JP6642705B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡に関する。

波長特性が調整可能である帯域通過フィルタを備える蛍光顕微鏡がある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１ 特開２０００−０５６２２８号公報

しかしながら、上記のような波長特性が調整可能である帯域通過フィルタは、遮光性能が低いという課題を有する。

本発明の第１の態様においては、顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系と、標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、蛍光を検出器に導く観察光学系とを有し、観察光学系は、波長特性が可変な光学フィルタと、光学フィルタを透過した光を分光する分光素子と、分光素子により分光された光の少なくとも一部を遮光する遮光板とを備える。

本発明の第２の態様においては、顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系と、標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、蛍光を検出器に導く観察光学系とを有し、観察光学系は、入射した光の長波長側を遮光する、波長特性が可変である光学フィルタと、光学フィルタを透過した光を分光する分光素子と、分光素子により分光された光の短波長側を遮光する遮光板とを備える。

本発明の第３の態様においては、顕微鏡であって、標本に励起光を照射する照明光学系と、標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、蛍光を検出器に導く観察光学系とを有し、観察光学系は、入射した光の短波長側を遮光する、波長特性が可変である光学フィルタと、光学フィルタを透過した光を分光する分光素子と、分光素子により分光された光の長波長側を遮光する遮光板とを備える。

上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションもまた発明となり得る。

顕微鏡１０１の模式図である。 ＬＶＦ１４１の機能を示す模式図である。 分光素子１５２の機能を示す模式図である。 遮光板１５４の配置を示す模式図である。 顕微鏡１０１の透過帯域を示す図である。 顕微鏡１０１による観察手順を示す流れ図である。 顕微鏡１０１の設定画面３１０を示す。 顕微鏡１０１の検出波長範囲を示す模式図である。 光源１１０の他の例を模式的に示す。 顕微鏡１０１による観察手順を示す流れ図である。 顕微鏡１０１の設定画面３３０を示す図である。 顕微鏡１０１の動作を示すグラフである。 顕微鏡１０１による観察手順を示す流れ図である。 顕微鏡１０１の設定画面３５０を示す図である。 顕微鏡１０１の動作を示す図である。 顕微鏡１０１の検出結果を示す図である。 顕微鏡１０１の表示画像３６０を示す図である。 顕微鏡１０１の表示画像３７０を示す図である。 顕微鏡１０２の模式図である。 円形ＬＶＦ２４１の正面図である。 顕微鏡１０３の模式図である。 顕微鏡１０４の模式図である。 顕微鏡１０４の取得波長範囲を示すグラフである。

以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。

図１は、標本２１０を観察する顕微鏡１０１の構造を示す模式図である。顕微鏡１０１は、共焦点顕微鏡であり、光源１１０、照明光学系２２０、観察光学系２４０、検出器１６０、情報処理装置１７０および制御装置１８０を備える。照明光学系２２０と観察光学系２４０とは一部の光学素子を共有する。なお、顕微鏡１０１は、これらすべての構成を有する必要はなく、例えば、光源１１０を有していなくてもよいし、情報処理装置１７０を有していなくてもよいし、制御装置１８０を有していなくてもよい。

光源１１０は、標本２１０を蛍光で観察する場合の励起光として使用される波長のレーザ光を射出する。光源１１０から射出された励起光は、照明光学系２２０に入射する。

照明光学系２２０は、ダイクロイックミラー１２１、ガルバノスキャナ１３０、リレーレンズ１２２、レンズ１９２、対物レンズ１９１を有する。ダイクロイックミラー１２１は、光源１１０から射出された励起光の波長を反射し、それ以外の波長の光を透過する特性を有する。光源１１０から入射した励起光は、ダイクロイックミラー１２１に反射されて伝播方向を変え、ガルバノスキャナ１３０に入射される。

ガルバノスキャナ１３０は、入射した光を反射する一対のガルバノミラー１３１、１３２を有する。ガルバノミラー１３１は図１のｘ軸回りに回転可能であり、ガルバノミラー１３２はｙ軸回りに回転可能である。ガルバノスキャナ１３０に入射した励起光は、一対のガルバノミラー１３１、１３２により反射された後、リレーレンズ１２２、レンズ１９２を介して、対物レンズ１９１に入射する。

リレーレンズ１２２からの励起光は、レンズ１９２により平行光束にされた後、対物レンズ１９１により標本２１０上に集光される。

ガルバノスキャナ１３０のガルバノミラー１３１、１３２の向きを制御することにより、標本２１０上において励起光の集光位置を変えることができる。よって、ガルバノスキャナ１３０により標本２１０上において励起光を二次元的（図１のｘ、ｙ方向）に走査する。

標本２１０には例えば蛍光物質が含まれており、その場合には標本２１０上の集光位置から蛍光が放射される。ただし、標本２１０から放射される放射光は、励起光の反射光等、蛍光以外の成分も含む。

標本２１０から放射された放射光は、対物レンズ１９１、レンズ１９２を通過してリレーレンズ１２２に入射する。レンズ１９２の焦点位置と、標本２１０における励起光の集光位置とは、光学的に共役である。リレーレンズ１２２に入射した放射光は、ガルバノスキャナ１３０を通過してダイクロイックミラー１２１に入射する。

放射光のうち、励起光と同じ波長の成分は、ダイクロイックミラー１２１に反射されて、光源１１０側に導かれる。放射光のうち、励起光と異なる波長を有する成分は、ダイクロイックミラー１２１を透過する。

