JP6618912B2

JP6618912B2 - 改良された、組換えポリペプチド作製方法

Info

Publication number: JP6618912B2
Application number: JP2016541174A
Authority: JP
Inventors: エアハルトコペツキ; ジェンズニーウォエフナー; ピーターマイアー
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2019-12-11
Anticipated expiration: 2034-12-10
Also published as: MX2016007207A; US20160326562A1; US10370692B2; BR112016012229A2; WO2015091144A1; EP3083977A1; EP3083977B1; RU2016128367A; CA2929149A1; CN105829542A; US20190271021A1; RU2019134445A; US11098338B2; MX368656B; HK1223980A1; RU2711322C1; KR20160098277A; JP2017500040A

Description

組換えによって作製される生物学的に活性なポリペプチドの収量を特に増加させるための方法が、本明細書において報告される。

発明の背景
今日、ほとんどの生物薬剤は、動物(哺乳動物)細胞中で作製され、これらの細胞は、通常、関心対象の組換えポリペプチドを高効率、高品質で、かつ適切な翻訳後(二次的)修飾(例えばグリコシル化)を加えて、培養培地中に分泌する。しかし、一部の融合ポリペプチド、特に、複雑な融合ポリペプチド、溶解度の低いポリペプチドまたはフォールディングが困難であるポリペプチド、ならびにそれを発現する細胞と相互作用するポリペプチドは、しばしば、極めて低収量で得られる。

例えば、抗体は、通常、哺乳動物細胞において、生物学的に活性な形態で高効率で発現される。しかし、抗体を含む融合ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)抗体コンジュゲートは、実験アプローチおよび診断アプローチのために大いに興味深いと思われる(例えば、WO 2011/135040(特許文献1)を参照されたい)が、このようなタンパク質は、まったく発現および/または分泌されない。

発現させるのが難しいいくつかの場合において、ポリペプチドは、分泌される可溶性の不活性前駆体タンパク質として作製することができ、例えば、インビトロで、例えばタンパク質分解活性化によって後から成熟させることができる、プロテアーゼの場合のいわゆるチモーゲンとして、作製することができる。他の場合において、特定の宿主細胞にとって有害であるポリペプチドは、細胞内で不活性な不溶性タンパク質凝集体(封入体(IB))として発現させ、その後、インビトロでリフォールディングさせることができる。しかし、プロポリペプチドのプロセシングは、困難であるか、または全く不可能である場合がある。さらに、得られた成熟ポリペプチドは、すべての翻訳後修飾を含むとは限らない。

十分に発現されないポリペプチドの例は、NGF、BDNF、GDNF、およびNT-3のような神経栄養因子である(例えば、Xia, Ch.-F., J. Gene Med. 10 (2008) 306-315(非特許文献1); Boado, R. J., Pharm. Res. 24 (2007) 1772-1787(非特許文献2); Negro, A., et al., J. Neurochem. 62 (1994) 471-478(非特許文献3)を参照されたい)。

WO 2008/005847(特許文献2)では、組換え法によって第VIII因子タンパク質を作製する方法が報告されている。ペプチドが伸長されたグリコシル化ポリペプチドが、WO 02/02597(特許文献3)において報告されている。WO 2007/044323(特許文献4)では、血液脳関門送達のための融合タンパク質が報告されている。神経細胞成長調節物質(アムフィボディ(amphibody))が、WO 00/64482(特許文献5)において報告されている。WO 2012/087835(特許文献6)では、タンパク質フォールディングを促進するための組成物および方法が報告されている。TNFαを阻害する安定かつ可溶性の抗体が、WO 2006/131013(特許文献7)において報告されている。WO 00/23473(特許文献8)では、インターフェロン-β融合タンパク質および使用法が報告されている。

WO 2011/135040 WO 2008/005847 WO 02/02597 WO 2007/044323 WO 00/64482 WO 2012/087835 WO 2006/131013 WO 00/23473

Xia, Ch.-F., J. Gene Med. 10 (2008) 306-315 Boado, R. J., Pharm. Res. 24 (2007) 1772-1787 Negro, A., et al., J. Neurochem. 62 (1994) 471-478

組換えによって作製されるポリペプチドの作製工程を改良するための方法が、本明細書において報告される。

この改良とは、例えば、収量の増加、より頑強な作製工程、より単純な工程、および/または後処理の間の複雑さの軽減であり得る。

この改良は、ポリペプチドの生物物理学的および/もしくは生化学的特性ならびに/または生物学的機能を損なわずに実現されることに注目されなければならない。いくつかの場合において、これらの特性の内の1つまたは複数は、改善さえされる。

第1の局面において、1つまたは複数のグリコシル化部位を導入することによって、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの組換え作製を改良できることが判明したことが、本明細書において報告される。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異ポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-変異ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、ポリペプチドのアミノ酸配列は、(i)ポリペプチドと比べて変異ポリペプチドの等電点を低下させる、表面に位置するアミノ酸残基の1つもしくは複数の変異、および/または(ii)融合ポリペプチドの2つのポリペプチドを連結するリンカーペプチド、および/または(iii)ポリペプチドの等電点を低下させる、N末端もしくはC末端に融合されたタグを含むアミノ酸、によって改変されている、段階
-該細胞または培養培地から組換え変異ポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

したがって、以下の段階を含む、変異ポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法が、本明細書において報告される:
-変異ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)を培養する段階であって、ポリペプチドのアミノ酸配列は、1つまたは複数の人工グリコシル化部位を含むように改変されている、段階、
-該細胞または培養培地から変異組換えポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異ポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-ポリペプチドをコードする核酸を提供する段階、
-変異ポリペプチドをコードするように該核酸を改変する段階であって、ポリペプチドのアミノ酸配列は、1つまたは複数の人工グリコシル化部位を含むように改変されている、段階、
-真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)中に該核酸を導入する段階、
-該真核細胞を培養する段階、および
-該細胞または培養培地から変異組換えポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される方法は、例えば、哺乳動物細胞において十分に発現/分泌されないか、または全く発現/分泌されないポリペプチドに特に適している。

導入されるグリコシル化部位は、ポリペプチドそれ自体の中に、もしくは融合ポリペプチドの2つのポリペプチドを連結するリンカーペプチドの中のいずれかに(互いに無関係に配置されて)存在してよく、または導入されるグリコシル化部位は、特定のグリコシル化タグであってよい。

1つの態様において、ポリペプチドは、グリコシル化タグを含む。

1つの態様において、ポリペプチドは、人工グリコシル化部位を含む。1つの態様において、人工グリコシル化部位は、表面に局在するアミノ酸の点変異によって導入される。

第2の局面において、プロポリペプチド中の、プロセグメントと成熟ポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位を(ポリペプチドの由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位または人工のプロテアーゼ切断部位で置換することによって、成熟ポリペプチドの収量を改善できることが判明したことが、本明細書において報告される。この変更により、プロポリペプチドを成熟型にするプロセシングが改良される。

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異プロポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-ポリペプチドをプロポリペプチド(プロセグメントとポリペプチドの融合ポリペプチド)としてコードする核酸を含む真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)を培養する段階であって、プロセグメントとポリペプチドの間の内在性酵素切断部位は外来性プロテアーゼ切断部位で置換されている、段階、
-該細胞または培養培地から組換え変異ポリペプチドまたは変異プロポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異プロポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-ポリペプチドをプロポリペプチド(プロセグメントとポリペプチドの融合ポリペプチド)としてコードする核酸を提供する段階、
-変異プロポリペプチドをコードするように該核酸を改変する段階であって、プロセグメントとポリペプチドの間の内在性酵素切断部位は外来性プロテアーゼ切断部位で置換される、段階、
-真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)中に該核酸を導入する段階、
-該真核細胞を培養する段階、および
-該細胞または培養培地から組換え変異ポリペプチドまたは変異プロポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

1つの態様において、外来性プロテアーゼ切断部位は、プラスミン切断部位、フューリン切断部位、IgAプロテアーゼ切断部位、TEVプロテアーゼ切断部位(タバコエッチ病ウイルス(Tobacco Etch Virus))、グランザイムB切断部位、トロンビン切断部位、第10因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、サブチリシン切断部位、カテプシン切断部位、メタロプロテイナーゼ切断部位、IDESプロテアーゼ切断部位、PreScissionプロテアーゼ切断部位、またはそれらの機能的変異体を含む群より選択される。1つの態様において、外来性プロテアーゼ切断部位は、IgAプロテアーゼ切断部位である。

1つの態様において、プロポリペプチドの切断は、培養培地中で行われる。1つの態様において、外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができる外来性プロテアーゼが、培養培地に添加される。1つの態様において、添加は、培養段階の間に行われる。1つの態様において、添加は、培養段階の後に行われる。

1つの態様において、外来性プロテアーゼは、プロポリペプチドを発現する細胞によって同時発現される。

1つの態様において、培養は、プロポリペプチドを発現する細胞および外来性プロテアーゼを発現する細胞の共培養である。

1つの態様において、切断は、培養培地から細胞を分離した後に行われる。1つの態様において、切断は、後処理の間に行われる。1つの態様において、切断はクロマトグラフィーカラム上で行われる。

第3の局面において、ポリペプチドの等電点を低下させることにより、哺乳動物細胞におけるそのポリペプチドの組換え作製を改良できることが判明したことが、本明細書において報告される。

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異ポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-変異ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)を培養する段階であって、ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチドと比べて変異ポリペプチドの等電点を低下させる、表面に位置するアミノ酸残基の1つまたは複数の変異によって改変されている、段階、
-該細胞または培養培地から組換え変異ポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異ポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-ポリペプチドをコードする核酸を提供する段階、
-変異ポリペプチドをコードするように該核酸を改変する段階であって、ポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチドと比べて変異ポリペプチドの等電点を低下させる、表面に位置するアミノ酸残基の1つまたは複数の変異によって改変されている、段階、
-真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)中に該核酸を導入する段階、
-該真核細胞を培養する段階、および
-該細胞または培養培地から組換え変異ポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

1つの態様において、ポリペプチドは、9を上回る等電点(高等電点、塩基性等電点)を有し、変異ポリペプチドは、(親/野生型)ポリペプチドと比べてpH単位で0.5以上低い(酸性寄りの)等電点を有する。

1つの態様において、ポリペプチドは、ニューロトロフィン/神経栄養因子である。

1つの態様において、等電点は、負に荷電した部分を導入することによって低下させる。

1つの態様において、負に荷電した部分は、リンカーペプチドである。

1つの態様において、負に荷電した部分は、表面に局在するアミノ酸残基である。1つの態様において、1つまたは複数の塩基性アミノ酸残基が、中性親水性アミノ酸残基および/もしくは酸性アミノ酸残基またはそれらの組合せによって置換される。

第4の局面において、リンカーペプチドの長さおよび連結性を調整することにより、例えば哺乳動物細胞のような真核細胞における融合ポリペプチドの組換え作製を改良できることが判明したことが、本明細書において報告される。

