JP6620239B2

JP6620239B2 - Ｓｏｃｓが抑制された免疫抑制能が向上した幹細胞およびその利用

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Publication number: JP6620239B2
Application number: JP2018523505A
Authority: JP
Inventors: ヘユ、コン; ヘク、ホン; ウイ、ミョン; ソンキム、テ
Original assignee: サムソンライフパブリックウェルフェアファウンデーション
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2019-12-11
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: US20180320178A1; US10961533B2; JP2018536403A; ES2875278T3; KR20170054262A; EP3375866A4; EP3375866B1; EP3375866A1

Description

本発明は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性が抑制された、免疫抑制能を有する幹細胞および前記幹細胞を含む免疫抑制用薬学的組成物に関する。
また、本発明は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現抑制剤または活性抑制剤を含む、幹細胞の免疫抑制活性誘導用組成物に関する。
また、本発明は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性抑制を通じて幹細胞の免疫抑制能の活性を誘導する方法に関する。

臓器、組織または細胞移植は、多様な種類の疾病にかかっている患者の生命を守るのに用いられる。ヒトの腎臓、肝、心臓、腎臓、肺およびすい臓などの臓器と皮膚などの組織、骨髄など細胞同種移植（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）は、末期臓器不全など難治性疾患を治療する方法であって、病院ですでに一般的に施行されている。また、ヒト以外の哺乳動物を供与者とする異種移植（ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）も、同種移植供与者の不足を代替する方法として活発に研究されているのが現況である。特に、最近には、自己自身を永久に再生することができ、適切な条件で身体を構成する多様な種類の細胞に分化可能な幹細胞の移植が、多様な難治性疾患の細胞代替治療法の一つとして提起されている。

一般的に、正常機能をする受恵者の免疫体系は、移植された臓器、組織や細胞を「非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）」と認識して移植片（ｇｒａｆｔ）に対して免疫拒否反応を誘発する。このような免疫拒否反応は、供与者の組織の同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎｓ）または異種抗原（ｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎｓ）を認識する受恵者の免疫システムに存在する同種反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ）または異種反応性（ｘｅｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）Ｔ細胞により一般的に媒介される。したがって、同種または異種移植片が長期間生存するためには、外部抗原を認知する受恵者の免疫体系を避けたり、免疫反応を抑制しなければならない。移植片に対する受恵者の免疫反応を避けるために、一般的に受恵者に免疫抑制剤を投与する。シクロスポリンおよびタクロリムス（ＦＫ−５０６）等のようなカルシニューリン抑制剤やアザチオプリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチルおよびシクロホスファミド等のような抗増殖性薬剤等が代表的な免疫抑制剤として現在同種腎臓、肝、すい臓、心臓移植などに頻繁に使用されている。

これらの免疫抑制剤は、一日を基準として投与しなければならず、万一、投与を中断する場合、通常的に免疫拒否反応がもたらされる。したがって、長期間にわたって投与しなければならないが、そのため、腎臓や肝毒性、高血圧などを誘発することができる。それだけでなく、これらの薬物は、移植片の同種抗原にのみ反応する免疫細胞にのみ選択的に作用する特異的免疫抑制剤ではないので、非特異的免疫抑制による日和見感染やリンパ腫のような腫瘍形成などの副作用を誘発することができる。他の免疫抑制方法として、ＯＫＴ３、ダクリズマブまたはバシリキシマブ等の単クローン抗体を投与する方法があるが、これらもやはり非特異的な免疫抑制剤であって、日和見感染や腫瘍形成の問題点を持っている。したがって、薬物毒性や日和見感染などの問題点がない新しい免疫抑制法の開発が要求される。

一方、ヒト間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）は、多様な組織に由来し、細胞基盤移植または再生医薬治療において強力な候補者である。

