JP6678483B2 - Method for producing oligosaccharide - Google Patents
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Description
本発明は、糖１リン酸を生成する反応、オリゴ糖を生成する反応、及び、ＡＴＰを再生させる反応の組み合わせを同時に行うことを含む、オリゴ糖の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an oligosaccharide, comprising simultaneously performing a combination of a reaction for producing a sugar monophosphate, a reaction for producing an oligosaccharide, and a reaction for regenerating ATP.
オリゴ糖は、数個の単糖がグリコシド結合によって結合してなるオリゴマーであり、今日、医薬品、化粧品、食品添加物等、様々な分野において利用されている。 Oligosaccharides are oligomers in which several monosaccharides are linked by glycosidic bonds, and are currently used in various fields such as pharmaceuticals, cosmetics, and food additives.
オリゴ糖の製造は一般的に、天然に得られる多糖（セルロース、キチン、アガロース、デンプン、グリコーゲン、ペクチン等）の限定分解、又は酵素による糖転移反応によって製造される。また、グリコシド結合を加リン酸分解して糖１リン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素であるホスホリラーゼを利用して、特定の糖１リン酸を用いてオリゴ糖を調製する技術も開発・報告されている（特許文献１−３）。 Oligosaccharides are generally produced by limited degradation of naturally-occurring polysaccharides (cellulose, chitin, agarose, starch, glycogen, pectin, etc.) or by enzymatic transglycosylation. We have also developed a technology to prepare oligosaccharides using specific sugar 1-phosphate using phosphorylase, which is an enzyme that catalyzes the reversible reaction to phosphorylate glycosidic bonds to produce sugar 1-phosphate. It has been reported (Patent Documents 1-3).
しかしながら、前者は製造効率が十分に高いものとはいえない課題を有し、また後者は特定の糖１リン酸を生成・利用する反応に依拠することから汎用性が乏しく、そのため安価な糖を原料としてオリゴ糖を製造できない場合もあった。 However, the former has a problem that the production efficiency cannot be said to be sufficiently high, and the latter has low versatility because it relies on a reaction for producing and utilizing a specific sugar monophosphate. In some cases, oligosaccharides could not be produced as raw materials.
本発明は、簡便かつ効率的であり、また、様々な糖を原料として利用し得る汎用性の高い、オリゴ糖の製造方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing an oligosaccharide that is simple and efficient, and that can be used with various sugars as a raw material and has high versatility.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、アノメリックキナーゼを用いて糖（供与体糖）より糖１リン酸を生成する反応と、得られた糖１リン酸と受容体糖よりホスホリラーゼを用いてオリゴ糖を生成する反応、ならびに、オリゴ糖生成の際に生じるリン酸を利用して、アノメリックキナーゼの反応に利用されるＡＴＰを再生させる反応を組み合わせ、これらの反応を同時に行うことにより、簡便かつ効率的に、また様々な糖を原料として、オリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that a reaction for producing sugar monophosphate from a sugar (donor sugar) using an anomeric kinase, and a reaction between the obtained sugar monophosphate and an acceptor. A reaction for generating oligosaccharides from body sugars using phosphorylase, and a reaction for regenerating ATP used for the reaction of anomeric kinase using phosphoric acid generated during the production of oligosaccharides, are combined. The present inventors have found that oligosaccharides can be produced simply and efficiently by using various sugars as raw materials, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］ オリゴ糖の製造方法であって、
以下の（ｉ）〜（ｖ）の酵素：
（ｉ）ホスホリラーゼ、
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、
（ｉｖ）カタラーゼ、及び
（ｖ）酢酸キナーゼ、を
リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、
供与体糖、受容体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用させることを含む、上記方法。
［２］ （ｉ）ホスホリラーゼが、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ、１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、マルトース転移スターチシンターゼより選択される、［１］の方法。
［３］ （ｉｉ）アノメリックキナーゼが、ガラクトキナーゼ、グルクロノキナーゼ、ガラクチュロノキナーゼ、アラビノキナーゼ、フコキナーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、及びマルトキナーゼより選択される、［１］又は［２］の方法。
［４］ （ｉ）ホスホリラーゼ及び（ｉｉ）アノメリックキナーゼが以下の組み合わせよりなる、［１］の方法：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；あるいは、
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ。
［５］ （ｉ）ホスホリラーゼ及び（ｉｉ）アノメリックキナーゼが以下の組み合わせよりなる、［４］の方法：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；あるいは、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ。
［６］ さらに、製造されたオリゴ糖を精製する工程を含む、［１］〜［５］のいずれかの方法。
That is, the present invention has the following features.
[1] A method for producing an oligosaccharide,
The following enzymes (i) to (v):
(I) phosphorylase,
(Ii) anomeric kinase,
(Iii) pyruvate oxidase,
(Iv) catalase and (v) acetate kinase in the presence of phosphate and ATP and / or ADP,
Such a method, comprising co-acting with a donor sugar, an acceptor sugar, an oxygen molecule, and pyruvate.
[2] (i) The phosphorylase is 1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase, 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase, N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase, 1,4 -Β-mannosyl glucose phosphorylase, 1,4-β-mannooligosaccharide phosphorylase, 1,4-β-mannosyl-N-acetylglucosamine phosphorylase, 1,4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase, The method of [1], which is selected from 1,2-β-mannobiose phosphorylase, 1,2-β-mannooligosaccharide phosphorylase, and maltose transfer starch synthase.
[3] (ii) the anomeric kinase is selected from galactokinase, glucuronokinase, galacturonokinase, arabinokinase, fucokinase, N-acetylgalactosamine kinase, N-acetylhexosamine 1-kinase and maltokinase , [1] or [2].
[4] The method of [1], wherein (i) phosphorylase and (ii) anomeric kinase comprise the following combination:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase;
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase;
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl glucose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl-N-acetylglucosamine phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,2-β-mannobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,2-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
Maltose transfer starch synthase and maltokinase.
[5] The method of [4], wherein (i) phosphorylase and (ii) anomeric kinase comprise the following combination:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase;
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase;
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase.
[6] The method according to any one of [1] to [5], further comprising a step of purifying the produced oligosaccharide.
本発明によれば、糖１リン酸を生成する反応、オリゴ糖を生成する反応、ならびに、ＡＴＰを再生させる反応を組み合わせ、これらの反応を同時に行うことにより、一段階でオリゴ糖の製造を行うことができ、また、様々な糖を原料として利用し得ることから、簡便かつ効率的であり、また汎用性の高い、オリゴ糖の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, a reaction for generating sugar monophosphate, a reaction for generating oligosaccharides, and a reaction for regenerating ATP are combined, and the oligosaccharides are produced in one step by simultaneously performing these reactions. In addition, since various sugars can be used as a raw material, it is possible to provide a method for producing an oligosaccharide that is simple, efficient, and versatile.
本発明はオリゴ糖の製造方法であって、
以下の（ｉ）〜（ｖ）の酵素：
（ｉ）ホスホリラーゼ、
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、
（ｉｖ）カタラーゼ、及び
（ｖ）酢酸キナーゼ、を
リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、
出発原料である、供与体糖、受容体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用・反応させることを含む。
The present invention relates to a method for producing an oligosaccharide,
The following enzymes (i) to (v):
(I) phosphorylase,
(Ii) anomeric kinase,
(Iii) pyruvate oxidase,
(Iv) catalase and (v) acetate kinase in the presence of phosphate and ATP and / or ADP,
It includes reacting and reacting simultaneously with the starting materials, donor saccharide, acceptor saccharide, oxygen molecule, and pyruvic acid.
