JP6582046B2 - 検出方法、および検出装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料中に含まれる検出対象物の検出方法および検出装置に関するものである。

抗体を表面に結合させた検出素子を備えるバイオセンサを用いて、試料中の標的物質を検出する方法が知られている（例えば、特許文献１または２参照）。

特許第２６２５５７７号公報 特開２００１−１３１４２号公報

しかしながら、従来の検出方法および検出装置では、試料に含まれる検出対象物以外の物質の影響を受けることによって、試料中の検出対象物を正確に検出できないおそれがあった。また、例えば、粘度および密度などの影響を受けることによって、検出対象物の信号値を正確に検出できないおそれがあった。

そのため、試料中に含まれる検出対象物以外の物質の影響、および試料間の粘度差および密度差の影響、を低減することによって、試料中の検出対象物をより正確に検出することができる検出方法および検出装置が求められている。

本発明の実施形態に係る検出方法は、試料中に含まれる検出対象物の検出方法であって、検出体の表面に結合しており、前記検出対象物と反応する一次物質を準備する準備工程と、試料を前記検出体の表面に供給し、前記検出対象物と前記一次物質との反応によって一次反応物を前記検出体の表面上に形成させる第１反応工程と、前記第１反応工程の後、第１液体を前記検出体の表面に供給する第１供給工程と、前記第１供給工程の後、前記検出体の表面状態に基づく第１信号値を測定する第１測定工程と、前記第１測定工程の後、信号増幅用物質を前記検出体の表面に供給し、前記第１反応工程で形成された前記一次反応物が関与する反応によって前記検出体の表面状態を変化させる信号増幅工程と、前記信号増幅工程の後、前記検出体の表面状態に基づく第２信号値を測定する第２測定工程と、前記第１信号値と前記第２信号値とから検出値を得る第１検出工程と、を備える。

本発明の実施形態に係る検出装置は、試料中に含まれる検出対象物を検出するための検出装置であって、試料を、検出体の表面に結合され前記検出対象物と反応する一次物質に供給し、前記検出対象物と前記一次物質との反応によって一次反応物を前記検出体の表面上に形成させる第１反応部と、第１液体を前記検出体の表面に供給する第１供給部と、前記第１供給部によって前記第１液体液が前記検出体の表面に供給された後、前記検出体の表面状態に基づく第１信号値を測定する第１測定部と、信号増幅用物質を前記検出体の表面に供給し、前記一次反応物が関与する反応によって前記検出体の表面状態を変化させる信号増幅部と、前記信号増幅用物質が供給された前記検出体の表面状態に基づく第２信号値を測定する第２測定部と、前記第１信号値と前記第２信号値とから検出値を得る第１検出部と、前記第１検出部で得られた検出値を表示する表示部と、を備える。

本発明の実施形態に係る検出方法および検出装置によれば、上述のような構成を有することによって、試料中に含まれる検出対象物以外の物質の影響を低減することが可能となるので、試料中に含まれる検出対象物をより正確に検出することが可能となる。また、試料によって生じる粘度および密度の影響を低減することが可能であるため、試料中に含まれる検出対象物をより正確に検出することが可能となる。

本発明の実施形態に係る検出方法のフローチャートを示す図である。 本発明の実施形態に係る検出方法のフローチャートを示す図である。 本発明の実施形態に係る検出装置を示すブロック図である。 本発明の実施形態に係るバイオセンサ装置２００の斜視図である。 本発明の実施形態に係るバイオセンサ装置２００の分解斜視図である。 本発明の実施形態に係る検出素子３の平面図である。 本発明の実施形態に係る検出方法で取得される信号値の模式図である。 本発明の実施形態に係る検出方法に関する実験データを示す図である。

＜検出方法＞
（第１実施形態）
図１は、本発明の第１実施形態の検出方法を示すフローチャートである。
本発明の第１実施形態に係る検出方法は、試料中に含まれる検出対象物の検出方法であって、
検出体の表面に結合しており、検出対象物と反応する一次物質を準備する準備工程Ａ１と、
試料を検出体の表面に供給し、検出対象物と一次物質との反応によって一次反応物を検出体の表面上に形成させる第１反応工程Ａ２と、
第１反応工程Ａ２の後、第１液体を検出体の表面に供給する第１供給工程Ａ３と、
第１供給工程Ａ３の後、検出体の表面状態に基づく第１信号値を測定する第１測定工程Ａ４と、
第１測定工程Ａ４の後、信号増幅用物質を検出体の表面に供給し、前記第１反応工程Ａ２で形成された前記一次反応物が関与する反応によって前記検出体の表面状態を変化させる信号増幅工程Ａ５と、
信号増幅工程Ａ５の後、検出体の表面状態に基づく第２信号値を測定する第２測定工程Ａ６と、
第１信号値と第２信号値とから検出値を得る第１検出工程Ａ７と、を備える。

準備工程Ａ１は、検出体の表面に結合しており、検出対象物と反応する一次物質を準備する工程である。
第１反応工程Ａ２は、一次物質が結合された検出体と、この検出体に試料を供給するための供給路、試料を供給路内に流すポンプなどによって実施されるが、構成は限定されない。
第１供給工程Ａ３は、第１液体を供給するための供給路、ポンプなどによって実施されるが、構成は限定されず、第１反応工程Ａ２と同様に実施されてもよい。
第１測定工程Ａ４は、検出体に信号を入力し、検出体から出力される信号に基づいて予め定める信号値を取得する素子を含む装置などによって実施されてもよいが、構成は限定されない。
信号増幅工程Ａ５は、第１反応工程Ａ２の検出体と、この検出体に信号増幅用物質を供給するための供給路、ポンプなどによって実施されるが、構成は限定されず、反応部２０と兼用されてもよい。
第２測定工程Ａ６は、検出体に信号を入力し、検出体から出力される信号に基づいて予め定める信号値を取得する素子を含む装置などで実施されてもよいが、構成は限定されず、第１測定工程Ａ４と同様に実施されてもよい。
第１検出工程Ａ７は、第１信号値と第２信号値とから検出値を得る演算素子を含む演算装置などによって実施されてもよいが、構成は限定されない。

