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JP6685396B2 - 標的分析物質に対するデータセットの補正方法 - Google Patents

標的分析物質に対するデータセットの補正方法 Download PDF

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Description

本発明は、試料内の標的分析物質に対するデータセットを補正する方法に関するものである。
重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、“ＰＣＲ”という）に公知された最も多く使われる核酸増幅反応は二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー延長の反復されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓなど、特許文献１から３、及び非特許文献１参照）。
リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は試料で標的核酸をリアルタイムに検出するためのＰＣＲ基盤技術である。特定標的物質を検出するために、リアルタイムＰＣＲは標的分子の量に比例して検出可能な蛍光信号を放出する信号発生手段を用いる。検出可能な蛍光信号の放出は、例えば二重らせんＤＮＡに結合して蛍光信号を放出する試薬（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）を使用するか、または蛍光信号体及びその蛍光放出を抑制するｑｕｅｎｃｈｅｒ分子を全て含むオリゴヌクレオチドを使用する方法がある。標的核酸の量に比例する蛍光信号がリアルタイムＰＣＲを通じて各サイクル毎に検出され、蛍光信号を測定して、サイクル対比検出される蛍光信号の強さを表示した増幅曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）または増幅プロファイル曲線（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｃｕｒｖｅ）を得るようになる。
蛍光信号を用いた試料分析は、次のようになされる。ＬＥＤなどの光源を通じて発光体（ｌｕｍｉｎａｎｔ）にエネルギーが供給されれば、発光体の電子はより高い量子状態に浮き上がるようになり、軌道電子が底状態に戻りながら発光体は特定波長の光を発散する。分析機器が光ダイオードまたはＣＣＤなどを用いてこの特定波長の光を電気的信号に変換させて試料分析に必要な情報を提供する。
この際、機器間ＬＥＤ光量の差（ｕｎｅｖｅｎ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）及び各機器にある光−電気変換装置の機能的偏差によって、同一な量の発光体が試料で分析されても、各分析機器は機器毎に互いに相異する数値を算出するようになる。このような機器間信号の差を機器間偏差（ｉｎｔｅｒ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）という。機器間信号偏差だけでなく、機器で反応が遂行される反応ウェルの位置または反応混合物の濃度、組成の微細な差のような反応環境の差によって、同一な１つの分析機器で同種、同量の標的物質に対して遂行された複数の反応の分析結果も信号水準に差がありうる。このような同一な機器での反応の間の信号差を機器内偏差（ｉｎｔｒａ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）という。また、分析物質がない基質であるブランクを対象に分析する場合にも機器自体で電気的ノイズ信号が発生し、これが正常な信号として記録できる。このような信号偏差を発生させる電気的ノイズ信号を機器ブランク信号という。このような機器ブランク信号は特定の信号値が各サイクル毎に加えられるか、差し引きされた形態に表れる。
正確で、かつ信頼性ある分析のために、このような問題は解決されなければならず、このために幾つかの方法が提案された。最も基本的な方法に、ハードウェア調整方法が使われる。例えば、分析機器が製造される時、ＬＥＤ光源のような各分析機器の一部を補正して同一試料に対する機器間の信号偏差を減少させて適正水準に維持する。更に他の方法には、基準染色剤が使用できる。ＲＯＣＴＭまたはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎのような一定量の信号を一定に発生させる基準染色剤を反応混合物に追加して試料で発生した信号をこの基準染色剤で発生した信号水準に基づいて補正する。
しかしながら、このような先行技術は幾つかの限界を有している。ハードウェア補正方法は補正正確度に限界があり、分析機器の老朽によって発生する誤差に対応するためには別途の追加補正が必要である。しかも、ハードウェア補正方法は単に機器間信号偏差のみを減少させることができるだけであり、機器内信号偏差を減少させることができない。基準染色剤を用いた信号の補正は反応単価を増加させ、基準染色剤の量的、質的偏差は更に他の誤りの原因となることがある。しかも、基準染色剤の使用は反応混合物内の標的物質の存在を決定する染色剤と基準染色剤との間の信号干渉現象の可能性を増加させる。干渉現象は非常に重要な問題であり、特に複数の染色剤が使われて、検出されなければならないマルチプレックスＰＣＲでより重要である。また、１つの染色剤と検出チャンネルを信号補正のために割り当てることは検出可能なターゲット１つを減らすことになるので、製品競争力の面で深刻な短所となる。
したがって、ハードウェアの調整や、基準染色剤の使用無しで、機器間、機器内信号偏差を減少させることができる新たなデータセット補正方法の開発が必要である。
本明細書の全体に亘って多数の引用文献及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容はその全体として本明細書に参照に挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第４，６８３，１９５号公報 米国特許第４，６８３，２０２号公報 米国特許第４，８００，１５９号公報
Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０、１３５０−１３５４
本発明者らは、リアルタイムＰＣＲシステムのようなデータセットを収得する機器で発生する複数のデータセットでの機器間、機器内信号偏差に対するより正確で、かつ信頼度ある補正結果を得るために努力した。
その結果、任意に定めた基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及びデータセットを用いて標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を求めて、これを複数のデータ地点の信号値に適用する場合、正確で、かつ信頼性ある補正されたデータセットを得ることができることを突き止めた。また、前記標準化係数が適用される前、機器ブランク信号を除去すれば、より正確で、かつ信頼性ある補正されたデータセットを得ることができることを突き止めた。
したがって、本発明の目的は試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取可能な記録媒体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、試料内の標的分析物質に対するデータセットを補正するための装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を実行するためのプロセッサを具現するコンピュータ読取可能な記録媒体に格納されるコンピュータプログラムを提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は以下の実施例、請求範囲、及び図面により、一層明確になる。
試料内の標的分析物質に対するデータセットを補正するための方法の一具現例を図示したフローチャートである。 背景信号に対する機器間信号偏差及び機器内信号偏差を確認するために、ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を示すものである。 背景信号に対する機器間信号偏差及び機器内信号偏差を確認するために、ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記データセットの機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法（ｔｈｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｂｌａｎｋ ｓｉｇｎａｌ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを共通基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットの増幅曲線を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始データセットを機器別基準値を用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正データセットのベースラインが差引きされた増幅曲線及び前記補正データセットの機器間及び機器内変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットのメルティングカーブを示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットのメルティングカーブを示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを共通基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットのメルティングカーブを示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを共通基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを共通基準値及び基準温度８５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを共通基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットのメルティングカーブを示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを共通基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを機器別基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットのメルティングカーブを示すものである。 ハードウェア的に未補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを機器別基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを機器別基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットのメルティングカーブを示すものである。 ハードウェア的に補正された３個の機器から各々収得した３個グループの原始メルティングデータセットを機器別基準値及び基準温度５５℃を基準サイクルとして用いた本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した補正メルティングデータセットの変化値をフローティングして収得したメルティングピーク及び前記メルティングデータセットの最大変化値の機器間及び機器内変動係数を分析した結果を示すものである。 多様な濃度のプローブを用いて収得したデータセットと多様な基準値を用いて本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により収得した補正データセットの比較結果である。
Ｉ．標的分析物質に対するデータセット補正方法
本発明の一態様によれば、本発明は次のステップを含む試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）方法を提供する：
（ａ）前記データセット補正のための標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を提供するステップ；前記データセットは信号発生手段を用いた前記標的分析物質に対する信号発生反応から収得され；前記データセットは前記信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含み；前記標準化係数は基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及び前記データセットを用いて提供され；前記基準サイクルは前記データセットのサイクルから選択され；前記基準値は任意に定まった値であり；前記標準化係数は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供され；そして
（ｂ）前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供するステップ。
本発明者らはデータセットを補正し、標的核酸分子のような標的分析物質の存在または不存在を示す複数のデータセットの間の機器間及び機器内信号偏差を効果的に減少させることができる新たな方法を開発するために努力した。その結果、本発明者らは基準値、基準サイクル、及びデータセットを用いて標準化係数を得て、これを複数のデータ地点の信号値に適用する場合、正確で、かつ信頼性ある補正データセットが収得できることを糾明した。
本発明の一具現例によれば、本発明では背景信号区域の特定サイクル（基準サイクル）の特定背景信号を補正に用いるので、このような接近法は“特定背景信号基盤標準化方法（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ：ＳＢＮ）”と命名される。
本明細書で、用語“標準化”（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）は信号発生反応で収得したデータセットの信号偏差を低減または除去する過程を意味する。本明細書で、用語“補正”（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）または“調整”（ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）はデータセットの訂正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、特にデータセットの信号値を分析目的に適するように訂正することを意味する。前記標準化は前記補正の一態様である。
図１は、本発明のＳＢＮ方法による試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法の一具現例を図示したフローチャートである。本発明の方法を詳細に説明すれば、次の通りである：
Ｓｔｅｐ（ａ）：データセットの補正のための標準化係数の提供（１１０）
本発明によれば、データセットを補正するための標準化係数が提供される。データセットは信号発生手段を用いた標的分析物質に対する信号発生反応から収得され、前記データセットは信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含む。
用語の標的分析物質は、多様な物質（例えば、生物学的物質及び化合物のような非生物学的物質）を含むことができる。具体的に、前記標的分析物質は核酸分子（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、生物学的化合物、ホルモン、抗体、抗原、代謝物質、及び細胞のような生物学的物質を含むことができる。本発明の一具現例によれば、前記標的分析物質は標的核酸分子でありうる。
本明細書で、用語“試料”（ｓａｍｐｌｅ）は生物学的試料（例えば、生物学的原料の組織及び体液）、及び非生物学的試料（例えば、食物、水、土壌）を含むことができる。
前記生物学的試料は、例えば、ウイルス、細菌、組織、細胞、血液（例えば、全血、血漿、及び血清）、リンパ、骨髄液、唾液、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、スワブ（ｓｗａｂ）、吸引液（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、乳、小便、大便、眼球液、精液、脳抽出物、脊髄液、関節液、胸腺液、気管支洗浄液、腹水、及び羊膜液でありうる。標的分析物質が標的核酸分子である場合、前記試料は核酸抽出過程を経ることができる。前記抽出される核酸がＲＮＡである場合、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）過程を追加で経ることができる（参照：Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１））。
本明細書で、用語“信号発生反応”は試料内の標的分析物質の特性に依存的に信号を発生させることができる反応を意味し、前記特性は、例えば、標的分析物質の活性、量、または存在（または、不存在）でありうる。本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応は試料内の標的分析物質の存在に依存的に信号を発生させる。
このような信号発生反応は、生物学的または化学的過程を含むことができる。前記生物学的過程は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ、及びインベーダー分析のような遺伝的分析過程、免疫学的分析過程、及び細菌成長分析を含むことができる。本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応は遺伝的分析過程でありうる。本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応はＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲでありうる。
前記信号発生反応は、信号変化を伴うことができる。本明細書で、用語“信号”は測定可能なアウトプットを意味する。前記信号変化は、標的分析物質の特性、具体的に存在または不存在を定性的または定量的に指示する指示子の役割をする。このような指示子の例は、蛍光強さ、発光強さ、化学発光強さ、生発光強さ、燐光強さ、電荷移動、電圧、電流、電力、エネルギー、温度、粘性度、光スキャッタ、放射能強さ、反射度、透光度、及び吸光度を含むが、これに限定されるものではない。最も頻繁に使われる指示子は蛍光強さ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）である。前記信号変化は信号の増加だけでなく減少も含む。本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応は信号値を増幅する反応である。
本明細書で、用語“信号発生手段”は分析しようとする標的分析物質の特性、具体的に存在または不存在を示す信号を発生することに使われる如何なる手段を意味する。
多様な信号発生手段が知られている。信号発生手段の例は、オリゴヌクレオチド、標識、及び酵素を含むことができる。前記信号発生手段は標識自体及び標識が結合されたオリゴヌクレオチドを含む。前記標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識、及び金属標識を含むことができる。前記インターカレーティング染料（ｉｎｔｅｒｃａｌｔｉｎｇ ｄｙｅ）のように標識自体が信号発生手段の役割をすることができる。または、単一標識または供与分子及び受容分子を含む相互作用的な二重標識が１つ以上のオリゴヌクレオチドに結合された形態に信号発生手段に利用できる。信号発生手段は、核酸切断酵素（例えば、５’−ｎｕｃｌｅａｓｅｓ及び３’−ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）のような信号発生のための追加構成を含むことができる。
本発明の方法が標的核酸分子の存在または不存在の決定に適用される場合、前記信号発生反応は公知の多様な方法により遂行できる。前記方法は、ＴａｑＭａｎＴＭ プローブ方法（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，２１０，０１５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ方法（Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４ （３）：３０３（１９９６））、スコルピオン方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７（１９９９））、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ ｏｒ Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）， ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ６，１１７，６３５）、Ｌｕｘ方法（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ７，５３７，８８６）、ＣＰＴ（Ｄｕｃｋ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ９：１４２−１４８（１９９０））、ＬＮＡ方法（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ６，９７７，２９５）、プレクサ（Ｐｌｅｘｏｒ）方法（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ ＣＢ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １２６：４５５０−４５５６（２００４））、ＨｙｂｅａｃｏｎｓＴＭ（Ｄ． Ｊ． Ｆｒｅｎｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （２００１） １３， ３６３−３７４ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ７，３４８，１４１）、二重標識された自己クエンチングプローブ（ＵＳ ５，８７６，９３０）、混成化プローブ（Ｂｅｒｎａｒｄ ＰＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００， ４６， １４７−１４８）、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（ＷＯ ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ ２０１３／１１５４４２） ａｎｄ ＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）、及びＣＥＲ方法（ＷＯ ２０１１／０３７３０６）でありうる。