本発明において「ホスホリラーゼ」とは、グリコシド結合を加リン酸分解して糖１リン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素を意味し、このような酵素には例えば、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２４７）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２８０）、１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２８１）、１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．３２０）、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ、１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ、マルトース転移スターチシンターゼ（ＥＣ２．４．９９．１６）等を挙げることができ（Ｍｏｔｏｍｉｔｓｕ Ｋｉｔａｏｋａ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９９（２０），８３７７−８３９０（２０１５））、本発明においては、目的とするオリゴ糖、ホスホリラーゼの反応に用いられる基質（供与体糖より生成される糖１リン酸及び受容体糖）に基づいて、これらより選択されるものを利用することができる。 In the present invention, the term "phosphorylase" refers to an enzyme that catalyzes a reversible reaction that phosphorylates a glycosidic bond to produce a sugar monophosphate. Examples of such an enzyme include 1,3-β-galactosyl. -N-acetylhexosamine phosphorylase (EC 2.4.1.211), 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase (EC 2.4.1.247), N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase (EC2) 4.4.1280), 1,4-β-mannosylglucose phosphorylase (EC 2.4.4.1281), 1,4-β-mannosooligosaccharide phosphorylase, 1,4-β-mannosyl-N-acetylglucosamine phosphorylase (EC 2.4.1.320), 1,4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose phosphoryler , 1,2-β-mannobiose phosphorylase, 1,2-β-mannooligosaccharide phosphorylase, maltose transfer starch synthase (EC 2.4.9.16) and the like (MotomitSU Kitaoka, Appl. Microbiol. Biotechnol). , 99 (20), 8377-8390 (2015)), and in the present invention, a substrate (sugar monophosphate and acceptor saccharide generated from a donor saccharide) used for a reaction of an objective oligosaccharide or phosphorylase. Based on the above, the one selected from these can be used.
本発明においては、好ましくは、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼを利用することができる。 In the present invention, preferably, 1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase, 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase, N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase is used. it can.
本発明において、ホスホリラーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌（例えば、クロストリジウム属細菌由来、ビブリオ属細菌由来、ビフィドバクテリウム属細菌）由来のもの等を用いることができる。 In the present invention, known phosphorylases can be used, and the origins thereof are not particularly limited. For example, human-derived, animal-derived, and bacterial (eg, Clostridium, Vibrio, Bifidobacterium) Genus).
本発明において「アノメリックキナーゼ」とは、糖とＡＴＰから糖１リン酸とＡＤＰを生成する反応を触媒する酵素を意味し、このような酵素には例えば、ガラクトースを基質として利用することができるガラクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６）、グルクロン酸を基質として利用することができるグルクロノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４３）、ガラクチュロン酸を基質として利用することができるガラクチュロノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４４）、Ｌ−アラビノースを基質として利用することができるアラビノキナーゼ（ＥＣ２．７．１．４６）、Ｌ−フコースを基質として利用することができるフコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５２）、Ｎ−アセチルガラクトサミンを基質として利用することができるＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１５７）、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びマンノースを基質として利用することができるＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６２）、マルトースを基質として利用することができるマルトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６５）等を挙げることができ、目的とするオリゴ糖、ホスホリラーゼの反応に必要とされる基質（供与体糖より生成される糖１リン酸及び受容体糖）に基づいて、これらより選択されるものを利用することができる。 In the present invention, “anomeric kinase” means an enzyme that catalyzes a reaction for producing sugar monophosphate and ADP from sugar and ATP, and for example, galactose can be used as a substrate for such an enzyme. Galactokinase (EC 2.7.1.6), glucuronokinase (EC 2.7.1.43) that can use glucuronic acid as a substrate, and galacturonokinase that can use galacturonic acid as a substrate (EC2.7.1.43) EC 2.7.1.44), arabinokinase (EC 2.7.1.46) that can use L-arabinose as a substrate, and fucokinase (EC 2.7.4) that can use L-fucose as a substrate. 1.52), N-acetylgalactosamine which can utilize N-acetylgalactosamine as a substrate (EC 2.7.1.157), N-acetylhexosamine 1-kinase (EC 2.7.1.162), which can utilize N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine and mannose as substrates, and maltose. Maltokinase (EC 2.7.1.165) and the like which can be used as a substrate can be exemplified, and a substrate (a sugar 1 generated from a donor sugar) required for a reaction of a target oligosaccharide or phosphorylase can be mentioned. Based on phosphoric acid and acceptor sugar), those selected from these can be used.
本発明においては例えば、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マルトキナーゼを利用することができ、好ましくは、ガラクトキナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼを利用することができる。 In the present invention, for example, galactokinase, N-acetylhexosamine 1-kinase and maltokinase can be used, and preferably, galactokinase and N-acetylhexosamine 1-kinase can be used.
本発明において、アノメリックキナーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌（例えば、ビフィドバクテリウム属細菌）由来のもの等を用いることができる。 In the present invention, known anomeric kinases can be used, and the origin is not particularly limited. Examples thereof include those derived from humans, animals, and bacteria (for example, bacteria of the genus Bifidobacterium). Can be used.
本発明において好ましくは、アノメリックキナーゼは上記ホスホリラーゼと以下の組み合わせで用いることができる：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；あるいは、
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ。
In the present invention, preferably, the anomeric kinase can be used in combination with the above phosphorylase in the following combination:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase;
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase;
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl glucose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl-N-acetylglucosamine phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,2-β-mannobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,2-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
Maltose transfer starch synthase and maltokinase.
より好ましくは、アノメリックキナーゼは上記ホスホリラーゼと以下の組み合わせで用いることができる：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；あるいは、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ。
More preferably, anomeric kinases can be used in combination with the above phosphorylases:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase;
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase;
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase.
本発明において「ピルビン酸オキシダーゼ」とは、ピルビン酸をリン酸の存在下に酸素により酸化し、アセチルリン酸と二酸化炭素と過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を意味する。 In the present invention, "pyruvate oxidase" means an enzyme that oxidizes pyruvic acid with oxygen in the presence of phosphoric acid and catalyzes a reaction that produces acetyl phosphate, carbon dioxide, and hydrogen peroxide.
本発明において、ピルビン酸オキシダーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌由来のもの等を用いることができる。 In the present invention, a known pyruvate oxidase can be used, and its origin is not particularly limited. For example, those derived from humans, animals, and bacteria can be used.
本発明において「カタラーゼ」とは、過酸化水素を不均化して、水１分子と酸素（Ｏ２）１／２分子に分解する反応を触媒する酵素を意味する。 In the present invention, “catalase” refers to an enzyme that catalyzes a reaction that disproportionates hydrogen peroxide and decomposes it into one molecule of water and 1/2 molecule of oxygen (O 2 ).
本発明において、カタラーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌由来のもの等を用いることができる。 In the present invention, known catalase can be used, and its origin is not particularly limited. For example, those derived from humans, animals, and bacteria can be used.
本発明において「酢酸キナーゼ」とは、アセチルリン酸とＡＤＰを酢酸とＡＴＰに変換する反応を触媒する酵素を意味する。 In the present invention, “acetate kinase” means an enzyme that catalyzes a reaction for converting acetyl phosphate and ADP to acetic acid and ATP.