損傷した組織への移動、免疫抑制機能、自家再生、および多分化能のようなＭＳＣｓの特徴は、その治療的適用の可能性をもたらす。現在、ＭＳＣｓの注入、または移植を含む５００個余りの臨床がｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録されている。また、これらのうち約２０％がＭＳＣの免疫抑制能に関連する。ＭＳＣｓの免疫抑制特性が明らかにされており、多くの臨床１相は、生物学的安定性の問題を示さないにもかかわらず、それ以上の臨床段階では、不備な結果が導き出されている。

さらに、ＭＳＣの標準化のための培養方法またはプロトコルが不在して、同じ授与者の同じ組織から分離したＭＳＣｓの場合にも、表現型的、および機能的多様性が観察されている。したがって、特定の条件を付与して、ＭＳＣの機能を促進または抑制する方法が必要である。

これより、本発明者らは、幹細胞の免疫抑制能を向上させることができる方案を開発するために鋭意努力した結果、幹細胞でＳＯＣＳの発現を抑制することが幹細胞の免疫抑制能を向上させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の一態様は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性が抑制された、免疫抑制能を有する幹細胞および前記幹細胞を含む免疫抑制用薬学的組成物を提供することにある。

また、本発明の一態様は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現抑制剤または活性抑制剤を含む、幹細胞の免疫抑制活性誘導用組成物を提供することにある。

また、本発明の他の態様は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性抑制を通じて幹細胞の免疫抑制能の活性を誘導する方法を提供する。

本発明の一態様は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性が抑制された、免疫抑制能を有する幹細胞を提供する。

本発明によるＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性抑制は、幹細胞の免疫抑制能を向上させることができる。したがって、前記免疫抑制能が向上した幹細胞は、自己免疫疾患、臓器移植拒否反応、またはアレルギー疾患において効果的な細胞治療剤として有用に活用され得る。

ＳＯＣＳが下向き調節されたＭＳＣ（間葉系幹細胞）の免疫抑制能特性をｉｎｖｉｔｒｏで確認した結果である。ＳＯＣＳが下向き調節されたＭＳＣ（間葉系幹細胞）の免疫抑制能特性をｉｎｖｉｔｒｏで確認した結果である。ＳＯＣＳをターゲットとするｓｈＲＮＡをＭＳＣに処理してＳＯＣＳタンパク質発現が抑制されたことを確認した赤色蛍光染色結果である。ＳＯＣＳをターゲットとするｓｈＲＮＡをＭＳＣに処理してＳＯＣＳタンパク質発現が抑制されたことを確認したウェスタンブロッティング結果である。ＳＯＣＳが下向き調節されたＭＳＣの免疫抑制能の特性をｉｎｖｉｖｏ移植片対宿主病動物モデルで確認した結果である。ＩＦＮ−γ処理したＭＳＣでのＳＯＣＳ発現水準を確認した結果である。ＳＯＣＳ下向き調節されたＭＳＣと、これにＩＦＮ−γをさらに処理したＭＳＣ間の免疫抑制能をｉｎｖｉｖｏ移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）動物モデルで比較評価した結果である。ＭＳＣを高密度培養した場合、免疫抑制マーカー遺伝子ＰＴＧＥＳの発現増加を確認した結果である。ＭＳＣを高密度培養した場合、免疫抑制マーカー遺伝子ＰＴＧＥＳの発現増加を確認した結果である。ＭＳＣを高密度培養した場合、免疫抑制マーカー遺伝子ＣＸＣＲ７の発現増加を確認した結果である。ＭＳＣを高密度培養した場合、免疫抑制マーカー遺伝子ＣＸＣＲ７の発現増加を確認した結果である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質は、サイトカイン信号伝達の陰性的フィードバック調節因子（ｎｅｇａｔｉｖｅｆｅｅｄｂａｃｋｒｅｇｕｌａｔｏｒ）グループに属し、ヤーヌスキナーゼ／信号伝達因子（Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ／ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）および転写（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）経路の活性因子を含んでいるものと知られている。また、最近報告された資料によれば、ＳＯＣＳタンパク質は、インスリン受容体（ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＲ）、ＥＧＦＲおよびＫＩＴを含む受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ、ＲＴＫ）信号伝達の陰性調節因子として作用し得るという内容が報告された。

