割が報告されているMICAL3タンパク質のがん幹細胞における機能を詳細に解析した。 As a result, it was confirmed that the expression of MICAL3 protein, which has not been reported to be associated with cancer stem cells, is increased. Based on this result, the present inventors analyzed in detail the function of MICAL3 protein in cancer stem cells, which has been reported to play a role in a pathway using semaphorin 3A as a ligand in nerve cells.
その結果、驚くべきことに、乳がん幹細胞において、セマフォリン3Aの刺激によってMICAL3の活性が上昇し、かつがん幹細胞によるスフィア形成が促進されることを見出した。同時に、MICAL3の発現、並びにその発現上昇に基づいて生じる細胞内の変化を遮断することで、スフィア形成を抑制し、結果的に抗がん効果が得られることを見出した。更に、スフィア形成能が低い細胞系においても、そのスフィア形成能を高めることで、より抗がん剤の候補薬剤の検出に適したスクリーニング系を確立することができた。 As a result, it was surprisingly found that in breast cancer stem cells, stimulation of semaphorin 3A increases the activity of MICAL3 and promotes sphere formation by cancer stem cells. At the same time, it was found that by blocking the expression of MICAL3 and the intracellular changes caused by the increase in its expression, sphere formation is suppressed, and as a result, an anticancer effect can be obtained. Furthermore, even in cell lines with low sphere-forming ability, it was possible to establish a screening system more suitable for detecting candidate drugs for anticancer agents by enhancing the sphere-forming ability.
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤であって、MICAL3タンパク質の発現、CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化、及び／又はNumbタンパク質の発現を阻害することを特徴とする、抗がん剤。
２．MICAL3タンパク質又はNumbタンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はMICAL3タンパク質又はNumbタンパク質に対する抗体である、上記１記載の抗がん剤。
３．セマフォリン3A刺激、またはMICAL3の過剰発現によってがん幹細胞のスフィア形成能を高める方法。
４．がん幹細胞にMICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAを導入することによって得られる、MICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片を過剰発現する、スフィア形成能の上昇した単離されたがん幹細胞。
５．抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞のスフィア形成能の低下の有無を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
６．抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞におけるCRMP2の二量体形成及び／又はリン酸化の減少を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法。
７．MICAL3タンパク質の発現の上昇がセマフォリン3A刺激、又はMICAL3タンパク質もしくはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAの導入によるものである、上記５又は６記載のスクリーニング方法。
８．更にヒトがん細胞を移植した異種移植モデルにおける造腫瘍能の候補薬剤による阻害を確認することを含む、上記５〜７のいずれか記載のスクリーニング方法。
That is, the present invention provides the following.
1. 1. An anticancer drug characterized by inhibiting sphere formation in cancer stem cells, which inhibits the expression of MICAL3 protein, dimerization or phosphorylation of CRMP2 protein, and / or the expression of Numb protein. Characteristic anti-cancer drug.
2. The anticancer agent according to 1 above, which is an antibody against siRNA or shRNA that inhibits the expression of MICAL3 protein or Numb protein, or MICAL3 protein or Numb protein.
3. 3. A method of enhancing the sphere-forming ability of cancer stem cells by semaphorin 3A stimulation or overexpression of MICAL3.
4. Isolated with increased sphere-forming ability, overexpressing the MICAL3 protein or a fragment having monooxygenase activity thereof, obtained by introducing DNA encoding the MICAL3 protein or a fragment having monooxygenase activity thereof into cancer stem cells. Cancer stem cells.
5. It is a screening method for anticancer drugs.
Increased expression of MICAL3 protein in isolated cancer stem cells,
Contact cells with increased expression of MICAL3 protein with candidate drugs
The screening method comprising detecting the presence or absence of a decrease in the sphere-forming ability of the cell as compared to the absence of the candidate drug.
6. It is a screening method for anticancer drugs.
Increased expression of MICAL3 protein in isolated cancer stem cells,
Contact cells with increased expression of MICAL3 protein with candidate drugs
The screening method comprising detecting a decrease in CRMP2 dimer formation and / or phosphorylation in the cells as compared to the absence of a candidate agent.
7. 5. The screening method according to 5 or 6 above, wherein the increase in the expression of the MICAL3 protein is due to semaphorin 3A stimulation or the introduction of DNA encoding the MICAL3 protein or a fragment having monooxygenase activity thereof.
8. The screening method according to any one of 5 to 7 above, which further comprises confirming inhibition of tumorigenicity by a candidate drug in a xenograft model in which human cancer cells are transplanted.
本発明により、増殖能の低いがん幹細胞のスフィア形成を阻害する新たな抗がん剤の提供が可能となった。また、本発明のスクリーニング方法を用いれば、同様のメカニズムで抗がん作用を有する更なる薬剤の提供も可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it has become possible to provide a new anticancer agent that inhibits sphere formation of cancer stem cells having low proliferative ability. Further, by using the screening method of the present invention, it is possible to provide a further drug having an anticancer effect by the same mechanism.
ヘレグリン（HRG）は、HER3/ErbB3に結合する増殖因子である。増殖因子が結合すると受容体がホモ二量体もしくはヘテロ二量体を形成し、細胞内チロシンキナーゼが活性化してシグナル伝達を行う。HER2/HER3のヘテロ二量体は、PI-3 キナーゼ-Aktパスウエイを活性化することが知られており、AktによってNFκBが活性化される（図１Ａ）。本発明者等は、HRGは、PI-3 キナーゼ-Akt-NFκBパスウェイの活性化を介して、スフェア形成を誘導することを見出している。 Helegrine (HRG) is a growth factor that binds to HER3 / ErbB3. When growth factors bind, the receptor forms a homodimer or heterodimer, and intracellular tyrosine kinase is activated to signal transduction. The HER2 / HER3 heterodimer is known to activate the PI-3 kinase-Akt pathway, and Akt activates NFκB (Fig. 1A). The present inventors have found that HRG induces sphere formation through activation of the PI-3 kinase-Akt-NFκB pathway.
増殖因子により制御される遺伝子発現は、時間経過にともない、様々な発現パターンを示す。そこで本発明者等は、HRG刺激により様々な発現パターンをとりうる遺伝子を網羅的に同定するため、乳がん細胞をHRG刺激した後、１時間おきに16時間までRNAを取り出し、DNAマイクロアレイ解析を行った。同時に、PI-3 キナーゼ阻害剤LY294002あるいはNFκB阻害剤DHMEQ（デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン）で処理した後にHRG刺激を行った細胞からもRNAを取り出した。得られたデータから、HRG刺激により発現上昇するが、阻害剤処理によってこの発現上昇が抑制される遺伝子群を抽出した（図１Ｂ）。 Gene expression controlled by growth factors exhibits various expression patterns over time. Therefore, in order to comprehensively identify genes that can have various expression patterns by HRG stimulation, the present inventors took out RNA every hour for up to 16 hours after HRG stimulation of breast cancer cells, and performed DNA microarray analysis. It was. At the same time, RNA was also removed from cells subjected to HRG stimulation after treatment with the PI-3 kinase inhibitor LY294002 or the NFκB inhibitor DHMEQ (dehydroxymethylepoxyquinomycin). From the obtained data, a group of genes whose expression was increased by HRG stimulation but whose expression was suppressed by inhibitor treatment was extracted (Fig. 1B).
解析の結果、HRG刺激によって発現の上昇した遺伝子は、5時間までに発現が上昇した252遺伝子、及び0-16時間を通して発現が上昇した592遺伝子であり、合わせて635遺伝子であった。 As a result of the analysis, the genes whose expression was increased by HRG stimulation were 252 genes whose expression was increased by 5 hours and 592 genes whose expression was increased throughout 0-16 hours, for a total of 635 genes.
