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JP6559266B2 - ウイルスポリメラーゼを阻害するための組成物および方法 - Google Patents

ウイルスポリメラーゼを阻害するための組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、２０１２年４月１８日に出願された、米国仮特許出願第６１／６２５９９４号への優先権の恩恵を主張するものである。
本発明は、ウイルスポリメラーゼを阻害するための組成物および方法に関する。
ウイルスは、哺乳類および特にヒトを含む動物における多くの感染病の原因である。細菌の感染とは異なり、ウイルス感染の予防と治療に効果的な薬剤は比較的数少ない。ウイルスゲノム転写、翻訳、および複製を含むウイルス感染の生態学は、今ではよく理解されている。ＲＮＡ含有ウイルスにおいて、重要な酵素は、ウイルスゲノム複製に関与するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、マイナス鎖ＲＮＡを有するＤＮＡ段階のない、ＲＮＡ含有ウイルスのゲノムにおいてコード化された必須タンパク質である。この酵素は、所定のＲＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡ鎖の合成を触媒する。ウイルスの複製はＲＮＡポリメラーゼに依存するので、この酵素は、新たな抗ウイルス性化合物の開発における見込みのある標的である。
本発明は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼの活性またはウイルスの複製の阻害に使用するための、およびウイルス感染を治療するための、その薬学的に許容される塩を含む、式Ｉの化合物を提供する。この化合物は、一部には、特に、具体的には経口投与を含む腸内投与と併せた、活性薬剤成分に関する好ましい薬物動態により特徴付けられる。本発明は、式Ｉの１種類以上の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物、並びにそれを調製する方法も提供する。ウイルスＲＮＡポリメラーゼの活性、ウイルスの複製を阻害する方法、およびウイルス感染を治療する方法も提供される。
図１は、ラットへの化合物１２ｉ（三角、対照）および化合物３０ｆ（丸、実験）の単回投与での経口投与後の化合物１２ｉの血漿薬物動態を示すグラフである。グループ当たりＮ＝４。 図２は、黄熱病ウイルスに感染したハムスターの生存への化合物１２ｉ（ＤＭＰＤ１）の影響を示すグラフである。**、プラセボと比較してＰ＜０．０１。***、プラセボと比較してＰ＜０．００１。ｄｐｉ、感染後の日数。
本発明の態様は、式Ｉにより表される化合物、またはその薬学的に許容される塩：
であり、
式中、
式Ｉにより表される化合物が、
ではないという条件で、
Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3、Ｌ4、Ｌ5、およびＬ6の各々は、独立して、結合または−Ｃ（Ｒ0）2−Ｏ−リンカーであり；
Ｒ0は、各発生毎に独立して、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3の各々は、独立して、Ｈ、アミノアシル、アミノチオニル、アシル、Ｒ10ＯＣ（Ｏ）−、ホスホリル、およびアミノホスホリルからなる群より選択され；あるいは、Ｒ1およびＲ2は一緒になって、またはＲ2およびＲ3は一緒になって、カルボニル、チオカルボニル、ホスホリル、および（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルホスホリルからなる群より選択され；
Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の各々は、独立して、Ｈ、アシル、ホスホリル、アルキルチオ、Ｒ10ＯＣ（Ｏ）−、およびアミノアルキルからなる群より選択され；
Ｒ7はＨであり；またはＲ6、Ｒ7、およびそれらが結合した窒素は一緒に、−Ｎ＝ＣＲ20Ｒ21を表し；
Ｒ10は、各発生毎に独立して、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキルからなる群より選択され；
Ｒ20およびＲ21の各々は、独立して、Ｈ、アルキル、アミノ、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキルからなる群より選択される。
特定の実施の形態において、式Ｉの化合物は、式ＩＡにより表される化合物、またはその薬学的に許容される塩：
である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ1−Ｒ1はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ2−Ｒ2はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ3−Ｒ3はＨである。
あるいは、上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ2−Ｒ2およびＬ3−Ｒ3は同一である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ2−Ｒ2およびＬ3−Ｒ3の各々はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ1−Ｒ1およびＬ3−Ｒ3は同一である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ1−Ｒ1およびＬ2−Ｒ2は同一である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ1−Ｒ1およびＬ2−Ｒ2の各々はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ1−Ｒ1およびＬ3−Ｒ3の各々はＨである。
あるいは、上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｌ1−Ｒ1、Ｌ2−Ｒ2、およびＬ3−Ｒ3は同一であり、Ｌ1−Ｒ1、Ｌ2−Ｒ2、およびＬ3−Ｒ3のいずれもＨではない。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、各発生毎に独立して、アミノアシルは、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（ＮＨ2）（ＣＨ2）nＣＨＲ30Ｒ31であり、式中、ｎは０または１であり；Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキルからなる群より選択される。
特定の実施の形態において、Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、Ｈおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群より選択される。
特定の実施の形態において、Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである。
特定の実施の形態において、ｎは０であり、Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、メチルである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、各発生毎に独立して、アミノチオニルは、−Ｃ（＝Ｓ）ＣＨ（ＮＨ2）（ＣＨ2）nＣＨＲ30Ｒ31であり、式中、ｎは０または１であり；Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキルからなる群より選択される。
特定の実施の形態において、Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、Ｈおよび（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルからなる群より選択される。
特定の実施の形態において、Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである。
特定の実施の形態において、ｎは０であり、Ｒ30およびＲ31の各々は、独立して、メチルである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、各発生毎に独立して、アシルは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ40であり、式中、Ｒ40は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキルからなる群より選択される。
特定の実施の形態において、Ｒ40はＨである。
特定の実施の形態において、Ｒ40は（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、各発生毎に独立して、Ｒ10はＨである。
あるいは、上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、各発生毎に独立して、Ｒ10は（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、各発生毎に独立して、アミノホスホリルは、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ50）ＮＲ51Ｒ52であり、式中、
Ｒ50は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、および−（ＣＨ2）mＳＣ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＯＨからなる群より選択され；
ｍは１または２であり；
Ｒ51はＨまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ52は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、および−ＣＲ60Ｒ61Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ62からなる群より選択され、式中、
Ｒ60およびＲ61の各々は、独立して、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルであり；
Ｒ62は、Ｈ、（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルからなる群より選択される。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ50はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ50はアリールである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ50は−（ＣＨ2）mＳＣ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ3）2ＣＨ2ＯＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、ｍは２である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ51はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ52はアラルキルである。
あるいは、上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ52は−ＣＲ60Ｒ61Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ62である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ60はＨであり、Ｒ61は（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルであり、Ｒ62は（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである。
特定の実施の形態において、式Ｉの化合物は、式ＩＢにより表される化合物、またはその薬学的に許容される塩：
である。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ7はＨであり、Ｌ4、Ｌ5、およびＬ6の各々は結合であり、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6のいずれか２つの各々はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ4およびＲ5の各々はＨである。
あるいは、上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ5およびＲ6の各々はＨである。
あるいは、上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ4およびＲ6の各々はＨである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6のいずれかのＲ10ＯＣ（Ｏ）−のＲ10は、Ｈまたは（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6のいずれかのアミノアルキルは−ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）2である。
特定の実施の形態において、Ｌ4、Ｌ5、およびＬ6の各々は結合であり、Ｒ6、Ｒ7、およびそれらが結合した窒素は一緒に、−Ｎ＝ＣＲ20Ｒ21を表す。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ20はＨであり、Ｒ21はアミノである。
上述したもののいずれか１つによる特定の実施の形態において、Ｒ4およびＲ5の各々はＨである。
あるいは、特定の実施の形態において、Ｒ7はＨであり、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6の少なくとも１つは−Ｃ（Ｒ0）2−Ｏ−リンカーであり、この少なくとも１つの−Ｃ（Ｒ0）2−Ｏ−リンカーに結合したＲ4、Ｒ5、またはＲ6のいずれかはホスホリルである。
定義
ここに用いた「アルキル」という用語は、専門用語であり、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を称する。特定の実施の形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、主鎖に約３０以下の炭素原子（例えば、直鎖についてはＣ1〜Ｃ30、分岐鎖についてはＣ3〜Ｃ30）、あるいは、約２０以下の炭素原子を有する。同様に、シクロアルキルは、その環構造に約３から約１０の炭素原子、あるいは、その環構造に約５、６または７の炭素原子を有する。
「アミノ」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、未置換および置換アミン、例えば、一般式：
により表される部分を称し、式中、Ｒa、Ｒb、およびＲcの各々は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、−（ＣＨ2）x＝Ｒdを表し、またはＲaおよびＲbは、それらが結合したＮ原子と一緒になって、環構造に４から８の原子を有する複素環を完成し、Ｒdは、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリルまたはポリシクリルを表し、ｘはゼロまたは１から８の範囲の整数である。特定の実施の形態において、ＲaまたはＲbの一方のみがカルボニルであってよく、例えば、Ｒa、Ｒbおよび前記窒素が一緒になってイミドを形成しない。他の実施の形態において、ＲaおよびＲb（および必要に応じてＲc）の各々は、独立して、水素、アルキル、アルケニル、または−（ＣＨ2）x−Ｒdを表す。
「アシル」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、形態ＲＣＯ−の任意の基またはラジカルを称し、式中、Ｒは任意の有機基、例えば、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、およびヘテロアラルキルである。代表的なアシル基としては、アセチル、ベンゾイル、およびマロニルが挙げられる。
ここに用いた「アミノアルキル」という用語は、１つ以上のアミノ基で置換されたアルキル基を称する。
「アミノアシル」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、１つ以上のアミノ基により置換されたアシル基を称する。
ここに用いた「アミノチオニル」という用語は、ＲＣ（Ｏ）−のＯが、硫黄により置換され、それゆえ、形態ＲＣ（Ｓ）−のものであるアミノアシルの類似体を称する。
「ホスホリル」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、一般に、式：
により表され（式中、Ｑ５０はＳまたはＯを表し、Ｒ５９は、水素、低級アルキルまたはアリール）、例えば、−Ｐ（Ｏ）（ＯＭｅ）−または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2であってよい。例えば、アルキルを置換するために使用される場合、ホスホリルアルキルのホスホリル基は、一般式：
により表され（式中、Ｑ５０およびＲ５９の各々は、独立して、先に定義されており、Ｑ５１は、Ｏ、ＳまたはＮを表す）、例えば、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＭｅまたは−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2であってよい。Ｑ５０がＳである場合、ホスホリル部分は「ホスホロチオエート」である。
ここに用いた「アミノホスホリル」は、ここに定義されるような少なくとも１つのアミノ基により置換されたホスホリル基、例えば、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＮＭｅ2を称する。
ここに用いた「カルボニル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）−を称する。
ここに用いた「チオカルボニル」という用語は、−Ｃ（Ｓ）−を称する。
ここに用いた「アルキルホスホリル」という用語は、ここに定義されるような少なくとも１のアルキル基により置換されたホスホリル基、例えば、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｍｅを称する。
ここに用いた「アルキルチオ」という用語は、アルキル−Ｓ−を称する。
「アリール」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、単環、二環および多環芳香族炭化水素基、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、およびピレンを称する。その芳香環は、１つ以上の環位置で、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、フルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）、シアノなどの１つ以上の置換基により置換されてもよい。「アリール」という用語は、２つ以上の炭素が２つの隣接環に共通している２つ以上の環式環(cyclic ring)を有する多環式環系（それらの環は「縮合環」である）も含み、ここで、それらの環の少なくとも１つは芳香族炭化水素であり、例えば、他方の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルであってよい。
「ヘテロ原子」は、当該技術分野で認識されており、炭素または水素以外の任意の元素の原子を含む。説明のヘテロ原子としては、ホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄、およびセレンを含み、あるいは、酸素、窒素または硫黄を含む。
「ヘテロアリール」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、環構造に１つ以上のヘテロ原子を有する単環、二環および多環芳香族基、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどを称する。「ヘテロアリール」は、１つ以上の環位置で、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族またはヘテロ芳香族部分、フルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）、シアノなどの１つ以上の置換基により置換されてもよい。「ヘテロアリール」という用語は、２つ以上の炭素が２つの隣接環に共通している２つ以上の環式環(cyclic ring)を有する多環式環系（それらの環は「縮合環」である）も含み、ここで、それらの環の少なくとも１つは、環構造に１つ以上のヘテロ原子を有する芳香族基であり、例えば、他方の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルであってよい。
「アラルキル」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、アリール基により置換されたアルキル基を称する。
「ヘテロアラルキル」という用語は、専門用語であり、ここに用いたように、ヘテロアリール基により置換されたアルキル基を称する。
本発明の組成物中に含まれるある化合物は、特定の幾何学形態または立体異性体で存在してもよい。その上、本発明の化合物は光学的に活性であってもよい。本発明は、本発明の範囲内に含まれるものとして、シスおよびトランス異性体、（Ｒ）−および（Ｓ）−エナンチオマー、ジアステレオ異性体、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、そのラセミ混合物、およびその他の混合物を含むそのような化合物の全てを意図する。追加の不斉炭素原子が、アルキル基などの置換に存在してもよい。そのような異性体の全て、並びにその混合物は、本発明に含まれることが意図されている。
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが望ましい場合、それは、不斉合成により調製しても、キラル補助基による誘導体化により調製してもよく、ここで、得られたジアステレオマー混合物が分離され、補助基が開裂されて、純粋な所望のエナンチオマーが提供される。あるいは、分子が、アミノなどの塩基性官能基、またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有する場合、適切な光学活性酸または塩基を有するジアステレオマー塩が形成され、その後、当該技術分野によく知られた分別結晶またはクロマトグラフ手段によって、そのように形成されたジアステレオマーが分割され、続いて、純粋なエナンチオマーが回収される。
「置換」または「により置換された」は、そのような置換が、置換された原子および置換基の許容価数にしたがうという暗黙の条件を含むこと、およびその置換により、安定な化合物、例えば、転位、環化、除去、または他の反応などにより、成分置換を自発的に経ない化合物が生じることが理解されよう。
「置換された」という用語は、有機化合物の全ての許容される置換基を含むことも意図されている。広い態様において、許容される置換基は、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族置換基を含む。説明の置換基の例としては、先に記載されたものが挙げられる。許容される置換基は、適切な有機化合物について、１つ以上であっても、同じでも異なってもよい。本発明の目的について、窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の価数を満たすここに記載された有機化合物の任意の許容される置換基を有してもよい。本発明は、有機化合物の許容される置換基によって、どのような様式によっても制限されることを意図するものではない。
本発明の目的について、化学元素は、元素の周期表、ＣＡＳ式、Handbook of Chemistry and Physics、第６７版、１９８６〜８７年、内表紙にしたがって特定される。
ここでの他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S.版, 1985, McGraw-Hill, San Francisco, ここに引用する)により例示されているような、当該技術分野における通常の用法にしたがって使用される。特に別の定義がなければ、ここに用いた全ての技術用語および科学的用語は、本発明の関連する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
