JP6566869B2 - 短時間作用性第ｖｉｉ因子ポリペプチド - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、これによりその全体が参照により組み込まれる、２０１２年１２月２４日出願の米国特許出願第６１／７４５６７４号および２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第６１／７８７０２６号の優先権を主張するものである。
ヒト凝固第ＶＩＩ因子変異体およびこのような変異体をコードするポリヌクレオチド、このような変異体を含みかつ発現するベクターおよび宿主細胞、このような変異体を得る方法、このような変異体を使用する方法、変異体の組成物、ならびにこれらに関連する追加の発明の特徴が本明細書で提供される。

血液凝固は、最終的にフィブリン凝塊をもたらす種々の血液成分（または因子）の複雑な相互作用からなる過程である。一般的に、凝固「カスケード」と呼ばれているものに参加する血液成分は、活性化因子（それ自体活性化凝固因子である）の作用によってタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質（酵素前駆体または酵素原）である。このような変換を受けた凝固因子は、一般的に「活性因子」と呼ばれ、凝固因子の名称に文字「ａ」を付加することによって示される（例えば、第ＶＩＩａ因子）。

止血過程の開始は、血管壁への損傷後の循環血に暴露した組織因子と、全第ＶＩＩ因子タンパク質質量の約１％に相当する量で循環中に存在する第ＶＩＩａ因子との間の複合体の形成によって媒介される。この複合体は、組織因子保有細胞に固定され、細胞表面で第ＩＸ因子および第Ｘ因子をその活性型である第ＩＸａ因子および第Ｘａ因子に変換する。第Ｘａ因子は、組織因子保有細胞上でプロトロンビンをトロンビンに変換し、トロンビンが第ＶＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩ因子および第ＸＩＩＩ因子を活性化する。さらに、止血のこの初期ステップで形成される限られた量のトロンビンは血小板も活性化する。血小板に対するトロンビンの作用の後、血小板は形状を変化させ、帯電リン脂質をその表面上に露出する。この活性化血小板表面が、さらなる第Ｘ因子活性化および完全なトロンビン産生のための鋳型を形成する。活性化血小板表面上でのさらなる第Ｘ因子活性化が、活性化血小板の表面上に形成した第ＩＸａ因子および第ＶＩＩＩａ因子複合体を介して起こり、次いで、第Ｘａ因子がまだ表面上にありながら、プロトロンビンをトロンビンに変換する。次いで、トロンビンがフィリブリノーゲンをフィブリンに変換し、フィブリンは不溶性であり、初期血小板血栓を安定化する。この過程は組織因子露出部位に局在し、それによって、凝固系の全身活性化のリスクを最小化する。近年、第ＶＩＩ因子および組織因子が血液凝固の主な開始因子であることが分かった。

第ＶＩＩａ因子はその前駆体である第ＶＩＩ因子から産生され、第ＶＩＩ因子は肝臓で合成されて、血液中に分泌され、ここで単鎖糖タンパク質（分子量約５００００Ｄａ）として循環する。本明細書で使用される野生型第ＶＩＩ因子は、図１および図２に開示されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を有する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、その未切断型（酵素原型）の第ＶＩＩ因子ポリペプチドならびに第ＶＩＩａ因子と呼ばれ得るそれぞれの生理活性型を産するようタンパク質分解的にまたは別の方法で処理されたものを包含するものとする。野生型第ＶＩＩ因子は、典型的には残基１５２と残基１５３との間で切断されて第ＶＩＩａ因子を産生する。

第ＶＩＩ因子はインビトロで第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子またはトロンビンによって二本鎖型の第ＶＩＩａ因子に変換される。止血に関与するいくつかの他の血漿タンパク質のように、第ＶＩＩ因子は、タンパク質のアミノ末端の近くにクラスター化する複数のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化に必要とされるその活性についてビタミンＫに依存する。これらのγ−カルボキシル化グルタミン酸は、金属イオンによって誘導される第ＶＩＩ因子とリン脂質の相互作用に必要とされる。組織因子、リン脂質およびカルシウムイオンの存在下で、二本鎖第ＶＩＩａ因子は限られたタンパク質分解によって第Ｘ因子または第ＩＸ因子を迅速に活性化する。第ＶＩＩａ因子はタンパク質分解切断を受けやすく、凝固活性を有さないいくつかの分解産物をもたらす。

１個または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入による野生型第ＶＩＩ因子由来のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子変異体が公開されている。例えば、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３、１４３７９〜１４３８４）は、Ｌｙｓ１５７、Ｖａｌ１５８、Ｇｌｕ２９６、Ｍｅｔ２９８、Ａｓｐ３３４、Ｓｅｒ３３６またはＬｙｓ２２７が個々にＡｌａによって置き換えられた第ＶＩＩ因子変異体に関する。Ｉｗａｎａｇａら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９９年８月補遺）、４６６、要約１４７４）は、残基３１６〜３２０が欠失しているまたは残基３１１〜３２２がトリプシンから対応する残基で置き換えられている第ＶＩＩａ因子変異体に関する。Ｂｏｌｔらの米国特許出願公開第２００８／００５８２５５号明細書は、Ｎ１４５もしくはＮ３２２のいずれか、またはＮ１４５とＮ３２２の両方にグリコシル化を破壊する置換を有する第ＶＩＩ因子変異体に関する。Ｔｏｓｏらは、天然の変異に基づく一連の第ＶＩＩ因子の構造−機能研究を報告した。変異型組換え第ＶＩＩ因子タンパク質はＴ３２４Ｍ、Ｅ３８５Ｋ、および第ＶＩＩ因子重鎖（Ｎ３２２Ｑ）または第ＶＩＩ因子軽鎖（Ｎ１４５Ｑ）のいずれかにおいてグリコシル化コア配列を欠く２つの変異型第ＶＩＩ因子タンパク質を含んでいた。Ｔｏｓｏら、「Ｌａｃｋ ｏｆ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｎｏｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｍｕｔａｎｔ ＦＶＩＩａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｂｌｏｏｄ、第９６巻、第１１号、第２部（２０００年１１月１６日）、７９ｂ頁（第４２回米国血液学会）。

ほとんどの天然ペプチドおよびタンパク質は、主要なペプチドまたはタンパク質鎖の長さに沿った選ばれた数のアミノ酸への特異的な結合を介してペプチドまたはタンパク質に結合した炭水化物部分を含有している。したがって、多くの天然ペプチドおよびタンパク質をそれぞれ「糖ペプチド」または「糖タンパク質」と呼ぶ。任意の所与のペプチドまたはタンパク質上のグリコシル化パターンの変異性が、そのペプチドまたはタンパク質の機能に影響を及ぼし得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質上のＮ結合型グリカンの構造が、細胞または生物中のペプチドまたはタンパク質のプロテアーゼ感受性、細胞内輸送、分泌、組織標的化、生物学的半減期および抗原性を含む、ペプチドまたはタンパク質の種々の特性に影響を及ぼし得る。これらの特性の１つまたは複数の変化は、その自然環境でのペプチドまたはタンパク質の有効性に影響を及ぼし、またペプチドまたはタンパク質がその目的のために産生された状況において治療剤としてのペプチドまたはタンパク質の有効性に影響を及ぼし得る。

ペプチドまたはタンパク質鎖に結合した炭水化物構造は「グリカン」分子として知られている。ペプチドまたはタンパク質上に存在する特異的なグリカン構造は、ペプチドまたはタンパク質の溶解度および凝集特性、主要ペプチドまたはタンパク質鎖の折り畳み、それゆえ、その機能または酵素活性、タンパク質分解攻撃に対するペプチドまたはタンパク質の抵抗性、およびペプチドまたはタンパク質の不活性型の活性型への変換をもたらすタンパク質分解の制御に影響を及ぼす。例えば、グリカン分子上に存在する末端シアル酸残基は、哺乳動物循環系中のペプチドまたはタンパク質の半減期の長さに影響を及ぼす。そのグリカンが末端シアル酸残基を含有しないペプチドおよびタンパク質は、一般的に肝臓によって循環からより迅速に除去される。

天然糖ペプチドおよび糖タンパク質に見られるグリカン構造は、典型的にはＮ結合型およびＯ結合型グリカンの２つのクラスに分けられる。野生型第ＶＩＩａ因子は、２つのＮ結合型および２つのＯ結合型グリコシル化部位を含有する。Ｎ結合型グリコシル化が真核生物において最も一般的な共有結合修飾である。Ｎ結合型グリコシル化はコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒで起こり、グリカンがアスパラギンのアミノ基に結合し、Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸を表す。Ｎ結合型グリカンは共通のコア五糖Ｍａｎ_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２に基づき、これはＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、フルクトース、マンノースおよびフコースなどの単糖の付加によってさらに修飾され得る。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭａｎ_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２は、Ｎ−アセチルグルコサミンを介してＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列中のＡｓｎに結合され得る。この化学的に複雑な同時翻訳修飾が多くの目的に叶い、適切な折り畳み、官能基配向およびクリアランス速度を含む様々な方法でタンパク質の生物学に影響を及ぼす。

ＤｅＦｒｅｅｓらの米国特許第８００８２５２号明細書に記載されているものを含む、ペプチドまたはタンパク質のグリコシル化パターンをカスタマイズするための種々の方法が当技術分野で提案されてきた。

対象の凝固カスケードを刺激または改善することが通常は望ましい。凝固因子欠乏（例えば、血友病ＡおよびＢ、または凝固第ＸＩ因子もしくは第ＶＩＩ因子の欠乏）または凝固因子阻害因子によって引き起こされる出血性障害を制御するために第ＶＩＩａ因子が使用されてきた。商品名ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）でＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋによって製造および販売されている組換え第ＶＩＩａ因子が、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子による血友病ＡまたはＢ患者、および後天性血友病の患者の出血性エピソードの治療；第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する阻害因子による血友病ＡまたはＢ患者、および後天性血友病の患者の外科的介入または侵襲的手技における出血の予防；先天性第ＶＩＩ因子欠乏症の患者における出血性エピソードの治療、ならびに先天性第ＶＩＩ因子欠乏症の患者の外科的介入または侵襲的手技における出血の予防のために承認されている。Ｈｅｄｎｅｒの米国特許第５１８０５８３号明細書は、凝固因子欠損または凝固因子阻害因子によって引き起こされていない状況における過度の出血を制御するために第ＶＩＩａ因子を用いることを開示している。Ｈｅｄｎｅｒは、例えば、欠陥のある血小板機能、血小板減少またはフォンウィルブランド病によって引き起こされる出血性障害を治療すること、およびこれらの用途のための組成物を開示している。

先天性もしくは後天性凝固因子欠乏または凝固因子に対する阻害因子によって引き起こされていない障害からの出血を治療する必要性がある。いくつかの臨床試験によって、組換え第ＶＩＩａ因子が出血を制御する有効性が証明された。しかしながら、この分子の使用から生じる望ましくない血栓塞栓性イベントの増加が懸念される。出血は、例えば、手術、手術、茎および臓器移植後の合併症、頭蓋内出血、大動脈瘤、および外傷、または過量の特定の抗凝固薬と関連する多くの障害における主要な課題である。

米国特許出願公開第２００８／００５８２５５号明細書 米国特許第８００８２５２号明細書 米国特許第５１８０５８３号明細書

Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９６）９３、１４３７９〜１４３８４） Ｉｗａｎａｇａら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９９年８月補遺）、４６６、要約１４７４） Ｔｏｓｏら、「Ｌａｃｋ ｏｆ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｎｏｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｍｕｔａｎｔ ＦＶＩＩａ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｂｌｏｏｄ、第９６巻、第１１号、第２部（２０００年１１月１６日）、７９ｂ頁（第４２回米国血液学会）

短時間作用性の第ＶＩＩ因子ポリペプチドにより出血性障害およびエピソードを治療することが目的である。本研究の１つの目的は、短縮された半減期などの１つまたは複数の薬物動態学的形質によって特徴付けられる、短時間作用性の第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）の組成物を提供することである。標的部位および治療時間枠外での血栓性イベントの機会が減少したこのような第ＶＩＩ因子分子を提供することが目的である。変化したグリコシル化パターンによりクリアランスが増強した第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）を提供することが目的である。

本明細書では、配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であり；かつ組成物中の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が０．０５未満、０．１未満、１．０未満、２．０未満、３．０未満、４．０未満、５．０未満または６．０未満である変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物が記載される。本明細書では、配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であり；かつＮ結合型グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモルの比が（１）０〜５；（２）０〜４；（３）０〜３；（４）０〜２；（５）０〜１および（６）０〜０．５からなる群から選択される範囲内にある変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も記載される。

本明細書では、配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基であり、ポリペプチドが０．０５未満、０．１未満、１．０未満、２．０未満、３．０未満、４．０未満、５．０未満または６．０未満の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比を有する単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も記載される。本明細書では、配列番号１６（野生型第ＶＩＩ因子）のアミノ酸配列を含み、かつ組成物中の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が（１）１〜５；（２）１〜４；（３）１〜３；（４）１〜２；および（５）０．５〜１からなる群から選択される範囲内にある；または抱合型シアル酸が検出不可能である第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も記載される。

本明細書では、
（１）配列番号１６の配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）１４５位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（２）配列番号１６の配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（３）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）１４５位および３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（４）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基からなり、１４５位および３２２位がアスパラギンであり、かつ結合したＮ結合型グリコシル化を有するポリペプチド；
（５）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（５）１４５位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（６）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（５）３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；
（７）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（５）１４５位および３２２位のＮ結合型グリコシル化が破壊されるような配列変化からなるポリペプチド；および
（８）配列番号１６のアミノ酸配列に関して配列変化を有する第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（４）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基からなり、１４５位および３２２位がアスパラギンであり、かつ結合したＮ結合型グリコシル化を有するポリペプチド
からなる群から選択される単離変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドも記載される。