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、(組換え)融合ポリペプチドを作製するための方法である:
-融合ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)を培養する段階、
-該細胞または培養培地から(組換え)融合ポリペプチドを回収し、それによって、(組換え)融合ポリペプチドを作製する段階。

1つの態様において、融合ポリペプチドの一方の部分はニューロトロフィンであり、融合ポリペプチドのもう一方の部分は、抗体または抗体断片である。

第5の局面において、
(i)1つもしくは複数のグリコシル化部位を導入することによって、かつ/または
(ii)プロポリペプチド中の、プロセグメントとポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位を(融合ポリペプチドの各部分の由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位もしくは人工のプロテアーゼ切断部位で置換することによって、かつ/または
(iii)ポリペプチドの等電点を低下させることによって、かつ/または
(iv)リンカーペプチドの長さ、連結性、および電荷を調整することによって、
哺乳動物細胞におけるポリペプチドの組換え作製を改良できることが判明したことが、本明細書において報告される。

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、(組換え)(融合)ポリペプチドを作製するための方法である:
-変異(融合)ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)を培養する段階であって、(融合)ポリペプチドのアミノ酸配列は、
(i)1つもしくは複数の人工グリコシル化部位を導入することによって、かつ/または
(ii)プロ(融合)ポリペプチド中の、プロセグメントと(融合)ポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位を(融合ポリペプチドの各部分の由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位もしくは人工のプロテアーゼ切断部位で置換することによって、かつ/または
(iii)(融合)ポリペプチドの等電点を低下させることによって、かつ/または
(iv)リンカーペプチドの長さを調整すること、リンカーの連結性を調整すること、リンカーの電荷を調整すること、表面に位置するアミノ酸残基の1つもしくは複数の変異を導入して(融合)ポリペプチドの等電点を低下させること、の内の1つもしくは複数によって、
改変されている、段階、
-該細胞または培養培地から(融合)ポリペプチドまたは(融合)プロポリペプチドを回収し、それによって、(組換え)(融合)ポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、(組換え)融合ポリペプチドを作製するための方法である:
-融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する段階、
-変異融合ポリペプチドをコードするように該核酸を改変する段階であって、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、リンカーペプチドの長さを調整すること、リンカーの連結性を調整すること、リンカーの電荷を調整すること、表面に位置するアミノ酸残基の1つまたは複数の変異を導入して融合ポリペプチドの等電点を低下させることによって改変される、段階、
-真核細胞(1つの態様において、哺乳動物細胞)中に該核酸を導入する段階、
-該真核細胞を培養する段階、および
-該細胞または培養培地から(組換え)変異融合ポリペプチドを回収し、それによって、(組換え)融合ポリペプチドを作製する段階。

前述の局面の1つの態様において、融合ポリペプチドは、生物学的に活性な実体と、リンカーペプチドと、血液脳関門(BBB)受容体に結合する一価の結合実体とを含む。

1つの態様において、血液脳関門受容体は、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質(LRP)/α2-マクログロブリン受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8(アポリポタンパク質E受容体2(ApoER2)としても公知)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(α-2-マクログロブリン受容体(A2MR)としても公知)、およびヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子からなる群より選択される。

1つの態様において、リンカーペプチドは、負に荷電した1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。1つの態様において、リンカーペプチドは、負に荷電した2つ以上のアミノ酸残基を含む。1つの態様において、リンカーペプチドは、負に荷電した2つ、または3つ、または4つ、または5つのアミノ酸残基を含む。

1つの態様において、生物学的に活性な実体は、神経栄養因子である。1つの態様において、神経栄養因子は、脳由来神経栄養因子(BDNF)である。

1つの態様において、一価の結合実体は、血液脳関門受容体に結合し、好ましくは、scFv、Fv、scFab、Fab、VHHより選択される一価の抗体断片である。

1つの態様において、融合ポリペプチドは、直接的にまたはリンカーペプチドを介して互いにコンジュゲートされた、第1の部分としてのヒト脳由来神経栄養因子および第2の部分としての単一の抗トランスフェリン受容体抗体FabまたはscFvを含む、単鎖融合ポリペプチドである。

本明細書において報告される1つの局面は、以下を含む融合ポリペプチドである:
-厳密に1つの野生型神経栄養因子ポリペプチド、もしくは神経栄養因子変異体ポリペプチド、または神経栄養因子活性を有するその断片、
-結合ドメイン、および
-神経栄養因子ポリペプチドと抗体断片の間のリンカーペプチド。

本明細書において報告される1つの局面は、以下を含む、神経栄養因子活性を有する融合ポリペプチド(例えば、二量体の複合体)である:
-厳密に1種類の野生型神経栄養因子ポリペプチド、もしくは神経栄養因子変異体ポリペプチド、または神経栄養因子活性を有するその断片、
-結合ドメイン、および
-神経栄養因子ポリペプチドと抗体断片の間のリンカーペプチド。

1つの態様において、結合ドメインは、抗体断片結合部位である。1つの態様において、結合ドメインは、抗体結合部位を含む抗体断片である。1つの態様において、抗体断片は、血液脳関門受容体に特異的に結合する。1つの態様において、抗体断片は、scFv、Fv、scFab、Fab、VHHを含む群より選択される一価の抗体断片である。

1つの態様において、融合ポリペプチドは、BBB受容体に結合しない、第2の一価または二価の結合実体を含む。

本明細書において報告される1つの局面は、以下を含む複合体である:
-第1の構成要素としての、本明細書において報告される融合ポリペプチド、および
-第2の構成要素としての、野生型神経栄養因子ポリペプチド、もしくは神経栄養因子変異体ポリペプチド、または神経栄養因子活性を有するその断片。

本明細書において報告される1つの局面は、以下を含む、神経栄養因子活性を有する多量体複合体である:
-第1の構成要素としての、本明細書において報告される融合ポリペプチド、および
-第2の構成要素としての、野生型神経栄養因子ポリペプチド、もしくは神経栄養因子変異体ポリペプチド、または神経栄養因子活性を有するその断片。

1つの態様において、複合体は、二量体複合体である。

全局面の1つの態様において、神経栄養因子は、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン3(NT-3)、およびニューロトロフィン4(NT-4)より選択される。1つの好ましい態様において、神経栄養成長因子はBDNFである。

本明細書において報告されるアミノ酸配列はすべて、本発明の具体的な局面である。
[本発明1001]
以下の段階を含む、変異プロポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法:
-ポリペプチドをプロポリペプチド(プロセグメントと該ポリペプチドの融合ポリペプチド)としてコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、該プロセグメントと該ポリペプチドの間の内在性酵素切断部位が外来性プロテアーゼ切断部位で置換されている、段階、
-該細胞または培養培地から組換え変異ポリペプチドまたは変異プロポリペプチドを回収し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。
[本発明1002]
外来性プロテアーゼ切断部位が、プラスミン切断部位、フューリン切断部位、IgAプロテアーゼ切断部位、TEVプロテアーゼ切断部位(タバコエッチ病ウイルス(Tobacco Etch Virus))、グランザイムB切断部位、トロンビン切断部位、第10因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、サブチリシン切断部位、カテプシン切断部位、メタロプロテイナーゼ切断部位、IDESプロテアーゼ切断部位、PreScissionプロテアーゼ切断部位、またはそれらの機能的変異体を含む群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
プロポリペプチドの切断が、ポリペプチドの精製中に行われる、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
外来性プロテアーゼがIgAプロテアーゼである、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
以下の段階を含む、融合ポリペプチドを作製するための方法:
-変異融合ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、該融合ポリペプチドのアミノ酸配列が、プロ融合ポリペプチド中の、プロセグメントと該融合ポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位を(融合ポリペプチドの各部分の由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位または人工のプロテアーゼ切断部位で置換することによって改変されている、段階、
-該細胞または培養培地から融合ポリペプチドまたはプロ融合ポリペプチドを回収し、それによって、(組換え)融合ポリペプチドを作製する段階。
[本発明1006]
融合ポリペプチドが、生物学的に活性な実体と、リンカーペプチドと、血液脳関門(BBB)受容体に結合する一価の結合実体とを含むことを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
リンカーペプチドが、負に荷電した1つまたは複数のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、本発明1006の方法。
[本発明1008]
ポリペプチドが神経栄養因子であることを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかの方法。

細胞培養期間中のBDNF変異体の安定性。大腸菌(E. coli)において作製した野生型BDNF(A)およびHEK293細胞における一過性発現によって作製したmycタグ付きBDNF(B)を、HEK293細胞の増殖培養物に添加し(10μg/ml)、還元型SDS PAGEおよび染色/可視化用に抗BDNF抗体を用いるウェスタンブロット解析によって、試料中のBDNF濃度を0日目および4日目に測定した;レーン1:Peprotechから入手した参照材料(大腸菌);レーン2:分子量マーカー;簡単にするために、ウェスタンブロットは切断され、再び合わせられた。発現/分泌されたBDNF変異体ポリペプチドを含む細胞培養上清のSDS PAGE/ウェスタンブロット解析;レーン1:分子量マーカー;レーン2:表9の1行目;レーン3:表9の5行目;レーン4:表9の2行目;レーン5:表9の4行目;レーン6:表9の3行目;レーン7=mBDNF参照;簡単にするために、ウェスタンブロットは切断され、再び合わせられた。発現/分泌されたBDNF変異体ポリペプチドを含む細胞培養上清のSDS PAGE/ウェスタンブロット解析;レーン1:分子量マーカー;レーン2:表6の1行目(グリコシル化されたプロBDNF);レーン3:表6の2行目(プロBDNF);レーン4:表6の3行目(グリコシル化された成熟BDNF);レーン5:表6の4行目(成熟BDNF)。表11の発現/分泌されたBDNF変異体ポリペプチドを含む細胞培養上清のSDS PAGE/ウェスタンブロット解析;レーンA:表11の1行目;レーンB:表11の2行目;レーンC:表11の3行目;レーンD:表11の4行目;レーンE:表11の5行目;レーンF:表11の6行目;星印は、異なる発現条件が使用されたことを示す。

発明の詳細な説明
哺乳動物細胞における組換えによって作製されるポリペプチドの発現量が低い理由は、公知ではないことが多く、通常、明らかにすることは容易ではない。

ある種のポリペプチドは、発現されると宿主細胞の機能を妨害する場合がある。これは、例えば、不正確な細胞位置への誤った局在化または間違った空間的(例えば、細胞型)状況および/もしくは時間的(例えば、細胞周期に依存する)状況での発現であり得る。さらに、ポリペプチドの組換え発現および分泌が増加すると、その結果、望ましくない状態のタンパク質フォールディングが起こって、例えば、タンパク質の凝集および/または細胞のストレス応答が起こり得る。結論として、ポリペプチドの組換え発現は、困難であるか(例えば、低い発現量をもたらす)または特定の宿主細胞においては不可能でさえあり得る。