本明細書で、用語“増幅”または“増幅反応”は信号を増加または減少させる反応を意味する。本発明の一具現例によれば、前記増幅反応は信号発生手段を用いて標的分析物質の存在に依存的に発生する信号の増加（または、増幅）を意味する。前記増幅反応は、標的分析物質（例えば、核酸分子）の増幅を伴うか、伴わないことがある。したがって、本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応は標的核酸分子の増幅を含むか、含まないで遂行できる。より具体的に、本発明の増幅反応は標的分析物質の増幅を伴った信号増幅反応を意味する。
増幅反応を通じて収得するデータセットは増幅サイクルを含む。
本明細書で、用語“サイクル”は一定の条件の変化を伴った複数の測定において、前記条件の変化単位または条件の変化の反復単位をいう。前記一定の条件の変化または条件の変化の反復は、例えば温度、反応時間、反応回数、濃度、ｐＨ、測定対象（例えば、標的核酸分子）の複製回数の変化または変化の反復を含む。したがって、サイクルは条件（例えば、温度または濃度）の変化サイクル、時間または過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）サイクル、単位運営（ｕｎｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）サイクル、及び再生産（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）サイクルでありうる。サイクル番号は、前記サイクルの反復回数を意味する。本明細書で、用語“サイクル”及び“サイクル番号”は混用できる。
例えば、酵素動力学が調査される場合、基質の濃度を一定に増加させながら酵素の反応速度を数回測定する。この場合、基質濃度の増加は前記条件の変化に該当し、基質濃度の増加単位が１つのサイクルに該当する。他の一例に、核酸の等温増幅反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の場合、１つの試料の信号を一定時間間隔で数回測定される。この場合、反応時間が条件の変化であり、反応時間単位が１つのサイクルに設定される。本発明の他の一具現例によれば、核酸増幅反応を通じての標的分析物質の検出方法のうちの１つに、標的分析物質に混成化されたプローブにより発生する複数の蛍光信号が一定の温度の変化と共に測定される。この場合、温度の変化が前記条件の変化に該当し、前記温度がサイクルに該当する。
特に、一連の反応を反復するか、または一定時間間隔で反応を反復する場合、用語“サイクル”は前記反復の単位を意味する。例えば、ＰＣＲで、サイクルは標的核酸分子の変性、標的核酸分子とプライマーのアニーリング（混成化）、及びプライマーの延長を含む反応単位を意味する。この場合、一定の条件の変化は反応の反復回数の増加であり、前記一連のステップを含む反応の反復単位が１つのサイクルに設定される。
本発明の一具現例によれば、標的核酸分子が試料に存在する場合、測定される信号値（例えば、信号強度）は増幅反応のサイクルの増加によって増加または減少する。本発明の一具現例によれば、標的核酸分子の存在を示す信号を増幅する前記増幅反応は、標的分析物質が増幅するにつれて、信号も増幅する方法により実施できる（例えば、リアルタイムＰＣＲ方法）。または、前記増幅反応は標的分析物質が増幅されず、標的分析物質の存在を示す信号のみ増幅される方法により実施できる（例えば、ＣＰＴ ｍｅｔｈｏｄ （Ｄｕｃｋ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ９：１４２−１４８ （１９９０））、Ｉｎｖａｄｅｒ ａｓｓａｙ（米国特許第６，３５８，６９１号、及び第６，１９４，１４９号））。
標的分析物質は多様な方法により増幅できる。例えば、これに制限されないが、次のように標的核酸分子の増幅のための多様な方法が知られている。ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４６８３１９５ ａｎｄ Ｎｏ． ４６８３２０２；Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ， １９９０）；Ｗｉｅｄｍａｎｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， “Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＬＣＲ）− ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。”ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９４ Ｆｅｂ；３（４）：Ｓ５１−６４）、ＧＬＣＲ （ｇａｐ ｆｉｌｌｉｎｇ ＬＣＲ， ＷＯ ９０／０１０６９、ＥＰ ４３９１８２及びＷＯ ９３／００４４７）、Ｑ−ｂｅｔａ （Ｑ−ｂｅｔａレプリカーゼ増幅、Ｃａｈｉｌｌ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．， ３７（９）：１４８２−５（１９９１）、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５５５６７５１）、ＳＤＡ （鎖置換増幅、Ｇ Ｔ Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（７）：１６９１−１６９６（１９９２）、ＥＰ ４９７２７２）、ＮＡＳＢＡ （塩基順序基盤増幅、Ｃｏｍｐｔｏｎ， Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１））、ＴＭＡ （転写媒介増幅、Ｈｏｆｍａｎｎ ＷＰ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ． ３２（４）：２８９−９３（２００５）； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５８８８７７９）．） ｏｒ ＲＣＡ （ローリングサークル増幅、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １０２：１７３３２−１７３３６（２００５））。
本発明の一具現例によれば、信号発生手段に用いられる標識は蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を含むことができ、具体的に、蛍光単一標識または供与分子（ｄｏｎｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）及び受容分子（ａｃｃｅｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む相互作用的な二重標識（例えば、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子含み）を含むことができる。
本発明の一具現例によれば、本発明の増幅反応は標的分析物質（具体的に、標的核酸分子）の増幅が伴われながら信号を増幅することができる。本発明の一具現例によれば、増幅反応はＰＣＲ、具体的にリアルタイムＰＣＲにより実施される。
信号発生反応により収得されたデータセットは信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含む。
本明細書で、用語“信号値”または“信号の値”は信号発生反応のサイクルで実際に測定される信号値（例えば、増幅反応により表れる実際蛍光値）を意味し、またはその変形値を意味する。前記変形値は測定された信号値（例えば、信号の強さ）の数学的に加工された値を含むことができる。実際的に測定された信号値の数学的に加工された信号値の例は、ログ値または導関数値（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）を含むことができる。測定された信号値の前記導関数値は多重導関数値を含む。
本明細書で、用語“データ地点”はサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む１つの座標値（ａ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｖａｌｕｅ）を意味する。用語“データ”はデータセットを構成する全ての情報を意味する。例えば、増幅反応のサイクル及び信号値の各々はデータである。信号発生反応、特に増幅反応により得られたデータ地点は２次元直交座標系に示すことができる座標値で表示できる。前記直交座標系でＸ−軸は増幅反応のサイクルを示し、Ｙ−軸は該当サイクルで測定または加工された信号値を示す。
本明細書で、用語“データセット”は前記データ地点の集合を意味する。前記データセットは信号発生手段を用いた信号発生反応（例えば、増幅反応）から直接収得したデータ地点の集合でありうる。または、前記データセットは信号発生反応から直接収得したデータ地点の集合を含むデータセットの変形によって収得される変形されたデータセットでありうる。前記データセットは、信号発生反応から収得したデータ地点またはその変形されたデータ地点の一部または全体でありうる。
本発明の一具現例によれば、前記データセットは原始データセットが数学的に加工されたデータセットでありうる。具体的に、前記データセットは原始データセットから背景信号値を除去するためにベースラインが差引きされたデータセットでありうる。前記ベースラインが差引きされたデータセットは当業界に公知された多様な方法（例えば、米国特許第８，５６０，２４７号）を通じて得ることができる。
本明細書で、用語“原始データセット”は増幅反応から直接収得したデータ地点の集合である。前記原始データセットはリアルタイムＰＣＲを遂行するための装置（例えば、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、ＰＣＲ機器またはＤＮＡ増幅器）から最初に受信した未加工データ地点の集合を意味する。本発明の一具現例によれば、前記原始データセットは当業界の技術者が通常的に理解している原始データセットを含むことができる。本発明の一具現例によれば、前記原始データセットは本明細書に記載された数学的に加工されたデータセットの基礎となるデータセットを含むことができる。本発明の一具現例によれば、前記原始データセットはベースラインが差引きされていないデータセット（ｎｏ ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａ ｓｅｔ）でありうる。
本発明の方法は試料内のターゲット分析物質に対する１つのデータセットを補正する方法でありうる。また、本発明の方法は複数のデータセットを補正する方法でありうる。本発明の一具現例によれば、本発明のデータセットは複数のデータセットを含むことができる。特に、前記複数のデータセットは同種の標的分析物質に対する複数のデータセットでありうる。
本発明の一具現例によれば、ステップ（ａ）のデータセットは機器ブランク信号が除去されたデータセットでありうる。または、前記ステップ（ａ）のデータセットは機器ブランク信号が除去されていないデータセットでありうる。
用語“１次補正データセット”は原始データセットから機器ブランク信号が除去された変形されたデータセットを示すために使われる。前記１次補正データセットは変形されたデータセットとして記載されることができ、最終補正データセットまたは２次補正データセットと区分される。
本発明の一具現例によれば、前記機器ブランク信号は信号発生手段無しで収得できる。具体的に、前記機器ブランク信号は標識自体または標的分析物質の存在により信号を発生させる標識されたオリゴヌクレオチドのような信号発生手段無しで遂行された反応から検出された信号をいう。このような機器ブランク信号は、信号発生手段無しで測定されるので、機器ブランク信号には機器対機器間で標的分析物質の単位濃度当たり発生する信号の比率的差による信号偏差が適用されない。
前記機器ブランク信号は多様な方法により測定及び適用できる。例えば、互いに異なる機器はこれに該当する各々の機器ブランク信号が決定できる。１つの機器ブランク信号は１つの機器により収得されるいろいろなデータセットに適用され、互いに異なる機器で収得したデータセットには該当機器に対比する互いに異なる機器ブランク信号が各々適用できる。または、１つの機器内の各ウェルに対して互いに異なる機器ブランク信号が決定できる。１つの機器内の各ウェルは固有の機器ブランク信号を有することができ、１つの機器内の各ウェルで収得したデータセットには各ウェルに対応する相異する機器ブランク信号が適用できる。
前記機器ブランク信号が除去されたデータセットは機器ブランク信号が全部または一部が除去されたデータセットでありうる。用語“除去”は、データセットに信号値を足したり差引きしたりすることを意味する。好ましくは、用語“除去”はデータセットから信号値を差引きすることを意味する。機器ブランク信号が負数の場合、前記ブランク信号は信号値を足して除去できる。
本発明の一具現例によれば、前記機器ブランク信号は信号発生手段無しで収得できる。具体的に、前記機器ブランク信号は空のウェル（ｅｍｐｔｙ ｗｅｌｌ）、空のチューブ、蒸溜水が含まれたチューブまたは蛍光分子が結合されたオリゴヌクレオチドのような信号発生手段がないリアルタイムＰＣＲ反応混合物を含むチューブを用いて測定できる。機器ブランク信号の測定は信号発生反応と共に遂行されることができ、または信号発生反応と別途に遂行できる。
本発明の一具現例によれば、機器ブランク信号の測定が信号発生反応と共に遂行され、前記信号発生反応により収得したデータセットの信号値で測定された機器ブランク信号を差引きする方法により機器ブランク信号全体が除去できる。
択一的に、信号発生反応により収得されたデータセットの信号値から一定の信号値を差引きする方法により機器ブランク信号の一部が除去できる。前記一定の信号値は、前記一定の信号値を差引きして機器ブランク信号に該当する信号が減少する範囲で決定される限り、如何なる値も可能である。例えば、前記一定の信号値は１つの機器または複数の機器で測定された複数の機器ブランク信号値に基づいて決定できる。各々の標的分析物質分析実験毎に機器ブランク信号を測定することが困難な場合、１つの機器または複数の機器で測定された複数の機器ブランク信号値に基づいて決定された機器ブランク信号の一部に該当する一定の信号値を決定し、前記決定された一定の信号値を各データセットから一律に差引きする方法により機器ブランク信号がデータセットから除去できる。
または、本発明の方法により、前記一定の信号値をデータセットから差引きした後、差引きされたデータセットの信号値を比率的に補正した時、同量の標的分析物質に対する信号値の差が減少する範囲で前記一定信号値が決定できる。このような場合、機器ブランク信号の測定無しで機器ブランク信号の一部を除去して１次補正データセットを提供することができる。
本発明の一具現例によれば、本発明の方法は、前記ステップ（ａ）の以前に前記データセットを得るための信号発生反応を実施するステップを追加的に含むことができる。
本発明の一具現例によれば、標的分析物質に対する前記データセットは試料内の標的分析物質の存在または不存在を示すことができる。この場合、本発明は“試料内の標的分析物質の存在または不存在を示すデータセットの補正方法”により表現できる。試料内の標的分析物質の存在または不存在を示すデータセットの補正は、結局、試料内の標的分析物質の存在または不存在を決定するために遂行される。用語“試料内の標的分析物質の存在または不存在を決定”することは、試料内の標的分析物質の存在または不存在を定性的または定量的に決定することを意味する。
本発明の一具現例によれば、前記標準化係数は、基準値、基準サイクル、及びデータセットを用いて提供できる。
前記基準サイクルはデータセットのサイクルから選択され、基準値は任意に定まった値であり、標準化係数は前記基準サイクルに該当する前記データセットのサイクルでの信号値と前記基準値との間の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を定めて提供される。
前記基準サイクルは基準値と共に標準化係数を提供するために使われる特定信号値を決定するために選択されるサイクルである。標準化係数の提供に用いられる基準サイクルはデータセットのサイクルのうちから任意に選択できる。
前記基準サイクルは、前記サイクルの意味によって、基準温度、基準濃度、または基準時間を含むことができる。例えば、サイクルの単位が温度であるメルティングデータセットでは基準温度が基準サイクルでありうる。メルティングデータセットに関する記載で、用語“基準サイクル”と“基準温度”は混用できる。
本発明の一具現例によれば、前記基準サイクルは各データセットの基準サイクルグループから選択されることができ、前記各データセットの基準サイクルグループは互いに同一な方式により提供される。
本発明の一具現例によれば、基準サイクルは各データセットの基準サイクルグループから選択され、前記基準サイクルグループは同一な条件に基づいて生成される。前記同一な基準は全てのデータセットで基準サイクルを決定することに同一に適用できる。
各データセットの基準サイクルグループは互いに同一な方式により提供される。前記基準サイクルは、多様な接近法により決定できる。例えば、前記基準サイクルグループは信号値の水準が類似するように測定されるサイクルを含むことができる。前記基準サイクルグループは、信号値の水準が実質的に同一なサイクルを含むことができる。前記基準サイクルグループは、信号値の変動係数が５％、６％、７％、８％、９％、１０％以内であるサイクルを含むことができる。
データセットがシグモイド反応形態にフローティングされる場合、前記基準サイクルは増幅区間（例えば、増幅器）の以前及び／又は以後のサイクルを含むことができる。増幅区間の以前はベースライン区域または初期区域であり、増幅区間の以後は高原期または末期区域でありうる。前記基準サイクルグループは１つのサイクルを含むことができ、この際、前記１つのサイクルの番号は各データセットで同一でありうる。
基準サイクルの数は各データセットに同一に決定できる。または、前記基準サイクルの数は各データセット毎に相異するように決定できる。
本発明の一具現例によれば、前記複数のデータセットは各データセットに同一な方式（共通の条件（ｒｕｌｅ）または予め決定された基準）により提供される基準サイクルグループで決定された基準サイクルまたはサイクルを用いて補正できる。
本発明の一具現例によれば、前記同一な方式（共通の条件または予め決定された基準）は基準サイクルグループを提供し、
基準サイクルグループから選択された基準サイクルまたはサイクルとデータセットにより計算された前記標準化係数は実質的に同一または狭い範囲（例えば、１５％、１０％、８％、５％、または４％）の標準偏差範囲内でありうる。
本発明の一具現例によれば、前記データセットが複数のデータセットを含む場合、同一な基準サイクルが複数のデータセットに適用されて同一な判断基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）に分析される。本発明の一具現例によれば、複数のデータセットは同一な基準サイクルを用いて補正できる。
内部または相互比較分析に使われるか、または同一なしきい値のように同一な判断基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）により分析されるデータセットの信号変化が最小化されなければならない。同一判断基準に標準化するデータセットの範囲は分析目的によって適切に決定することができ、これに制限されないが、例えば同一標的分析物質に対する複数のデータセット、同一種類試料に対する複数のデータセット、同一反応混合物（例えば、同一蛍光物質、同一プローブなど）を使用する複数のデータセットは各々同一判断基準に標準化できる。
本発明の一具現例によれば、複数のデータセットを含むデータセットの場合、相異する基準サイクルの信号値が実質的に同一であれば、前記複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットは互いに異なる基準サイクルが適用できる。
基準サイクルは基準値と共に標準化係数を提供することに使われる特定信号値を決定することに用いられるので、前記基準サイクルは信号値を提供することができるサイクルのうちから選択されなければならない。
基準サイクルは、予め決定されたサイクルであるか、または実験により決定できる。前記基準サイクルは、データセットのサイクルのうちから選択できる。具体的に、基準サイクルはデータセットで増幅信号がほとんど検出されない領域のサイクルのうちから選択できる。
例えば、データセットが核酸増幅反応により収得される場合、前記基準サイクルは背景信号区域で決定されることが好ましい。背景信号区域は信号発生反応の初期に増幅信号が十分に検出される前の区域をいう。
背景信号区域は多様な方法により決定できる。例えば、核酸増幅過程により収得したデータセットの１次微分した結果で特定しきい値を超過する傾きを有する最初データ地点のサイクルが背景信号区域の最後のサイクルに決定できる。または、核酸増幅過程により収得したデータセットの１次微分した結果で、最初のピークの開始サイクルを背景信号区域の最後のサイクルに決定することができる。または、曲率が最大になるデータ地点を背景信号区域の最後のサイクルに決定することができる。
本発明の一具現例によれば、信号値の増幅反応は背景信号区域及び信号増幅区域の信号値を全て提供し、前記基準サイクルは背景信号区域から選択される。より具体的に、本発明の一具現例によれば、信号発生反応はＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲであり、基準サイクルはＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲの信号増幅区間の以前の背景信号区域から選択できる。同一な標的に対して同一な条件でＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを遂行して収得したデータセットの初期背景区域の信号値は、理論的に同一であるか、または少なくとも類似の値を有しなければならない。その理由は、初期背景区域の信号値は標的分析物質の濃度に関わらず標的分析物質に対する信号を非常に低い水準に含むためである。したがって、基準サイクルは背景信号区域から選択されることが好ましい。
したがって、本発明の基準サイクルは５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、または８番目サイクル以下でありうる。本発明の基準サイクルはＰＣＲ初期サイクルに示されるノイズを避けて設定できる。本発明の基準サイクルは、０、１、２、３、４、５、６、または７番目サイクル以上でありうる。具体的に、基準サイクルは背景信号区域に位置する１−３０サイクル、２−３０サイクル、２−２０サイクル、２−１５サイクル、２−１０サイクル、２−８サイクル、３−３０サイクル、３−２０サイクル、３−１５サイクル、３−１０サイクル、３−９、３−８、４−８、または５−８サイクル区域のどの１つのサイクルに定めることができる。
本発明の一具現例によれば、基準サイクルは１つの基準サイクルでありうる。１つのサイクルが基準サイクルに用いられることができ、データセットの基準サイクルでの信号値が標準化係数を提供するために利用できる。択一的に、本発明の一具現例によれば、前記基準サイクルは少なくとも２つの基準サイクルを含むことができる。
基準サイクルは少なくとも２つの基準サイクルを含むことができ、データセットで基準サイクルに該当する信号値は少なくとも２つの信号値を含むことができる。