本発明において、酢酸キナーゼは公知のものを利用することができ、その由来は特に限定されず、例えば、ヒト由来、動物由来、細菌（例えば、ビフィドバクテリウム属細菌）由来のもの等を用いることができる。 In the present invention, known acetate kinases can be used, and the origin is not particularly limited. For example, those derived from humans, animals, bacteria (for example, bacteria of the genus Bifidobacterium), and the like are used. be able to.
上記の酵素はいずれも、天然の生物又は遺伝子組換え生物（もしくは細胞）により産生されたもの、あるいは市販されているものを用いることができる。遺伝子組換え生物（もしくは細胞）は、当業者に公知である分子生物学的手法を用いて、各酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、そのベクターを用いて適当な宿主生物（例えば、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を形質転換することにより得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ／Ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）参照）。 Any of the above enzymes can be produced from natural organisms or genetically modified organisms (or cells), or commercially available enzymes. The genetically modified organism (or cell) is prepared by incorporating a gene encoding each enzyme into a suitable vector using a molecular biology technique known to those skilled in the art, and using the vector to prepare a suitable host organism (eg, (Bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc.) (Sambrook J. et al., “Molecular Cloning A LBORATORY MANUAL / Fourth edition”, Cold Spring Harbor Laboratory, Press. ).
上記生物により産生された酵素は、通常の方法を用いて、当該生物の培養物より単離精製できる。ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞もしくは培養菌体又は細胞もしくは細胞の破砕物を意味する。培養後、目的の酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合には、細胞を遠心分離により回収し、適当な緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を回収する。あるいは、目的の酵素が菌体外または細胞外に生産される場合には、遠心分離などにより菌体または細胞を除去し、培養液を回収する。この無細胞抽出液を遠心分離し、得られた上清から、又は上記培養液から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いて、精製酵素を得ることができる。 The enzyme produced by the above organism can be isolated and purified from a culture of the organism using a conventional method. As used herein, the term “culture” refers to a culture supernatant, cultured cells or cultured cells, or cells or disrupted cells. If the target enzyme is produced in the cells or cells after culturing, the cells are collected by centrifugation, suspended in an appropriate buffer, and then sonicated, a French press, a Mantongaulin homogenizer, Dynomill. The cells are disrupted by, for example, and the cell-free extract is collected. Alternatively, when the target enzyme is produced outside the cells or cells, the cells or cells are removed by centrifugation or the like, and the culture solution is collected. This cell-free extract is centrifuged, and from the resulting supernatant or from the above culture solution, a normal enzyme isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, an organic Solvent precipitation, anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc. Purified enzymes can be obtained by using techniques such as electrophoresis alone or in combination.
本発明方法において用いられる酵素は、精製された形態であっても、上記無細胞抽出液又は培養液のような粗製物の形態であってもよい。 The enzyme used in the method of the present invention may be in a purified form or in the form of a crude product such as the above-mentioned cell-free extract or culture solution.
また、本発明方法において用いられる酵素は、固定化された状態であってもよい。酵素を固定化することによって、酵素が安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。酵素の固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、酵素を担体（例えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多糖類の誘導体、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など）に、物理的吸着、イオン結合及び共有結合等を用いて結合させることができる。架橋法では、２個又はそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、酵素同士を互いに架橋することによって固定化することができる。架橋試薬としては、Ｓｃｈｉｆｆ塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、Ｎ，Ｎ’−エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するＮ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨードアセトアミド等を用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中に酵素を取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によって酵素を皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂等の合成高分子物質や、デンプン、コンニャク粉、ゼラチン、アルギン酸、カラギーナン等の天然高分子物質といった高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる（福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、１９８１年）。担体には、上記５種の酵素のそれぞれを固定してもよいし、あるいはこれらより選択される２，３，４、又は５種の酵素の組み合わせにて固定してもよい。 Further, the enzyme used in the method of the present invention may be in an immobilized state. The immobilization of the enzyme is effective in that the enzyme is stabilized and continuous use is possible. The enzyme can be immobilized using a carrier binding method, a cross-linking method, or an entrapment method. In the carrier binding method, an enzyme is physically adsorbed, ionically and covalently bonded to a carrier (eg, a polysaccharide derivative such as cellulose, dextran, agarose, polyacrylamide gel, polystyrene resin, porous glass, metal oxide, etc.). And the like. In the cross-linking method, enzymes can be immobilized by cross-linking the enzymes with each other using a reagent having two or more functional groups. Examples of the cross-linking reagent include glutaraldehyde for forming a Schiff base, an isocyanic acid derivative for forming a peptide bond, N, N'-ethylenemaleimide, bisdiazobenzine for diazo coupling, and N, N'-polymethylenebisiodide for alkylation. Acetamide and the like can be used. In the entrapment method, a lattice type in which the enzyme is incorporated into the fine lattice of the polymer gel and a microcapsule type in which the enzyme is coated with a semipermeable polymer film are used. In the lattice type method, a synthetic polymer such as polyacrylamide gel, polyvinyl alcohol, and a photocurable resin, or a polymer such as a natural polymer such as starch, konjac powder, gelatin, alginic acid, and carrageenan can be used. . In the microcapsule type method, hexamethylenediamine, sebacoyl chloride, polystyrene, lecithin and the like can be used (Saburo Fukui, Ichiro Chibatake, Shuichi Suzuki, "Enzyme Engineering", Tokyo Chemical Dojin, 1981). Each of the above five enzymes may be immobilized on the carrier, or a combination of two, three, four or five enzymes selected therefrom may be immobilized.
本発明において、上記酵素群は、反応液中以下の一連の反応を触媒し、リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、ホスホリラーゼの基質の一つとなる受容体糖、アノメリックキナーゼの基質となる供与体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸より、オリゴ糖を生成する： In the present invention, the enzyme group catalyzes the following series of reactions in a reaction solution, and in the presence of phosphate and ATP and / or ADP, a receptor sugar serving as one of phosphorylase substrates, anomeric kinase, Oligosaccharides are formed from donor sugars, oxygen molecules, and pyruvate, which are substrates for:
すなわち、ピルビン酸オキシダーゼはピルビン酸をリン酸の存在下に酸素により酸化し、アセチルリン酸と二酸化炭素と過酸化水素を生成する。 That is, pyruvate oxidase oxidizes pyruvate with oxygen in the presence of phosphoric acid to produce acetyl phosphate, carbon dioxide and hydrogen peroxide.
酢酸キナーゼは、生成されたアセチルリン酸を基質としてＡＤＰをＡＴＰに変換するとともに酢酸を生成する。ここで生じたＡＴＰは、下記アノメリックキナーゼの反応によりＡＤＰに変換され、リサイクルされる。 Acetate kinase converts ADP to ATP using the produced acetyl phosphate as a substrate and generates acetic acid. The ATP generated here is converted to ADP by the reaction of anomeric kinase described below, and is recycled.
アノメリックキナーゼは、供与体糖及びＡＴＰより、糖１リン酸とＡＤＰを生成する。ここで生じたＡＤＰは、上記酢酸キナーゼの反応によりＡＴＰに変換されることによりリサイクルされる。 Anomeric kinase produces sugar monophosphate and ADP from donor sugar and ATP. The ADP generated here is recycled by being converted into ATP by the above-mentioned reaction of acetate kinase.