ここで、本明細書において、「試料」とは、たとえば、血液、尿、唾液、痰などを含む生体試料そのものであってもよく、生体試料を緩衝液などによって希釈したものであってもよい。なお、生体試料以外の試料であってもよい。

ここで、複数の試料について、各試料中にそれぞれ同量含まれている検出対象物を検出する場合において、第１供給工程Ａ３において第１液体を検出体の表面に供給しても、試料に含まれており且つ検出対象物とは異なる物質である夾雑物を検出体の表面から完全に除去することができずに、各検出対象物に対する信号値に差が生じる可能性がある。しかしながら、本実施形態の検出方法によれば、第１信号値と第２信号値とから検出値を得ることで、各試料間における夾雑物の影響あるいは粘度差および密度差の影響を低減することができる。これは、第１信号値と第２信号値とから得られる検出値が、検出体の表面に残存する夾雑物の量による影響を受けないことによるものである。このように、各試料間における夾雑物（残渣）の影響を低減することにより、試料中に含まれる検出対象物をより正確に検出することが可能となる。

以下、本実施形態の検出方法について順に説明を行なう。
本実施形態の準備工程Ａ１は、検出体の表面に結合しており、検出対象物と反応する一次物質を準備するものである。

本明細書において、「検出対象物」とは、たとえば、抗原、抗体などを含み、これらに限定されない。なお、以下において、検出対象物を抗原として記載することがある。

本明細書において、「検出体」とは、たとえば、表面弾性波素子、ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、およびＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）などの信号値を出力する素子を含み、これらに限定されない。

本実施形態の第１反応工程Ａ２は、試料を検出体の表面に供給し、検出対象物と一次物質との反応によって一次反応物を検出体の表面上に形成させるものである。

本明細書において、「一次物質」とは、検出対象物と特異的に反応する物質であれば特に限定されるものではないが、たとえば、検出対象物が抗原の場合であれば当該抗原と結合する抗体、検出対象物が抗体の場合であれば当該抗体に結合する抗原などを含む。

本明細書において、「一次反応物」とは、たとえば、一次物質が検出対象物を捕捉した捕捉体、検出対象物と一次物質とが結合した複合体、一次物質の一部が検出対象物と結合して一次物質から上記一部が解離した解離体などを意味し、これらに限定されるものではないが、抗原と抗体とが反応して得られる複合体などを含む。

なお、変形例として、上述したように、第１反応工程Ａ２において、検出対象物と一次物質の一部とを結合させるとともに一次物質から一部を解離させることによって、一次反応物を形成することも可能である。

本実施形態の第１供給工程Ａ３は、第１液体を検出体の表面に供給するものである。

本明細書において、「第１液体」とは、たとえば、緩衝液などであってもよい。緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジンエタンスルホン酸）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液、およびＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液などを含み、これらに限定されず緩衝液として周知のものを適宜用いればよい。また、緩衝液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、およびＥＤＴＡ（エチレンジアミンン四酢酸）を含んでもよく、必要に応じて、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）、Ｂｒｉｊ３５（登録商標）などの界面活性剤をさらに含んでもよい。さらに、緩衝液には、必要に応じてブロッキング物質が混合されてもよい。ブロッキング物質は、たとえば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、ポリエチレングリコール、ＭＰＣ（メタクリル酸ホスホリルコリン）ポリマー、ベタインポリマー、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチルメタクリル酸）ポリマーなどが挙げられる。これらの点は、後述する第２液体および第３液体においても同様である。

本実施形態の第１測定工程Ａ４は、検出体の表面状態に基づく信号値を測定するものである。

本実施形態において、検出体の表面に表面弾性波素子を形成し、検出体の表面状態に基づく信号値として、表面弾性波素子の位相特性の値を用いてもよい。

また、本実施形態において、検出体の表面状態に基づく信号値は、ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）センサ、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）センサおよびＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ Ｅｆｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）センサから選択された方法によって測定された値であってもよい。

本実施形態の信号増幅工程Ａ５は、信号増幅用物質を検出体の表面に供給し、第１反応工程Ａ２で形成された一次反応物が関与する反応によって検出体の表面状態を変化させるものである。

本明細書において、「信号増幅用物質」とは、検出体の表面状態を変化させる物質であれば特に限定されるものではないが、たとえば、一次反応物に特異的に反応する、標識化二次抗体、標識化ペプチド、標識化リガンド、および標識化アプタマーなどを含む。標識は、検出体の表面状態を変化させるものであれば、特に限定されるものではないが、ストレプトアビジンなどのタンパク質、ビオチン、酵素、蛍光物質、および金属粒子などのナノ粒子などを含む。

本明細書において、「第１反応工程で形成された一次反応物が関与する反応」とは、一次反応物の量に応じて検出体の表面状態が変化する反応であれば特に限定されるものではないが、第１反応工程Ａ２で形成された一次反応物と信号増幅用物質との結合反応、第１反応工程Ａ２で形成された一次反応物と信号増幅用物質との酵素反応、第１反応工程Ａ２で形成された一次反応物と信号増幅用物質との還元反応などを含み、一次物質と信号増幅用物質とが直接反応してもよく、一次物質と信号増幅用物質とが他の物質を介して間接的に反応してもよい。