なお、ダイクロイックミラー１２１は、励起光の波長成分を完全に取り除くことができるわけではない。このため、ダイクロイックミラー１２１を透過した放射光には、依然として励起光波長の成分も含まれている。

観察光学系２４０は、上記ダイクロイックミラー１２１、ガルバノスキャナ１３０、リレーレンズ１２２、レンズ１９２および対物レンズ１９１を照明光学系２２０と共有する。さらに観察光学系２４０は、反射ミラー１２３、集光レンズ１２４、第１のピンホール１２５、集光レンズ１４３、ＬＶＦ（Ｌｉｎｅａｒ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ）１４１、第２のピンホール１５１、分光素子１５２、凹面鏡１５３、遮光板１５４および集光レンズ１５６を有する。

ダイクロイックミラー１２１を通過してミラー１２３に反射された放射光は、集光レンズ１２４を通じて、第１のピンホール１２５に入射する。ここで、第１のピンホール１２５は、対物レンズ１９１の焦点位置と共役な位置に配されている。このため、第１のピンホール１２５は、対物レンズ１９１の焦点である集光位置から放射された光に限って通過させ、その他の点からの光をノイズとして遮光する。

集光レンズ１４３は、第１のピンホール１２５を通過した光を、ＬＶＦ１４１の一部の領域に照射する。ＬＶＦ１４１は、波長特性が可変な光学フィルタである。ＬＶＦ１４１は、入射光の一部の帯域を遮光して、他の領域を透過させる。

図２は、ＬＶＦ１４１の機能を示す模式図である。ＬＶＦ１４１は、予め定められた方向（図中のｙ方向）に沿って膜厚が変化する誘電体層を透明基板上に有し、光が透過する位置に応じて波長特性が変化する。より詳しくは、光が透過するｙ方向の位置によって、透過する波長と遮光する波長との境界である遮光波長が変化する。よって、ＬＶＦ１４１を駆動部１４２によりｙ方向に移動させて、固定された光路からの入射光に対する波長特性を変化させる。

図２の下部に示すグラフは、ＬＶＦ１４１の波長特性を示す。図２に示されるグラフにおいて、横軸は波長、縦軸は透過率を示す。図２に示される波長特性を有するＬＶＦ１４１は、遮光波長よりも短い波長の光を透過し、遮光波長よりも波長が長い光を遮光するショートパスフィルタである。なお、ＬＶＦ１４１は、遮光波長よりも短い波長の光を遮光し、遮光波長よりも波長が長い光を透過するロングパスフィルタであってもよい。

再び図１を参照すると、ＬＶＦ１４１から射出された放射光は、第２のピンホール１５１に入射する。第２のピンホール１５１は、第１のピンホール１２５と共役な位置に配される。第２のピンホール１５１を通過させることにより、ＬＶＦ１４１の裏面反射等により発生した散乱光が後段の光学素子に入射することが防止される。

第２のピンホール１５１を通過した入射光は、分光素子１５２に入射する。分光素子１５２の一例は、プリズムである。分光素子１５２は、ＬＶＦ１４１を透過した放射光を、波長に応じて空間的に分光する。分光素子１５２により分光された光は、凹面鏡１５３により反射されて光路の向きを変えた後、集光レンズ１５６を介して検出器１６０に入射する。

凹面鏡１５３と集光レンズ１５６との間には、遮光板１５４および駆動部１５５が配される。遮光板１５４は、駆動部１５５に駆動され、分光素子１５２により分光された光の一部を物理的に遮光する。

図３は、分光素子１５２の機能を説明する模式図である。図３に示すように、分光素子１５２に入射した光は、波長に応じて分光される。例えば、分光素子１５２がプリズムである場合、プリズムに入射した光はそれぞれの波長における屈折率によって異なる角度で屈折し、異なる角度で射出することにより、分光される。

さらに、分光素子１５２により分光された光は、凹面鏡１５３により集光され、集光された光の一部は、遮光板１５４により遮光される。

遮光板１５４は、分光素子１５２により分光された光の光路に進退可能に配置され、凹面鏡１５３により集光された光の一部を遮光するように配置される。駆動部１５５は遮光板１５４を分光方向であるｘ方向に駆動することにより、遮光の波長特性を変化させる。つまり、駆動部１５５に駆動された遮光板１５４は、分光素子１５２により分光された光の光路に短波長側から進入し、また退出可能である。よって、分光された光のうち、遮光板１５４の先端位置に応じた波長を遮光波長として短波長側が遮光され、遮光板１５４は遮光波長可変のロングパスフィルタとして機能する。図３は、例示された二つの波長成分のうち短波長の方が遮光板１５４で遮光されており、長波長の方が遮光されない状態が示されている。なお、遮光板１５４は、分光素子１５２により分光された光の長波長側から光路に挿入されてもよい。この場合、長波長側が遮光されるため遮光板１５４は、遮光波長可変のショートパスフィルタとして機能する。

上記のように、不要な波長帯域を遮光板１５４で物理的に遮蔽しているので、干渉フィルタを用いるよりも高い遮光性能を容易に得ることができる。さらに、凹面鏡１５３で集光された光が遮光板１５４上に遮光されるため、遮光板１５４での遮光特性がさらに向上する。

図４は、図３に示す矢印Ａの方向から遮光板１５４を見た様子を示す図である。また、図４は、付加的に設けられた光吸収部１５７を示す。

図示のように、遮光板１５４は入射光（図中のｚ方向）に対して直交する面に対して、図中のy方向に傾いて配置される。なお、遮光板１５４は、分光に対する進退方向（図中のｘ方向）に傾いていない。