ホスホリラーゼは、生成された糖１リン酸と受容体糖より、目的のオリゴ糖とリン酸を生成する。ここで生じたリン酸は、上記ピルビン酸オキシダーゼの反応により、アセチルリン酸に変換され、上記酢酸キナーゼの反応に利用されリサイクルされる。 The phosphorylase generates the target oligosaccharide and phosphate from the generated sugar monophosphate and the acceptor sugar. The phosphoric acid generated here is converted to acetyl phosphate by the reaction of pyruvate oxidase, and is used for the reaction of acetate kinase and recycled.
カタラーゼは、上記ピルビン酸オキシダーゼの反応により生じた過酸化水素を水１分子と酸素（Ｏ２）１／２分子に分解する。ここで生じた酸素は上記ピルビン酸オキシダーゼの反応に利用される。 Catalase decomposes hydrogen peroxide generated by the reaction of pyruvate oxidase into one molecule of water and １ ／ molecule of oxygen (O 2 ). The oxygen generated here is used for the reaction of pyruvate oxidase.
本発明においては反応全体として、ピルビン酸、供与体糖、受容体糖、及び酸素を原料として、目的のオリゴ糖、二酸化炭素、水、酢酸を生成することができる。 In the present invention, the target oligosaccharide, carbon dioxide, water, and acetic acid can be produced from pyruvic acid, a donor saccharide, an acceptor saccharide, and oxygen as the whole reaction.
これら一連の反応は、反応液中、リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下、上記の５種の酵素群を受容体糖、供与体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用させることにより行うことができる。 In a series of these reactions, the above five kinds of enzymes are allowed to act simultaneously with an acceptor sugar, a donor sugar, an oxygen molecule, and pyruvate in the presence of phosphoric acid and ATP and / or ADP in a reaction solution. Can be performed.
反応液中に加える各酵素の量は、各反応を触媒可能な量であればよく、特に限定はされないが、例えば、０．０５Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲で適宜選択することができる。精製酵素として加える場合はその酵素の比活性にもよるが、１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの範囲で適宜選択できる。ホスホリラーゼであれば、例えば、０．０５Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは、０．１Ｕ／ｍＬ〜５０Ｕ／ｍＬの範囲より、アノメリックキナーゼであれば、例えば、０．０５Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬの範囲より、ピルビン酸オキシダーゼであれば、例えば、０．１Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ〜１０Ｕ／ｍＬの範囲より、カタラーゼであれば、例えば、１Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜２００Ｕ／ｍＬの範囲より、酢酸キナーゼであれば、例えば、１０Ｕ／ｍＬ〜１０００Ｕ／ｍＬ、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ〜５００Ｕ／ｍＬの範囲より、それぞれ適宜選択して用いることができる。 The amount of each enzyme added to the reaction solution is not particularly limited as long as it can catalyze each reaction, and can be appropriately selected, for example, in the range of 0.05 U / mL to 1000 U / mL. When added as a purified enzyme, it can be appropriately selected within the range of 1 μg / mL to 1000 μg / mL, depending on the specific activity of the enzyme. For phosphorylase, for example, 0.05 U / mL to 100 U / mL, preferably 0.1 U / mL to 50 U / mL, and for anomeric kinase, for example, 0.05 U / mL to 200 U / mL. mL, preferably from 0.1 U / mL to 100 U / mL, and for pyruvate oxidase, for example, from 0.1 U / mL to 100 U / mL, preferably from 0.1 U / mL to 10 U / mL. For catalase, for example, from the range of 1 U / mL to 500 U / mL, preferably 10 U / mL to 200 U / mL. For acetate kinase, for example, 10 U / mL to 1000 U / mL, preferably 10 U / mL. It can be appropriately selected and used from the range of ~ 500 U / mL.
「供与体糖」は、アノメリックキナーゼの基質となり、上記アノメリックキナーゼの反応によって糖１リン酸を生成できるものであればよく、目的とするオリゴ糖や反応液中に加えるアノメリックキナーゼに応じて適宜選択することができる。このような「供与体糖」としては例えば、ガラクトース、グルクロン酸、ガラクチュロン酸、Ｌ−アラビノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マルトース等を挙げることができるが、これらに限定はされない。反応液中に加える供与体糖の量は、特に限定されるものではないが、例えば、２５ｍＭ〜２．５Ｍ、８０ｍＭ〜２Ｍより選択される量とすることができる。供与体糖は反応液中に一度に全量を加えても良いし、複数回に分けて、また、間隔をあけて加えても良い。 The “donor sugar” may be any substrate as long as it becomes a substrate of the anomeric kinase and can generate sugar monophosphate by the reaction of the anomeric kinase, and depends on the target oligosaccharide and the anomeric kinase added to the reaction solution. Can be selected appropriately. Such "donor sugars" include, for example, galactose, glucuronic acid, galacturonic acid, L-arabinose, L-fucose, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, mannose, maltose, and the like. However, it is not limited to. The amount of the donor sugar added to the reaction solution is not particularly limited, but may be, for example, an amount selected from 25 mM to 2.5 M, 80 mM to 2 M. The donor sugar may be added to the reaction solution in its entirety at once, or may be added in multiple portions or at intervals.
「受容体糖」は、ホスホリラーゼの基質となり、上記ホスホリラーゼの反応によって糖１リン酸と共に目的とするオリゴ糖を生成できるものであればよく、目的とするオリゴ糖や反応液中に加えるホスホリラーゼに応じて適宜選択することができる。このような「受容体糖」としては例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｌ−ラムノース、グルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース、１，４−β−マンノオリゴ糖、１，２−β−マンノオリゴ糖、マルトオリゴ糖等を挙げることができるが、これらに限定はされない。「受容体糖」は、上記「供与体糖」と同じであっても良いし、異なっていても良い。反応液中に加える受容体糖の量は、特に限定されるものではないが、例えば、２５ｍＭ〜２．５Ｍ、好ましくは８０ｍＭ〜２Ｍより選択される量とすることができる。受容体糖は反応液中に一度に全量を加えても良いし、複数回に分けて、また、間隔をあけて加えても良い。 The “acceptor saccharide” may be any one that can serve as a substrate for phosphorylase and can produce the target oligosaccharide together with the sugar monophosphate by the above-mentioned phosphorylase reaction, depending on the target oligosaccharide and the phosphorylase added to the reaction solution. Can be selected appropriately. Such “acceptor sugars” include, for example, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, L-rhamnose, glucose, galactose, mannose, N, N′-diacetylchitobiose, 1,4-β-mannooligosaccharide , 1,2-β-mannooligosaccharides, maltooligosaccharides and the like, but are not limited thereto. The “acceptor sugar” may be the same as or different from the above “donor sugar”. The amount of the acceptor saccharide to be added to the reaction solution is not particularly limited, but may be, for example, an amount selected from 25 mM to 2.5 M, preferably 80 mM to 2 M. The acceptor saccharide may be added to the reaction solution in its entirety at once, or may be added in multiple portions or at intervals.