本明細書において報告される方法を、具体的なポリペプチド、融合ポリペプチド、および抗体融合ポリペプチドを用いて、以下に例示する。これらの分子は、例として使用するにすぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

神経栄養性タンパク質は、高い治療的関心が持たれている対象であると考えられている。例えば、脳由来神経栄養因子(BDNF)は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および周産期の白質の疾患、ダウン症候群および自閉症/レット症候群、統合失調症、うつ病、摂食障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脊髄損傷のような神経損傷、ならびに他の疾患の症状を治癒させるか、または緩和することが示唆されている(Apfel, S.C., Clin. Chem. Lab Med. 39 (2001) 351-355; Nagahara, A. H. and Tuszynski, M. H., Nat. Rev. Drug Discov. 10 (2011) 209-219; Zuccato, C. and Cattaneo, E., Nature Reviews Neurology 5 (2009) 311-322; Thoenen, H. and Sendtner, M., Nature Neuroscience Supplement 5 (2002) 1046-1050; Gharami, K., et al., J. Neurochem. 105 (2008) 369-379)。

ヒト体内では、神経栄養性タンパク質は存在量が非常に少なく、多くの場合、非常に複雑な微小環境に位置する特殊な細胞型によって発現される(例えば、Greenberg, M. E., et al., J. Neurosci. 29 (2009) 12764-12767を参照されたい)。その天然の機能と一致して、このようなポリペプチドを組換えによって大規模生産するのに典型的に使用される(CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、およびHEK細胞のような)真核細胞におけるニューロトロフィンの発現レベルは、非常に低い(Acklin, C., et al., Int. J. Pept. Protein Res. 41 (1993) 548-552)。

I. N-グリコシル化部位の導入による、発現の改善
本明細書において報告される1つの局面は、1つまたは複数の(人工)グリコシル化部位が、ポリペプチドの組換え作製のために、ポリペプチド中に導入されることである。1つまたは複数の(人工)グリコシル化部位を導入することによって、真核細胞、特に哺乳動物細胞におけるポリペプチドの組換え作製を改良することができる。この方法は、例えば、哺乳動物細胞において十分に発現/分泌されないか、または全く発現/分泌されないポリペプチドに特に適している。導入されるグリコシル化部位は、ポリペプチドそれ自体の中に、もしくは融合ポリペプチドの2つのポリペプチドを連結するリンカーペプチドの中のいずれかに存在してよく、または導入されるグリコシル化部位は、特定のグリコシル化タグであってよい。表面に局在するアミノ酸の点変異によってグリコシル化部位を導入して(人工)N-グリコシル化モチーフを作製することが、特に有利である。

例:抗体部分およびGFPを含む融合ポリペプチド
抗体およびGFP部分を含む例示的な融合ポリペプチドを構築した。

GlySerリンカー

を用いて、(i)eGFP部分(高感度緑色蛍光タンパク質; SEQ ID NO: 02)、または(ii)emGFP部分(エメラルドグリーン蛍光タンパク質; SEQ ID NO: 03)、または(iii)tagGFP部分(SEQ ID NO: 04)のいずれかを、サブクラスIgG1の抗IGF-1R抗体(HC: SEQ ID NO: 05; LC: SEQ ID NO: 06)の重鎖(HC)のC末端に融合した。これらの異なる重鎖融合物は、SEQ ID NO: 07、08、および09のアミノ酸配列を有している。

一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞の細胞培養上清における抗体融合ポリペプチドの分泌は、ウェスタンブロット法および/またはプロテインAに基づく高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アッセイ法によって検出することが全くできなかった。また、生物学的に活性なGFPを、その生物発光特性(GFP固有の蛍光)に基づいてモニターすることもできなかった。しかし、ウェスタンブロット解析によって、細胞沈殿物画分中に融合ポリペプチドを検出することはできた。これらの結果を下記の表に示す。

＜1μg/ml=検出限界未満

この理論に縛られるわけではないが、GFPは、(弱い)二量体を形成する傾向のある細胞質内の単量体タンパク質である。したがって、野生型GFPは、「天然から」(天然のオワンクラゲ(Aequorea Victoria)クラゲ細胞から)分泌されないものであり、したがって、GFP分子は、哺乳動物細胞の分泌の仕組みと適合しないため、分泌に適するようにしなければならない。

分泌されるGFPを含む融合ポリペプチドを提供するために、網膜の光受容細胞中に存在するヒト感光性膜結合型Gタンパク質共役型オプシン受容体に由来するポリペプチドを、融合ポリペプチド中に、すなわちグリコシル化タグとしてさらに含めた。このグリコシル化タグを用いて、追加の(人工)N-グリコシル化部位を、融合ポリペプチドに導入する。

オプシン受容体に由来するポリペプチドを、直接的に、すなわち、介在するリンカーペプチドなしで、GFP部分のC末端に融合した。オプシンに由来するポリペプチド

は、2つのNグリコシル化部位モチーフ、すなわちNGTモチーフおよびNATモチーフ(一般的なNグリコシル化部位モチーフ:NxS/T;Asn、続いてPro以外の任意のアミノ酸、続いてSerまたはThrのいずれか)を含む。HEK293細胞におけるオプシングリコシル化タグ(SEQ ID NO: 11)を含む融合ポリペプチドの一過性発現により、融合ポリペプチドが分泌された。これらの結果を下記の表に示す。

＜1μg/ml=検出限界未満

SDS-PAGE解析(バンドのブロードニング)から、分泌された融合ポリペプチドが、付加的な糖を含むことを確認することができる。

抗体-GFP-オプシンタグ融合ポリペプチドを、2段階の手順、具体的には、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって、精製した。融合ポリペプチド内の抗体部分の機能性を、表面プラズモン共鳴(BIAcore)を用いてIGF-1R受容体タンパク質への結合に基づいて、かつFACSおよび/または共焦点顕微鏡観察により、IGF-1Rを過剰発現する細胞における受容体を介したエンドサイトーシスによる細胞中への内部移行に基づいて、実証した。GFP部分の機能性は、緑色蛍光の特徴によって示された。

例:神経栄養性タンパク質
例示的な神経栄養性タンパク質は、脳由来神経栄養因子(BDNF)である。

i)グリコシル化タグ
GSGリンカーを介して融合されたC末端T7-His6タグ

を含むヒト野生型プレプロBDNFを、HEK239細胞において発現させた(プレプロBDNF-T7-His6; SEQ ID NO: 13)。成熟BDNFのアミノ酸配列は、N-グリコシル化部位モチーフを含まず、したがって、N-グリコシル化されていない。成熟BDNFは、わずか数μg/mlという低収量で得られる。遺伝子コドン使用頻度の最適化によっても、潜在的なプロテアーゼ切断部位(プレプロBDNF(-RGR)-T7-His6)の除去によっても、十分に発現される抗体のシグナル配列

でネイティブのBDNFシグナル配列を交換することによっても、BDNFプレプロセグメントをNGFのプレプロセグメントで交換することによっても、低発現量を改善することができなかった。これらの結果を下記の表に示す(成熟BDNFの濃度に対して標準化した)。

BDNFの(分泌)収量を改善するために、様々な長さのオプシングリコシル化タグ：
16アミノ酸残基

、19アミノ酸残基

、および20アミノ酸残基

を用いて、(人工)グリコシル化部位をBDNF分子中に導入した。この改変を用いて、(成熟BDNFの濃度に対して標準化した)発現量を改善することができた。これらの結果を下記の表に示す(成熟BDNFの濃度に対して標準化した)。

^*:定量の線形範囲を超えた

驚くべきことに、グリコシル化タグを含むBDNF変異体は、ネイティブのグリコシル化されていないBDNFと比べた場合(CHO-TrkB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法)、生物活性も向上していた。これらの結果を下記の表に示す。

さらなるグリコシル化タグ候補は、

(1つのN-グリコシル化部位モチーフ; SEQ ID NO: 17)、

(2つのN-グリコシル化部位モチーフ; SEQ ID NO: 18)、および

(2つのN-グリコシル化部位モチーフ; SEQ ID NO: 19)である。

ii)導入されるN-グリコシル化部位モチーフ
BDNFの(分泌)収量を改善するために、人工のN-グリコシル化部位をBDNFアミノ酸配列中に導入した。人工のN-グリコシル化部位は、例えば、BDNFアミノ酸配列に対する点変異によって導入することができる(N-グリコシル化部位モチーフ:Asn-Xxx-Ser/Thr;XxxはPro以外の任意のアミノ酸)。対応するコード核酸配列を調製し、HEK293細胞において一過性に発現させた。変異の番号付けは、成熟BDNF(SEQ ID NO: 25)のアミノ酸配列に基づいている。分泌されたBDNF変異体を、発現/分泌レベルについて、N-グリコシル化の程度について(イムノブロッティング解析により、(グリコシル化されていない参照BDNFと比べた場合に)、導入し使用したN-グリコシル化部位1つにつきMWが約3〜5kDa増加したバンドとしての移動から推定した)、かつCHO-TrkB-ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ法により機能性/受容体結合について、解析した。これらの結果を下記の表(成熟BDNFの濃度に対して標準化した発現量および生物活性)および図3に示す。

n.d.:未測定
-:グリコシル化なし
+:部分的なグリコシル化
++:十分なグリコシル化

n.d.:未測定
-:グリコシル化なし
+:部分的なグリコシル化
++:十分なグリコシル化
活性;大腸菌において発現され、リフォールディングされ、精製された、グリコシル化されていない成熟した野生型BDNFの活性に匹敵するBDNF活性
不活性:活性が測定されなかった

また、グリコシル化されたBDNF変異体の機能性/生物活性を後根神経節(DRG)アッセイ法においても示した。DRGアッセイ法で測定された活性は、グリコシル化されていない野生型BDNFに匹敵していた。

II. 酵素切断部位の改変による発現の改善
しばしば、分泌ポリペプチドは、プレプロ-ポリペプチドとして合成される。プレセグメントは、いわゆるシグナル配列に相当する。プロセグメントは、例えば、タンパク質フォールディング、特定の細胞区画への(例えばリソソームへの)細胞ターゲティング/輸送、または細胞内での輸送時および貯蔵時もしくは細胞外輸送(例えば、培地中への分泌)時の成熟タンパク質の不活性化のために必要とされる場合がある。プレセグメントおよびプロセグメントは、成熟ポリペプチドの生物活性のためには必要ではない。プロセグメントが正しくプロセシングされない、すなわち、(プレ)プロセグメントが、例えば産生/分泌細胞中で成熟タンパク質から切断されない場合、そのために成熟ポリペプチドの生物物理学的活性、生化学的活性、および/または生物学的活性が変化する場合がある。