本実施形態において、第１測定工程Ａ４と信号増幅工程Ａ５との間に、少なくとも１種の追加反応物質を前記検出体の表面に供給する追加反応工程をさらに備えてもよい。また、少なくとも１種の追加反応物質は複数種の追加反応物質を有し、当該追加反応物質は１種ずつ供給されてもよい。

追加反応工程が実施される場合、信号増幅物質は、一次反応物に特異的に反応するものでなくてもよく、たとえば、ストレプトアビジン、３，３’ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムなどの基質、ならびに塩化金酸とヒドロキシルアミン塩酸塩との組み合わせ、および硝酸銀と硫酸鉄との組み合わせなどの金属イオンと還元剤との組み合わせなどを含んでもよい。

本明細書において、「追加反応物質」とは、たとえば、ビオチン、ストレプトアビジン、ビオチン標識抗体、ペルオキシダーゼ標識抗体、およびアルカリホスファターゼ標識抗体などの酵素標識抗体、金属粒子標識抗体などのナノ粒子標識抗体、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、およびアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンなどの酵素標識ストレプトアビジン、ならびに金属粒子標識ストレプトアビジンなどのナノ粒子標識ストレプトアビジンなどを含む。

追加反応物質は、選択される信号増幅用物質に応じて選択されるべきである。たとえば、信号増幅用物質がストレプトアビジンである場合、追加反応物質は、ビオチン標識抗体である。たとえば、信号増幅用物質が３，３’ジアミノベンジジンである場合、追加反応物質は、ビオチン標識二次抗体、およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンである。たとえば、信号増幅用物質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムである場合、追加反応物質は、ビオチン標識二次抗体、およびアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンである。たとえば、信号増幅用物質が塩化金酸およびヒドロキシルアミン塩酸塩である場合、追加反応物質は、ビオチン標識二次抗体、およびＡｕ粒子標識ストレプトアビジンである。

追加反応工程において、追加反応物質は、検出体の表面状態の変化をさらに増幅させるために繰り返し供給されてもよい。たとえば、信号増幅用物質がストレプトアビジンであり、追加反応物質がビオチン標識抗体である場合、追加反応工程において、第１にビオチン標識二次抗体が供給され、第２にストレプトアビジンが供給され、第３にビオチン標識抗体が供給され、第４にストレプトアビジンが供給され、第５にビオチン標識抗体が供給され、続いて信号増幅工程Ａ５においてストレプトアビジンが供給される。

本実施形態において、第１反応工程Ａ２と第１供給工程Ａ３との間に、少なくとも１種の前駆反応物質を前記検出体の表面に供給する前駆反応工程をさらに備えてもよい。また、少なくとも１種の前駆反応物質は複数種の前駆反応物質を有し、当該前駆反応物質は１種ずつ供給されてもよい。

前駆反応工程が実施される場合、信号増幅物質は、一次反応物に特異的に反応するものでなくてもよく、たとえば、ストレプトアビジン、３，３’ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、４−クロロ−１−ナフトール、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムなどの基質、ならびに塩化金酸とヒドロキシルアミン塩酸塩との組み合わせ、および硝酸銀と硫酸鉄との組み合わせなどの金属イオンと還元剤との組み合わせなどを含んでもよい。

本明細書において、「前駆反応物質」とは、たとえば、ビオチン、ストレプトアビジン、ビオチン標識抗体、ペルオキシダーゼ標識抗体、およびアルカリホスファターゼ標識抗体などの酵素標識抗体、金属粒子標識抗体などのナノ粒子標識抗体、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、およびアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンなどの酵素標識ストレプトアビジン、ならびに金属粒子標識ストレプトアビジンなどのナノ粒子標識ストレプトアビジンなどを含む。

前駆反応物質は、選択される信号増幅用物質に応じて選択されるべきである。たとえば、信号増幅用物質がストレプトアビジンである場合、前駆反応物質は、ビオチン標識抗体である。たとえば、信号増幅用物質が３，３’ジアミノベンジジンである場合、前駆反応物質は、ビオチン標識二次抗体、およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンである。たとえば、信号増幅用物質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムである場合、追加反応物質は、ビオチン標識二次抗体、およびアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンである。たとえば、信号増幅用物質が塩化金酸およびヒドロキシルアミン塩酸塩である場合、前駆反応物質は、ビオチン標識二次抗体、およびＡｕ粒子標識ストレプトアビジンである。

前駆反応工程において、前駆反応物質は、検出体の表面状態の変化をさらに増幅させるために繰り返し供給されてもよい。たとえば、信号増幅用物質がストレプトアビジンであり、前駆反応物質がビオチン標識抗体である場合、前駆反応工程において、第１にビオチン標識二次抗体が供給され、第２にストレプトアビジンが供給され、第３にビオチン標識抗体が供給され、第４にストレプトアビジンが供給され、第５にビオチン標識抗体が供給され、第１供給工程Ａ３および第１測定工程Ａ２を経た後、信号増幅工程Ａ５においてストレプトアビジンが供給される。

なお、信号増幅用物質、追加反応物質、前駆反応物質は緩衝液などによって希釈したものであってもよい。

なお、信号増幅工程Ａ５において、信号増幅用物質を、一次反応物のうち検出対象物と結合させることも可能である。

なお、本実施形態において、信号増幅工程Ａ５の後であって第２測定工程Ａ６の前において、第２液体を検出体の表面に供給する第２供給工程をさらに備えてもよい。
これによれば、信号増幅工程Ａ５において一次反応物と反応しなかった信号増幅用物質を検出体の表面から除去することによって、第２信号値から一次反応物に反応しなかった信号増幅用物質の影響を低減することができ、第２測定工程Ａ６で測定される検出対象物に関する信号値の正確性を向上することができる。