ここに用いた「保護基」という用語は、潜在的に反応性である官能基を望ましくない化学成分置換から保護する一時的な置換基を称する。そのような保護基の例としては、カルボン酸およびホウ酸のエステル、アルコールのエーテル、並びにアルデヒドとケトンのアセタールとケタールが挙げられる。例えば、ここに用いた「Ｎ末端保護基」または「アミノ保護基」は、合成法中の望ましくない反応に対してアミノ酸またはペプチドのＮ末端を保護するために利用できる様々なアミノ保護基を称する。適切な基の例としては、例えば、ホルミル、ダンシル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、およびメトキシスクシニルなどのアシル保護基；例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などの芳香族ウレタン保護基；およびｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの脂肪族ウレタン保護基が挙げられる。
「アミノ保護基」または「Ｎ末端保護基」という用語は、合成法中の望ましくない反応に対して、アミノ酸またはペプチドのα−Ｎ末端を保護する、またはアミノ酸またはペプチドのアミノ基を他の様式で保護することを意図した基を称する。一般に使用されるＮ保護基が、ここに引用する、Greene, Protective Groups In Organic Synthesis, (John Wiley & Sons, New York (1981))に開示されている。その上、保護基は、例えば、酵素加水分解によりインビボで容易に開裂されて、生物学的に活性な元の薬物を放出するプロドラッグとして使用できる。α−Ｎ保護基は、ホルミル、アセチル（「Ａｃ」）、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチルなどの低級アルカノイル基を含み；他のアシル基としては、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイルなどが挙げられ；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなどのスルホニル基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−エトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキシルカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリロキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなどのカルバミン酸形成基；ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などのアリールアルキル基；およびトリメチルシリルなどのシリル基。さらに他の例としては、テイル(theyl)、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリ(subery)、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、メトキシアゼラリ(methoxyazelaly)、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４−ジニトロフェニルが挙げられる。
「カルボキシ保護基」または「Ｃ末端保護基」という用語は、化合物の他の官能部分を含む反応を行いながら、カルボン酸官能基を遮断または保護するために利用されるカルボン酸保護エステルまたはアミド基を称する。カルボキシ保護基は、ここに引用するにGreene, Protective Groups In Organic Synthesis, pp. 152-186 (1981)開示されている。その上、カルボキシ保護基は、それによって、カルボキシ保護基が、例えば、酵素加水分解によりインビボで容易に開裂されて、生物学的に活性な元の薬物を放出できるプロドラッグとして使用できる。そのようなカルボキシ保護基は、当業者によく知られており、その開示をここに引用する、米国特許第３８４０５５６号および同第３７１９６６７号の各明細書に記載されているようなペニシリンおよびセファロスポリンの分野におけるカルボキシル基の保護に広く使用されてきた。代表的なカルボキシ保護基は、Ｃ1〜Ｃ8低級アルキル（例えば、メチル、エチルまたはｔ−ブチルなど）；フェネチルまたはベンジルなどのアリールアルキルおよびアルコキシベンジルまたはニトロベンジル基などのその置換誘導体；フェニルエテニルなどのアリールアルケニル；５−インダニルなどのアリールとその置換誘導体；ジメチルアミノエチルなどのジアルキルアミノアルキル；アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル、イソブチリルオキシメチル、イソバレリルオキシメチル、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル、１−メチル−１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチルなどのアルカノイルオキシアルキル基；シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシメチルなどのシクロアルカノイルオキシアルキル基；ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチルなどのアロイルオキシアルキル；ベンジルカルボニルオキシメチル、２−ベンジルカルボニルオキシエチルなどのアリールアルキルカルボニルオキシアルキル；メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル、１−メトキシカルボニル−１−エチルなどのアルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル；メトキシカルボニルオキシメチル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル、１−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ−１−エチルなどのアルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル；２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）エチルなどのアリールオキシカルボニルオキシアルキル；２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ）エチルなどのアルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル；２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチルなどのアリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル；２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチルなどのアリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル；ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチルなどのアルコキシカルボニルアミノアルキル；メチルアミノカルボニルアミノメチルなどのアルキルアミノカルボニルアミノアルキル；アセチルアミノメチルなどのアルカノイルアミノアルキル；４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチルなどの複素環カルボニルオキシルアルキル；ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチルなどのジアルキルアミノカルボニルアルキル；（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルなどの（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル；および（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルなどの（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキルが挙げられる。代表的なアミドカルボキシ保護基は、アミノカルボニルおよび低級アルキルアミノカルボニル基である。例えば、アスパラギン酸は、酸に不安定な基（例えば、ｔ−ブチル）によりα−Ｃ末端で保護し、水素化に不安定な基（例えば、ベンジル）によりβ−Ｃ末端で保護し、次いで、合成中に選択的に脱保護してもよい。上述したように、保護されたカルボキシ基は、低級アルキル、シクロアルキルまたはアリールアルキルエステル、例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステルなど、またはアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキルまたはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルであってもよい。
ここに用いた「アミノ酸」という用語は、いわゆる天然に生じるアルファ−アミノ酸および天然に生じないアミノ酸を含む、アルファ−およびベータ−アミノカルボン酸を称する。天然に生じるアルファ−アミノ酸としては、具体的に、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セレノシステイン、セリン（Ｓｅｒ）、タウリン、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。極性の天然に生じるアルファ−アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、オルニチン、セリン、スレオニン、およびチロシンが挙げられる。非極性の天然に生じるアルファ−アミノ酸としては、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンが挙げられる。
天然に生じないアミノ酸としては、以下に限られないが、Ｄ−アミノ酸（すなわち、天然に生じる形態と反対のキラリティーのアミノ酸）、Ｎ−α−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、β−メチルアミノ酸、β−アラニン（β−Ａｌａ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、オルニチン（ｏｒｎ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａＰ）、Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン、Ｄ−またはＬ−２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、Ｄ−またはＬ−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｄ−またはＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−１−，２−，３−または４−ピレニルアラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−メトキシビフェニルアラニン、メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）およびホモアルギニン（Ｈａｒ）が挙げられる。他の例としては、Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニンおよびＤ−またはＬ−アルキルアラニンが挙げられ、ここで、アルキルは、置換または未置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、またはイソペンチル、およびホスホノ−または硫酸（例えば、−ＳＯ3Ｈ）非カルボン酸系アミノ酸が挙げられる。
天然に生じないアミノ酸の他の例としては、３−（２−クロロフェニル）−アラニン、３−クロロ−フェニルアラニン、４−クロロ−フェニルアラニン、２−フルオロ−フェニルアラニン、３−フルオロ−フェニルアラニン、４−フルオロ−フェニルアラニン、２−ブロモ−フェニルアラニン、３−ブロモ−フェニルアラニン、４−ブロモ−フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、２−メチル−フェニルアラニン、３−メチル−フェニルアラニン、４−メチル−フェニルアラニン、２，４−ジメチル−フェニルアラニン、２−ニトロ−フェニルアラニン、３−ニトロ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、２，４−ジニトロ−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、２，４−ジクロロ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−フェニルアラニン、３，５−ジフルオロ−フェニルアラニン、２，４，５−トリフルオロ−フェニルアラニン、２−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、３−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、４−トリフルオロメチル−フェニルアラニン、２−シアノ−フェニルアラニン、３−シアノ−フェニルアラニン、４−シアノ−フェニルアラニン、２−ヨード−フェニルアラニン、３−ヨード−フェニルアラニン、４−ヨード−フェニルアラニン、４−メトキシフェニルアラニン、２−アミノメチル−フェニルアラニン、３−アミノメチル−フェニルアラニン、４−アミノメチル−フェニルアラニン、２−カルバモイル−フェニルアラニン、３−カルバモイル−フェニルアラニン、４−カルバモイル−フェニルアラニン、ｍ−チロシン、４−アミノ−フェニルアラニン、スチリルアラニン、２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸、９−アントリルアラニン、４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニルアラニン、３，３−ジフェニルアラニン、４，４’−ジフェニルアラニン、ベンゾイルフェニルアラニン、α−メチル−フェニルアラニン、α−メチル−４−フルオロ−フェニルアラニン、４−チアゾリルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、２−チエニルアラニン、２−（５−ブロモチエニル）−アラニン、３−チエニルアラニン、２−フリルアラニン、２−ピリジルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ピリジルアラニン、２，３−ジアミノプロピオン酸、２，４−ジアミノ酪酸、アリルグリシン、２−アミノ−４−ブロモ−４−ペンテン酸、プロパルギルグリシン、４−アミノシクロペント−２−エンカルボン酸、３−アミノシクロペンタンカルボン酸、７−アミノ−ヘプタン酸、ジプロピルグリシン、ピペコリン酸、アゼチジン−３−カルボン酸、シクロプロピルグリシン、シクロプロピルアラニン、２−メトキシ−フェニルグリシン、２−チエニルグリシン、３−チエニルグリシン、α−ベンジル−プロリン、α−（２−フルオロ−ベンジル）−プロリン、α−（３−フルオロ−ベンジル）−プロリン、α−（４−フルオロ−ベンジル）−プロリン、α−（２−クロロ−ベンジル）−プロリン、α−（３−クロロ−ベンジル）−プロリン、α−（４−クロロ−ベンジル）−プロリン、α−（２−ブロモ−ベンジル）−プロリン、α−（３−ブロモ−ベンジル）−プロリン、α−（４−ブロモ−ベンジル）−プロリン、α−フェネチル−プロリン、α−（２−メチル−ベンジル）−プロリン、α−（３−メチル−ベンジル）−プロリン、α−（４−メチル−ベンジル）−プロリン、α−（２−ニトロ−ベンジル）−プロリン、α−（３−ニトロ−ベンジル）−プロリン、α−（４−ニトロ−ベンジル）−プロリン、α−（１−ナフタレニルメチル）−プロリン、α−（２−ナフタレニルメチル）−プロリン、α−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−プロリン、α−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−プロリン、α−（３，４−ジフルオロ−ベンジル）−プロリン、α−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−プロリン、α−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−プロリン、α−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−プロリン、α−（２−シアノ−ベンジル）−プロリン、α−（３−シアノ−ベンジル）−プロリン、α−（４−シアノ−ベンジル）−プロリン、α−（２−ヨード−ベンジル）−プロリン、α−（３−ヨード−ベンジル）−プロリン、α−（４−ヨード−ベンジル）−プロリン、α−（３−フェニル−アリル）−プロリン、α−（３−フェニル−プロピル）−プロリン、α−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−プロリン、α−ベンズヒドリル−プロリン、α−（４−ビフェニルメチル）−プロリン、α−（４−チアゾリルメチル）−プロリン、α−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェニルメチル）−プロリン、α−（２−チオフェニルメチル）−プロリン、α−（５−ブロモ−２−チオフェニルメチル）−プロリン、α−（３−チオフェニルメチル）−プロリン、α−（２−フラニルメチル）−プロリン、α−（２−ピリジニルメチル）−プロリン、α−（３−ピリジニルメチル）−プロリン、α−（４−ピリジニルメチル）−プロリン、α−アリル−プロリン、α−プロピニル−プロリン、γ−ベンジル−プロリン、γ−（２−フルオロ−ベンジル）−プロリン、γ−（３−フルオロ−ベンジル）−プロリン、γ−（４−フルオロ−ベンジル）−プロリン、γ−（２−クロロ−ベンジル）−プロリン、γ−（３−クロロ−ベンジル）−プロリン、γ−（４−クロロ−ベンジル）−プロリン、γ−（２−ブロモ−ベンジル）−プロリン、γ−（３−ブロモ−ベンジル）−プロリン、γ−（４−ブロモ−ベンジル）−プロリン、γ−（２−メチル−ベンジル）−プロリン、γ−（３−メチル−ベンジル）−プロリン、γ−（４−メチル−ベンジル）−プロリン、γ−（２−ニトロ−ベンジル）−プロリン、γ−（３−ニトロ−ベンジル）−プロリン、γ−（４−ニトロ−ベンジル）−プロリン、γ−（１−ナフタレニルメチル）−プロリン、γ−（２−ナフタレニルメチル）−プロリン、γ−（２，４−ジクロロ−ベンジル）−プロリン、γ−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−プロリン、γ−（３，４−ジフルオロ−ベンジル）−プロリン、γ−（２−トリフルオロメチル−ベンジル）−プロリン、γ−（３−トリフルオロメチル−ベンジル）−プロリン、γ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）−プロリン、γ−（２−シアノ−ベンジル）−プロリン、γ−（３−シアノ−ベンジル）−プロリン、γ−（４−シアノ−ベンジル）−プロリン、γ−（２−ヨード−ベンジル）−プロリン、γ−（３−ヨード−ベンジル）−プロリン、γ−（４−ヨード−ベンジル）−プロリン、γ−（３−フェニル−アリル−ベンジル）−プロリン、γ−（３−フェニル−プロピル−ベンジル）−プロリン、γ−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル）−プロリン、γ−ベンズヒドリル−プロリン、γ−（４−ビフェニルメチル）−プロリン、γ−（４−チアゾリルメチル）−プロリン、γ−（３−ベンゾチオイエニルメチル）−プロリン、γ−（２−チエニルメチル）−プロリン、γ−（３−チエニルメチル）−プロリン、γ−（２−フラニルメチル）−プロリン、γ−（２−ピリジニルメチル）−プロリン、γ−（３−ピリジニルメチル）−プロリン、γ−（４−ピリジニルメチル）−プロリン、γ−アリル−プロリン、γ−プロピニル−プロリン、トランス−４−フェニル−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−フルオロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−フルオロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−フルオロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−クロロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−クロロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−クロロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−ブロモ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−ブロモ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−ブロモ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−メチル−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−メチル−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−メチル−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−ニトロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−ニトロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−ニトロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（１−ナフチル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−ナフチル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２，５−ジクロロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２，３−ジクロロ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−トリフルオロメチル−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−シアノ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−シアノ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−シアノ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−メトキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−メトキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−メトキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−ヒドロキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−ヒドロキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２，３−ジメトキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３，５−ジメトキシ−フェニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−ピリジニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−ピリジニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（４−ピリジニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−チエニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（３−チエニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−（２−フラニル）−ピロリジン−３−カルボン酸、トランス−４−イソプロピル−ピロリジン−３−カルボン酸、４−ホスホノメチル−フェニルアラニン、ベンジル−ホスホスレオニン、（１’−アミノ−２−フェニル−エチル）オキシラン、（１’−アミノ−２−シクロヘキシル−エチル）オキシラン、（１’−アミノ−２−［３−ブロモ−フェニル］エチル）オキシラン、（１’−アミノ−２−［４−（ベンジルオキシ）フェニル］エチル）オキシラン、（１’−アミノ−２−［３，５−ジフルオロ−フェニル］エチル）オキシラン、（１’−アミノ−２−［４−カルバモイル−フェニル］エチル）オキシラン、（１’−アミノ−２−［ベンジルオキシ−エチル］）オキシラン、（１’−アミノ−２−［４−ニトロ−フェニル］エチル）オキシラン、（１’−アミノ−３−フェニル−プロピル）オキシラン、（１’−アミノ−３−フェニル−プロピル）オキシラン、および／またはその塩および／またはその保護基の変種が挙げられる。