本発明において好ましくは、供与体糖及び受容体糖は、以下のアノメリックキナーゼ及びホスホリラーゼとの組み合わせと共に、以下の組合せで用いることができ、生成物として各オリゴ糖を生成することができる：
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、Ｎ−アセチルグルコサミン（受容体糖）、ラクト−Ｎ−ビオースＩ（生成物）；
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（受容体糖）、ガラクト−Ｎ−ビオース（生成物）；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、Ｌ−ラムノース（受容体糖）、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノース（生成物）；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、グルコース（受容体糖）、１，３−β−ガラクトシルグルコース（生成物）；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ、ガラクトース（供与体糖）、ガラクトース（受容体糖）、１，３−β−ガラクトビオース（生成物）；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン（供与体糖）、Ｎ−アセチルグルコサミン（受容体糖）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース及びＮ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオース（生成物）；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、グルコース（受容体糖）、１，４−β−マンノシルグルコース（生成物）；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、マンノース（受容体糖）、１，４−β−マンノオリゴ糖（生成物）；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（受容体糖）、１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（生成物）；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、マンノース（受容体糖）、１，２−β−マンオビオース及び１，２−β−マンノトリオース（生成物）；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、マンノース（供与体糖）、マンノース（受容体糖）、１，２−β−マンノオリゴ糖（生成物）；
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ、マルトース（供与体糖）、マルトオリゴ糖（受容体糖）、１，４−α−グルカン（生成物）。
Preferably, in the present invention, the donor saccharide and the acceptor saccharide can be used in the following combinations in combination with the following anomeric kinases and phosphorylases, and can produce each oligosaccharide as a product:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase, galactose (donor sugar), N-acetylglucosamine (acceptor sugar), lacto-N-biose I (product);
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase, galactose (donor sugar), N-acetylgalactosamine (acceptor sugar), galacto-N-biose (product);
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase, galactose (donor sugar), L-rhamnose (acceptor sugar), 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose (product);
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase, galactose (donor sugar), glucose (acceptor sugar), 1,3-β-galactosyl glucose (product);
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase, galactose (donor sugar), galactose (acceptor sugar), 1,3-β-galactobiose (product);
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase, N-acetylglucosamine (donor sugar), N-acetylglucosamine (acceptor sugar), N, N'-diacetylchitobiose and N , N ', N "-triacetylchitotriose (product);
1,4-β-mannosyl glucose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase, mannose (donor sugar), glucose (acceptor sugar), 1,4-β-mannosyl glucose (product);
1,4-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase, mannose (donor sugar), mannose (acceptor sugar), 1,4-β-mannooligosaccharide (product);
1,4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase, mannose (donor sugar), N, N′-diacetylchitobiose (acceptor sugar), 1 , 4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose (product);
1,2-β-mannobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase, mannose (donor sugar), mannose (acceptor sugar), 1,2-β-manobiose and 1,2-β-mannotriose (Product);
1,2-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase, mannose (donor sugar), mannose (acceptor sugar), 1,2-β-mannooligosaccharide (product);
Maltose transfer starch synthase and maltokinase, maltose (donor sugar), maltooligosaccharide (acceptor sugar), 1,4-α-glucan (product).
反応液中に加えるピルビン酸の量は、特に限定されるものではないが、例えば、５０ｍＭ〜３Ｍ、好ましくは８０ｍＭ〜２Ｍより選択される量とすることができる。ピルビン酸は塩の形態（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）で反応液中に加えることができる。 The amount of pyruvic acid added to the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, an amount selected from 50 mM to 3 M, preferably 80 mM to 2 M. Pyruvic acid can be added to the reaction solution in the form of a salt (eg, sodium salt, potassium salt, etc.).
反応液中の酸素分子は、気相より供給されるものを利用することができる。このため反応は、反応液中に酸素が供給可能な条件、例えば、通気性を有する、又は比表面積の大きい反応容器を用いて実施することができる。また、反応液気相の酸素分圧を高くすることにより、気液界面の酸素移動速度を高めることができる。 As the oxygen molecules in the reaction solution, those supplied from the gas phase can be used. For this reason, the reaction can be carried out under conditions that allow oxygen to be supplied to the reaction solution, for example, using a reaction vessel having gas permeability or a large specific surface area. In addition, by increasing the oxygen partial pressure of the gas phase of the reaction liquid, the oxygen transfer rate at the gas-liquid interface can be increased.
上記反応中、ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びリン酸はリサイクルされるため、反応液中にこれらの要素は触媒量存在すれば良く、上記反応の等量となるように加えなくても良い。反応液中に加えるＡＴＰ及びＡＤＰの量はそれぞれ、特に限定されるものではないが、例えば、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜５ｍＭより選択される量とすることができる。また、反応液中に加えるリン酸の量は、特に限定されるものではないが、例えば、１ｍＭ〜２００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭより選択される量とすることができる。リン酸は塩の形態（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等）で反応液中に加えることができる。 Since ATP, ADP, and phosphoric acid are recycled during the above reaction, these elements only need to be present in the reaction solution in a catalytic amount, and need not be added so as to be equivalent to the above reaction. The amounts of ATP and ADP added to the reaction solution are not particularly limited, but may be, for example, 0.1 mM to 10 mM, preferably 0.2 mM to 5 mM. The amount of phosphoric acid added to the reaction solution is not particularly limited, but may be, for example, an amount selected from 1 mM to 200 mM, preferably 10 mM to 100 mM. Phosphoric acid can be added to the reaction solution in the form of a salt (eg, sodium salt, potassium salt, calcium salt, etc.).
本発明において「反応液」は、特に限定されるものではないが、水又は緩衝液を利用することができる。緩衝液としては、酵素反応に一般的に用いられるもの、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液などを使用できる。使用濃度は、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜３００ｍＭより選択される量とすることができる。反応液のｐＨは４〜９、好ましくは、５．５〜８．５とすることができる。 In the present invention, the “reaction solution” is not particularly limited, but water or a buffer solution can be used. As the buffer, those generally used in an enzyme reaction, for example, Tris-HCl buffer, Tris-acetate buffer, HEPES buffer, MOPS buffer, phosphate buffer, sodium acetate buffer, sodium citrate buffer Etc. can be used. The concentration used can be an amount selected from 10 mM to 500 mM, preferably 10 mM to 300 mM. The pH of the reaction solution can be 4 to 9, preferably 5.5 to 8.5.
反応液中には必要に応じてさらに、二価金属イオン、チアミン二リン酸、フラビンアデニンジヌクレオチドより選択される一又は複数の因子を加えることができる。二価金属イオンは、酢酸キナーゼ及びアノメリックキナーゼの補因子として作用することができる。二価金属イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等を利用することができ、塩の形態で反応液中に加えることができる。反応液中に加える二価金属イオンの量は特に限定されるものではないが、例えば、０．１ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、より選択される量とすることができる。チアミン二リン酸及びフラビンアデニンジヌクレオチドは、ピルビン酸オキシダーゼの補因子として作用することができる。反応液中に加えるチアミン二リン酸の量は特に限定されるものではないが、例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、より選択される量とすることができる。また、反応液中に加えるフラビンアデニンジヌクレオチドの量は特に限定されるものではないが、例えば、０．０００５ｍＭ〜０．０５ｍＭ、好ましくは０．００１ｍＭ〜０．０１ｍＭ、より選択される量とすることができる。 If necessary, one or more factors selected from divalent metal ions, thiamine diphosphate, and flavin adenine dinucleotide can be added to the reaction solution. Divalent metal ions can act as cofactors for acetate kinase and anomeric kinase. The divalent metal ion is not particularly limited, but magnesium ion, calcium ion and the like can be used, and can be added to the reaction solution in the form of a salt. The amount of the divalent metal ion added to the reaction solution is not particularly limited, but may be, for example, 0.1 mM to 50 mM, preferably 0.5 mM to 10 mM, and an amount selected from the range. Thiamine diphosphate and flavin adenine dinucleotide can act as cofactors for pyruvate oxidase. The amount of thiamine diphosphate added to the reaction solution is not particularly limited, but may be, for example, 0.01 mM to 1 mM, preferably 0.05 mM to 0.5 mM, which is a more selected amount. Further, the amount of flavin adenine dinucleotide to be added to the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 0.0005 mM to 0.05 mM, preferably 0.001 mM to 0.01 mM, and an amount selected from the group. be able to.