本明細書では、シアル酸と第ＶＩＩ因子ポリペプチドの抱合が減少した第ＶＩＩ因子ポリペプチドも記載される。特定の例では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが変化したグリコシル化パターンをもたらす変異形ポリペプチドである。他の例では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドがシアル酸の抱合が減少した野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。特定の実施形態では、減少したシリカ酸抱合が、シアリダーゼ酵素によるポリペプチドの処理によって果たされ得る。他の実施形態では、減少したシアル酸抱合が、ペプチドのシアリル化が部分的または完全に欠乏した細胞系で組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドを産生することによって果たされ得る。さらなる実施形態では、減少したシアル酸結合が、細胞系で組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドと、組換えまたは外因性シアリダーゼ酵素を同時発現することによって果たされ得る。

血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療する方法であって、有効量のシアル酸抱合が減少した第ＶＩＩ因子ポリペプチドをそれを必要とする哺乳動物に投与するステップを含む方法も記載される。特定の実施形態では、抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比が０．０５未満である。他の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが野生型第ＶＩＩ因子を含む。追加の実施形態では、治療されている疾患または障害が、出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される。

さらなる変異体、組成物、方法ならびに関連する産物およびプロセスを以下で詳細に開示する。

本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのヌクレオチド配列を示す図である。「Ｖ１」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して４個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。「Ｖ２」は配列番号１６の野生型ヒトアミノ酸配列に関して６個のアミノ酸変異：（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎ）を有するヒト第ＶＩＩ因子の変異体である。図１はまた、実施例で使用される種々の構築物についてのヌクレオチド配列も示している。 本出願で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子についてのアミノ酸配列を示す図である。本明細書で使用される野生型ヒト第ＶＩＩ因子は配列番号１６のアミノ酸配列を有する。Ｖ１は配列番号１７のアミノ酸配列を有する。Ｖ２は配列番号１８のアミノ酸配列を有する。Ｖ１およびＶ２において、配列番号１６の野生型第ＶＩＩ因子からの変化を太字で示す。 本出願の実施例で使用される３個の第ＶＩＩ因子分子を示す模式図である。Ｎ−グリコシル化部位におけるグリカンの結合を示している。グリカンを描写するために、実線の箱はＮ−アセチルグルコサミンを表し、斜線のついた楕円形はマンノースを表し、あいた楕円形はガラクトースを表し、濃い菱形はシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸としても知られている）を表し、閉じた三角形はフコースを表す。グリカン構造はグリカンの１つの可能な変異体を用いた描写であるが、実際に測定されるグリカンを表していない。 Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列中のＡｓｎにおける結合を示すＮ結合型グリカンを示す概略図である。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭａｎ_３（ＧｌｃＮＡｃ）_２コアを示している。 Ｖ２に関して例示される、第ＶＩＩ因子変異体の半減期を減少させるために本開示で使用される２つのアプローチを示す概略図である。 ヒポグリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）第ＶＩＩ因子分子の表である。 実験の条件による脱シアリル化後のＶ２の重鎖上に残っているシアル酸を同定するためのＬＣ−ＭＳ法の結果を示す図である。 シアル酸含量についての脱シアリル化Ｖ２の分析を示す図である。 リン脂質ＦＸ活性化アッセイの結果を示す図である。 脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイの結果を示す図である。 ヒポグリコシル化第ＶＩＩ因子変異体の発現を示す図である。 トランスフェクション上清を用いたヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の「特異的活性」の測定を示す表である。 精製したヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイの結果を示す図である。 野生型第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化Ｖ２のインビトロ肝細胞クリアランスを示す図である。 第ＶＩＩ因子変異体によるインビトロ肝細胞クリアランスの結果を示す図である。ヒポグリコシル化変異体は、このモデルでクリアランスの増加を示さなかった。この結果は、これらの分子についての脱シアリル化Ｖ２によって利用されるクリアランス機構とは異なるクリアランス機構を示唆している。 ラットにおける薬物動態試験結果を示す図である。脱シアリル化Ｖ２およびＶ１の半減期は、第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡによって測定されるようにスプラーグドーリーラットにおいてその未修飾親分子よりも有意に短かった。 ＨｅｍＡマウスにおける薬物動態試験結果を示す図である。 ＨｅｍＡマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。 ＴＶＴ ＨｅｍＡモデルにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。 第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化Ｖ２を有するＨｅｍＡマウスにおけるトロンビン−抗トロンビン（「ＴＡＴ」）産生の結果を示す図である。 凝固能力のあるマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験を示す図である。 シアル酸の正常な抱合を有する野生型第ＶＩＩ因子と比較した脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）のインビトロ肝細胞クリアランスを示す図である。 野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ ＶＩＩａについてのヒト組織因子ノックイン（ＴＦＫＩ）マウスの尾切断試験結果を示す図である。脱シアリル化第ＶＩＩ因子は、野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に効果的であることが分かった。 ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型第ＶＩＩ因子のいずれかの投与後のトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）複合体のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す図である。 ＦｅＣｌ_３血栓症モデルにおける血栓形成の分析の結果を示す図である。所与の用量のｄＷＴ ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して大いに減少した血栓形成をもたらした。 蛍光原基質によって測定される可溶性組織因子に対するｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子の見かけの結合親和性を示す図である。 可溶性組織因子と、ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型第ＶＩＩ因子のいずれかの複合体による第Ｘ因子の第Ｘａ因子への変換を示す図である。

急性出血の治療において血栓性合併症を制限するために組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）の薬物動態を調節する方法が本明細書で記載される。シアル酸抱合が減少した第ＶＩＩ因子ポリペプチドも記載される。血液からのクリアランスが増強し、有効性の持続期間が減少した組換え第ＶＩＩ因子の変異体がさらに記載される。このような変異体は、変化したグリコシル化パターンにより、組換え野生型第ＶＩＩ因子よりも短いインビボでの半減期を有する。このような短時間作用性第ＶＩＩ因子ポリペプチドを製造および使用する方法も記載される。

第ＶＩＩ因子およびグリコシル化を説明するために、図３および図４を提供する。図３は、そのドメインを有する第ＶＩＩ因子分子の３つの例を模式的に示している。第ＶＩＩ因子は、Ｇｌａ、ＥＧＦおよび触媒ドメインからなり、かつ２個のＮ結合型グリカン（Ｎ１４５およびＮ３２２）を含有するタンパク質である。Ｖ１は４個の変異（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｔ１０６Ｎ、Ｖ２５３Ｎ）を有する第ＶＩＩ因子変異体である。Ｖ２は６個の変異（Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４３、Ｒ３６Ｅ、Ｔ１０６Ｎ、Ｖ２５３Ｎ）を有する第ＶＩＩ因子変異体である。Ｖ１およびＶ２は共に活性化血小板に対する増加した親和性を有し、野生型第ＶＩＩ因子と比べて長い半減期をもたらすさらに２個のＮ−グリコシル化部位を含有する。Ｖ２にのみ見られる２個の突然変異（Ａ３４Ｅ、Ｒ３６Ｅ）は、その組織因子非依存性を説明すると考えられている。

図４は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列中のＡｓｎにおける結合を示すＮ結合型グリカンの例を模式的に示している。末端シアル酸を含む種々の単糖を有するＭａｎ_３（ＧｌｃＮａｃ）_２コアを示している。

所望の短い半減期を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを調製する方法が本明細書で提供される。短時間作用性第ＶＩＩ因子ポリペプチドを製造するための２つの一般的な方法が提供され、これらの方法を別々にまたは組み合わせて用いることができる。第ＶＩＩ因子変異体の一例を用いて図５に模式的に示されるように、グリコシル化第ＶＩＩ因子変異体を、脱シアリル化または脱グリコシル化によって処理して変異体のグリコシル化パターンを変化させ、それによって、その半減期を変化、好ましくは短縮することができる。この方法を用いて野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチドを脱シアリル化することもできるだろう。

脱シアリル化は、当技術分野で既知の任意の方法によって起こり得る。適切な方法の例としては、それだけに限らないが、ノイラミニダーゼ−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｎ５２５４）を含むシアリダーゼ、ならびにＧＩ：４０４７９およびＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３８（１）、３１〜３４（１９８８）で同定されたウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）のノイラミニダーゼを含む脱シアリル化するよう機能する任意の既知の酵素と接触させることによる酵素的脱シアリル化が挙げられる。このような脱シアリル化は、部分的に精製した組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドを適切な条件下インビトロでシアリダーゼと接触させること、または組換え第ＶＩＩ因子ポリペプチドを発現している宿主細胞中でのシアリダーゼの同時発現によって達成され得る。インビトロでの接触は、部分的脱シアリル化のみが起こるような持続時間となり得る。例えば、所望の半減期を第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物中０．５〜１モルの抱合型シアル酸と一定モルのＮ結合型グリカンの比を有する分子から得ることができる場合、完全な脱シアリル化が起こる前の限られた期間シアリダーゼと接触させることが推奨される。部分的脱シアリル化は、修飾シアリダーゼを使用すること、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをシアリダーゼの完全な機能を遅くするもしくは損なう条件下でシアリダーゼと接触させること、または部分的脱シアリル化ポリペプチドのみ産生する当業者に明らかな他の方法によっても得られ得る。部分的脱シアリル化は、完全に脱シアリル化された基準調製物中の抱合型シアル酸とグリカンの比との比較によって測定され得る。

脱シアリル化はまた、シアル酸付加に必要とされる１種または複数の細胞成分を欠くまたは欠乏している細胞系での第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）の発現を通しても達成され得る。特定の細胞系はシアリル化を減少させるまたは除去するよう修飾されているまたはされ得る。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）起源のＬｅｃ２細胞は、野生型細胞よりおよそ１０倍少ないシアル酸を含む糖タンパク質を産生する。グリカンの脱シアリル化は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を含む肝臓受容体によって活発に排除され得る分子をもたらし、この理由のために、半減期が短縮すると考えられる。

第２のアプローチは、第ＶＩＩ因子変異体を脱グリコシル化し、それによって半減期が短縮した分子を得るというものである。グリコシル化の減少によって、腎クリアランス（５０〜６０Ｋｄカットオフ、Ｃａｌｉｃｅｔｉ ＰおよびＶｅｒｏｎｅｓｅ ＦＭ、「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００３；５５（１０）：１２６１〜７７、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｔ ら、「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ ｒａｔ ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９７；８（４）：５８６〜９５、Ｃｈｏｉ ＨＳら、「Ｒｅｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；２５（１０）：１１６５〜７０に概説）、表面電荷および等電点（ｐＩ）電荷（糖タンパク質循環の増加と関連していた、Ｂｙｒｎｅ Ｂ．ら、「Ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄｓ：ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ」、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００７；１２（７〜８）：３１９の概説参照）、および任意の数の血漿プロテアーゼからの少ない糖タンパク質媒介保護（Ｔｏｎ Ｇ．ら、２００５、Ｎｉｅ Ｙら、２００６）を通して第ＶＩＩ因子のクリアランスが増強される。

本明細書で使用される脱グリコシル化は、限定されないが、基準第ＶＩＩ因子ポリペプチドと比較して変化したアミノ酸配列をもたらす第ＶＩＩ因子ポリペプチドの遺伝子改変を含み、この変化によりＮ結合型グリコシル化部位が除去される。例えば、第ＶＩＩ因子変異体は、Ｎ結合型グリカンコンセンサス配列、すなわち、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸を表す）に必要とされる１個または複数のアミノ酸残基でのグリコシル化を破壊する変化により作成され得る。本明細書で使用する場合、第ＶＩＩ因子アミノ酸配列の「グリコシル化を破壊する変化」とは、１個または複数のアミノ酸残基の置換、付加または欠失をもたらし、かつＮ結合型グリコシル化のための１つまたは複数の部位の喪失をもたらす野生型第ＶＩＩ因子に関する変化を指す。例えば、Ｎ結合型グリコシル化部位は、共に野生型第ＶＩＩ因子中に存在するＮ１４５および／またはＮ３２２を、任意のアミノ酸（天然または非天然）で置き換えることによって除去され得る。グリコシル化部位は、グリコシル化を破壊するよう変化させた場合に活性に及ぼす影響が最小であることが確認されるべきである。別の例では、脱グリコシル化が、グリコシル化のための機構を欠く細胞系での第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型または変異体）の発現によって起こり得る。例えば、細菌細胞はグリコシル化のための細胞機構を欠くので、細菌細胞で産生される第ＶＩＩ因子は、完全に非グリコシル化されていると予想される。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、末端グリコシル化酵素を欠く、またはこのような酵素を有しているが、１個または複数が野生型細胞系で見られるものより小さい活性を有する細胞系で産生される。例えば、Ａｐｐａ Ｒ．ら、２０１、Ｎａｒｉｔａ Ｍら、１９９８、Ｓｅｅｓｔｅｄら、２０１０を参照されたい。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、グリカンの合成もしくは第ＶＩＩ因子への結合に関与する酵素の欠損、またはＣＭＰ−シアル酸トランスポーターの合成に関与する酵素の欠損を持つ細胞系で産生される。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをデグリコシラーゼ（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）または脱グリコシル化する化学物質で処理する。

シアリダーゼ、デグリコシラーゼまたは第ＶＩＩ因子ポリペプチドからグリカンを減少させるもしくは除去する化学物質による処理は、発現、精製または精製後に起こり得る。

一実施形態では、第ＶＩＩ因子変異体Ｖ１（Ｎ３２２、Ｎ１４５）または第ＶＩＩ因子変異体Ｖ２（Ｎ３２２、Ｎ１４５、Ｎ１０６、Ｎ２５３）中のＮ結合型グリコシル化部位の少なくとも１つを、活性に対する最小限の影響で選択的に除去した。Ｎ−グリカン部位を、Ｎ−グリカンコンセンサス配列を破壊することによって、ＤＮＡレベルで消した。Ｎ（アスパラギン）コドンの除去およびＱ（グルタミン）コドンによる置換によってこれを行った。図６は、ヒポグリコシル化変異体の例を示す表である。グリコシル化変異体を、野生型第ＶＩＩ因子（本明細書では「Ｆ７」と呼ぶ）、Ｖ１およびＶ２骨格で作成した。Ｖ１およびＶ２中の操作したＮ−グリカン部位（Ｎ１０６、Ｎ２５３）をその野生型配列（Ｔ１０６、Ｖ２５３）に戻した。変異体ｐＭＢ１１３、ｐＭＢ１１７およびｐＭＢ１２１はそれぞれ２個の内因性Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ１４５、Ｎ３２２）を含有する野生型第ＶＩＩ因子、Ｖ１およびＶ２構築物である。図６の他の全ての変異体は、ＮからＱへの変異（Ｎ１４５Ｑ、Ｎ３２２Ｑ）を導入することによって除去された内因性Ｎ−グリカン部位の一方または両方を有していた。この脱グリコシル化アプローチによりより速いクリアランスがもたらされる。