ベータ−アミノ酸としては、制限するものではなく、ベータ−アラニン（３−アミノプロパン酸）が挙げられる。
ここに用いた「本発明の化合物」という用語は、式Ｉの化合物およびその薬学的に許容される塩を意味する。
ここに用いた「薬学的に許容される塩」という用語は、例えば、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、グリコール酸、サリチル酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、マロン酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ナフタレン−２−硫酸、および他の酸を含む無機酸または有機酸に由来する塩を含む。薬学的に許容される塩の形態は、その塩を構成する分子の比が１：１ではない形態を含み得る。例えば、塩は、式Ｉの化合物の分子当たり２つの塩化水素酸分子などの、塩基の分子当たり２つ以上の無機酸または有機酸の分子を含んでもよい。別の例として、その塩は、酒石酸の分子当たり化合物Ｉの化合物の２つの分子などの、塩基の分子当たり１未満の無機酸または有機酸の分子を含んでもよい。
ここに用いた「担体」および「薬学的に許容される担体」という用語は、化合物がそれと共に投与される、または投与のために配合される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを称する。そのような薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、水、生理食塩水、および油などの液体；およびアカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などの固体が挙げられる。それに加え、助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、香味剤、および着色剤を使用してもよい。適切な医薬担体の他の例が、ここに全てを引用する、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E.W. Martinに記載されている。
ここに用いた「治療する(treat)」という用語は、対象における疾病または病気(condition)を予防する、その進行を停止するまたは遅くする、もしくはなくすことを意味する。１つの実施の形態において、「治療する」は、対象における疾病または病気の進行を停止させるまたは遅くする、もしくはなくすことを意味する。１つの実施の形態において、「治療する」は、疾病または病気の少なくとも１つの兆候を低減させることを意味する。
ここに用いた「有効量」という用語は、所望の生物学的効果をもたらすのに十分な量を称する。
ここに用いた「阻害する(inhibit)」という用語は、客観的に測定可能な量または程度の減少を意味する。様々な実施の形態において、「阻害する」は、関連対照と比べて、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５パーセントの減少を意味する。１つの実施の形態において、「阻害する」は、１００パーセントの減少、すなわち、停止またはなくすことを意味する。
ここに用いた「対象」という用語は、哺乳類を称する。様々な実施の形態において、対象は、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、またはヒトではない霊長類である。１つの実施の形態において、対象はヒトである。
特定の実施の形態において、式Ｉにより表される化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
特定の実施の形態において、式Ｉにより表される化合物は、
（Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルブタノエート；
（２Ｓ，３Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルペンタノエート；
（Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−４−メチルペンタノエート；
（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）；
（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート；
（Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート；および
その薬学的に許容される塩；
からなる群より選択される。
本発明の化合物の調製の一般方法：
複素環およびヘテロアリールは、文献に報告されているような公知の方法から調製できる（ａ．Ring system handbook, published by American Chemical Society edition 1993 and subsequent supplements. ：ｂ．The Chemistry of Heterocyclic Compounds; Weissberger, A., Ed.; Wiley: New York, 1962. ：ｃ．Nesynov, E. P.; Grekov, A. P. The chemistry of 1,3,4-oxadiazole derivatives. Russ. Chem. Rev. 1964, 33, 508-515. ：ｄ．Advances in Heterocyclic Chemistry; Katritzky, A. R., Boulton, A. J., Eds.; Academic Press: New York, 1966. ：ｅ．In Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Potts, K. T., Ed.; Pergamon Press: Oxford, 1984. ：ｆ．Eloy, F. A review of the chemistry of 1,2,4-oxadiazoles. Fortschr. Chem. Forsch. 1965, 4, pp 807-876. ：ｇ．Adv. Heterocycl. Chem. 1976. ：ｈ．Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Potts, K. T., Ed.; Pergamon Press: Oxford, 1984. ：ｉ．Chem. Rev. 1961 61, 87-127. ：ｊ．1,2,4-Triazoles; John Wiley & Sons: New York, 1981; Vol 37）。合成中の官能基は、保護し、その後、脱保護する必要があるかもしれない。適切な保護基の例が、Protective Groups in Organic Synthesis, fourth edition, edited by Greene and Wut
sに見つけられる。
本発明の化合物およびそれを調製するのに有用な中間体を調製するために使用できる代表的なプロセスが、以下のスキームに示されている。
スキーム８に関する文献：
スキーム９に関する文献：
スキーム１０に関する文献：
スキーム１１に関する文献：
ガーナーアルデヒド化合物１２ａに関する文献：
化合物１２ｂに関するウィッティヒ反応に関する文献：
１２ｃに関連する化合物のジヒドロキシル化に関する文献：
塩基１２ｅの合成に関連する文献：
化合物１３ａの調製に関する文献：
タイプ１３ｄの化合物の調製に関連する環化に関する文献：
スキーム１５に関する文献：
スキーム１７に関する文献：
スキーム１９に関する文献：
スキーム２０に関する文献：
７−ニトロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンに関する文献：
（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブチル２−メチル５−オキソピロリジン−１，２−ジカルボキシレート（２３ｃ）を製造するための文献：
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（ヒドロキシメチル）−２，３−ジヒドロ−ピロール−１−カルボキシレート（２３ｄ）を製造するための文献：
化合物２３ｇおよび２３ｈの調製に関連するヘックカップリングに関する文献：
（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−６−オキソジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（４０ａ）の調製に関する文献：
ラクトン（４０ａ）からラクトール（４０ｂ）への還元に関する文献：
ラクトールからブロモ化合物（４０ｃ）に関する文献：
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
またはその薬学的に許容される塩である。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択され、式中、各例において、「ＡＡ」は、アミノ酸のアミノアシル基、例えば、アラニル、ロイシル、メチオニル、またはバリニルを表す。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択され、式中、各例において、「ＡＡ」は、アミノ酸のアミノアシル基、例えば、アラニル、ロイシル、メチオニル、またはバリニルを表す。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
またはその薬学的に許容される塩である。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
またはその薬学的に許容される塩である。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
ある実施の形態において、式Ｉの化合物は、
またはその薬学的に許容される塩である。
本発明のある態様は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
本発明のある態様は、医薬組成物を調製する方法である。その方法は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体と混ぜ合わせる工程を含む。
本発明の化合物は、特定のウイルスの核酸ポリメラーゼ活性を阻害するのに有用である。本発明の化合物は、ウイルスの複製を阻害するまたはウイルス感染を治療するのにも有用である。
動物のＲＮＡウイルスは、それらのゲノムと複製様式（並びに古いボルティモア分類に基づく数値群）に基づいて３つの異なる群に分類される：
２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルス（ボルティモア分類の第３群）は、各々が１つ以上のウイルスタンパク質をコードする、１つから多くの異なるＲＮＡ分子を含有する。ｄｓＲＮＡの例にレオウイルス科がある。
プラス鎖の１本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルス（ボルティモア分類の第４群）は、まるでｍＲＮＡであるかのように直接利用されるゲノムを有し、１つのタンパク質を産生し、それが、宿主およびウイルスタンパク質によって変性されて、複製に必要な様々なタンパク質を形成する。これらの内の１つにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがあり、これは、そのウイルスＲＮＡをコピーして２本鎖複製形態を形成し、これは転じて、新たなビリオンの形成を指示する。プラス鎖のｓｓＲＮＡウイルスの例としては、トガウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、およびトガウイルス科が挙げられる。
マイナス鎖のｓｓＲＮＡウイルス（ボルティモア分類の第５群）は、プラス鎖のＲＮＡを形成するためには、それらのゲノムがＲＮＡポリメラーゼによりコピーされなければならない。これは、ウイルスがそれと共にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を持っていかなければならないことを意味する。次いで、プラス鎖のＲＮＡ分子がウイルスｍＲＮＡとして働き、それが宿主のリボソームによってタンパク質に翻訳される。結果として得られるタンパク質は、カプシドタンパク質およびＲＮＡレプリカーゼなどの新たなビリオンの合成を指示し、これは、新たなマイナス鎖のＲＮＡ分子を産生するために使用される。マイナス鎖のｓｓＲＮＡウイルスとしては、ボルナウイルス科、フィロウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、アレナウイルス科、およびブニヤウイルス科が挙げられる。
レトロウイルス（ボルティモア分類の第６群）は、１本鎖ＲＮＡゲノムを有するが、一般には、複製するためにＤＮＡ中間体を使用するので、ＲＮＡウイルスとは考えられない。脱殻された後にウイルス自体に由来するウイルス酵素である、逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡをＤＮＡの相補鎖に転換し、ウイルスＤＮＡの２本鎖分子を産生するためにこれがコピーされる。このＤＮＡが組み込まれた後、コード化された遺伝子の発現により、新たなビリオンの形成がもたらされるであろう。レトロウイルスとしては、制限するものではなく、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２が挙げられる。
本発明の態様は、ウイルスのウイルス核酸ポリメラーゼ活性を阻害する方法である。この方法は、そのウイルスのウイルス核酸ポリメラーゼを有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩と接触させる工程を含む。
１つの実施の形態において、そのウイルス核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。
１つの実施の形態において、そのウイルス核酸ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼである。
１つの実施の形態において、そのウイルスは、ＲＮＡウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、そのウイルスは、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、およびコロナウイルス科からなる群より選択される。
１つの実施の形態において、そのウイルスは、アデノウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルス、コクサッキーウイルス、ウエストナイルウイルス、天然痘ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラ・クロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴウイルス、マールブルグ・ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、プンタトロウイルス、タカリベウイルス、およびピキンデウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、アデノウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、フニンウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ピキンデウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、タカリベウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、および黄熱病ウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスからなる群より選択される。
本発明のある態様は、ウイルスの複製を阻害する方法である。この方法は、ウイルスを、そのウイルスの複製を阻害するように、有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩と接触させる工程を含む。
１つの実施の形態において、前記ウイルスはＲＮＡウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、およびコロナウイルス科からなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、アデノウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルス、コクサッキーウイルス、ウエストナイルウイルス、天然痘ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラ・クロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴウイルス、マールブルグ・ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、プンタトロウイルス、タカリベウイルス、およびピキンデウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、アデノウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、フニンウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ピキンデウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、タカリベウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、および黄熱病ウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスからなる群より選択される。
本発明のある態様は、対象におけるウイルス感染を治療する方法である。その方法は、それを必要とする対象に有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する工程を含む。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、ＲＮＡウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、そのウイルスは、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、およびコロナウイルス科からなる群より選択される。
１つの実施の形態において、そのウイルスは、アデノウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルス、コクサッキーウイルス、ウエストナイルウイルス、天然痘ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラ・クロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴウイルス、マールブルグ・ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、プンタトロウイルス、タカリベウイルス、およびピキンデウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、アデノウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、フニンウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ピキンデウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、タカリベウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、および黄熱病ウイルスからなる群より選択される。
１つの実施の形態において、前記ウイルスは、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスからなる群より選択される。
本発明の化合物は、医薬組成物として配合でき、ヒトの患者などの哺乳類宿主に、選択された投与経路、例えば、経口または非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、局所または皮下経路に適合した様々な形態で投与できる。
このように、本発明の化合物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体などの薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、全身投与、例えば、経口投与してもよい。本発明の化合物は、殻の硬いまたは柔らかいゼラチンカプセル中に被包されても、錠剤に圧縮されても、患者の食事の食品に直接含まれてもよい。経口の治療的投与について、活性化合物は、１種類以上の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形態で使用してもよい。そのような組成物および製剤は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。組成物および製剤の百分率は、もちろん、様々であってよく、都合よく、所定の単位投薬形態の質量の約２％から約６０％であってよい。そのような治療に有用な組成物中の活性化合物の量は、効果的な投与量レベルが得られるようなものである。
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、以下の希釈剤および担体を含有してもよい：トラガントガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびショ糖、果糖、乳糖またはアスパルテームなどの甘味剤もしくはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香味料などの香味剤を加えてもよい。単位投薬形態がカプセルである場合、上述したタイプの材料に加え、植物油またはポリエチレングリコールなどの液体担体を含有してもよい。コーティングとして、または固体の単位投薬形態の物理的形態を他の様式で改良するために、様々な他の材料が存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、ゼラチン、蝋、セラックまたは砂糖などにより被覆されてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、前記活性化合物、甘味剤としてのショ糖または乳糖、防腐剤としてのメチルパラベンとプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ香味料などの香味剤を含有してもよい。もちろん、どの単位投薬形態を調製するのに使用されるどの材料も、使用される量で、薬学的に許容され、実質的に非毒性であるべきである。その上、前記活性化合物は、持続放出製剤およびデバイスに含まれてもよい。
前記活性化合物は、点滴または注射によって静脈内または腹腔内に投与してもよい。活性化合物またはその塩の溶液は、必要に応じて非毒性界面活性剤と混合された、水または生理的に許容される水溶液中に調製できる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびその混合物中、並びに油中に調製しても差し支えない。貯蔵と使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。