反応温度は特に限定されるものではないが好ましくは１５℃〜５０℃、より好ましくは２５℃〜４０℃とすることができる。 The reaction temperature is not particularly limited, but is preferably 15 ° C to 50 ° C, more preferably 25 ° C to 40 ° C.
反応時間は、１時間〜６０日間、好ましくは１２時間〜４０日間とすることができる。必要に応じて撹拌しながら反応を行っても良い。 The reaction time can be 1 hour to 60 days, preferably 12 hours to 40 days. The reaction may be carried out with stirring if necessary.
生成したオリゴ糖は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過法など各種のクロマトグラフィー、熱水抽出、硫安分画、結晶化（濃縮、温度低下、溶媒添加（エタノール、メタノール、アセトン等））等の、オリゴ糖の精製に用いられる通常の精製法を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることによって精製することができる。 The resulting oligosaccharide is subjected to various types of chromatography such as ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration, hot water extraction, ammonium sulfate fractionation, crystallization (concentration, temperature reduction, solvent addition (ethanol , Methanol, acetone, etc.)) can be used alone or in an appropriate combination in a usual purification method used for the purification of oligosaccharides.
得られたオリゴ糖は、例えば医薬品、化粧品、食品添加物等の材料として好適に用いることができる。 The obtained oligosaccharide can be suitably used, for example, as a material for pharmaceuticals, cosmetics, food additives and the like.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって
限定されるものではない。
The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１．各酵素の調製
（ｉ）ホスホリラーゼ
（ｉ−１）１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ
クロストリジウム・フィトファーメンタンス由来の１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２４７）を、公知の手法（Ｍ．Ｎａｋａｊｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４（２９），１９２２０−１９２２７（２００９））に基づいて調製した。
Embodiment 1 FIG. Preparation of each enzyme (i) phosphorylase (i-1) 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase derived from Clostridium phytofermentans (EC 2.4. 1.247) was prepared based on known procedures (M. Nakajima et al., J. Biol. Chem., 284 (29), 19220-19227 (2009)).
すなわち、クロストリジウム・フィトファーメンタンスのゲノムＤＮＡを鋳型として、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＴＴＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＡＣＧＧ（配列番号２）。
That is, using genomic DNA of Clostridium phytofermentans as a template, a gene encoding 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase was amplified by PCR using the following primers:
Forward primer: AGGAGAAATCATATGAGAACAAAAAAGGAG (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer: ATTATGTTCCGAGTAATGGGAAGAATTACCGG (SEQ ID NO: 2).
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は４３Ｕ／ｍｇであった。 The resulting PCR product was incorporated into a commercially available plasmid for gene expression, and then used to transform Escherichia coli. The resulting recombinant protein was purified to obtain 1,4-β-galactosyl- A purified enzyme preparation of L-rhamnose phosphorylase was obtained. The specific activity of the obtained purified enzyme was 43 U / mg.
（ｉ−２）１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株由来の１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２１１）を、公知の手法（特開２００５−３４１８８３号公報）に基づいて調製した。
(I-2) 1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase 1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase derived from Bifidobacterium longum JCM1217 strain (EC 2.4.1.211). Was prepared based on a known method (JP-A-2005-341883).
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＴＣ（配列番号４）。
That is, using genomic DNA of Bifidobacterium longum JCM1217 strain as a template, a gene encoding 1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase was amplified by PCR using the following primers:
Forward primer: AGCACCCATGGCCAGCACCGGCCGCTTCACGCTGC (SEQ ID NO: 3)
Reverse primer: CGCGGCTCGAGGGCTTCACGCGCATGCGATGCCGCTGTC (SEQ ID NO: 4).
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１９Ｕ／ｍｇであった。 The resulting PCR product was incorporated into a commercially available plasmid for gene expression, and then used to transform Escherichia coli and to purify the produced recombinant protein, thereby obtaining 1,3-β-galactosyl- A purified enzyme preparation of N-acetylhexosamine phosphorylase was obtained. The specific activity of the obtained purified enzyme was 19 U / mg.
（ｉ−３）Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ
ビブリオ・プロテオリティクス由来のＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．２８０）を、公知の手法（Ｙ．Ｈｏｎｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３７７（１），２２５−２３２（２００４）；なお、本論文中において、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼは、「ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ」として記載される）に基づいて調製した。
(I-3) N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase (EC2.4. 1.280) derived from Vibrio proteolitics was synthesized by a known method (Y. Honda). Biochem. J., 377 (1), 225-232 (2004); in this paper, N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase is described based on "chitobiose phosphorylase"). Prepared.
すなわち、ビブリオ・プロテオリティクスのゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＴ（配列番号５）
リバースプライマー：ＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＣ（配列番号６）。
That is, using genomic DNA of Vibrio proteolitics as a template, a gene encoding N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase was amplified by PCR using the following primers:
Forward primer: CATATGAAATACGGCTATTTCGATAATGACAAT (SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: CTCGAGACCGAGTACCACAACCTGGTTGTC (SEQ ID NO: 6).
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は３．１Ｕ／ｍｇであった。 The obtained PCR product is incorporated into a commercially available plasmid for gene expression, and then used to transform E. coli and to purify the produced recombinant protein to obtain N, N'-diacetylchitobi. A purified enzyme preparation of aus phosphorylase was obtained. The specific activity of the obtained purified enzyme was 3.1 U / mg.
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ
（ｉｉ−１）Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ
Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１６２）は、公知の手法（特開２００７−９７５１７号公報）に基づいて調製した。
(Ii) Anomeric kinase (ii-1) N-acetylhexosamine 1-kinase N-acetylhexosamine 1-kinase (EC 2.7.1.162) is based on a known method (JP-A-2007-97517). Prepared.
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＡＣＧＧＡＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣ（配列番号７）
リバースプライマー：ＧＣＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＴＡＣ（配列番号８）。
That is, using genomic DNA of Bifidobacterium longum JCM1217 strain as a template, a gene encoding N-acetylhexosamine 1-kinase was amplified by PCR using the following primers:
Forward primer: AACGGACCCCATATGACCGAAAGCAATGAAGTTTTATTC (SEQ ID NO: 7)
Reverse primer: GCTGACCTCGAGCCTGGCAGCTCTCCATGATGTCGGCTAC (SEQ ID NO: 8).
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１．５Ｕ／ｍｇであった。 The obtained PCR product was incorporated into a commercially available plasmid for gene expression, and then used to transform Escherichia coli. The resulting recombinant protein was purified to obtain N-acetylhexosamine 1-kinase. A purified enzyme preparation was obtained. The specific activity of the obtained purified enzyme was 1.5 U / mg.