本開示の一態様では、脱グリコシル化および脱シアリル化を組み合わせて、所望の短縮した半減期を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを得る。例えば、第ＶＩＩ因子分子を遺伝子組換えして、野生型第ＶＩＩ因子中に存在する２つを超える追加のＮ結合型グリコシル化部位を含めることができる。次いで、本明細書に記載される方法の１つを用いて、この変異体を脱シアリル化することができる。次いで、得られた分子は、末端シアル酸を含まない各Ｎ結合型グリコシル化部位でグリカン構造を保持し得る。本明細書で報告される実験で、出願人らは、有するＮ結合型グリコシル化部位が少ない類似の脱シアリル化第ＶＩＩ因子変異体よりも速い排除時間を有する変異体を報告する。同様に、野生型第ＶＩＩ因子に見られる２つのＮ結合型グリコシル化部位のみを有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、これらの部位の１つで脱グリコシル化し、次いで、脱シアリル化に供することができる。シアル酸を欠く１個のＮ結合型グリカンを有する得られた第ＶＩＩ因子変異体は、本明細書で報告される実験証拠に基づいて、第２のＮ結合型グリコシル化部位を欠いていない類似の第ＶＩＩ因子ポリペプチドとは異なる薬物動態を有する。

定義および実施形態
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、一般的に本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションの実験室手順は、当技術分野で周知でありかつ一般的に使用されているものである。核酸およびポリペプチド合成のために標準的な技術を使用する。本明細書で使用される命名法ならびに下記の分析化学および有機合成の実験室手順は、当技術分野で周知でありかつ一般的に使用されているものである。化学合成および化学分析のために標準的な技術またはその修正を使用する。遺伝子操作に使用される手順は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に見出され得る。

「シアル酸」または「シアリル」という用語は、九炭素カルボキシル化糖のファミリーのいずれかのメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ）−１−オン酸（通常Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略される））である。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、モノマーがアミノ酸であり、かつアミド結合を通して結合されているポリマーを指す。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンも含まれる。遺伝子コードされていないアミノ酸も本明細書で開示される技術で使用することができる。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療部分、生体分子などを含むよう修飾されたアミノ酸も使用することができる。本明細書で使用されるアミノ酸の全てはＤ−またはＬ−異性体のいずれであってもよい。Ｌ−異性体が一般的に好ましい。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、グリコシル化と非グリコシル化両方のポリペプチドおよびタンパク質をそれぞれ指す。

「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされているもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ酸およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然アミノ酸と同様に機能する構造を有する化学化合物を指す。

ポリペプチドまたはタンパク質薬物を患者に投与する文脈において本明細書で使用される「半減期」または「ｔ１／２」という用語は、患者における薬物の血漿中濃度が２分の１低下するのに要する時間として定義される。

半減期は、例えば、約２５〜２５０μｇ／ｋｇの用量の製剤を投与し：投与後の所定の時間に血漿試料を得て；凝固アッセイ（もしくは任意の生物検定）、免疫測定法または同等の方法の１つまたは複数を用いて試料中の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの含量を測定することによって、試験動物で測定することができる。データを図表で表示し、次いで、生物学的利用能を曲線下の面積として決定する。特定の例では、ラットまたはマウスモデルを半減期測定に使用する。第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたはその組成物の相対的生物学的利用能は、短時間作用性第ＶＩＩ因子ポリペプチドの曲線下の面積と野生型第ＶＩＩ因子または別の適切なコンパレータポリペプチド（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）もしくはタンパク質の曲線下の面積の比を指す。第ＶＩＩ因子の血液凝固活性を有するいずれの第ＶＩＩ因子変異体も本明細書に記載される目的および方法に有用である。本明細書で使用される第ＶＩＩ因子変異体はポリペプチドである。「変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチド」および「第ＶＩＩ因子変異体」という用語は本明細書で互換的に使用される。一実施形態では、第ＶＩＩ因子変異体が、１個または複数のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入による野生型第ＶＩＩ因子（配列番号１６）由来のアミノ酸配列を有する。アミノ酸置換の命名において、第１の文字はある位置で野生型ヒト第ＶＩＩ因子中に存在するアミノ酸を表す。次の数字はヒト野生型第ＶＩＩ因子中の位置を表す。第２の文字は野生型に見られるアミノ酸に置き換わるアミノ酸を表す。例えば、「Ｐ１０Ｑ」は、アミノ酸１０位におけるプロリン（Ｐ）のグルタミン（Ｑ）による置換を表す。

特定の例では、第ＶＩＩ因子変異体がＰ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｒ３６Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｔ１０６ＮおよびＶ２５３Ｎからなる群から選択される１個または複数のアミノ酸置換を含む。他の例では、第ＶＩＩ因子変異体がこれらの置換の少なくとも２、３、４、５または６個を含む。さらなる例では、第ＶＩＩ因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列（野生型ヒト第ＶＩＩ因子）に関して少なくとも２つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも２つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、および（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基である。別の例では、第ＶＩＩ因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも３つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも３つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、および（３）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基である。さらなる例では、第ＶＩＩ因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも４つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも４つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、および（４）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基である。１つの特定の例では、第ＶＩＩ因子変異体が配列番号１６のアミノ酸配列に関して少なくとも６つの配列変化を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも６つまたは６つの配列変化が（１）１０位のプロリン残基に置換したグルタミン残基、（２）３２位のリジン残基に置換したグルタミン酸残基、（３）３６位のアルギニン残基に置換したグルタミン酸残基、（４）３４位のアラニン残基に置換したグルタミン酸残基、（５）１０６位のトレオニン残基に置換したアスパラギン残基、および（６）２５３位のバリン残基に置換したアスパラギン残基である。別の特定の例では、第ＶＩＩ因子変異体がこれらの６つの変化のみを含む。これらの変異体についてのさらなる詳細は、共に全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍａｘｙｇｅｎの国際公開第２００１５８９３５号パンフレットおよびＰｅｄｅｒｓｅｎらの米国特許第７３７１５４３号明細書に見出される。

本明細書に記載される第ＶＩＩ因子変異体は、出発ポリペプチドとして任意の機能的第ＶＩＩ因子ポリペプチドを用いて設計することができる。特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドがヒト第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。さらなる実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが配列番号１６のヒト第ＶＩＩ因子ポリペプチド、またはその修飾型もしくは対立遺伝子変異体である。有用な出発ポリペプチドには、第ＶＩＩ因子活性も有する、野生型ヒト第ＶＩＩ因子の配列（配列番号１６）と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％同一のアミノ酸配列を含む修飾または変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドも含まれる。さらに、特定の例では、本開示の変異形第ＶＩＩ因子ポリペプチドには、第ＶＩＩ因子機能性を有し、かつ配列番号１６に関して本明細書で論じられるアミノ酸変化の１つまたは複数も含有する、配列番号１６の配列と少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％の同一性を有する任意のポリペプチドが含まれる。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、配列番号１６との９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％超の相同性および第ＶＩＩ因子活性を有し、かつ本明細書で言及されるアミノ酸変化の１つまたは複数も有するアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用される第ＶＩＩ因子変異体には、野生型第ＶＩＩ因子のグリコシル化変異体も含まれる。例えば、部分的脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子変異体およびその組成物は野生型第ＶＩＩ因子よりも短い半減期を有するので有用となり得る。部分的または完全脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子の医薬製剤ならびに第ＶＩＩ因子活性を有する短時間作用性ポリペプチドから利益を得る本明細書に列挙される疾患の治療へのこのようなポリペプチドおよび製剤の使用も本明細書で有用である。部分的または完全脱シアリル化は、本明細書に記載されるように第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物中の抱合型シアル酸のモルとＮ結合型グリカンのモルの比によって測定することができる。

本明細書中の第ＶＩＩ因子変異体をコードするヌクレオチド配列も有用である。一実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型第ＶＩＩ因子のヌクレオチド配列（配列番号１）と全長にわたって少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％の同一性を有し、かつ機能的第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされている。特定の例では、ヌクレオチド配列が配列番号１６に関して本明細書で論じられるアミノ酸変化の１つまたは複数を含有するポリペプチドもコードする。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型第ＶＩＩ因子のヌクレオチド配列（配列番号１）との９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％または６６％超の相同性を有し、かつ機能的第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされている。特定の例では、ヌクレオチド配列が配列番号１６に関して本明細書で論じられるアミノ酸変化の１つまたは複数を含有するポリペプチドもコードする。

同一性％値は、アミノ酸または核酸配列領域全体にわたって計算される。異なる配列を比較するために、種々のアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能である。少なくとも一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性％が、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅ，Ｐ．、Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．、およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（６）、２７６〜２７７、２０００）のｎｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ １９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３）を用いて、遠縁のタンパク質についてのＢＬＯＳＵＭ ４５もしくはＰＡＭ２５０スコアリングマトリクスのいずれか、または近縁のタンパク質についてのＢＬＯＳＵＭ ６２もしくはＰＡＭ１６０スコアリングマトリクスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ開始ペナルティおよび０．５、１、２、３、４、５または６のギャップ伸長ペナルティを用いて決定される。ＥＭＢＯＳＳパッケージのローカルインストールのためのガイドならびにウェブサービスへのリンクは、ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔに見出され得る。ｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて２つのアミノ酸配列を整列させるために使用されるパラメータの非限定的例には、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータがある。さらに別の実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性％が、ＥＭＢＯＳＳソフトウェアパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅ，Ｐ．、Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．、およびＢｌｅａｓｂｙ，Ａ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６（６）、２７６〜２７７、２０００）のｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ開始ペナルティおよび０．５、１、２、３、４、５または６のギャップ伸長ペナルティと共にＥＤＮＡＦＵＬＬスコアリングマトリクスを用いて決定される。ｎｅｅｄｌｅプログラムを用いて２つのアミノ酸配列を整列させるために使用されるパラメータの非限定的例には、ＥＤＮＡＦＵＬＬスコアリングマトリクス、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを含むデフォルトパラメータがある。核酸およびタンパク質配列を「クエリ配列」としてさらに使用して公共データベースに対して検索を行って、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）のＢＬＡＳＴシリーズのプログラム（バージョン２．２）を用いて行うことができる。クエリ配列として本開示の核酸配列を用いるＢＬＡＳＴを、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｘまたはｔＢＬＡＳＴｘプログラムで行って、本開示の核酸配列によってコードされる配列と相同なヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ）またはアミノ酸配列（ＢＬＡＳＴｘ）のいずれかを得ることができる。クエリ配列として本開示の核酸配列によってコードされるタンパク質配列を用いるＢＬＡＳＴを、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴｐまたはｔＢＬＡＳＴｎプログラムで行って、本開示の配列と相同なアミノ酸配列（ＢＬＡＳＴｐ）または核酸配列（ｔＢＬＡＳＴｎ）のいずれかを得ることができる。比較目的のためのギャップ化アラインメントを得るために、ＡＬｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているように、デフォルトパラメータを用いるＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。

本開示のポリヌクレオチドは上記ヌクレオチド配列から本質的になるまたは上記ヌクレオチド配列を含む。したがって、これらはさらなるヌクレオチド配列も含有することができる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームに加えて、コード遺伝子領域の３’および／または５’末端にさらなる未翻訳配列、例えば、コード領域の５’末端の上流の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列および／またはコード遺伝子領域の３’末端の下流の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列を含むことができる。さらに、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質の一方のパートナーが上に列挙されるヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドである融合タンパク質をコードすることができる。このような融合タンパク質は、精製目的のための検出可能なマーカーまたは補助尺度として働き得るいわゆる「タグ」を含むことができる。異なる目的のためのタグは当技術分野で周知であり、ＦＬＡＧタグ、６−ヒスチジンタグ、ＭＹＣタグなどを含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列と作動可能に連結した発現制御配列をさらに含む。

特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸配列を適切なベクターに挿入する。種々の目的に有用な多数のベクターが当技術分野で周知であり、当業者であれば所望の用途に適したベクターを容易に選択することができるだろう。特定の例では、ベクターがクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。他の例では、ベクターがプラスミド、ウイルスベクター、コスミドまたは人工染色体であり得る。特定の例では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸が、適切なプロモーターに隣接しておよび／またはその制御下に配置され得る。種々の目的に有用な多数のプロモーターが当技術分野で周知であり、当業者であれば所望の用途に適したプロモーターを容易に選択することができるだろう。特定の例では、プロモーターが構成型プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターであり得る。

特定の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが細胞、組織または生物中で組換え産生される。特定の実施形態では、このような組換え産生が、変異ポリペプチドをコードする核酸分子またはこのような核酸を含有するベクターで宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることによって達成される。多数の形質転換およびトランスフェクション法が当技術分野で周知であり、当業者であれば所望の用途に適した方法を容易に選択することができるだろう。

このような組換え産生を、任意の適切な宿主細胞、組織または生物を用いて達成することもできる。適切な細胞、組織および生物が当技術分野で周知であり、当業者であれば所望の用途に適した宿主を容易に選択することができるだろう。いくつかの実施形態では、宿主細胞が哺乳動物である。適切な哺乳動物細胞系の例には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２、１９７７）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２６８；ＤＳＭ ＡＣＣ ２４９４）およびＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９００７）細胞系がある。有用なＢＨＫ細胞系は以下でＢＨＫ５７０細胞と呼ぶ、ｔｋ^３１ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞系（参照により本明細書に組み込まれている、ＷａｅｃｈｔｅｒおよびＢａｓｅｒｇａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：１１０６〜１１１０、１９８２）である。ＢＨＫ５７０細胞系は、ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１０３１４で、米国培養細胞系統保存機関、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２により寄託された。ｔｋ⁻ｔｓ１３ ＢＨＫ細胞系も寄託番号ＣＲＬ１６３２で、ＡＴＣＣから入手可能である。さらに、Ｒａｔ Ｈｅｐ Ｉ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６００）、Ｒａｔ Ｈｅｐ ＩＩ（ラット肝細胞癌；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣ ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９．１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＩ６１）、ＤＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６〜４２２０、１９８０）およびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂら Ｃｅｌｌ ３３：４０５〜４１２、１９８３）を含む、いくつかの他の細胞系を本開示中で使用することができる。