前記ＳＯＣＳは、その種類に制限がなく、例えば、ＣＩＳＨ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６およびＳＯＣＳ７であってもよい。また、最も好ましくは、ＳＯＣＳ１またはＳＯＣＳ３であってもよい。

本明細書で使用された用語「幹細胞」は、多様な身体組織に分化できる能力を有する未分化細胞であって、これは、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）に分類され得る。

本発明で幹細胞は、その由来または類型によって、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、腫瘍幹細胞または人工多能性幹細胞であってもよい。

また、本明細書で使用された用語「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ、ＭＳＣ）」は、骨、軟骨、脂肪、筋肉細胞を含む様々な中胚葉細胞または神経細胞のような外胚葉細胞にも分化する能力を有する多分化能幹細胞である。前記間葉系幹細胞は、好ましくは、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜、および胎盤からなる群より選択されるものに由来し得る。また、前記間葉系幹細胞は、ヒト、胎児、またはヒトを除いた哺乳動物に由来し得る。前記ヒトを除いた哺乳動物は、より好ましくは、犬科動物、猫科動物、猿科動物、牛、羊、豚、馬、ラット、マウスまたはギニアピッグ等であってもよく、その由来を制限しない。

本発明の具体的な実施例では、間葉系幹細胞の免疫抑制能を増加させるために、ＳＯＣＳの発現を抑制するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを利用してＳＯＣＳ１またはＳＯＣＳ３が下向き調節されたＭＳＣを製造した。以後、ＳＯＣＳが下向き調節されたＭＳＣがｉｎｖｉｔｒｏでＴ−細胞の増殖を抑制するだけでなく、ｉｎｖｉｖｏ移植片対宿主病動物モデルにおいても免疫を抑制して、生存率を増加させることを確認した。

これにより、本発明は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現抑制剤または活性抑制剤を含む、幹細胞の免疫抑制活性誘導用組成物を提供する。

前記ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現抑制剤は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をコードするｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスヌクレオチド、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムであってもよい。

また、前記ＳＯＣＳの活性抑制剤は、ＳＯＣＳに特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド模倣体、基質類似体、アプタマー、抗体、またはＳＯＣＳの拮抗剤、その他ＳＯＣＳ抑制活性を示す抽出物、化合物であってもよい。

また、本発明は、前記ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性が抑制された免疫抑制能を有する幹細胞を有効成分として含む免疫抑制用組成物を提供する。

前記組成物は、体液性拒否反応、移植片対宿主疾患、臓器移植時の拒否反応、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の予防または治療用であってもよい。

前記自己免疫疾患は、その種類に制限はないが、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、第１型糖尿、ルプス、慢性疲労症候群、繊維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性硬皮症、喘息または潰瘍性大腸炎であってもよい。

また、前記アレルギー性疾患は、過敏性、アレルギー性鼻炎、喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、じんましん、掻痒症、昆虫アレルギー、食品アレルギーまたは薬品アレルギーであってもよい。

前記有効成分は、前記幹細胞を含む幹細胞培養液、前記培養物の濃縮物などを含む概念である。

前記組成物が免疫抑制用薬学的組成物で製造される場合、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイル等を含むが、これに限定されるものではない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

前記免疫抑制用薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは、消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコートしたり、胃での分解から保護されるように剤形化しなければならない。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動し得る任意の装置により投与され得る。

前記免疫抑制用薬学的組成物の適当な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。前記組成物の好ましい投与量は、成人を基準として１００〜１００，０００，０００（１０^２〜１０^８）ｃｅｌｌ／ｋｇの範囲内である。用語「薬学的有効量」は、癌を予防または治療するか、または血管新生による疾患の予防または治療するのに十分な量を意味する。

前記組成物は、当該当業者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量の形態で製造されたり、または多用量容器内に内入させて製造され得る。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与することができる。また、単回または必要に応じて追加投与され得る。

また、本発明の他の態様は、幹細胞にＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性を抑制する段階を含む、幹細胞の免疫抑制能の活性を誘導する方法を提供する。