（ｉｉ−２）ガラクトキナーゼ
ガラクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６）は、公知の手法（Ｔ．Ｎｉｈｉｒａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７１（２），２５９−２６１（２００７））に基づいて調製した。
(Ii-2) Galactokinase Galactokinase (EC 2.7.1.6) is prepared based on a known method (T. Nihira et al., Anal. Biochem., 371 (2), 259-261 (2007)). did.
すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ガラクトキナーゼをコードする遺伝子を以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＣ（配列番号９）
リバースプライマー：ＧＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＴＣＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＣ（配列番号１０）。
That is, using genomic DNA of Bifidobacterium longum JCM1217 strain as a template, a gene encoding galactokinase was amplified by a PCR method using the following primers:
Forward primer: GATACATATATGACTGCTGTTGAATTCATTGGAGC (SEQ ID NO: 9)
Reverse primer: GATTTACTCGAGGTCCTCGCGTGAAGCGGATTTTCGCCGC (SEQ ID NO: 10).
得られたＰＣＲ産物は、市販の遺伝子発現用プラスミドに組み込んだ後、これを用いて大腸菌の形質転換体を行い、生産された組換えタンパク質を精製することによって、ガラクトキナーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１７４Ｕ／ｍｇであった。 The resulting PCR product was incorporated into a commercially available plasmid for gene expression, and then used to transform Escherichia coli and to purify the produced recombinant protein, thereby obtaining a purified enzyme preparation of galactokinase. Obtained. The specific activity of the obtained purified enzyme was 174 U / mg.
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ
ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．２．３．３）は東洋紡社製のＰＹＯ−０３１１を用いた。
(Iii) Pyruvate oxidase PYO-0311 manufactured by Toyobo was used for pyruvate oxidase (EC 1.2.3.3).
（ｉｖ）カタラーゼ
カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）は和光純薬社製（製品コード０３５−１２９０３）を用いた。
(Iv) Catalase Catalase (EC1.11.1.6) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (product code 035-12903) was used.
（ｖ）酢酸キナーゼ
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＣＭ１２１７株のゲノムＤＮＡを鋳型として酢酸キナーゼ（ＢＬＬＪ＿０６４３）遺伝子を、以下のプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した：
フォーワードプライマー：ＡＴＧＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＡＣＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号１１）
リバースプライマー：ＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧＴ（配列番号１２）。
(V) Acetate kinase Using the genomic DNA of Bifidobacterium longum JCM1217 strain as a template, the acetate kinase (BLLJ_0643) gene was amplified by PCR using the following primers:
Forward primer: ATGCCCCATATGGCGAAAACCGTCCTTTGTC (SEQ ID NO: 11)
Reverse primer: CGGTCTCGAGCTTGGGCGAAGGTGTTGCCGT (SEQ ID NO: 12).
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ３０（ノバジェン社製）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結した。 The obtained PCR product was digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, and ligated to a similarly treated commercially available plasmid pET30 for gene expression (Novagen) using a DNA ligation kit (Takara Shuzo).
次いで、得られたプラスミドを用いてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版”１．７４章Ｖｏ１．１（１９８９）に記載された方法に従い、大腸菌を形質転換した。 Subsequently, Sambrook, J. et al. Fritsch, E .; F. and Maniatis, T .; E. coli was transformed according to the method described in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition", Chapter 1.74, Vo1.1 (1989).
得られた形質転換体を用い、常法に従って該遺伝子の発現及び組換えタンパク質の生産を行った。得られた組換えタンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸キナーゼの精製酵素標品を得た。得られた精製酵素の比活性は１２０００Ｕ／ｍｇであった。 Using the obtained transformant, expression of the gene and production of a recombinant protein were performed according to a conventional method. The obtained recombinant protein was purified by column chromatography using Ni-NTA agarose (manufactured by Qiagen) to obtain a purified enzyme preparation of acetate kinase. The specific activity of the obtained purified enzyme was 12000 U / mg.
以上のようにして得られた（ｉ）ホスホリラーゼ、（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、（ｉｖ）カタラーゼ、及び（ｖ）酢酸キナーゼの各酵素を以下の実施例に用いた。 The enzymes (i) phosphorylase, (ii) anomeric kinase, (iii) pyruvate oxidase, (iv) catalase, and (v) acetate kinase obtained as described above were used in the following Examples.
実施例２．ラクト−Ｎ−ビオースＩの調製
以下の組成からなる反応液１Ｌを調製した。
反応液：
Reaction solution:
反応液を３３ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ３０枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて１１日反応を行った。 The reaction solution was dispensed in 33 mL portions into 30 polystyrene petri dishes having an inner diameter of 85 mm, and reacted at 30 ° C. under 1 atm of oxygen for 11 days.
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７８：２２；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、ラクト−Ｎ−ビオースＩ濃度は２９２ｍＭであり、Ｎ−アセチルグルコサミンの残存濃度は１４ｍＭであった。
この結果、収率９５％でラクト−Ｎ−ビオースＩを合成できたことが確認された。
After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPLC ([column] Shodex Asahipak NH2P-504E; [solvent] acetonitrile / water 78:22; [flow rate] 1 mL / min; [detection] charged particle detector). The lacto-N-biose I concentration was 292 mM and the residual concentration of N-acetylglucosamine was 14 mM.
As a result, it was confirmed that lacto-N-biose I could be synthesized with a yield of 95%.
また、反応液を中空糸膜カートリッジ（旭化成社製ＳＬＰ−００５３）を用いて除タンパクしたのち、マイクロアシラーザーＳ３（アストム社製）を用いＡＣ−２２０−５５０カートリッジ（アストム社製）により脱塩を行った。 The reaction solution was deproteinized using a hollow fiber membrane cartridge (SLP-0053, manufactured by Asahi Kasei Corporation), and then desorbed using an AC-220-550 cartridge (manufactured by Astom) using a micro-acylerser S3 (manufactured by Astom). Salted.
得られた除タンパク−脱塩反応液を濃縮することによりラクト−Ｎ−ビオースＩの結晶化を行い、８６．５ｇの結晶ラクト−Ｎ−ビオースＩを得た。 The lacto-N-biose I was crystallized by concentrating the obtained deproteinization-desalting reaction solution to obtain 86.5 g of crystalline lacto-N-biose I.
実施例３．１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースの調製
以下の組成からなる反応液１００ｍＬを調製した。
反応液を２０ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ５枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて６日反応を行った。 The reaction solution was dispensed in 20 mL portions into five polystyrene petri dishes having an inner diameter of 85 mm, and reacted at 30 ° C. under 1 atm of oxygen for 6 days.
反応６日後に、ガラクトース及びＬ−ラムノースともに検出されなくなった。反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ ＨＩＬＩＣｐａｋ ＶＧ−５０ ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水８７：１３；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースの濃度は２９２ｍＭであり、原料のＬ−ラムノースはほぼ定量的に１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースに変換されたことが確認された。 Six days after the reaction, neither galactose nor L-rhamnose was detected. The reaction solution was analyzed by HPLC ([column] Shodex HILICpak VG-504E; [solvent] acetonitrile / water 87:13; [flow rate] 1 mL / min; [detection] charged particle detector). The concentration of β-galactosyl-L-rhamnose was 292 mM, and it was confirmed that L-rhamnose as a raw material was almost quantitatively converted to 1,4-β-galactosyl-L-rhamnose.