注射または点滴に適した薬の投薬形態としては、必要に応じてリポソーム中に被包された、無菌の注射可能なまたは点滴可能な溶液または分散液の即時製剤に適合した、活性成分を含む無菌水溶液または分散液もしくは無菌粉末を含むことができる。全ての場合において、最終的な投薬形態は、製造と貯蔵の条件下で、無菌、流体および安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒体であって差し支えない。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散液の場合には、要求される粒径の維持により、または界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の活動は、様々な抗生物質および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって防ぐことができる。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、組成物に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。
無菌注射剤は、必要に応じて、先に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中の活性化合物を必要量含ませることによって調製され、その後、フィルタ殺菌が行われる。無菌注射剤の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法を含み、これにより、以前に無菌濾過された溶液中に存在する任意の追加の所望の成分に加え、活性成分の粉末が生成される。
局所性投与について、本発明の化合物は、純粋形態、すなわち、液体である場合に施してよい。しかしながら、一般に、それらは、固体または液体であってよい、皮膚科的に許容される担体と組み合わせて、組成物または製剤として皮膚に投与することが望ましい。
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉固体が挙げられる。有用な液体担体としては、本発明の化合物を、必要に応じて非毒性界面活性剤の助けにより、効果的なレベルで溶解または分散させられる、水、アルコールまたはグリコールもしくは水とアルコール／グリコールのブレンドが挙げられる。所定の使用の前に特性を最適にするために、香料および追加の抗菌剤などのアジュバントを加えても差し支えない。結果として得られた液体組成物は、吸収性パッドから塗布しても、包帯や他の着衣に含浸させるために使用しても、もしくはポンプタイプまたはエアゾール噴霧器を使用して患部に噴霧しても差し支えない。
合成高分子、脂肪酸、脂肪酸の塩とエステル、脂肪アルコール、変性セルロースまたは変性鉱物材料などの増粘剤も、液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布するための、塗ることができるペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成しても差し支えない。
式Ｉの化合物を皮膚に送達するために使用できる有用な皮膚用組成物の例が、当該技術分野で公知であり、例えば、Jacquet等（米国特許第４６０８３９２号明細書；ここに引用する）、Geria（米国特許第４９９２４７８号明細書；ここに引用する）、Smith等（米国特許第４５５９１５７号明細書；ここに引用する）、およびWortzman（米国特許第４８２０５０８号明細書；ここに引用する）を参照のこと。
本発明の化合物の有用な投薬は、それらのインビトロ活性と動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス、および他の動物における効果的な投薬のヒトへの外挿方法が、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第４９３８９４９号明細書を参照のこと。
治療に使用するのに必要な、前記化合物、もしくはその活性塩または誘導体の量は、選択される特定の化合物または塩だけでなく、投与経路、治療されている病気の性質、および患者の年齢と状態によっても様々であり、最終的には、担当医または臨床医の決定権にある。
しかしながら、一般に、適切な用量は、一日当たり服用者の体重１ｋｇ当たり約０．５から約１００ｍｇ、例えば、一日当たり体重１ｋｇ当たり約３から約９０ｍｇ、一日当たり体重１ｋｇ当たり約６から約７５ｍｇ、約１０から約６０ｍｇ／ｋｇ／日、または約１５から約５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある。
本発明の化合物は、例えば、単位投薬形態当たり５から１０００ｍｇ、１０から７５０ｍｇ、または５０から５００ｍｇの活性成分を含有する、単位投薬形態で都合よく配合できる。１つの実施の形態において、本発明は、そのような単位投薬形態で配合された本発明の化合物を含む組成物を提供する。所望の用量は、単回投与で、または適切な間隔で投与される分割投与として、例えば、一日当たり２、３、４以上の分割投与(sub-dose)として、都合よく提供されるであろう。分割投与自体は、例えば、吸入器からの多数回の吸入として、または眼の中への点眼などの多数の不連続の少し間隔の空いた投与に、さらに分割されてもよい。
本発明の化合物は、他の治療薬、例えば、ウイルス感染の治療に有用な他の薬剤と組み合わせて投与しても差し支えない。
本発明はまた、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩、少なくとも１種類の他の治療薬、包装材、および哺乳類におけるウイルス感染を治療するために哺乳類に本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩と他の治療薬を投与するための取扱説明書を含むキットも提供する。１つの実施の形態において、哺乳類はヒトである。
ここで、本発明を以下の非限定的実施例により説明する。
実施例１：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジオール二塩酸塩（１２ｉ）
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ｆ）を３つのバッチにおいて以下のように処理した。
バッチ１．（２８ｆ）をＨＣｌ水溶液（１６５８．８ミリモル、１１８ｍＬの濃ＨＣｌおよび２９３ｍＬの水）中に溶かした。
バッチ２．（２８ｆ）をＨＣｌ水溶液（２３９．６ミリモル、１６９ｍＬの濃ＨＣｌおよび２９３ｍＬの水）中に溶かした。
バッチ３．（２８ｆ）をＨＣｌ水溶液（２６３．５ミリモル、１８６ｍＬの濃ＨＣｌおよび４６８ｍＬの水）中に溶かした。
これらの反応混合物を３０分間に亘り室温で撹拌し（ＣＯ2ガスの強烈な発生）、次いで、各バッチを真空下で濃縮乾固した（８０〜９０℃）。バッチ２および３を貯留して、２２６ｇの湿った透明な黄色の生成物を得た。バッチ１からは、９１．４ｇの濃い灰色がかった生成物を得た。結晶化を以下のように行った：バッチ２および３の湿った生成物については、その生成物に２２６ｍＬの水を加え、次いで、５０℃に加熱し、その時点で、結晶化が始まるまで高温エタノールをゆっくりと加えた。この混合物を１０分間に亘り５０℃に維持し、次いで、濾過前に激しく撹拌しながら２５℃に到達させて、薄黄色の粉末の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジオール（１２ｉ）（８８ｇ、５２％）を得た。バッチ１を同様に精製して、３３．０ｇ（５９％）の薄灰色がかった生成物を得た。高真空下における５５℃での乾燥後、全収量は１２１．０ｇ（５３．５％）であった。バッチ１および２の再結晶化からの母液を再処理して、１５．０ｇの薄黄色がかった粉末生成物（１２ｉ）を得た；ＭＰ：２３８℃。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.60 (s, 1H), 13.25 (s, 1H), 10.23 (s, 1H), 9.13 (s, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 5.55 (s, 2H), 4.78 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.44 (dd, J = 8.8, 5.0 Hz, 1H), 4.14 - 4.02 (m, 1H), 3.73 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 3.52 (s, 1H); 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.33 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 4.90 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.65 (s, 1H), 4.37 (dd, J = 4.8, 3.4 Hz, 1H), 3.89 (s, 1H), 3.88 (s, 1H), 3.81 (dd, J = 8.1, 4.5 Hz, 1H); MS (ES+) 266.3 (M+1); 旋光度 -52.69; (H2O,C=1.15); 分析値: C11H15N5O3・2HCl.0.25H2Oについて計算: C, 38.55; H, 5.15; Cl, 20.44; N, 20.69; 実測値: C, 38.67; H, 5.05; Cl, 20.45; N, 20.42。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイルジアセテート（２８ｃ）からの（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジオール二塩酸塩（１２ｉ）の調製のための代わりの方法
エタノール（４００ｍＬ）中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイルジアセテート（２８ｃ）（４０ｇ、７８．２９ミリモル）の透明な溶液に、−５０℃でアンモニア（エタノールに対して３５体積％）をパージした。この冷却溶液をオートクレーブ中に注意深く注ぎ入れ、１００〜１０５℃で１６時間に亘り加熱した。ＴＬＣで調査して、反応の完了を確認した。混合物を室温まで冷ませた。溶媒を蒸留して、濃い茶色の粘着性塊として、３８ｇの（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ｆ）を得た。
脱イオン水（５８４ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（ヒドロキシメチル）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−ピロリジン−３，４−ジヒドロキシカルボキシレート（２８ｆ）の撹拌溶液（２９２ｇ、７９９．１６ミリモル）に、濃ＨＣｌ（４２３ｍＬ）を加えた。得られた透明溶液を室温で３０分間に亘り撹拌した。次いで、それを濃縮乾固して（水浴８０〜９０℃）、湿った黄色の固体を得た。次いで、この湿ったケークを脱イオン水（４７５ｍＬ）で希釈し、７０℃で加熱して、透明な溶液を得て、５０℃に冷却した。高温エタノール（１．６Ｌ）をゆっくりと加えて、部分沈殿を生じさせた。この混合物を６０℃で１０分間に亘り撹拌した。混合物を室温まで冷ませ、１０℃に冷却し、同じ温度で１時間に亘り撹拌した。得られた固体を濾過により収集し、一定質量となるまで５５〜６０℃で乾燥させて、薄黄色からオフホワイト色の固体として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジオール二塩酸塩（１２ｉ）（６５ｇ）を得た；ＭＰ：２５５．５℃。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 14.64 (s, 1H), 13.19 (s, 1H), 10.20 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.83 (s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.11 (d, J = 3.1 Hz, 1H), 5.99 − 5.20 (bs, 2H), 4.78 (s, 1H), 4.43 (dd, J = 8.9, 4.9 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 3.73 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 3.51 (s, 2H); MS (ES+) 266.1 (M+1); 旋光度 -51.74 (H2O,C=0.545); 分析値: C11H15N5O3・2HCl・0.25H2Oについて計算: C, 38.55; H, 5.15; Cl, 20.69; N, 20.44; 実測値: C, 38.51; H, 5.11; Cl, 20.57; N, 20.31。
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイルジアセテート（２８ｃ）およびｔｅｒｔ−ブチル（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（ヒドロキシメチル）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−ピロリジン−３，４−ジヒドロキシカルボキシレート（２８ｆ）の調製
工程１：Ｄ−リボノラクトン（１９ｂ）の調製
機械式撹拌機、１Ｌの均圧添加漏斗、および効率凝縮器を備えた２２Ｌの三口フラスコに、Ｄ−リボース（１９ａ）（２．０ｋｇ、１３．３３モル）、固体の重炭酸ナトリウム（２．２４ｋｇ、２６．６６モル）および水（１２Ｌ）を入れた。この反応混合物を１時間に亘り室温で撹拌し、その時点で、固体のほとんどが消失した。この反応容器を氷浴に入れ、内部温度を５±１℃に維持した。この添加漏斗に臭素（７１０ｍＬ、１３．８６モル）を満たし、その臭素を、温度が５〜１０℃に維持されるように約５ｍＬ／分の速度で、激しく撹拌されている水溶液に加えた。添加を完了したときに（約２．５時間）、得られたオレンジ色の溶液をさらに３時間に亘り撹拌した。この反応混合物に、オレンジ色が完全に消えるまで、固体の亜硫酸水素ナトリウム（〜７５ｇ）を少量ずつ加えた。この透明な水溶液を２０Ｌの蒸発フラスコに移し、４時間の期間に亘り回転式蒸発器（８０℃、１０ｍｍＨｇ）で蒸発乾固させると、半固体の残留物が残った。この残留物にエチルアルコール（〜４Ｌ）を加え、１時間に亘り４０℃で撹拌した。この混合物を冷却し、漏斗で濾過して、不溶性無機塩のほとんどを除去した。固体残留物をエチルアルコール（１Ｌ）で洗浄した。濾液を２０Ｌの蒸発フラスコに移し、回転式蒸発器（５０℃、１０ｍｍＨｇ）で濃縮乾固すると、固体残留物が残った。この残留物にエチルアルコール（〜３Ｌ）を加え、このスラリーを１２時間に亘り室温で撹拌した。その固体を濾過により収集し、エチルアルコール（７５０ｍＬ）で洗浄した。生成物のＤ−リボノラクトン（１９ｂ）を４０℃で真空オーブン（０．１ｍｍＨｇ）内で乾燥させた。収量１．２８ｋｇ（６５％）；Ｍ．Ｐ．７７〜８０℃；1H NMR (D2O) δ 4.72 (d, 1 H), 4.57 (t, 1 H), 4.42 (d, 1 H), 3.80 (m, 2 H)。
工程２：２，３−Ｏ−イソプロピリデンＤ−リボノ−１，４−ラクトン（１９ｃ）の調製
５０Ｌのジャケット付き反応槽にＤ−リボノ−１，４−ラクトン（１９ｂ）（３．０ｋｇ、２０．２７モル）、および３０ＬのＡＣＳグレードのアセトンを入れた。この反応混合物を１時間に亘り室温で撹拌した。この反応槽の内部温度を１０℃に低下させ、反応混合物に濃硫酸（４９ｍＬ）をゆっくりと加えた。硫酸の添加の際に、内部の反応温度をゆっくりと上昇させた。この反応混合物を２．５〜３時間に亘りこの温度で撹拌した。反応はＴＣＬ（ＴＬＣ；９：１、塩化メチレン：メチルアルコール、Ｒf＝０．７５）により監視した。ｐＨが中性となるまで固体の重炭酸ナトリウム（〜５００ｇ）を加えることによって、反応混合物を中和した。反応混合物を漏斗で濾過した。無機塩を含有する固体残留物をアセトン（３Ｌ）で洗浄した。濾液を２０Ｌの蒸発フラスコに移し、蒸発乾固させて（５０℃、１０ｍｍＨｇ）、半固体の化合物を得た。この残留物を酢酸エチル（３Ｌ）中に採取し、回転式蒸発器において４時間に亘り室温で撹拌した。濾過により固体の２，３−Ｏ−イソプロピリデンＤ−リボノ−１，４−ラクトン（１９ｃ）を収集し、４０℃で１６時間に亘り真空オーブン（０．１ｍｍＨｇ）内で乾燥させた。収量：１．８１９ｋｇ（４８％）；ＭＰ１３６〜１４０℃；1H NMR (CDCl3) δ 4.8 (dd, 2 H), 4.6 (s, 1 H), 3.85 (dd, 2 H), 1.5 (s, 3 H), 1.4 (s, 3 H)。
工程３：２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−メタンスルホニルＤリボノ−１，４−ラクトン（２６ａ）の調製
５０Ｌの反応槽内においてＡＣＳグレードのピリジン（２０Ｌ）中の２，３−Ｏ−イソプロピリデンＤ−リボノ−１，４−ラクトン（１９ｃ）（４．３ｋｇ、２２．９６モル）の溶液を、完全に溶解するまで、１５分間に亘り室温で撹拌した。この反応槽の内部温度を−１５℃まで低下させ、その後、２時間の期間に亘り塩化メタンスルホニル（１．９６Ｌ、２５．２６モル）をゆっくりと加えた。内部温度は０〜５℃に維持した。反応のＴＬＣがＳＭを示さなくなるまで（ＴＬＣ；７：３酢酸エチル：ヘキサン、Ｒf＝０．８５）、反応混合物を不活性雰囲気下で〜２時間に亘り０℃で撹拌した。反応が完了した際に、ＤＣＭ（１０Ｌ）を加え、３ＮのＨＣｌ（４回、ｐＨ＝３）で抽出し、［各回に、ＤＣＭ（５Ｌ）で水相を逆抽出た］、その後、迅速に飽和ＮａＨＣＯ3で洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、シロップにした。収量：４．８９ｋｇ（８０％）。生成物の２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−メタンスルホニルＤリボノ−１，４−ラクトン（２６ａ）は、さらに精製せずに、次の工程に持って行った；1H NMR (CDCl3) δ 4.8 (m, 3H), 4.5 (m, 2H), 3.08 (s, 3H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H)。
工程４：２，３−Ｏ−イソプロピリデンＬリキソノ−１，４−ラクトン（２６ｂ）の調製
２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−メタンスルホニルＤリボノ−１，４−ラクトン（２６ａ）（３．０４ｋｇ、１１．３７モル）に水（１０Ｌ）を加え、その後、固体のＫＯＨ（１．８３ｋｇ、３２．７７モル）をゆっくりと加えた。（注意：この化合物は、固体のＫＯＨの添加の際に溶液になる。ＫＯＨの添加中、反応は発熱性であり、よって、反応槽は氷浴に入れなければならない。）ＫＯＨの添加が完了する時までに、反応温度は４５℃に到達した。この反応混合物を３時間に亘りほぼ室温（ＲＴ）で撹拌した。この溶液を氷浴中で再び冷却し、次いで、濃ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨ＝３（正確に）に酸性化した。反応混合物を蒸発させて、固体の茶色の残留物を得た。この残留物を１時間に亘り沸騰アセトン（〜５Ｌ）で２回かき混ぜ、有機物を静かに移した。次いで、残りの塩を最小量の水に溶かし、濃ＨＣｌ（〜２００ｍＬ）を使用して、ｐＨを３に調節した。この水溶液を濃縮し、固体の残留物をアセントン（〜５Ｌ）で抽出した。この有機相を乾燥させ、濾過し、蒸発させて、２，３−Ｏ−イソプロピリデンＬリキソノ−１，４−ラクトン（２６ｂ）の白色の針状結晶を得た。結晶化は、高温アセトン中で行っても差し支えない。収量：１．６０ｋｇ（７５％）；1H NMR (D2O) δ 5.00 (m, 2H), 3.8 (m, 3H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H)。
工程５：２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルＬリキソノ−１，４−ラクトン（２６ｃ）の調製
機械式撹拌機を備えた２２Ｌの三口フラスコに、２，３−Ｏ−イソプロピリデンＬリキソノ−１，４−ラクトン（２６ｂ）（２．０ｋｇ、１０．６３モル）、ＤＭＡＰ（〜２５ｇ）、イミダゾール（１．６０ｋｇ、２３．４０モル、２．２当量）を加え、１時間に亘りＡＣＳグレードのＤＭＦ（８Ｌ）中で撹拌した。氷浴を使用して、反応温度を０℃に低下させた。この反応混合物に、ＴＢＤＭＳＣｌ（２．０８ｋｇ、１３．８１モル、１．３当量）を２時間の期間に亘りゆっくりと加えた。この反応混合物を１４時間に亘り不活性雰囲気下において室温で撹拌した。ＴＬＣ（７：３、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、Ｒf＝０．８０）により示されるように、反応が完了したときに、反応混合物を氷水に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃ（×２）で抽出した。有機層を分離し、乾燥させ、濾過して、油性残留物を得た。この生成物を収容している反応槽を氷浴内に入れ、その後、ヘキサン（〜３Ｌ）を加えた。化合物がヘキサン中で結晶化した。結晶を濾過し、この結晶を最小量のヘキサンで洗浄し、その生成物を一晩、４０℃の真空オーブンに入れて、２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルＬリキソノ−１，４−ラクトン（２６ｃ）３．０１ｋｇ（９３％）を得た；1H NMR (CDCl3) δ 4.8 (s, 2H), 4.5 (m, 1H), 3.9 (m, 2H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
工程６：２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラノキシ）−１−（５−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラノ−４−イル）−エタノール（２６ｄ）の調製
ＴＨＦ：ＭｅＯＨ（９：１ ｖ／ｖ混合物、１５Ｌ）中の２，３−Ｏ−イソプロピリデン５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルＬリキソノ−１，４−ラクトン（２６ｃ）（３．００ｋｇ、９．９３モル）の溶液を、完全な溶解が観察されるまで、０．５時間に亘り室温で撹拌した。反応槽の内部温度を−５℃に低下させた。水素化ホウ素ナトリウム（７５１ｇ、１９．８６モル、２当量）を、その温度が１５〜１７℃を超えないように少量ずつ加えた。試薬の添加は、１時間の期間で完了した。この反応は、３時間の期間に亘り室温のままにし、次いで、１８時間に亘りこの温度で撹拌を継続した。反応混合物はＴＬＣ（３：７、酢酸エチル：ヘキサン、Ｒf＝０．１５）により監視した。反応が完了したときに、この溶液をＥｔＯＡｃ（５Ｌ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ溶液で洗浄した（２回）。有機層を水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、油性残留物を得た。これに、〜３Ｌのヘキサンを加え、蒸発フラスコを氷浴中で冷却した。この溶液から結晶が激しく形成された。その結晶を濾過し、〜２５０ｍＬのヘキサンで洗浄した。２４時間に亘り４０℃で真空オーブン内で乾燥させて、２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラノキシ）−１−（５−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラノ−４−イル）−エタノール（２６ｄ）を得た。収量：２．３２ｋｇ（７７％）；1H NMR (CDCl3) δ 4.2 (m, 2H), 3.7 (m, 5H), 1.5 (s, 3H), 1.4 (s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
工程７：メタンスルホン酸２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシライルオキシ）−１−１（５−メタンスルホニルオキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラノ−４−イル）−エチルエステル（２６ｅ）