前記ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性を抑制することは、ＳＯＣＳの発現抑制剤または活性抑制剤によることができ、その定義は、前記と通りである。

また、前記幹細胞には、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）をさらに処理することができる。

前記のように、細胞培養時にインターフェロンガンマを処理する場合、前記幹細胞は、ＨＬＡ−ＤＲＡ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ、ｃｌａｓｓＩＩ、ＤＲａｌｐｈａｃｈａｉｎ）、ＣＤ２７４（Ｂ７Ｈ１、Ｂ７ｈｏｍｏｌｏｇ１）、ＩＤＯ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、ＩＣＡＭ２（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ２）、ＣＣＬ８（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ８）、ＣＸＣＬ９（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ９）またはＣＸＣＬ１０（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ１０）の発現が増加することができる。

また、前記幹細胞は、高密度培養され得、この際、高密度培養は、５，０００〜２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で培養するものであってもよい。

前記のように、幹細胞を高密度培養する場合、前記幹細胞は、ＰＴＧＤＳ（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＤ２ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＰＴＧＥＳ（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＶＣＡＭ１（ｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＣＸＣＲ７（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅ７）、またはＵＬＢＰ１（ＵＬ１６ＢｉｎｄｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ１）の発現が増加することができる。

前記ＩＦＮ−γ処理および高密度培養は、ＳＯＣＳの発現抑制剤または活性抑制剤の処理前または後であってもよい。また、前記ＩＦＮ−γ処理もやはり、高密度培養前または後、または高密度培養中であってもよい。

また、前記ＩＦＮ−γの処理は、体内移植の直前、または一日や二日前に処理され得る。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：実験方法
１−１．ヒト組織由来間葉系幹細胞の分離および培養
本実験は、サムスン医療院の研究審査委員会（ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄ；ＩＲＢ）の承認（ＩＲＢＮｏ．２０１１−１０−１３４）を受け、すべてのサンプルは、事前同意を得て収集した。間葉系幹細胞の分離は、従来知られている方法で分離した。分離した細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）が含まれているＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）培地を利用して２×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度でシーディングして、３７℃および５％ＣＯ_２条件下で培養した。

１−２．ｓｉＲＮＡ形質感染
ｓｉＲＮＡ形質感染２４時間前に、ＭＳＣｓを播種（ｐｌａｔｉｎｇ）して、形質感染日に５０％のコンフルエンスになるようにした。細胞を製造社の指示に応じてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で形質感染させた。

簡略に、細胞をｓｉＲＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００複合体で処理し、１８時間の間ＣＯ_２インキュベーターで３７℃でインキュベーションした。次いで、培地を新鮮な培養培地（１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ− Ｇｉｂｃｏ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）を含む低グルコース−ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）に交換し、引き続いて、標的遺伝子が効果的に下向き調節されるまで形質感染された細胞を０〜２４時間までさらにインキュベーションした。ＳＯＣＳ１（ｓｃ−４０９９６）、ＳＯＣＳ３（ｓｃ−４１０００）を標的にするｓｉＲＮＡおよびスクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｃ−３７００７）は、全部ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）で購入した。