上記のように傾いた遮光板１５４により遮光された光は、凹面鏡１５３に戻る光路から外れて、光吸収部１５７に向かう。これにより、遮光板１５４からの反射光は光吸収部１５７に吸収され、顕微鏡１０１の内部で迷光となることが防止される。

光吸収部１５７は、奥に向かうほど間隔が狭くなる楔型の空間を形成する一対の壁面の内面を、反射率の低い塗料により塗装した構造を有する。これにより、光吸収部１５７に入射した光は、光吸収部１５７の内部で反射を繰り返すうちに減衰し、光吸収部１５７の外側で迷光となることが防止される。

図５は、ＬＶＦ１４１の波長特性と、遮光板１５４の波長特性とを合成した特性を示すグラフである。すでに説明した通り、ＬＶＦ１４１は入射光の長波長側を遮光する。また、遮光板１５４は入射光の短波長側を遮光する。よって、これらの組み合わせは、ＬＶＦ１４１の長波長側の遮光波長と、遮光板１５４の短波長側の遮光波長とにはさまれた帯域を透過するバンドパスフィルタとして機能する。

再び図１を参照すると、遮光板１５４で遮光されなかった光は、検出器１６０に入射する。検出器１６０は、光電子増倍管（ＰＨＯＴＯＭＵＬＴＩＰＬＩＥＲ ＴＵＢＥ）等の高感度な光電気変換素子により形成される。

検出器１６０は、検出した蛍光の強度に応じた電気信号を、情報処理装置１７０に出力する。情報処理装置１７０は、制御部１７１、表示部１７２、入力部１７３、１７４を有する。制御部１７１は、検出器１６０に対するインターフェイスを有すると共に、検出器１６０から取得した信号から画像を生成する画像処理を実行し、更に、生成された画像を格納して保存する。

表示部１７２は、ＬＣＤパネル、ＣＲＴ装置等により形成され、生成された画像をユーザに表示する他に、顕微鏡１０１に各種設定を入力する場合のユーザインターフェースの表示等も担う。入力部１７３、１７４は、キーボード等の文字入力装置、マウス等のポインティングデバイスを含み、ユーザが顕微鏡１０１に設定、動作の指示等を入力する場合に使用される。

更に、情報処理装置１７０は、制御装置１８０と通信して、制御装置１８０に対するユーザインターフェースとしても使用される。制御装置１８０は、ガルバノスキャナ１３０ＬＶＦ１４１、分光素子１５２および検出器１６０等の動作に関する設定値を保持して、これらユニットの動作を制御する。また、制御装置１８０は、情報処理装置１７０の負荷を軽減する目的で、情報処理装置１７０における画像処理等の全部または一部を実行してもよい。つまり、制御装置１８０は、情報処理装置１７０の制御部１７１で行う動作の全部または一部を実行してもよい。
また、情報処理装置１７０の制御部１７１は、制御装置１８０で行う動作の全部または一部を実行してもよい。

図６は、顕微鏡１０１を使用した標本２１０の観察手順を示す流れ図であり、図７は顕微鏡１０１の観察条件を設定する設定画面３１０の一例である。図６および図７の例は、観察位置毎に、一つの励起波長を用いて一度に（一回で）蛍光の強度を検出する形態を示す。以下、一度に（一回で）蛍光の強度を検出するときの波長帯域を検出波長範囲と呼ぶことがある。

まず、標本２１０に対して蛍光観察を実行する領域を顕微鏡１０１に指定する（ステップＳ１０１）。

次に、蛍光観察の観察条件がユーザにより設定される（Ｓ１０２）。観察条件には、励起光の波長および強度、検出器１６０の感度(印加電圧)、検出波長範囲、後述する波長分解能等が含まれる。観察条件は、情報処理装置１７０の表示部１７２に表示された設定画面３１０において、入力部１７３、１７４を用いて設定される。つまり、観察条件は、設定画面３１０を介して制御装置１８０に入力される。

図７の設定画面３１０は、励起波長の入力フィールド３１１、検出波長範囲の入力フィールド３１２、３１３、３１４を有する。入力フィールド３１１は、光源１１０から射出される光（励起光）の波長をプルダウンメニューから設定する領域である。入力フィールド３１２は遮光板で遮光する短波長側の遮光波長を設定する領域である。入力フィールド３１４はＬＶＦで遮光する長波長側の遮光波長を設定する領域である。これらの入力フィールド３１２、３１４へは数値が入力されてよい。入力フィールド３１３は、入力フィールド３１２、３１４で設定された検出波長範囲がグラフィックで示されている。入力フィールド３１３に表示されている検出波長範囲を示すバーの左右端が、入力部１７４等でドラッグされて遮光波長が設定できてもよい。これら入力フィールド３１２、３１４の数値と、入力フィールド３１３の検出範囲を示すバーとは連動している。

設定画面３１０はさらに、検出器１６０の感度(印加電圧)を設定するためのスライダ３１６および励起光の強度を設定するためのスライダ３１７を有する。入力部１７４等で当該スライダ３１６、３１７をドラッグして左右に移動させることで、感度および励起光強度が設定される。

ステップＳ１２０で、顕微鏡１０１は、設定画面３１０の画像取得ボタン３１８が押された場合に、次のステップＳ１０３に進む。

ステップＳ１０３において、上記ステップＳ１０２で設定された長波長側の遮光波長に基づいて、ＬＶＦ１４１の位置が設定される。具体的には、情報処理装置１７０からのデータに基づいて制御装置１８０が駆動部１４２を駆動して、ＬＶＦ１４１のｙ方向の位置を設定する。例えば、情報処理装置１７０又は制御装置１８０は、ＬＶＦ１４１の位置と遮光波長とを対応づけたテーブル等の情報を保持していてもよい。制御装置１８０は、ＬＶＦ１４１の位置と遮光波長とを対応づけた情報に基づいて、駆動部１４２を駆動して、ＬＶＦのｙ方向の位置を設定してもよい。