下記に報告する方法は、酵素的切断によってプロポリペプチドからインビボで産生されるポリペプチドに適している。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、変異プロポリペプチドを用いてプロポリペプチドから組換えポリペプチドを作製するための方法である:
-プロポリペプチド(プロセグメントとポリペプチドの融合ポリペプチド)をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、プロセグメントとポリペプチドの間の内在性酵素切断部位は外来性プロテアーゼ切断部位で置換されている、段階、
-該細胞または培養培地から組換え変異プロポリペプチドを回収し、そのプロポリペプチドを切断し、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面は、以下の段階を含む、プロ融合ポリペプチドから融合ポリペプチドを作製するための方法である:
-変異プロ融合ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、該プロ融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、ネイティブのプロ融合ポリペプチド中の、プロセグメントと融合ポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位を(融合ポリペプチドの各部分の由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位または人工のプロテアーゼ切断部位で置換することによって改変されている、段階、
-該細胞または培養培地からプロ融合ポリペプチドを回収し、プロ融合ポリペプチドを切断し、それによって、(組換え)融合ポリペプチドを作製する段階。

本明細書において報告される1つの局面において、プロポリペプチド中の、プロセグメントと成熟ポリペプチドの間のプロテアーゼ切断部位は、(ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの各部分の由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位または人工のプロテアーゼ切断部位で置換される。

この文脈で使用される「内在性プロテアーゼ切断部位」という用語は、プロセグメントと成熟ポリペプチドの間に天然に存在するプロテアーゼ切断部位を意味する。

この文脈で使用される「外来性プロテアーゼ切断部位」という用語は、プロセグメントと成熟ポリペプチドの間に天然には存在しないプロテアーゼ切断部位を意味する。

内在性プロテアーゼ切断部位を外来性プロテアーゼ切断部位に変更することによって、分泌されたプロポリペプチドを成熟型にするプロセシングおよび切断を改良することができる。

外来性プロテアーゼ切断部位は、そのプロテアーゼが、プロポリペプチドの由来元である、すなわち、プロポリペプチドが(部分的にまたは全面的に)自然界で存在する場である細胞において存在しない/発現されない限り、任意のプロテアーゼに由来してよい。

(ポリペプチドの由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位は、任意の外来性プロテアーゼ切断部位、例えば、IgAプロテアーゼ切断部位、TEVプロテアーゼ切断部位(タバコエッチ病ウイルス)、グランザイムB切断部位、トロンビン切断部位、第10因子切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、サブチリシン切断部位、カテプシン切断部位、メタロプロテイナーゼ切断部位、IDESプロテアーゼ切断部位、PreScissionプロテアーゼ切断部位、またはそれらの機能的変異体であってよい。

プロポリペプチドの切断は、ポリペプチドの組換え作製期間中の様々な時点で起こってよい。

プロポリペプチドの切断は、培養培地中で起こってよい。本明細書において、(プロポリペプチドの切断を行う)外来性プロテアーゼは、培養培地に添加されるか、または(プロポリペプチドの切断を行う)外来性プロテアーゼは、培養培地中で同時発現される。

細胞から分離した後、例えば、後処理の前、間、または後(ただし、培養後)に、プロポリペプチドを切断することもまた、可能である。

1つの好ましい態様において、外来性プロテアーゼ切断部位は、プロポリペプチドおよびプロポリペプチドを発現する組換え細胞とは異なる生物に由来する。これには、プロポリペプチドがプロセシングされる時点を定めることができるという利点がある。変異プロポリペプチドを発現する細胞が外来性プロテアーゼを同時発現せず、かつ外来性プロテアーゼが培養培地に添加されない場合、切断は、それぞれ、変異プロポリペプチドを発現する細胞によっても培養期間中にも、もはや行われることができない。

1つの態様において、プロポリペプチドの切断は、精製中に行われる。

1つの態様において、プロポリペプチドの切断は、精製工程の間にカラム上で行われる。1つの特定の態様において、カラムはアフィニティーカラムである。

1つの好ましい態様において、プロポリペプチドの切断は、プロポリペプチドを培養培地から分離した後に、プロポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベートすることによって行われる。1つの態様において、インキュベートする段階は、最初の(クロマトグラフィー)精製段階の後に行われる。1つの態様において、インキュベートする段階は、カラム上で実施される。

また、この技術により、例えば、精製を改良/単純化するために、人工精製タグ、例えば、His6タグ、mycタグ、HAタグ、またはビオチン/アビジンタグをプロセグメント内部に含めることも可能になる。

1つの態様において、プロポリペプチドは、プロセグメントおよび成熟ポリペプチドを含み、そのプロセグメントは精製タグを含む。1つの態様において、精製タグは、His6タグ、mycタグ、HAタグ、およびビオチン/アビジンタグを含む精製タグの群より選択される。

1つの態様において、精製タグを含むプロポリペプチドの切断は、精製タグを用いる精製段階の後に行われる。

いずれの場合も、成熟ポリペプチドからのプロセグメントの切断は、患者に成熟ポリペプチドを投与する前に行われる。1つの態様において、切断はインビトロで行われる。

1つの好ましい態様において、内在性プロテアーゼ切断部位は、IgAプロテアーゼ切断部位であり、精製タグは、ヘキサヒスチジン(His6)タグである。1つの態様において、ヘキサヒスチジンタグは、GSGペプチドを介してプロテアーゼ切断部位にコンジュゲートされる。

例:BDNFプロポリペプチド内部に外来性プロテアーゼ切断部位を有するプレプロBDNF変異体
(プレ)プロポリペプチドとして発現され、切断されて成熟型となる例示的なポリペプチドは、BDNFである。

野生型ヒトBDNFをHEK293細胞において発現させた。ポリペプチドのプロセシングの間(すなわち、発現/組換え作製の間)、プロセグメントは、宿主細胞のプロテアーゼによって部分的にしか除去されず、その結果、成熟BDNFとプロセシングされていないプロBDNFとの混合物が生じた。ヒトプロBDNFは、主に分泌性プロタンパク質転換酵素フューリンによって、分泌時に宿主細胞内でプロセシングされる。

天然に存在するフューリンプロテアーゼ切断部位が外来性のIgAプロテアーゼ切断部位によって置換されているプロBDNF変異体を、人工的に作製した。IgAプロテアーゼは、アミノ酸配列N-X-Z-Pro-Pro/-Y-Pro-C(X=好ましくはProまたはSer;Y=Thr、Ser、またはAla;Z=好ましくはArgまたはThr)を含むタンパク質を認識し、切断する。プロBDNFポリペプチドのアミノ酸配列は、フューリン切断部位(RVRR;SEQ ID NO: 21)を含む。フューリン切断部位をIgAプロテアーゼ切断部位

によって置換した。さらに、GSGリンカーペプチドを介してBDNFのC末端にHis6タグを融合した(HHHHHH;アフィニティー精製のために使用される;SEQ ID NO: 23)。さらに、潜在的なプロテアーゼ切断部位を除去した(C末端アミノ酸配列RGRの欠失;SEQ ID NO: 24)。比較される変異体では、R54A変異をBDNFのプロポリペプチド中に導入し(プレプロBDNFポリペプチドは、アミノ酸54位にArgの代わりにアミノ酸残基Alaを有する)、および/またはHis6タグの代わりにT7-His6タグを使用した。これらの結果を下記の表に示す(成熟BDNFの濃度に対して標準化した生物活性)。

R54A変異の番号付けは、野生型プレプロBDNF (SEQ ID NO: 20)のアミノ酸配列に基づいている。

操作されたプレプロBDNFポリペプチドは、HEK293細胞において高収量で発現された。分泌された操作されたプロBDNFポリペプチドを、IgAプロテアーゼを用いて切断することによって、成熟したネイティブBDNFへとインビトロで効率的に変換した。

したがって、天然のフューリン/PC転換酵素切断部位を含むネイティブのプレプロBDNFポリペプチドの発現とは対照的に、外来性のIgAプロテアーゼ切断部位を含む操作されたプロBDNFポリペプチドは、単一の発現産物として得られた。さらに、改善した発現量が得られた。さらに、操作されたプロBDNFポリペプチドから得られた成熟BDNFポリペプチドは、TrkBルシフェラーゼレポーター細胞アッセイ法において、野生型プレプロBDNFから得られた成熟BDNFポリペプチドと比べて生物活性が向上している。

例:BDNFプロポリペプチド内部に外来性プロテアーゼ切断部位および人工的に作製された精製タグを有するプレプロBDNF変異体
アフィニティータグは、組換えによって作製されるポリペプチドの単純かつ効率的な精製のために非常に有用である。しかし、最終的な治療用タンパク質中に残存する人工精製タグは、潜在的な免疫原性、生物物理学的特性および生化学的特性ならびに生物学的活性の変化を含むいくつかの理由が原因で、臨床使用には許容されていない。これらの制約を克服するために、除去可能な精製タグが有益である。

1つの態様において、(BDNF)プロポリペプチドは、精製タグを含む。

His6タグがプロポリペプチド中に導入されているプロBDNF変異体を、人工的に作製した。さらに、天然に存在するフューリンプロテアーゼ切断部位を、外来性のIgAプロテアーゼ切断部位によって置換し、かつ/またはR54A変異をプロポリペプチド中に導入した。

比較される変異体では、GSGリンカーペプチドを介してBDNFのC末端にHis6タグを融合した。さらに、T7-His6タグをHis6タグの代わりに使用した。これらの結果を下記の表(成熟BDNFの濃度に対して標準化した生物活性)および図2に示す。

様々なプロBDNF変異体ポリペプチドから得られたBDNFポリペプチドの生物学的活性/機能性が、インビトロおよびインビボのアッセイ法を用いて確認された。IgAプロテアーゼ切断部位を含む構築物は、向上した活性を示す。

プロペプチドのN末端領域内に挿入される除去可能な精製タグ(例えばヘキサヒスチジンタグ)は、効率的な精製のために使用することができ、インビトロのタンパク質成熟化の間に切断除去される。そのため、インビボ投与に使用される成熟ポリペプチド中に、潜在的な免疫原性ペプチド配列が保持されない。

III. 等電点を低下させることによる、発現の改善
塩基性の等電点(IEP)、すなわち、9を上回る等電点を有する一部のポリペプチド、例えば、ニューロトロフィンは、凝集体を形成する傾向がある。

本明細書において報告される1つの局面において、ポリペプチドの等電点の低下は、哺乳動物細胞を用いて組換えによって作製されるポリペプチドの収量を増加させるのに使用される。この方法は、例えばニューロトロフィンのような9を上回る等電点(高等電点、塩基性等電点)を有するポリペプチドに特に適している。等電点の低下(低減)は、例えば、負に荷電したアミノ酸残基の導入および/またはリンカーペプチドのような負に荷電した部分への融合によって、ポリペプチド中の負電荷の数を増加させることによって実現することができる。あるいは、IEPの低下は、例えば、ポリペプチド表面に負に荷電したアミノ酸残基を導入することにより、ポリペプチドの表面から正電荷を取り除くことによって実現することができる。これは、例えば、中性親水性アミノ酸残基および/もしくは酸性アミノ酸残基またはそれらの組合せによって、1つまたは複数の塩基性アミノ酸残基を置換することによって、実施することができる。