１−３．ｓｈＲＮＡ形質感染
ＳＯＣＳ１の発現を阻害するために、脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＴ−ＭＳＣ）にＳＯＣＳ１ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するアデノウイルスを処理した。具体的に、ＳＯＣＳ１をターゲットとするｓｈＲＮＡ配列は、ヒトＵ６プロモーターとＴａｇＲＦＰマーカー遺伝子含有シャトルベクター（ｐＯ６Ａ５−Ｕ６−ｍＰＧＫ−ＴａｇＲＦＰ）にクローニングされて、ｐＯ６Ａ５−Ｕ６−ｓｈＳＯＣＳ１−ｍＰＧＫ−ＴａｇＲＦＰ発現ベクターとして準備し、シャトルベクターのＵ６−ｓｈＲＮＡ−ＳＶ４０−ｐＡ領域は、ＢＡＣベクターに組換えしてトランスファーした。回収した組換えアデノウイルス（Ａｄ５−Ｕ６−ｓｈＳＯＣＳ１−ｍＰＧＫ−ＴａｇＲＦＰ）は、ＨＥＫ−２９３細胞で増殖させ、ＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）であるＨＰ４は、ペプトロン社から購入した。間葉系幹細胞にアデノウイルスパーティクルをトランスフェクションするために、ＨＰ４（１００ｎＭ）とともにアデノウイルスパーティクルをＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１００で処理し、室温で３０分間無血清培地に培養させた。以後、培養された細胞をＰＢＳで洗い、Ａｄ−ＲＦＰ−ｓｈＳＯＣＳ１およびＨＰ４ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎで培養し、２時間後に細胞をＰＢＳで洗って、血清含有培地で培養させた。選別された間葉系幹細胞は、ＲＦＰ（ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を用いた蛍光観察およびウェスタンブロッティングを通じて確認した。

１−４．免疫ブロッティング（ウェスタンブロッティング）
細胞を冷たいＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、３００μＬの冷たいＲＩＰＡバッファー［１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、および１％デオキシコール酸ナトリウムを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５］でプロテアーゼ抑制剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）で溶出した。

細胞溶出液を４℃で１０分間３０００ｇで遠心分離した。上澄み液を収集し、タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して決定した。電気泳動のために、３０μｇのタンパク質をサンプルバッファー（１４．４ｍＭのｂｅｔａ−メルカプトエタノール、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、および０．１％ブロモフェノールブルーを含む６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）内に溶解させ、５分間沸かした後、１０％ＳＤＳリデューシングジェル上で分離した。分離したタンパク質をａｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用してＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）上に移動させた。前記ＰＶＤＦ膜を１時間室温で５％脱脂粉乳（ＢＤＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むＴＢＳ（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）でブロッキングした後、ＴＢＳで３回洗浄し、３％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）内の１次抗体（すべての抗体を１：１０００で希釈）と４℃で一晩中インキュベーションした。翌日、ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、１時間３％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ内のＨＲＰ−融合した２次抗体（１：２０００または１：５０００希釈）と室温でインキュベーションした。これをＴＢＳＴで３回洗浄した後、タンパク質をＥＣＬ検出システム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で視角化した。

１−５．免疫細胞化学染色法
間葉系幹細胞に固定溶液である４％ホルムアルデヒドを処理し、光を遮断させた状態の室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳで３回洗った。細胞の内部に発現するタンパク質（ＰＴＧＥＳ、ＣＸＣＲ７）を検出するために、細胞に０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を処理し、光を遮断させた状態の室温で５分間反応させて、細胞透過性を高めた。以後、さらに細胞を３回洗い、５％ＦＢＳブロッキング溶液を処理して、室温で１時間反応させた後、さらに細胞を洗い、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）で購入した１次抗体を処理（１：１００）した後、やはり室温で１時間反応させた。次に、細胞をさらに３回洗い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８が付着しているｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ）２次抗体を処理して、室温で１時間反応させ、以後、ＣａｒｌＺｅｉｓｓＬＳＭ７００ｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓｙｓｔｅｍ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して細胞イメージを得た。

１−６．Ｔ−細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ）
９６−ウェルプレートに１０％ＦＢＳが補充された高グルコースＤＭＥＭ内にＭＳＣｓを１．２５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬでシーディングした。２４時間後、細胞増殖を抑制するために、１０μｇ／ｍＬのミトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。処理された細胞をさらなる２時間の間に３７℃でインキュベーションした後、培養培地で５回洗浄した。引き続いて、１×１０^５ｈＰＢＭＣｓ（ｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ）を勾配遠心で分離し、各ウェルに添加し、１μｇ／ｍＬのＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でＴ−細胞増殖を促進した。引き続いて、ＢｒｄＵ（５−ｂｒｏｍｏ−２−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を添加する前に、３〜４日間ＰＨＡ−活性化したｈＰＢＭＣｓを異なる条件のＭＳＣｓ上で培養した。増殖水準は、ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のアッセイキットを利用して１８時間後に測定した。