更に、上記ステップＳ１０２で設定された短波長側の遮光波長に基づいて、遮光板１５４の位置が設定される（Ｓ１０４）。具体的には、情報処理装置１７０からのデータに基づいて制御装置１８０が駆動部１５５を駆動して、遮光板１５４のｘ方向の位置を設定する。例えば、情報処理装置１７０又は制御装置１８０は、遮光板１５４の位置と遮光波長とを対応づけたテーブル等の情報を保持していてもよい。制御装置１８０は、遮光板１５４の位置と遮光波長とを対応づけた情報に基づいて、駆動部１４２を駆動して、ＬＶＦのｙ方向の位置を設定してもよい。

次に、制御装置１８０は、光源１１０を制御して、波長、発光強度等を調整する。また、制御装置１８０は、検出器１６０へ印加する電圧を調整する（Ｓ１０５）。

上記のように、蛍光観察の準備が完了すると制御装置１８０は、光源１１０に励起光の照射を開始し（Ｓ１０６）、指定された観察領域に励起光が照射されるようにガルバノミラー１３１、１３２を駆動する（Ｓ１０７）。これにより、検出器１６０は、ＬＶＦ１４１および遮光板１５４により画定された検出波長範囲に含まれる蛍光を検出する（Ｓ１０８）。

こうして、ステップＳ１０７およびステップＳ１０８の一連の動作により、集光位置から発生した蛍光の強度が検出されると、制御装置１８０は、検出された強度を保存した上で、当初指定された観察領域における１走査線上で指定された画素数の検出が完了したかどうかを判断する（Ｓ１０９）。

検出した画素数が指定された画素数に達していない場合（Ｓ１０９：ＮＯ）、制御装置１８０は、Ｘ座標における検出数をインクリメントして（Ｓ１１０）、制御をステップＳ１０７に戻す。これにより、顕微鏡１０１は、再びガルバノミラー１３１、１３２のいずれかを駆動して、励起光の集光位置を、同一ライン上の他の画素の位置に移動させ（Ｓ１０７）、再び蛍光の光強度を検出する（Ｓ１０８）。

これらステップＳ１０７およびステップＳ１０８の動作を繰り返し、蛍光の光強度を検出した画素数が指定の画素数に達した場合（Ｓ１０９：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、当初指定された観察領域における走査線数の検出が完了したか否かを判断する。（Ｓ１１１）。検出した走査線数が指定された走査線数に達していない場合（Ｓ１１１：ＮＯ）、制御装置１８０は、Ｙ座標における検出数をインクリメントして（Ｓ１１２）、制御をステップＳ１０７に戻す。そこで、制御装置１８０は、ガルバノミラーを駆動し、励起光の集光位置を他の走査線上に移動させ、再び蛍光の光強度を検出させる。

蛍光の光強度を検出した走査線数が指定された観察領域の走査線数に達した場合（Ｓ１１１：ＹＥＳ）、制御装置１８０は、検出した蛍光の光強度の値に基づいて、観察領域における観察画像を構築する（Ｓ１１３）。構築された観察画像は、表示部１７２の設定画面３１０の領域３１９に表示してもよいし、情報処理装置１７０に設けられた記憶部（図示せず）に格納してもよい。

取得された観察画像は情報処理装置１７０に格納されると共に、格納された観察画像が設定画面３１０の領域３１９に表示されてもよい。

図８は、顕微鏡１０１の検出波長範囲を示す模式図である。図６の設定画面３１０での設定に基づいて、上記ステップＳ１０３およびＳ１０４で、ＬＶＦ１４１と遮光板１５４の位置が設定されることにより、当該位置に対応した検出波長範囲の蛍光を検出することができる。

よって、検出器１６０に入射する光は、標本２１０から放射された放射光のうち、ＬＶＦ１４１においても、遮光板１５４においても遮光されなかった、観察目的とする蛍光であり、励起光も確実に取り除かれている。これにより、検出器１６０は、放射光のうちの蛍光成分を高いＳ／Ｎ比で検出できる。

本実施例では、ＬＶＦ１４１において長波長側の光を遮光し、遮光板１５４により短波長側の光を遮光した場合を例示して説明した。
したがって、蛍光に対して短波長側に位置し、光強度が大きい励起光を、遮光板１５４により物理的に遮光するため、ＬＶＦ１４１で励起光を遮光する場合と比較して、より確実に（より効率的に）励起光を遮光することができる。
また、例えば、分光素子１５２としてプリズムを用いた場合、長波長になるにつれて、波長間の射出角度の差が小さくなる。言い換えると、短波長になるにつれて、波長間の射出角度の差が大きくなる。したがって、短波長側の光を遮光板１５４により遮光する方が、長波長側の光を遮光板１５４により遮光する場合と比較して、高分解能で波長を遮光することができる。
本実施例では、プリズムにより分光された光のうち、短波長側の光を遮光板１５４により遮光するため、長波長側を遮光板１５４により遮光する場合と比較して、より遮光分解能を向上させることができる。
したがって、ＬＶＦ１４１において長波長側の光を遮光し、遮光板１５４により短波長側の光を遮光した場合、励起光を確実に遮光でき、また、遮光分解能も向上させることができる。言い換えると、ＬＶＦ１４１において長波長側の光を遮光し、遮光板１５４により短波長側の光を遮光した場合、遮光特性を向上させることができる。