５００ｍＬの三口フラスコに、乾燥ピリジン（２０ｍＬ）、触媒量のＤＭＡＰを入れ、その後、０℃で塩化メタンスルホニル（４．９８ｍＬ、６４．４ミリモル、４．０当量）を加えた。乾燥ピリジン（２０ｍＬ）中に溶かした２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシラノキシ）−１−（５−ヒドロキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラノ−４−イル）−エタノール（２６ｄ）（５．０ｇ、１６．３ミリモル）を反応槽にゆっくりと加えた。この反応混合物をこの温度で４時間に亘り不活性雰囲気下において撹拌した。（ＴＬＣ；１：９酢酸エチル：ヘキサン、Ｒf＝０．８５）。反応が完了したときに、１ｍＬの水および１００ｍＬのＥｔＯＡｃを加え、撹拌した。有機層を水で抽出し、乾燥させ、蒸発させて、メタンスルホン酸２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシライルオキシ）−１−１（５−メタンスルホニルオキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラノ−４−イル）−エチルエステル（２６ｅ）のシロップを得た。収量：８．７ｇ（９０％）。この原料を、さらに精製せずに次に工程に持って行った。
工程８：５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−Ｎ−ベンジルイミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｆ）の調製
メタンスルホン酸２−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシライルオキシ）−１−１（５−メタンスルホニルオキシメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキソラノ−４−イル）−エチルエステル（２６ｅ）（８．６ｇ）に、生の(neat)ベンジルアミン（１０ｍＬ）を加え、この反応混合物を４８時間に亘り７０℃に加熱した。ＴＬＣ（４：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、Ｒf＝０．６８）は、反応が完了したことを示した。この反応混合物を冷却し、反応混合物にブラインを加えた。この反応混合物をジクロロメタンで抽出し、水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させて、大量のアミン試薬を含有するシロップを得た。この残留物をトルエン中に取り出し、塩を沈殿させるように、それにドライアイス小片を加えた。固体を濾過し、濾液を蒸発させて、所望の生成物である５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−Ｎ−ベンジルイミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｆ）（５．６ｇ、９２％）を得た。これを、さらに精製せずに、次の工程に直接持って行った。1H NMR (CDCl3) δ 7.2 - 7.4 (m, 5H), 4.65 (m, 1H), 4.55 (dd, 1H), 4.0 (d, 1H), 3.6 - 3.8 (m, 3H), 3.1 (dd, 1H), 3.0 (m, 1H), 2.75 (dd, 1H), 1.5 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
工程９：５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２０ａ）の調製
ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中の５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−Ｎ−ベンジルイミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｆ）（５．９３ｇ、１５．７４ミリモル）にＰｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加え、５時間に亘り、またはＴＬＣ（３：２、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、Ｒf＝０．１８）が、反応が完了したことを示すまで、反応を８０ｐｓｉ（約５２ｋＰａ）で水素化した。この反応混合物をＣｅｌｉｔｅで濾過し、このＣｅｌｉｔｅパッドをＥｔＯＨ（２５ｍＬ）で洗浄した。濾液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタ（０．２５μｍ）に通して、微量の触媒を除去し、蒸発させて、シロップとして５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２０ａ）を得た。収量：３．５ｇ（７５％−段階）；1H NMR (CDCl3) δ 4.65 (m, 2H), 3.60 (dd, 2H), 3.24 (t, 1H), 3.00 (d, 2H), 1.5 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.0 (s, 6H)。
工程１０：（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール（２０ｂ）の調製
トルエン（４７０ｍＬ）中の５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２０ａ）（９４ｇ、３２７ミリモル）の溶液を、６０から９０分間の期間に亘り１７から２３℃でトルエン（４７０ｍＬ）中のＮ−クロロスクシンイミドの懸濁液（５４．６ｇ、４０８．８ミリモル）に加えた。この反応混合物を１時間に亘り１７から２３℃で撹拌し、−３から３℃に冷却し、さらに１時間に亘り撹拌した。スクシンイミド副生成物を濾過により除去し、濾過した溶液を、臭化テトラブチルアンモニウム（１０．５３ｇ、３２．７ミリモル）を含有する６０％の水酸化カリウム溶液（４５８ｇ、３０５ｍＬの水中８１７５ミリモル）に直接加えた。この反応混合物を１７時間に亘り−５から５℃で撹拌した。次いで、水（７００ｍＬ）をこの二相混合物に加えて、無機沈殿物を溶かし、トルエン生成物溶液を、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ〜４．５）で緩衝したブライン溶液（７００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムに循環させ、次いで、硫酸マグネシウムを反応槽に装填することによる乾燥前にトリエチルアミンで安定化させた。トルエン中の（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール（２０ｂ）を含有する乾燥溶液を、次に工程のために、直ちにそのまま使用する。
工程１１：１Ｓ−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｇ）の調製
Ｎ2雰囲気下で、無水アニソール（１．７Ｌ）が入った２２Ｌの三口丸底フラスコに、６−メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−９−デアザヒポキサンチン（２７ｆ）（２７１．０ｇ、０．７７５モル）を加えた。この混合物が均質になるまで（≒４５℃）、この混合物をおだやかに加熱した。この混合物を周囲温度まで冷却し、無水エーテル（２．９Ｌ）を加えた。この反応フラスコを冷却浴に入れ、ドライアイス／アセトンを使用して−７０℃に冷却した。約−２０℃で、微細な白色固体として、臭化物が沈殿し始めた。この懸濁液に、内部温度が−５０℃未満に維持されるように、滴下漏斗により１．２時間の期間に亘りｎＢｕＬｉ（１．６Ｎ、４８６ｍＬ、０．７７８モル）を加えた。最後の添加後、ＴＬＣ（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）分析は、２％未満の臭化物しか残留しなかったことを示した。内部温度を−５０℃未満に維持しながら、トルエン中の（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール（２０ｂ）（１８３ｇ、０．６４２モル）を添加漏斗を介して１５分間の期間で加えた。反応混合物は淡い琥珀色であった。この反応フラスコを冷却浴から取り出し、暖まらせた。反応混合物を−２℃まで暖まらせ、ＴＬＣ（４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、エールリッヒ試薬により視覚化）は、（３ａＲ，４Ｒ，６ａＳ）−４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチル−４，６ａ−ジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール（２０ｂ）の残留を示さなかった。Ｈ2Ｏ（２Ｌ）で反応を停止させ、エーテルで抽出した（２×２Ｌ）。混合有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、真空下で濃縮して（６０℃の高真空を使用してアニソールを除去した）、１Ｓ−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｇ）を得た。これは次の工程に使用するのに適していた。収量２８４ｇ（７９％）。少量（５ｇ）の粗製混合物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中０〜４０％の酢酸エチルによる溶出）により精製して、オレンジ色のシロップ（３．４ｇ）として１Ｓ−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｇ）を得た；1H NMR (DMSO-d6) δ 0.02 (s, 3 H), 0.03 (s, 3 H), 0.8 (s, 9 H), 1.25 (s, 3 H), 1.48 (s, 3 H), 3.11-3.20 (m, 1 H), 3.60-3.71 (m, 2 H), 4.05 (s, 3 H), 4.26 (d, 1 H, J = 4.7 Hz), 4.49 (s, 2 H), 4.52-4.56 (m, 1 H), 4.81-4.85 (m, 1 H), 5.71 (s, 2 H), 7.21-7.32 (m, 5 H), 7.80 (s, 1 H), 8.40 (s, 1 H); 13C NMR (CDCl3) δ -5.46, -5.43, 18.30, 25.53, 25.88, 27.63, 53.43, 61.59, 62.54, 66.14, 70.14, 76.93, 82.32, 86.40, 114.43, 116.22, 116.56, 127.67, 127.93, 128.43, 130.55, 136.93, 149.61, 149.82, 156.16; IR 3420, 1610 cm-1; MS (ES+) m/z 555.3; 分析値: C29H42N4O5Siについて計算: C, 62.79; H, 7.63; N, 10.10; 実測値: C, 62.95; H, 7.59; N, 9.95。
工程１２：１Ｓ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｈ）の調製
粗製１Ｓ−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｇ）（２７５ｇ、０．４９６モル）をＣＨ2Ｃｌ2（１．４Ｌ）中に採取し、氷／水浴中で５℃に冷却した。この冷却混合物に、反応混合物の温度を１０℃未満に維持するように、４回に分けてＢｏｃ2Ｏ（１６８．５ｇ、０．７７２モル）を加えた。３０分後、ＴＬＣ（４０％酢酸エチル／ヘキサン）は、出発材料が残っていないことを示した。この粗製混合物をＳｉＯ2（７００ｇ）上に吸収させ、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル１．５ｋｇ、ヘキサン中１０％の酢酸エチルで溶出）により精製した。適切な画分を貯留し、真空中で濃縮して、黄色のシロップとして１Ｓ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｈ）（２７２ｇ、８４％）を得た；1H NMR (CDCl3) δ 0.02 (s, 3 H), 0.03 (s, 3 H), 0.82 (s, 9 H), 1.31-1.58 (m, 15 H) 2.05-2.09 (m, 1 H); 3.58-3.80 (m, 2 H), 4.08 (s, 3 H), 4.17-4.32 (m, 1 H), 4.44 (s, 2 H), 4.84-5.71 (m, 4 H), 7.19-7.33 (m, 5 H), 7.46 (s, 1 H), 8.51 (s, 1 H); 13C NMR (CDCl3) δ -5.31, -5.20, 14.10, 14.20, 18.32, 21.01, 22.64, 25.56, 25.93, 27.46, 28.46, 31.58, 53.44, 60.34, 62.48, 70.08, 76.96, 79.84, 111.69, 115.89, 127.67, 127.93, 128.43, 136.90, 148.62, 149.90, 154.38, 156.19; IR 1692, 1608 cm-1; MS (ES+) m/z 655.3; 分析値: C34H50N4O7Siについて計算: C, 62.43; H, 7.65; N, 8.56; 実測値: C, 62.79; H, 7.89; N, 8.47。
工程１３：（３ａＲ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＳ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−６−（４−メトキシ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（２６ｉ）の調製
チャコール上の水酸化パラジウム（１２０ｇ、５０％の湿式）を２Ｌに三角フラスコに入れた。２０Ｌのポリドラムにメタノール（７．６０ｋｇ）を秤量して入れた。このメタノールの０．８０ｋｇを使用して、水酸化パラジウム触媒が入った三角フラスコに移し、この三角フラスコを旋回させて、均質な混合物を調製した。次いで、この懸濁液を、窒素でパージした２０Ｌの水素化槽に注ぎ入れた。チャコール上の残留した水酸化パラジウムをメタノール（２５ｍＬ）で三角フラスコから水素化槽に注ぎ入れた。１Ｓ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｈ）（３８０ｇ）を１０Ｌのポリドラムに入れ、その後、２０Ｌのポリドラムから１．３２ｋｇのメタノールを入れた。この１Ｓ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−５−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−１，４−ジデオキシ−１−Ｃ−［（４−メチオキシピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−９−Ｎ−（ベンジルオキソメチル）−７−イル）］−１，４−イミノ−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リビトール（２６ｈ）のメタノール溶液を２０Ｌの水素化槽に入れた。２０Ｌのポリドラムの残りを濯ぎ液として１０Ｌのポリドラムを通じてこの槽に入れた。メタノール中のアンモニア溶液（７．０Ｍ、０．６８ｋｇ）を１０Ｌのポリドラムに計り取り、水素化槽に移した。この槽を水素ガスで５バール（５００ｋＰａ）に加圧し、その内容物を撹拌によって３５℃に加熱した。これらの反応条件は、必要に応じて、水素を補給しながら、２０時間に亘り維持した。この後、ＨＰＬＣ分析は、約２％の出発材料が残留したことを示し、これは、反応が十分に完了したことを示唆した。その槽の内容物を２０Ｌのポリドラムに移し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ床に通して濾過した。この作業中にフィルタの漏斗に窒素をパージし、メタノール（１．５０ｋｇ）を使用して、濾過ケークを洗浄した。濾液および洗浄液を回転式蒸発器に移し、減圧下で０．４８ｋｇの質量まで濃縮した。この回転式蒸発器のフラスコにメタノール（２．５０ｋｇ）を加え、その溶液を一定質量（０．３４０ｋｇ、ほぼ定量的収率）まで濃縮した。追加のメタノール（１．０ｋｇ）を生成物の（３ａＲ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＳ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−６−（４−メトキシ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（２６ｉ）に加えて、次の工程に使用するための溶液を調製した。
工程１４：７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン塩酸塩（２６ｊ）の調製
（３ａＲ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＳ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）メチル）−６−（４−メトキシ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（２６ｉ）の溶液をメタノールで希釈して、２．５Ｌの全体積にし、機械式撹拌機、還流冷却器および内部温度計を備えた５Ｌの多口の丸底フラスコに入れた。油浴を使用して、この溶液を加熱すると同時に、濃塩酸（３７％、２．１８Ｌまたは２．６２ｋｇ）を４０分間で入れた（この期間中に内部温度が４３℃から５８℃に上昇した）。さらに６時間に亘り加熱を継続し、内部温度が６８℃に到達し、その時点で、溶液を室温まで冷ませ、さらに１５時間に亘り撹拌した。この茶色の溶液を回転式蒸発器で１．５〜２．０Ｌの体積まで濃縮し、次いで、水（０．５Ｌ）を加えた。この懸濁液を先の５Ｌのフラスコに戻し、加熱して、固体を再度溶かした。これは、追加の水（０．５Ｌ）を加えた後に５０℃で行った。チャコール（９５ｇ）を加え、この懸濁液を１時間に亘り５０℃で撹拌した。このチャコールは、Ｃｅｌｉｔｅパッドに通す濾過によって除去し、水（約１．０Ｌ）で洗浄した。今ではある程度脱色された濾液と洗浄液を回転式蒸発器で０．９５Ｌの体積に濃縮した。この周囲温度の溶液を１０Ｌのフラスコに移し、撹拌しながら氷浴中で冷却した。エタノール（７．９０Ｌ）をこの溶液に少しずつ入れ、生成物を結晶化させた。さらに２時間に亘り撹拌し、内部温度を５℃に低下させた。固体生成物を窒素シール下で濾過により収集し、予め冷却したエタノールで洗浄した（３×２５０ｍＬ）。この生成物を３０分間に亘りフィルタの漏斗で引いて乾燥させ、次いで、乾燥トレイに移した。この生成物を７０℃で一晩オーブン乾燥させて、オフホワイト色の固体（１０１．２ｇ、５８％）として７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン塩酸塩（２６ｊ）を得た。この７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン塩酸塩（２６ｊ）（１０１．２ｇ）を２０Ｌのジャケット付き槽に入れた。水（１．５２Ｌ）を加え、固体が溶けるまで懸濁液を撹拌した。濃塩酸（３７％、６３．６ｍＬ）を入れ、この溶液を２５℃で撹拌した。一旦均質になったら、この溶液をポリドラムに流し入れ、その槽を水（５０６ｍＬ）できれいに濯いだ。浄化工程として、７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン塩酸塩（２６ｊ）の溶液を、ポリプロピレン製フィルタ漏斗上の濾紙に通して濾過し、次いで、前記槽に戻した。洗浄液も同様に濾過し、次いで、この槽に戻した。この溶液を４５分間に亘り約１５℃で撹拌した。１５分間に亘り、この撹拌溶液にエタノール（１．０Ｌ）を加えた。７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン塩酸塩（２６ｊ）種結晶（２．０ｇ）を加えて、結晶化を誘発した。７０分後、エタノール（１．０Ｌ）を加え、この懸濁液をさらに１９．５時間に亘り１５℃で撹拌した。この懸濁液に追加のエタノール（８．０Ｌ）を加え、１５℃での撹拌をさらに５時間に亘り継続した。ジャケットの温度を０℃に設定し、撹拌をさらに２時間に亘り継続した。この時点で、懸濁液をポリドラムに流し入れ、ポリプロピレン製フィルタ漏斗内の濾紙に通して濾過した。濾過ケークを冷却したエタノールで洗浄し（１．０Ｌと、次いで、０．５Ｌ）、３０分間にフィルタの漏斗上で引いて乾燥させた。次いで、この固体を乾燥トレイに移し、７０℃で一晩オーブン乾燥して、オフホワイト色の固体（１７６．９ｇ、８７％の回収率）として７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン塩酸塩（２６ｊ）を得た。
工程１５：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３，４−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ａ）の調製
水：メタノールの混合物（１：１、１０．４Ｌ）中の７−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−２−イル）−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（２６ｊ）の懸濁液（４４６．１９ｇ、１．４７モル）に、室温でトリエチルアミン（６２１ｍＬ、４．４２モル、３．０当量）を加え、その後、（Ｂｏｃ）2Ｏ（９８７ｇ、４．５３モル、３．１当量）を加えた。この反応混合物は、（Ｂｏｃ）2Ｏの添加後、透明な着色溶液となり、内部温度が２８℃から３３℃へとわずかに上昇した。この溶液は、１時間の撹拌後に、いくらか濁り始めた。この溶液を室温で一晩撹拌した。固体生成物を濾過により収集し、水（５．０Ｌ）で洗浄し、５０℃で高真空において乾燥させて、オフホワイト色の固体として（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３，４−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ａ）（４８２ｇ、８９％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.92 (s, 2H), 7.81 (s, 1H), 7.32 (d, J = 22.7 Hz, 1H), 5.73 - 5.20 (m, 1H), 5.05 - 4.91 (m, 1H), 4.87 - 4.76 (m, 1H), 4.74 - 4.49 (m, 1H), 4.33 - 4.17 (m, 1H), 4.09 - 3.86 (m, 2H), 3.64 - 3.48 (m, 2H), 1.39 - 1.00 (m, 9H); MS (ES+) 755.1 (2M+Na), (ES-) 731.7 (2M-1); 分析値: C16H22N4O6について計算: C, 52.45; H, 6.05; N, 15.29; 実測値: C, 52.24; H, 6.02; N, 15.05。
工程１６：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｂ）の調製
ピリジン（７４０ｍＬ、９．２１モル、７当量）中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル３，４−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ａ）（４８２ｇ、１．３２モル、１．０当量）の懸濁液に、室温でＤＭＡＰ（３．２２ｇ、２６．３２ミリモル、０．０２当量）および無水酢酸（４３５ｍＬ、４．６１ミリモル、３．５当量）を加えた。無水酢酸を添加した際に、内部温度が上昇し始め、そのため、氷水浴の冷却が必要であった。無水酢酸を全て添加したら、温度は６７℃に上昇し、次いで、室温まで低下した。反応が２５℃に到達した後、氷水浴を取り除いた。この懸濁液は透明な溶液を生じなかったが、淡い色の懸濁液が観察された。この反応混合物を１５時間に亘り室温で撹拌して、不透明な溶液が生成された。生じたアリコートは、出発材料がなく、ＴＬＣ（９：１ クロロホルム：メタノール）により２つしか主要なスポットがないことを示し、ＭＳは、生成物およびテトラアセチル化生成物についての（４９３．０、Ｍ＋１）に２つの主要なピークを示す（Ｍ＋１＝５３５）。この反応混合物を３．０Ｌのクロロホルムで希釈し、１０分間に亘り撹拌し、次いで、２．０Ｌの脱イオン水を加えた。水相と有機相の界面に、蝋状の白色の未知の生成物が形成された。この未知の生成物は、分配を行った後に水相中に残留した。有機相を分離し、２．０Ｌの水で再び洗浄した。これらの混合水層を１．０Ｌのクロロホルムで逆抽出した。混合有機相を２．０ＮのＨＣｌ水溶液（２×１．０Ｌ）、水（２×１．０Ｌ）、飽和重炭酸ナトリウム（２×１．０Ｌ）およびブライン（２×１．０Ｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、真空下と５０〜５５℃の水浴で濃縮乾固した。蒸留液が見られなくなったら真空を高真空油ポンプに切り換えて、緻密なシロップ状生成物を得た。丸底フラスコを１４時間に亘り高真空下において、残留ピリジンを最小にした。微細な白色固体となった固体の泡と（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｂ）の緻密な残留物の組合せが得られた（７１５、収率１１０％）。この百分率は、テトラアセチル化化合物の量を反映している。この生成物は、次の工程にそのまま使用するのに十分に純粋であった。分析用サンプルは、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中の０〜１００％酢酸エチル／メタノール（９：１）による溶出）を使用して混合物を精製して、白色固体として（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｂ）を得ることによって、調製した；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ12.13 (s, 1H, D2O 交換可能), 11.98 (s, 1H, D2O 交換可能), 7.82 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 5.37 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 4.99 (s, 1H), 4.55 (dd, J = 11.3, 6.6 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.03 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 2.01 (d, J = 12.6 Hz, 9H), 1.23 (dd, J = 39.9, 32.8 Hz, 9H); MS (ES+) 493.0 (M+1); (ES-) 526.7 (M+Cl); 分析値: C22H28N4O9について計算: C, 53.65; H, 5.73; N, 11.38; 実測値: C, 53.18; H, 5.89; N, 11.10。