１−７．移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の動物モデル
８〜９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫欠乏マウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）に３００ｃＧｙの全身照射法を実施し、２４時間後にヒト末梢血液単球細胞を静脈投与した。具体的に、各マウスに２×１０^７個のヒト末梢血液単球細胞を１×１０^６個の間葉系幹細胞とともに投与した。以後、同じ個数の間葉系幹細胞を投与７日目に反復投与した。

実施例１：ＳＯＣＳ下向き調節されたＭＳＣのｉｎｖｉｔｒｏ免疫抑制能の評価
ＭＳＣでＳＯＣＳを抑制するために、ｓｉＲＮＡを利用してＳＯＣＳ１またはＳＯＣＳ３の発現を抑制した。その結果、図１のＡに示したように、ＳＯＣＳ１またはＳＯＣＳ３は、それぞれのＭＳＣで有意的に発現抑制されることを確認することができた。

また、前記ＳＯＣＳが抑制されたＭＳＣをＰＨＡ−誘導されたｈＰＢＭＣｓと培養し、その増殖活性をＢｒｄＵ^＋細胞のパーセントを通じて確認した。その結果、図１のＢに示したように、ＳＯＣＳ１またはＳＯＣＳ３のｓｉＲＮＡが処理されたＭＳＣは、ｈＰＢＭＣｓの細胞増殖を有意的に抑制することを確認することができた。

実施例２：ＳＯＣＳ下向き調節されたＭＳＣのｉｎｖｉｖｏ免疫抑制能の評価
ＳＯＣＳ１をターゲットとするｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスを脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＴ−ＭＳＣ）に形質感染させることにより、ＭＳＣでＳＯＣＳの発現抑制を確認した。その結果、図２に示したように、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の標識（Ａ）およびウェスタンブロッティング（Ｂ）の結果においてＭＳＣ内ＳＯＣＳ１タンパク質の発現が有意的に抑制されることを確認することができた。

また、前記獲得されたＳＯＣＳ下向き調節されたＭＳＣが実際に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の動物モデルで免疫抑制能を発揮するかを確認した。その結果、図３に示したように、ｓｈＲＮＡによりＳＯＣＳが下向き調節されたＭＳＣ（赤色ライン）処理群は、対照群に比べて生存率（免疫抑制能）を顕著に増加させることが分かった。

実施例３：ＩＦＮ−γを処理したＭＳＣでのＳＯＣＳの発現水準
免疫抑制能を増進させるためにＩＦＮ−γをＭＳＣに処理した後、ＳＯＣＳ（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現を免疫ブロッティングを利用して分析した。

その結果、図４に示したように、ＩＦＮ−γのようなサイトカインシグナルを調節するものと知られているＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１および３）の発現が時間別に変わることを確認した。これは、ＩＦＮ−γによる信号を調節するためにＳＯＣＳの発現が変わることを意味する。

実施例４：ＳＯＣＳ下向き調節されたＭＳＣにＩＦＮ−γ処理時の免疫抑制能の評価
前記実施例２で獲得されたＳＯＣＳ下向き調節されたＭＳＣと、これにＩＦＮ−γをさらに処理したＭＳＣ間の免疫抑制能をｉｎｖｉｖｏ移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の動物モデルで比較評価した。

その結果、図５に示したように、ｓｈＲＮＡによりＳＯＣＳが下向き調節されたＭＳＣ処理群（青色ライン）に比べて、ＳＯＣＳの下向き調節に加えてＩＦＮ−γをさらに処理したＭＳＣ処理群（赤色ライン）が、生存率（免疫抑制能）を顕著に増加させることが分かった。

実施例５：高密度培養したＭＳＣでの免疫抑制遺伝子発現増加の確認
ＭＳＣを高密度培養（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）する場合、ＰＴＧＥＳ（ＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥｓｙｎｔｈａｓｅ）とＣＸＣＲ７（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃｍｏｔｉｆ）ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅ７）の遺伝子発現が増加するかを確認することにより、高密度培養により免疫抑制能がさらに増進されるかを評価した。