例:等電点を低下させたBDNF変異体
BDNFは、等電点が約10であり、厄介な塩基性/アルカリ性分子である(例えば、Leibrock, J., et al., Nature 341 (1989), 149-152を参照されたい)。

(分泌)収量を改善するために、分子の等電点を低下させるためにアミノ酸残基が変更されたBDNF変異体を人工的に作製した。さらに、GSGリンカーペプチドを介してBDNFのC末端にT7-His6タグを融合した。さらに、1つの比較される変異体では、潜在的なプロテアーゼ切断部位を除去した(C末端アミノ酸配列RGRの欠失; SEQ ID NO: 23)。第1の変異体において、次のアミノ酸変異を導入した:P60E、K65D、K73D、およびK95A。第2の変異体において、次のアミノ酸変異を導入した:K65D、K73D、K95A、およびR97A。IEP 値は、EMBOSS IEP法(Alan Bleasby (ajb (C) ebi.ac.uk); European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK)を用いて計算された。これらの結果を下記の表に示す(成熟BDNFの濃度に対して標準化した生物活性)。

^*:定量の線形範囲を超えた

野生型BDNFとは対照的に、IEPが低下した操作されたBDNF変異体は、一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞において、細胞培養培地/上清中で3〜6日間にわたって、安定に蓄積した。このことは、精製された成熟BDNF(大腸菌において作製)および精製されたIEP低下mycタグ付きBDNF変異体が、増殖中のHEK293宿主細胞培養物に添加される(BDNF濃度10μg/ml)、細胞培養研究によっても示された。4日間の細胞培養後、細胞培養上清中の残存BDNF濃度を還元SDS PAGEおよびウェスタンブロット解析によって測定した:成熟BDNFは4日後に細胞培養上清から完全に消失していたのに対し、mycタグ付きBDNF変異体は、ほぼ完全に安定していた(図1を参照されたい)。

IV. 様々な改変の組合せによる、発現の改善
本明細書において報告される1つの局面において、以下の改変の内の1つまたは複数が、ポリペプチドの組換え作製を改良するために加えられた/導入された:
(i)1つもしくは複数のグリコシル化部位の導入、ならびに/または
(ii)(ポリペプチドの由来に対して)外来性のプロテアーゼ切断部位もしくは人工のプロテアーゼ切断部位による、プロセグメントと成熟ポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位の置換、ならびに/または
(iii)ポリペプチドの等電点の低下、ならびに/または
(iv)リンカーペプチドの長さ、連結性、および電荷を調整することによる。

ポリペプチドの組換え作製をさらに改良するために、特定の態様において、前述した任意の2つ、任意の3つ、または4つすべての改変が、組み合わせて使用される。

BDNFのアミノ酸配列に、以下の改変の内の2つまたはそれ以上を加えた:
-1つまたは複数の人工のN-グリコシル化部位の導入、
-N-グリコシル化タグとしてのオプシンタグの導入、および
-外来性のIgAプロテアーゼ切断部位による、内在性フューリン切断部位の置換。

これらの結果を下記の表に示す(成熟BDNFの濃度に対して標準化した生物活性)。

図4から、追加のN-グリコシル化部位を有していないBDNF変異体(図4のレーンC、D、およびE)と比べて、1つまたは複数の追加のN-グリコシル化部位を含むBDNF変異体ポリペプチド(図4のレーンA、B、およびF)の発現量/分泌量が改善していることを認めることができる。

V. 血液脳関門を介して輸送される融合ポリペプチドの発現の改善
大型の生物学的治療薬の脳への透過は、神経血管単位(NVU)中の他の細胞構成要素に加えて広範囲かつ不透過性の血液脳関門(BBB)によって、厳しく制限されている。この障害を克服するための多くの戦略が試験されており、1つは、脳毛細血管内皮上で発現される内在性受容体によって媒介されるトランスサイトーシス経路を使用することである。受容体を介して生物学的治療物質を脳に送達するのを可能にするために、モノクローナル抗体またはポリペプチドなどの組換えタンパク質が、これらの受容体に対して設計されている。

生物学的治療物質は、中枢神経系(CNS)の病変の治療に関して、非常に大きな治療可能性を有している。しかし、脳中へのそれらの経路は、BBBによって妨げられている。以前の研究から、CNS区画に浸透できるのは、血流中に注入されたIgGのごくわずかな割合(約0.1％)であることが示されている(Felgenhauer, Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164)。生物学的治療物質のCNS内での濃度が低くなるため、これにより、任意の薬理学的効果が確実に制限されると考えられる。したがって、神経栄養因子に似た生物学的治療物質の脳中への輸送を媒介する、抗体断片を含む担体は、医学的ニーズが大きい。

したがって、エフェクター実体とBBB受容体に結合する一価または二価の結合実体とを含む融合ポリペプチドが、開発されている(例えば、EP 12182181.3を参照されたい)。

1つの態様において、一価の結合実体は、血液脳関門受容体に特異的に結合するか、または好ましくはscFv、Fv、scFab、Fab、およびVHHより選択される、血液脳関門受容体に特異的に結合する一価の抗体断片である。

1つの態様において、エフェクター実体は、BDNFのような神経栄養性ポリペプチドである。

1つの態様において、血液脳受容体は、トランスフェリン受容体、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質8、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1、およびヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子からなる群より選択される。

例:抗体部分とBDNFとを含む融合ポリペプチド
Boadoら(Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1376-1386)は、ヒトインスリン受容体を認識するキメラ抗体の重鎖のカルボキシル末端にヒトBDNFのアミノ末端が融合されている、抗体-BDNF融合ポリペプチドを報告している。しかし、この融合ポリペプチドの発現は、融合ポリペプチドが細胞内で凝集するため、不可能であった。

一般に、野生型BDNFまたはBDNF変異体は、そのC末端またはそのN末端のいずれかを介して抗体ポリペプチド鎖に融合され得る。BDNFはホモ二量体としてしか活性ではないため、生物学的に活性な抗体-BDNF融合ポリペプチドを人工的に作製するには、(i)BDNF部分のフォールディング、成熟化、および会合、ならびに(ii)抗体ポリペプチド鎖/ドメインのフォールディングおよび会合の両方が正確であることが必要となる。したがって、例えば、BDNFポリペプチドのN末端融合またはC末端融合と組み合わせた、2本の重鎖および軽鎖から構成される完全抗体、軽鎖および重鎖断片から構成される抗体Fab断片、単鎖Fab(scFab)または単鎖Fv(scFv)などの、異なる融合ポリペプチド形態(複合体)が可能である。さらに、融合ポリペプチド複合体は、例えば、BDNF-scFv融合ポリペプチドおよび成熟した(融合されていない)BDNFポリペプチド、BDNF-Fab(重鎖)融合ポリペプチドおよびBDNF-Fab(軽鎖)融合ポリペプチド、またはBDNF-Fab(重鎖)融合ポリペプチドおよびFab(軽鎖)融合ポリペプチドおよび成熟した(融合されていない)BDNFポリペプチドといった組合せのような、2つまたはそれ以上の異なるポリペプチド鎖を含んでもよい。さらに、BDNFポリペプチドは、直接的にまたはリンカーペプチドを介して、各抗体鎖ポリペプチドに融合され得る。リンカーペプチドは、(i)アミノ酸の数、(ii)アミノ酸の種類(例えば、負に荷電したアミノ酸および/または疎水性アミノ酸)、ならびに(iii)人工的に作製される推定上の翻訳後修飾モチーフ(例えば、N結合型グリコシル化部位モチーフ)が異なってよい。例えば、BDNFポリペプチドを、異なるリンカーペプチドを介して連結される異なる抗体断片(例えば、Fab、scFab、およびscFv)にコンジュゲートして、生物学的に活性な異なる融合ポリペプチドを得ることができる。

本明細書において報告される1つの局面は、以下を含む融合ポリペプチドである:
-厳密に1つの野生型BDNFポリペプチド、もしくはBDNF変異体ポリペプチド、またはBDNF活性を有するその断片、
-抗体断片、および
-BDNFポリペプチドと抗体断片の間のリンカーペプチド。

本明細書において報告される1つの局面は、以下を含む、BDNF活性を有する融合ポリペプチド(例えば二量体複合体)である:
-厳密に1つの種類の野生型BDNFポリペプチド、もしくはBDNF変異体ポリペプチド、またはBDNF活性を有するその断片、
-抗体断片、および
-BDNFポリペプチドと抗体断片の間のリンカーペプチド。

本明細書において報告される別の局面は、以下からなる二量体複合体である:
-第1の構成要素としての、本明細書において報告される融合ポリペプチド、および
-第2の構成要素としての、野生型BDNFポリペプチド、もしくはBDNF変異体ポリペプチド、またはBDNF活性を有するその断片。

リンカーペプチドを介して抗体断片に共有結合的に融合されている厳密に1つのBDNFポリペプチドおよび厳密に1つの融合されていないBDNFポリペプチドを含む形態の場合、BDNF-抗体融合形態のみが発現され、第2の融合されていないBDNFポリペプチドと複合体化して、生物学的に活性な形態に適切に会合されることが判明している。

さらに、負に荷電した1つまたは複数のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドを用いて、そのような構築物の発現をさらに改善できることも、判明している。

様々な融合ポリペプチド形態を、HEK293細胞において一過性に発現させた。ウェスタンブロット法および/またはプロテインAに基づく高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アッセイ法を用いて、解析を行った。これらの結果を下記の表に示す(成熟BDNFの濃度に対して標準化した生物活性)。

pp-BDNF=プレプロBDNF
n.a.=該当なし
n.d.=未測定
VL(I)=抗IGF-1R抗体の軽鎖可変ドメインのN末端に融合されたBDNF
VH(I)=抗IGF-1R Fab抗体断片の重鎖可変ドメインのN末端に融合されたBDNF
VL(II)=抗TfR抗体(抗トランスフェリン受容体抗体)の軽鎖可変ドメインのN末端に融合されたBDNF
VH(II)=抗TfR Fab抗体断片の重鎖可変ドメインのN末端に融合されたBDNF
なし-LC=BDNFが融合されていない、使用された重鎖と同起源の軽鎖抗体ポリペプチド鎖
scFv =抗IGF-1R抗体のscFvのN末端に融合されたBDNF
^*: Peprotechから入手した市販の材料
^**:大腸菌において組換えによって作製された

以下の実施例、配列、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に修正を加えてよいことが理解される。

組換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。

遺伝子合成
所望の遺伝子および遺伝子セグメントは、Geneart GmbH(Regensburg, Germany)において化学合成によって調製された。合成された遺伝子および遺伝子断片を、増殖/増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子および遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。

タンパク質測定
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製したポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。