工程１７：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｃ）の調製
アセトニトリル（２．７５Ｌ）中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−オキソ−４，５−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｂ）の溶液に、室温で、塩化ベンジルトリエチルアンモニウム（５７５ｇ、２．５モル、２．０当量）、ジメチルアニリン（２４０ｍＬ、１．９モル、１．５当量）を加え、その後、ＰＯＣｌ3（７０６ｍＬ、７．５８モル、６．０当量）を加えた。透明な薄黄色の溶液が得られた。この反応混合物を８０℃までゆっくりと加熱し、１０分間に亘りこの温度に保持した。９：１のクロロホルム：メタノール中のＴＬＣは、反応が９８％超完了したことを示した。この黒色の均質溶液を５０．０℃に冷却し、真空下（水浴７０〜７３℃）で濃縮して、ＰＯＣｌ3を除去した；残留物を、蒸留液が見られなくなるまで、高真空油ポンプ下に置いた。この残留物を３．０Ｌのクロロホルム中に溶かし、中性ｐＨが得られるまで、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で注意深く迅速に洗浄した。その有機層を分離し、水（２Ｌ）、ブライン（２Ｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮乾固した（５０〜５３℃で水浴）。（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｃ）の黒色生成物を、精製せずに次の工程にそのまま使用した。分析用サンプルは、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１２ｇ、ヘキサン中の０〜５０％の酢酸エチル／メタノール（９：１）による溶出）を使用して０．５ｇを精製することにより調製し、得られた関連生成物をエーテル／ヘキサン中に溶かし、一晩放置し、形成された結晶（３０１ｍｇ）を濾過により収集して、白色固体として（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｃ）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.55 (s, 1H, D2O 交換可能), 8.65 (s, 1H), 7.87 (bs, 1H), 5.79 (bs, 1H), 5.44 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 5.10 (bs, 1H), 4.56 (dd, J = 11.5, 6.8 Hz, 1H), 4.38 (dd, J = 11.4, 4.1 Hz, 1H), 4.08 (bs, 1H), 2.07 (s, 3H), 2.00 (s, 6H), 1.38 (s, 4H), 1.13 (s, 5H); MS (ES+) 510.865 (M+1), (ES-) 508.717 (M-1); 分析値: C22H27ClN4O8について計算: C, 51.72; H, 5.33; Cl, 6.94; N, 10.97; 実測値: C, 51.91; H, 5.32; Cl, 6.76; N, 10.90。
工程１８：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）の調製
ＤＭＦ（１．５Ｌ）中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｃ）（６２２ｇ、１．２６モル、１．０当量）の溶液に、ナトリウムアジド（４１１ｇ、６．３２モル、５当量）を加え、１０時間に亘り６０℃で撹拌しながら加熱し、その時点で、反応が完了した（９：１のクロロホルム：メタノールおよび１：１のヘキサン：酢酸エチル中のＴＬＣ）。この反応混合物を２５℃に冷却し、氷（２Ｌ）中に放出し、クロロホルム（２×１Ｌ）で抽出した。これらのクロロホルム層を混ぜ合わせ、水（２×２Ｌ）、ブライン（２Ｌ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、真空下（水浴７０〜８０℃）で濃縮して、黒色のスラッジを得た。このスラッジの精製は、カラムクロマトグラフィー（９８７ｇの黒色スラッジ、８×３０インチカラム、半分のシリカゲル、溶出プロファイルヘキサン：酢酸エチル；９：１（４０．０Ｌ）；７：３（２０．０Ｌ）；６：４（２０．０Ｌ）；１：１（２０Ｌ）；４：６（２０．０Ｌ）および２：８（２０．０Ｌ））により行った。適切な画分を貯留し、真空下（水浴５０．０℃）で濃縮して、緻密な赤みがかったハチミツ様生成物として、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）（４０７．０５ｇ、２工程で収率６２．３％）として得た。分析用サンプルは、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の０〜１００％の酢酸エチル）による混合物の精製により調製して、オレンジ色の固体として（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）を得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.08 (d, J = 155.6 Hz, 1H, D2O 交換可能), 9.86 (s, 1H), 7.61 (d, J = 76.8 Hz, 1H), 5.78 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 5.41 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.55 (dd, J = 11.4, 6.4 Hz, 1H), 4.41 (dd, J = 11.4, 3.9 Hz, 1H), 4.07 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 2.06 (s, 3H), 2.01 (d, J = 9.9 Hz, 6H), 1.23 (dd, J = 39.8, 32.7 Hz, 9H); MS (ES+) 518.0 (M+1), 540 (M+23); (ES-) 516.4 (M-1); 分析値: C22H27N7O8について計算: C, 51.06; H, 5.26; N, 18.95; 実測値: C, 50.97; H, 5.30; N, 18.62。
工程１９：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｅ）の調製
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）を以下のように３つの異なるバッチで還元した。
バッチ１：テフロン（登録商標）インサートを備えた２．０ＬのＰａｒｒ水素化装置に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）（１０８．０１ｇ、メタノール中３００ミリモル、８００ｍＬ）、Ｐｄ（ＯＨ）2（２１．６ｇ、２０％ｗ／ｗ）を加えた。
バッチ２：テフロン（登録商標）インサートを備えた２．０ＬのＰａｒｒ水素化装置に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）（１４０．７０ｇ、メタノール中２７１．９ミリモル、１．０Ｌ）、Ｐｄ（ＯＨ）2（２８．１４ｇ、２０％ｗ／ｗ）を加えた。
バッチ３：テフロン（登録商標）インサートを備えた２．０ＬのＰａｒｒ水素化装置に、（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｄ）（１４０．７ｇ、メタノール中２７１．９ミリモル、１．０Ｌ）、Ｐｄ（ＯＨ）2（２８．１４ｇ、２０％ｗ／ｗ）を加えた。
この反応混合物を１５〜１８時間に亘り１５０ｐｓｉ（約１．０４ＭＰａ）で水素化した。この反応混合物をＣｅｌｉｔｅに通して濾過して、触媒を除去した。一定質量となるまで、その濾液を真空下（水浴６０〜７０℃）で濃縮して、濃い色の生成物（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｅ）（３２８．８ｇ、８９％）を得た。この生成物は、次の工程にそのまま使用するのに十分に純粋であった。分析用サンプルは、フラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中０〜１０％メタノール）を使用した混合物の精製により調製してた。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.06 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 5.86 (s, 1H), 5.44 (t, J = 4.2 Hz, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.56 (dd, J = 11.3, 6.9 Hz, 1H), 4.40 (dd, J = 11.3, 4.2 Hz, 1H), 4.16 - 3.98 (m, 1H), 2.09 - 1.94 (m, 9H), 1.48 - 1.14 (m, 9H); MS (ES+) 492.1 (M+1); (ES-) 526.4 (M+Cl); 分析値: C22H29N5O8.1.25H2Oについて計算: C, 51.41; H, 6.18; N, 13.62; 実測値: C, 51.24; H, 5.92; N, 13.33。
工程２０：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ｆ）の調製
バッチ１：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｅ）（８１．５ｇ、１６５．８ミリモル）に、室温で、無水メタノール（３７０ｍＬ）を加え、その後、ＮａＯＭｅ（ナトリウムメトキシド、メタノール中２５質量％の溶液、４．４９ｇ、２０．７６ミリモル）を加えた。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール９：１）が全ての出発材料が反応したことを示すまで、この反応混合物を室温で撹拌した。
バッチ２：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｅ）（１１７．８ｇ、２３９．６ミリモル）に、室温で、無水メタノール（５３０ｍＬ）を加え、その後、ＮａＯＭｅ（ナトリウムメトキシド、メタノール中２５質量％の溶液、６．５８ｇ、３０．４５ミリモル）を加えた。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール９：１）が全ての出発材料が反応したことを示すまで、この反応混合物を室温で撹拌した。
バッチ３：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−３，４−ジイル−ジアセテート（２８ｅ）（１２９．５ｇ、２６３．５ミリモル）に、室温で、無水メタノール（５８４ｍＬ）を加え、その後、ＮａＯＭｅ（ナトリウムメトキシド、メタノール中２５質量％の溶液、６．９９ｇ、３２．３５ミリモル）を加えた。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール９：１）が全ての出発材料が反応したことを示すまで（７〜８時間）、この反応混合物を室温で撹拌した。
上記溶液を濃縮して（水浴６５〜７５℃）、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（２８ｆ）を得た。これは、次の工程にそのまま使用するのに十分に純粋であった。分析用サンプルは、フラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中の０〜１０％メタノール）を使用した混合物の精製により調製した。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.77 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.82 (s, 3H), 5.04 - 4.91 (m, 1H), 4.87 - 4.74 (m, 1H), 4.56 - 4.35 (m, 2H), 4.04 - 3.90 (m, 2H), 3.72 - 3.63 (m, 1H), 3.59 - 3.41 (m, 1H), 1.15 (2s, 9H); MS (ES+) 366.1 (M+1); (ES-) 400.3 (M+Cl); 分析値: C16H23N5O5.0.25H2Oについて計算: C, 51.33; H , 6.46; N, 18.71; 実測値: C, 51.04; H, 6.43; N, 18.48。
メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシメチル）−９−ブロモ−９−デアザヒポキサンチン（２７ｆ）の調製
工程１：３−アミノ−１Ｈ−ピロール−２，４−ジカルボン酸ジメチル（２７ｂ）の調製
メタノール（３．６Ｌ）中のアミノマロン酸ジエチル（３７０．４ｇ、１．７５モル）の溶液に、室温で、一度にＮａＯＭｅの５．４Ｍ溶液（９７５ｍＬ、５．２５モル）を加えた（反応混合物は薄茶色であった）。この反応混合物に、（エトキシメチレン）シアノ酢酸エチル（２７ａ）（２９６ｇ、１．７５モル）を３回で加えた（添加中にそれほど温度変化は観察されなかった〜１℃の変化、反応の色は、薄茶色から濃茶色に変化した）。この反応混合物を４８時間に亘り還流しながら加熱した（出発材料の消失を調査するために、ヘキサン中５０％の酢酸エチルのＴＬＣ分析を行った）。この反応混合物は、ｐＨ６までＡｃＯＨ（２１０ｍＬ、３．５モル）の添加により中和した。この反応混合物を真空下で濃縮して、茶色の残留物を得た。その残留物を水（３Ｌ）でトリチュレートし、濾過、水（５００ｍＬ）とヘキサンで洗浄した。これを４８時間に亘り空気乾燥し、６０℃で真空オーブン乾燥させて、茶色の固体として３−アミノ−１Ｈ−ピロール−２，４−ジカルボン酸ジメチル（２７ｂ）２８７ｇ（８３％）を得た。これを次の工程のそのまま使用した。
工程２：３Ｈ，５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン（２７ｃ）の調製
エタノール（２．８Ｌ、２ｍＬ／ミリモル）中の３−アミノ−１Ｈ−ピロール−２，４−ジカルボン酸ジメチル（２７ｂ）（２８６ｇ、１．４４モル）および酢酸ホルムアミジン（４５１ｇ、４．３３モル）の混合物を一晩、還流しながら加熱した。この反応混合物は、最初は均質ではなかったが、数時間の還流後に、均質になり、濃茶色になってようである（溶液から固体が沈殿し始めると、撹拌が難しくなる）。アリコート（ヘキサン中５０％の酢酸エチル）のＴＬＣ分析により、まだいくらかの未反応の出発材料が存在したことが示された。反応混合物を、さらに２４時間に亘り還流しながら加熱し続け、室温まで冷却した。得られた固体を濾過により収集し、水とヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥させて、薄茶色の固体として３Ｈ，５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン（２７ｃ）（２２３ｇ、８０％）を得た。この材料を、精製せずにそのまま使用した。
工程３：３Ｈ，５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン（２２ａ）の調製
２ＮのＫＯＨ（１．３５Ｌ、２．７モル）中の３Ｈ，５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン（２２ａ）（１３０．４ｇ、０．６７５モル）の混合物を４０時間に亘り穏やかに還流しながら加熱した。この反応混合物を６０℃に冷却し、氷酢酸（１６２ｍＬ、２．７モル）でｐＨ６に注意深く中和した（脱炭酸による泡立ちが観察され、反応混合物の色は黒色であった）。この反応混合物を室温まで冷却し、得られた固体を濾過により収集し、水（２×２５０ｍＬ）で洗浄し、空間乾燥し、Ｐ2Ｏ5上で高真空により乾燥させて、黒灰色の固体（１４５ｇ、１５９％）として生成物を得た。この生成物のＮＭＲは、多くの酢酸またはその塩を示し、よって、収率は高くなる（ＴＬＣは、溶媒系としてＣＭＡ−８０を使用して、ベースラインのいくらかの生成物に加えて清浄な生成物を示す）。この生成物を水（４００ｍＬ）でトリチュレートし、泡立ちがなくなりかつｐＨが７〜８程度になるまで、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液で中和した。黒灰色の固体を濾過により収集し、水で洗浄し、４８時間に亘り空気乾燥して、６７．６２ｇ（７４％）の生成物を得た。この生成物を、エタノール還流温度で真空乾燥させて、黒灰色の粉末として３Ｈ，５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン（２２ａ）を得た；分析的に純粋なサンプルのＭＰ＞２５０℃；1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12.05 (s, D2O 交換可能, 1H), 11.82 (s, D2O 交換可能, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.35 (s, 1H)。 13C-NMR (DMSO-d6) 153.88, 144.80, 141.66, 127.51, 117.92, 103.10; IR (KBr) 3107, 3030 および 1674 cm-１; MS (ES+) 136.2 (M+1); 分析値: C6H5N3Oについて計算: C, 53.33; H, 3.73; N, 31.10; 実測値: C, 53.38; H, 3.77; N, 31.11。
工程４：４−クロロピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン（２７ｄ）の調製
３Ｈ，５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オン（２２ａ）（３１．０８ｇ、２３０ミリモル）のサンプルに、窒素雰囲気下でオキシ塩化リン（６０ｍＬ、６４４モル、２．８当量）を加えた。この混合物を１時間に亘り還流しながら加熱し、その際中に、その反応は黒色に均質となった。その反応を氷水浴中で冷却し、次いで、撹拌しながら氷片（７７５ｍＬ）中に注ぎ入れた。この水溶液のｐＨを、混合物を継続して冷却しながら、濃ＮＨ4ＯＨ（２２５ｍＬ）で〜ｐＨ８にゆっくりと調節した。得られた沈殿物を真空濾過により収集し、水で洗浄した。その固体を乾燥トレイに移し、１１０℃で真空乾燥させて、濃灰色の固体として４−クロロピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン（２７ｄ）（３１．４８ｇ、８９％）を得た。分析用サンプルは、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、３５：６５）と、その後の関連画分の蒸発によって得た。ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨによる固体のトリチュレーションにより、オフホワイト色の固体として４−クロロピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン（２７ｄ）を得た、ＭＰ＞１５０℃；1H NMR (DMSO-d6) δ 12.43 (s, D2O 交換可能, 1H), 8.61 (s, 1H), 7.97 (dd, J = 2.8, 2.8 Hz; D2O dまで崩壊したら交換(exchange collapse to d), 1H), 6.72 (dd, J = 1.7, 3.5 Hz; D2O dまで崩壊したら交換, 1H). 13C-NMR (DMSO-d6) 151.30, 149.58, 142.12, 134.83, 124.32, 102.70; IR (neat) 3128, 3078, 2979, 1621 cm-1; MS (ES+) 154.01 (100 %, M+1) および 156.01 (33 %); 分析値: C6H4N3Clについて計算: C, 46.93; H, 2.63; N, 27.36; Cl, 23.09; 実測値: C, 47.10; H, 2.79; N, 27.15; Cl, 22.93。
工程５：６−メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシメチル）−９−デアザヒポキサンチン（２７ｅ）の調製
４℃に冷却した無水ＴＨＦ（１．０Ｌ）中の予洗したＮａＨの懸濁液（２０ｇ、５００ミリモル、１．２５当量、６０％の油分散、ヘキサンにより２回洗浄）に、Ｈ2ガスの発生が制御されるように１０〜１５分間に亘りＮ2雰囲気下で撹拌しながら注意深く、４−クロロピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン（２７ｄ）（６１．４ｇ、４００ミリモル）を何回かに分けて加えた。約１時間後、ガスの発生が止まり、４℃で４５分間に亘りベンジルクロロメチルエーテル（６１ｍＬ、４４０ミリモル、１．１当量）を滴下した。得られた混合物を周囲温度まで暖まらせ、１時間に亘りかき混ぜた。反応混合物を４℃に冷却し、ナトリウムメトキシド（９３ｍＬ、メタノール中５．４Ｍの溶液、５００ミリモル）で注意深く急冷した。混合物を一晩で周囲温度まで暖まらせ、氷酢酸（３０ｍＬ、５００ミリモル）でｐＨ６に中和した。この混合物を濃縮し、残留物を水（２×４００ｍＬ）でトリチュレートした。水層を他の容器に移し、残留物を真空中で乾燥させた。残留物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）中に採取し、沸騰させて還流し、波形濾紙に通して濾過した。残留物を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）と共に沸騰させ、濾過した（後に残った残留物は、望ましくない化合物であり、ヘキサン中５０％の酢酸エチルのＴＬＣ分析において動かない）。濾液を混ぜ合わせ、２５０ｍＬに真空下で濃縮し、一晩冷蔵庫内に保持した。得られた茶色の結晶を濾過により収集し、氷冷酢酸エチル／ヘキサン（２×１００ｍＬ）で洗浄し、真空内で乾燥させて、橙褐色の固体として６−メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシメチル）−９−デアザヒポキサンチン（２７ｅ）（４６．６４ｇ、４３％）を得た。分析用サンプルは、酢酸エチルからの再結晶化により調製した；ＭＰ１２３〜１２７℃；1H NMR (DMSO-d6) δ 8.44 (s, 1H), 7.86 (d, J = 3.1 Hz, 1 H), 7.31 - 7.22 (m, 5 H), 6.62 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 5.75 (s, 2 H), 4.49 (s, 2 H), 4.05 (s, 3 H); 13C-NMR (DMSO-d6) 156.11, 151.59, 150.09, 137.82, 134.80, 128.53, 127.87, 127.77, 114.99, 103.08, 77.55, 69.95, 53.73; IR (KBr) 1602 cm-1; MS (ES+) 269.97 (M+1); 分析値: C15H15N3O2について計算: C, 66.90; H, 5.61; N, 15.60; 実測値: C, 67.09; H, 5.60; N, 15.60。