本明細書に定義され、組成物中のＮ結合型グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモルの比が０．０５未満、０．１未満、１．０未満、２．０未満、３．０未満、４．０未満、５．０未満または６．０未満である第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物、あるいはＮ結合型グリカン１モル当たりの抱合型シアル酸のモルの比が（１）０〜８；（２）０〜７；（３）０〜６；（４）０〜５；（５）０〜４；（６）０〜３；（７）０〜２；（８）０〜１および（９）０〜０．５からなる群から選択される範囲内、または１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５および０．１〜１の比である組成物が有用である。比は、糖タンパク質上のグリカンの数に対する糖タンパク質に結合したシアル酸のモルの測定値である。グリカンの数とは、糖タンパク質中のＮ結合型グリカンに結合した糖部分の数を指し、１つのＮ結合型グリコシル化部位はこの比の目的のために本明細書で定義されるただ１つのグリカンを支持し得る。比は、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（カタログ番号４４００）によって販売されているようなシアル酸蛍光標識キットを用いて決定される。このようなシアル酸蛍光標識キットは、部分的酸加水分解またはアルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼなどのシアリダーゼの使用などによって、結合糖タンパク質からシアル酸を放出するステップを含む。次いで、遊離シアル酸を１，２−ジアミノ−４，５−メチレンオキシベンゼン（「ＤＭＢ」）などの発蛍光団で標識する。次いで、標識シアル酸を、ＨＰＬＣを用いておよびピーク高さを較正曲線と比較して、定量的に測定する。したがって、測定される比は、組成物の全第ＶＩＩ因子ポリペプチドから放出されるグリカン１モル当たりのシアル酸のモルの比である。

一連の実施形態では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物または単離ポリペプチド自体が、ヒトまたは哺乳動物血漿、例えば、マウスまたはラット血漿中で測定された場合、２時間未満、１．５時間未満、１時間未満、．７５時間未満、．５時間未満、．２５時間未満、０．１時間未満の半減期、あるいは合理的に測定することができないほど短い半減期を有する。

本明細書で使用する場合、第ＶＩＩ因子活性は、当技術分野で周知のように、第ＶＩＩ因子欠乏血漿およびトロンボプラスチンを用いて、製剤が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化され得る生物活性である。特定の例では、第ＶＩＩ因子活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、同じ条件下で測定される場合、野生型第ＶＩＩ因子の活性の少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を示す。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよび第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むその組成物と、薬学的に許容される賦形剤または担体との医薬製剤も有用である。特定の例では、医薬製剤が、例えば、静脈内、皮下または筋肉内投与などによる非経口投与用であり、投薬が単一ボーラス用量、間欠投薬または連続静脈内注射としてのものとなり得る。局所投与も有用である。一実施形態は、使用時に再構成される凍結乾燥製剤中に本明細書に記載される単離第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたは本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物を含む医薬製剤を含む。あるいは、医薬製剤は、再構成を要さない安定な液体の即時使用可能な製剤であり得る。医薬製剤は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド１、２、５または８ｍｇの単回使用バイアル中の凍結乾燥粉末であり得る。ヒスチジンを含有する滅菌水などの、指定量の液体による再構成後、最終溶液は、治療効果をもたらす任意の適切な量の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、例えば、限定されないが、１ｍｇ／ｍＬ（１０００μｇ／ｍＬ）、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１〜２ｍｇ／ｍＬ、１〜３ｍｇ／ｍＬ、１〜５ｍｇ／ｍＬ、１〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．５〜１ｍｇ／ｍＬまたは０．５〜２ｍｇ／ｍＬの第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有することができる。患者への適切な投与量は、例えば、患者の体重、治療している出血性障害またはエピソードの種類、および使用している特定の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性に基づいて当業者によって容易に決定され得る。特定の例では、投薬が７０〜１１０μｇ／ｋｇ、７０〜９０μｇ／ｋｇまたは８０〜１００μｇ／ｋｇの範囲にあり、９０μｇ／ｋｇであり得る。凍結乾燥粉末は、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等などの水性担体を用いて再構成され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に知られているまたは明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ．（１９９０）により詳細に記載されている。外傷の場合に賢明となり得るような局所適用は、スプレー、灌流、カテーテル、ステント、血管移植もしくはステント、軟膏、または当技術分野で知られている他の製剤によって行うことができる。特定の例では、局所投与が、第ＶＩＩ因子変異体を含む組成物で処理された、これを注入された、これでコーティングされた、またはこれに浸漬された外科スポンジまたはコラーゲンマトリクスなどの固体または半固体マトリクスを通してもよい。このようなマトリクスを調製する方法は当技術分野で周知であり（例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ １２：４４５、２００６参照）、当業者であれば適切な用量および組成物を所与のマトリクスに適用する方法を容易に決定することができるだろう。

一実施形態では、本開示は第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むキットに関する。特定の例では、キットが適切な医薬組成物中に第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する即時使用可能な液体を含有するバイアルを含有する。他の例では、キットが凍結乾燥第ＶＩＩ因子ポリペプチドまたはポリペプチドを含む凍結乾燥製剤と、再構成用の希釈剤とも含有するバイアルを含有する。他の例では、キットが、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの局所製剤、例えば、軟膏、スプレー、または液体、および局所製剤を患者への投与前に適用することができるスポンジまたは他の医療用マトリクスなどのマトリクスを含有する。

本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物も有用である。第ＶＩＩ因子はその天然分解産物との混合で存在する。したがって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物は、本明細書で列挙される完全アミノ酸配列の１つを有するポリペプチドと、本明細書に記載されるものの部分的アミノ酸配列を有する分解産物とを含む。さらに、第ＶＩＩ因子は糖タンパク質であるので、第ＶＩＩ因子の組成物は、組成物中の各糖タンパク質が他のものと正確に同じグリコシル化を有するわけではない第ＶＩＩ因子ポリペプチドの不均一な混合物を含有すると予想され得る。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの組成物または単離第ＶＩＩ因子ポリペプチドへの言及は、個々のポリペプチドが異なるグリコシル化を有するこのようなポリペプチドの混合物を包含するものとし、したがって、「組成物」または「単離第ＶＩＩ因子ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド中にグリコシル化パターンの不均一性を包含する。

本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよび組成物は、血液凝固障害、および血液凝固から利益を得る障害の治療、特に、野生型第ＶＩＩ因子よりも短い半減期を有する薬物を用いた凝固に有用である。したがって、本明細書の第ＶＩＩ因子ポリペプチドおよび組成物は、穿通性外傷性損傷；鈍的外傷性損傷；待機手術における出血；心臓手術における出血；脊髄手術における出血；整形外科手術；神経外科手術；腫瘍学手術；分娩後手術；月経過多；幹細胞移植における出血；肝移植における出血；消化管出血；肝硬変の活発な静脈瘤出血；肝硬変の非静脈瘤出血；びまん性肺胞出血；大動脈瘤；脳内出血；外傷性脳損傷；脳挫傷；ワルファリンの逆転；ヘパリンの逆転；抗凝固薬の逆転；抗血栓薬の逆転；第ＶＩＩ因子欠乏症；火傷；阻害因子による血友病患者の予防；非肝硬変および肝硬変患者のための部分肝切除；後天性血友病；特発性血小板減少性紫斑病；グランツマン血小板無力症；血小板輸血に対して難治性のグランツマン血小板無力症およびベルナール−スリエ症候群に有用である。

本明細書では、第ＶＩＩ因子などの凝固因子の半減期を測定するのに有用なアッセイも開示される。生存ラット肝細胞を血液凝固因子と共にインキュベートするステップと、試験時点１で試料を取り出すステップと、試料中の細胞から上清を分離するステップと、試料中の上清中の血液凝固因子の活性または量を定量化するステップとを含む、凝固因子の半減期を測定する方法であって、血液凝固因子の活性または量が二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定される方法が存在する。本方法を異なる時点で繰り返して、経時的な血液凝固因子の活性または量のプロットを作成してもよい。

［実施例］
脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチドを得る方法
ポリペプチドの酵素的脱シアリル化、シアリル化欠乏細胞系での第ＶＩＩ因子ポリペプチドの産生、および組換え細胞での第ＶＩＩ因子とシアリダーゼの同時発現を含む、多数の方法を使用して脱シアリル化第ＶＩＩ因子ポリペプチド（野生型と変異体の両方）を産生した。

シアル酸欠乏細胞系の作成
内因性シアル酸を、３２種の酵素からなる複雑な経路を含む哺乳動物細胞で合成する（ＷｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅおよびＭｅｄｒａｎｏ ２０１１）。シアル酸の生合成は、サイトゾル中で始まり、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎアセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、シアル酸９−リン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）およびシアル酸９−リン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ）などのいくつかの酵素を伴い、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ）をＮｅｕ５Ａｃに変換する。サイトゾル中のＮｅｕ５Ａｃは、核膜孔を通して核内に輸入され、ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ（ＣＭＡＳ）と呼ばれる酵素によってＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃに変換される。合成されたＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃは、さらなる修飾およびゴルジ装置への抱合のために、核膜孔を介してサイトゾル内に再度輸送される。サイトゾル中でのＮｅｕ５ＡｃのＮｅｕ５Ｇｃへの変換は、酵素ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）によって触媒される。次いで、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５ＡｃおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃが中央トランスゴルジの膜に位置する疎水性３型膜輸送体、ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＳＬＣ３５Ａ１）を介してゴルジコンパートメントに輸送される。ＣＭＰ−シアル酸輸送体は、細胞シアリル化経路の重要な要素である（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら １９９８）。この遺伝子のホモ接合性変異は、マウスにおいて生後致死を引き起こす（ＭＧＩ ４．３２、Ｈｏｍｏｌｏｇｅｎｅ）。ヒトでは、ＳＬＣ３５Ａ１の変異がシアリル抱合体の減少または完全な喪失に関連している。ＳＬＣ３５Ａ１におけるいくつかの挿入および欠失変異は、ヒトのグリコシル化の先天性障害に関連し、神経系発達、凝固の欠陥、および免疫不全をもたらす（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｄｕｎｃｋｅｒら、２００５）。いったんＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ／ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ｇｃがゴルジ装置に輸送されると、これらは２０のメンバーを含むシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）ファミリー内の酵素によって炭水化物、糖タンパク質および糖脂質と抱合する。

ＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＳＬＣ３５Ａ１）はゴルジ装置でのシアル酸抱合を支持する主要な分子であり、この輸送体タンパク質の変異は適切なシアリル化を欠くタンパク質の合成につながる。脱シアリル化第ＶＩＩ因子を産生するために、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子ノックアウトを有する第ＶＩＩ因子産生細胞系を作成する。あるいは、治療分子上のシアリル化が極めて低レベルまたは全くないタンパク質治療剤を産生する細胞系での第ＶＩＩ因子変異体の発現によって、脱シアリル化を達成することができるだろう。この技術を用いて患者においてＴ１／２が短い治療タンパク質を産生することができるだろう。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）起源を有するＬｅｃ２細胞を、それぞれの野生型細胞よりもおよそ１０倍少ない糖タンパク質および糖脂質中のシアル酸を産生するという特性により同定した（ＳｔａｎｌｅｙおよびＳｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ、１９７７、Ｓｔａｎｌｅｙ、１９８０および１９８３）。後の研究により、Ｌｅｃ２変異体がインビトロアッセイにおいてＣＭＰ−シアル酸をゴルジ小胞の膜を横切って転位置させることができない一方で、他のヌクレオチド誘導体の転位置は変異細胞において比較的正常であることが示された（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、１９８４）。発現クローニングを用いることにより、Ｌｅｃ２細胞からＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードする遺伝子が報告された（Ｅｃｋｈａｒｄｔら、１９９６）。さらなる調査により、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子中のヌクレオチド５７５〜７５１の欠失がＬｅｃ２表現型の原因であることが示された（Ｅｃｋｈａｒｄｔら、１９９８）。例えば、例えば、１Ｅ３、６Ｂ２、８Ｇ８および９Ｄ３細胞の場合のＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子中の他の変異もＬｅｃ２表現型をもたらす（Ｅｃｋｈａｒｄｔら、１９９８）。

実験１
この実験を、例えば、Ｌｅｃ２細胞の場合のＣＭＰ−シアル酸輸送体の遺伝子中の変異が、正常なＣＨＯ細胞から発現される同じタンパク質と比較してシアリル化の欠乏した発現組換えタンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子）をもたらすかどうかを決定するよう設計する。

（１）Ｌｅｃ２細胞からの第ＶＩＩ因子などの組換えタンパク質の発現の試験 第ＶＩＩ因子変異遺伝子を含有する発現ベクター（例えば、ｐＭＢ１１７およびｐＭＢ１２１）を正常なトランスフェクション条件下でＬｅｃ２細胞および正常なＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。これらの細胞の細胞培養からの第ＶＩＩ因子の発現レベルを、第ＶＩＩ因子活性アッセイによって監視する。トランスフェクト細胞の培養をスケールアップし、培養条件培地を第ＶＩＩ因子の精製のために回収する。

（２）正常なＣＨＯ細胞から発現した同じタンパク質と比較したＬｅｃ２細胞から発現した精製第ＶＩＩ因子のシアル酸含量の試験 これらの条件培地からの第ＶＩＩ因子の精製を、通常の第ＶＩＩ因子精製法にしたがって行う。Ｌｅｃ２細胞または正常なＣＨＯ細胞のいずれかからの精製第ＶＩＩ因子を、精製第ＶＩＩ因子のシアル酸含量について分析する。生物活性および薬物動態（ＰＫ）パラメータを本明細書に記載されるように分析する。