基本的な/標準的な哺乳動物発現プラスミドの説明
ヒト胎児由来腎臓細胞(HEK293)の一過性トランスフェクションによって、所望の遺伝子/ポリペプチドを発現させた。所望の遺伝子/ポリペプチド(例えば、抗体-GFP融合ポリペプチド、野生型BDNF、BDNF変異体ポリペプチド、BDNF-Fab融合ポリペプチドおよびBDNF-scFv融合ポリペプチド)を発現させるために、以下の機能的エレメントを含む転写単位を使用した:
-イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-発現させようとする遺伝子、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。

発現させようとする所望の遺伝子を含む発現単位/カセットのほかに、基本的な/標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
-大腸菌においてこのプラスミドが複製するのを可能にするベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含む。

実施例1
抗体発現プラスミドの作製
a)親ヒト抗ヒトIGF-1R抗体のための抗体発現プラスミドの作製
ヒトのκ軽鎖可変領域(Vk)および重鎖可変領域(VH)をコードする遺伝子セグメントを、それぞれ、ヒトκ軽鎖定常領域(Ck)またはヒトγ-1重鎖定常領域(CH1-ヒンジ-CH2-CH3)をコードする遺伝子セグメントに連結した。両方の抗体鎖遺伝子を、それらの抗体遺伝子のゲノムエキソン-イントロン構造を含む2つの個別の発現プラスミドから発現させた。抗ヒトIGF-1R抗体の成熟した(シグナル配列無しの)重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 05およびSEQ ID NO: 06に示している。

抗体鎖の発現は、ヒト重鎖免疫グロブリン5'-非翻訳領域(5'-UTR)、マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、およびウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化シグナル(BGH pA)を含めて、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)に由来する短縮したイントロンA欠失最初期エンハンサーおよびプロモーターによって、制御される。発現プラスミドはまた、大腸菌(Escherichia coli)におけるプラスミド増幅のために、ベクターpUC18に由来する複製起点およびβ-ラクタマーゼ遺伝子も含む(Kopetzki, E., et al., Virol. J. 5 (2008) 56; Ji, C., et al., J. Biol. Chem. 284 (2009) 5175-5185を参照されたい)。

b)抗トランスフェリン受容体抗体軽鎖の発現プラスミドの作製
抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖を得るために、マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列

、ラット抗マウストランスフェリン受容体のVL可変ドメイン、およびヒトVκ軽鎖定常領域をコードする軽鎖遺伝子を、化学合成した。ラット抗体のVLドメインのアミノ酸配列は、Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258から得た。キメララット/ヒト抗トランスフェリン受容体抗体軽鎖のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 80に示している。

実施例2
抗体-GFP融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
a)抗IGF-1R抗体-GFP融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
抗ヒトIGF-1R抗体重鎖-GFP融合ポリペプチドのコード遺伝子はすべて、各GFP変異体ならびに2つのGly₄Serリピートからなるグリシン-セリンリンカーおよびさらなるGlyをコードする化学合成したDNA断片を、少し切断されたヒトγ-1重鎖定常領域(最後の天然アミノ酸Lysの除去)をコードする抗IGF-1R抗体重鎖遺伝子の3'末端に融合することによって、組み立てた

。抗IGF-1R抗体重鎖eGFP融合タンパク質、抗IGF-1R抗体重鎖emGPF融合タンパク質、および抗IGF-1R抗体重鎖tagGFP融合タンパク質のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、およびSEQ ID NO: 09にそれぞれ示している。

抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子を、抗体遺伝子のゲノムエキソン-イントロン構造を含む2つの個別の発現プラスミドから発現させた。

b)抗IGF-1R抗体重鎖-eGFP-オプシンタグ融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
HEK293細胞において抗IGF-1R抗体重鎖-GFP-オプシンタグ融合ポリペプチドを一過性発現させるための発現プラスミドは、前述の発現ベクターに由来した。これらは、19アミノ酸ペプチド

が各GFPのC末端に直接的に融合される、GFP-オプシンタグをコードするDNAセグメントのみが異なった。例として、抗IGF-1R抗体重鎖-eGFP-オプシン(M)タグ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 33に示している。

実施例3
BDNF発現プラスミドの作製
a)野生型プレプロBDNFの発現プラスミドの作製
ヒトプレプロBDNF遺伝子をコードしているDNAセグメントを化学合成によって調製し、前述の基本的発現ベクター中に挿入した。このために、プレプロBDNF遺伝子の5'末端をCMVプロモーターと連結し、3'末端をウシ成長ホルモンポリアデニル化配列と連結した。野生型プレプロBDNFタンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 20に示している。

b)BDNF変異体の発現プラスミドの作製
最適な生産収率を得るために、いくつかのBDNF変異体を構築した(下記の表を参照されたい):
-いくつかの変異体では、野生型BDNFシグナル配列(プレセグメント)を、高度に発現されるマウス免疫グロブリン重鎖抗体に由来するシグナル配列

に交換した;
-いくつかの変異体では、BDNFコード遺伝子のコドン使用頻度を、プロセグメントおよび/またはBDNFの成熟部分において、最適化されたコドン使用頻度に換えた;コドン使用頻度が最適化されたBDNF遺伝子は、Geneartによるアルゴリズムを用いた各アミノ酸配列の逆翻訳によって得た(例えば、Fath, S., et al., PLOS One 6 (2011) e17596を参照されたい);
-いくつかの変異体では、タンパク質発現を増大させると一般に考えられているため、T7-His6タグ(SEQ ID NO: 12)を使用した(例えば、Luan, C.H., et al., Genome Res. 14 (2004) 2102-2110を参照されたい);
-ほとんどのBDNF変異体では、試料の調製/精製を簡単にするために、His6タグを含めた;
-いくつかの変異体では、フューリンまたは他のPC転換酵素のようなプロテアーゼの潜在的なプロテアーゼ切断部位として機能する可能性があるため、成熟BDNFの最後の3つのC末端アミノ酸、すなわちRGRモチーフを欠失させた;
-別の変異体では、BDNFのシグナル配列およびプロセグメントを、ヒトNGFの対応するアミノ酸配列に交換した(この変異が別のニューロトロフィンの発現を改善することが発表された(Iwane et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1994) 225-232)ことに基づく)。

1:BDNFのC末端RGRモチーフが欠失している(ΔRGR)
2:SEQ ID NO: 14に示すアミノ酸配列によって定義される、高度に発現されるマウス免疫グロブリン重鎖抗体に由来するシグナル配列

3:ヒトNGFに由来する対応配列によって交換された、BDNFのシグナル配列およびプロ断片

c)プレ-プロ(IgA)-BDNF変異体およびプロセグメント内に成熟BDNFのN末端のHis6タグを部分的に含むプレ-プロ(IgA;His6)変異体の発現プラスミドの作製
プレ-プロ-(IgA)-BDNF遺伝子は、天然に存在するフューリン切断部位(RVRR)が、配列

を有する人工的に作製されたIgAプロテアーゼ切断部位によって置換されたプロポリペプチド変異体をコードする(下記の表を参照されたい)。

さらに、いくつかの変異体では、R54A点変異をBDNFのプロポリペプチド中に導入して、推定上のプロテアーゼ切断部位を破壊した(Mowla, S.J., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 12660-12666を参照されたい)。さらに、いくつかの変異体では、さらに、プロ断片内の成熟BDNFのN末端に、除去可能なHis6タグを含めた。このタグのおかげで、プロ(IgA;His6)-BDNF変異体タンパク質のタンパク質精製が簡単になる。IgAプロテアーゼを用いてインビトロで最終的なタンパク質成熟化を行うと、プロ(IgA;His6断片)が除去され、したがって、潜在的な免疫原性リスクが回避される。

HEK293細胞においてプレ-プロ(IgA)-BDNFおよびプレ-プロ(IgA;His6)-BDNF変異体遺伝子/タンパク質を一過性発現するための発現プラスミドは、プレプロBDNF(-RGR)-T7-His6タンパク質をコードする前述の発現ベクターに由来する。それらは、以下の特徴に違いがある。

R54A変異の番号付けは、野生型プレプロBDNF(SEQ ID NO: 20)のアミノ酸配列に基づいている。

d)等電点を操作されたBDNF変異体の発現プラスミドの作製
以前に、操作された低いIEPを有する、大腸菌において発現されリフォールディングされたいくつかのBDNF変異体が、説明されている。それに応じてプレプロBDNF(-RGR)-T7-His6遺伝子を変異させ、得られた変異BDNF遺伝子を、HEK293細胞中で一過性に発現させた(下記の表を参照されたい)。さらに、(1)mycタグ

が約-3の実効電荷の差を導入し、かつ(2)mycタグがヒト由来であり、したがって免疫原性が低いと予想されるため、mycタグ付きBDNF変異体も構築した。

-RGDおよび(ΔRGR);成熟BDNFの最後の3つのC末端アミノ酸の欠失;
アミノ酸変異の番号付けは、成熟BDNFの最初のアミノ酸から始める;
成熟BDNF(-RGR)変異体のIEPは、European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)のタンパク質統計プログラムpepstatsを用いて計算した。

e)追加のグリコシル化部位を有するBDNF変異体の発現プラスミドの作製
(1)グリコシル化部位を含むC末端タグまたは(2)成熟BDNF部分内の1つの人工的に作製されたグリコシル化部位を有するBDNF変異体を作製した。

これらのグリコシル化タグは、公開されている配列(例えば、Meder, D., et al., J. Cell Biol. 168 (2005) 303-313; Bulbarelli, A., et al., J. Cell Sci. 115 (2002) 1689-1702; Perlman, S., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (2003) 3227-3235; WO 2002/002597)から導き出し、推定上のN-グリコシル化部位は、人工神経回路網を用いて予測した(NetNglycサーバー; http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。

成熟BDNF部分内にN-グリコシル化部位を導入するために、成熟BDNF配列内にアスパラギン、セリン、またはトレオニンが存在するか、配列を検査した。その場合、ヒトBDNFの三次元タンパク質構造に基づいて(1bnd; www.rcsb.org)、表面に局在していないAsn残基、Ser残基、またはThr残基はすべて、考慮に入れなかった。表面に露出している残りのAsn残基、Ser残基、およびThr残基について、部位特異的変異誘発によって推定上のN-グリコシル化部位(コンセンサスモチーフ:N-X-(S/T)、X=Pro以外の任意のアミノ酸)を人工的に作製するために、隣接するアミノ酸残基を同定した。これら推定上の人工的に作製されたN-グリコシル化部位のアミノ酸位置を用いて、配列アラインメントおよびタンパク質3D構造比較により、構造および機能が類似しているニューロトロフィンNGFおよびNT-3中の対応するアミノ酸を同定した。相応する受容体::リガンド結晶構造(例えば、3buk、3ij2、および2ifg)に基づいて、ニューロトロフィン::p75NTRまたはニューロトロフィン::Trk(A、B)相互作用界面の一部分であると予想されるアミノ酸位置は、除外した。推定上のBDNF-TrkB/p75相互作用界面の外側の表面に露出した推定上のN-グリコシル化部位に対して選択された変異を、下記の表に挙げている(2列目)。