補正のための標準化係数は、データセットのサイクルのうち、前記少なくとも２つの基準サイクルに対応するサイクルでの信号値から計算された信号値を用いて提供できる。択一的に、データセットのサイクルのうち、前記少なくとも２つの基準サイクルに対応するサイクルでの信号値の各々を用いて少なくとも２つの標準化係数が提供され、補正のための標準化係数は前記少なくとも２つの標準化係数により提供できる。例えば、基準サイクルを４、５、及び６番目サイクルに指定し、データセットの４、５、及び６番目サイクルの信号値の平均を標準化係数の提供に利用することができる。または、基準サイクルを４、５、及び６番目サイクルに指定し、各基準サイクルでの信号値を用いて各基準サイクルでの標準化係数を決定し、これを平均値をデータセットに適用する最終標準化係数に決定することができる。
本発明の一具現例によれば、基準サイクルがデータセットの一定範囲のサイクル内で決定される場合、前記基準サイクルは同一判断基準に分析されるデータセットでその信号値が同一であるか、または少なくとも類似の値を有するサイクルのうちから選択できる。
データセットの補正のために複数のデータ地点に適用される標準化係数の提供に用いられる信号値は、基準サイクル及びデータセットにより決定される。具体的に、標準化係数は基準サイクルに該当する前記データセットのサイクルでの信号値と基準値との間の関係を定めて提供される。
本発明の一具現例によれば、本発明の方法は基準サイクルとデータセットから標準化係数の提供に使われる信号値を決定する前の信号発生反応により得られたデータセットでスパイク（ｓｐｉｋｅ）、ジャンプ誤り（ｊｕｍｐ ｅｒｒｏｒ）など、いろいろな異常な信号を除去するステップを追加で含むことができる。
基準値は、標準化係数を提供することに用いられる値である。本明細書で、基準値はデータセットの信号値を補正するために基準サイクルに適用される任意の値を意味する。同一基準に標準化しようとするデータセットには同一な基準値が適用される。補正しようとするデータセットが複数のデータセットである場合、前記複数のデータセットは同一な基準値により補正されることができ、これは本発明の重要な特徴のうちの１つである。
基準値は任意に定まった値でありうる。好ましくは、基準値は０でない実数のうちから任意に定まった値である。基準値が０の場合、標準化係数は決定できない。本明細書で、“基準値は任意に定まった値でありうる”ということは、基準値は試料内の標的分析物質の存在が前記基準値を用いた補正データセットにより決定できる限り、特別に制限されず、決定できるという意味である。基準値は、試料内の標的分析物質の存在が前記基準値を用いた補正データセットにより決定できる限り、実験者により任意に選択できる。したがって、データセットの補正に用いられる基準値は、前記データセットが収得された信号発生反応と同一種類の信号発生反応により基準サイクルで収得できる信号値の範囲内で決定できる。基準値は、補正されるデータセットと別途に収得できる。具体的に、基準値は分析対象である標的分析物質と同一種類の標的分析物質に対する信号発生反応から収得されたデータセットから決定できる。択一的に、前記基準値は補正されるデータセットを含む一群のデータセットから収得できる。
好ましくは、基準値は補正対象であるデータセットの信号値と同一な種類の値であり、補正対象であるデータセットと同一な単位または次元（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）でありうる。しかしながら、基準値とデータセットの信号値が互いに異なる単位または次元を有するか、または基準値が単位や次元を有しなくても、各反応に対する適切な標準化係数は基準値と補正対象データセットの信号値から提供され、補正データセットが各反応に対する標準化係数を用いて収得できる。
本発明の一具現例によれば、信号発生反応は、同種の標的分析物質を検出するための複数の信号発生反応であることがあり、前記データセットは複数のデータセットであることがあり、各データセットに適用された基準値は他の基準値とは独立的に決定できる。基準値が独立的に決定できるということは、複数のデータセットのうちの１つのデータセットのための基準値は、他のデータセットの基準値を考慮しないで決定できるという意味である。したがって、本発明のデータセットが複数のデータセットを含む場合、少なくとも２つのデータセットは互いに異なる基準値を用いて補正されるか、全てのデータセットが同一な基準値を用いて補正できる。
前記複数の信号発生反応は同種の標的分析物質の検出のための複数の信号発生反応でありうる。前記同種の標的分析物質は同一な試料から分離された複数の標的分析物質でありうる。択一的に、前記同種の標的分析物質は互いに相異する試料から分離されたが、同一な信号発生手段（例えば、同一プローブまたは同一プライマー）により検出できる標的分析物質でありうる。
本発明の一具現例によれば、前記複数の信号発生反応は相異する反応環境で遂行される同種の標的分析物質に対する複数の信号発生反応でありうる。相異する反応環境で遂行される信号発生反応は多様な態様を含む。具体的に、相異する反応環境で遂行される信号発生反応は、機器が互いに異なる反応、反応チューブ、またはウェルが互いに異なる反応、試料が互いに異なる反応、標的分析物質の量が互いに異なる反応、プライマーまたはプローブが互いに異なる反応、信号発生染色剤が互いに異なる反応、または信号発生手段が互いに異なる反応を含む。
本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応は互いに異なる反応容器で遂行される複数の信号発生反応を含むことができ、前記データセットは前記複数の信号発生反応から収得した複数のデータセットを含むことができる。複数の信号発生反応は、互いに異なる反応容器で遂行できる。用語“反応容器”は試料と信号発生手段（例えば、プライマーまたはプローブ）が混合されて反応が起こる容器または装置の一部分を意味する。複数の信号発生反応が互いに異なる反応容器で遂行できるということは、更に他の信号発生反応のための更に他の信号発生手段、及び更に他の試料と分離された信号発生手段及び試料を使用して信号発生反応が遂行されることを意味する。例えば、複数のチューブで、またはプレートの複数のウェルで遂行される信号発生反応は前記複数の信号発生反応に該当する。信号発生反応が同一な反応容器で遂行されるが、時間を異にして遂行される場合もやはり前記複数の信号発生反応に該当する。
複数の信号発生反応は、反応環境（例えば、使われた機器）によって数個のグループに分類できる。具体的に、相異する機器で遂行された複数の信号発生反応は、遂行された機器によって互いに異なるグループに分類できる。前記複数の相異する機器で遂行された信号発生反応から収得したデータセットは、同一な基準値を使用して補正されることができ、またはより精密な補正のために相異する基準値を使用することができる。
本発明の一具現例によれば、前記複数の信号発生反応は互いに異なる機器で遂行できる。機器が一回作動して１つの試料を分析する場合、このような方式により複数の信号発生反応を通じて得られた複数のデータセットは互いに異なる基準値を用いて補正できる。
本発明の一具現例によれば、複数のデータセットは同一な基準値を用いて補正できる。本発明の一具現例によれば、複数のデータセットは同一な基準サイクルを用いて補正できる。
複数のデータセットが複数のデータセットに共通的に適用される同一な基準値（共通基準値）を用いて補正される場合、全てのデータセットは基準サイクルで同一な信号値を有するように補正されて、データセットの信号偏差が減少する。したがって、互いに異なる反応環境の複数の信号発生反応から収得したデータセットに対する標準化係数は同一な基準値を用いて求めることができ、これは本発明の重要な特徴のうちの１つである。具体的に、反応環境が相異する複数の信号発生反応を通じて収得したデータセットに対する各々の標準化係数は、同一な基準サイクル及び同一な基準値を用いて収得することができる。本発明の一具現例によれば、互いに異なる機器で収得した前記複数のデータセットは同一な基準値を使用して補正できる。
本発明の一具現例によれば、基準値は複数のデータセットで基準サイクルに該当するサイクルでの信号値の平均±標準偏差範囲内で決定される。基準値が前記説明した範囲内で決定される場合、複数のデータセットはデータセットと補正されたデータセット間の差を最小化しながら補正することができる。
一方、複数のデータセットは相異する基準値を用いて補正できる。相異する基準値は同一な判断基準により分析されるべき複数のデータセットに適用できる。本発明の一具現例によれば、複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットは互いに異なる基準値を用いて補正できる。
複数のデータセットは、反応環境（例えば、使われた機器）によって数個のグループに分類されることができ、また反応環境の差を考慮して、各グループに適切な基準値が決定され、適用できる。このような過程を通じて、複数のデータセットの間の信号偏差はより精巧に補正できる。
全ての複数のデータセットが各々互いに異なるグループに分類される場合には、各々の基準値が全てのデータセットの各々に適用される。複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットが同一グループに分類される場合、前記少なくとも２つのデータセットには同一な基準値が適用できる。例えば、１つの機器の互いに異なるウェルで収得したデータセットは同一グループに分類されることができ、他の機器で収得したデータセットは互いに異なるグループに分類できる。本発明の一具現例によれば、互いに異なる機器で収得されたデータセットには相異する基準値が適用されることができ、同一な機器の互いに異なるウェルで収得されたデータセットには同一な基準値が適用できる。本発明の一具現例によれば、複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットが互いに異なる基準値を用いて補正されることができ、前記少なくとも２つのデータセットは互いに異なる機器を用いて収得されたものでありうる。
本発明の一具現例によれば、前記信号発生反応は同一種類の標的分析物質に対して互いに異なる反応容器で遂行される複数の信号発生反応であり、前記データセットは前記複数の信号発生反応から収得した複数のデータセットを含み、前記複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットは互いに異なる基準値を用いて補正できる。例えば、機器間の信号偏差をより精巧に補正するために、各機器の機器−特異的標準データセット、及びその総信号変化値を収得し、前記総信号変化値を用いて対応する機器を用いて収得したデータセットに適用される基準値を決定することができる。これは本発明の更に他の特徴である。
機器間の偏差は各々別途の機器で遂行された同一な標的分析物質に対する信号発生反応により収得した別途のデータセットの間の信号偏差でありうる。択一的に、前記機器間偏差は同一な機器で同一な標的分析物質に対する独立的な信号発生反応により収得した別途のデータセットの間の信号偏差でありうる。例えば、１つの機器で１つの標的分析物質に対する信号発生反応が時間を異にして独立的に遂行されることができ、この場合、前記機器の独立的な遂行の各々が１つの機器として取扱できる。
本発明の一具現例によれば、たとえ複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットが互いに異なる基準値を用いて補正される場合にも、前記複数のデータセットのうち、前記少なくとも２つのデータセットは同一な基準サイクルを使用して補正できる。
本発明の一具現例によれば、前記基準値は（ｉ）基準総信号変化値に対する標準データセットの総信号変化値の割合、及び（ｉｉ）標準データセットを用いて決定される。前記標準データセットは、標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得するために使われる反応サイトと同一な反応サイトを用いて収得されることができ、前記基準総信号変化値は標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得するために使われるデータセットを含む１つ以上のデータセットから決定できる。
具体的に、標準データセットの基準サイクルでの信号値が基準総信号変化値に対する標準データセットの総信号変化値の割合を用いて補正されることができ、前記補正された標準データセットの基準サイクルでの信号値から基準値を決定することができる。
基準値は、標準データセットの総信号変化値及び基準総信号変化値を用いて決定できる。
本発明の一具現例によれば、標準データセットは標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得する時に使用したものと同一な反応サイトを用いて収得することができる。
前記反応サイト（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）は、試料に対する反応または実験が遂行される物理的空間をいう。前記反応サイトは、機器（例えば、ＰＣＲ機器）及び機器の一部（例えば、ＰＣＲ機器に形成された反応ウェル）を含むことができる。前記反応サイトは、ＰＣＲ増幅のような標的分析物質検出のために形成される。
標準データセットは知られた濃度の標的分析物質に対する信号発生反応により得られるデータセットでありうる。前記標準データセットは、標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを得るために使われたものと同一なウェルまたは機器を使用して収得することができる。
本発明の一具現例によれば、前記標準データセットは補正対象である標的分析物質に対するデータセットと別途に得られることができる。機器に対する補正割合が前記機器を用いた標準データセットに基づいて計算される場合、標準データセットのための信号発生反応は必ず試料内の標的分析物質を検出しようとする信号発生反応と同一な条件の反応で同時に遂行される必要はない。
本発明の一具現例によれば、標準データセットは補正しようとするデータセットと同時に収得できる。この場合、標準データセットは試料内の標的分析物質に対するデータセットを収得するものと同一な条件の反応で得られることができる。これで、機器を使用する度に微細に変化する変化も補正可能である。
標準データセットは知られた濃度の標的分析物質に対するデータセットであるので、前記標準データセットは前記知られた濃度と同一な濃度の標的分析物質に対する他のデータセットと前記標準データセットとの間の共通する要素の比較分析による基準値決定に利用できる。具体的に、前記知られた濃度の標的分析物質は標準濃度の標的分析物質でありうる。前記共通する要素は同一な条件で同一な信号発生反応が遂行される場合、理論的に同一な値を有する要素である。前記共通する要素は、例えば、総信号変化値、しきい値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）以上の信号値を有する最初データ地点のサイクル数、またはベースライン領域のサイクルでの信号値でありうる。
本発明の一具現例によれば、データセットは前記共通する要素のうちの１つの総信号変化値を用いて補正できる。本明細書で、用語“総信号変化値”はデータセットの信号変化量（増加量または減少量）をいう。総信号変化値は、全体データセットの信号変化量（増加量または減少量）であるか、またはデータセットの一部領域の信号変化量（増加量または減少量）でありうる。例えば、前記総信号変化値はデータセットで信号の変化が最も大きいサイクルの信号変化値でありうる。具体的に、総信号変化値はデータセットのベースラインの信号値と最大信号値の差であるか、またはデータセットのベースラインの信号値と最後のサイクルの信号値との差でありうる。
一方、総信号変化値がデータセットの一部区間で決定される場合、前記総信号変化値は前記一部区間の最初サイクルと最後のサイクルの信号値との差であるか、または前記一部区間で最大信号値と最小信号値との差でありうる。同一な濃度の標的分析物質を用いて信号発生反応が遂行される場合、理論的に同一な機器または相異する機器で一定の総信号変化値が得られなければならない。したがって、複数のデータセット間の信号偏差は前記総信号変化値に基づいた補正により減少できる。
標準データセットの総信号変化値と比較して補正係数を決定することに使われる総信号変化値を基準総信号変化値という。
本発明の一具現例によれば、基準総信号変化値は標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得することに使われたものと相異する反応サイトを用いた信号発生反応から収得したデータセットを含む１またはその以上のデータセットにより決定できる。
具体的に、基準総信号変化値は標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得することに使われたものと相異する反応サイトを用いた信号発生反応から収得したデータセットと標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得することに使われたものと同一な反応サイトを用いた信号発生反応から収得したデータセットを共に用いて決定できる。
より具体的に、前記基準総信号変化値は標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得することに使われたものと相異する反応サイトを用いた信号発生反応から収得したデータセットにより決定できる。
基準総信号変化値は、標準データセットと別個に収得した総信号変化値でありうる。
本発明の一具現例によれば、基準総信号変化値は予め決定された総信号変化値でありうる。前記基準総信号変化値は基準（または、標準）反応容器または機器及び標準データセットの総信号変化値を収得する時に使用したものと実質的に同一な物質を用いて収得することができる。
本発明の基準総信号変化値は知られた濃度の標的分析物質に対する信号発生反応で収得したデータセットから決定できる。択一的に、本発明の基準総信号変化値は知られた濃度の標的分析物質に対する複数の信号発生反応で収得した複数のデータセットの総信号変化値から算出できる。この場合、基準総信号変化値は知られた濃度の標的分析物質に対する複数の信号発生反応で収得した複数のデータセットの総信号変化値の平均または中間値であり、または知られた濃度の標的分析物質に対する複数の信号発生反応の結果に基づいて実験者により予め決定できる。
択一的に、本発明の一具現例によれば、標準データセットが複数の標準データセットである場合、基準総信号変化値は前記複数の標準データセットから決定できる。例えば、複数の標準データセットの総信号変化値のうちの１つが基準総信号変化値に決定されることができ、または複数の標準データセットの総信号変化値の平均または中間値が基準総信号変化値に決定できる。
本発明の一具現例によれば、基準値は同一な判断基準により分析される複数のデータセットの基準サイクルでの複数の信号値の範囲で決定できる。基準値が同一な判断基準により分析される複数のデータセットの基準サイクルでの複数の信号値の範囲で決定される場合、前記複数のデータセットはデータセットと補正されたデータセット間の差を最小化しながら補正できる。
本発明の一具現例によれば、データセットの標準化係数は基準値及び基準サイクル及びデータセットを用いて提供できる。具体的に、補正しようとするデータセットにおいて、標準化係数は基準サイクルに対応するサイクルでの信号値と基準値を用いて提供できる。前記標準化係数は反応により収得したデータセットの複数のデータ地点に適用され、これによってデータセットを補正する。
データセットが複数のデータセットである場合、前記複数のデータセットは互いに異なる反応容器で複数の信号発生反応により収得されたものでありうる。この場合、標準化係数は複数のデータセットの各データセット別に提供され、前記提供された標準化係数を適用して複数のデータセットが補正できる。同一な判断基準により分析されるデータセットの間に示される信号偏差を減らすために、本発明の方法は各データセットに適切な標準化係数を提供する。標準化係数はデータセットの複数のデータ地点の信号値に適用され、これによって補正されたデータセットを提供するための補正された信号値を得ることができる。
標準化係数は、基準値及び基準サイクル及びデータセットを用いて提供できる。前記標準化係数は、データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供できる。前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係は多様な方法により示すことができ、例えば前記関係は数学的に定義できる。データセットで前記基準サイクルに該当するサイクル（言い換えると、“データセットの基準サイクル対応サイクル”）の信号値は変形されない信号値その自体であるか、または数学的に変形された信号値でありうる。具体的に、データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値と基準値との間の関係は前記２つ値の差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）である。前記２つ値の差は、具体的にデータセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値と基準値の割合（ｒａｔｉｏ）である。
データセットで基準サイクルに該当するサイクルはデータセットの基準サイクル対応サイクルである。本発明の一具現例によれば、前記データセットの基準サイクル対応サイクルの信号値は単一信号値でありうる。択一的に、前記データセットの基準サイクル対応サイクルの信号値は複数の信号値でありうる。
標準化係数は１つの信号値と基準値との間の関係を定めて提供されるか、または複数の信号値と基準値との間の関係を定めて提供できる。前記複数の信号値は単一基準サイクルまたは複数の基準サイクルで収得できる。
標準化係数が基準値とデータセットの基準サイクル対応サイクルの信号値により提供される場合、標準化係数は基準値に対する前記データセットの基準サイクル対応サイクルの信号値の割合により決定できる。
標準化係数が基準値とデータセットの基準サイクル対応サイクルの複数の信号値により提供される場合、前記データセットの基準サイクル対応サイクルの複数の信号値は、複数の基準サイクルまたは単一基準サイクルにより定まることができる。
例えば、３番目サイクルが単一基準サイクルに指定されれば、基準サイクル対応サイクルでの複数の信号値は、前記３番目サイクルの信号値及び前記３番目サイクルの前または後に位置したサイクルの信号値を含むことができる。更に他の例に、２、３、４番目サイクルが複数の基準サイクルに指定されれば、基準サイクル対応サイクルでの複数の信号値は基準サイクル対応サイクルである２、３、４番目サイクルの信号値を含むことができる。
基準サイクルにより指定された複数の信号値と基準値の関係は多様な方法により定義できる。例えば、前記複数の信号値と基準値の関係は指定された複数の信号値の平均値、中間値、最小値、または最大値、または前記複数の信号値のうち、しきい値以下の信号値の平均値と基準値の割合で定義できる。好ましくは、前記基準サイクルにより指定された複数の信号値と基準値の関係は、複数の信号値の平均の基準値に対する割合で定義できる。複数の信号値が標準化係数を提供することに用いられれば、１つの異常信号値がデータセットの補正に及ぼす影響が最小化できる。