なお、本明細書において、「第２液体」とは、たとえば、緩衝液などであってもよい。

また、本実施形態において、第１液体と第２液体とを同一種類の液体とすることができる。

本実施形態の第２測定工程Ａ６は、検出体の表面状態に基づく信号値を測定するものである。

本工程は、上述の第１測定工程Ａ４と同様に行なえばよい。

本実施形態の第１検出工程Ａ７は、第１信号値と第２信号値とから検出値を得るものである。

本実施形態において、第２信号値は、第１信号値よりも大きくてもよい。ここで、信号値の大小は、たとえば第１反応工程Ａ２前の信号値との差分の絶対値にて判断すればよい。

なお、本実施形態において、試料として、検出対象物とは異なる物質からなる夾雑物をさらに含むものを用いても良い。

この場合には、第１反応工程Ａ２において検出体の表面に検出対象物とは異なる夾雑物が付着し、その後、第１供給工程Ａ３において第１液体を検出体の表面に供給することによって検出体の表面から完全に除去することができずに残存する場合がある。それ故、第１信号値は、検出体の表面に残存している検出対象物とは異なる夾雑物の影響を受ける。

その場合において、この夾雑物の残渣による影響を低減するために、第１信号値と第２信号値から検出値を得ることによって、検出体の表面に残存している夾雑物に由来する信号値を、第２信号値から除去することができることから、検出対象物のより正確な信号値を測定することが可能となる。

本発明の一実施形態において、信号増幅工程Ａ５の一態様として第２反応工程を備えてもよい。第２反応工程において、一次反応物と反応する二次物質が検出体の表面に供給され、一次反応物と二次物質との反応によって二次反応物が検出体の表面上に形成される。

第２反応工程は、第１反応工程の検出体と、この検出体に二次物質を供給するための供給路、ポンプなどによって実施されるが、構成は限定されず、第１反応工程と同様に実施されてもよい。

本明細書において、「二次物質」とは、一次反応物に特異的に反応する物質であれば特に限定されるものではないが、たとえば、二次抗体などを含み、信号増幅用物質の一態様であってもよい。

なお、二次物質は、たとえば、ビオチン、酵素、ナノ粒子、金属ナノ粒子などで標識された標識化二次抗体を用いることができる。二次物質に標識を付した標識化二次抗体を用いることによって、二次物質に由来する信号値を増幅させることができるので、検出対象物をより高感度に検出することができる。

本明細書において、「二次反応物」とは、たとえば、一次反応物が二次物質を捕捉した捕捉体、一次反応物と二次物質との複合体などを意味し、これらに限定されるものではないが、抗原と一次抗体と二次抗体との複合体などを含む。

なお、二次反応物の分子量は、一次反応物の分子量よりも大きくてもよい。これによれば、後述する第２測定工程Ａ６において大きな信号値を得ることによって、検出対象物を高感度に検出することができる。

なお、第２反応工程において、二次物質を、一次反応物のうち検出対象物と結合させて二次反応物を形成することも可能である。

信号増幅工程Ａ５の一態様として第２反応工程を実施する一実施例として、検出対象物が抗原であり、検出体として表面弾性波素子を用い、一次物質として一次抗体を用い、第１液体として緩衝液を用い、二次物質として標識化二次抗体を用いた例を以下に示す。
すなわち、第１実施形態の一実施例は、試料中に含まれる抗原の検出方法であって、
表面弾性波素子の表面に結合しており、抗原に対する一次抗体を準備する準備工程と、
試料を表面弾性波素子の表面に供給し、前記抗原に対する一次抗体に反応させ、前記試料中に含まれる抗原と前記一次抗体との一次複合体を表面弾性波素子の表面上に形成させる第１反応工程と、
第１反応工程の後、緩衝液を表面弾性波素子の表面に供給する第１供給工程と、
第１供給工程の後、表面弾性波素子の表面状態に基づく第１信号値を測定する第１測定工程と、
第１測定工程の後、前記抗原に対する標識化二次抗体を表面弾性波素子の表面に供給し、前記一次複合体と前記標識化二次抗体との二次複合体を表面弾性波素子の表面上に形成させる第２反応工程と、
第２反応工程の後、表面弾性波素子の表面状態に基づく第２信号値を測定する第２測定工程と、
第１測定工程で測定された第１信号値と第２測定工程で測定された第２信号値から検出値を得る第１検出工程と、を備える検出方法であってもよい。

（第２実施形態）
図２は、本発明の第２実施形態の検出方法を示すフローチャートである。
本発明の第２実施形態に係る検出方法は、試料中に含まれる検出対象物の検出方法であって、
検出体の表面に結合しており、検出対象物と反応する一次物質を準備する準備工程Ｂ１と、
試料を検出体の表面に供給し、検出対象物と一次物質との反応によって一次反応物を検出体の表面上に形成させる第１反応工程Ｂ２と、
第１反応工程Ｂ２の後、第１液体を検出体の表面に供給する第１供給工程Ｂ３と、
第１供給工程Ｂ３の後、検出体の表面状態に基づく信号値を測定する第１測定工程Ｂ４と、
第１測定工程Ｂ４の後、一次反応物と反応する二次物質を検出体の表面に供給し、一次反応物と二次物質との反応によって二次反応物を検出体の表面上に形成させる第２反応工程Ｂ５と、
第２反応工程Ｂ５の後、二次反応物と反応する三次物質を検出体の表面に供給し、二次反応物と三次物質との反応によって三次反応物を検出体の表面上に形成させる第３反応工程Ｂ６と、
第３反応工程Ｂ６の後、検出体の表面状態に基づく信号値を測定する第３測定工程Ｂ７と、
第１測定工程Ｂ４で測定された信号値を第３測定工程Ｂ７で測定された信号値から減算して検出値を得る第２検出工程Ｂ８と、を備える。