HEK293細胞においてN-グリコシル化されたBDNF変異体タンパク質を一過性発現するための発現プラスミドは、BDNF変異体プレプロBDNF(-RGR)-T7-His6(-RGR:最後の3つのC末端アミノ酸RGRが欠失している、切断型成熟野生型BDNF;T7タグおよびHis6タグが、BDNFの切断されたC末端にGSGリンカーを介して結合されている)をコードする発現ベクターに由来する。追加の人工N-グリコシル化部位を作製するために導入されるBDNFセグメント、タグ、グリコリンカー(glycolinker)、および変異を、以下の表に提示する。

成熟BDNF(ΔRGR)中に部位特異的変異誘発によって導入されるアミノ酸変異に関する配列番号(SEQ ID NO)を、BDNF変異体プレプロBDNF(-RGR;M61T)-T7-His6およびプレプロBDNF(-RGR;R81N)-T7-His6について例示的に示している。

f)複数の(2つ以上の)N-グリコシル化部位およびIgA切断部位を導入するために組み合わせられた変異を含むBDNF変異体の発現プラスミドの作製
複数のN-グリコシル化部位を有するBDNF変異体を作製するために、以前の実験において特定された追加のN-グリコシル化部位のいくつかを組み合わせた。出発構築物であるプレ-プロ(IgA)-BDNF(-RGR)-His6変異体ポリペプチドは、プロセグメント内のネイティブのフューリン部位の代わりのIgAプロテアーゼ切断部位、C末端を切断された成熟BDNF(最後の3アミノ酸RGRの欠失)、およびC末端のHis6タグを特徴とする。所望の変異およびタグを、下記の表に示すように導入した/結合させた。

g)複数の(2つ以上の)N-グリコシル化部位を導入するために組み合わせられた変異を含むBDNF変異体の発現プラスミドの作製
複数のN-グリコシル化部位を有するBDNF変異体を作製するために、以前の実験において特定された追加のN-グリコシル化部位のいくつかを組み合わせた。このために、C末端を切断された成熟BDNF(最後の3アミノ酸RGRの欠失)およびC末端のT7-His6タグを特徴とするプレプロBDNF(-RGR)-T7-His6変異体タンパク質を出発材料として使用した。所望の変異を、下記の表に示すように挿入した。

実施例4
BDNF抗体断片融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
a)BDNF-Fab抗体重鎖融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
BDNF-(Gly₄Ser)_n-Fab(抗IGF-1R抗体重鎖)融合ポリペプチドを得るために、HEK293細胞において一過性発現させるためのプラスミドを構築した。このプラスミドは、以下の特徴を有するポリペプチドをコードするCDS(coding DNS sequence)の化学合成したDNA断片を含んだ:
-C末端RGRモチーフを欠失させた野生型プレプロBDNF部分のC末端は、グリシンに富むリンカーとそれに続くヒト抗IGF-1R抗体のFab重鎖部分(VH-CH1)およびC末端His6タグに融合されている;
-グリシンに富むリンカーは、(G4S)2-GGモチーフまたは(G4S)4-GGモチーフまたは(G4S)6-GGモチーフからなる(下記の表を参照されたい)。

b)BDNF-Fab抗体軽鎖融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
BDNF-(Gly₄Ser)_n-Fab融合ポリペプチドを得るために、HEK293細胞において一過性発現させるためのプラスミドを構築した。このプラスミドは、以下の特徴を有するポリペプチドをコードするCDSの化学合成したDNA断片を含んだ:
-C末端RGRモチーフを欠失させた野生型プレプロBDNF部分のC末端は、グリシンに富むリンカーとそれに続くヒト抗IGF-1R抗体のFab VL-Cκ軽鎖ドメインおよびC末端His6タグに融合されている;
-グリシンに富むリンカーは、(G4S)2-GGモチーフまたは(G4S)4-GGモチーフまたは(G4S)6-GGモチーフからなる(上記の表を参照されたい)。

c)抗IGF-1R抗体軽鎖の発現プラスミドの作製
抗IGF-1RをベースとするBDNF-Fab複合体を作製するために、ネイティブの抗IGF-1R抗体軽鎖を使用した。抗IGF-1R抗体軽鎖の発現プラスミドの作製は、実施例1で説明している。

d)負に荷電したGly-Aspリンカーを含むBDNF-Fab(抗IGF-1R抗体重鎖)融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
BDNF-(G3D)4-Fab(抗IGF-1R抗体重鎖)融合ポリペプチドを得るために、HEK293細胞において一過性発現させるためのプラスミドを構築した。このプラスミドは、以下の特徴を有するポリペプチドをコードするCDSの化学合成したDNA断片を含んだ:
-C末端RGRモチーフを欠失させた野生型プレプロBDNF部分のC末端は、グリシンに富む負に荷電したリンカーとそれに続くヒト抗IGF-1R抗体のFab VH-CH1重鎖ドメインおよびC末端His6タグに融合されている:
-グリシンに富む負に荷電したリンカーは、(G3D)4-GGGSモチーフからなる。

e)プロBDNFセグメント内のIgA切断部位、負に荷電したGlyAspリンカー、および複数のN-グリコシル化部位を含むBDNF-Fab(抗IGF-1R抗体重鎖)融合タンパク質の発現プラスミドの作製
複数のN-グリコシル化部位を有するプロ(IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab(抗IGF-1R抗体重鎖)融合ポリペプチドを得るために、HEK293細胞において一過性発現させるためのプラスミドを構築した。このプラスミドは、以下の特徴を有するポリペプチドをコードするCDSの化学合成したDNA断片を含んだ:
-成熟BDNFのC末端RGRモチーフを欠失させたプレ-プロ(IgA)-BDNF部分のC末端は、伸長されたオプシンタグ

とそれに続く、グリシン-アスパラギン酸に富む負に荷電したリンカー、およびヒトインスリン様増殖因子1(IGF-1R)に対するヒトモノクローナル抗体のFab重鎖部分(VH-CH1、ヒンジに由来するペプチドEPKSCによって部分的に伸長されている)、およびC末端His6タグに融合されている;
-グリシン-アスパラギン酸に富む負に荷電したリンカーは、(G3D)4-GGGSモチーフまたは(G2D)5-G2SGモチーフのいずれかからなる。

これらの構築物の詳細を下記の表に要約する。

f)プロBDNFセグメント内のIgA切断部位、負に荷電したGlyAspリンカー、および複数のN-グリコシル化部位を含むBDNF-Fab(抗トランスフェリン受容体抗体重鎖)融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
負に荷電したGlyAspリンカーおよび複数のN-グリコシル化部位を有するプロ(IgA)-BDNF-(G3D)4-Fab(抗TfR)抗体重鎖融合ポリペプチドを得るために、HEK293細胞において一過性発現させるためのプラスミドを構築した。このプラスミドは、以下の特徴を有するポリペプチドをコードするCDSの化学合成したDNA断片を含んだ:
-C末端RGRモチーフを欠失させたプレプロ(IgA)-BDNF部分のC末端は、オプシン(L)タグとそれに続く、グリシン-アスパラギン酸に富む負に荷電したリンカー、およびキメラのラット/ヒトFab重鎖部分(VH可変ドメインは、マウストランスフェリン受容体(mTfR)に対するラット8D3モノクローナル抗体に由来し、CH1ドメインは、ヒトIgG1に由来する)、およびC末端His6タグに融合されている;抗体のVHドメインのアミノ酸配列は、Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258から得た;
-グリシン-アスパラギン酸に富む負に荷電したリンカーは、(G3D)4-GGGSモチーフからなる;
-ほとんどの変異体において、BDNFのプロセグメントと成熟部分の間の内在性フューリン/PC転換酵素切断部位は、IgAプロテアーゼ切断部位

に交換された;
-いくつかの変異体において、切断された野生型成熟BDNF部分(BDNF;ΔRGR)は、人工R209Nグリコシル化部位を含む切断型成熟BDNF変異体(BDNF(ΔRGR;R209N))に交換された。

これらの構築物の詳細を下記の表に要約する。

実施例6
BDNF-scFv融合ポリペプチドの発現プラスミドの作製
BDNF(G4S)3-scFv-抗IGF-1R抗体重鎖融合ポリペプチドを得るために、HEK293細胞において一過性発現させるためのプラスミドを構築した。このプラスミドは、以下の特徴を有するポリペプチドをコードするCDSの化学合成したDNA断片を含んだ:
-C末端RGRモチーフを欠失させた野生型プレプロBDNF部分のC末端は、(G4S)3リンカーとそれに続くヒト抗ヒトIGF-1R抗体のscFv部分に融合されている;
-抗ヒトIGF-1R抗体のscFv部分は、VLドメインとそれに続く(G4S)4-GGリンカー、VH領域、およびHis6タグで構築されており;プレプロBDNF(-RGR)_(G4S)3_scFv-His6＜IGF-1R＞融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 78に示している。

実施例7
ポリペプチドの一過性発現、精製、および解析的特徴付け
一過性発現
F17培地(Invitrogen Corp.)中で培養したHEK293細胞(ヒト胎児由来腎臓細胞株293に由来(human embryonic kidney cell line 293-derived))の一過性トランスフェクションによって、ポリペプチドを作製した。トランスフェクションには、「293フリー」トランスフェクション試薬(Novagen)を使用した。抗体および抗体断片(FabおよびscFv)を含む融合ポリペプチドを、トランスフェクションの際に等モルのプラスミド比で用いて、1種、2種、または3種の異なるプラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の取扱い説明書で指定されたようにして実施した。組換えポリペプチドを含む細胞培養上清を、トランスフェクション後4〜7日目に回収した。上清は、精製するまで低温で保存した。

例えばHEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組み換え発現に関する一般的情報は、例えば、Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203において与えられている。

精製
a)プロテインAクロマトグラフィーおよびSuperdex 200(商標)カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーを含む2段階の手順を用いて、GFP融合ポリペプチドを精製した
GFP融合ポリペプチドを含む培養上清をろ過した。その後、PBS(1mM KH₂PO₄、10mM NaHPO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)で平衡にしたHiTrap MabSelectSuRe(GE Healthcare)を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、GFP融合ポリペプチドを捕捉した。平衡緩衝液で洗浄することによって、未結合ポリペプチドを除去し、0.1Mクエン酸緩衝液、pH2.8を用いて融合ポリペプチドを回収した。溶離の直後に、1M Tris塩基、pH9.0を用いて、画分をpH6.0に中和した。