５−１．ＰＴＧＥＳ発現増加の確認
ＰＴＧＥＳに特異的な抗体を利用してウェスタンブロッティング（Ａ）および免疫細胞化学染色（Ｂ）した結果、図６に示したように、低密度培養（２００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）に比べて高密度培養（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）時にＰＴＧＥＳのタンパク質発現が顕著に増加することを確認した。

５−２．ＣＸＣＲ７発現増加の確認
ＣＸＣＲ７に特異的な抗体を利用してウェスタンブロッティング（Ａ）および免疫細胞化学染色（Ｂ）した結果、図７に示したように、低密度培養（２００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）に比べて高密度培養（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）時にＣＸＣＲ７のタンパク質発現が顕著に増加することを確認した。
（付記）
＜１＞ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性が抑制された、免疫抑制能を有する幹細胞。
＜２＞前記ＳＯＣＳは、ＣＩＳＨ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６およびＳＯＣＳ７からなる群より選択されるものであることを特徴とする、＜１＞に記載の幹細胞。
＜３＞前記幹細胞は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、腫瘍幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群より選択されるものであることを特徴とする、＜１＞に記載の幹細胞。
＜４＞前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜および胎盤からなる群より選択されるものに由来することを特徴とする、＜３＞に記載の幹細胞。
＜５＞ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現抑制剤または活性抑制剤を含む、幹細胞の免疫抑制活性誘導用組成物。
＜６＞前記ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現抑制剤または活性抑制剤は、ＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）またはこれをコードする遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、リボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、アプタマー、拮抗剤、抽出物および化合物からなる群より選択されるものであることを特徴とする、＜５＞に記載の組成物。
＜７＞＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の幹細胞を有効成分として含む、免疫抑制用薬学的組成物。
＜８＞前記組成物は、体液性拒否反応、移植片対宿主疾患、臓器移植時の拒否反応、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の予防または治療用であることを特徴とする、＜７＞に記載の組成物。
＜９＞前記自己免疫疾患は、クローン病、紅斑病、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アディソン病、第１型糖尿、ループス、慢性疲労症候群、繊維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、硬皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、全身性硬皮症、喘息および潰瘍性大腸炎からなる群より選択されるものであることを特徴とする、＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞幹細胞にＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の発現または活性を抑制する段階を含む、幹細胞の免疫抑制能の活性を誘導する方法。
＜１１＞インターフェロンガンマを幹細胞に処理する段階をさらに含むことを特徴とする、＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞前記幹細胞を高密度培養する段階をさらに含むことを特徴とする、＜１０＞に記載の方法。
＜１３＞前記高密度培養は、５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ ^２〜２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ ^２の密度で培養することを特徴とする、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞前記幹細胞は、自家由来、他家由来または同種異系由来であることを特徴とする、＜１０＞に記載の方法。

Claims

（ａ）ヒト由来の間葉系幹細胞においてＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１またはＳＯＣＳ３の発現または活性を抑制すること、
（ｂ）前記間葉系幹細胞をインターフェロンガンマで処理すること、および
（ｃ）前記間葉系幹細胞を５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２〜２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で培養すること、
を含む、ｉｎｖｉｔｒｏでヒト由来の間葉系幹細胞の免疫抑制活性を誘導する方法。
（ａ）ヒト由来の間葉系幹細胞においてＳＯＣＳ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１またはＳＯＣＳ３の発現または活性を抑制すること、
（ｂ）前記間葉系幹細胞をインターフェロンガンマで処理すること、および
（ｃ）前記間葉系幹細胞を５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ ^２〜２０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ ^２の密度で培養すること、
を含む、免疫抑制活性が誘導されたヒト由来の間葉系幹細胞をｉｎｖｉｔｒｏで製造する方法。
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜および胎盤からなる群より選択されるものに由来する、請求項２に記載の方法。