なお、上記の例では、分光素子１５２としてプリズムを用いたが、分光素子１５２として回折格子を用いてもよい。回折格子は、透過型回折格子でもよいし、反射型回折格子でもよい。また、分光素子１５２として回折格子を用いた場合は、短波長帯域側をＬＶＦ１４１で遮光し、長波長側帯域を遮光板１５４で遮光するようにして顕微鏡１０１を構成してもよい。
なお、分光素子１５２としてプリズムを用いた場合でも、短波長帯域側をＬＶＦ１４１で遮光し、長波長側帯域を遮光板１５４で遮光するようにして顕微鏡１０１を構成してもよい。

以上は１つの検出波長範囲の画像取得方法について説明したが、波長帯域を予め複数設定しておくことで複数の検出波長範囲の画像を取得するようにしてもよい。以下にその具体的な例について説明する。

図９は光源１１０の他の例を模式的に示し、図１０は図９の光源１１０に対応した顕微鏡１０１の観察手順を示す流れ図であり、図１１は図１０に対応した設定画面３３０を示す。図９から図１１において、図１から図８と同じ構成および動作については同じ参照番号を付して説明を省略する。また、簡略化のため、図１０では図６におけるステップＳ１０７からＳ１１２までを走査処理（Ｓ２００）としてまとめて表した。

図９の例では、光源１１０は互いに異なる波長の光を出射する４つのレーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４を有する。例えばレーザ光源１１１から射出されるレーザ光の波長が４０５ｎｍであり、レーザ光源１１２から射出されるレーザ光の波長が４８８ｎｍであり、レーザ光源１１３から射出されるレーザ光の波長が５６１ｎｍであり、レーザ光源１１４から射出されるレーザ光の波長が６４０ｎｍである。

ミラー１１５はレーザ光源１１４から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１６は、ミラー１１５で反射されたレーザ光を透過するとともに、レーザ光源１１３から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１７は、ダイクロイックミラー１１６を透過および反射したレーザ光を透過するとともに、レーザ光源１１２から出射したレーザ光を反射する。ダイクロイックミラー１１８は、ダイクロイックミラー１１７を透過および反射したレーザ光を反射するとともに、レーザ光源１１１から出射したレーザ光を透過する。

図１０の観察手順において、ステップＳ１０２で観察条件が設定される。ここで、図９の光源１１０が４つのレーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４を有していることに対応して、観察条件として４つの励起光の波長を選択することができる。その場合には標本２１０にもそれぞれの励起光で励起される４種類の蛍光物質を含有させておく。

図１１の設定画面において、入力フィールド３１１は、励起光の波長を設定するための領域である。より詳細には、入力フィールド３１１は、光源１１０から射出される光（励起光）の波長をプルダウンメニューから設定する領域であり、複数の入力領域を含む。図示の例ではレーザ光源が４つあることに対応して、ＣＨ１からＣＨ４までの４つの値を設定できる。つまり、ＣＨ１からＣＨ４において、異なる４種類の励起波長が設定可能である。入力フィールド３１１への入力は、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。励起光の波長を設定する数は自由に設定でき、４つに限られない。

入力フィールド３３１は、ＬＶＦ１４１における遮光波長と、遮光板１５４における遮光波長とを数値で入力することにより、検出波長範囲の上限および下限の数値を入力する領域を示す。入力フィールド３３１への入力も、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。また、入力フィールド３３１も複数の領域を有し、図示の例では、励起光の波長の各々に対応して４つの範囲を設定できる。

入力フィールド３１３は、入力フィールド３３１で設定された検出波長範囲がグラフィックで示されている。入力フィールド３１３に表示されている検出波長範囲を示すバーの左右端が、入力部１７４等でドラッグされて遮光波長が設定できてもよい。これら入力フィールド３３１の数値と、入力フィールド３１３の検出範囲を示すバーとは連動している。

画像取得ボタン３１８が押下されると（Ｓ１２０：ＹＥＳ）、顕微鏡１０１は、図６に示した観察手順と同じ手順で画像の取得を開始する（Ｓ１０３以降）。顕微鏡１０１は、ステップＳ１０２で設定された検出波長領域に従って、駆動部１４２を駆動してＬＶＦ１４１のｙ方向位置を設定するとともに（Ｓ１０３）、駆動部１５５を駆動して遮光板１５４のｘ方向位置を設定する（Ｓ１０４）。

ステップＳ１０２において、光源１１０の波長と検出器１６０の受光帯域とがそれぞれ複数設定されていた場合に、制御装置１８０の制御の下に、複数の励起波長およびそれに対応する検出波長領域による標本２１０の観察を自動的に順次実行して（Ｓ１２１）、観察画像を構築する。
具体的には、ステップＳ１２１において、制御装置１８０は、予め設定された全て（図１１の例では４つ）の励起波長での画像の構築が完了したか否かを判断する。予め設定された全て（図１１の例では４つ）の励起波長での画像の構築が完了した場合は、処理を終了し、それ以外の場合は、ステップ１０３の処理に戻る。

図１２は、図１１に示した設定画面３１０で設定された観察条件における顕微鏡１０１の動作を説明するグラフである。制御装置１８０は、光源１１０の波長と、検出器１６０が受光する検出波長範囲とを同期して切り換えることにより、異なる波長帯域の蛍光を順次検出する。図示の例では、４つの励起光のそれぞれに対応して４つの検出波長範囲で蛍光が検出される様子が示されている。