例えば、データセットの基準サイクル対応サイクルでの信号値が０の場合、データセットの全ての補正された信号値が同一な値を有するようになる。このような誤った結果の発生は、単一信号値を用いて標準化係数を提供する時より、複数の信号値を用いて標準化係数を提供する時に格段に減少するようになる。したがって、本発明の一具現例によれば、前記標準化係数が０の場合、標準化係数提供に使われる全てのまたは一部の信号値は他の信号値に変更できる。
本発明の一具現例によれば、前記標準化係数は基準値及びデータセットの基準サイクル対応サイクルでの信号値を用いて提供できる。
前記標準化係数は、次の数式により提供できる：
［標準化係数＝データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値／基準値］
例えば、標的分析物質の検出のためにリアルタイムＰＣＲを遂行して収得したデータセットが次の条件により補正される場合、標準化係数は１．４８として算出される。
（ａ）５番目サイクルが基準サイクルに指定され、（ｂ）基準値に９０００が指定され、（ｃ）データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値が１３，２８５であり、（ｄ）データセットで前記基準サイクル対応サイクルの信号値と基準値との関係は基準値に対するデータセットの前記基準サイクル対応サイクルの信号値の割合である。前記標準化係数（１．４８）を複数のデータ地点の信号値に適用して補正されたデータセットが提供できる。
本発明の一具現例によれば、前記標準化係数は前記データセットの基準サイクル対応サイクルの信号値の基準値に対する割合を定めて提供されることができ、前記標準化係数は次の数式により決定できる：
［標準化係数＝αＸ（データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値／基準値）］
前記α（アルファ）は０でない実数であり、好ましくは１でありうる。前記αは前記基準値が任意に（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）定まれず、他の因子（ｆａｃｔｏｒ）に従属して決定される場合、データセットが分析に適切な範囲に補正されるように標準化係数を調節する定数である。反応の信号水準は前記基準値または前記α値の調整を伴った信号値の補正を通じて調節できるので、信号発生反応に用いられる反応混合物の量に対する調節が可能である。
データセットの全てのデータ地点は同一な数式に従う同一な標準化係数により補正されることができ、択一的に、データセットの全てのまたは一部のデータ地点は互いに相異する標準化係数が適用されるか、または同一な標準化係数が互いに相異する数式により適用されて補正できる。
Ｓｔｅｐ（ｂ）：標準化係数による補正されたデータセットの提供（Ｓ１２０）
補正されたデータセットは標準化係数をデータセットの信号値に適用して補正された信号値を得て提供される。具体的に、補正されたデータセットは複数のデータ地点の信号値に標準化係数を適用して補正された信号値を得て提供できる。
前記標準化係数は多様な方式によりデータセットの信号値に適用できる。
標準化係数が基準値に対する前記データセットの基準サイクル対応サイクルの信号値の割合により決定される場合、補正されたデータセットは補正された信号値を求めて提供できる。
本発明の一具現例によれば、補正された信号値は次の＜数式１＞により提供できる：
前記＜数式１＞の信号値は補正前の信号値である。補正前の信号値は標準化係数によりデータセットが補正される前のデータセットの信号値をいう。したがって、補正前の信号値は測定された信号値であるか、または前記測定された信号値の加工された信号値でありうる。前記加工は標準化係数を用いた補正とは独立的に遂行される手続である。例えば、信号値の加工は信号値から特定値を足したり引いたりする方法により遂行できる。特に、前記加工は測定された信号値から機器ブランク信号の全部または一部を差引きするものでありうる。
補正された信号値は、本発明の標準化係数により補正された信号値をいう。補正されたデータセットは、データセットの補正された信号値を追加補正無しでデータセットの信号値に用いて提供できる。
または択一的に、前記補正されたデータセットは補正された信号値を追加補正してデータセットの信号値に用いて提供できる。例えば、標準化係数により補正された信号値に特定値を足したり差引きしたりする方法により追加補正できる。具体的に、標準化係数により補正された信号値はベースライン信号値を追加で差引きすることによって追加補正できる。
本発明の一具現例によれば、前記補正されたデータセットは試料内の標的分析物質の定性的または定量的検出に利用できる。
本発明の一具現例によれば、本発明のデータセットは基準染色剤（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｄｙｅ）の使用無しで標的分析物質に対する信号発生反応により収得されることができ、これは本発明の特徴のうちの１つである。従来技術によれば、基準染色剤は標準化のために反応混合物に添加される（参照：ＷＯ２０１２／０８３２３５）。このような先行技術は次のような問題点がある。
基準染色剤を反応混合物に追加することは、基準染色剤と標的分析物質の存在を検出するための異なる染色剤の間の干渉現象の可能性を増加させることがある。反対に、本発明は基準染色剤を信号発生手段が含まれる反応混合物に追加せず、データセットを補正することができる。
本発明の方法によれば、データセットは信号発生手段を含んだ反応混合物に基準染色剤の投与無しで標的分析物質の信号値を使用して補正できるので、信号発生手段と共に基準染色剤を使用する従来の方法に比べて正確で、かつ効果的にデータセットを補正することができ、分析結果の偏差と関連した多様な問題を克服することができる。
本発明の一実施例では２つグループのデータセットに対する機器間及び機器内変動係数（ＣＶ；ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が計算されて比較された。データセットグループ１はハードウェア的に補正しない３個の機器を用いたリアルタイムＰＣＲを通じて収得した原始データセットを本発明の方法により補正して収得したものである。データセットグループ２は、ハードウェア的に補正した３個の機器を用いた同一なリアルタイムＰＣＲを通じて収得したデータセットである。
また、実施例で２つグループのメルティングデータセットの機器間及び機器内信号変化に対する変動係数が計算され比較された。メルティングデータセットグループ１は、ハードウェア的に補正しない３個の機器を用いたリアルタイムＰＣＲの結果物をメルティング分析して収得した原始メルティングデータセットを本発明の方法により補正して収得したものである。データセットグループ２は、ハードウェア的に補正した３個の機器を用いた同一なリアルタイムＰＣＲの結果物をメルティング分析して収得したメルティングデータセットである。
実験結果、グループ１のデータセットまたはメルティングデータセットの機器間及び機器内信号変化に対する変動係数がグループ２のデータセットまたはメルティングデータセットのものより格段に小さいことを確認した。これで、本発明の方法が増幅データセットだけでなく、メルティングデータセットに対するハードウェア的な調整の代案になることができることが分かる。
一方、本発明の方法によれば、基準値の調節を通じてデータセットの信号値水準が調整できる。その結果、少ない量の信号発生手段（例えば、プライマー及びプローブ）を使用する場合にも統計的に有意味な標準化されたデータセットを得ることができ、試料内標的分析物質の存在、不存在を決定することができる。
本発明の一具現例によれば、基準値はデータセットのベースラインの最大信号値より高い値に選択されることができ、信号発生反応は相異する反応環境で遂行された同種の標的分析物質に対する複数の信号発生反応であり、データセットは複数のデータセットであり、前記複数のデータセットは同一な基準値及び同一な基準サイクルを用いて補正できる。
前記基準値はデータセットのベースラインの最大信号値より高く設定され、データセットのベースラインの最大信号値に対する前記基準値の割合は特別に限定されないが、例えばベースラインの最大信号値の１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、及び５００倍の信号値に設定できる。
興味深いことに、本発明の方法により複数のデータセットの信号水準を意図した水準に増加させながら、同時に複数のデータセット間の信号偏差が最小化できることを確認した。
本発明の一実施例では、２つグループのデータセットが比較された。データセットグループ１は多様な濃度の信号発生手段を用いて収得したデータセットであり、したがって、多様な水準の信号値を有する。データセットグループ２は、低い濃度の信号発生手段を用いて原始データセットを得て、原始データセットの信号値の水準がデータセットグループ１の信号値の水準になるように調節された複数の基準値を用いて原始データセットを各々補正して収得した。その結果、データセットグループ１及び２は、類似の増幅曲線パターンと類似のＣｔ値を有することを確認した。
また、低い濃度の信号発生手段を用いて収得した原始データセットを補正したデータセットと補正前の原始データセットのＣＶは実質的に同一であることを確認した。
ＩＩ．記録媒体、装置、及びコンピュータプログラム
本発明の他の態様によれば、本発明の試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取可能な記録媒体を提供し、前記方法は次のステップを含む：
（ａ）前記データセット補正のための標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を提供するステップ；前記データセットは信号発生手段を用いた前記標的分析物質に対する信号発生反応から収得され；前記データセットは前記信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含み；前記標準化係数は基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及び前記データセットを用いて提供され；前記基準サイクルは前記データセットのサイクルから選択され；前記基準値は任意に定まった値であり；前記標準化係数は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供され；そして
（ｂ）前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供するステップ。
本発明の他の態様によれば、本発明は試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読取可能な記録媒体に格納されるコンピュータプログラムを提供し、前記方法は次のステップを含む：
（ａ）前記データセット補正のための標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を提供するステップ；前記データセットは信号発生手段を用いた前記標的分析物質に対する信号発生反応から収得され；前記データセットは前記信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含み；前記標準化係数は基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及び前記データセットを用いて提供され；前記基準サイクルは前記データセットのサイクルから選択され；前記基準値は任意に定まった値であり；前記標準化係数は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供され；そして
（ｂ）前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供するステップ。
プログラム指示はプロセッサにより実行される時、プロセッサが前述した本発明の方法を実行するようにする。前記試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法に対するプログラム指示は基準値、基準サイクル、及び前記データセットを用いて前記データセット補正のための標準化係数を提供する指示、及び前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供する指示を含むことができる。
前述した本発明の方法は、独立実行型コンピュータ、ネットワーク付着コンピュータ、またはリアルタイムＰＣＲ装置のようなデータ収集装置にあるプロセッサのようなプロセッサに内蔵できる。
コンピュータ読取可能な記録媒体は当業界に公知された多様な格納媒体、例えば、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードドライブ、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、マグネチックテープ、ＭＩＮＩＤＩＳＣ、不揮発性メモリカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学格納媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリ、及びウェブサーバーを含むが、これに限定されるものではない。
データセットは多様な方式により収集できる。例えば、データセットはＰＣＲデータ収集装置にあるプロセッサにより収集できる。データセットはリアルタイムにプロセッサに提供されることができ、またはメモリユニットまたはバッファに格納され、実験完了後、プロセッサに提供できる。類似するように、データセットは、前記収集装置とのネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、及びイントラネット）または直接連結（例えば、ＵＳＢまたは他の直接有線連結または無線連結）によりデスクトップコンピュータシステムのような別途のシステムに提供されることができ、またはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、及びポータブルＨＤＤのようなポータブル媒体上に提供できる。類似するように、データセットは、ノートブックまたはデスクトップコンピュータシステムのようなクライアントにネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネット、及び無線通信ネットワーク）を通じてサーバーシステムに提供できる。
本発明を実行するプロセッサに具現された指示はロジックシステムに含まれることができる。前記指示は、たとえソフトウェア記録媒体（例えば、ポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ、及びＤＶＤ）に提供できるが、ダウンロード可能であり、メモリモジュール（例えば、ハードドライブ、またはローカルまたは付着ＲＡＭ、またはＲＯＭのような他のメモリ）に格納できる。本発明を実行するコンピュータコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、及びＸＭＬのような多様なコーディング言語で実行できる。また、多様な言語及びプロトコルは本発明に従うデータと命令の外部及び内部格納と伝達に利用できる。
本発明の他の態様によれば、本発明は（ａ）コンピュータプロセッサ、及び（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた前記本発明のコンピュータ読取可能な記録媒体を含む、試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正装置（ｄｅｖｉｃｅ）を提供する。
本発明の一具現例によれば、本発明の装置は試料及び信号−発生手段を収容することができる反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段、及び／又は増幅サイクルでの信号を検出する検出器を追加的に含むことができる。
本発明の一具現例によれば、前記コンピュータプロセッサはサイクルでの信号値を受信するだけでなく、試料またはデータセットを分析するか、または試料内の標的分析物質に対する補正されたデータセットを収得することができる。コンピュータプロセッサは１つのプロセッサが前述したパフォーマンスを全て行うように構築できる。択一的に、プロセッサユニットは多数個のプロセッサが各々のパフォーマンスを実行するように構築することができる。
本発明の一具現例によれば、前記プロセッサは標的分析物質（例えば、標的核酸分子）の検出に用いられる従来の装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）にソフトウェアをインストールして具現させることができる。
本発明の一具現例によれば、標的分析物質に対するデータセットを収得し、任意に定まった基準値、基準サイクル、及びデータセットを用いて標準化係数を提供した後、前記標準化係数をデータセットの信号値に適用して補正された信号値を得る方法により補正されたデータセットは提供される。
基準値及び基準サイクルは、製品供給者または使用者が任意に定めた値を使用することができる。択一的に、基準値及び基準サイクルは本発明の装置が決定することができる。例えば、複数のデータセットを収集した本発明の装置は累積された複数のデータセットの信号値を考慮して背景信号領域のサイクルから基準サイクルを決定することができる。また、本発明の装置は累積された複数のデータセットの信号値を考慮して複数のデータセットで基準サイクルに対応するサイクルの信号値の平均±標準偏差の範囲で基準値を決定することができる。また、本発明の装置は標準データセットと基準標準データセットの割合及び標準データセットの基準サイクルでの信号値を考慮して基準値を決定することができる。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明によれば、データセットに標準化係数を適用する簡単な方式によりデータセットを補正することができ、これで、機器間及び機器内信号偏差を効果的に減少させることができる。特に、機器間信号偏差だけでなく、機器内の互いに異なる位置（例えば、互いに異なる反応チューブまたはウェル）で遂行された信号発生反応の間の機器内信号偏差を減少させることができるので、正確度及び再現性に優れる分析が可能である。
（ｂ）本発明は基準染色剤を必要としない。本発明の方法は基準染色剤を使用する既存の信号補正方法に比べてより正確で、かつ経済的にデータセットを補正することができる。機器間信号偏差を減少させるために、基準染色剤を使用する既存の補正方法は基準染色剤を検出する光学チャンネルと標的分析物質を検出する光学チャンネルの機器間の信号偏差が同一でなければならない。したがって、既存の補正方法は単に基準染色剤を使用することで、機器間信号偏差と関連した問題を成功的に解決することができず、ハードウェア的な補正を通じての追加補正が必要である。しかも、既存の方法は機器内信号偏差を減少させるためには反応混合物に基準染色剤を使用する条件（例えば、基準染色剤の品質または量）が全ての反応混合物において同一でなければならないという問題がある。
（ｃ）本発明の方法によれば、データセットが基準染色剤を反応混合物に添加しなくても補正できるので、補正のための波長領域を割り当てる必要がない。したがって、基準染色剤による蛍光干渉の問題が発生せず、このような点はｈｉｇｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘリアルタイムＰＣＲで特に大きい長所となる。
（ｄ）本発明の補正方法はソフトウェアで具現できるので、製造社に関係無しで多様な分析機器（例えば、リアルタイムＰＣＲ機器）に汎用的に適用できる。したがって、本発明の方法は伝統的なハードウェア的な補正方法に比べて非常に簡便で、汎用性が優れる。
（ｅ）逐退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー及び／又はプローブを使用するＲＮＡウイルスの検出では、信号偏差が非常に重要な問題である。本発明の方法によれば、信号偏差を格段に減少させることができる。したがって、本発明の方法はＲＮＡウイルスを検出するための逐退性プライマー及び／又はプローブ使用に従う信号偏差の問題に対して卓越した解決方法になることができる。
（ｆ）本発明によれば、データセットの信号水準は基準値の調節により調整可能である。 その結果、少ない量の信号発生手段（例えば、ｄＮＴＰ、酵素、プライマー、及びプローブ）を使用する場合にも統計的に有意味な標準化されたデータセットを得ることができる。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これら実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に当たって自明である。
実施例１：特定背景信号基盤標準化方法（ＳＢＮ）によるデータセット補正及び補正データセットの分析
リアルタイムＰＣＲ機器の機器間信号偏差を最小化するために、ハードウェア的に入・出力信号強さを調節する方法が広く使われている。例えば、光源（例えば、ＬＥＤ及びハロゲンランプ（Ｈａｌｏｇｅｎ ｌａｍｐ））の出力強さを調整するか、または検出器（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）のフィルタ（Ｆｉｌｔｅｒ）で入力強さの調整を通じて信号を補正する。
実施例では、データセットの増幅信号の偏差を補正するために本発明の特定背景信号基盤標準化方法（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ−ｂａｓｅｄ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ；ＳＢＮ）を使用した。
次の３個グループのデータセットに対する信号偏差が比較分析された：（ｉ）ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットグループ、（ｉｉ）ハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットグループ、及び（ｉｉｉ）ＳＢＮによりソフトウェア的に補正されたデータセット。
＜１−１＞データセット準備
標的核酸分子に対するリアルタイムＰＣＲは＜表１＞に記載された３台のＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＴａｑＭａｎプローブを信号発生手段に使用して増幅サイクル５０回で遂行された。標的核酸分子はＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍのゲノムＤＮＡを使用した。相互作用的二重標識はＴａｑＭａｎプローブにレポーター分子（ＦＡＭ）及びクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を結合して使用した。反応は、標的核酸分子、アップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ及びＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ及びＴａｑ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むマスターミックスが含まれたチューブで遂行された。反応混合物が含まれたチューブをリアルタイムｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に取り付けて、１５分間９５℃で変性後、９５℃１０秒、６０℃６０秒、及び７２℃１０秒を１サイクルにして５０サイクルを進行した。各サイクル毎に６０℃で信号を測定した。