上記の遺伝子のうち、本発明者等は、MICAL3（microtubule associated monoxygenase, calponin and LIM domain containing 3）に注目した。MICAL3は、NCBI参照配列NP_056056.2を有するアミノ酸2002個からなるタンパク質であり、N-末端にモノオキシゲナーゼドメイン（NCBI参照配列NP_056056.2における2〜494アミノ酸）を有するマルチドメインのシグナル伝達タンパク質として知られ、また形質膜への小胞融合に関与するいくつかのタンパク質と相互作用すること、更に細胞骨格の解離への関与等も知られている。 Among the above genes, the present inventors paid attention to MICAL3 (microtubule associated monoxygenase, calponin and LIM domain containing 3). MICAL3 is a protein consisting of 2002 amino acids having NCBI reference sequence NP_056056.2, and is known as a multidomain signaling protein having a monooxygenase domain (2-494 amino acids in NCBI reference sequence NP_056056.2) at the N-terminus. It is also known that it interacts with some proteins involved in vesicle fusion to the plasma membrane, and is also involved in the dissociation of the cytoskeleton.
主に神経細胞において、セマフォリン3Aの刺激により、MICAL1のN末のモノオキシゲナーゼが活性化し、それによってCRMP2（コラプシン反応媒介タンパク質（collapsin response mediator protein 2））が二量体化することが報告されている（Science Signaling, vo. 4, ra26. doi: 10.1126/scisignal.2001127）。MICAL3のC末には、Rabタンパク質が結合し、小胞体を介した輸送に関わっている。 It has been reported that stimulation of semaphorin 3A activates the N-terminal monooxygenase of MICAL1 mainly in nerve cells, thereby dimerizing CRMP2 (collapsin response mediator protein 2). (Science Signaling, vo. 4, ra26. Doi: 10.1126 / scisignal.2001127). The Rab protein binds to the C-terminal of MICAL3 and is involved in endoplasmic reticulum-mediated transport.
一方、セマフォリン3Aは、神経軸索の反発性因子であり、神経軸索末端に存在する受容体に結合すると、軸索が反発してセマフォリン濃度の低い方向へ軸索を導くことが知られている。セマフォリンシグナリングの細胞生物学的な機能は細胞骨格の再構成と細胞接着の調節であると考えられてきた。神経系においては神経回路形成や軸索伸長制御における役割が知られている。 On the other hand, semaphorin 3A is a repulsive factor of nerve axons, and it is known that when it binds to a receptor present at the nerve axon terminal, the axons repel and guide the axons in the direction of low semaphorin concentration. Has been done. The cytobiological function of semaphorin signaling has been thought to be the rearrangement of the cell skeleton and the regulation of cell adhesion. In the nervous system, its role in neural circuit formation and axon extension control is known.
本発明は、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする抗がん剤であって、MICAL3タンパク質の発現、CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化、及び／又はNumbタンパク質の発現を阻害することを特徴とする、抗がん剤を提供する。がん幹細胞としては、乳がん幹細胞、肝がん幹細胞、大腸がん幹細胞、肺がん幹細胞等が挙げられ、特に限定するものではない。本発明において好適ながん幹細胞の一態様は、乳がん幹細胞である。 The present invention is an anticancer agent characterized by inhibiting sphere formation in cancer stem cells, which exhibits MICAL3 protein expression, CRMP2 protein dimerization or phosphorylation, and / or Numb protein expression. Provided is an anticancer drug characterized by inhibiting. Examples of cancer stem cells include breast cancer stem cells, liver cancer stem cells, colon cancer stem cells, lung cancer stem cells, and the like, and are not particularly limited. One aspect of cancer stem cells suitable in the present invention is breast cancer stem cells.
本発明の抗がん剤は、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することを特徴とする。従って、増殖能の高い細胞を標的とする抗がん剤と異なるメカニズムで作用するため、従来の抗がん剤では効果が十分でないがんに対して効果を発揮する。従って、本発明の抗がん剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの抗がん剤及び抗がん治療と組み合わせて使用することができる。 The anticancer agent of the present invention is characterized by inhibiting sphere formation of cancer stem cells. Therefore, since it acts by a mechanism different from that of anticancer drugs that target cells with high proliferative ability, it is effective against cancers for which conventional anticancer drugs are not sufficiently effective. Therefore, the anticancer agent of the present invention can be used alone, but can be used in combination with an anticancer agent and an anticancer treatment having different mechanisms.
従って、本発明の抗がん剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の抗がん剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば乳がん治療の場合には、患部若しくは患部の近辺に注射又は注入により投与することが好ましい。医薬組成物には、本発明の抗がん剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の抗がん剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜1mg/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。 Therefore, the anti-cancer agent of the present invention can be in the form of a pharmaceutical composition alone or in combination with other active ingredients. The anticancer agent or pharmaceutical composition of the present invention can be locally administered or systemically administered, and the administration form is not limited. For example, in the case of breast cancer treatment, injection or injection is performed in or near the affected area. It is preferable to administer by. In addition to the anticancer agent and other active ingredients of the present invention, the pharmaceutical composition contains carriers, excipients, buffers, stabilizers and the like commonly used in the art, depending on the dosage form. be able to. The dose of the anticancer agent of the present invention varies depending on the body weight, age, severity of the disease, etc. of the patient, and is not particularly limited, but is, for example, in the range of 0.0001 to 1 mg / kg body weight. It is possible to administer once to several times a day, every two days, every three days, every week, every two weeks, every month, every two months, every three months.
尚、本発明の抗がん剤は、生体内にスフィア形成を阻害するものであるが、例えばin vitroにおいて人為的に生じさせるスフィア形成を阻害することもできる。スフィア形成を人為的に生じさせるものとして、当業者に知られているスフィア培養培地(SCM)中での培養、ヘレグリンでの刺激、及び本発明者等が見出したセマフォリン3Aでの刺激等が挙げられるが、本発明の抗がん剤はこれらの培養又は刺激によって生じたスフィア形成を有意に阻害することができる。 The anticancer agent of the present invention inhibits sphere formation in vivo, but it can also inhibit sphere formation artificially generated in vitro, for example. As those that artificially cause sphere formation, culture in a sphere culture medium (SCM) known to those skilled in the art, stimulation with heregulin, stimulation with semaphorin 3A found by the present inventors, etc. As mentioned above, the anticancer agent of the present invention can significantly inhibit the sphere formation caused by these cultures or stimuli.
本発明者等が見出した新たな抗がん剤は、例えばMICAL3タンパク質又はNumbタンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はMICAL3タンパク質又はNumbタンパク質に対する抗体である。 The new anticancer agents found by the present inventors are, for example, siRNA or shRNA that inhibits the expression of MICAL3 protein or Numb protein, or an antibody against MICAL3 protein or Numb protein.
上記の通り、MICAL3は、NCBI参照配列NP_056056.2を有するアミノ酸2002個からなるタンパク質であり、mRNA配列はNCBI参照配列NM_015241を有する（9471bp）。また、Numbタンパク質は、NCBI参照配列NP_001005743.1を有する651アミノ酸の配列であり、mRNAはNCBI参照配列NM_001005743.1を有する（3647bp）。当業者であれば、容易に入手できるこれらの配列情報に基づいて、これらのタンパク質の発現を阻害するsiRNA及びshRNA、及び抗体を、容易に合成することができる。あるいはまた、特定の標的タンパク質の発現を抑制又は阻害するsiRNA及びshRNA、及び抗体は、例えばDharmacon、Invitrogen等の供給業者から市販品を入手することもできる。 As described above, MICAL3 is a protein consisting of 2002 amino acids having NCBI reference sequence NP_056056.2, and the mRNA sequence has NCBI reference sequence NM_015241 (9471bp). In addition, the Numb protein is a sequence of 651 amino acids having the NCBI reference sequence NP_001005743.1, and the mRNA has the NCBI reference sequence NM_001005743.1 (3647 bp). Those skilled in the art can easily synthesize siRNAs and shRNAs that inhibit the expression of these proteins, and antibodies based on these readily available sequence information. Alternatively, siRNAs and shRNAs that suppress or inhibit the expression of specific target proteins, and antibodies can be commercially available from suppliers such as Dharmacon and Invitrogen.