本実施形態において、第１反応工程Ｂ２、第１供給工程Ｂ３、および第１測定工程Ｂ４は、それぞれ第１実施形態と同様であるので説明は省略する。

第２反応工程Ｂ５は、第１反応工程Ｂ２の検出体と、この検出体に二次物質を供給するための供給路、ポンプなどによって実施されるが、構成は限定されない。
第３反応工程Ｂ６は、第２反応工程Ｂ５の検出体と、この検出体に三次物質を供給するための供給路、ポンプなどによって実施されるが、構成は限定されない。
第３測定工程Ｂ７は、検出体に信号を入力し、検出体から出力される信号に基づいて予め定める信号値を取得する素子を含む装置などによって実施されてもよいが、構成は限定されず、第１測定工程Ｂ４と同様に実施されてもよい。
第２検出工程Ｂ８は、第１測定工程Ｂ４で測定された信号値と第３測定工程Ｂ７で測定された信号値とから検出値を得る演算素子を含む演算装置などで実施されてもよいが、構成は限定されない。

本実施形態では、追加反応工程の一態様として第２反応工程Ｂ５が実施され、第２反応工程Ｂ５の後、信号増幅工程の一態様として第３反応工程Ｂ６が実施される。第３反応工程Ｂ６においては、二次反応物と反応する三次物質が検出体の表面に供給され、二次反応物と三次物質との反応によって三次反応物が検出体の表面上に形成される。これによれば、三次物質を用いることによって、二次物質に由来する信号値を増幅することができるので、試料中に含まれる検出対象物をより高感度に検出することができる。

本明細書において、「三次物質」とは、二次物質に特異的に反応する物質であれば特に限定されるものでないが、たとえば、二次物質がビオチンで標識化された標識二次抗体である場合には、標識に特異的に反応するストレプトアビジンなどの標識検出試薬を含む。

ここで、上述の例のように、試料に、検出対象物とは異なる物質からなる夾雑物をさらに含む場合においては、第１供給工程Ｂ３において第１液体を検出体の表面に供給することによって検出体の表面から夾雑物を完全に除去することができない場合には、第１測定工程Ｂ４で測定された信号値は、検出体の表面に残存している夾雑物に影響を受ける。そこで、検出体の表面に残存している夾雑物による影響を低減するために、第１測定工程Ｂ４で測定された信号値と第３測定工程Ｂ７で測定された信号値から検出値を得ることで、検出体の表面に残存している夾雑物に由来する信号値を、第３測定工程Ｂ７で測定された信号値から低減することができる。なぜなら、第１測定工程Ｂ４で測定された信号値と第３測定工程Ｂ７で測定された信号値との差は、検出体の表面に残存する夾雑物の量に影響を実質的に受けないからである。

また、複数の試料について各試料中の検出対象物を検出する場合においては、複数の試料の間で粘度や密度が異なるときは、第１供給工程Ｂ３において第１液体を検出体の表面に供給しても、検出対象物とは異なる夾雑物を検出体の表面から完全に除去することができず、各試料において検出体の表面に異なる量の夾雑物が残存し、各試料の間で信号値に差が生じることがある。しかしながら、表面に残存している夾雑物は、第１測定工程Ｂ４で測定された信号値と第３測定工程Ｂ７で測定された信号値との差には実質的に影響を与えないので、第１測定工程Ｂ４で測定された信号値と第３測定工程Ｂ７で測定された信号値とから検出値を得ることによって、各試料間における夾雑物の残渣の影響を低減することができる。

このように、各試料間における夾雑物の残渣の影響を低減することにより、試料中に含まれる検出対象物をより正確に検出することが可能となる。

なお、本実施形態において、二次物質がビオチンで標識されており、三次物質がストレプトアビジンを含むようにすることができる。これによって、二次物質に由来する信号値を増幅することができるので、検出対象物をより高感度に検出することができる。

なお、本実施形態において、第２反応工程Ｂ５と第３反応工程Ｂ６との間に、第２液体を検出体の表面に供給する第２供給工程をさらに備えるようにしてもよい。これによって、第２反応工程Ｂ５において一次反応物に反応しなかった二次物質を除去することができるので、一次反応物に反応しなかった二次物質の影響を第３反応工程Ｂ６以降の工程から除くことができ、第３測定工程Ｂ７で測定される信号値の正確性を向上することができる。

また、本実施形態において、第２反応工程Ｂ５と第２供給工程との間に、検出体の表面状態に基づく信号値を測定する中間測定工程をさらに備えるようにしてもよい。これによって、第２反応工程Ｂ５において一次反応物に反応しなかった二次物質を除去することができるので、一次反応物に反応しなかった二次物質の影響を除くことができ、中間測定工程で測定される信号値の正確性を向上することができる。

なお、本実施形態において、中間測定工程で測定された信号値と第３測定工程Ｂ７で測定された信号値とから検出値を得る第３検出工程をさらに備えるようにしてもよい。これによって、第３反応工程Ｂ６によって生じた信号値を測定することができる。

また、本実施形態において、第３反応工程Ｂ６と第３測定工程Ｂ７との間に、第３液体を検出体の表面に供給する第３供給工程をさらに備えるようにしてもよい。これによって、第３反応工程Ｂ６において二次反応物に反応しなかった三次物質を除去することができるので、二次反応物に反応しなかった三次物質の影響を第３測定工程Ｂ７で測定される信号値から除去することができ、第３測定工程Ｂ７で測定される信号値の正確性を向上することができる。