Superdex 200(商標)(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを、2回目の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーは、50mMヒスチジン緩衝液、0.15M NaCl、pH 6.8中で実施した。回収されたGFP融合ポリペプチドを、-80℃で保存した。

b)ヒスチジンタグ付きタンパク質を、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)から始め、続いてSuperdex 75(商標)カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーを行う2段階プロトコールを用いて精製した
ヒスチジンタグ付きポリペプチドを含む培養上清を、NaClを用いて調整して、最終NaCl濃度を500mMとした。AKTA explorer 100システム(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を用いて、1ml/分の流速で、NiA緩衝液(製造業者の取扱い説明書で指定されているEDTAを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル錠(EDTAフリーコンプリートミニタブレット(EDTA-free Complete Mini Tablets);Roche Applied Science)を含む50mM TRIS、300mM NaCl、5mMイミダゾール)で前もって平衡にしたNi-Sepharose(商標)6 Fast Flowカラムに、ろ過した培養上清を添加した。UV測定値がベースライン近くに戻ってくるまで、NiA緩衝液でカラムを洗浄した。ヒスチジンタグ付きポリペプチドを、10カラム容量の50mM TRISおよび500mM NaCl、pH8.0中5mM〜300mMイミダゾール直線勾配を用いて溶出させた。

Superdex 75(商標)(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを、2回目の精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーは、50mMヒスチジン緩衝液、0.15M NaCl、pH 6.8中で実施した。溶離したヒスチジンタグ付きタンパク質を-80℃で保存した。

解析的特徴付け
280nmにおける光学濃度(OD)を測定し、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いることによって、精製ポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。還元剤(5mM 1.4-ジチオトレイトール)の存在下および非存在下でのSDS-PAGEならびにクーマシーブリリアントブルーを用いた染色によって、ポリペプチドの純度および適切な二量体形成を解析した。Superdex 200(商標)分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を用いる高性能SECによって、Fc融合ポリペプチド調製物の凝集物含有量を測定した。ノイラミニダーゼ、O-グリカナーゼ、およびペプチド-N-グリコシダーゼFの組合せ(Roche Applied Science、Mannheim、Germany)を用いる酵素処理によってN-グリカンを除去した後、還元されたポリペプチドのアミノ酸主鎖の完全性をNano Electrospray QTOF質量分析法によって検証した。

培養上清中のBDNF濃度の測定
培養上清中の野生型BDNF、BDNF変異体、およびBDNFを含む融合ポリペプチドの濃度を、Peprotech社の組換えヒトBDNF(カタログ番号:450-02)を標準品として用いる半定量的ウェスタンブロット解析によって測定した。ウサギ抗BDNF抗体(Santa Cruz;カタログ番号:sc-20981)(一次抗体)および西洋ワサビペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヒツジ抗ウサギ抗血清(1:5000希釈、Roche Diagnostics GmbH、Germany)(二次抗体)、ならびに高感度化学発光基質(LUMI-Light plusウェスタンブロットの基質、Roche Diagnostics GmbH、Germany)を、染色のために使用した。

BDNF融合ポリペプチドの濃度はまた、Promega社のBDNF Emax(登録商標)イムノアッセイキット(カタログ番号:G7610)を供給業者の取扱い説明書に従って用いるBDNF ELISAによっても測定した。

実施例8
インビトロの機能特徴付け
野生型GFPおよびGFPを含む融合ポリペプチドの生物活性の測定
精製した野生型GFPおよびGFPを含む融合ポリペプチドの生物活性を、その生物発光特性(GFP固有の蛍光)に基づいてモニターした。

表面プラズモン共鳴(SPR、BIAcore)による、BDNF結合親和性の測定
アミンカップリングキットを製造業者のマニュアル(GE Healthcare、Uppsala、Swedenによって提供される)に従って用いて、約750レゾナンスユニット(RU)の捕捉系(ヒトIgGに特異的な捕捉mAb、Jackson Immunoresearch)のアミンカップリングを、pH 4.5で、CM5チップ上で実施した。濃度5μg/mlのヒトFcタグ付きTrkB(R&D Systems、カタログ番号:688-TK-100)を捕捉した。濃度1.25μMのヒトFc混合物(Biodesign、カタログ番号:50175)を注入することによって、過剰な結合部位をブロックした。0.1nM〜50nMの範囲の様々な濃度の、BDNFを含む融合ポリペプチドに、298Kで120〜240秒間、10μL/分の流速でフローセルを通過させた。解離相は、最長600秒間モニターし、試料溶液を泳動用緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30μL/分の100mMリン酸溶液で1分間洗浄することによって、表面を再生した。いずれの実験のためにも、GE Healthcareによって供給されるHBS-P+緩衝液(10mM HEPES((4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid))、pH7.4、150mM NaCl、0.05％(v/v) Surfactant P20)を選択した。

ブランクを結合させた表面から得られる応答を差し引くことによって、バルク屈折率の差を補正した。また、ブランクの注入も差し引く(2つの基準(double referencing))。

ka/kdと定義される平衡解離定数(Kd)は、いくつかの異なる濃度を用いて得られるセンサーグラム曲線を、BIAevaluation 4.1ソフトウェアパッケージを用いて解析することによって決定した。データのフィッティングは、適切な結合モデルに従った。

ELISAによるBDNF結合親和性の測定
BDNFを含む融合タンパク質の結合特性を、TrkB ELISAを用いて測定した。PBSに溶かした1μg/mLのTrkB-Fc融合物(R&D Systems)で、Maxisorbプレートを4℃で一晩コーティングした。PBSTC(0.05％ Tween-20および2％ニワトリ血清(Gibco)を含むPBS)を用いてプレートを室温で1時間ブロックし、PBSTで3回洗浄した後、BDNFを含む融合タンパク質またはBDNFのみを、PBSTCに溶かして濃度15〜500ng/mLとしてウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。6回洗浄した後、これらのウェルを、マウス抗BDNF抗体(クローン4F11.1A1、PBSTC中1μg/mL)と共にインキュベートし、さらに洗浄した後、抗マウスHRP抗体(PBSTC中1:10000)と共にインキュベートした（いずれも室温で1時間）。PBSTで3回洗浄した後、ABTS基質および波長492nmでの光度測定定量を用いて、HRP活性を検出した。

TrkBレポーター遺伝子アッセイ法による、BDNFを含む融合タンパク質の生物活性の測定
BDNF変異体およびBDNFを含む融合タンパク質の生物活性を、SRE(serum-response element)を含むプロモーターの制御下にある安定にトランスフェクトされたルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む、TrkBをトランスフェクトされたCHO細胞株(CHO-K1-hTrkB/pSRE-Luc)を用いて測定した。実験前日に、飢餓させるために、増殖培地(10％FCS、2mM L-グルタミン、300μg/mL G418、および3μg/mLピューロマイシンを含むハムF12)からFCSを含まない同じ培地に細胞培地を変更した。翌日、96ウェルプレートのウェル1つにつき10⁵個の細胞を培地50μL中に播種し、次いで、培地50μL中に0.02nM〜115nMの間の濃度のBDNF融合タンパク質を添加した。37℃、7.5％CO₂で4時間インキュベーションした後、室温で30分間、細胞を平衡化し、ウェル1つにつき100μLのBrightGloルシフェラーゼアッセイ法試薬(Promega)を添加した。5分間のインキュベーションの後、Tecanプレートリーダーを用いて(積分時間100ms)、発光を読み取った。

SH-SY5Y神経突起伸長アッセイ法における、BDNFを含む融合タンパク質の生物活性の測定
BDNF変異体およびBDNFを含む融合タンパク質の生物活性を、ヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞を用いる神経突起伸長アッセイ法を用いて測定した。簡単に説明すると、SH-SY5Y細胞を、96ウェルプレートにおいて、神経単位の分化を誘導するための10μMレチノイン酸(Sigma)を添加された(under addition)通常の増殖培地(ハムF12、1×非必須アミノ酸(PAN)、10％ FCS、2mM L-グルタミン、1×ピルビン酸ナトリウム(PAN))中に、ウェル1つにつき細胞4000個の濃度で播種した。3日後、培地を、様々な濃度のBDNF融合タンパク質を含む増殖培地に交換した。さらに3日後、PBS中4％パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間、細胞を固定し、洗浄し、短時間の透過処理を行い(0.1％トリトンX-100)、PBS中1％ BSAを用いてブロックし、PBS/1％ BSA中で1:1000に希釈したTuJ1抗体(Covance)を用いて抗β-チューブリン免疫反応性を対象として染色し、続いて、3回洗浄し、Alexa488標識抗ヤギ抗体(Invitrogen)と共にインキュベーションした。ウェル1つにつき1つの視野を評価する蛍光顕微鏡検査法によって、神経突起の数を測定した。

FACSによる、抗体/抗体断片を含む融合タンパク質の結合活性の測定
各標的受容体(トランスフェリン受容体、IGF-1R)に対するBDNF融合タンパク質の結合活性をFACSによって測定した。各受容体を発現する細胞(マウストランスフェリン受容体:MEF-1マウス胚性線維芽細胞;IGF-1R:ヒトIGF-1Rを安定にトランスフェクトした3T3線維芽細胞)を増殖培地から採取し、PBSで洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁した(PBS+5％ FCS;96ウェル丸底プレートのウェル1つにつき3×10⁵個の細胞を含む100μL)。1〜10μg/mLの一次抗体(使用されるBDNF融合タンパク質による。例えば、抗ヒトFab抗体(Jackson ImmunoResearch)または抗His6抗体(Roche))を添加し、氷上で2時間、細胞をインキュベートした。FACS緩衝液で3回洗浄した後、氷上で1時間、PE標識した二次抗体(Jackson ImmunoResearch、1:5000〜1:10000)を用いて、結合した抗体を検出した。細胞を再び洗浄し、FACS Cantoサイトメーター (Becton-Dickinson)によって平均蛍光を測定した。

Claims

以下の段階を含む、変異プロポリペプチドを用いて組換えポリペプチドを作製するための方法:
-ポリペプチドをプロポリペプチド(プロセグメントと該ポリペプチドの融合ポリペプチド)としてコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、該プロセグメントと該ポリペプチドの間の内在性酵素切断部位がIgAプロテアーゼ切断部位で置換されている、段階、
-該細胞または培養培地から変異プロポリペプチドを回収し、ここで該プロポリペプチドの切断が、ポリペプチドの精製中に行われ、それによって、組換えポリペプチドを作製する段階。
以下の段階を含む、融合ポリペプチドを作製するための方法:
-変異融合ポリペプチドをプロ融合ポリペプチドとしてコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階であって、該融合ポリペプチドのアミノ酸配列が、該プロ融合ポリペプチド中の、プロセグメントと該融合ポリペプチドの間の内在性プロテアーゼ切断部位をIgAプロテアーゼ切断部位で置換することによって改変されている、段階、
-該細胞または培養培地からプロ融合ポリペプチドを回収し、ここで該プロ融合ポリペプチドの切断が、ポリペプチドの精製中に行われ、それによって、融合ポリペプチドを作製する段階。
融合ポリペプチドが、生物学的に活性な実体と、リンカーペプチドと、血液脳関門(BBB)受容体に結合する一価の結合実体とを含むことを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
リンカーペプチドが、負に荷電した1つまたは複数のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
ポリペプチドが神経栄養因子であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。