実験２
発現組換えタンパク質上にシアル酸を含まない第ＶＩＩ因子変異体を発現する製造細胞系を作成するために、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子を標的化して第ＶＩＩ因子を発現する細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞系）を修飾する遺伝子欠失法を使用する。細胞でのシアリル化を完全に阻害するために、序論で上に列挙されるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎアセチルマンノサミンキナーゼ（ＧＮＥ）、シアル酸９−リン酸シンターゼ（ＮＡＮＳ）、シアル酸９−リン酸ホスファターゼ（ＮＡＮＰ）およびＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼ（ＣＭＡＳ）などの他の標的を欠失させて、ＣＭＰ−シアル酸輸送体のための基質を提供するＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ生合成の阻害を増強してもよい。

２つの遺伝子欠失技術、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のＺＦＰヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を、ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子のノックアウトまたはシアル酸合成経路の複数の遺伝子のノックアウトを行うために使用することができる。

ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子ノックアウトを有する第ＶＩＩ因子発現細胞系を評価してＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子の欠失を確認する。確認した細胞系を培養して第ＶＩＩ因子を産生する。ＣＭＰ−シアル酸輸送体遺伝子欠失細胞系からの第ＶＩＩ因子を本明細書に記載されているように精製および評価し、分子上のシアル酸含量について親第ＶＩＩ因子発現細胞系からの第ＶＩＩ因子と比較する。

第ＶＩＩ因子と細菌シアリダーゼの同時発現による脱シアリアル化第ＶＩＩ因子の産生
ＦＶＩＩの脱シアリル化型を作成するために、本発明者らは、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼ（ＡＵシアリダーゼ）（Ｎ−アセチルノイラミネートグリコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１８）由来の細菌シアリダーゼ変異体と共にＦＶＩＩを同時発現させた。ＣＨＯ細胞安定に発現ＦＶＩＩ（例えば、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４ＥおよびＲ３６Ｅ変異を有する配列番号１６）を、ｐＪ６０８発現ベクターを用いてＡＵシアリダーゼでさらにトランスフェクトした。発現したタンパク質は、タンパク質の分泌を促進する、Ｎ末端の成長ホルモンシグナル配列を有する。培地中のシアリダーゼについての発色性アッセイによって検出されるＡＵシアリダーゼを産生する安定なクローンを選択した。本発明者らはまた、細胞が高レベルのＦＶＩＩタンパク質を発現し続けることを示した（これは、プローブとしてＦＶＩＩ特異的抗体を用いる、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によって検出した）。レクチンブロッティングアッセイを用いて、本発明者らは、精製ＦＶＩＩを用いて条件培地中のＦＶＩＩタンパク質上のシアル酸を検出することができなかった。対照的に、シアリダーゼでトランスフェクトしていない細胞由来の同様のレベルの精製ＦＶＩＩは、強力なレクチン結合シグナルを示した。まとめると、本発明者らのデータは、ＡＵシアリダーゼが、細胞によって同時発現したＦＶＩＩを効率的に脱シアリル化するのに十分なレベルでＣＨＯ細胞培地中で発現したことを示している。

可溶性シアリダーゼ処理を用いた脱シアリル化第ＶＩＩ因子の酵素調製
以下の出発材料をこの実験に利用した：
第ＶＩＩ因子：２０ｍｇ野生型第ＶＩＩａ因子、濃度約１ｍｇ／ｍｌ
シアリダーゼ：２０μｇ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、５００００Ｕ／ｍｌ、Ｐ０７２０Ｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入
緩衝液Ａ：２５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４
緩衝液Ｂ：２５ｍＭヒスチジン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４
ＦＶＩＩａ製剤緩衝液：２．３ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、１．５ｍｇ／ｍｌ塩化カルシウム脱水物、１．３ｍｇ／ｍｌグリシルグリシン、０．１ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、２５ｍｇ／ｍｌマンニトール、１０ｍｇ／ｍｌスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌメチオニン、１．６ｍｇ／ｍｌヒスチジン、ｐＨ６．０
精製カラム：５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム
これらの材料を用いて、以下の手順を行った：
１．ＦＶＩＩａ２０ｍｇ（約１ｍｇ／ｍｌ）に、シアリダーゼのシアリダーゼ２０μｇ（０．２５ｍｇ／ｍｌ、１：１０００質量比）を添加する。

２．下記のように脱シアリル化ＦＶＩＩａをクロマトグラフィによって精製する前に、反応物を室温で一晩（約１９時間）インキュベートする。

３．以下の通り、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムで脱シアリル化ＦＶＩＩａを精製する。

ａ）緩衝液Ａ（２５ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）５ＣＶを用いてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを平衡化する。

ｂ）カラムに適用する前に、ＦＶＩＩａおよびシアリダーゼ反応物を緩衝液Ａ２００ｍｌで希釈し、ｐＨを６．４に調整する。

ｃ）Ａ２８０を監視しながら、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムを用いて２．５ｍｌ／分の流量で充填する。分画を通して流れを回収する。

ｄ）充填が完了した後、カラムを緩衝液Ａ １０ＣＶで洗浄する。

ｅ）カラムを０〜５０％緩衝液Ｂ（２５ｍＭヒスチジン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．４）２０ＣＶにより４０分間溶出する。ピーク分画を回収する（脱シアリル化ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）。

ｆ）ピーク分画対ＦＶＩＩａ製剤緩衝液を４℃で一晩透析する。

ｇ）試料を−８０℃においてアリコートで凍結させる。

生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ａＳＥＣによって高度に純粋であること、およびＦＶＩＩａについての生物アッセイで活性であることが示された。シアル酸含量についてのアッセイにより残留シアル酸はないことが示され、重鎖のＬＣ−ＭＳ分析によりシアル酸の除去以外のグリカン構造の有意な変化はないことが示された。

ノイラミニダーゼ−アガロースビーズを用いた脱シアリル化第ＶＩＩ因子の酵素調製
本明細書で使用される組換え野生型第ＶＩＩ因子は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから得たＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）であり、本明細書では「Ｆ７」と呼ぶ。他の出発材料は上記のＶ１およびＶ２である。

凍結出発材料を３７℃水浴で急速解凍し、プールした。タンパク質を遠心分離によって２．５倍濃縮し、濃縮物をピペット操作によって穏やかに混合してタンパク質−フィルタ界面での超濃縮（ｓｕｐｅｒ−ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（凝集）を最小化した。

Ｖ２を、Ｖ２製剤緩衝液（ヒスチジン、ＣａＣｌ_２、トレハロース、メチオニンおよび微量レベルのＴｗｅｅｎ（登録商標）−２０、ｐＨ６．４〜６．６を含有）からＭＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０、滅菌濾過を含有）に緩衝液交換した。これを３つの方法の１つで達成した。第１の選択肢では、Ｖ２を、それぞれ３カラム体積のＭＥＳ緩衝液で３〜５回予洗したＮＡＰ−１０重力流動カラム（ＧＥ、１７−０８５４−０１）を用いて緩衝液交換した。次いで、Ｖ２をカラムに充填し、充填体積の１．５倍のＭＥＳ緩衝液で希釈した。第２の選択肢では、Ｖ２を、ＭＥＳ緩衝液中での一晩の透析によって緩衝液交換した。透析カセットをＭＥＳ緩衝液に予浸し、Ｖ２をシリンジによって３．５００ＭＷＣＯ ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６６１３０）に、滅菌濾過ＭＥＳ緩衝液を含む１０Ｌピッチャー中４℃で一晩充填した。第３の選択肢では、Ｖ２を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ、Ｇ−２５−８０）ゲル濾過カラムを通してＭＥＳ緩衝液に緩衝液交換し、ＭＥＳ緩衝液を用いて平衡化した。

緩衝液交換Ｖ２を、ノイラミニダーゼ−アガロース（Ｓｉｇｍａ Ｎ５２５４）を用いて脱シアリル化した。アガロースビーズ産物を５０％スラリー混合物に供給し、硫酸アンモニウム緩衝液中に保存し；ビーズをＭＥＳ緩衝液中３〜５回予洗し；ビーズ／緩衝液混合物を４℃で３分間１０００ｒｃｆでの遠心分離によって分離し、上清液をピペットによって取り出して、捨てた。洗浄したビーズに、緩衝液交換Ｖ２を添加し、室温で１６〜２２時間回転によって穏やかに混合した。タンパク質１ｍｇ当たり２．０８ｍＬの充填ビーズを脱シアリル化に使用し；より大規模の調製のために、これをタンパク質１ｍｇ当たり０．２０８ｍＬのビーズまで１：１０減少させた。その後、脱シアリル化Ｖ２を遠心分離によって回収し、ピペットで取り出した。ビーズを１回、１：１体積の新鮮なＭＥＳ緩衝液中で回転によって５分間穏やかに洗浄し；洗浄混合物を前の通りに遠心分離し、上清をＶ２と共にプールした。ビーズを、最終的に０．２ミクロンシリンジフィルタを通した滅菌濾過によってまたは０．４５ミクロンフィルタを通した真空濾過によって除去した。

ＥｎｄｏＴｒａｐ ＨＤ樹脂（Ｈｙｇｌｏｓ）を用いて数ラウンドのエンドトキシン除去を行った。樹脂をＭＥＳ緩衝液中３〜５回洗浄し、洗浄緩衝液を捨てた。２つのバッチで、洗浄樹脂１〜３ｍＬを、室温で一晩脱シアリル化Ｖ２と穏やかに混合した。樹脂を遠心分離によって除去し、次いで、シリンジまたは真空フィルタを通して濾過した。

脱シアリル化Ｖ２を１０分サイクル間、Ｕｌｔｒａｃｅｌｓ中での遠心分離によって２．１ｍｇ／ｍＬまで４．７５倍濃縮し；濃縮物をピペット操作によって穏やかに混合して、タンパク質−フィルタ界面での凝集を減少させた。

脱シアリル化Ｖ２を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除カラムを用いて高分子量種（および凝集したエンドトキシン）からさらに分離した。カラムおよびＡＫＴＡ精製装置システムを０．１Ｎ ＮａＯＨ＋２０％ＥｔＯＨを用いて予衛生化した。システムをｐＨ中和し、水ですすぎ、再構成しプールしたＶ２製剤緩衝液を用いて平衡化した。数バッチの濃縮物を１２ｍＬ試料ループに手動で注入し、３ｍＬ／分の流量でサイズ排除カラムに充填し；溶離液を回収し、Ｆｒａｃ−９００を用いてポリスチレンチューブ（１７×１００ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、１４−９５６−６Ｄ）に分画した。初期に、高分子量ピークが排除され、所望のＶ２分画をプールし、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥｎｄｏＳａｆｅ ＰＴＳおよびＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００を用いてエンドトキシンレベルおよび濃度について試験した。Ｖ２緩衝液を用いて脱シアリル化Ｖ２を溶出した。

５バッチのサイズ排除を行い、回収した溶離液を１バッチにプールし、これをＵｌｔｒａｃｅｌｓ中１．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最終調製物を、０．２ミクロンシリンジフィルタを通して滅菌濾過し、エンドトキシンおよび濃度について試験した。１ｍＬアリコートを標識２ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、７２．６９４．００６）にピペットで入れ、エタノール／ドライアイスバッチ中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で標識ボックスに保存した。

特性評価−タンパク質分析学およびインビトロアッセイ
最終調製材料ならびに未処理出発材料を、ＭＥＳ泳動緩衝液中４〜１２％ビス−トリスＮｕＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ ＮＰ０３３５ＢＯＸ）を用いたタンパク質ゲル分析および分析的サイズ排除（ＴＳＫ３０００カラム；泳動緩衝液：２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．８、流量：０．１５ｍｌ／分、蛍光検出）によって特性評価した。少量の試験試料を、第ＶＩＩ因子重鎖上のシアル酸含量についてＬＣ−ＭＳにより、ならびに総タンパク質のＤＭＢ−標識シアル酸定量化について本明細書に論じられているＴａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．キットを用いて分析した。活性を、リン脂質依存性第Ｘ因子活性化およびトロンビン産生アッセイによって試験した。

シアル酸含量分析
ＬＣ−ＭＳ法を用いて、未処理対照および脱シアリル化第ＶＩＩ因子について第ＶＩＩ因子の重鎖のＮ−グリカン上のシアル酸を同定した。タンパク質１０μｇを３７℃で３０分間１０ｍＭ ＤＴＴ混合物を用いて還元し、次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ：カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ ８μｍ ４０００Ａ、０．３×１５０ｍｍ、７５℃で分析した。緩衝系：Ａ：０．２％ギ酸＋０．０１％ＴＦＡを含む水；Ｂ：０．２％ギ酸＋０．０１％ＴＦＡを含むＡＣＮ。勾配：５０μＬ／分、２分で１０％Ｂ、２５分で９０％Ｂまで、９０％Ｂ洗浄５分、１０％Ｂ平衡化５分。

Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０Ｑ−ＴＯＦシステム：ＤｕａｌＥｓｉ源、ガス温度：３５０℃、乾燥ガス：７ｐｓｉ、ネブライザ：１０ｐｓｉ、スキャン範囲：５００〜３０００ａｍｕ、１スペクトル／秒。基準イオン：１２２１．９９０６３７および２４２１．９１３９９ａｍｕ、５０ｐｐｍ窓、分１０００カウント。

結果を図７に報告する。

ＤＭＢ標識キットを用いたシアル酸定量化
シアル酸蛍光標識キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、カタログ番号４４００）は、シアロ糖抱合体の定量的および高感度分析のためのものである。１，２−ジアミノ−４，５−メチレンオキシベンゼン（ＤＭＢ）を用いたこのＨＰＬＣに基づくシアル酸蛍光標識技術は、単純かつ高感度定量法である。この方法では、遊離シアル酸を、ＤＭＢによる標識後に逆相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏｓｅｐＲ、Ｇｌｙｋｏ製、番号１−４７２７）によって分析する。

結論
Ｖ２重鎖は２つのＮ−グリコシル化部位を有する。Ｎ−グリカンはフコシル化された、高度にシアリル化された、二、三および四構造である。脱シアリル化試料上に末端シアル酸は見られず、このことは試料が十分に脱シアリル化されていること、および第ＶＩＩ因子Ｎ−グリカン上のシアル酸の９９．９％超が除去されたことを示唆している。