siRNA及びshRNAは、RNA干渉と呼ばれるメカニズムにより、特定のmRNAを標的として、その翻訳を阻止することが知られている。標的配列の塩基数は特に限定されず、15〜500塩基の範囲で選択され得る。siRNAは、短鎖二本鎖RNA分子であり、shRNAは、生体内でダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成することができるヘアピン型RNAである。siRNA及びshRNAは、例えばリポフェクタミン等のトランスフェクション試薬と共に、in vitro又はin vivoで細胞内に導入することができる。あるいはまた、siRNA及びshRNAは、細胞内でこれらを生成することができるようにDNAの形態でベクターに組み込んで細胞内に導入することができる。 siRNAs and shRNAs are known to target specific mRNAs and block their translation by a mechanism called RNA interference. The number of bases in the target sequence is not particularly limited and can be selected in the range of 15 to 500 bases. SiRNA is a short double-stranded RNA molecule, and shRNA is a hairpin-type RNA that can be processed by a dicer in vivo to produce siRNA. siRNA and shRNA can be introduced into cells in vitro or in vivo together with transfection reagents such as lipofectamine. Alternatively, siRNA and shRNA can be incorporated into a vector in the form of DNA and introduced into the cell so that they can be produced intracellularly.
当業者であれば、siRNA及びshRNAの設計及び選択は、標的配列の情報等に基づいて容易に得ることができる。従って、特に限定するものではないが、例えば本発明者等が実施例において使用したものとして、MICAL3に対するsiRNAとして、配列番号１及び／又は２に示すヌクレオチド配列を標的として設計されるsiRNA、shRNAとして配列番号３〜１０に示すヌクレオチド配列を有するDNAの導入によって生体／細胞内で生じるshRNA、Numbに対するsiRNAとして配列番号１３〜１６に示すヌクレオチド配列を有するsiRNAを挙げることができる。 Those skilled in the art can easily obtain the design and selection of siRNA and shRNA based on the information of the target sequence and the like. Therefore, although not particularly limited, for example, as used in Examples by the present inventors, as siRNA for MICAL3, as siRNA and shRNA designed by targeting the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and / or 2. Examples of siRNAs for shRNA and Numb generated in vivo / cells by introduction of DNA having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 10 include siRNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13 to 16.
MICAL3タンパク質又はNumbタンパク質に対する抗体は、当分野において通常使用されている方法によって、MICAL3タンパク質又はNumbタンパク質を抗原として作製することができる。抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体とすることができるが、ヒト抗体であることがより好ましい。 Antibodies to MICAL3 protein or Numb protein can be prepared using MICAL3 protein or Numb protein as an antigen by a method commonly used in the art. The antibody can be a humanized antibody or a human antibody, but is more preferably a human antibody.
MICAL3の発現もしくは活性の阻害のためには、特にMICAL3のモノオキシゲナーゼドメインを標的とすることが好ましい。 For inhibition of MICAL3 expression or activity, it is particularly preferred to target the monooxygenase domain of MICAL3.
CRMP2は、NCBI参照配列NP_001184222を有するアミノ酸677個からなるタンパク質であり、mRNA配列はNCBI参照配列NM_001197293を有する（4655bp）。CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化を阻害する薬剤も、がん幹細胞のスフィア形成を阻害することができる本発明の抗がん剤である。CRMP2タンパク質の二量体化若しくはリン酸化は、例えばMICAL3に対するsiRNA及びshRNAによって阻害される。 CRMP2 is a protein consisting of 677 amino acids with NCBI reference sequence NP_001184222, and the mRNA sequence has NCBI reference sequence NM_001197293 (4655bp). An agent that inhibits the dimerization or phosphorylation of CRMP2 protein is also an anticancer agent of the present invention that can inhibit sphere formation of cancer stem cells. Dimerization or phosphorylation of CRMP2 protein is inhibited by, for example, siRNA and shRNA for MICAL3.
本発明は、新たな抗がん剤のスクリーニング方法をも提供するものであり、そのためには、スクリーニングのためにより適した細胞系を提供する必要がある。スフィア形成を指標として抗がん剤のスクリーニングを行うためには、使用する細胞系が適切なスフィア形成能を有する必要がある。しかしながら、例えば乳がん細胞系のMCF7細胞のスフィア形成能は他の細胞系と比較して低く、検出するためにはサンプル中の細胞数を多くしたり、インキュベーション時間を長くしたりする必要があった。従って本発明はまた、セマフォリン3A刺激、またはMICAL3の過剰発現によってがん幹細胞のスフィア形成能を高める方法を提供する。 The present invention also provides a new method for screening an anticancer agent, and for that purpose, it is necessary to provide a more suitable cell line for screening. In order to screen for anticancer drugs using sphere formation as an index, the cell line used must have an appropriate sphere formation ability. However, for example, the sphere-forming ability of MCF7 cells in breast cancer cell lines is lower than that in other cell lines, and it was necessary to increase the number of cells in the sample and lengthen the incubation time in order to detect them. .. Therefore, the present invention also provides a method for enhancing the sphere-forming ability of cancer stem cells by semaphorin 3A stimulation or overexpression of MICAL3.
本発明はまた、がん幹細胞にMICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAを導入することによって得られる、MICAL3タンパク質またはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片を過剰発現する、スフィア形成能の上昇した単離されたがん幹細胞を提供する。抗がん剤のスクリーニングのために適したがん幹細胞のスフィア形成能は、例えば5,000個/mlの濃度のがん幹細胞を例えば５〜７日間培養して、10〜100個／ml程度のスフィア（例えば直径が>50μm、>75μm、又は>100μmとして）の形成が観察されるものであれば良い。スフィア形成能は、培養開始時点で単一の細胞から形成されるスフィアを形成するものであり、スフィア形成を観察可能な系であれば上記の範囲に限定されるものではない。 The present invention also has the ability to overexpress the MICAL3 protein or a fragment having monooxygenase activity thereof, which is obtained by introducing DNA encoding a MICAL3 protein or a fragment having monooxygenase activity thereof into cancer stem cells. Provides elevated isolated cancer stem cells. The sphere-forming ability of cancer stem cells suitable for screening of anticancer agents is, for example, spheres of about 10 to 100 cells / ml after culturing cancer stem cells at a concentration of 5,000 cells / ml for, for example, 5 to 7 days. Any formation (eg, with a diameter of> 50 μm,> 75 μm, or> 100 μm) can be observed. The ability to form spheres forms spheres formed from a single cell at the start of culture, and is not limited to the above range as long as the system allows observable sphere formation.
本発明は更に、抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞のスフィア形成能の低下の有無を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法を提供する。
The present invention is further a method for screening an anticancer agent.
Increased expression of MICAL3 protein in isolated cancer stem cells,
Contact cells with increased expression of MICAL3 protein with candidate drugs
Provided are the above screening method, which comprises detecting the presence or absence of a decrease in the sphere forming ability of the cell as compared with the absence of the candidate drug.
本発明は更に、抗がん剤のスクリーニング方法であって、
単離されたがん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞におけるCRMP2の二量体形成及び／又はリン酸化の減少を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法を提供する。
The present invention is further a method for screening an anticancer agent.
Increased expression of MICAL3 protein in isolated cancer stem cells,
Contact cells with increased expression of MICAL3 protein with candidate drugs
Provided are the above screening methods comprising detecting a decrease in CRMP2 dimer formation and / or phosphorylation in the cells as compared to the absence of a candidate agent.