この場合に、まず、励起光の波長が４０５ｎｍに対して検出波長範囲が４２０ｎｍから４７０ｎｍに設定されていることに従って、ＬＶＦ１４１のｙ方向位置と遮光板１５４のｘ方向位置とが設定される。レーザ光源１１１から波長４０５ｎｍの励起光を標本２１０に向かって照射しつつ、波長４２０ｎｍから４７０ｎｍの帯域を検出器１６０で受光して、当該波長帯域の蛍光を検出する。更に、制御装置１８０は、ガルバノスキャナ１３０により励起光の集光位置を移動させながら蛍光の検出を繰り返すことにより、顕微鏡１０１は、波長４０５ｎｍの励起光で発生する蛍光により形成された観察画像を取得できる。

次いで、励起光の波長が４８８ｎｍに対して検出波長範囲が５００ｎｍから５５０ｎｍに設定されていることに従って、ＬＶＦ１４１のｙ方向位置と遮光板１５４のｘ方向位置とが設定される。制御装置１８０は、レーザ光源１１２から波長４８８ｎｍの励起光を標本２１０に向かって照射しつつ蛍光を検出する。更に、ガルバノスキャナ１３０により励起光の集光位置を移動させながら蛍光の検出を繰り返すことにより、顕微鏡１０１は、波長４８８ｎｍの励起光で発生する蛍光により形成された観察画像を取得できる。

次いで、制御装置１８０は、光源１１０の波長を、設定画面３１０で設定された５６１ｎｍ、６４０ｎｍに順次切り換えて、波長５７０ｎｍから６３０ｎｍの帯域、および、波長６６０ｎｍから７２０ｎｍの帯域でそれぞれ蛍光による観察画像を取得する。

これにより、簡便な構成で複数の励起波長に対応する複数の検出波長範囲の画像を取得することができる。なお、図９から図１２に示す実施形態において、各レーザ光源１１１、１１２、１１３、１１４から順次、レーザ光を出射したが、すべてのレーザ光源からレーザ光を出射した状態で、ＬＶＦ１４１および遮光板１５４の位置を順次変えてもよい。
また、図９から図１２に示す実施形態において、画像構築が完了した後に励起波長の切り替えを行ったが、例えば、１ラインの走査が完了する毎に励起波長の切り替えを行ってもよい。

これまでは複数の蛍光物質に対応した励起光毎の画像を得る操作方法について説明をしてきたが、一度（一回）に検出する検出波長範囲の幅をより狭くして同様に連続的に蛍光画像を取得することで、標本２１０の蛍光スペクトル分布を得ることが出来る。

図１３は、顕微鏡１０１を用いて蛍光スペクトル分布を取得するための流れ図であり、図１４は図１３に対応した設定画面３５０を示す。図１３および図１４において、図１から図１２と同一の構成および動作については同じ参照番号を付して説明を省略する。

この観察パターンは、ＬＶＦ１４１と遮光板１５４を設定し、複数回蛍光を取得する場合である。ここでは一度に（一回で）検出する波長範囲を２０ｎｍとし、それを１４回繰り返すことで４３０ｎｍから７１０ｎｍまでの蛍光スペクトルプロファイルを取得することとする。

図１４の設定画面３５０は、図１３のステップＳ１０２で観察条件を設定する場合に、表示部１７２に表示される。入力フィールド３１１は、図７に示した設定画面３１０の入力フィールド３１１と同じレイアウトを有し、光源１１０により射出される光（励起光）の波長の値を設定できるが、図示の例では、４０５ｎｍが指定されている。入力フィールド３１１への入力は、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。

入力フィールド３１２、３１４は、標本２１０から放射される蛍光スペクトルの取得波長範囲を数値で設定する場合に入力する領域である。入力フィールド３１２、３１４への入力には、情報処理装置１７０の入力部１７３、１７４を使用できる。入力フィールド３１２は取得波長範囲の短波長端を入力する領域であり、入力フィールド３１４は長波長端を入力する領域である。図示の例では、波長４３０ｎｍから７１０ｎｍの取得波長範囲が設定されている。

入力フィールド３５１は、上記の入力フィールド３１２、３１４で設定された取得波長範囲において一度に（一回で）蛍光スペクトルを検出する検出波長範囲を設定する。なお、ここでの検出波長範囲は、蛍光スペクトルプロファイルの波長分解能に相当する。図示の例では、２０ｎｍ間隔で蛍光強度を検出することが設定されている。よって、この例では、波長４３０ｎｍから７１０ｎｍの帯域について、１４帯域の検出が指定されることになる。なお、検出波長範囲を設定することに代えて、上記の入力フィールド３１２、３１４で設定された取得波長範囲において検出する帯域の数が入力できるようになっていてもよい。この場合には入力された帯域の数に基づいて波長分解能が自動的に設定される。

入力フィールド３１３は、入力フィールド３５１、３１２、３１４において設定された取得波長範囲と波長分解能とがグラフィックで表示されると共に、入力フィールド３１３に表示されたバーを直接に操作して、取得する波長範囲を入力することもできる。入力フィールド３１２、３１４の数値と入力フィールド３１３に表示されたバーとは連動している。