同一な標的核酸序列が同一な濃度で含まれた試料を用いて各機器別に９６個ウェルで９６個反応を同一な条件で遂行したものであり、これから得られたデータセットを分析してデータセットの機器間、機器内信号偏差、及び本発明のＳＢＮ方法に従う偏差水準の減少有無を確認した。
３個の機器をハードウェア的な補正をしていない未補正状態で反応を進行して３個グループのデータセットを収得し、ハードウェア的な補正を行い、反応を進行して３個グループのデータセットを収得して、総６個グループの原始データセットを準備した。各グループは９６個の反応を通じて収得した９６個のデータセットで形成される。
前記原始データセットからベースライン差引きされたデータセットを求めた。ベースライン差引きされたデータセットは次のような方法により収得した。リアルタイムＰＣＲ反応を通じて得られた原始データセットで３番目サイクルから増幅が始まる前のサイクルまでをベースラインに設定し、前記区間のサイクルに対する信号値の回帰直線方程式を求める。各サイクル毎に測定された信号値で該当サイクルで前記回帰直線方程式を通じて計算された信号値を差引きしてベースライン差引きされたデータセットを求める。
＜１−２＞ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセット分析
前記実施例<１−１>からハードウェア的に未補正された機器から収得した３個グループの原始データセットと、これから得られた３個グループのベースライン差引きされたデータセットの信号偏差を分析した。
３個の機器の背景信号強さを比較するために、ベースラインが差引きされていない原始データセットをフローティングしてベースライン差引きのない増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）を収得した（図２Ａ参照）。
図２Ａに示すように、同一な条件の増幅反応であるので、理論上、同一な強さの背景信号がフローティングされなければならないが、機器間の背景信号が区分されて分かれることを確認した。また、同一機器で互いに異なるウェルでなされた互いに異なる反応間にも背景信号の強さに差があることを確認した。
増幅区間の信号偏差を比較するために、各機器から収得したベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を準備した。
ベースラインが差引きされたデータセットの最後のサイクル（５０番目サイクル）を分析サイクル（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｙｃｌｅ）に定めて、前記５０番目サイクルで増幅信号の変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ、ＣＶ）を収得した（図２Ｂ参照）。
変動係数はデータの標準偏差を算術平均で割ったものである。
機器内変動係数は１つの機器で測定された複数個の反応に対する結果のうち、特定サイクルに対応する信号値の標準偏差と算術平均で算出した。機器間変動係数は実験に使われた３台の機器で測定された全ての反応に対する結果データセットで特定サイクルに対応する信号値の標準偏差と算術平均で算出した。
図２Ｂのように、ベースライン差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）の最後のサイクルで増幅信号の変動係数を確認した結果、機器内増幅信号変動係数は５．２％、９．１％、そして４．５％と確認され、機器間増幅信号変動係数は４９．３％と確認された。
＜１−３＞ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセット分析
実施例＜１−１＞で収得した原始データセット及びこれらのベースライン差引きされたデータセットを使用した。信号偏差はハードウェア的に補正された機器から収得した３個グループの原始データセット及びこれから収得したベースライン差引きされた３個グループのデータセットの信号偏差を分析した。
実施例＜１−２＞に記載されたものと同一な方法によりベースライン差引きのない増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を分析した。図３Ａに示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットに比べて機器間背景信号の偏差は減少したが、相変らず機器間、反応間、広く分散された背景信号偏差分布を示すことを確認した。
実施例＜１−２＞と同一な方法によりベースライン差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）の最後のサイクルで増幅信号の変動係数を確認した。図３Ｂに示すように、機器１、２、及び３の増幅信号の機器内増幅信号変動係数は５．３％、７．８％、そして５．５％と各々確認され、機器１、２、及び３の増幅信号の機器間変動係数は１７．７％と確認された。
実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットの結果と前記結果を比較すると、増幅信号の機器内変動係数は大きい変化がないことと確認され、増幅信号の機器間変動係数は３１．６ｐ％（パーセントポイント）減少したことと確認された。
このような結果から、ハードウェア調整による補正は機器の増幅信号の機器間変動係数を一部減少させることができるが、相変らず機器間相当水準の信号偏差が存在し、単一機器内ウェル間増幅信号の変動係数はハードウェア調整により減少させることができないことを確認した。
＜１−４＞ＳＢＮによりソフトウェア的に補正されたデータセットの分析
特定背景信号基盤標準化方法（ＳＢＮ）は、基準値と基準サイクルでの信号値を用いてデータセットを比率的に標準化する方法であり、補正対象データセットの背景信号領域（ベースライン領域）の特定サイクルが基準サイクルに指定される。複数のデータセットを同一基準により標準化するために基準値及び基準サイクルは標準化しようとするデータセットに同一に適用される。反応環境（例えば、増幅に使われた機器）によって複数のデータセットが幾つかのグループに分類される場合、基準値はグループ間の相異する反応条件を考慮して算出されることができ、算出された基準値は各グループに適用できる。
＜１−４−１＞共通基準値を適用したＳＢＮを用いたデータセットの補正
本実施例では全ての機器で収得したデータセットに１つの共通基準値を適用してデータセットを補正した。実施例＜１−１＞で収得した６個グループの原始データセットを次のステップに従ってＳＢＮ方法によりソフトウェア的に補正した。
＜ステップ１＞
原始データセットの背景地域（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｒｅｇｉｏｎ）の特定サイクルを基準サイクルに指定した。本実施例では５番目サイクルを基準サイクルに指定した。
＜ステップ２＞
特定背景信号に標準化するために基準値を指定した。本実施例ではＲＦＵ８，４００を基準値に指定した。
＜ステップ３＞
前記ステップ２で指定された基準値及び基準サイクルに対応する原始データセットのサイクルでの信号値から標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
標準化係数＝基準サイクルでの信号値÷基準値
＜ステップ４＞
全てのサイクルでの信号値を前記標準化係数を用いて補正した。
補正された信号値（ＲＦＵ）＝原始データセットの信号値（ＲＦＵ）÷標準化係数。
実施例＜１−１＞で提供された６個グループの原始データセットを前記ステップ１〜４に従って補正して、補正された６個グループのデータセットを収得した。
Ａ．ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットをＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である補正データセットを分析した。図４Ａ及び図４Ｂはハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを前記ステップ１〜４によって補正して収得した補正されたデータセットの増幅曲線（図４Ａ）及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図４Ｂ）を各々示す。
補正されたデータセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図４Ａは、補正されたデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。図４Ａに示すように、機器間背景信号偏差の分布がＳＢＮを用いた補正により明確に減少したことを確認することができる。特に、５番目サイクル（基準サイクル）での全てのＲＦＵ値が指定された基準値と同一になっており、背景信号の偏差が無いことを確認することができる。
また、補正されたデータセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図４Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は各々２．３％、３．０％、及び１．０％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は１２．１％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットをＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットの信号の変動係数。
＜表２＞に示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットをＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットは次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は３７．２ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は５．６ｐ％だけ減少することを確認した。
本発明のＳＢＮによる信号補正方法が機器間信号偏差だけでなく、単一機器内ウェル間信号偏差も減少させることができることを確認した。特に、ＳＢＮ方法が機器をハードウェア的に補正する方法より格段に優れる補正効果を示すことを確認しており、機器に対するハードウェア上の信号補正無しでＳＢＮによる補正だけでもハードウェア的な補正より優れる信号補正効果が達成できることを確認した。
Ｂ．ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットをＳＢＮ方法により追加補正したものであり、その結果である補正データセットを分析した。図５Ａ及び図５Ｂはハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを前記ステップ１〜４によって補正して収得した補正されたデータセットの増幅曲線（図５Ａ）、及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図５Ｂ）を各々示す。
補正されたデータセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図５Ａは補正されたデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。図５Ａに示すように、機器間背景信号偏差の分布がＳＢＮを用いた補正により明確に減少したことを確認することができる。特に、５番目サイクル（基準サイクル）での全てのＲＦＵ値が指定された基準値と同一になっており、背景信号の偏差が無いことを確認することができる。
また、補正されたデータセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図５Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は各々２．３％、２．３％、及び１．９％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は４．２％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットをＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットの信号の変動係数。
＜表３＞に示すように、ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットをＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットは次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器と比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４５．１ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は１３．５ｐ％だけ減少することを確認した。
本発明のＳＢＮによる信号補正方法が機器間信号偏差だけでなく、単一機器内ウェル間信号偏差も減少させることができることを確認した。特に、ハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットをＳＢＮ方法により追加標準化する場合、追加的な補正効果が達成されることを確認した。
＜１−４−２＞総信号変化値により決定された機器別基準値を適用したＳＢＮによるデータセット補正
本実施例では、機器間偏差を考慮して決定された機器別基準値を適用してデータセットを補正した。機器別基準値は基準総信号変化値（Ｒ−ＴＳＣ；ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｖａｌｕｅ）及び各機器の標準データセットの総信号変化値（ＴＳＣ；ｔｏｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｖａｌｕｅ）の割合を用いて決定した。
基準総信号変化値（Ｒ−ＴＳＣ）は標準機器で収得したデータセットの総信号変化値または複数のデータセットの総信号変化値から決定できる。また、基準総信号変化値は該当標的分析物質に対する複数の信号発生反応の結果に基づいて実験者により決定できる。
標準データセットは知られた濃度（標準濃度）の標的分析物質に対する信号発生反応から収得されたデータセットを意味する。各機器の標準データセットは知られた濃度の標的分析物質を用いて各機器で信号発生反応を遂行して収得した。
総信号変化値（Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｓｉｇｎａｌ ｃｈａｎｇｅ ｖａｌｕｅ；ＴＳＣ）は該当データセットでの増加または減少した信号変化量を意味する。機器別標準データセットの総信号変化値は各機器で収得した標準データセットから算出する。
機器別基準値を決定するために、標準濃度の標的分析物質を用いて各機器の標準データセットを収得し、これから標準データセットに対する機器別総信号変化値を決定した。予め決定された基準総信号変化値（Ｒ−ＴＳＣ）に対する機器別総信号変化値（ＴＳＣ）の割合を算出した。前記算出された割合を用いて標準データセットの基準サイクルでの信号値を補正し、その結果、補正された基準サイクルでの信号値を該当機器で収得したデータセットに適用する機器別基準値に決定した。
前記決定された機器別基準値を用いて該当機器から収得したデータセットを補正して機器間偏差を追加的に減少させた。
以下のステップ１〜３で機器別標準データセットから機器別基準値を決定し、決定された機器別基準値を用いてステップ４で実施例＜１−１＞で収得した各原始データセットを補正した。
＜ステップ１＞
実際実験試料からデータセットを収得するために実施する信号発生反応の条件と同一な反応条件で標準濃度の標的分析物質を用いて標準信号発生反応を遂行して機器別標準データセットを収得した。基準値を決定するための信号値及び総信号変化値を機器別標準データセットから収得した。
本実施例で５番目サイクルが基準サイクルに指定されたので、標準データセットの５番目サイクルでの信号値を基準値決定に使われる信号値に指定した。
標準データセットの総信号変化値を算出するために、実施例＜１−１＞と同一に収得した標準データセットからベースラインを差引きしてベースライン差引きされたデータセットを収得した。得られたベースライン差引きされたデータセットから総信号変化値が算出された。ベースライン差引きされたデータセットの最後の５０番目サイクルでのＲＦＵを前記総信号変化値とした。
本実施例では各機器から３個の標準データセットを収得し、各データセットの総信号変化値及び基準値決定に使われた信号値を算出した。具体的に、３個の機器別標準データセットから算出された３個の総信号変化値の平均を該当機器の総信号変化値に指定した。また、３個の機器別標準データセットの基準サイクルでの信号値の平均を該当機器の基準値決定に使われる信号値に指定した。
ハードウェア的に補正または未補正された機器１、２、３の標準データセットの総信号変化値（ＴＳＣ）及び基準値決定に使われる信号値は＜表４＞のように測定された。
＜ステップ２＞
前記算出された総信号変化値と共に機器別基準値決定に使われる基準総信号変化値（Ｒ−ＴＳＣ）が指定された。本実施例では前記実施例＜１−１＞で収得したハードウェア的に補正された３個機器で収得したデータセットの平均総信号変化値と類似したＲＦＵ ４５６０を基準総信号変化値に指定した（図３Ｂ参照）。
＜ステップ３＞
（ｉ）標準データセットの総信号変化値（ステップ１）、（ｉｉ）標準データセットの基準サイクルでの信号値（ステップ１）、及び（ｉｉｉ）基準総信号変化値（ステップ２）を用いて次の数式によって各機器に適用される基準値を算出した。
基準値＝標準データセットの基準サイクルでの信号値÷（標準データセットの総信号変化値／基準総信号変化値）
基準値算出結果、ハードウェア的に補正または未補正された機器１、２、３で収得したデータセットの補正に使われる基準値は＜表５＞に示すように決定された。
＜ステップ４＞
実施例＜１−１＞で収得した６個グループの原始データセットを前記ステップ３で決定された基準値を用いて実施例＜１−４−１＞と同一な方法により補正して、６個グループの補正されたデータセットを収得した。
Ａ．ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を適用したＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である補正データセットを分析した。図６Ａ及び図６Ｂは、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正して収得した補正されたデータセットの増幅曲線（図６Ａ）及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図６Ｂ）を各々示す。
補正されたデータセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図６Ａは補正されたデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。３個機器から収得したデータセットの５番目サイクルでの信号値は機器別基準値であるＲＦＵ ９８６２、８４００、及び７３８３に各々補正されて背景信号領域が類似するようになり、増幅区間も互いに類似の信号値を有することを確認した。
また、補正されたデータセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図６Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は各々２．３％、３．０％、及び１．０％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は３．０％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットの信号の変動係数。
＜表６＞に示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４６．３ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は５．６ｐ％だけ減少することを確認した。
これで、本発明の信号補正方法によれば、機器別標準データセットを用いて機器別に適用される基準値を調整しても機器間信号偏差及び単一機器内ウェル間信号偏差を効果的に減少させることができることを確認した。
Ｂ．ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である補正データセットを分析した。図７Ａ及び図７Ｂは、ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正して収得した補正されたデータセットの増幅曲線（図７Ａ）、及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図７Ｂ）を各々示す。
補正されたデータセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図７Ａは補正されたデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。３個の機器から収得したデータセットの５番目サイクルでの信号値は機器別基準値であるＲＦＵ ９０９９、８２５１、及び８３１６に各々補正されて背景信号領域が類似するようになっており、増幅区間も互いに類似の信号値を有することを確認した。
また、補正されたデータセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図７Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は、各々２．３％、２．３％、及び１．９％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は２．３％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを本実施例の機器別基準値を用いたＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットの信号の変動係数。
＜表７＞に示すように、ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４７ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は１５．４ｐ％だけ減少することを確認した。
これで、本発明の信号補正方法によれば、機器別標準データセットを用いて機器別に適用される基準値を調整しても機器間信号偏差及び単一機器内ウェル間信号偏差を効果的に減少させることができることを確認した。特に、ハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットをＳＢＮ方法により追加標準化する場合、追加的な補正効果が達成されることを確認した。