上記のスクリーニング方法において、MICAL3タンパク質の発現の上昇は、例えばスフィア培養培地(SCM)中での培養、ヘレグリンでの刺激、セマフォリン3A刺激、又はMICAL3タンパク質もしくはそのモノオキシゲナーゼ活性を有する断片をコードするDNAの導入によって実現することができる。 In the above screening method, elevated expression of MICAL3 protein encodes, for example, culture in sphere culture medium (SCM), stimulation with heregrine, stimulation with semaphorin 3A, or fragment with MICAL3 protein or monooxygenase activity thereof. This can be achieved by introducing DNA.
CRMP2の二量体の形成は、例えばCRMP2単量体のそれぞれに蛍光タンパク質を結合させ、それらの二量体形成の有無による蛍光の変動を検出することによって確認することができる。 The formation of CRMP2 dimers can be confirmed, for example, by binding fluorescent proteins to each of the CRMP2 monomers and detecting changes in fluorescence depending on the presence or absence of those dimers formation.
細胞のスフィア形成能の低下、及び細胞におけるCRMP2の二量体形成及び／又はリン酸化の減少は、細胞と薬剤との相対的な比率、培養時間、MICAL3タンパク質の発現の度合い等によって変動するものであり、またin vitroのスクリーニング方法においては完全な阻害である必要はない。従って、候補薬剤の非存在下と比較して10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50%以上の低下又は減少であれば良い。 The decrease in cell sphere formation ability and the decrease in CRMP2 dimer formation and / or phosphorylation in cells vary depending on the relative ratio between cells and drugs, culture time, degree of expression of MICAL3 protein, etc. And it does not have to be a complete inhibition in the in vitro screening method. Therefore, the decrease or decrease may be 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more as compared with the absence of the candidate drug.
上記のスクリーニング方法は更に、ヒトがん細胞を移植した異種移植モデルにおける造腫瘍能（tumor initiating ability）の候補薬剤による阻害を確認することを含むものとすることができる。スフィア形成は、がん幹細胞からの腫瘍形成の可能性を示唆するものであるが、必ずしもがん化するものではない。スフィア形成は、in vitroの実験系であるので、in vivoの異種移植モデルを用いた限界希釈アッセイ（limiting dilution assay (LDA)）を行って、造腫瘍能を測定することが重要である。従って、候補薬剤が抗がん剤として有効であることを確認する上で、異種移植モデルを用いた造腫瘍能の阻害の検出は有用である。 The above screening method can further include confirming inhibition of tumor initiating ability by a candidate drug in a xenograft model in which human cancer cells have been transplanted. Sphere formation suggests the possibility of tumor formation from cancer stem cells, but does not necessarily cause canceration. Since sphere formation is an in vitro experimental system, it is important to measure tumorigenicity by performing a limiting dilution assay (LDA) using an in vivo xenograft model. Therefore, detection of inhibition of tumorigenicity using a xenotransplantation model is useful in confirming that the candidate drug is effective as an anticancer drug.
異種移植モデルとしては、特に限定するものではないが、免疫不全状態のマウス、ラット、ハムスター、モルモット等を使用することができ、例えば免疫不全NSGマウス（チャールズリバー社）等を挙げることができる。特に限定するものではないが、例えば乳がん臨床検体由来異種移植(patient derived xenograft, PDX)モデルを好適に使用することができる。 The xenograft model is not particularly limited, but immunodeficient mice, rats, hamsters, guinea pigs and the like can be used, and examples thereof include immunodeficient NSG mice (Charles River). Although not particularly limited, for example, a breast cancer clinical specimen-derived xenograft (PDX) model can be preferably used.
本発明者等が想定する新たなパスウェイを、図１３に模式的に示す。セマフォリン3A（sema）がその受容体であるニューロピリン-1（NP-1）やプレキシンA（PlexA）に結合することで、MICAL3のモノオキシゲナーゼ活性が上昇し、MICAL3はそのC末端を介してPlexAに結合し、N末端のモノオキシゲナーゼドメインによるCRMP2の酸化反応を触媒し、それによってCRMP2の二量体化が生じる。CRMP2の二量体化及びリン酸化が、次いでNumbの発現上昇につながる。 A new pathway assumed by the present inventors is schematically shown in FIG. The binding of semaphorin 3A (sema) to its receptors, neuropyrin-1 (NP-1) and plexin A (PlexA), increases the monooxygenase activity of MICAL3, and MICAL3 passes through its C-terminus. It binds to PlexA and catalyzes the oxidation reaction of CRMP2 by the N-terminal monooxygenase domain, which results in the dimerization of CRMP2. CRMP2 dimerization and phosphorylation then lead to increased expression of Numb.
MICAL3は、モノオキシゲナーゼ活性を用いて、乳がん細胞のスフィア形成能並びに造腫瘍能を上昇させる。セマフォリン3A刺激により、MICAL3 モノオキシゲナーゼの活性が上昇し、このモノオキシゲナーゼ活性依存性にCRMP2が二量体化を起こし、またセマフォリン刺激により、MICAL3依存性に、非対称分裂に重要な役割を果たすNumbの発現が上昇する。 MICAL3 uses monooxygenase activity to increase sphere-forming and tumorigenicity of breast cancer cells. Semaphorin 3A stimulation increases the activity of MICAL3 monooxygenase, and CRMP2 dimerizes in this monooxygenase activity dependence, and semaphorin stimulation plays an important role in MICAL3 dependence and asymmetric division. Increased expression of Numb.
MICAL3は、セマフォリン3A刺激によらないスフィア形成や、造腫瘍能にも重要であることから、上記のメカニズムは、がん幹細胞の維持に普遍的に関与すると考えられる。 Since MICAL3 is also important for sphere formation not stimulated by semaphorin 3A and tumorigenicity, the above mechanism is considered to be universally involved in the maintenance of cancer stem cells.
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実施例１ HRG-PI3 キナーゼパスウエイの時系列解析］
乳がん細胞株MCF7細胞（American Type Culture Collection (ATCC)より入手）を、血清飢餓状態で１４時間培養後、ホスファチジルイノシトール (PI)3 キナーゼの阻害剤であるLY294002(1μM)、もしくはNFkBの阻害剤であるDHMEQ(1μg/ml)で処理して、または無処理のまま更に２時間培養した後、ヘレグリン（Heregulin(HRG)）(R&D Systems Inc.)(100ng/ml)にて細胞を刺激した。その後、１時間おきに１６時間後まで細胞を回収して全RNAを抽出し、DNAマイクロアレイ解析を行った（図１）。
[Example 1 Time-series analysis of HRG-PI3 kinase pathway]
Breast cancer cell line MCF7 cells (obtained from the American Type Culture Collection (ATCC)) were cultured in serum starvation for 14 hours and then with LY294002 (1 μM), an inhibitor of phosphatidylinositol (PI) 3 kinase, or an inhibitor of NFkB. The cells were stimulated with Heregulin (HRG) (R & D Systems Inc.) (100 ng / ml) after treatment with a DHMEQ (1 μg / ml) or culturing untreated for an additional 2 hours. Then, cells were collected every hour until 16 hours later, total RNA was extracted, and DNA microarray analysis was performed (Fig. 1).
RNAは、TRIzol試薬(Life technologies)を用いて回収した。全RNA 100ngをLow Input Quick Amp labeling kit(Agilent Technologies)を用いて、シアニン(Cyanine)3-CTPでラベルした。ハイブリダイゼーションは、遺伝子発現ハイブリダイゼーションキット（Gene Expression Hybridization Kit） (Agilent Technologies)を用い、4x180K Agilent 全ヒトゲノムオリゴDNAカスタムマイクロアレイ（Whole Human genome Oligo DNA Custom Microarray）(G4862A, Agilent Technologies)を用いて行った。
RNA was recovered using TRIzol reagent (Life technologies).