ラット肝細胞を用いた半減期アッセイ
肝細胞の調製
凍結保存された初代培養ラット肝細胞をＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。およそ５００万個の細胞を含有する各バイアルを解凍し、細胞を解凍培地１０ｍｌに添加し、引き続いて６０ｇで３分間遠心分離した。細胞をインキュベーション培地＋０．２５％ＢＳＡ（約４ｍｌ）に再懸濁し、血球計数器を用いて細胞をカウントした。トリパンブルーによって染色して死細胞を同定した後、生細胞をカウントした。細胞生存率は８０〜８２％であった。細胞を、カウント直後にクリアランスアッセイに使用した。

解凍培地：５００ｍｌウィリアムスＥ培地に添加したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＭ３０００ Ｔｈａｗｉｎｇ／Ｐｌａｔｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ。インキュベーション培地：５００ｍｌウィリアムスＥ培地に添加したＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＭ４０００ Ｃｅｌｌ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ。

インビトロ肝細胞クリアランスアッセイ
初代培養ラット肝細胞、１００万個生細胞／ｍｌを、エッペンドルフチューブ中で、ＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔインキュベーション培地＋０．２５％ＢＳＡ中２５ｎｇ／ｍｌの種々の第ＶＩＩ因子変異体と共にインキュベートし、１．２ｍｌの出発体積中、３７℃で穏やかにくるくると回転して混合した。示される時点の各々で、混合物０．２５ｍｌを取り出して、直ちに遠心分離して細胞をペレット化した（１０００ｒｐｍ、エッペンドルフ遠心分離で３分）。清澄化上清０．１８ｍｌを取り出し、急速凍結し、−８０℃で一晩保管した。翌日、上清中の第ＶＩＩ因子を、対応する精製変異タンパク質を標準として使用するＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量化した。第ＶＩＩ因子変異体を培地中単独で３７℃で２時間インキュベートした無細胞対照上清を０時点値として使用した。各インキュベーションを３連で行った。固有クリアランス値を、インキュベーション体積および細胞数に関して正規化した式ＣＬｉｎｔ＝０．６９３／インビトロＴ_１／２を用いて、Ｌｕら（Ｌｕ ｒｅｆ．）の方法に基づいて計算した。プログラムＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、インビトロ半減期（Ｔ_１／２）を計算した。肝細胞インキュベーションからの上清を、二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを用いてアッセイした。０．１ｍｌ／ウェルの抗第ＶＩＩ因子モノクローナル抗体（１．０μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中）をＧｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ ６５５０６１ ９６ウェルプレートに添加した。４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを０．２ｍｌ／ウェルの１％カゼインブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．２）を用いて３７℃で１．５時間ブロッキングした。プレートを０．３ｍｌ／ウェルのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で（ＢｉｏＴｅｋ ＥＬｘ４０５プレート洗浄機を用いて）４回洗浄し、次いで、関連第ＶＩＩ因子標準および未知試料をプレートに添加した。各肝細胞上清０．１８ｍｌを、希釈緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．２）０．１８ｍｌを添加することによって２倍希釈した。各希釈上清０．１０ｍｌを３連でＥＬＩＳＡプレートに添加した。希釈緩衝液に希釈した対応する精製第ＶＩＩ因子変異体から標準を作成した。標準の２倍連続希釈を希釈緩衝液に製造して、５０〜０．８ｎｇ／ｍｌ最終濃度範囲の希釈液を得た。第ＶＩＩ因子標準および試料（０．１ｍｌ／ウェル）を室温（２１℃）で２時間インキュベートした。プレートを上記のように４回洗浄し、次いで、ビオチン化検出抗体、希釈緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％カゼイン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ｐＨ７．２）中１μｇ／ｍｌを添加し（０．１ｍｌ／ウェル）、引き続いて室温で１．５時間インキュベートした。プレートを上記のように４回洗浄し、次いで、希釈緩衝液に１／１０００希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し（０．１ｍｌ／ウェル）、引き続いて室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢを０．１ｍｌ／ウェル添加した。室温で１０〜１５分間のインキュベーション後、０．０５ｍｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して反応を停止した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ５．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデータ分析を行った。

凍結保存ラット肝細胞、解凍培地およびインキュベーション培地（ＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）製とした。１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ（Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ）基質、カタログ番号３４０２８はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）製とした。ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）、カタログ番号ＤＹ９９８はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ製とした。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）製とした。スプラーグ−ドーリーラット血漿（５％クエン酸ナトリウム抗凝固薬）はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）製とした。Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎプレート（カタログ番号６５５０６１）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を通して得た。

脱グリコシル化変異体：分子変異体を得る方法
野生型第ＶＩＩａ因子は２個のＮ−グリカン（Ｎ３２２およびＮ１４５）を有し、Ｖ１およびＶ２はそれぞれ４個のＮ−グリカン（Ｎ１０６、Ｎ１４５、Ｎ２５３、Ｎ３２２）を有する。Ｖ１およびＶ２に見られるさらに２個のＮ−グリカン（Ｎ１０６、Ｎ２５３）を、半減期を増加させるよう最初に設計した。本研究のために、これらの部位を野生型第ＶＩＩ因子の内因性アミノ酸配列（Ｔ１０６、Ｖ２５３）に戻すことによって、除去する。次いで、残りの２個の内因性Ｎ−グリカン部位（Ｎ１４５およびＮ３２２）を、これらの部位でのＮ→Ｑ変異における操作によってＤＮＡレベルで除去した。（図６）
野生型第ＶＩＩ因子をｐｍＣＭＶにクローニングしてｐＭＢ１１３を作成した。ａａ１４５または３２２位における単一のＮからＱへの変異を含有する挿入物ならびに二重変異体（ａａ１４５および３２２）を合成し、ＸｂａＩおよびＰｍｌＩ部位を用いてｐＭＢ１１３にクローニングしてクローンｐＭＢ１１４〜１１６を得た。次いで、Ｖ１およびＶ２のＧｌａドメインをコードする挿入物を、ＡｓｃＩおよびＡｆｅＩを用いてｐＭＢ１１３〜１１６にクローニングして、構築物ｐＭＢ１１７〜１２０（Ｖ１系変異体）およびｐＭＢ１２１〜１２４（Ｖ２系変異体）を得た。全ての構築物を配列確認した（ＭｃＬａｂ）。哺乳動物細胞（ＣＨＯ由来細胞系）を、６ウェルフォーマットで、電気穿孔を介して各構築物で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション４日後、上清を回収し、発現についてウエスタンブロット法によって、引き続いて、ｈＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ（ＡｓｓａｙＰｒｏ）およびＦＶＩＩ活性アッセイによってアッセイした。次いで、変異体のサブセットを単細胞クローニングした。ｐＭＢ１２１と呼ぶＶ２ ２−Ｎグリカン変異体を精製し、さらなる分析のために活性化した。

１０Ｌ ＷＡＶＥ発現からのＦＶＩＩａの精製／活性化の方法
方法の概要
数日にわたって行われる多段階プロセスを用いて、透析濾過した濃縮条件培地からのＦＶＩＩの精製および活性化を達成した。最初に、培地を解凍し、遠心分離して、凍結／解凍中に形成したかもしれない凝集体を除去する。ＣａＣｌ_２で溶出する陰イオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を使用した擬似アフィニティ（ｐｓｕｅｄｏａｆｆｉｎｉｔｙ）捕捉ステップを用いてＦＶＩＩタンパク質をさらに濃縮し、緩衝液を交換する。次に、ヒドロキシアパタイトカラムを用いてＦＶＩＩタンパク質をさらに精製する。次いで、より小型のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いて、ＦＶＩＩをｐＨ７．８〜８．２で溶液中２４時間活性化する前にさらに精製する。ｐＨを４．０に低下させることによって、活性化反応を停止する。最後に、ＦＶＩＩａを製剤緩衝液（ｐＨ６．５）に透析し、凍結保存する。

最終的な精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ａＳＥＣ、ＥＬＩＳＡ、糖分析（ｇｌｙｃｏａｎａｌｙｓｉｓ）、エンドトキシンおよびＦＶＩＩａ活性アッセイによって特性評価する。

ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ
Ｚｙｍｕｔｅｓｔ ＦＶＩＩ酵素結合免疫測定法（Ａｎｉａｒａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｏｈｉｏ）。ＥＬＩＳＡは、９６ウェルマイクロプレートのウェルに結合したウサギ抗ＦＶＩＩポリクローナル抗体を用いた２部位免疫測定法である。試料を導入し、引き続いて西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したウサギ抗ＦＶＩＩポリクローナル抗体を導入する。アッセイは製造業者の指示にしたがって行った。手短に言えば、試料および較正物質を、９６ウェル丸底ポリプロピレン希釈プレート中アッセイ緩衝液に希釈した。５０μＬアリコートの希釈試料を用意したウサギ抗ＦＶＩＩコーティングプレートに移し、室温で１５分間インキュベートした。２００μＬのＨＲＰ結合ウサギ抗ＦＶＩＩを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを用意した洗浄緩衝液３００μＬで５回洗浄した。ＴＭＢを２００μＬ／ウェルで添加し、室温でおよそ５分間インキュベートした。０．４５Ｍ硫酸５０μＬを導入することによって、反応を停止した。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。試料値を４パラメータ曲線当てはめを用いて作成したＶ２較正曲線と比較することによって、第ＶＩＩ因子レベルを得た。

第ＶＩＩ因子発色アッセイ
Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ発色アッセイ（Ａｎｉａｒａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｏｈｉｏ）を使用した。発色アッセイ原理は、試料の第ＶＩＩ因子および製造業者によって供給されたウサギトロンボプラスチン（組織因子）からなる酵素複合体の形成を伴う。過剰に添加したＦＸをＦＸａに活性化し、今度はこれがＦＸａ特異的発色基質（ＳＸａ−１１）を切断してｐＮＡを産生する。放出されたｐＮＡの量はＦＸａ活性に正比例する。アッセイは製造業者の指示にしたがって行った。手短に言えば、試料および較正物質を、９６ウェル丸底ポリプロピレン希釈プレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中トリスＢＳＡアッセイ緩衝液に希釈した。キット試薬、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ならびに９６ウェル平底ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を使用前に３７℃に加温した。試料および較正物質３０μＬを希釈プレートからアッセイプレートに移し、引き続いて、試薬Ｒ２ ３０μＬ、次いで試薬Ｒ１ ６０μＬを移した。アッセイプレートを混合し、ジルバプレート振盪装置（Ｂｏｅｋｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中３７℃で７分間インキュベートした。Ｒ３ ６０μＬを添加し、吸光度の変化率（４０５ｎｍ／分におけるＯＤの変化）を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて３７℃で測定した。試料値を４パラメータ曲線当てはめを用いて作成したＶ２較正曲線と比較することによって、第ＶＩＩ因子レベルを得た。

リン脂質依存性トロンビン産生アッセイ
野生型ＦＶＩＩａと比較して、Ｇｌａドメインの修飾（Ｐ１０Ｑ／Ｋ３２Ｅ）により、さらなるγ−カルボキシル化の結果としてＦＸ活性化、トロンビン産生、および陰イオン性リン脂質または活性化血小板の存在下での全血凝固の効力が増加する。ＰＬ依存性ＴＧＡを、陰イオン性リン脂質の存在下でのｒＦＶＩＩａ活性を測定するよう設計し、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ、ＢＶ製のトロンビン較正物質および基質試薬、ＦＬｕＣａキットを用いて行った。２０％ホスファチジルセリン（ＰＳ）、４０％ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）および４０％ホスファチジルコリン（ＰＣ）で構成されるリン脂質（ＰＬ）小胞は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ製とし、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）中１０分間の超音波処理によって調製した。

ＰＬ小胞（５００μＭ）またはトロンビン較正物質２０μＬを９６ウェルプレートに分配した。異なる濃度のｒＦＶＩＩａをヒトＨｅｍＡ血漿に希釈し、３連でＰＬ混合物に添加し、３７℃に１０分間平衡化した。ＦｌｕＣａ溶液を添加することによって、トロンビン産生反応を開始し、反応をＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ^ＢＶによって概説される較正自動トロンボグラフィ（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）法にしたがって６０分間連続的に監視した。トロンビン較正物質を用いてα_２−マクログロブリン活性について補正するＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ^ＢＶ（３．４．０）ソフトウェアを用いて、データを取得および分析した。分析パラメータ「ピーク高さ」は産生したトロンビンの最高レベルを表し、「内因性トロンビンポテンシャル」（ＥＴＰ）は産生したトロンビンの総量に相当していた。Ｐｒｉｓｍ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ）を用いた４パラメータ非線形曲線当てはめ法によってトロンビン産生パラメータを分析した。

リン脂質依存性ＦＸ活性化アッセイ
ＰＬ依存性ＦＸ活性化アッセイを用いて、ＦＶＩＩａが組織因子を含まないリン脂質小胞の存在下でＦＸを活性化する能力を測定した。第ＶＩＩａ因子またはＦＶＩＩａ変異体を、リン脂質小胞の存在下でＦＸと共にインキュベートする。Ｓ−２７６５、ＦＸａについての発色基質を添加することによって、ＦＸの活性化を測定する。手短に言えば、較正物質および試料をポリプロピレン丸底プレート中トリスＨＣｌ緩衝液に希釈する。４μｇ／ｍＬ ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）３０μＬを９６ウェル平底ポリスチレンプレートの全ウェルに添加し、引き続いて２０：４０：４０の重量％比のホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなるリン脂質小胞３０μＬを添加した。希釈試料および較正物質３０μＬをＦＸ／リン脂質混合物に移した。プレートを密閉し、穏やかに混合し、３７℃で２０〜２３時間インキュベートした。Ｓ−２７６５（ＤｉａＰｈａｒｍａ）の５ｍＭ溶液４０μＬを全ウェルに添加した。プレートを密閉し、３７℃で６時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍで吸光度を読み取った。試料のＦＸ活性化レベルをＦ７較正曲線と比較することによって、試料の活性を測定した。

ラットＰＫ試験動物、試験プロトコル（調製物の注入、血液および調製物のサンプリング、ＥＬＩＳＡ、データ分析、動物の屠殺）。

タンパク質（Ｆ７、Ｖ２、Ｖ１、ｄＶ２およびｄＶ１）を０．１ｍｇ／ｋｇでスプラーグドーリーラットに静脈内投与した。血漿試料を、投与１分後に始めて採取し、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡによって分析した。