本明細書において、「第３液体」とは、たとえば、緩衝液などであってもよい。緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液などを含み、これらに限定されない。

なお、本実施形態において、第１液体と第２液体と第３液体とを同一種類の液体とすることができる。

追加反応工程の一態様として第２反応工程Ｂ５を実施し、信号増幅工程の一態様として第３反応工程Ｂ６を実施する一実施例として、検出対象物が抗原であり、検出体として表面弾性波素子を用い、一次物質として一次抗体を用い、第１液体として緩衝液を用い、二次物質として標識化二次抗体を用い、三次物質として標識検出試薬を用いた例を以下に示す。
すなわち、第３実施形態の一実施例は、試料中に含まれる抗原の検出方法であって、
表面弾性波素子の表面に結合しており、抗原に対する一次抗体を準備する準備工程と、
試料を表面弾性波素子の表面に供給し、前記抗原に対する一次抗体に反応させ、前記試料中に含まれる抗原と前記一次抗体との一次複合体を表面弾性波素子の表面上に形成させる第１反応工程と、
第１反応工程の後、緩衝液を表面弾性波素子の表面に供給する第１供給工程と、
第１供給工程の後、表面弾性波素子の表面状態に基づく信号値を測定する第１測定工程と、
第１測定工程の後、前記抗原に対する標識化二次抗体を表面弾性波素子の表面に供給し、前記一次複合体と前記標識化二次抗体との二次複合体を表面弾性波素子の表面上に形成させる第２反応工程と、
第２反応工程の後、前記標識化二次抗体に対する標識検出試薬を表面弾性波素子の表面に供給し、前記二次複合体と前記標識検出試薬との三次複合体を形成させる第３反応工程と、
第３反応工程の後、表面弾性波素子の表面状態に基づく信号値を測定する第３測定工程と、
第１測定工程で測定された信号値を第３測定工程で測定された信号値から検出値を得る第２検出工程と、を備える検出方法であってもよい。

＜検出装置＞
次に検出装置１００の一例を示す。図３は、検出装置の一例を示すブロック図である。検出装置１００は、各種の液体を供給する供給部１０と信号増幅のための反応だけでなく、前駆反応および追加反応も行う反応部２０とを備えるバイオセンサ装置に、信号値を測定するための測定部３０と、演算のための演算装置である検出部４０と、検出結果を表示するためのディスプレイである表示部５０とを接続して構成される。
本実施形態の検出装置１００においては、前述の第１供給工程、第２供給工程などの各供給工程は、１つの供給部１０を繰り返し使用することで実施される。同じく前述の第１反応工程、第２反応工程などの各反応工程は、も、１つの反応部２０を繰り返し使用することで実施され、前述の各測定工程は、１つの測定部３０を繰り返し使用し、前述の各検出工程は、１つの検出部４０を繰り返し使用することでそれぞれ実施される。表示部５０は、本実施形態では、必須構成ではなく、検出部４０から外部に検出結果を出力できるように構成していればよい。また、測定部３０と検出部４０との間、検出部４０と表示部５０との間などの、電気的な接続については、信号ケーブルなどを用いた有線接続であってもよく、アンテナなどを用いた無線接続であってもよい。

図４は、バイオセンサ装置２００の斜視図であり、図５は、バイオセンサ装置２００の分解斜視図であり、図６は、検出素子３の平面図である。

バイオセンサ装置２００は、基板１、流路構成体２および検出素子３からなる。流路構成体２は、図４に示すように検出素子３および支持部材４を介して基板１の上に配置されている。流路構成体２は、長手方向の一方の端部側に液体状の試料の入口である流入口１４を有し、流入口１４と連通する流路が内部に形成されている。基板１は平板状であり、例えば、樹脂基板、セラミックス基板などであり、表層または内層に配線導体などを設けている。

基板１の上面の一方の端部側には検出素子３が実装されている。検出素子３の両側には、検出素子３に電気的に接続された端子６が設けられている。端子６には、装置、演算装置などが接続される。

検出素子３は、弾性表面波素子であり、圧電基板７、第１ＩＤＴ（Inter Digital Transducer）電極８、第２ＩＤＴ電極９および検出部１３からなる。圧電基板７は、タンタル酸リチウムなどの圧電性を有する単結晶の基板からなる。第１ＩＤＴ電極８は、一対の櫛歯電極を有する。各櫛歯電極は互いに対向する２本のバスバーおよび各バスバーから他のバスバー側へ延びる複数の電極指を有する。一対の櫛歯電極は、複数の電極指が互いに噛み合うように配置されている。第２ＩＤＴ電極９も第１ＩＤＴ電極８と同様に構成されている。第１ＩＤＴ電極８および第２ＩＤＴ電極９は、トランスバーサル型のＩＤＴ電極を構成している。

第１ＩＤＴ電極８は、所定の弾性表面波を発生させるためのものであり、第２ＩＤＴ電極９は、第１ＩＤＴ電極８で発生したＳＡＷを受信するためのものである。第１ＩＤＴ電極８および第２ＩＤＴ電極９は、例えばアルミニウム、アルミニウムと銅との合金などからなる。

検出部１３は、第１ＩＤＴ電極８と第２ＩＤＴ電極９との間に設けられている。検出部１３は、例えばクロムおよびクロム上に成膜された金の２層構造となっている。検出部１３の金属膜の表面には、検出対象物と反応する一次物質が結合されている。試料が検出部に供給されると、試料中の検出対象物が一次物質と反応して一次反応物が形成される。