解析の結果、ヘレグリン刺激によって発現の上昇した遺伝子は、5時間までに発現が上昇した252遺伝子、及び0-16時間を通して発現が上昇した592遺伝子であり、合わせて635遺伝子であった（データは示さない）。これらの遺伝子のそれぞれについて、乳癌の病理学的悪性度（グレード）との相関、再発リスクとの相関等を解析した。 As a result of the analysis, the genes whose expression was increased by hellegrin stimulation were 252 genes whose expression was increased by 5 hours and 592 genes whose expression was increased throughout 0-16 hours, for a total of 635 genes (data: Not shown). For each of these genes, the correlation with the pathological grade of breast cancer, the correlation with the risk of recurrence, etc. were analyzed.
見出された遺伝子の中で、本発明者等はMICAL3に着目した。図２に示すように、ヘレグリン刺激によってMICAL3の発現量は上昇し、この発現上昇はLY294002及びDHMEQの双方によって阻害された。このことは、図１Ａに示すHRG-PI3 キナーゼパスウエイにおいて、MICAL3の発現が、PI3Kの下流にあり、かつNFkBよりも下流であることを示唆する。MICAL3の発現が高いがん患者において予後がより悪い傾向があることは、インターネットを介して利用できるPrognoscan（http://www.abren.net/PrognoScan/）においても確認することができた（データは示さない）。 Among the genes found, the present inventors focused on MICAL3. As shown in FIG. 2, the expression level of MICAL3 was increased by the stimulation of Helegrin, and this increased expression was inhibited by both LY294002 and DHMEQ. This suggests that the expression of MICAL3 is downstream of PI3K and downstream of NFkB in the HRG-PI3 kinase pathway shown in FIG. 1A. It was also confirmed by Prognoscan (http://www.abren.net/PrognoScan/) available via the Internet that the prognosis tends to be worse in cancer patients with high expression of MICAL3 (data). Is not shown).
［実施例２ セマフォリン3Aによるスフィア形成誘導］
MCF7細胞を5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまいた。この低濃度の細胞でできてきたスフィアは、単一の細胞由来である。細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にセマフォリン3A (R&D Systems Inc.)(200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、直径が>75μmのスフィアを計数した。
[Example 2 Induction of sphere formation by semaphorin 3A]
MCF7 cells were sprinkled on a 24-well ultralow attachment plate at a concentration of 5,000 cells / ml. The spheres made up of this low concentration of cells are from a single cell. Cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium / nutrient mixture F-12 (DMEM / F-12) supplemented with semaphorin 3A (R & D Systems Inc.) (200 ng / ml). After 4-7 days, spheres with a diameter of> 75 μm were counted.
その結果、図３に示すように、MCF7細胞にセマフォリン３Aを添加すると、スフィアの形成が促進された。グラフの縦軸は、播種した細胞数5,000に対して、形成したスフィアの数をパーセンテージで示したスフィア形成効率である。 As a result, as shown in FIG. 3, addition of semaphorin 3A to MCF7 cells promoted sphere formation. The vertical axis of the graph is the sphere formation efficiency showing the number of formed spheres as a percentage with respect to the number of seeded cells of 5,000.
［実施例３ MICAL3ノックダウンによるスフィア形成阻害］
MCF7細胞を5x105個/ウェルの濃度で6-ウェルプレートにまいた。これに、MICAL3 siRNAとして、以下の配列：
配列番号１：CCAAGAGAAUGAACGGAUA
及び
配列番号２：CCGUACAGCCAUCGACUUA
を標的とする二本鎖RNA(Dharmacon GE Healthcare, Cat.No., LU-024432-00-0002, ON-TARGETplus Human MICAL3 (57553) siRNA J-024432-09 及び J-024432-11)を混合して用い、LipofectamineTM RNAi MAXトランスフェクション試薬(Life technologies)と共にウェルに添加して24時間培養した。尚、対照siRNAとして、Cat.No., D-001810-01-05, ON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1を用いた。
[Example 3 Inhibition of sphere formation by knockdown of MICAL3]
MCF7 cells were sprinkled on a 6-well plate at a concentration of 5x10 5 cells / well. In addition, as MICAL3 siRNA, the following sequence:
SEQ ID NO: 1: CCAAGAGAAUGAACGGAUA
And SEQ ID NO: 2: CCGUACAGCCAUCGACUUA
Double-stranded RNA (Dharmacon GE Healthcare, Cat.No., LU-024432-00-0002, ON-TARGETplus Human MICAL3 (57553) siRNA J-024432-09 and J-024432-11) targeting Was added to wells with Lipofectamine TM RNAi MAX transfection reagent (Life technologies) and cultured for 24 hours. As a control siRNA, Cat.No., D-001810-01-05, ON-TARGETplus
図４Ａ上図は、定量リアルタイム(qRT)-PCRにてMICAL3のmRNAの量を測定して、MICAL3のノックダウンを確認した結果を示す。細胞から全RNAをTRIzol（登録商標）試薬（Life technologies）で抽出し、高性能cDNA逆転写キット（High Capacity cDNA Reverse Transcription kit）(Applied Biosystemes)を用いてcDNAを作製し、Taqman プローブ（Taqman probes）(Applied Biosystems)を用いて、mRNAの定量を行った。この結果から、対照siRNAをトランスフェクションした細胞と比較して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした細胞では、MICAL3のmRNAの発現が低下していることがわかった。 The upper figure of FIG. 4A shows the result of confirming the knockdown of MICAL3 by measuring the amount of MICAL3 mRNA by quantitative real-time (qRT) -PCR. Total RNA is extracted from cells with TRIzol® reagent (Life technologies), cDNA is prepared using High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystemes), and Taqman probes (Taqman probes). ) (Applied Biosystems) was used to quantify mRNA. From this result, it was found that the expression of MICAL3 mRNA was decreased in the cells transfected with MICAL3 siRNA as compared with the cells transfected with control siRNA.
また、抗MICAL3抗体（Santa Cruz）を用いて、MICAL3のノックダウンを確認した結果も示す（図４Ａ下図）。MCF7細胞を、RIPAバッファー(Pierce)にホスファターゼインヒビターカクテル（Phosphatase inhibitor cocktail）(Nacalai Tesque)とプロテアーゼインヒビターカクテル（Protease inhibitor cocktail）(Nacalai Tesque)を含む溶解バッファーを用いて可溶化した。タンパク質をSDS-PAGEにて泳動したのち、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に転写し、５％のスキムミルクにてブロッキングしたのち、抗MICAL3抗体（1:1000、Santa Cruz）と対照の抗アクチン抗体（Millipore）を用いてウエスタンブロットを行った。この結果から、対照siRNAをトランスフェクションした細胞と比較して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした細胞では、MICAL3タンパク質の発現も低下していることがわかった。 The result of confirming the knockdown of MICAL3 using an anti-MICAL3 antibody (Santa Cruz) is also shown (Fig. 4A, lower figure). MCF7 cells were solubilized using a lysis buffer containing a RIPA buffer (Pierce) containing a phosphatase inhibitor cocktail (Nacalai Tesque) and a protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque). The protein was electrophoresed on SDS-PAGE, transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, blocked with 5% skim milk, and then anti-MICAL3 antibody (1: 1000, Santa Cruz) and a control anti-actin antibody ( Western blot was performed using Millipore). From this result, it was found that the expression of MICAL3 protein was also reduced in the cells transfected with MICAL3 siRNA as compared with the cells transfected with the control siRNA.
図４Ｂは、siRNAによるMICAL3のノックダウンによりスフィア形成能が低下することを示す。細胞は、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまいて、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にセマフォリン3A (R&D Systems Inc.)(200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。 FIG. 4B shows that knockdown of MICAL3 by siRNA reduces the ability to form spheres. Cells were sprinkled in 24-well ultralow attachment plates at a concentration of 5,000 cells / ml and Semaphorin 3A (R & D Systems Inc.) in Dulbecco's modified Eagle's medium / nutrient mixture F-12 (DMEM / F-12). ) (200 ng / ml) was added to the medium. After 4-7 days, sphere diameters of> 75 μm were counted.