ＨｅｍＡ−ＰＫ試験
タンパク質（Ｆ７、ｄＶ１）を１．０ｍｇ／ＫｇでＨｅｍＡマウスに静脈内投与した。血漿試料を、投与５分後に始めて採取し、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡおよびｓＴＦ−ＰＴアッセイによって分析した。

血漿試料に対するＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡ
材料
ＦＶＩＩａに対するモノクローナル抗体を使用した。１つのモノクローナル抗体をさらにビオチン化した。精製ＦＶＩＩａ変異体（野生型または脱シアリル化）をアッセイ較正物質およびアッセイ対照として使用する。ブロッキング緩衝液は３０ｍＭトリスｐＨ７．２、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ ２０中１％（ｗ／Ｖ）カゼインである。アッセイ希釈緩衝液（ＡＤＢ）は、０．１％（ｗ／ｖ）カゼイン、５０ｍＭトリスｐＨ７．２、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。アッセイ洗浄緩衝液はＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０である。免疫測定プレートはＧｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ高結合プレート（番号６５５０６１）である。ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製である。ＨＲＰ基質Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｉｅｒｃｅ製である。ブランクマウス血漿は商業的に（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）または社内供給源を通してＣＤ１またはＨｅｍＡマウスから得た。他の全ての材料（カゼイン、トリス、ＮａＣｌ、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ、硫酸）は試薬等級の品質のものである。

ＦＶＩＩａサンドイッチ免疫測定の方法
９６ウェルアッセイプレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの、ＦＶＩＩａに対する抗体０．１ｍｌ／ウェルでコーティングする。プレートを吸引し、回転させながら（１５０ｒｐｍ）室温で少なくとも２時間０．２ｍｌ／ウェルのブロッキング緩衝液でブロッキングする。ブロッキング後、ウェルを４×０．３ｍｌ／ウェルの洗浄緩衝液で洗浄する。ＦＶＩＩａ試料または標準をＡＤＢ中５％血漿の最終濃度に１：２０希釈し、回転させながら室温で少なくとも１．５時間０．１ｍｌ／ウェルでインキュベートする。全ての標準、対照および試料を３連ウェルで測定する。前記の通りプレートを洗浄した後、ＦＶＩＩａに対するビオチン化抗体をＡＤＢ中４２ｎｇ／ｍｌ、０．１ｍｌ／ウェルで添加し、プレートを回転させながら室温で少なくとも１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、引き続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ、ＡＤＢ中１：１０００と共にインキュベートし、回転させながら室温で少なくとも１時間インキュベートする。最終的なプレート洗浄後、ウェルを０．１ｍｌ／ウェルのＵｌｔｒａ−ＴＭＢで展開し、０．０５ｍｌ／ウェルの２Ｍ硫酸を用いて反応を停止する。停止した反応物をＯＤ−４５０ｎｍで読み取り、データを分析および較正する。アッセイについての定量下限値（ＬＬＯＱ）は、典型的には１００％血漿中１５〜３０ｎｇ／ｍｌのＦＶＩＩａである。

ｒＦＶＩＩａ活性を測定するための可溶性組織因子（ｓＴＦ）に基づく修正ＰＴアッセイ
プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを行って、ＨｅｍＡマウスエキソビボ血漿試料中のヒトｒＦＶＩＩａの活性を測定した。

手短に言えば、ａＰＴＴ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５ＭトリスｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ）中１０％のＨｅｍＡマウス血漿および５０％のヒトＦＶＩＩ欠乏血漿（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｉｎｃ）を含有する試料５０μＬをｓＴＦ−ＰＴ試薬５０μＬと混合し、３７℃で３０秒間インキュベートした。ｓＴＦ−ＰＴ試薬は１体積の２μＭ組換えヒト可溶性ＴＦ（ｓＴＦ_{１−２２１}）および１体積の８μＭリン脂質小胞（ＰＳ^２０：ＰＣ^４０：ＰＥ^４０）で構成されていた。２５ｍＭのＣａＣｌ_２ ５０μＬを添加することによって凝固を開始し、凝固時間をＳＴＡ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ Ｉｎｃ）で記録した。標準は、２００から０．７８ｎｇ／ｍＬまで２倍連続希釈したｒＦＶＩＩａ（ｗｔ−ｒＦＶＩＩまたは修飾ｒＦＶＩＩａ変異体）からなっていた。

血友病Ａ（ＨｅｍＡ）マウスにおける脱シアリル化Ｖ２の有効性
急性尾切断有効性試験
失血量を測定するために、マウスをイソフルランで麻酔し、尾を１５ｍｌプラスチックチューブ中３７〜３８℃に加温した０．９％生理食塩水に１０分間入れた。尾をメスによって先端から４ｍｍで切断し、直ちに生理食塩水１０ｍｌを含有する別の予め加温した１５ｍｌプラスチックチューブに戻し入れた。マウスを４０分にわたって自由に出血させた。脱シアリル化Ｖ２およびＦ７を、尾切断損傷の５分後または１５分および３０分前に静脈内投与した。血液回収前後のチューブを秤量することによって重量測定で失血量を定量化した。

尾静脈切断有効性（ＴＶＴ）試験
ＨｅｍＡマウスに、尾静脈切断損傷の１時間前または５分後に尾静脈注射によって脱シアリル化Ｖ２またはＦ７を投与した。適切な麻酔を使用した。尾静脈を１１番メスの直線刃を用いて切断し、タイマーを開始した。次いで、マウスを４×８インチ加熱パッドの上部に置かれた白色紙寝具（Ｖｅｒｓｉ−Ｄｒｉ（商標））を含む個々の清潔なケージに戻した。動物の活動状態を次の９時間にわたって１時間毎におよび２４時間の時点で監視した。活動レベル低下の兆候を示したマウスを監視フォームに書き留め、過剰な失血の兆候を示したマウスを直ちに安楽死させた。

ＨｅｍＡマウス血漿におけるトロンビン−抗トロンビン（ＴＡＴ）アッセイ
試薬：
（１）捕捉抗体：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＴＡＴ−ＥＩＡ−Ｃの抗トロンビンポリクローナル抗体；（２）検出抗体：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＴＡＴ−ＥＩＡ−ＤのＨＲＰ抱合抗ＡＴ−ＩＩＩポリクローナル抗体、（３）アッセイ希釈液：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＴＡＴ−ＥＩＡ−Ｄ、（４）ＨＲＰ基質：Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２２１６、（５）α−トロンビン：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＨＴ−１００２ａ、−８０℃で保管、（６）ＡＴ−ＩＩＩ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、カタログ番号ＨＡＴ、−８０℃で保管、（７）ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−７０３０；（８）ＡＴ−ＩＩＩ欠乏血漿：Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓから購入、カタログ：ＡＴ−ＤＰ、−８０℃で保管。

緩衝液
（１）ＴＡＴ標準緩衝液：２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５Ｕ／ｍｌヘパリン；（２）コーティング緩衝液：１錠剤の重炭酸塩＋１００ｍｌ ｄＨ２０、４℃で保管；（３）ブロッキング緩衝液：２％ＢＳＡ−ＰＢＳ；（４）試料希釈緩衝液：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加、濾過および分割し、−２０℃で保管；（５）基質緩衝液：５ｍｇ／ｍＬ Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ５０μＬ、３％Ｈ２Ｏ２ ２０μｌをＰＢＳ緩衝液に添加する。混合し、プレートに添加する前に新たに調製する；（６）１μＭ ＴＡＴ標準ストックの調製：１．３６ｍｇ／ｍｌのヒトＡＴ−ＩＩＩ １００μＬおよび３．２８ｍｇ／ｍＬのヒトトロンビン５．９３μＬをＴＡＴ緩衝液４１９μＬに添加し、混合し、３７℃で１０〜２０分間インキュベートする；（７）６０ｎＭ ＴＡＴ標準ストックの調製：１μＭ ＴＡＴ複合体５０μＬをＡＴ−ＩＩＩ欠乏血漿７８３μＬに添加し、混合する。５０μＬ／バイアルに分割し、−８０℃で保管する。

アッセイ手順
１．抗トロンビンｐＡｂ（捕捉抗体）を重炭酸塩緩衝液に希釈する（１：１００希釈：１つの９６ウェルプレートについて、抗体１１０μＬを重炭酸塩緩衝液１１ｍＬに添加する）。

２．希釈コーティング抗体１００μＬを２ＨＢ Ｉｍｍｕｌｏｎ ９６ウェルプレート上の各ウェルに添加する。プレートを穏やかに叩いて確実に全ての液体がプレートの底を覆うようにする。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートする。

３．自動プレート洗浄機において３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

４．ブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ−ＰＢＳ）１５０μＬを各ウェルに添加する。プレートを密閉し、室温で１．５時間インキュベートする。

５．自動プレート洗浄機を用いて３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

６．標準、試料およびＱＣ１００μＬを各ウェルに３連で添加し、プレートを室温で２時間室温でインキュベートする。

７．自動プレート洗浄機を用いて３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

８．ＨＲＰ−検出抗体１００μＬ（１／１００、抗体１１０μＬを抱合体希釈液１１ｍＬに添加する）を各ウェルに添加する。プレートを密閉し、室温で１時間インキュベートする。

９．自動プレート洗浄機を用いて３００μＬ洗浄緩衝液で４回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを反転させ、清潔なペーパータオルに軽く叩きつける。

１０．Ａｍｐｌｅｘ Ｒｄ基質７０μＬ（新たに調製）を各ウェルに添加する。

１１．プレートを室温で暗所に置き、１５〜３０分間インキュベートする。

１２．ＯＤ４８５ｎｍ／５９５ｎｍでプレートを読み取る。

１３．標準を４パラメータ曲線当てはめでプロットする；対照および各試料の濃度を各ＥＬＩＳＡプレートの標準から計算した。

凝固能力のあるマウスにおける脱シアリル化Ｖ２の有効性
急性尾切断試験を行って凝固能力のあるマウスにおけるｄＶ２の有効性を測定した。凝固能力のあるマウスをイソフルランで麻酔し、尾を１５ｍｌプラスチックチューブ中３７〜３８℃に加温した０．９％生理食塩水に１０分間入れた。５ｍｇ／ｋｇ組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の静脈内投与後、尾をメスによって先端から５０ｍｍで切断し、生理食塩水１０ｍｌを含有する別の予め加温した１５ｍｌプラスチックチューブに戻し入れた。脱シアリル化Ｖ２およびＦ７を尾切断損傷直後に静脈内投与した。マウスを４５分にわたって自由に出血させた。血液回収前後のチューブを秤量することによって重量測定で失血量を定量化した。

結果
脱シアリル化または脱グリコシル化タンパク質のインビトロ特性評価
ｄＶ２の重鎖をＬＣ−ＴＯＦ ＭＳによって分析した。分析により、重鎖上のＮ−グリカンがシアリダーゼ処理後にシアル酸を含有していないことが示された。軽鎖に対するこのような分析は、Ｇｌａドメインの存在によって困難にされた。処理分子のシアル酸含量の全般的な状況を得るために、シアル酸蛍光標識を行った。この方法により、シアル酸の９９．９％超が脱シアリル化プロセス中にＶ２上で除去されることが示された。図７は、シアル酸含量についての脱シアリル化Ｖ２の分析を示している。ＬＣ−ＴＯＦ ＭＳ分析およびシアル酸蛍光標識を利用した。シアル酸含量分析をｄＶ１に対しても同様に行うと同様の結果が得られた（データ不掲載）。脱シアリル化分子を、リン脂質依存性Ｘａ活性化とリン脂質依存性ＴＧＡアッセイの両方によって活性について試験した。ＰＬ−ＸａおよびＰＬ−ＴＧＡアッセイにより、脱シアリル化後のタンパク質の活性が低下しないことが証明された（図９および図１０参照）。図９は、脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ−ＦＸａ活性化アッセイを示している。脱シアリル化Ｖ１およびＶ２（ｄＶ１、ｄＶ２）を、リン脂質ＦＸａ活性化アッセイを用いて活性について試験した。両脱シアリル化タンパク質が、このアッセイでその未修飾親分子と比較してわずかに高い活性を有した。図１０は、脱シアリル化タンパク質に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイを示している。ＰＬ−ＴＧＡによって、ｄＶ２およびｄＶ１は、その未修飾親分子に対してわずかに増加した活性を示した。結果をＦ７に正規化した。

ＰＬ−Ｘａアッセイにより、その未修飾親分子に対するｄＶ２およびｄＶ１の活性の測定可能な増加が一貫して示された。ヒポグリコシル化ｗｔＦＶＩＩａ、Ｖ２およびＶ１分子を発現させ（図１１）、発現と活性の両方について粗製発現抽出物として試験した。図１１は、ヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の発現を示している。電気穿孔４日後の培地試料をＦＶＩＩ発現について分析した。抗Ｇｌａドメイン抗体を用いたウエスタンブロット解析は、変異体の発現を示している。Ｎ−グリカン部位の除去は、発現レベルについて正規化すると活性に影響を及ぼすように見えなかった。図１２は、トランスフェクション上清を用いたヒポグリコシル化ＦＶＩＩ変異体の「特異的活性」の測定を示している。ヒポグリコシル化変異体の２つの一過性トランスフェクションからの粗製発現上清の活性をＸａ活性化アッセイによって分析した。ＥＬＩＳＡによって測定される発現について正規化すると、Ｎ−グリカン除去の結果としての活性の低下は認められなかった。このアッセイで予想されるように、Ｖ１およびＦ７タンパク質は類似の活性を有する一方で、Ｖ２分子はそのＴＦ非依存性の結果である低い活性を有していた。このことは、ｐＭＢ１２１と呼ばれる２個のＮ−グリカン（Ｎ３２２およびＮ１４５）のみを有する精製ヒポグリコシル化Ｖ２に対して行ったＰＬ−ＴＧＡ活性アッセイによってさらに証明された。図１３は、精製したヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１に対するＰＬ−ＴＧＡアッセイを示している。ＰＬ−ＴＧＡアッセイによって、ｐＭＢ１２１２は未修飾Ｖ２と同様にＦ７に対して増強した活性を示す。これらの分子のインビトロクリアランスを肝細胞クリアランスモデルで試験した。ｄＶ２はこのモデルで未修飾Ｖ２に対して有意なクリアランスを証明した（図１４）一方で、ヒポグリコシル化変異体についてはクリアランスの増加がほとんどまたは全く見られなかった（図１５）。