図１５は、図１４に示した設定画面３５０で設定された観察条件での取得波長範囲および検出波長範囲を説明する模式図である。この場合の蛍光スペクトル取得においては、入力フィールド３１１で指定された波長４０５ｎｍの励起光が標本２１０に照射される。また、入力フィールド３１２、３１４で指定された波長４３０ｎｍから７１０ｎｍまでの取得波長範囲において、入力フィールド３５１で指定した波長分解能（検出波長範囲）で、２０ｎｍおきに１４回、蛍光画像を取得する。

この場合に、各検出波長範囲において、短波長側が遮光板１５４により遮光され、長波長側がＬＶＦ１４１により遮光される。言い換えると、制御装置１８０は、各検出波長範囲の下限から低い波長帯域を遮光板１５４で遮光し、同範囲の上限よりも高い帯域をＬＶＦ１４１で遮光させる。また、ひとつの検出波長範囲において蛍光画像を取得すると、駆動部１４２、１５５をそれぞれ動作させて、検出波長範囲を、すでに蛍光強度を検出した検出波長範囲に隣接した帯域にずらす（図１３のＳ１２２、Ｓ１０３、Ｓ１０４）。

図１６は、顕微鏡１０１で検出された標本２１０のある位置での蛍光スペクトルプロファイルを例示する図である。顕微鏡１０１は、上記のような動作を繰り返すことにより、複数の検出波長範囲について、検出波長範囲毎に蛍光強度を検出する。よって、検出された画像の蛍光強度を横軸波長、縦軸強度のグラフにプロットすることにより、図１６に示すように、標本２１０の各検出位置でのスペクトルプロファイルを生成できる。なお、スペクトルプロファイルは、例えば、領域３２０に表示される。なお、検出波長範囲毎に検出された蛍光強度（発光強度）を足し合わせた二次元画像を設定画面３５０の領域３１９にさらに表示してもよい。

図１７は、図１４から図１６の実施形態において取得された画像を表示する表示画像３６０を示す例である。観察画像３４８は、所定の検出波長領域で構築された観察画像である。表示画像３６０は、異なる検出波長領域で構築された複数の観察画像３４８をタイル状に表示する複数の画像表示フィールド３４３を有する。これにより、ユーザは、それぞれの検出波長領域の観察画像３４８を一度に観察することができる。

図１８は、図１４から図１６の実施形態において取得された画像を表示する他の表示画像３７０、３７１、３７２を示す例である。取得した二次元の表示画像３７０上で指定した領域Ａ、Ｂにおける蛍光強度を平均化または積算して検出波長範囲毎にプロットすれば、標本２１０上における任意の範囲Ａ、Ｂの蛍光スペクトルプロファイルの表示画像３７１、３７２を得ることも可能である。

図１９は、他の構造を有する顕微鏡１０２の模式図である。顕微鏡１０２は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１０１と同じ構造を有する。よって、顕微鏡１０２において顕微鏡１０１と共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

顕微鏡１０２は、ＬＶＦ１４１に代えて、円形ＬＶＦ２４１を有する。また、顕微鏡１０２は、駆動部１４２に代えて、回転駆動部２４２を有する。

図２０は、円形ＬＶＦ２４１を、円形ＬＶＦ２４１に入射する放射光の伝播方向に交差する方向から見た様子を示す図である。円形ＬＶＦ２４１は、透明円板２４３および環状誘電体膜２４４を有する。

透明円板２４３は、回転駆動部２４２により回転駆動される、放射光の帯域に対して透明な円板である。環状誘電体膜２４４は、透明円板２４３と同心状に透明円板２４３に形成され、透明円板２４３から支持される。また、環状誘電体膜２４４は、周方向に厚さが連続的に変化する。これにより、環状誘電体膜２４４は、遮光波長が周方向に連続的に変化するＬＶＦを形成する。これにより、回転駆動部２４２により回転駆動された場合に、環状誘電体膜２４４に形成される放射光スポット２４７に対して、所望の遮光波長の領域を位置合わせできる。

このような構造により、顕微鏡１０２におけるＬＶＦの構造を簡素化できる。また、円形ＬＶＦ２４１は、運動方向を変えることなく遮光波長を変更できるので、円形ＬＶＦ２４１の振動および騒音を低減できる。

図２１は、また他の顕微鏡１０３の模式図である。顕微鏡１０３は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１０１と同じ構造を有する。よって、顕微鏡１０３において顕微鏡１０１と共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

顕微鏡１０３は、第１のピンホール１２５とＬＶＦ１４１との間に配されたコリメートレンズ１４７を備える点で、顕微鏡１０１と異なる構造を有する。コリメートレンズ１４７は、第１のピンホール１２５から入射した放射光を平行光束にする。これにより、放射光はＬＶＦ１４１に平行光束として入射する。

よって、ＬＶＦ干渉膜に対する斜入射による波長選択性能の劣化が防止される。

また、顕微鏡１０３では、ＬＶＦ１４１から射出された放射光は、分光素子１５２にも平行光線として入射する。このため、分光素子１５２の入射端の第２のピンホール１５１は省かれている。

分光素子１５２としてのプリズムにおいても、入射光束に斜入射光が含まれている場合、波長毎に異なる収差が発生する。よって、分光素子１５２に入射する放射光を平行光線とすることにより、分光素子１５２以降の光学設計が複雑になることを防止できる。

図２２は、顕微鏡１０４の模式図である。顕微鏡１０４は、次に説明する部分を除くと、図１に示した顕微鏡１０１と同じ構造を有する。よって、顕微鏡１０４において顕微鏡１０１と共通の要素には同じ参照番号を付して重複する説明を省く。