図４Ｂの結果から、MICAL3の発現が抑制されると、MCF7細胞のスフィア形成が大きく低下することが明らかとなった。 From the results shown in FIG. 4B, it was clarified that when the expression of MICAL3 was suppressed, the sphere formation of MCF7 cells was significantly reduced.
［実施例４ 種々の乳がん細胞株におけるMICAL3ノックダウンによるスフィア形成阻害］
実施例３と同様の実験を、各種乳がん細胞株を用いて行った。細胞株として、ルミナルタイプの細胞株MCF7細胞及びBT474細胞、ベーサルタイプのBT20細胞及びMM436細胞（いずれもAmerican Type Culture Collection (ATCC)より入手）を使用した。
[Example 4 Inhibition of sphere formation by MICAL3 knockdown in various breast cancer cell lines]
The same experiment as in Example 3 was performed using various breast cancer cell lines. As cell lines, luminal type cell lines MCF7 cells and BT474 cells, basal type BT20 cells and MM436 cells (all obtained from the American Type Culture Collection (ATCC)) were used.
実施例３と同様にして、各細胞を、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまき、ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中に、20 ng/mlの上皮成長因子(EGF)(Millipore)、20ng/mlの塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)(Pepro Tech)、B27 サプリメント(GIBCO)、ヘパリン（Stem Cell Technologies）を添加したスフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養、もしくはダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物F-12 (DMEM/F-12)中にHRG (200ng/ml)を添加した培地中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。 In the same manner as in Example 3, each cell was sprinkled on a 24-well ultralow attachment plate at a concentration of 5,000 cells / ml and into Dalbeco's modified Eagle's medium / nutrient mixture F-12 (DMEM / F-12). , 20 ng / ml epithelial growth factor (EGF) (Millipore), 20 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF) (Pepro Tech), B27 supplement (GIBCO), heparin (Stem Cell Technologies) Cultivated in Sphere culture medium (SCM) (bFGF + EGF + B27) or in medium supplemented with HRG (200 ng / ml) in Dalbeco's modified Eagle's medium / nutrient mixture F-12 (DMEM / F-12). did. After 4-7 days, sphere diameters of> 75 μm were counted.
その結果、図５に示すように、いずれの細胞株においても、対照siRNAをトランスフェクションした場合にはほとんど変化がないのに対して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした場合にはスフィア形成が有意に抑制されることが明らかとなった。 As a result, as shown in FIG. 5, in all cell lines, there was almost no change when the control siRNA was transfected, whereas sphere formation was significantly suppressed when the MICAL3 siRNA was transfected. It became clear that it would be done.
［実施例５ 乳がん臨床検体由来の初代培養細胞からのスフィア形成阻害］
乳がん患者の臨床検体（No.50及びNo.76）由来の初代培養細胞を用いて、実施例３及び４と同様の効果が得られることを確認した。
[Example 5 Inhibition of sphere formation from primary cultured cells derived from breast cancer clinical specimens]
It was confirmed that the same effects as in Examples 3 and 4 could be obtained by using primary cultured cells derived from clinical specimens (No. 50 and No. 76) of breast cancer patients.
臨床検体の初代培養は、以下のように行った。腫瘍組織は、3mm3にカットし、Accumax(Innova Technologies Inc.)を用いて10分間分散させた。機械的に分散させるシステム（Medimachine, Becton Dickinson）を用いて、シングルセルにまで細胞を分散させた。シングルセル分散液は、100mmのセルストレーナー(BD Falcon)に通し、Ca2+,Mg2+-不含リン酸緩衝生理食塩水(PBS)にて洗った。血球マーカーを発現しない（Lineage negative）乳がん細胞を分離するため、ビオチンコンジュゲート抗体混合物にて処理した。この抗体混合物には、MACS（登録商標）細胞分離キット（MACS lineage kit）として、以下の抗体が含まれる：CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD56、CD16、CD19、CD123、CD235a（Miltenyi Biotec)、CD31（eBioscience）、CD140b(Biolegend)。分離した乳がん細胞は、無血清ヒト乳房上皮細胞増殖培地（serum-free human mammary epithelial cell growth medium）(HuMEC、GIBCO)にて培養した。 The primary culture of clinical specimens was performed as follows. Tumor tissue was cut into 3 mm 3 and dispersed using Accumax (Innova Technologies Inc.) for 10 minutes. Cells were dispersed into single cells using a mechanical dispersion system (Medimachine, Becton Dickinson). The single cell dispersion was passed through a 100 mm cell strainer (BD Falcon) and washed with Ca 2+ , Mg 2+ -phosphate buffered saline (PBS). Breast cancer cells that do not express blood cell markers (Lineage negative) were treated with a biotin-conjugated antibody mixture to isolate them. This antibody mixture contains the following antibodies as a MACS® cell separation kit (MACS lineage kit): CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD56, CD16, CD19, CD123, CD235a (Miltenyi Biotec). ), CD31 (eBioscience), CD140b (Biolegend). The isolated breast cancer cells were cultured in serum-free human mammary epithelial cell growth medium (HuMEC, GIBCO).
細胞を5x105個/ウェルの濃度で6-ウェルプレートにまき、実施例３と同じRNAi duplex(Dharmacon GE Healthcare)とLipofectamine（登録商標） RNAiMAX トランスフェクション試薬(Life technologies)を添加して培養してRNAiをトランスフェクションし、解析まで２４時間培養した。尚、本実施例では、siRNA #09 (Dharmacon GE Healthcare, Cat.No., LU-024432-00-0002, ON-TARGETplus Human MICAL3 (57553) siRNA J-024432-09) 及び #11(同 J-024432-11)を別個に使用した。 Cells are sprinkled on a 6-well plate at a concentration of 5x10 5 cells / well and cultured with the same RNAi duplex (Dharmacon GE Healthcare) and Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent (Life technologies) as in Example 3. RNAi was transfected and cultured for 24 hours until analysis. In this example, siRNA # 09 (Dharmacon GE Healthcare, Cat.No., LU-024432-00-0002, ON-TARGETplus Human MICAL3 (57553) siRNA J-024432-09) and # 11 (J-) 024432-11) was used separately.
初代培養細胞は、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまき、スフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。 Primary cultured cells were sprinkled on a 24-well ultralow attachment plate at a concentration of 5,000 cells / ml and cultured in sphere culture medium (SCM) (bFGF + EGF + B27). After 4-7 days, sphere diameters of> 75 μm were counted.
その結果、図６に示すように、ルミナルＡタイプ（No.50）及びトリプルネガティブタイプ（No.76）のいずれの細胞株においても、対照siRNAをトランスフェクションした場合にはほとんど変化がないのに対して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした場合にはスフィア培養培地(SCM)中での培養によって誘導されるスフィア形成が有意に抑制されることが明らかとなった。 As a result, as shown in FIG. 6, there was almost no change when the control siRNA was transfected in any of the luminal A type (No. 50) and triple negative type (No. 76) cell lines. On the other hand, it was revealed that when MICAL3 siRNA was transfected, the sphere formation induced by the culture in the sphere culture medium (SCM) was significantly suppressed.
［実施例６ 乳がん臨床検体由来異種移植(patient derived xenograft, PDX)モデルにおける抗がん効果の確認］
乳がん臨床検体由来異種移植(PDX)モデルを用い、MICAL3のノックダウンにより移植細胞の造腫瘍能(tumor initiating ability)が低下することを確認した。
[Example 6 Confirmation of anticancer effect in breast cancer clinical specimen-derived xenograft (PDX) model]
Using a breast cancer clinical specimen-derived xenotransplantation (PDX) model, it was confirmed that knockdown of MICAL3 reduces the tumor initiating ability of transplanted cells.