本発明のＳＢＮを用いたリアルタイムＰＣＲ機器から収得した信号の補正方法は、機器内信号偏差及び機器間信号偏差を容易に、かつソフトウェア的接近により減少させることができる。しかも、本発明の補正方法はハードウェア的方式でなく、ソフトウェア的方式であるので、多様なリアルタイムＰＣＲ機器に汎用的に適用可能である。また、本発明の方法は既にハードウェア的に補正されている機器から出た信号も追加的に補正することができる。リアルタイムＰＣＲ装置のような機器は出回る前のハードウェア的な補正を経る。このようなハードウェア的に補正された機器に適用される場合、本発明の方法はより正確に補正された機器を提供することができる。
実施例２：機器ブランク信号除去及び特定背景信号基盤標準化方法（ＩＢＳ−ＳＢＮ）によるデータセットの補正及び補正データセットの分析
ＳＢＮを用いたデータセットの補正は、機器ブランク信号と類似した信号値を差引きする場合、より正確になる。本実施例では、機器ブランク信号除去及び特定背景信号基盤標準化方法（ＩＢＳ−ＳＢＮ）が増幅された信号を補正することに使われた。
次の３個グループのデータセットが比較分析された；（ｉ）実施例＜１−１＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットグループ；（ｉｉ）実施例＜１−１＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットグループ；及び（ｉｉｉ）実施例＜１−１＞のデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法によりソフトウェア的に補正して収得したデータセットグループ。
＜２−１＞機器ブランク信号の測定
原始データセットは一般的に蛍光分子により発生する信号及び蛍光分子がなくても機器で基本的に発生する機器ブランク信号（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｂｌａｎｋ ｓｉｇｎａｌ）を全て含んでいる。したがって、蛍光分子により発生する信号のみを用いてより正確な結果を得るためには、機器ブランク信号を測定し、これを原始データセットから差引きすることが必要である。
本実施例では、空のチューブを測定して収得した信号を機器ブランク信号に用いた。
機器ブランク信号の測定はリアルタイムＰＣＲで信号を検出する温度付近でなされることができ、増幅サイクル反復の有無によって測定できる。本実施例では、実施例＜１−１＞に記述されたものと同一条件で１０個サイクルの増幅が遂行されており、１０番目サイクルで測定された信号値を機器ブランク信号に使用した。各条件別に機器ブランク信号は＜表９＞のように測定された。
＜２−２＞機器ブランク信号除去（ＩＢＳ）により１次補正データセット収得
実施例＜１−１＞の原始データセットから実施例＜２−１＞の機器ブランク信号を次の式により差引きして１次補正データセットを収得した。
１次補正データセット＝原始データセット−機器ブランク信号
前記式を用いた計算により、ハードウェア的に未補正された機器から収得した原始データセットを用いて３個グループの１次補正データセットを収得し、ハードウェア的に補正された機器から収得した原始データセットを用いて３個グループの１次補正データセットを収得して、総６個グループの１次補正データセットを準備した。
＜２−３＞ＳＢＮによるデータセット補正及び補正データセットの分析
前記１次補正データセットに実施例＜１−４＞と同一な方法によりＳＢＮを適用して２次補正データセットを収得しており、これを分析した。
＜２−３−１＞共通基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮによるデータセットの補正
本実施例では、実施例＜２−２＞のＩＢＳ方法により収得した６個グループの１次補正データセットを次のステップに従ってＳＢＮ方法によりソフトウェア的に補正した。
＜ステップ１＞
データセットの背景地域（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｒｅｇｉｏｎ）の特定サイクルを基準サイクルに指定した。本実施例では５番目サイクルを基準サイクルに指定した。
＜ステップ２＞
特定背景信号に標準化するために基準値を指定した。本実施例では、ＲＦＵ ５，３５０を基準値に指定した。
＜ステップ３＞
前記ステップ２で指定された基準値及び基準サイクルに対応する１次補正データセットのサイクルでの信号値から標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を計算した。
標準化係数＝基準サイクルでの信号値÷基準値
＜ステップ４＞
全てのサイクルでの信号値を前記標準化係数を用いて補正した。
２次補正信号値（ＲＦＵ）＝１次補正データセットの信号値（ＲＦＵ）÷標準化係数
実施例＜２−２＞で提供された６個グループの原始データセットを前記ステップ１〜４に従って補正して、補正された６個グループのデータセットを収得した。
Ａ．ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である２次補正データセットを分析した。図８Ａ及び図８Ｂは、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器ブランク信号を差引きし、前記ステップ１〜４に従って補正して収得した補正されたデータセットの増幅曲線（図８Ａ）及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図８Ｂ）を各々示す。
補正された２次補正データセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図８Ａは、２次補正データセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。図８Ａに示すように、機器間背景信号偏差の分布がＳＢＮを用いた補正により明確に減少したことを確認することができる。特に、５番目サイクル（基準サイクル）での全てのＲＦＵ値が指定された基準値と同一になっており、背景信号の偏差が無いことを確認することができる。
また、２次補正データセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図８Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は、各々１．１％、１．３％、及び０．８％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は１．３％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正データセットの信号の変動係数。
＜表１０＞示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４８．０ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は１６．４ｐ％だけ減少することを確認した。
本発明のＩＢＳ−ＳＢＮによる信号補正方法が機器間信号偏差だけでなく、単一機器内ウェル間信号偏差も減少させることができることを確認した。特に、ＩＢＳ−ＳＢＮ方法が機器をハードウェア的に補正する方法より顕著に優れる補正効果を示すことを確認しており、機器に対するハードウェア上の信号補正無しでＩＢＳ−ＳＢＮによる補正だけでもハードウェア的な補正より優れる信号補正効果が達成できることを確認した。
Ｂ．ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加補正したものであり、その結果である２次補正データセットを分析した。図９Ａ及び図９Ｂはハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを機器ブランク信号を差引きし、前記ステップ１〜４に従って補正して収得した２次補正データセットの増幅曲線（図９Ａ）及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図９Ｂ）を各々示す。
補正された２次補正データセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図９Ａは、２次補正データセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。図９Ａに示すように、機器間背景信号偏差の分布がＩＢＳ−ＳＢＮを用いた補正により明確に減少したことを確認することができる。特に、５番目サイクル（基準サイクル）での全てのＲＦＵ値が指定された基準値と同一になっており、背景信号の偏差が無いことを確認することができる。
また、２次補正データセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図９Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は、各々１．２％、１．７％、及び１．０％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は１．６％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正データセットの信号の変動係数。
＜表１１＞に示すように、ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した補正されたデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器と比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４７．３ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は１６．１ｐ％だけ減少することを確認した。
本発明のＩＢＳ−ＳＢＮによる信号補正方法が機器間信号偏差だけでなく、単一機器内ウェル間信号偏差も減少させることができることを確認した。特に、ハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加標準化する場合、追加的な補正効果が達成されることを確認した。
＜２−３−２＞総信号変化値によって決定された機器別基準値を適用したＩＢＳ−ＳＢＮによるデータセット補正
本実施例では機器間偏差を考慮して決定された機器別基準値を適用してデータセットを補正した。
以下のステップ１〜３で機器別標準データセットから機器別基準値を決定し、決定された機器別基準値を用いてステップ４で実施例＜２−２＞で収得した各１次補正データセットを補正した。
＜ステップ１＞
実験試料からデータセットを収得するために実施する実際信号発生反応の条件と同一な反応条件で標準濃度の標的分析物質を用いた標準信号発生反応を遂行して機器別標準データセットを収得した。基準値を決定するための信号値及び総信号変化値を機器別標準データセットから収得した。
本実施例で５番目サイクルが基準サイクルに指定されたので、標準データセットの５番目サイクルでの信号値を基準値決定に使われる信号値に指定した。
標準データセットの総信号変化値を算出するために、実施例＜２−２＞と同一な方法により得られた標準データセットに対する１次補正データセットを収得し、実施例＜１−１＞と同一な方法により得られた標準データセットからベースラインを差引きしてベースライン差引きされたデータセットを収得した。得られたベースライン差引きされたデータセットから総信号変化値が算出された。ベースライン差引きされたデータセットの最後の５０番目サイクルでのＲＦＵを前記総信号変化値とした。
本実施例では、各機器から３個の標準データセットを収得し、各データセットの総信号変化値及び基準値決定に使われた信号値を算出した。具体的に、３個の機器別標準データセットから算出された３個の総信号変化値の平均を該当機器の総信号変化値に指定した。また、３個の機器別標準データセットの基準サイクルでの信号値の平均を該当機器の基準値決定に使われる信号値に指定した。
ハードウェア的に補正または未補正された機器１、２、３の標準データセットの総信号変化値（ＴＳＣ）及び基準値決定に使われる信号値は＜表１２＞のように測定された。
＜ステップ２＞
前記算出された総信号変化値と共に機器別基準値決定に使われる基準総信号変化値（Ｒ−ＴＳＣ）が指定された。本実施例では、前記実施例＜１−１＞で収得したハードウェア的に補正された３個機器で収得したデータセットの平均総信号変化値と類似したＲＦＵ ４５６０を基準総信号変化値に指定した（図３Ｂ参照）。
＜ステップ３＞
（ｉ）標準データセットの総信号変化値（ステップ１）、（ｉｉ）標準データセットの基準サイクルでの信号値（ステップ１）、及び（ｉｉｉ）基準総信号変化値（ステップ２）を用いて各機器に適用される基準値を算出しており、算出された基準値を＜表１３＞に示した。
＜ステップ４＞
実施例＜２−２＞で機器ブランク信号除去（ＩＢＳ）方法により収得した６個グループの１次補正データセットを前記ステップ３で決定された基準値を用いて実施例＜２−３−１＞と同一な方法により補正して、６個グループの２次補正データセットを収得した。
Ａ．ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を適用したＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である２次補正データセットを分析した。図１０Ａ及び図１０Ｂは、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器ブランク信号を差引きした後、前記ステップ１〜４に従って補正して収得した２次補正データセットの増幅曲線（図１０Ａ）及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図１０Ｂ）を各々示す。
補正された２次補正データセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図１０Ａは２次補正データセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号の強さを比較することができる。分析結果、３個の機器から収得したデータセットの５番目サイクルでの信号値は機器別基準値であるＲＦＵ ５３２５、５４１１、及び５４１６に各々補正されて背景信号領域が類似するようになっており、増幅区間も互いに類似の信号値を有することを確認した。
また、２次補正データセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図１０Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は、各々１．１％、１．３％、及び０．８％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は１．１％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正データセットの信号の変動係数。
＜表１４＞に示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正データセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４８．２ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は１６．６ｐ％だけ減少することを確認した。
これで、ＩＢＳ−ＳＢＮを用いた本発明の信号補正方法によれば、機器別標準データセットを用いて機器別に適用される基準値を調整しても機器間信号偏差及び単一機器内ウェル間信号偏差を効果的に減少させることができることを確認した。
実施例＜１−４＞のＳＢＮを用いた補正方法と比較すると、機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮ方法が機器間信号偏差及び単一機器内ウェル間信号偏差減少効果がより優れることを確認した。
Ｂ．ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加補正したものであり、その結果である２次補正データセットを分析した。図１１Ａ及び図１１Ｂは、ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを機器ブランク信号を差引きした後、前記ステップ１〜４に従って補正して収得した補正されたデータセットの増幅曲線（図１１Ａ）、及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図１１Ｂ）を各々示す。
補正された２次補正データセットをフローティングして増幅曲線を収得した。図１１Ａは補正されたデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得た増幅曲線（Ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ）であり、背景信号領域及び増幅区間の信号強さを比較することができる。分析結果、３個機器から収得したデータセットの５番目サイクルでの信号値は機器別基準値であるＲＦＵ ５２３６、５２１８、及び５３３２に各々補正されて背景信号領域が類似するようになっており、増幅区間も互いに類似の信号値を有することを確認した。
また、２次補正データセットからベースラインを差引きし、ベースラインが差引きされたデータセットをフローティングしてベースラインが差引きされた増幅曲線（Ｂａｓｅｌｉｎｅ Ｂｕｂｔｒａｃｔｅｄ Ｃｕｒｖｅ）を収得し、５０番目サイクルでの変動係数を計算した。図１１Ｂはベースラインが差引きされた曲線であり、増幅領域の信号偏差を比較することができる。最後のサイクルでの増幅信号の変動係数を分析した。機器内増幅信号の変動係数は、各々１．２％、１．７％、及び１．０％であると確認され、増幅信号の機器間変動係数は１．３％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜１−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、（ｉｉ）実施例＜１−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットの信号の変動係数、及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを本実施例の機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正データセットの信号の変動係数。
＜表１５＞に示すように、ハードウェア的に補正された機器から収得したデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正データセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は４８ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットと比較した時、（ｉ）機器内増幅信号の変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間増幅信号の変動係数は１６．４ｐ％だけ減少することを確認した。
これで、本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法によるデータセット補正方法によれば、機器別標準データセットを用いて機器別に適用される基準値を調整しても機器間信号偏差及び単一機器内ウェル間信号偏差を効果的に減少させることができることを確認した。特に、ハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加標準化する場合、追加的な補正効果が達成されることを確認した。
実施例＜１−４＞のＳＢＮを用いた補正方法と比較すると（表７参照）、機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮ方法が機器別基準値を用いたＳＢＮ方法に比べてハードウェア的に補正された機器に対する追加補正の面で格段に効果が優れることを確認した。
本発明のＩＢＳ−ＳＢＮを用いたリアルタイムＰＣＲ機器から収得した信号の補正方法は、機器内信号偏差及び機器間信号偏差をやさしくてソフトウェア的接近により減少させることができ、ＳＢＮを用いた方法より格段に優れる補正効果を示す。
ＳＢＮまたはＩＢＳ−ＳＢＮ方法を利用すれば、標準化しようとするサイクル（言い換えると、基準サイクル）は、適切な信号が発生しない背景地域だけでなく、信号発生領域でも指定が可能である。これは、標準化方法自体が信号補正効果を有しており、基準サイクルの位置によって補正水準の差があるだけであることを意味する。
次の実施例３では、前記のような本発明方法の特徴を用いてメルティングカーブ分析でメルティング信号偏差も補正されることを確認した。
実施例３：機器ブランク信号除去及び特定背景信号基盤標準化方法（ＩＢＳ−ＳＢＮ）を用いたメルティングデータセットの補正及び分析
前記実施例１及び２では、ＳＢＮまたはＩＢＳ−ＳＢＮを用いて核酸増幅データセットを補正した。実施例３では、メルティングデータセットも本発明の方法によりソフトウェア的に補正されるかを確認した。
次に、３個グループのメルティング信号偏差が比較分析された：（ｉ）ハードウェア的に未補正された機器で収得したメルティングデータセットグループ；（ｉｉ）ハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットグループ、及び（ｉｉｉ）ＩＢＳ−ＳＢＮによりソフトウェア的に補正されたメルティングデータセット。
＜３−１＞メルティングデータセット準備
標的核酸分子に対するメルティング分析は＜表１６＞に記載された６台のＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＰＴＯＣＥアッセイを信号発生手段に使用して増幅サイクル５０回で遂行された。標的核酸分子は、Ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎのＤＮＡを使用した。相互作用的二重標識はレポーター分子（Ｑｕａｓａｒ ６７０）及びクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）が標識されたＣＴＯを使用した。
反応は、標的核酸分子、ダウンストリームプライマー、アップストリームプライマー、二重標識されたＣＴＯ、ＰＴＯ、及びＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ、及びＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むマスターミックスが含まれたチューブで遂行された。反応混合物が含まれたチューブをリアルタイムｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に取り付けて、１５分間９５℃で変性後、９５℃３０秒、６０℃６０秒、及び７２℃３０秒を１サイクルにして５０サイクルを進行した。メルティングデータセットは、リアルタイムＰＣＲ結果物を５５℃から８５℃まで加温しながら０．５℃単位で温度別蛍光信号を測定して収得した。
各機器別に９６個ウェルで同一な標的核酸序列が同一な濃度で含まれた試料を用いて９６個反応を同一な条件で遂行しており、これから得られたメルティングデータセットを分析して機器間、機器内信号偏差、及び本発明の方法に従う偏差水準の減少有無を確認した。
ハードウェア的な補正をしていない３台の機器とハードウェア的な補正をした３台の機器で構成された総６台のＰＣＲ機器を使用して温度に従う蛍光値で構成された総６個グループの原始メルティングデータセットを収得した。各グループは９６個の反応を通じて収得した９６個のデータセットで形成される。