ラットＰＫおよびＨｅｍＡ ＰＫ
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態試験により、脱シアリル化およびヒポグリコシル化タンパク質がＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡによって測定されるようにその未修飾対応物よりも有意に速く排除された。図１６は、ラット薬物動態結果を示している。脱シアリル化Ｖ２およびＶ１の半減期は、ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡによって測定されるようにスプラーグドーリーラットにおいてその未修飾親分子よりも有意に短かった。これは、脱シアリル化Ｖ２、脱シアリル化Ｖ１およびｐＭＢ１２１（ヒポグリコシル化Ｖ２）も同様であった。両脱シアリル化分子についてのｔ１／２は１分未満であった一方で、その親タンパク質のｔ１／２はおよそ２．５時間であった。ヒポグリコシル化Ｖ２分子ｐＭＢ１２１のクリアランスは、１．６時間のｔ１／２を有するＦ７のクリアランスと同等であった。ＨｅｍＡマウスにおけるＰＫ試験は、それぞれおよそ３分および２．６時間の半減期を有するｄＶ２およびＦ７と同様の結果を有した（図１７（Ａ））。ｓＴＦ−ＰＴＴ凝固アッセイによって短い半減期が確認された（図１７（Ｂ））。図１７は、ＨｅｍＡ ＰＫ結果を示している。脱シアリル化Ｖ２の半減期は、ＨｅｍＡマウスにおいて、Ａ）ＦＶＩＩ ＥＬＩＳＡおよびＢ）ｓＴＦ−ＰＴアッセイによって測定されるように、その未修飾親分子よりも有意に短かった。

ＨｅｍＡ有効性モデル
ｄＶ２を有効性についてＨｅｍＡマウスで試験した。ＨｅｍＡ尾切断モデルを用いると、ｄＶ２は１ｍｇ／ｋｇの用量で（ボーラス、静脈内）効果的であることが示された。比較して、このモデルでは、Ｆ７の効果的な用量は２．５ｍｇ／ｋｇ（ボーラス、静脈内）であった。これらの結果により、ｄＶ２がＦ７よりも効果的であることが証明される（図１８（Ａ））。このモデルを利用してｄＶ２の有効性がＦ７の有効性よりも速く消滅することも示された（図１８（Ｂ））。図１８は、ＨｅｍＡマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験の結果を示している。ｄＶ２を用いた試験により、この分子が、ＨｅｍＡ尾切断モデルにおいて、Ｆ７よりもＡ）効果的でありかつＢ）速い有効性クリアランスを有することが示される。

より感受性のＴＶＴモデルを用いると、Ｆ７に対するｄＶ２のより速い有効性クリアランスも証明され、効果的な用量が確認された。図１９は、ＴＶＴ ＨｅｍＡモデルにおけるｄＶ２有効性試験を示している。より高い感受性を有する有効性モデル（ＴＶＴ）を用いたＴＶＴ試験により、ｄＶ２がＦ７よりも速い有効性クリアランスを有することが確認された。ＨｅｍＡマウスへの投与３０分後および６０分後に行った血栓形成性のマーカーとしてのトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）測定により、ｄＶ２について有意に低いレベルが示された。図２０はＴＡＴ測定を示している。ＨｅｍＡマウスでは、効果的な用量（１ｍｇ／ｋｇ）で投与したｄＶ２が、効果的な用量のＦ７（２．５ｍｇ／ｋｇ）よりも少ないトロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）を産生した。このデータは、有効性データと合わせて、ｄＶ２がＦ７よりも好都合な治療指数を有することを示唆しているだろう。

凝固能力のあるマウスにおける有効性
ｄＶ２を、有効性について、ｔＰＡ処理した凝固能力のあるマウスで試験した。尾切断モデルを用いると、ｄＶ２は０．３〜１ｍｇ／ｋｇの用量で（ボーラス、静脈内）効果的であることが示された。比較して、このモデルでは、Ｆ７の効果的な用量は５ｍｇ／ｋｇ（ボーラス、静脈内）であった。これらの結果により、ｄＶ２がＦ７よりも効果的であることが証明される（図２１）。図２１は、ｔＰＡ処理した凝固能力のあるマウスにおける脱シアリル化Ｖ２有効性試験の結果を示している。

脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）のクリアランスおよび有効性
脱シアリル化野生型第ＶＩＩ因子（ｄＷＴ ＶＩＩａ）を、出発第ＶＩＩ因子材料としてＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから得たＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）を用いて、かつ上記のように可溶性シアリダーゼ酵素を用いて出発ポリペプチドを脱シアリル化することによって上記のように産生した。ｄＷＴ ＶＩＩａは、９９％超の純度、低いエンドトキシンを有し、検出可能なシアル酸を有さないことが分かった。さらに、質量分析により、シアル酸の選択的除去が示された。

このｄＷＴ ＶＩＩａ材料の活性を、上記のＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ発色アッセイおよび修正ＰＴアッセイを用いて分析し、野生型第ＶＩＩ因子と比較した。これらの分析の各々により、ｄＷＴ ＶＩＩａが野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチドとほぼ同一の活性を有することが示された。

ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子（１ｍｇ／ｋｇ）のクリアランスも、ヒト組織因子ノックイン（ＴＦＫＩ）マウスのマウスモデルを用いて分析および比較した。図２２に示されるように、ｄＷＴ ＶＩＩａの半減期は野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に短く、クリアランス（ｍｌ／時間／ｋｇ）は４０倍速かった。

上記のＴＦＫＩマウスおよび尾切断法を用いて、野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ ＶＩＩａの有効性を調査した。手短に言えば、５ｍｇ／ｋｇのｔＰＡをマウスに静脈内注射し、引き続いて尾の先端から５０ｍｍを切り落とした。次いで、野生型第ＶＩＩ因子（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標））またはｄＷＴ ＶＩＩａを１〜６ｍｇ／ｋｇに及ぶ投与量で静脈内注射した。次いで、血液を４５分間尾から採取し、不安定な血餅を採取期間全体にわたって６分毎に破壊した。図２３に示されるように、驚くべきことにｄＷＴ ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子よりも有意に効果的であることが分かった。より具体的には、６ｍｇ／ｋｇ用量の野生型第ＶＩＩ因子と比較して、３ｍｇ／ｋｇ用量のｄＷＴ ＶＩＩａにより失血減少が引き起こされた。この分析の結果を仮定すると、２ｍｇ／ｋｇのｄＷＴ ＶＩＩａが６ｍｇ／ｋｇの野生型第ＶＩＩ因子と生物学的同等用量であると決定された。

ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））が全身性凝固を引き起こす能力も上記トロンビン抗トロンビン（ＴＡＴ）法によって調査した。マウスを生物学的同等用量のｄＷＴ ＶＩＩａ（２ｍｇ／ｋｇ）および野生型第ＶＩＩ因子（６ｍｇ／ｋｇ）で処理し、次いで、ＴＡＴ複合体の形成をＥＬＩＳＡによって測定した。図２４に示されるように、野生型ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）第ＶＩＩ因子は、ｄＷＴ ＶＩＩａよりも有意に高いレベルのＴＡＴを産生した。ｄＷＴ ＶＩＩａがベースラインＴＡＴレベルのみを産生したという事実を仮定すると、この実験は、ポリペプチドが野生型第ＶＩＩ因子と同じくらい効果的であるという事実にもかかわらず、この用量のｄＷＴ ＶＩＩａが観察可能な全身性凝固をもたらさないことを示唆している。

さらに、ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））が血栓形成を引き起こす能力もＦｅＣｌ_３血栓症モデルで調査した。マウスを血栓症試験の開始１５分前に生物学的同等用量のｄＷＴ ＶＩＩａ（２ｍｇ／ｋｇ）および野生型第ＶＩＩ因子（６ｍｇ／ｋｇ）で処理した。次いで、３．２５％ＦｅＣｌ_３溶液の投与によって血栓症を開始し、次いで、血栓形成をドップラーによって３０分間測定した。得られた血流データを血流対時間のグラフにプロットし、次いで、対照試料についての曲線下の面積の百分率を計算して、第ＶＩＩ因子処理群の各々について血栓形成によって引き起こされた血流の低下を決定した。図２５に示されるように、野生型ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）第ＶＩＩ因子は、血流の有意な減少（平均ほぼ４０％）をもたらした一方で、ｄＷＴ ＶＩＩａは血流の低下をほぼ示さなかった（平均＞９０％）。この実験により、所与の用量のｄＷＴ ＶＩＩａは、野生型第ＶＩＩ因子と比較して大いに減少した血栓形成をもたらすことが証明された。

野生型第ＶＩＩ因子と比較したｄＷＴ ＶＩＩａの活性および有効性を、ＳＮ−１７ｃトリペプチド蛍光原基質（ＨＴＩ）を用いて、これらのペプチドの可溶性組織因子（ｓＴＦ）に対する見かけの結合親和性を調べることによってさらに調査した。図２６に示されるように、この分析により、ｄＷＴ ＶＩＩａ（ｄＦ７）および野生型第ＶＩＩ因子（Ｆ７）が同等のｓＴＦに対する見かけの結合親和性を有することが証明された。しかしながら、図２７に示されるように、ｓＴＦ−第ＶＩＩ因子複合体（０．５ｍＭ 第ＶＩＩ因子［ｄＷＴ ＶＩＩａまたは野生型］、１２５ｎＭ ｓＴＦ）の存在下で第Ｘ因子濃度を滴定することによって、これらのペプチドが第Ｘ因子を活性化する能力を調べる実験モデルでは、ｄＷＴ ＶＩＩａおよび野生型第ＶＩＩ因子についてのミカエリスメンテン型反応速度論により、ｄＷＴ ＶＩＩａ（ｄＦ７）が野生型第ＶＩＩ因子（Ｆ７）よりも有効に（およそ２倍）第Ｘ因子を活性化することができることが証明される。このデータは、ｄＷＴ ＶＩＩａがその野生型対応物よりも１つの第ＶＩＩ因子活性部位当たり多くの第Ｘ因子を第Ｘａ因子に変換することができることを示唆している。

考察
急性出血の治療に効果的であるが、血栓形成性が低下した治療薬を開発する未だ対処されていない医学的必要性が存在する。半減期が短い効果的な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、急性出血に使用するのに適したより大きな治療窓を有する分子を潜在的にもたらすだろう。

Ｖ２およびＶ１は２つの第ＶＩＩａ因子変異体である（図１〜図３）。これらの変異体は、活性化血小板に対する親和性を増加させ、Ｖ２の場合には、組織因子非依存性をもたらすＧｌａドメインの変異を含有する。両変異体はさらに２個のＮ−グリコシル化部位も有し、これにより野生型第ＶＩＩａ因子と比較して延長した半減期、血友病の治療に有利な形質がもたらされる。しかしながら、急性出血のための治療剤としてのその使用は、半減期の減少から利益を得るだろう。この修正により、オフターゲットの効果のリスクが低下し、結果として、その治療指数が増加するだろう。本発明者らは、ここで、Ｖ２およびＶ１の炭水化物鎖上に存在するシアル酸の除去により、インビトロ肝細胞クリアランスモデルにおいて分子の有意に速いクリアランスがもたらされることを示した。ヒポグリコシル化変異体はインビトロモデルではこれで速く排除されなかったが、このことは脱シアリル化分子とヒポグリコシル化分子との間のクリアランスの機構が異なることを示唆している。スプラーグドーリーラットで行ったインビボ試験により、脱シアリル化分子（ｄＶ２およびｄＶ１）ならびにヒポグリコシル化変異体ｐＭＢ１２１が有意に減少した半減期を有することが証明された。興味深いことに、脱シアリル化Ｖ２とＶ１の両方が、脱シアリル化野生型ＦＶＩＩａについて報告されている速度と比較して増加したクリアランス速度（Ａｐｐａら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １０４．２／２０１０）、そのさらに２個のＮ−グリカンにより得る特徴を有していた。この活性についての１つの可能な理論は、本明細書で主張されるものに限定されないが、これらの余分なＮ−グリカンが、脱シアリル化されて、ＡＳＧＰＲまたは類似の受容体のための追加のリガンドとなり、より速いクリアランスを媒介するというものである。これらの分子の活性は、インビトロ活性アッセイによって測定されるように、その親分子と比較して保持されたまたは増加した。ｄＶ２のより速いクリアランスは、ＨｅｍＡマウスＰＫ試験においてインビボでさらに検証され、ＨｅｍＡ尾切り落としおよびＴＶＴ試験において効果的であることが示された。

さらに、野生型第ＶＩＩ因子の脱シアリル化によって、野生型よりもずっと急速に消滅する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが産生された一方で、多数の実験モデルにおいて示されるように有効性が増加するという驚くべき結果も提供された。

第ＶＩＩａ因子または第ＶＩＩａ因子変異体のＮ−グリカンの除去またはＮ−グリカンの単糖組成の修正により、より速く消滅する分子が得られる。これらの分子はインビボで活性を保持し効果的である。これらの速く消滅する第ＶＩＩ ａ因子分子の開発は、急性出血性適応症の治療に有益であるのみならず、潜在的に市場の種々の抗凝固薬の解毒薬となるだろう。

Claims (6)

1. 血餅形成が望ましい疾患または障害を有する哺乳動物を治療するための医薬の製造における、Ｎ結合型グリカンに対する抱合型シアル酸のモル比が１．０未満である第ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用。
2. 前記疾患または障害が、出血、胃腸出血、制御されない出血、移植または切除または手術を受けている哺乳動物の出血、静脈瘤出血、血小板減少症、血友病、頭蓋内出血、大動脈瘤、および抗凝固薬の過剰投与からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
3. 前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、配列番号１６の野生型ヒト第ＶＩＩ因子アミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、配列番号１６に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、該第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子活性を有する、請求項１または２に記載の使用。
5. Ｎ結合型グリカンに対する抱合型シアル酸のモル比が０．０５未満である、請求項１に記載の使用。
6. Ｎ結合型グリカンに対する抱合型シアル酸のモル比が０．１未満である、請求項１に記載の使用。

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