顕微鏡１０４は、観察光学系２４０において、ＬＶＦ１４１と分光素子１５２との間で、放射光の光路上に複数のダイクロイックミラー１２６、１２８が挿入されている点で、顕微鏡１０１と異なる構造を有する。

ダイクロイックミラー１２６、１２８は、各々の反射特性または透過特性に応じて、ＬＶＦ１４１から分光素子１５２に向かって伝播する放射光の一部成分を反射して、当初の光路から分岐させる。ダイクロイックミラー１２６、１２８において反射した光は、各々が励起光除去フィルタ１２７、１２９を通じて、検出器１６１、１６２に受光される。

図２３は、顕微鏡１０４における検出器１６０、１６１、１６２の検出波長を示すグラフである。図示のように、ＬＶＦ１４１から分光素子１５２に向かって伝播する放射光の長波長側の帯域は、ＬＶＦ１４１の遮光波長に応じて遮光され、帯域ＡからＤの光が透過する。

ダイクロイックミラー１２６は予め定められた波長よりも短波長側の帯域Ａの光を反射して、長波長側の帯域ＢからＤの光を透過する。励起光除去フィルタ１２７は帯域Ａにおける短波長側にある励起光の波長帯域を遮光し、それ以外の帯域の光を透過する。検出器１６１は、励起光除去フィルタ１２７を透過した、帯域Ａの光を検出する。

ダイクロイックミラー１２８は、ダイクロイックミラー１２６よりも長波長側の予め定められた波長よりも短波長側の帯域の光を反射して、長波長側の帯域の光を透過する。ここで、帯域Ａの光はダイクロイックミラー１２６でほぼ反射されておりダイクロイックミラー１２６には入射しないので、ダイクロイックミラー１２８は実質的に帯域Ｂの光を反射して、帯域ＣおよびＤの光を透過する。励起光除去フィルタ１２９は励起光の波長帯域を遮光し、それ以外の帯域の光を透過する。よって、検出器１６１は、励起光除去フィルタ１２９を透過した、帯域Ｂの光を検出する。

分光素子１５２には帯域ＣおよびＤの光が入射するが、図１で説明したのと同様に、遮光板１５４で領域Ｄの光を透過し、領域Ｃの光を遮光する。よって、検出器１６０は、遮光板１５４の遮光波長と、ＬＶＦ１４１の遮光波長とに挟まれた帯域Ｄの放射光を受光する。このように、顕微鏡１０４において検出器１６１、１６２を設けることにより、遮光板１５４で遮光されることになる波長の一部を検出器１６１、１６２で検出することができる。

以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。

請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。

１０１、１０２、１０３、１０４ 顕微鏡、１１０ 光源、１２１、１２６、１２８ ダイクロイックミラー、１２２ リレーレンズ、１２３ ミラー、１２４、１４３、１５６ 集光レンズ、１２５ 第１のピンホール、１５１ 第２のピンホール、１２７、１２９ 励起光除去フィルタ、１３０ ガルバノスキャナ、１３１、１３２ ガルバノミラー、１４２、１５５ 駆動部、１４１ ＬＶＦ、１４２、１５５ 駆動部、１４７ コリメートレンズ、１５２ 分光素子、１５３ 凹面鏡、１５４ 遮光板、１５７ 光吸収部、１６０、１６１、１６２ 検出器、１７０ 情報処理装置、１７１ 制御部、１７２ 表示部、１７３、１７４ 入力部、１８０ 制御装置、１９１ 対物レンズ、１９２ レンズ、２１０ 標本、２２０ 照明光学系、２４０ 観察光学系、２４１ 円形ＬＶＦ、２４２ 回転駆動部、２４３ 透明円板、２４４ 環状誘電体膜、２４７ 放射光スポット、３１０、３３０、３５０ 設定画面、３１１、３１２、３１３、３１４、３３１、３５１ 入力フィールド、３１６、３１７ スライダ、３１８ 画像取得ボタン

Claims (9)

1. 標本に励起光を照射する照明光学系と、
   前記標本から発せられた蛍光を検出する検出器と、
   前記蛍光を前記検出器に導く観察光学系と
   を有し、
   前記観察光学系は、
   光が入射する位置に基づいて波長特性が可変な光学フィルタと、
   前記光学フィルタを透過した光を分光する分光素子と、
   前記分光素子により分光された光の少なくとも一部を遮光する遮光板と
   を
   備え、
   前記遮光板は、前記分光された光の光路の片側のみに設けられ、前記分光された光の光路に対して進退可能に設けられる
   顕微鏡。
2. 前記光学フィルタは、前記分光された光のうち所定の波長の光よりも短い波長を透過させ、長い波長を遮光する波長特性を有し、
   前記遮光板は、前記分光された光のうち所定の波長の光よりも短い波長を遮光する、
   請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記光学フィルタと前記分光素子との間にピンホールが設けられている請求項１または２に記載の顕微鏡。
4. 前記光学フィルタはＬＶＦである、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
5. 前記分光素子はプリズムおよび回折格子のいずれかである
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡。
6. 前記観察光学系は、
   前記分光された光を前記遮光板上に集光する集光光学系を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡。
7. 前記遮光板が傾斜して配される請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡。
8. 前記遮光板において反射された光を吸収する吸収部をさらに備える請求項７に記載の顕微鏡。
9. 表示部と、
   前記蛍光の検出波長範囲を設定するための設定画面を前記表示部に表示し、前記設定画面において設定された前記蛍光の検出波長範囲に基づいて、前記光学フィルタおよび前記遮光板の位置を制御する制御部
   とをさらに備える
   請求項１〜８のいずれか１項に記載の顕微鏡。

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