収得した原始メルティングデータセットの負数変化値を計算して原始メルティングデータセットの変化値を求めた。前記変化値計算のために、以下の式によって最小二乗法（Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅ Ｍｅｔｈｏｄ）を原始メルティングデータセットに適用しており、原始メルティングデータセットの変化値が負数変化値形態に収得された。
I：データセットで変化値を求めようとするサイクル番号
ｘｉ：ｉ番目サイクルのサイクル番号
ｙｉ：ｉ番目サイクルで測定された信号強さ
ｓｉ：ｉ番目サイクルでデータの変化量
“ａ”及び“ｂ”：０以上１０以下の整数
ｎ：ａ＋ｂ＋１、変化値算出に使われるデータの個数
ｘ：“Ｉ−ａ”から“Ｉ＋ｂ”までのサイクル番号の平均
ｙ：“Ｉ−ａ”番目サイクルから“Ｉ＋ｂ”番目サイクルまで測定された信号強さの平均
本実施例では、前記ａ及びｂは１を使用した。Ｉ−ａが１より小さくなるデータ地点はＩ−ａを１になるようにａを変化させた。Ｉ＋ｂが全てのデータ地点の個数より大きくなるデータ地点ではＩ＋ｂが全てのデータ地点の個数と同一になるようにｂを変化させた。
原始メルティングデータセットをフローティングしてメルティングカーブを得ており、メルティング変化値曲線（メルティングピーク）は原始メルティングデータセットの変化値をフローティングして得た。
＜３−２＞ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセット分析
前記実施例＜３−１＞で収得した原始メルティングデータセット及びその変化値を用いた。ハードウェア的に未補正された機器から収得した３個グループの原始メルティングデータセット及び３個グループの原始メルティングデータセットの変化値の信号偏差を分析した。
３個の機器の全体的なメルティング信号パターンを確認するために原始メルティングデータセットをフローティングしてメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を収得した（図１２Ａ参照）。
メルティングカーブ分析結果、図１２Ａに示すように、同一な条件の増幅反応であるので、理論上、同一なメルティング開始温度での信号及び温度増加によって同一な強さの信号変化がフローティングされなければならないが、機器間信号が区分されて分かれることを確認した。また、同一機器で互いに異なるウェルでなされた互いに異なる反応間にも信号に差があることを確認した。
メルティングカーブ分析で信号を比較するために、３個の機器の各々で収得した原始メルティングデータセットの変化値をフローティングしてメルティング変化値カーブ（メルティングピーク）を収得した。メルティングピークの偏差がメルティングデータセットの変化値の偏差である。
メルティングピークの値が最高になる地点を分析温度（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に指定し、前記分析温度でのメルティングピークの値の変動係数を計算した。メルティングピークの変動係数、言い換えると、メルティングデータセットの変化値の変動係数は分析温度でのメルティングピークの値の変動係数である。変動係数の計算方法は、実施例＜１−２＞に記載されている。
図１２Ｂのように、メルティングピークの変動係数を確認した結果、機器内メルティングピークの信号変動係数は４．９％、５．９％、そして７．５％と確認され、機器間メルティングピークの信号変動係数は３７．８％と確認された。
＜３−３＞ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセット分析
実施例＜３−１＞でハードウェア的に補正された機器で収得した３個グループの原始メルティングデータセットと３個グループの前記原始メルティングデータセットの変化値の信号偏差を実施例＜３−２＞に記載されたものと同一な方法により分析した。
実施例＜３−２＞に記載されたものと同一な方法によりメルティングカーブを分析した結果、図１３Ａに示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットに比べて機器間信号の偏差は減少した。しかしながら、相変らず機器間、反応間、広く分散された信号偏差分布を示すことを確認した。
実施例＜３−２＞と同一な方法によりメルティング変化値曲線（メルティングピーク）の最大変化値の変動係数を確認した結果、図１３Ｂのように、機器内の変化値変動係数は５．８％、８．３％、そして７．９％と確認され、機器間変化値変動係数は７．５％と確認された。
前記結果を実施例＜３−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセット結果と比較すると、メルティングピークの機器内変動係数は大きな差がないと確認され、メルティングピークの機器間変動係数は３０．３ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ減少することと確認された。
このような結果から、ハードウェア調整による補正方法がメルティングピークの機器間変動係数を一部減少させることができるが、相変らず機器間の相当な信号偏差が存在し、単一機器内ウェル間メルティングピークの変動係数はハードウェア調整により減少させることができないことを確認した。
＜３−４＞ＩＢＳ−ＳＢＮを用いてソフトウェア的に補正されたメルティングデータセット分析
＜３−４−１＞機器ブランク信号測定
前記実施例＜２−１＞と同一な方法により機器ブランク信号を測定することができる。
メルティング分析では多様な温度で信号を検出するので、多様な温度で機器ブランク信号を測定することができ、各温度別に測定された各機器ブランク信号を適用することができる。
本実施例では、１つ温度で機器ブランク信号を測定し、前記実施例＜２−１＞と同一なリアルタイムＰＣＲ条件で空のチューブを用いて増幅サイクル１０回で遂行して収得したデータセットの１０番目サイクルの信号値を機器ブランク信号に使用した。各機器別に機器ブランク信号は＜表１７＞のように測定された。
＜３−４−２＞機器ブランク信号除去（ＩＢＳ）による１次補正メルティングデータセット収得
実施例＜３−１＞の原始メルティングデータセットから実施例＜３−４−１＞の機器ブランク信号を次の式に従って差引きして１次補正メルティングデータセットを収得した。
１次補正メルティングデータセット＝原始データセット−機器ブランク信号
前記式を用いた計算により、総６個グループの１次補正メルティングデータセットが用意された。ここには、ハードウェア的に未補正された機器から収得した原始メルティングデータセットを用いて収得した３個グループの１次補正メルティングデータセットとハードウェア的に補正された機器から収得した原始メルティングデータセットを用いて収得した更に他の３個グループの１次補正メルティングデータセットが含まれる。
＜３−４−３＞ＳＢＮによる１次補正メルティングデータセットの補正及び補正されたメルティングデータセットの分析
前記１次補正メルティングデータセットに実施例＜２−３＞と同一な方法によりＳＢＮを適用して２次補正メルティングデータセットを収得しており、これを分析した。
＜３−４−３−１＞共通基準値を用いたＳＢＮによる１次補正メルティングデータセットの補正
本実施例では、実施例＜３−４−２＞で収得した６個グループの１次補正メルティングデータセットを次のステップに従ってＳＢＮ方法によりソフトウェア的に補正した。全ての機器で収得したメルティングデータセットに単一基準値が適用された。
＜ステップ１＞
ＳＢＮ方法をサイクルの単位が温度であるメルティングカーブ分析に適用するために、標準化しようとする地点、言い換えると、メルティングデータセットで特定温度が基準サイクルに該当する基準温度に指定される。本実施例では、５５℃及び８５℃を基準温度に指定してメルティングデータセットを補正したものであり、その結果を比較分析した。
＜ステップ２＞
特定信号に標準化するための基準値を指定する。本実施例では、基準温度が５５℃である場合、ＲＦＵ４，９００を基準値に指定しており、基準温度が８５℃である場合、ＲＦＵ２，７００を基準値に指定した。
＜ステップ３＞
１次補正メルティングデータセットで基準温度に対応する信号値と前記ステップ２で提供された基準値から標準化係数を計算する。
標準化係数＝基準温度での信号値÷基準値
＜ステップ４＞
前記標準化係数を用いて全ての温度での信号値を補正した。
２次補正信号値（ＲＦＵ）＝１次補正メルティングデータセットの信号値（ＲＦＵ）÷標準化係数
実施例＜３−４−２＞で収得した６個グループの１次補正メルティングデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正して６個グループの２次補正メルティングデータセットを収得した。
Ａ．ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセット補正結果分析
ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である２次補正データセットを分析した。
図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１４Ｃは、ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器ブランク信号を差引きし、前記ステップ１〜４に従って補正して収得した２次補正メルティングデータセットの増幅曲線（図１４Ａ）、及び機器間及び機器内変動係数（ＣＶｓ）（図１４Ｂ及び１４Ｃ）を各々示す。
２次補正メルティングデータセットをフローティングしてメルティングカーブを収得した。図１４Ａは２次補正メルティングデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得たメルティングカーブであり、メルティング信号の強さを比較することができる。分析結果、機器間信号偏差は基準温度５５℃でＩＢＳ−ＳＢＮを用いた補正により明確に減少したことを確認することができる。特に、基準温度５５℃での全てのＲＦＵ値が指定された基準値と同一になっており、信号偏差が無いことを確認することができる。
また、前記２次補正メルティングデータセットから原始メルティングデータセットの変化値を得て、前記原始メルティングデータセットの変化値をフローティングしてメルティング変化値曲線（メルティングピーク）を収得した後、基準温度５５℃または８５℃で変動係数を計算した。
図１４Ｂは、基準温度５５℃に補正した２次補正メルティングデータセットのメルティングピークを示す。前記メルティングピークの変動係数（言い換えると、メルティングデータセットの変化値の変動係数）を分析した結果、メルティングピークの機器内変動係数は各々１．８％、１．１％、及び１．８％であると確認され、メルティングピークの機器間変動係数は１．８％と確認された。
図１４Ｃは、基準温度８５℃に補正した２次補正メルティングデータセットのメルティングピークを示す。前記メルティングピークの変動係数を分析した結果、メルティングピークの機器内変動係数は各々１．５％、１．９％、及び２．５％であると確認され、メルティングピークの機器間変動係数は２．３％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜３−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉ）実施例＜３−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉｉ）ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットの変化値で算出したメルティングピークの変動係数。
＜表１８＞に示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）基準温度５５℃及び８５℃のメルティングピークの機器間変動係数は各々３６．０ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）及び３５．５ｐ％だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）基準温度５５℃及び８５℃のメルティングピークの機器間変動係数は各々５．７ｐ％及び５．２ｐ％だけ減少することを確認した。
本発明のＩＢＳ−ＳＢＮによる信号補正方法が原始メルティングデータセットの変化値の機器間、機器内偏差を効果的に減少させることを確認した。特に、ＩＢＳ−ＳＢＮ方法が機器をハードウェア的に補正する方法より顕著に優れる補正効果を示すことを確認しており、機器に対するハードウェア上の補正無しでＩＢＳ−ＳＢＮによる補正だけでもハードウェア的な補正より優れるメルティング信号補正効果が達成できることを確認した。
基準温度（基準サイクル）に他の結果を比較した結果、基準温度に従う原始メルティングデータセットの変化値の偏差の減少割合はほとんど差がないし、原始メルティングデータセットの変化値の変動係数は基準温度に関わらず減少することを確認した。したがって、以下の実験は基準温度５５℃で進行された。
Ｂ．ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセット補正結果分析
ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法によりステップ１〜４に従って追加補正して２次補正メルティングデータセットを得ており、これを分析した。
図１５Ａは、ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットから機器ブランク信号を差引きした後、前記機器ブランク信号が差引きされたメルティングデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正して収得した２次補正メルティングデータセットに対するメルティングカーブを示す。
図１５Ｂは、前記２次補正メルティングデータセットに対する原始メルティングデータセットの変化値のメルティングピークから収得した機器内及び機器間変動係数を示す。
メルティングカーブは、前記２次補正メルティングデータセットをフローティングして収得した。図１５Ａは、２次補正メルティングデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得たメルティングカーブであり、メルティング信号の強さを比較することができる。図１５Ａに示すように、機器間信号偏差は基準温度５５℃でＩＢＳ−ＳＢＮを用いた補正により明確に減少したことを確認することができる。特に、基準温度５５℃での全てのＲＦＵ値が指定された基準値と同一になっており、信号偏差が無いことを確認することができる。
また、前記２次補正メルティングデータセットから原始メルティングデータセットの変化値を得て、前記原始メルティングデータセットの変化値をフローティングしてメルティング変化値曲線（メルティングピーク）を収得した後、基準温度５５℃で変動係数を計算した。図１５Ｂは、基準温度５５℃で補正した２次補正メルティングデータセットのメルティングピークを示す。前記メルティングピークの変動係数（言い換えると、メルティングデータセットの変化値の変動係数）を分析した結果、メルティングピークの機器内変動係数は各々１．６％、１．５％、及び２．３％であると確認されており、メルティングピークの機器間変動係数は２．０％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜３−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉ）実施例＜３−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉｉ）ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットの変化値で算出したメルティングピークの変動係数。
＜表１９＞に示すように、ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）基準温度５５℃のメルティングピークの機器間変動係数は３５．８ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）基準温度５５℃のメルティングピークの機器間変動係数は各々５．５ｐ％だけ減少することを確認した。
本発明のＩＢＳ−ＳＢＮによる信号補正方法が原始メルティングデータセットの変化値の機器間、機器内偏差を効果的に減少させることを確認した。特に、ハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットを本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加標準化する場合、メルティングデータセットに対する追加的な補正効果が達成されることを確認した。
＜３−４−３−２＞総信号変化値によって決定された機器別基準値を適用したＳＢＮによる１次補正メルティングデータセットの補正
機器別基準値は機器間偏差を考慮して決定されており、前記機器別基準値を用いてメルティングデータセットが補正された。実施例＜２−３−２＞に記載されたように、標準濃度の標的分析物質を用いて標準データセットを収得しており、これを用いて機器別基準値を用いた本発明の方法がメルティングカーブ分析にも適用されるかを確認した。
＜ステップ１＞
実験試料からメルティングデータセットを収得するために実施する実際の信号発生反応の条件と同一な反応条件で標準濃度の標的分析物質を用いて標準信号発生反応を遂行して機器別標準メルティングデータセットを収得した。基準値を決定するための信号値及び総信号変化値を機器別標準データセットから収得した。
本実施例で５５℃が基準温度（基準サイクル）に指定されたので、標準メルティングデータセットの５５℃でのメルティング信号値を基準値決定に使われる信号値に指定した。
標準メルティングデータセットの総信号変化値を算出するために、実施例＜３−４−２＞と同一な方法により得られた標準メルティングデータセットに対する１次補正データセットを収得し、収得した補正された標準メルティングデータセットから実施例＜３−１＞と同一な方法によりメルティングデータセットの変化値を収得した。得られたメルティングデータセットの変化値から総信号変化値が算出された。メルティングデータセットの変化値の最大値（メルティングピークの最大値）を前記総信号変化値とした。
本実施例では、各機器から３個の標準メルティングデータセットを収得し、各メルティングデータセットの総信号変化値及び基準値決定に使われた信号値を算出した。具体的に、３個の機器別標準メルティングデータセットから算出された３個の総信号変化値の平均を該当機器の総信号変化値に指定した。また、３個の機器別標準メルティングデータセットの基準サイクル（基準温度）での信号値の平均を該当機器の基準値決定に使われる信号値に指定した。
ハードウェア的に補正または未補正された機器１、２、３の標準メルティングデータセットの総信号変化値（ＴＳＣ）及び基準値決定に使われる信号値は＜表２０＞のように測定された。
＜ステップ２＞
前記算出された総信号変化値と共に機器別基準値決定に使われる基準総信号変化値（Ｒ−ＴＳＣ）が指定された。本実施例では、前記実施例＜３−１＞で収得したハードウェア的に補正された３個の機器で収得したデータセットの平均総信号変化値と類似したｓｌｏｐｅ ３００を基準総信号変化値に指定した（図１３Ｂ参照）。
＜ステップ３＞
（ｉ）標準メルティングデータセットの総信号変化値（ステップ１）、（ｉｉ）標準データセットの基準温度（基準サイクル）での信号値（ステップ１）、及び（ｉｉｉ）基準総信号変化値（ステップ２）を用いて各機器に適用される基準値を算出した。
基準値＝標準メルティングデータセットの基準サイクルでの信号値÷（標準メルティングデータセットの総信号変化値／基準総信号変化値）
各機器から収得した標準メルティングデータセットを分析して、ハードウェア的に未補正された機器及びハードウェア的に補正された機器で収得したデータセットの補正に使われる基準値を＜表２１＞のように決定した。
＜ステップ４＞
実施例＜３−４−２＞で収得した６個グループの１次補正メルティングデータセットを前記ステップ３で決定された機器別基準値を用いて実施例＜３−４−３−１＞と同一な方法により補正して、６個グループの２次補正メルティングデータセットを収得した。
Ａ．ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットの補正結果分析
ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器別基準値を適用したＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正したものであり、その結果である２次補正メルティングデータセットを分析した。図１６Ａは、ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正した結果のメルティングカーブである。図１６Ｂは、ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正した結果のメルティングピークから得た機器内及び機器間変動係数を示す。前記メルティングカーブは、ハードウェア的に未補正された機器から収得した原始メルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した２次補正メルティングデータセットをフローティングして収得した。
図１６Ａは２次補正メルティングデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得たメルティングカーブであり、メルティング信号の強さを比較することができる。分析結果、３個機器から収得したメルティングデータセットの５５℃での信号値は機器別基準値であるＲＦＵ４８５４、５００６、及び４９４３に各々補正されて背景信号領域が類似するようになっており、メルティング信号も互いに類似するようになったことを確認した。
前記２次補正メルティングデータセットから原始メルティングデータセットの変化値を収得し、これをフローティングしてメルティング変化値曲線（メルティングピーク）を収得し、前記メルティング変化値曲線から基準温度５５℃で変動係数を計算した。
図１６Ｂは、前記基準温度５５℃に補正した２次補正メルティングデータセットのメルティングピークを示す。前記メルティングピークの変動係数（言い換えると、メルティングデータセットの変化値の変動係数）を分析した結果、メルティングピークの機器内変動係数は各々１．８％、１．１％、及び１．８％であると確認されており、メルティングピークの機器間変動係数は１．７％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜３−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉ）実施例＜３−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉｉ）ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットの変化値で算出したメルティングピークの変動係数。
＜表２２＞に示すように、ハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間変化値偏差の変動係数は３６．１ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間変化値偏差の変動係数は５．８ｐ％だけ大幅に減少することを確認した。