レンチウイルスを用いたshRNA導入システムは、以下のように作製した。CSII-EF-MCS-IRES2-Venus ベクター(筑波理化学研究所の三好浩之博士より供与)に、MICAL3を標的とするshRNA（shRNA 1（配列番号３及び４）及びshRNA 2（配列番号５及び６））を合成して組み込んだ。対照として、対照shRNA 1（配列番号７及び８）及び対照shRNA 2（配列番号９及び１０）を組み込んだ。
MICAL3 shRNA 1 フォワード：GATCCCCGATGTGCGCTGGACTCGTATAACGTGTGCTGTCCGTTATATGAGTCCAGTGCACGTCTTTTTGGAAAT（配列番号３）
MICAL3 shRNA 1 リバース：CTAGATTTCCAAAAAGACGTGCACTGGACTCATATCACGGACAGCACACGTTATACGAGTCCAGCGCACATCGGG（配列番号４）
MICAL3 shRNA 2 フォワード：GATCCCCGGGAGTTCCTCCGACATGGAAACGTGTGCTGTCCGTTTTCATGTTGGAGGAGCTCCCTTTTTGGAAAT（配列番号５）
MICAL3 shRNA 2 リバース：CTAGATTTCCAAAAAGGGAGCTCCTCCAACATGAAGACGGACAGCACACGTTTCCATGTCGGAGGAACTCCCGGG（配列番号６）
対照shRNA 1 フォワード：GATCCCCGTGTGCTTTGTAGGGTTCTACGTGTGCTGTCCGTAGAATCCTACAAAGCGCGCTTTTTGGAAAT（配列番号７）
対照shRNA 1 リバース：CTAGATTTCCAAAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGACGGACAGCACACGTAGAACCCTACAAAGCACACGGG（配列番号８）
対照shRNA 2 フォワード：GATCCCCTTCTCTGAGCGTGTCGCGTACGTGTGCTGTCCGTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAAT（配列番号９）
対照shRNA 2 リバース：CTAGATTTCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTACGGACAGCACACGTACGCGACACGCTCAGAGAAGGG（配列番号１０）
A shRNA introduction system using a lentivirus was prepared as follows. CSII-EF-MCS-IRES2-Venus vector (provided by Dr. Hiroyuki Miyoshi of RIKEN), shRNA targeting MICAL3 (shRNA 1 (SEQ ID NOs: 3 and 4) and shRNA 2 (SEQ ID NOs: 5 and 6)) ) Was synthesized and incorporated. Control shRNA 1 (SEQ ID NOs: 7 and 8) and control shRNA 2 (SEQ ID NOs: 9 and 10) were incorporated as controls.
得られた各レンチウイルスプラスミドDNA(1000ng/μl)を、パッケージングプラスミド (pCMV-VSV-G-RSV-RevとpCAGHIVgp)と共に、リポフェクタミン(Invirtogen)を用いてHEK293T細胞（パッケージング細胞）にトランスフェクションし、レンチウイルスを回収した。 Each of the obtained lentiviral plasmid DNAs (1000 ng / μl) was transfected into HEK293T cells (packaging cells) using lipofectamine (Invirtogen) together with packaging plasmids (pCMV-VSV-G-RSV-Rev and pCAGHIVgp). Then, the lentil virus was recovered.
shRNAを用いてMICAL3をノックダウンした乳がん臨床検体由来細胞と対照のshRNAを導入した細胞を限界希釈して、103〜105個を8週齢の免疫不全NSGマウス（チャールスリバー社）に移植した。マウスはイソフルラン(Abbott Japan)にて麻酔し、細胞を50μlのマトリゲル（登録商標）(BD Biosciences)に混合し、乳腺皮下部に移植した。8週間経過後、形成した腫瘍の数を計測した。図７中の表は、各群5匹のマウスを使用した場合の腫瘍形成の有無を示したものである。表に示す通り、MICAL3をノックダウンした細胞は、造腫瘍能が低下していた。また、対照shRNAをトランスフェクションしたマウスでは触診にて腫瘍の形成が確認されたが、MICAL3 shRNA 1をトランスフェクションしてMICAL3をノックダウンしたマウスでは腫瘍が確認されなかった。
Breast cancer clinical specimen-derived cells in which MICAL3 was knocked down using shRNA and cells in which control shRNA was introduced were limitingly diluted, and 10 3 to 10 5 cells were transplanted into 8-week-old immunodeficient NSG mice (Charles River). did. Mice were anesthetized with isoflurane (Abbott Japan), cells were mixed with 50 μl Matrigel® (BD Biosciences) and transplanted subcutaneously into the mammary gland. After 8 weeks, the number of tumors formed was counted. The table in FIG. 7 shows the presence or absence of tumor formation when 5 mice in each group were used. As shown in the table, the cells in which MICAL3 was knocked down had reduced tumorigenicity. In addition, tumor formation was confirmed by palpation in mice transfected with control shRNA, but no tumor was confirmed in mice transfected with
［実施例７ MICAL3の過剰発現によるスフィア形成の上昇］
図８にMICAL3タンパク質のドメイン構造を示す。MICAL3（NP_056056）はN末にモノオキシゲナーゼドメインを持ち、モノオキシゲナーゼドメイン中のGXGXXG（93-98アミノ酸、配列番号１１）のグリシンをトリプトファンに置換した変異体3G3W（配列番号１２）は、モノオキシゲナーゼ活性を失っている。
[Example 7 Increase in sphere formation due to overexpression of MICAL3]
FIG. 8 shows the domain structure of the MICAL3 protein. MICAL3 (NP_056056) has a monooxygenase domain at the N-terminal, and the mutant 3G3W (SEQ ID NO: 12) in which the glycine of GXGXXG (93-98 amino acid, SEQ ID NO: 11) in the monooxygenase domain is replaced with tryptophan has monooxygenase activity. Have lost.
MICAL3-WT(BAG10388)は、MICAL-3タンパク質の合成部分配列としてGenBankにBAG10388として登録されている1918アミノ酸のタンパク質である。図８に示すような、MICAL3-WT、変異体MICAL3-3G3W、及びRab結合ドメインを欠失したMICAL3-N1を発現ベクターに組み込んだ（Dr. Akhmanovaより供与を受けた。Iiya Grigoriev et al., Current Biology vol. 21, Issue 11, p967-974, 2011を参照されたい）。
MICAL3-WT (BAG10388) is a 1918 amino acid protein registered as BAG10388 in GenBank as a synthetic partial sequence of MICAL-3 protein. MICAL3-WT, mutant MICAL3-3G3W, and MICAL3-N1 lacking the Rab binding domain were incorporated into the expression vector as shown in FIG. 8 (donated by Dr. Akhmanova. Iiya Grigoriev et al., See Current Biology vol. 21,
MCF7細胞を6ウェルプレートに3x105個/ウェルの濃度でまき、一晩培養した。上記で得られたベクターを用いて、MCF7細胞でMICAL3の野生型もしくは変異体タンパク質を一過性に過剰発現させるために、1.8μg プラスミドDNA（発現ベクター）、4.5μl ポリフェクトトランスフェクション試薬（Polyfect Transfection Reagent）（QIAGEN）と100μl RPMI1640培地を混合し、室温で15分間インキュベートし、細胞の培地に添加した後、48時間培養した。尚、対照ベクターとして、EGFP-C1（Dr. Akhmanovaより供与を受けた。）を使用した。 MCF7 cells were sprinkled on a 6-well plate at a concentration of 3x10 5 cells / well and cultured overnight. Using the vector obtained above, 1.8 μg plasmid DNA (expression vector), 4.5 μl Polyfect transfection reagent (Polyfect) for transient overexpression of wild-type or mutant protein of MICAL3 in MCF7 cells. Transfection Reagent (QIAGEN) and 100 μl RPMI1640 medium were mixed, incubated at room temperature for 15 minutes, added to cell medium and then cultured for 48 hours. As a control vector, EGFP-C1 (provided by Dr. Akhmanova) was used.