第１ＩＤＴ電極８と第２ＩＤＴ電極９と検出部１３を１組とすると、検出素子３には、２組設けられている。たとえば、一方の検出部１３では、試料を測定し、他方の検出部１３では、リファレンス値を測定することができる。たとえば、他方の検出部１３は、検出対象物と反応する一次物質が結合されていない。

このようなＳＡＷを利用した検出素子３では、まず、第１ＩＤＴ電極８に外部から所定電圧の信号を印加する。第１ＩＤＴ電極８において、圧電基板７の表面が励振され、所定の周波数のＳＡＷが発生する。発生したＳＡＷの一部が検出部１３に向かって伝搬し、検出部１３を通過して第２ＩＤＴ電極９によって受信される。検出部１３では、検出対象物の量に応じて一次反応物が形成され、一次反応物の分だけ検出部１３の質量が増加する。質量の増加に伴い検出部１３を通過するＳＡＷの位相が変化すると、変化に応じた電圧が第２ＩＤＴ電極９に生じる。第１ＩＤＴ電極８に印加された信号の位相と、第２ＩＤＴ電極９から出力される信号の位相との違いを位相変化として測定する。

基板１の上面には、さらに支持部材４が搭載され、支持部材４は、流路構成体２を支持している。流路構成体２は、検出素子３の少なくとも一部を覆うようにして配置される。流路構成体２は、たとえば、第１接着層１９、第１親水性シート２２、第２接着層２３および第２親水性シート２４から構成される。

第１接着層１９は、貫通孔１９ｈを有する枠体であり、検出素子３の一部が貫通孔１９ｈによって露出している。第１接着層１９の上には第１親水性シート２２が積層される。第１親水性シート２２は、貫通孔１９ｈと同様の貫通孔２２ｈを有しており、貫通孔同士が連通するように第１接着層１９と第１親水性シート２２とが積層される。第１親水性シート２２の上には第２接着層２３が積層される。第２接着層２３には、流路を構成する長手方向に延びる貫通孔２３ｈを有する。貫通孔２３ｈの一方端部は、貫通孔２２ｈと重なる位置にまで延びている。第２接着層２３の上には第２親水性シート２４が積層される。第２親水性シート２４の両端部寄りには、貫通孔からなる流入口１４および排気口１８が設けられている。流入口１４および排気口１８は、貫通孔２３ｈと重なる位置に形成されている。

図７に示した模式図は、ビオチン標識二次抗体、およびアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを前駆反応物質として用いて前駆反応工程を行い、信号増幅物質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムを用いて信号増幅工程を行い、ＳＡＷ素子において信号値を取得した信号値の一例である。

図７に示した模式図において実施された工程を以下に述べる。まず、第１反応工程、および第１供給工程を行い、一次反応物を形成した。次に、第１前駆反応工程を行い、ビオチン標識二次抗体を一次反応物に反応させた。第１前駆反応工程の後、１０ｍＭ ＰＢＳ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１３７ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ， ２．７ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）, ｐＨ７．４）を供給する第２供給工程を行い、遊離のビオチン標識二次抗体を除去した。第２供給工程の後、第２前駆反応工程を行い、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させた。第２前駆反応工程の後、１０ｍＭ ＰＢＳ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１３７ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ， ２．７ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）, ｐＨ７．４）を供給する第３供給工程を行い、遊離のアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを取り除いた。第３供給工程の後、第１測定工程を行い、第１信号値を取得した。第１測定工程の後、信号増幅工程を行い、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムを反応させた。信号増幅工程の後、第２測定工程を行い、第２信号値を取得した。最後に、第１信号値を第２信号値から減算して検出値を得た。

以下、上述した実施形態に係る検出方法の実施例について説明する。
本実施例では、生体試料を用い、生体試料に含まれる検出対象物を検出した。

生体試料として、異なる２種類の試料にそれぞれ同量の抗原を含むもの（生体試料Ａ，Ｂ）を用意した。すなわち、生体試料Ａと生体試料Ｂとでは、粘度や含まれる物質が異なるが、抗原は同量含まれている。

検出体は、弾性表面波素子（ＳＡＷ素子）を用い、ＳＡＷ素子の表面に予め一次物質である抗体（以下、単に「抗体」という。）を結合させたものを用意した。ここで、抗体は、検出対象物に結合する物質である。

実施例１として、まず、第１反応工程として、生体試料をＳＡＷ素子の表面に供給し、検出対象物である抗原（以下、単に「抗原」という。）と抗体とが反応してなる一次反応物を形成した。

次に、第１供給工程で、第１液体としての緩衝液１０ｍＭ ＰＢＳ
（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，
１３７ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，
２．７ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，
１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）, ｐＨ７．４）を、ＳＡＷ素子の表面に供給した。

次に、第１測定工程で、ＳＡＷ素子において、入力信号と出力信号との位相変化を信号値として取得した。

次に、信号増幅工程では、信号増幅用物質としてビオチン修飾二次抗体をＳＡＷ素子の表面に供給し、一次反応物とビオチン修飾二次抗体とが反応してなる一次反応物とビオチン修飾二次抗体との複合体を形成した。

次に、第２測定工程で、ＳＡＷ素子において、入力信号と出力信号との位相変化を信号値として取得した。

次に、第１検出工程では、第１測定工程で測定された第１信号値を、第２測定工程で測定された第２信号値から減算して検出値を得た。

以上のようにして得られた、各生体試料についての信号値を、図８のようにグラフとして示している。

図８に示すように、実施例１では、それぞれ同量の抗原を含む生体試料Ａの検出値と生体試料Ｂの検出値とが同等であった。

このことから、本発明の実施形態に係る検出方法によれば、生体試料間の差異による影響が低減され、それぞれの生体試料に含まれる検出対象物（抗原）を正確に検出することが可能であることが分かった。