機器別標準メルティングデータセットを用いて機器別基準値を調整する本発明の方法は、温度をサイクルにするメルティングデータセットの機器内及び機器間信号偏差を効果的に減少させることを確認しており、機器に対するハードウェア上の補正無しで総信号変化値により決定された基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮ方法による補正だけでもハードウェア的な補正より優れるメルティング信号補正効果を達成することができることを確認した。
Ｂ．ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセット補正結果分析
ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器別基準値を適用したＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加補正して２次補正メルティングデータセットを得ており、これを分析した。図１７Ａはハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正した結果に対するメルティングカーブを示す。図１７Ｂは、ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットを前記ステップ１〜４に従って補正した結果のメルティングピークから得た機器内及び機器間変動係数を示す。前記メルティングカーブは、ハードウェア的に補正された機器から収得した原始メルティングデータセットをＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した２次補正メルティングデータセットをフローティングして収得した。
図１７Ａは、２次補正メルティングデータセットをベースライン差引き無しでフローティングして得たメルティングカーブであり、メルティング信号の強さを比較することができる。分析結果、３個機器から収得したメルティングデータセットの５５℃での信号値は機器別基準値であるＲＦＵ ４８７５、４９６３、及び４９６３に各々補正されて背景信号領域が類似するようになっており、メルティング信号も互いに類似するようになったことを確認した。
前記２次補正メルティングデータセットから原始メルティングデータセットの変化値を収得し、これをフローティングしてメルティング変化値曲線（メルティングピーク）を収得し、前記メルティング変化値曲線から基準温度５５℃で変動係数を計算した。
図１７Ｂは、前記基準温度５５℃に補正した２次補正メルティングデータセットのメルティングピークを示す。前記メルティングピークの変動係数（言い換えると、メルティングデータセットの変化値の変動係数）を分析した結果、メルティングピークの機器内変動係数は各々１．６％、１．５％、及び２．３％と確認されており、メルティングピークの機器間変動係数は１．９％と確認された。
次の３個の変動係数を比較分析した：（ｉ）実施例＜３−２＞のハードウェア的に未補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；（ｉｉ）実施例＜３−３＞のハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットの変化値から算出したメルティングピークの変動係数；及び（ｉｉｉ）ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットの変化値で算出したメルティングピークの変動係数。
＜表２３＞に示すように、ハードウェア的に補正された機器から収得したメルティングデータセットを機器別基準値を用いたＩＢＳ−ＳＢＮにより補正して収得した２次補正メルティングデータセットは、次のような特徴を有する：ハードウェア的に未補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間メルティングピークの変動係数は３５．９ｐ％（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）だけ大幅に減少することを確認した。また、これをハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットと比較した時、（ｉ）機器内メルティングピークの変動係数が半分以下に減少することを確認しており、（ｉｉ）機器間メルティングピークの変動係数は５．６ｐ％だけ大幅に減少することを確認した。
ハードウェア的に補正された機器で収得したメルティングデータセットを本発明のＩＢＳ−ＳＢＮ方法により追加標準化する場合、メルティングデータセットに対するより正確な補正効果が達成されることを確認した。
以上のように、本発明のＩＢＳ−ＳＢＮを用いた信号補正方法は増幅信号だけでなく、メルティング信号にも適用可能であり、同一な効果が示されることを確認した。メルティングカーブ分析は、信号検出温度に対する微細な調節が必要な方法であるので、増幅曲線分析より機器間信号偏差が発生する可能性が高い。したがって、本発明の信号補正方法はメルティングカーブ分析にさらに有用であることと期待される。
実施例４：機器ブランク信号除去及び特定背景信号基盤標準化方法（ＩＢＳ−ＳＢＮ）によるデータセットの信号強さ調節
実施例４では、機器ブランク信号除去及び特定背景信号基盤標準化方法（ＩＢＳ−ＳＢＮ）によりデータセットの信号補正だけでなく、信号強さの調節が可能であるかを試験したものであり、このようなデータセットの信号強さ調節により信号発生手段に使われる物質（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）の濃度を減少させることができるかを確認した。
まず、低濃度のＴａｑＭａｎプローブを使用して標的核酸序列に対するリアルタイムＰＣＲを通じてデータセット収得し、これを多様な基準値を適用したＩＢＳ−ＳＢＮ方法により補正して収得した２次補正データセットを収得した。前記２次補正データセットを実際の多様な濃度のＴａｑＭａｎプローブを使用して標的核酸物質に対するリアルタイムＰＣＲを通じて収得したデータセットと比較分析した。
また、多様な基準値を適用したＩＢＳ−ＳＢＮ方法によりデータセットを補正する場合のデータセットの機器間信号偏差が変わるか否かも調査した。
＜４−１＞ＩＢＳ−ＳＢＮにより補正されたデータセットと濃度別データセットの比較
標的核酸分子に対するリアルタイムＰＣＲはＢｉｏ−Ｒａｄ社のＣＦＸ９６ＴＭ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、ＴａｑＭａｎプローブを信号発生手段に使用して増幅サイクル５０回で遂行された。
１つの機器を用いてＴａｑＭａｎプローブ濃度を反応当たり１ｐｍｏｌｅ、２ｐｍｏｌｅ、３ｐｍｏｌｅ、及び５ｐｍｏｌｅに設定して４個の原始データセットを収得した。
前記実施例＜１−１＞に記載された方法と同一な方法により前記原始データセットから濃度別ベースライン差引きされたデータセット（グループＡ）を求めた。
１ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブを使用して収得したデータセットを実施例２の方法により補正して、２ｐｍｏｌｅ、３ｐｍｏｌｅ、５ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブを使用して収得した各々のデータセットと類似した信号値を有する３個の２次補正データセットを収得した。
具体的に、まず使われた機器の機器ブランク信号を実施例＜２−１＞のように測定した。機器ブランク信号はＲＦＵ ３４６６に測定された。１ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブを使用して収得したデータセットで機器ブランク信号であるＲＦＵ ３４６６を差引きして１次補正データセットを収得した。
前記１次補正データセットから基準サイクルを５番目サイクルに設定し、ＴａｑＭａｎプローブ濃度別データセットの信号強さと類似した信号強さが検出されるように基準値をＲＦＵ ２，７００、４，１００、そして５，９００に設定して３個の補正された２次補正データセットを収得した。前記濃度別２次補正データセットから実施例＜１−１＞の方法によりベースライン差引きされたデータセット（グループＢ）を各々求めた。
前記グループＡとグループＢのデータセットをフローティングして比較分析した。
第１に、データセットの信号強さを比較するために前記グループＡ及びグループＢデータセットの最後のサイクル（５０番目サイクル）で信号値を比較した。
その結果、図１８のように、グループＡのＴａｑＭａｎプローブ濃度増加に従ってデータセットの信号強さが増加するパターンと、グループＢのＩＢＳ−ＳＢＮを用いて基準値変化によりデータセットの信号強さが増加するパターンが類似することを確認することができた。
第２に、グループＡとグループＢデータセット間ターゲット検出時点差の比較のために、グループＡとグループＢの各データセットのＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値を分析した。Ｃｔ値はしきい値をＲＦＵ ５００に設定して、前記しきい値に該当するサイクル値に決定した。
その結果、図１８に示すように、グループＡの各濃度別データセットのＣｔ値とグループＢの適用された各基準値別データセットのＣｔ値が互いに類似することを確認した。
前記結果のように、ＩＢＳ−ＳＢＮを用いて基準値変化によりデータセットの信号強さを所望の通り調節できることを確認しており、これはデータセットの信号強さ増加のために測定機器をハードウェア的に調節するか、または信号発生手段に使用する物質（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）の濃度を増加させる必要無しで、ソフトウェア上でデータセットの信号強さ調節が可能であることが分かった。
上記のようにＩＢＳ−ＳＢＮを用いて基準値変化によりデータセットの信号強さを調節する場合、基準値変化によってＩＢＳ−ＳＢＮの効果である信号偏差補正効果に差があるかを以下の実施例＜４−２＞で確認した。
＜４−２＞ＩＢＳ−ＳＢＮによる信号強さの調節に従う補正されたデータセットの変動係数確認
ＩＢＳ−ＳＢＮ方法により信号強さが調節された２次補正データセットを収得する場合、基準値調節によりデータセットの信号偏差（変動係数）に変化が発生するかを確認した。
実施例＜２−２＞で、ハードウェア的に未補正された機器３台を用いて収得した１次補正データセットをＲＦＵ ５，０００、１０，０００、及び１５，０００を基準値にして実施例＜２−３＞の方法のように、各々ＳＢＮにより補正して２次補正データセットを収得し、実施例＜１−２＞と同一な方法により増幅曲線及び変動係数を収得した。基準サイクルを５番目サイクルに設定した。その結果は、以下の＜表２４＞の通りである。
Ｍｉｎ．：最小値；Ｍａｘ．：最大値；Ｒａｎｇｅ：Ｍａｘ−Ｍｉｎ；ＳＤ：標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）；ＣＶ：変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）
前記＜表２４＞に示すように、基準値変化によって各機器毎に信号の最大値、最小値、範囲、平均値、そして標準偏差は変化することを見ることができるが、機器内（Ｉｎｔｒａ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、機器間（Ｉｎｔｅｒ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）信号偏差に該当する変動係数（ＣＶ）は基準値の変化に関わらず同一な値であることを確認することができた。
前記結果のように、ＩＢＳ−ＳＢＮを用いて基準値変化によりソフトウェア上でデータセットの信号強さを所望の通り調節できるので、信号強さを増加させるために測定機器をハードウェア的に調節するか、または信号発生手段に使用する物質（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）の濃度を調節する必要がない。したがって、本発明の方法により補正用物質の生産費、補正時間、及び信号発生物質生産費の減少効果が表れることと期待される。これと同時に、ソフトウェア上でデータセットの信号偏差の補正も同時に可能であるので、より有用な補正方法に使用することができる。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものでない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。

Claims (26)

  1. 次のステップを含む試料内の標的分析物質に対するデータセットを補正するためのコンピュータにより実行される方法：
    （ａ）前記データセット補正のための標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を提供するステップ；前記データセットは信号発生手段を用いた前記標的分析物質に対する信号発生反応から収得され；前記データセットは前記信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含み；前記標準化係数は基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及び前記データセットを用いて提供され；前記基準サイクルは前記データセットのサイクルから選択され；前記基準値は任意に定まった値であり；前記標準化係数は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供され；前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の前記関係は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値の前記基準値に対する割合（ｒａｔｉｏ）であり；そして
    （ｂ）前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供するステップ。
  2. 前記標的分析物質に対するデータセットは、前記試料内の前記標的分析物質の存在または不存在を示す情報を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記信号発生反応は、試料内の前記標的分析物質の存在に依存的に信号を発生させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記信号発生反応は、前記信号値の増幅反応であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記標的分析物質は、標的核酸分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記信号発生反応は、標的核酸分子の増幅が伴われるか、または伴われないで遂行される反応であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 前記信号発生反応は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）またはリアルタイムＰＣＲであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ステップ（ａ）のデータセットは、機器ブランク信号が除去されたデータセットであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  9. 前記基準サイクルは、信号基準サイクルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 前記基準サイクルは、少なくとも２つの基準サイクルを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 前記信号値の増幅反応は背景信号区域の信号値と信号増幅区域の信号値を提供する反応であり、前記基準サイクルは背景信号区域から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  12. 前記信号発生反応はＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）またはリアルタイムＰＣＲであり、前記基準サイクルは前記ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲの信号増幅区域の以前の背景信号区域から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記信号発生反応は別途の反応容器で遂行される複数の信号発生反応を含み、前記データセットは前記複数の信号発生反応で収得された複数のデータセットであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  14. 前記複数のデータセットは、同一な基準値を用いて補正されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記複数のデータセットのうち、少なくとも２つのデータセットは互いに異なる基準値を用いて補正されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記基準サイクルは各データセットの基準サイクルグループから選択され、前記各データセットの基準サイクルグループは互いに同一な方式により提供されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記複数のデータセットは同一な基準サイクルを用いて補正されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記複数の信号発生反応は、互いに異なる機器で遂行されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記基準値は前記基準サイクルに該当する前記複数のデータセットのサイクルでの信号値の平均値±標準偏差範囲内で決定されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  20. 前記基準値は、（ｉ）基準総信号変化値に対する標準データセットの総信号変化値の割合、及び（ｉｉ）前記標準データセットから決定され；前記標準データセットは標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得するために使われる反応サイトと同一な反応サイトを用いて収得し；前記基準総信号変化値は標的分析物質に対する信号発生反応からデータセットを収得するために使われる反応サイトと相異する反応サイトを用いて収得した１つまたはその以上のデータセットから決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  21. 前記補正データセットは、試料内の標的分析物質の定性的または定量的検出に用いられることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  22. 前記補正された信号値は、次のような＜数式１＞を用いて収得したことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  23. 前記方法は次のステップをステップ（ａ）以前に追加で含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法：試料内の標的分析物質に対するデータセットを収得するために信号発生反応を遂行するステップ。
  24. 試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取可能な記録媒体であって、前記方法は次のステップを含む：
    （ａ）前記データセット補正のための標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を提供するステップ；前記データセットは信号発生手段を用いた前記標的分析物質に対する信号発生反応から収得され；前記データセットは前記信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含み；前記標準化係数は基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及び前記データセットを用いて提供され；前記基準サイクルは前記データセットのサイクルから選択され；前記基準値は任意に定まった値であり；前記標準化係数は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供され；前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の前記関係は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値の前記基準値に対する割合（ｒａｔｉｏ）であり；そして
    （ｂ）前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供するステップ。
  25. （ａ）コンピュータプロセッサ、及び（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた前記請求項２４のコンピュータ読取可能な記録媒体を含む、試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正装置。
  26. 試料内の標的分析物質に対するデータセットの補正方法を実行するためのプロセッサを具現する、コンピュータ読取可能な記録媒体に格納されるコンピュータプログラムであって、前記方法は、次のステップを含む：
    （ａ）前記データセット補正のための標準化係数（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を提供するステップ；前記データセットは信号発生手段を用いた前記標的分析物質に対する信号発生反応から収得され；前記データセットは前記信号発生反応のサイクル及び前記サイクルでの信号値を含む複数のデータ地点を含み；前記標準化係数は基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）、基準サイクル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｙｃｌｅ）、及び前記データセットを用いて提供され；前記基準サイクルは前記データセットのサイクルから選択され；前記基準値は任意に定まった値であり；前記標準化係数は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の関係を定めて提供され；前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値及び前記基準値の間の前記関係は前記データセットで前記基準サイクルに該当するサイクルの信号値の前記基準値に対する割合（ｒａｔｉｏ）であり；そして
    （ｂ）前記標準化係数を前記データセットの信号値に適用して補正された信号値を得て補正データセットを提供するステップ。
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