培養後の細胞を、5,000個/mlの濃度にして、24-ウェルウルトラローアタッチメントプレートにまき、スフィア培養培地(SCM)(bFGF+EGF+B27)中で培養した。４〜７日後、スフィアの直径が>75μmのものを計数した。 The cultured cells were sprinkled on a 24-well ultralow attachment plate at a concentration of 5,000 cells / ml and cultured in a sphere culture medium (SCM) (bFGF + EGF + B27). After 4-7 days, sphere diameters of> 75 μm were counted.
その結果、図９に示すように、スフィア培養培地(SCM)中での培養により、SCMなし（NT）と比較して、スフィア形成が観察されるが、MICAL3-WTを過剰発現させるとMCF細胞のスフィア形成能が大きく上昇した。この効果は、モノオキシゲナーゼドメインに変異を有するMICAL3-3G3Wの過剰発現ではみられなかった。一方、C末ドメインの欠損変異体(MICAL-WT-N1)を過剰発現させた場合には、野生型MICAL3と同程度にスフィア形成能を上昇させた。 As a result, as shown in FIG. 9, sphere formation was observed by culturing in sphere culture medium (SCM) as compared with no SCM (NT), but when MICAL3-WT was overexpressed, MCF cells were observed. Sphere forming ability was greatly increased. This effect was not seen with overexpression of MICAL3-3G3W, which has a mutation in the monooxygenase domain. On the other hand, when the C-terminal domain-deficient mutant (MICAL-WT-N1) was overexpressed, the sphere-forming ability was increased to the same extent as that of wild-type MICAL3.
［実施例８ MICAL3のノックダウンによるCRMP2の二量体形成抑制］
MCF7細胞をセマフォリン3A(200ng/ml)により刺激した後、細胞のライセートを抽出し、抗CRMP2抗体(IBL)、リン酸化CRMP2抗体(ECM Biosciences)にて、ウエスタンブロットを行った。その結果、セマフォリン3A刺激によりCRMP2が二量体を形成し、かつS522のリン酸化も上昇することが見出された（データは示さない）。実施例６で使用したshRNAを用いてMICAL3をノックダウンすると、CRMP2の二量体形成が抑制された（図１０）。
[Example 8 Suppression of CRMP2 dimer formation by knockdown of MICAL3]
After stimulating MCF7 cells with semaphorin 3A (200 ng / ml), cell lysates were extracted and Western blots were performed with anti-CRMP2 antibody (IBL) and phosphorylated CRMP2 antibody (ECM Biosciences). As a result, it was found that CRMP2 forms a dimer and S522 phosphorylation is also increased by semaphorin 3A stimulation (data not shown). Knockdown of MICAL3 using the shRNA used in Example 6 suppressed the dimer formation of CRMP2 (Fig. 10).
［実施例９ セマフォリン3A刺激によるNumbの発現上昇］
実施例３と同様にして、MICAL3 siRNA又は対照siRNAをトランスフェクションしたMCF7細胞をセマフォリン3A(200ng/ml)で刺激した後、細胞のライセートを抽出し、抗Numb抗体（Abcam）にてウエスタンブロットを行った。
[Example 9 Increased expression of Numb by semaphorin 3A stimulation]
In the same manner as in Example 3, MCF7 cells transfected with MICAL3 siRNA or control siRNA were stimulated with semaphorin 3A (200 ng / ml), and then lysates of the cells were extracted and Western blot with anti-Numb antibody (Abcam). Was done.
その結果、図１１に示すように、セマフォリン3A刺激により、siRNAをトランスフェクションしない細胞、及び対照siRNAをトランスフェクションした細胞ではNumbの発現が上昇するのに対して、MICAL3 siRNAをトランスフェクションした細胞では、セマフォリン刺激によるNumBの発現上昇は観察されなかった。 As a result, as shown in FIG. 11, Numb expression was increased in cells not transfected with siRNA and cells transfected with control siRNA by semaphorin 3A stimulation, whereas cells transfected with MICAL3 siRNA. No increase in NMB expression was observed by semaphorin stimulation.
［実施例１０ Numbノックダウンによるスフィア形成能の低下］
実施例３と同様にして、MCF7細胞に以下の配列を有するsiRNA：
Numb siRNA #01：NUMBHSS112687(3_RNAI)
Forword: UCUUAGCCAGAAGAUGUCACCCUUU（配列番号１３）
Reverse: AAAGGGUGACAUCUUCUGGCUAAGA（配列番号１４）
及び
Numb siRNA #02：NUMBHSS112689(3_RNAI)
Forword: GAGAAAGAAGGAUGUUUAGAGGCCA（配列番号１５）
Reverse: UGGAACAUAAACAUCCUUCUUUCUC（配列番号１６）
（Invitrogen Stealth RNAi(TM) siRNA (https://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/life-science/rnai/synthetic-rnai-analysis/stealth-rnai-technology.html)）をトランスフェクションし、Numbをノックダウンした。尚、対照siRNAとして、Stealth RNAiTM siRNA Negative Control LO GC (Cat. No. 12935-200)を用いた。
[Example 10 Decrease in sphere forming ability due to Numb knockdown]
Similar to Example 3, siRNA having the following sequence in MCF7 cells:
Numb siRNA # 01: NUMBHSS112687 (3_RNAI)
Forword: UCUUAGCCAGAAGAUGUCACCCUUU (SEQ ID NO: 13)
Reverse: AAAGGGUGACAUCUUCUGGCUAAGA (SEQ ID NO: 14)
as well as
Numb siRNA # 02: NUMBHSS112689 (3_RNAI)
Forword: GAGAAAGAAGGAUGUUUAGAGGCCA (SEQ ID NO: 15)
Reverse: UGGAACAUAAACAUCCUUCUUUCUC (SEQ ID NO: 16)
Transfect (Invitrogen Stealth RNAi (TM) siRNA (https://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/life-science/rnai/synthetic-rnai-analysis/stealth-rnai-technology.html)) , Knocked down Numb. As a control siRNA, Stealth RNAi TM siRNA Negative Control LO GC (Cat. No. 12935-200) was used.
siRNAをトランスフェクションした細胞及びトランスフェクションしていないMCF7細胞をスフィア培養培地（SCM）とセマフォリン3A刺激（200ng/ml）の両方の条件で培養し、スフィア形成能を調べた。 SiRNA-transfected cells and non-transfected MCF7 cells were cultured under both sphere culture medium (SCM) and semaphorin 3A stimulation (200 ng / ml), and the sphere-forming ability was examined.
その結果、図１２に示すように、いずれの場合も、siRNAによるNumbのノックダウンにより、スフィア形成が抑制された。 As a result, as shown in FIG. 12, in each case, sphere formation was suppressed by knockdown of Numb by siRNA.
従来の抗がん治療は増殖能の高い細胞を標的とするものであり、また、例えば乳がんでは特定のサブタイプの乳がんのみに有効な抗がん剤が使用されてきた。本発明により、がん幹細胞を標的とする新たな抗がん剤が提供され、従来の治療と組み合わせることでより効果的な治療が可能となるだけでなく、がんの転移や再発を効果的に予防することが可能となる。 Conventional anti-cancer treatments target cells with high proliferative potential, and for example, in breast cancer, anti-cancer agents effective only for specific subtypes of breast cancer have been used. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a new anticancer agent that targets cancer stem cells, and not only enables more effective treatment in combination with conventional treatments, but also effectively metastasizes and recurs cancer. It becomes possible to prevent it.
Claims (6)
単離された乳がん幹細胞でMICAL3タンパク質の発現を上昇させ、
MICAL3タンパク質の発現が上昇した細胞を候補薬剤と接触させ、
候補薬剤の非存在下と比較した該細胞のスフィア形成能の低下の有無を検出する
ことを含む、上記スクリーニング方法。 It is a screening method for anticancer drugs.
Increased expression of MICAL3 protein in isolated breast cancer stem cells,
Contact cells with increased expression of MICAL3 protein with candidate drugs
The screening method comprising detecting the presence or absence of reduced sphere-forming ability of the cell as compared to the absence of a candidate drug.
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2015
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