一方、比較例として、上述のような第１測定工程を実施することなく、第２測定工程で測定された位相変化の値を検出値として取得した。

このような比較例では、それぞれ同量の抗原を含む生体試料Ａの検出値と生体試料Ｂの検出値とが異なっており、生体試料間の差異の影響によってそれぞれの生体試料に含まれる検出対象物（抗原）を正確に検出することができないことが分かった（図８参照）。

なお、実施例２として、生体試料を用いず、実施例１と同量の抗原を、緩衝液
１０ｍＭ ＰＢＳ（１０ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，
１３７ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，
２．７ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，
１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）, ｐＨ７．４）を用いて希釈した得られたものを試料として使用し、実施例１と同様の方法にて得られた検出値は実施例１と同等であった。
このことからも、実施例１において、生体試料に含まれる検出対象物（抗原）を正確に検出できることが証明された。

本発明は、上記の実施例に限定されず、検出対象物が異なる種類の抗原であっても、同様の効果を奏する。

以上、本発明は、上述の各実施形態および各変形例などに示した構成だけに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で改良や変更ができることは言うまでもない。

１ 基板
２ 流路構成体
３ 検出素子
４ 支持部材
６ 端子
７ 圧電基板
８ 第１ＩＤＴ電極
９ 第２ＩＤＴ電極
１０ 供給部
１３ 検出部
１４ 流入口
２０ 反応部
３０ 測定部
４０ 検出部
５０ 表示部
１００ 検出装置
２００ バイオセンサ装置

Claims (14)

1. 試料中に含まれる検出対象物の検出方法であって、
   検出体の表面に結合しており、前記検出対象物と反応する一次物質を準備する準備工程と、
   試料を前記検出体の表面に供給し、前記検出対象物と前記一次物質との反応によって一次反応物を前記検出体の表面上に形成させる第１反応工程と、
   前記第１反応工程の後、第１液体を前記検出体の表面に供給する第１供給工程と、
   前記第１供給工程の後、前記検出体の表面状態に基づく第１信号値を測定する第１測定工程と、
   前記第１測定工程の後、信号増幅用物質を前記検出体の表面に供給し、前記第１反応工程で形成された前記一次反応物が関与する反応によって前記検出体の表面状態を変化させる信号増幅工程と、
   前記信号増幅工程の後、前記検出体の表面状態に基づく第２信号値を測定する第２測定工程と、
   前記第１信号値と前記第２信号値とから検出値を得る第１検出工程と、を備え、
   前記検出体の表面に表面弾性波素子が形成されており、
   前記検出体の表面状態に基づく信号値は、前記表面弾性波素子の位相特性の値である、検出方法。
2. 前記信号増幅工程と前記第２測定工程との間に、第２液体を前記検出体の表面に供給する第２供給工程をさらに備える、請求項１に記載の検出方法。
3. 前記第１測定工程と前記信号増幅工程との間に、少なくとも１種の追加反応物質を前記検出体の表面に供給する追加反応工程をさらに備える、請求項１または２に記載の検出方法。
4. 前記少なくとも１種の追加反応物質は複数種の追加反応物質を有し、前記追加反応物質を１種ずつ供給する、請求項３に記載の検出方法。
5. 前記第１反応工程と前記第１供給工程との間に、少なくとも１種の前駆反応物質を前記検出体の表面に供給する前駆反応工程をさらに備える、請求項１または２に記載の検出方法。
6. 前記少なくとも１種の前駆反応物質は複数種の前駆反応物質を有し、前記前駆反応物質を１種ずつ供給する、請求項５に記載の検出方法。
7. 前記試料は、前記検出対象物とは異なる夾雑物をさらに含み、
   前記第１反応工程において前記検出体の表面に前記夾雑物を付着させ、前記第１供給工程の後に前記夾雑物は前記検出体の表面に残存している、請求項１〜６のいずれかに記載の検出方法。
8. 前記試料は、生体試料である、請求項１〜７のいずれかに記載の検出方法。
9. 前記第１反応工程において、前記検出対象物と前記一次物質とを結合させて前記一次反応物を形成する、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
10. 前記第１反応工程において、前記検出対象物と前記一次物質の一部とを結合させるとともに前記一次物質から前記一部を解離させることによって、前記一次反応物を形成する、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
11. 前記第２信号値は、前記第１信号値よりも大きい、請求項１〜１０のいずれかに記載の検出方法。
12. 前記第１液体は、緩衝液である、請求項１〜１１のいずれかに記載の検出方法。
13. 前記第１液体と前記第２液体とは同一である、請求項２に記載の検出方法。
14. 試料中に含まれる検出対象物を検出するための装置であって、
    試料を、検出体の表面に結合され前記検出対象物と反応する一次物質に供給し、前記検出対象物と前記一次物質との反応によって一次反応物を前記検出体の表面上に形成させる第１反応部と、
    第１液体を前記検出体の表面に供給する第１供給部と、
    前記第１供給部によって前記第１液体が前記検出体の表面に供給された後、前記検出体の表面状態に基づく第１信号値を測定する第１測定部と、
    信号増幅用物質を前記検出体の表面に供給し、前記一次反応物が関与する反応によって前記検出体の表面状態を変化させる信号増幅部と、
    前記信号増幅用物質が供給された前記検出体の表面状態に基づく第２信号値を測定する第２測定部と、
    前記第１信号値と前記第２信号値とから検出値を得る第１検出部と、
    前記第１検出部で得られた検出値を表示する表示部と、を備え、
    前記検出体の表面に表面弾性波素子が形成されており、
    前記検出体の表面状態に基づく信号値は、前記表面弾性波素子の位相特性の値である、装置。

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