工程６：６−メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシメチル）−９−ブロモ−９−デアザヒポキサンチン（２７ｆ）の調製
４℃に冷却されたＮ2雰囲気下にあるジクロロメタン（２２５ｍＬ）中の６−メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシメチル）−９−デアザヒポキサンチン（２７ｅ）（５９．８１ｇ、２２２ミリモル）の溶液（均質な反応混合物）に、反応温度が１５℃未満のままであるように何回かに分けてＮＢＳ（４０．３ｇ、２２４モル、１．０１当量）を加えた。この混合物を１５分間に亘り０℃で撹拌し、１５分間で室温まで暖まらせた（ヘキサン中５０％の酢酸エチルのＴＬＣ分析）。この反応混合物を真空濾過して、不溶性のスクシンイミドを除去した。濾液を水（２×２５０ｍＬ）とブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、真空内で濃縮して、薄茶色の固体として生成物を得た。その固体を、酢酸エチル（２００ｍＬ）の沸騰により溶かし、ヘキサン（２００ｍＬ）で希釈した。この溶液を沸騰させて還流し、非常に迅速に高温濾過した（固体の晶出を避けるために）。次いで、濾液を沸騰させ、２００ｍＬずつヘキサンを加えた（１６００ｍＬの全体積のヘキサン）。この高温溶液を必要に応じて、他に移して、不溶性の残留物を除去した（生成物は、ヘキサン中１０％の酢酸エチル中に可溶性である）。高温濾液を室温まで冷ませ、次いで、一晩、冷蔵庫内に保持した。得られた固体を濾過により収集し、ヘキサンで洗浄し、室温で真空内において乾燥させて、薄黄色の固体として６−メトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシメチル）−９−ブロモ−９−デアザヒポキサンチン（２７ｆ）（５９．６ｇ、７７％）を得た：ＭＰ １０３〜１０８℃；1H NMR (DMSO-d6) δ 8.51 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 5.74 (s, 2H), 4.52 (s, 2H), 4.07 (s, 3H). 13C-NMR (DMSO-d6) 156.19, 150.66, 148.14, 137.59, 133.45, 128.38, 127.80, 127.67, 115.02, 90.90, 77.79, 70.25, 54.07; IR (KBr) 3078, 1602, 1542 cm-1; MS (ES+) 348.27 (100 %), 350.28 (98 %); 分析値: C15H14N3O2Brについて計算: C, 51.74; H
, 4.05; N, 12.07; 実測値: C, 51.72; H, 4.04; N, 12.06。
実施例２：（Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルブタノエート塩酸塩（３０ｆ）
方法Ａ：
ＴＦＡ（１０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）（６００ｍｇ、１ミリモル）の溶液を１時間に亘り室温で撹拌し、真空下で濃縮乾固した。その残留物を１０ｍＬのＡｃＯＨ中に溶かし、ＢＣｌ3の溶液（３．６ｍＬ、３．６ミリモル、ジクロロメタン中１Ｍ）を加え、４分間に亘り室温で撹拌し、水（５ｍＬ）で急冷した。反応混合物を濃縮乾固した。残留物を凍結乾燥して、白色の固体として、（Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルブタノエート塩酸塩（３０ｆ）（４００ｍｇ、７６％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6/D2O) δ 8.64 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 4.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.63 - 4.49 (m, 3H), 4.27 - 4.19 (m, 1H), 3.94 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.82 - 3.70 (m, 1H), 2.33 - 2.18 (m, 1H), 0.99 (d, J = 6.9 Hz, 6H); MS (ES+) 365.1 (M+1); 分析値: C16H27Cl3N6O4.3HCl.2.5H2Oについて計算: C, 37.17; H, 6.07; Cl, 20.16; N, 16.09; 実測値: C, 37.04; H, 6.22; Cl, 20.50; N, 16.20。
方法Ｂ：
アセトン（２ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）（０．１５１ｇ、０．２５ミリモル）の溶液に、濃硫酸（１８Ｎ、０．１３９ｍＬ、２．５ミリモル）を加え、一晩、室温で撹拌した。反応混合物を他に移し、残留物にアセトン（１０ｍＬ）を加え、沸騰させ、室温まで冷却した。得られた固体を濾過により収集して、白色の固体として、（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルブタノエート硫酸塩（３０ｆ）を得た；1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.42 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 5.05 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.79 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 12.6, 7.5 Hz, 1H), 4.55 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.20 - 4.08 (m, 3H), 2.45 - 2.28 (m, 1H), 1.06 (t, J = 7.3 Hz, 6H)。
方法Ｃ：
ＭＴＢＥ（２．５ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）（０．３０２ｇ、０．５ミリモル）の溶液に、水（０．０４６ｍＬ）およひ濃硫酸（０．１３８ｍＬ、５．００ミリモル）を加え、１５分後にＭＴＢＥ（２．５ｍＬ）を加え、４時間に亘り室温で撹拌した。ＴＢＤＭＥを他に移し、水（０．５ｍＬ）を加え、撹拌して、固体を溶かし、次いで、エタノール（９．５ｍＬ）を加え、２時間に亘り激しく撹拌した。得られた微細な固体を濾過により収集し、エタノールで洗浄して、白色の固体として（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルブタノエート硫酸塩（３０ｆ）（０．２８８ｇ、収率１０３％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6/D2O) δ 8.26 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 4.67 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 4.59 - 4.41 (m, 3H), 4.27 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.91 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 3.81 - 3.69 (m, 1H), 2.28 - 2.10 (m, 1H), 0.97 (d, J = 6.9 Hz, 6H)。
方法Ｄ：
ＭＴＢＥ（２．５ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）（０．３０２ｇ、０．５ミリモル）の溶液に、水（０．１３８ｍＬ）およひ濃硫酸（０．１３８ｍＬ、５．００ミリモル）を加え、１５分後にＭＴＢＥ（２．５ｍＬ）を加え、４時間に亘り室温で撹拌した。ＴＢＤＭＥを他に移し、エタノール（９．５ｍＬ）を加え、２時間に亘り撹拌し、濾過により固体を収集し、真空下で乾燥させて、（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルブタノエート硫酸塩（３０ｆ）の白色固体（０．１６０ｇ、０．２８５ミリモル、収率５７．１％）を得た。
（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）の調製
工程１：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３０ａ）の調製
メタノール（２００ｍＬ）中に溶かした（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイルジアセテート（２８ｃ）（２５．８ｇ、５０．５ミリモル）の溶液に、室温で、メタノール中２５質量％のナトリウムメトキシド（３．６ｍＬ、１６．６６ミリモル）を加えた。この反応混合物を一晩室温で撹拌した。この反応混合物を濃縮乾固し、６００ｇのカラムで精製して、無色の泡として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３０ａ）（１７．７ｇ、４６ミリモル、収率９１％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.34 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 5.40 - 5.02 (m, 2H), 4.96 - 4.70 (m, 2H), 4.41 - 4.25 (m, 1H), 4.13 - 3.93 (m, 2H), 3.69 - 3.51 (m, 2H), 1.35 (s, 3H), 1.01 (s, 6H); MS (ES+) 384.9 (M+1), 792.6 (2M+Na); (ES-) 382.6 (M-1)。
工程２：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｂ）の調製
アセトン（４００ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３０ａ）（１６．３ｇ、４２．４ミリモル）の溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（１１．１７ｍＬ、８９ミリモル）および４−メチルベンゼンスルホン酸水和物（０．４１ｇ、２．１２ミリモル）を加えた。この反応混合物を一晩、室温で撹拌した。この反応混合物をＴＥＡ（５９０μＬ、４．２４ミリモル）で反応停止させ、濃縮乾固した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５００ｇ）により精製して、無色の泡として（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｂ）（１０．７ｇ、２５．２ミリモル、収率５９．５％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.45 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 5.09 (d, J = 36.7 Hz, 3H), 4.82 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.00 (s, 1H), 3.53 (s, 1H), 3.34 (s, 1H), 1.47 (s, 3H), 1.40 (bs, 4H), 1.29 (bs, 4H), 1.20 (bs, 4H); MS (ES+) 426.9 (M+1); 422.6 (M-1)。
工程３：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｃ）の調製
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｂ）（５．１ｇ、１２ミリモル）の溶液にナトリウムアジド（３．９ｇ、６０ミリモル）を加え、得られた溶液を４時間に亘り８０℃で撹拌した。この反応混合物を真空内で濃縮して、ＤＭＦのほとんどを除去し、得られた残留物をクロロホルムに溶かした。有機層を水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥させ、真空内において濃縮して、（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｃ）（５ｇ、９７％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.22 (bs, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.69 - 7.47 (m, 1H), 5.28 (m, 1H), 5.05 (m, 2H), 4.81 (d, J = 5.9, 1H), 4.06 - 3.91 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 3.51 - 3.38 (m, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.41-1.23 (bs, 9H), 1.30 (s, 3H); MS (ES+) 454 (M+Na), 863.1 (2M+1), 885.2 (2M+Na); (ES-) 429.7 (M-1)。
工程４：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｄ）の調製
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｃ）（１．０８８ｇ、２．５ミリモル）および（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタン酸（Ｌ−Ｂｏｃバリン、０．５４３ｇ、２．５ミリモル）の溶液に、ＥＤＣＩ（１．１９８ｇ、６．２５ミリモル）およびＤＭＡＰ（９２ｍｇ、０．７５ミリモル）を加えた。この反応混合物を１０日間に亘り室温で撹拌し、水（６０ｍＬ）で反応停止させ、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混ぜ合わせ、水（２×５０ｍＬ）、ブラインで洗浄し、乾燥させ、真空内で濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより２回精製して、白色の固体として（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｄ）（０．７５ｇ、４７％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.30 (s, 1H), 9.88 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 5.34 (s, 1H), 5.20 (dd, J = 5.7, 1.5 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.34 - 4.14 (m, 2H), 3.80 (dd, J = 8.0, 5.9 Hz, 1H), 3.34 (s, 1H), 1.97 - 1.84 (m, 1H), 1.47 (s, 3H), 1.43-1.31(m, 21H), 0.80 (dd, J = 6.9, 5.2 Hz, 6H); MS (ES-) 629.1 (M-1); IR (KBr) 2315 cm-1。
工程５：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）の調製
メタノール（２０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｄ）（０．７２ｇ、１．１９ミリモル）の溶液にＰｄ／Ｃ（２００ｍｇ、Ｃ上５質量％）を加え、２時間に亘り窒素雰囲気下で水素化した。Ｃｅｌｉｔｅに通す濾過によって触媒を除去し、濾液を真空内において濃縮した。得られた残留物をカラムで精製して、白色の固体として、（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｅ）（６００ｍｇ、８３％）を得た。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 10.87 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 6.78 (s, 2H), 5.30 - 5.22 (m, 1H), 5.19 - 5.07 (m, 1H), 4.88 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.18 - 4.07 (m, 2H), 3.87 - 3.79 (m, 1H), 3.44 (qd, J = 7.0, 5.1 Hz, 1H), 2.01 - 1.92 (m, 1H), 1.44 - 1.32 (m, 21H), 1.28 (s, 3H), 0.82 (d, J = 6.7 Hz, 6H); MS (ES+) 605.1 (M+1)。
実施例３：（２Ｓ，３Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルペンタノエート塩酸塩（３１ｃ）
トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ｂ）（０．３９８ｇ、０．６４３ミリモル）の溶液を１時間に亘り室温で撹拌し、真空内で濃縮乾固した。残留物をトルエン（２０ｍＬ）でトリチュレートし、真空内において濃縮乾固した。得られた残留物をＡｃＯＨ（１０ｍＬ）に溶かし、これに、トリクロロボラン（２．３２ｍＬ、２．３２ミリモル）の溶液を加え、４分間に亘り室温で撹拌し、水（５ｍＬ）で反応停止させた。その反応混合物を真空内において濃縮乾固した。得られたゴム状固体を水（５ｍＬ）に溶かして、濾過した。濾液を凍結乾燥して、白色の固体として（２Ｓ，３Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−３−メチルペンタノエート塩酸塩（３１ｃ）（０．２７５ｇ、収率８８％）を得た。
1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.24 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 4.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.61 - 4.43 (m, 3H), 4.41 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 3.98 (dt, J = 6.7, 4.2 Hz, 1H), 2.00 - 1.88 (m, 1H), 1.41 - 1.10 (m, 2H), 0.88 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.79 (t, J = 7.4 Hz, 3H); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6/D2O) δ 8.61 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 4.85 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.62 (dd, J = 12.2, 4.2 Hz, 1H), 4.57 - 4.46 (m, 2H), 4.24 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 2.01 - 1.94 (m, 1H), 1.56 - 1.39 (m, 1H), 1.36 - 1.22 (m, 1H), 0.96 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 0.90 (t, J = 7.3 Hz, 3H); MS (ES+) 379.1 (M+1), (ES-) 412.5 (M+Cl); HPLC ［Restek Pinnacle DB C18, 150 x 4.6 mm, 5 μm, 流量: 40℃で毎分1.0 mL。"A"緩衝剤 = 900 mLのHPLCグレードの水に4.3 gの１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物を溶かす。10 mLの酢酸および100 mLのアセトニトリルを加える。"B" 緩衝剤 = 600 mLのHPLCグレードの水に4.3 gの１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物を溶かす。10 mLの酢酸および400 mLのアセトニトリルを加える, UV 吸光度 = 260 nM; (A:B, 85/15 (0分)からA:B 0/100 (25分) からA:B 0/100 (40分) からA:B 85/15 (50分)) Rt = 22.79 (97.26 %)］; 分析値: C17H26N6O4・3
HCl・2.25H2O・2B(OH)3について計算: C, 31.84; H, 6.21; Cl, 16.59; N, 13.11; 実測値: C, 31.99; H, 6.13; Cl, 16.33; N, 12.80。
（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ｂ）の調製
工程１：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ａ）の調製
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｃ）（１．０７９ｇ、２．５ミリモル）、（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタン酸（Ｂｏｃ−Ｌ−イソロイシン）（０．５７８ｇ、２．５ミリモル）の溶液に、Ｎ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（ＥＤＣＩ、１．２０ｇ、６．２５ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（ＤＭＡＰ、０．０９２ｇ、０．７５ミリモル）を加えた。この反応混合物を５日間に亘り室温で撹拌し、１ＮのＨＣｌ水溶液（５．００ｍＬ）および水（６０ｍＬ）で反応停止させた。この反応混合物を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混ぜ合わせ、水（２×２５ｍＬ）、ブラインで洗浄し、乾燥させ、真空内において濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２５ｇ、ヘキサン中の０〜１００％の酢酸エチルで溶出）により精製して、白色の固体として（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ａ）（０．６８３ｇ、収率４２％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.29 (s, 1H, D2O 交換可能), 9.86 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.11 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.20 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.81 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.28 (bs, 2H), 4.08 - 3.93 (m, 1H), 3.90 - 3.77 (m, 1H), 1.62 (s, 1H), 1.52 - 1.21 (m, 26H), 0.84 - 0.66 (m, 6H); MS (ES+) 645.2 (M+1), 667.2 (M+Na), (ES-) 643.1 (M-1)。
工程２：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ｂ）の調製