実施例４．１，３−β−ガラクトシル−グルコースの調製
以下の組成からなる反応液１Ｌを調製した。
反応液を２５ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ４０枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて１４日反応を行った。 The reaction solution was dispensed in 25 mL aliquots into 40 polystyrene Petri dishes having an inner diameter of 85 mm, and reacted at 30 ° C. under 1 atm of oxygen for 14 days.
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７５：２５；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、反応１４日後のガラクトシルグルコース濃度は３７０ｍＭであった。 After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPLC ([column] Shodex Asahipak NH2P-504E; [solvent] acetonitrile / water 75:25; [flow rate] 1 mL / min; [detection] charged particle detector). 14 days after the reaction, the galactosyl glucose concentration was 370 mM.
また、反応液を中空糸膜カートリッジ（旭化成社製ＳＬＰ−００５３）を用いて除タンパクしたのち、マイクロアシラーザーＳ３（アストム社製）を用いＡＣ−２２０−５５０カートリッジ（アストム社製）により脱塩を行った。得られた除タンパク−脱塩反応液に乾燥酵母５ｇを添加し一晩３７℃にて発酵を行うことにより残存している単糖類を除去した。反応液を遠心分離後、固形分濃度６３％までエバポレーターで濃縮し、４℃にて結晶化を行った。得られた結晶を脱水−真空乾燥を行い、純度９２％の１，３−β−ガラクトシル−グルコース７０．５ｇを得た。 The reaction solution was deproteinized using a hollow fiber membrane cartridge (SLP-0053, manufactured by Asahi Kasei Corporation), and then desorbed using an AC-220-550 cartridge (manufactured by Astom) using a micro-acylerser S3 (manufactured by Astom). Salted. 5 g of dry yeast was added to the resulting deproteinization-desalting reaction solution, and fermentation was carried out at 37 ° C. overnight to remove residual monosaccharides. After centrifugation of the reaction solution, the reaction solution was concentrated to a solid content concentration of 63% by an evaporator and crystallized at 4 ° C. The obtained crystals were dehydrated and dried under vacuum to obtain 70.5 g of 1,3-β-galactosyl-glucose having a purity of 92%.
実施例５．１，３−β−ガラクトビオースの調製
以下の組成からなる反応液１００ｍＬを調製した。
反応液を３３ｍＬずつ内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレ３枚に分注し、１気圧酸素下において３０℃にて３３日反応を行った。 The reaction solution was dispensed in 33 mL portions into three polystyrene petri dishes having an inner diameter of 85 mm, and reacted at 30 ° C. under 1 atm of oxygen for 33 days.
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７５：２５；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、反応３３日後の１，３−β−ガラクトビオース濃度は３２０ｍＭであった。 After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPLC ([column] Shodex Asahipak NH2P-504E; [solvent] acetonitrile / water 75:25; [flow rate] 1 mL / min; [detection] charged particle detector). 33 days after the reaction, the 1,3-β-galactobiose concentration was 320 mM.
実施例６．Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース、及びＮ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオースの調製
以下の組成からなる反応液５０ｍＬを調製した。
反応液を内径８５ｍｍのポリスチレン製シャーレに入れて、１気圧酸素下において３０℃にて反応を行った。反応１，２，３，４，５，６，７，９，１１日時点でそれぞれ２．５ｍｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミン（５５３ｍｇ）と２．５ｍｍｏｌのピルビン酸ナトリウム（２７５ｍｇ）とを反応液に追加して、溶解した。Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼは、Ｎ−アセチルグルコサミンによる拮抗基質阻害を受けるため、Ｎ−アセチルグルコサミンを逐次添加して、反応系中のＮ−アセチルグルコサミン濃度を低く抑えることができる。 The reaction solution was put in a petri dish made of polystyrene having an inner diameter of 85 mm and reacted at 30 ° C. under 1 atm of oxygen. 2.5 mmol of N-acetylglucosamine (553 mg) and 2.5 mmol of sodium pyruvate (275 mg) were added to the reaction solution as of reactions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, and 11, respectively. And dissolved. Since N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase is subjected to antagonistic substrate inhibition by N-acetylglucosamine, N-acetylglucosamine can be added sequentially to reduce the N-acetylglucosamine concentration in the reaction system.
反応終了後、反応液をＨＰＬＣ（［カラム］Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ；［溶媒］アセトニトリル／水７０：３０；［流速］１ｍＬ／ｍｉｎ；［検出］荷電化粒子検出器）で分析したところ、反応１２日後のＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース濃度は１３０ｍＭであり、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオースの濃度は３９ｍＭであった。この時点でのＮ−アセチルグルコサミンの添加量は合計５５０ｍＭ相当であった。 After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by HPLC ([column] Shodex Asahipak NH2P-504E; [solvent] acetonitrile / water 70:30; [flow rate] 1 mL / min; [detection] charged particle detector). 12 days after the reaction, the concentration of N, N′-diacetylchitobiose was 130 mM, and the concentration of N, N ′, N ″ -triacetylchitotriose was 39 mM. At this time, the amount of N-acetylglucosamine added was equivalent to a total of 550 mM.
本発明によれば、簡便かつ効率的に様々なオリゴ糖を製造することができ、製造されたオリゴ糖は医薬品、化粧品、食品等、様々な分野において利用することができる。 According to the present invention, various oligosaccharides can be easily and efficiently produced, and the produced oligosaccharides can be used in various fields such as pharmaceuticals, cosmetics, and foods.
Claims (6)
以下の（ｉ）〜（ｖ）の酵素：
（ｉ）ホスホリラーゼ、
（ｉｉ）アノメリックキナーゼ、
（ｉｉｉ）ピルビン酸オキシダーゼ、
（ｉｖ）カタラーゼ、及び
（ｖ）酢酸キナーゼ、を
リン酸、ならびにＡＴＰ及び／又はＡＤＰの存在下にて、
供与体糖、受容体糖、酸素分子、ならびにピルビン酸と同時に作用させることを含む、上記方法。 A method for producing an oligosaccharide, comprising:
The following enzymes (i) to (v):
(I) phosphorylase,
(Ii) anomeric kinase,
(Iii) pyruvate oxidase,
(Iv) catalase and (v) acetate kinase in the presence of phosphate and ATP and / or ADP,
Such a method, comprising co-acting with a donor sugar, an acceptor sugar, an oxygen molecule, and pyruvate.
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシルグルコースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，４−β−マンノシル−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；
１，２−β−マンノオリゴ糖ホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ；あるいは、
マルトース転移スターチシンターゼ及びマルトキナーゼ。 2. The method of claim 1, wherein (i) phosphorylase and (ii) anomeric kinase comprise the following combination:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase;
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase;
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl glucose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl-N-acetylglucosamine phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,4-β-mannosyl-N, N′-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,2-β-mannobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
1,2-β-mannooligosaccharide phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase;
Maltose transfer starch synthase and maltokinase.
１，３−β−ガラクトシル−Ｎ−アセチルヘキソサミンホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；
１，４−β−ガラクトシル−Ｌ−ラムノースホスホリラーゼ及びガラクトキナーゼ；あるいは、
Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースホスホリラーゼ及びＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ。 5. The method of claim 4, wherein (i) phosphorylase and (ii) anomeric kinase comprise the following combination:
1,3-β-galactosyl-N-acetylhexosamine phosphorylase and galactokinase;
1,4-β-galactosyl-L-rhamnose phosphorylase and galactokinase;
N, N'-diacetylchitobiose phosphorylase and N-acetylhexosamine 1-kinase.
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