メタノール（２０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ａ）（０．６２５ｇ、０．９６９ミリモル）の溶液に、炭素上の（１０％）パラジウム（２０６ｍｇ）を加え、３．５時間に亘り６０ｐｓｉ（約４１０ｋＰａ）で水素化した。ＴＬＣ分析は、（１：１ヘキサン中の酢酸エチル／メタノール（９：１））反応が完了したことを示した。触媒を、Ｃｅｌｉｔｅに通す濾過により除去し、濾液を真空内において濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１２ｇ、ヘキサン中の０〜１００％の酢酸エチル／メタノール（９：１）で溶出）により精製して、白色の固体として（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（２Ｓ，３Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３１ｂ）（０．４１８ｇ、収率７０％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.86 (bs, 1H, D2O 交換可能), 8.09 (s, 1H), 7.36 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.77 (s, 2H), 5.25 (s, 1H), 5.14 (bs, 1H), 4.88 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.18 (s, 1H), 4.05 (s, 3H), 3.90 (s, 1H), 1.68 (bs, 1H), 1.42 (s, 3H), 1.38 (s, 18H), 1.28 (s, 3H), 1.17 (s, 1H), 0.78 (m, 6H); MS (ES+) 619.2 (M+1), (ES-) 653.2 (M+Cl); 分析値: C30H46N6O8・0.25H2Oについて計算: C, 57.82; H, 7.52; N, 13.48, 実測値: C, 57.56; H, 7.42; N, 13.40。
実施例４：（Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−４−メチルペンタノエート塩酸塩（３２ｃ）
トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ｂ）（０．２４３ｇ、０．３９３ミリモル）の溶液を１時間に亘り室温で撹拌し、真空内において濃縮乾固した。残留物をトルエン（２０ｍＬ）でトリチュレートし、真空内において濃縮乾固した。その残留物をＡｃＯＨ（１０ｍＬ）に溶かし、トリクロロボラン（１．４ｍＬ、１．４ミリモル）の溶液に加え、４分間に亘り室温で撹拌し、水（５ｍＬ）で反応停止させた。この反応混合物を濃縮乾固した。ゴム状固体を水（５ｍＬ）で溶かし、濾過した。濾液を凍結乾燥して、固体（２０１ｍｇ）を得た。その固体を０．３７ｍＬの水に溶かし、透明な溶液が形成されるまで穏やかに加熱し、再び０．１３ｍＬの水を加え、次いで、９．０ｍＬの２−プロパノール（ＩＰＡ）で希釈し、次いで、０．２５ｍＬの水を加え（現在、合計で０．７５ｍＬ）、この溶液をデカンテーションして、不溶性塊を除去した。この段階で、溶液は透明であり、これを加熱し、５．５ｍＬのＩＰＡを加え、するとこの溶液は混濁し、１時間に亘り静置した。得られた固体を濾過により収集して、白色の固体として（Ｓ）−（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシピロリジン−２−イル）メチル２−アミノ−４−メチルペンタノエート塩酸塩（３２ｃ）（７３ｍｇ、収率４９％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 4.77 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.60 - 4.45 (m, 3H), 4.29 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.03 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.80 - 3.71 (m, 1H), 1.83 - 1.58 (m, 3H), 0.90 (d, J = 5.2 Hz, 6H); MS (ES+) 379.1 (M+1), (ES-) 412.7 (M+Cl); HPLC［Restek Pinnacle DB C18, 150 x 4.6 mm, 5 μm カラム, 流量: 40℃で毎分1.0 mL。 "A"緩衝剤 = 900 mLのHPLCグレードの水に4.3 gの１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物を溶かす。10 mLの酢酸および100 mLのアセトニトリルを加える。 "B" 緩衝剤 = 600 mLのHPLCグレードの水に4.3 gの１−オクタンスルホン酸ナトリウム一水和物を溶かす。10 mLの酢酸および400 mLのアセトニトリルを加える, UV 吸光度 = 260 nM; (A:B, 85/15 (0分) からA:B 0/100 (25分) からA:B 0/100 (40分) からA:B 85/15 (50分)) Rt = 22.79 (96.3027 %)］; 分析値: C17H26N6O4 2.75 H2O 2.5HClについて計算: C, 39.33; H, 6.60; Cl, 17.07; N, 16.19; 実測値: C, 39.04; H, 6.32; Cl, 17.46; N, 15.96。
（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ｂ）の調製
工程１：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ａ）の調製
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（ヒドロキシメチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３０ｃ）（１．０８８ｇ、２．５２ミリモル）および（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタン酸（Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン）（０．５８３ｇ、２．５２ミリモル）の溶液に、Ｎ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（ＥＤＣＩ、１．２１ｇ、６．３０ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（ＤＭＡＰ、０．０９２ｇ、０．７５７ミリモル）を加えた。この反応混合物を９６時間に亘り室温で撹拌し、水（６０ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。混ぜ合わされた有機層を水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、真空内において濃縮乾固した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２５ｇ）により精製して、白色の固体として（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ａ）（６３３ｍｇ、収率３９％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.28 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 5.31 (s, 1H), 5.16 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.86 (t, J = 11.4 Hz, 1H), 1.39 (m, 27H), 0.86 (dd, J = 11.7, 6.0 Hz, 1H), 0.75 (dd, J = 13.6, 6.5 Hz, 6H); MS (ES+) 645.1
9(M+1), 667.17 (M+Na); (ES-) 643.20(M-1), 679.18 (M+Cl)。
工程２：（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ｂ）
メタノール（２０ｍＬ）中の（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ａ）（５８４ｍｇ、０．９１ミリモル）の溶液に、炭素上の１０％パラジウム（１９３ｍｇ）を加え、２時間に亘り５０ｐｓｉ（約３５０ｋＰａ）で水素化した。この触媒を、Ｃｅｌｉｔｅに通して濾過し、濾液を真空内において濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、４ｇ）により精製して、白色の固体として（３ａＳ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−６−（（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−メチルペンタノイル）オキシ）メチル）−２，２−ジメチルジヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール−５（４Ｈ）−カルボキシレート（３２ｂ）（３００ｍｇ、収率５３．５％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.86 (s, 1H, 交換可能), 8.09 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.78 (s, 2H, 交換可能), 5.23 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 5.14 (s, 1H), 4.87 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.22-4.05 (m, 3H), 3.99-3.86 (m, 1H), 3.17 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 1.55 (dd, J = 12.5, 6.0 Hz, 1H), 1.46-1.34 (m, 22H), 1.28 (s, 3H), 0.81 (dd, J = 9.1, 6.7 Hz, 6H); MS (ES+) 619.13(M+1), 642.15 (M+Na); (ES-) 617.18(M-1), 653.27 (M+Cl); 分析値: C30H44N8O8・0.5H2Oについて計算: C, 57.40; H, 7.55; N, 13.39; 実測値: C, 57.46; H, 7.53; N, 13.13。
実施例５：（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）（３８ｃ）
アセトン（２５ｍＬ）中の（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ｂ）（７１５ｍｇ、０．７１１ミリモル）の溶液に、９Ｍの硫酸（０．３９５ｍＬ、３．５５ミリモル）を加え、一晩室温で撹拌した。このアセトン層をデカンテーションし、残留物をアセトンで処理し、デカンテーションした（３回）。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１２ｇ、ＣＭＡ−８０中０〜１００％のＣＭＡ−５０による溶出）により精製して、白色の固体として（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−アミノ−３−メチルブタノエート）（３８ｃ）（１８８ｍｇ、５７％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.84 (bs, 1H, D2O 交換可能), 8.06 (s, 1H), 7.51 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.77 (s, 2H, D2O 交換可能), 5.33 (dd, J = 7.6, 5.6 Hz, 1H), 5.24 (dd, J = 5.7, 3.8 Hz, 1H), 4.39 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.64 - 3.51 (m, 2H), 3.17 (dd, J = 4.5, 2.9 Hz, 2H), 3.06 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 2.01 - 1.88 (m, 1H), 1.87 - 1.75 (m, 1H), 0.91 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.84 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.79 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.73 (d, J = 6.8 Hz, 3H); MS (ES+) 928.2 (2M+1); (ES-) 462.0 (M-1), 925.1(2M-1)。
（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ｂ）の調製
工程１：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ａ）
メタノール（２００ｍＬ）中の（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシルカルボニル）−５−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）ピロリジン−３，４−ジイルジアセテート（２８ｃ）（２５．８ｇ、５０．５ミリモル）の溶液に、室温でメタノール中２５質量％のナトリウムメトキシド（３．６ｍＬ、１６．６６ミリモル）を加えた。この反応混合物を一晩室温で撹拌した。この反応混合物を真空内において濃縮乾固し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６００ｇ）により精製して、無色の泡として（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ａ）（１７．７ｇ、収率９１％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.34 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 5.40 - 5.02 (m, 2H), 4.96 - 4.70 (m, 2H), 4.41 - 4.25 (m, 1H), 4.13 - 3.93 (m, 2H), 3.69 - 3.51 (m, 2H), 1.35 (s, 3H), 1.01 (s, 6H); MS (ES+) 384.9 (M+1), 792.6 (2M+Na); (ES-) 382.6 (M-1)。
工程２：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ｂ）の調製
ＤＭＦ（８０ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−クロロ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ａ）（４ｇ、１０．３９ミリモル）の溶液に、ナトリウムアジド（３．３８ｇ、５２．０ミリモル）を加え、１０時間に亘り８０℃で撹拌しながら加熱した。この反応を２５℃に冷却し、氷中に放り込み、酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル層を分離し、水、ブラインで洗浄し、乾燥させ、濾過し、真空内において濃縮乾固した（水浴５０℃）。得られた粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１２０ｇ、クロロホルム中の０〜１００％のメタノールによる溶出）により精製して、白色の固体として（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ｂ）（１．２８ｇ、収率３１％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.05 (bs, 1H, D2O 交換可能), 9.84 (s, 1H), 7.81 (m, 1H), 5.13 (m, 1H), 5.05 - 4.83 (m, 3H, D2O 交換可能), 4.24 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.59 (m, 2H), 1.38 (s, Bocについて4H) および1.05 (s, Bocについて5H); MS (ES+) 782.8 (2M+1), (ES-) 389.6 (M-1)。
工程３：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３５ａ）の調製
ピリジン（５．０ｍＬ、６２．０６ミリモル）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ｂ）（１．０ｇ、２．５５ミリモル）の溶液に、クロロトリフェニルメタン（０．８５ｇ、３．０７ミリモル）を加えた。得られた混合物を４時間に亘り５０℃で撹拌し、その時点で、反応は完了した（９：１のクロロホルム：メタノール中のＴＬＣ）。反応混合物を２５℃に冷却し、氷水（８０ｍＬ）中に放り込み、酢酸エチル（１００ｍＬ、２×６０ｍＬ）で抽出した。有機層を混ぜ合わせ、水、ブラインで洗浄し、乾燥させ、濾過し、真空内において濃縮して、オフホワイト色の固体を得た。この固体をｎ−ヘキサン中５％のＥｔＯＡｃでトリチュレートし、濾過により収集して、薄黄色の固体として（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３５ａ）（１．４７ｇ、収率９０．７４％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 370 K) δ 12.82 (s, 1H), 9.48 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 5H), 7.29 − 7.19 (m,9H), 4.96 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.54 - 4.46 (m, 1H), 4.38 - 4.30 (m, 1H), 4.08 - 3.99 (m, 1H), 3.93 - 3.84 (m, 1H), 3.46 (dd, J = 9.1, 6.4 Hz, 1H), 3.37 (dd, J = 9.2, 4.2 Hz, 1H), 1.19 (s, 9H); MS (ES+) 655.85 (M+Na), (ES-) 632.55 (M-1). IR (KBr) 2133 cm-1。
工程４：（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ａ）；（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｂ）；および（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ａ）の調製
方法１：
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３５ａ）（１ｇ、１．５７８ミリモル）の溶液に、室温でＮ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（ＥＤＣＩ、０．７５６ｇ、３．９５ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（ＤＭＡＰ、０．１９３ｇ、１．５７８ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ分析（メタノール中１０％のクロロホルム）は、いくらかの未反応の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３５ａ）を示した。この反応を水（５０ｍＬ）で停止させ、酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ）。有機層を混ぜ合わせ、水、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、真空内において濃縮した。得られた粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ）により精製して：
白色の固体として、２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３５ａ）（１９６ｍｇ、１９．６％）；
白色の固体として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ａ）（５１１ｍｇ、３８．９％）；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 370K) δ 12.86 (s, 1H), 9.39 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.9 Hz, 6H), 7.31 - 7.18 (m, 9H), 6.57 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.46 (s, 1H), 5.05 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 6.3 Hz, 1H), 4.78 - 4.69 (m, 1H),4.13 - 4.05 (m, 2H), 3.53 - 3.36 (m, 2H), 2.19 - 2.04 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 0.92 (t, J = 6.7 Hz, 6H); IR (KBr) 2133 cm-1; MS (ES-) 831.1 (M-1)；
白色の固体として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｂ）（２５０ｍｇ、１９％）；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 370K) δ12.84 (s, 1H), 9.49 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.36 - 7.28 (m, 6H), 7.25 -7.17 (m, 9H), 6.48 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.81 - 5.71 (m, 1H), 5.22 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.71 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.56 - 3.32 (m, 2H), 2.10 - 2.00 (m, 1H),1.32 (s, 9H), 1.22 (s, 9H), 0.88 (dd, J = 6.6, 3.4 Hz, 6H); IR (KBr) 2134 cm-1; MS (ES-) 831.1(M-1)；および
白色の固体として、（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ａ）（１８ｍｇ、１．１％）；1H NMR (300 MHz, DMSO, 370K) δ 12.94 (s, 1H, N-H), 9.38 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.38- 7.14 (m, 15H), 6.51 (s, 1H, N-H), 6.37 (s, 1H, N-H), 5.97 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.76 (s, 1H), 5.22 (t, J = 11.3 Hz, 1H), 4.19 - 3.98 (m, 2H), 3.91 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 3.55 (d, J = 18.8 Hz, 1H), 3.35 (m, 1H), 2.06 (m, 2H), 1.37 (s,, 9H), 1.24 (s, 9H), 1.21 (s, 9H), 0.94 - 0.78 (m, 12H)；
を得た。
方法２：
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３５ａ）（１．０ｇ、１．５８ミリモル）および（Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタン酸（Ｌ−Ｂｏｃバリン、０．７２０ｇ、３．３１ミリモル）の溶液に、室温でＮ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（ＥＤＣＩ、０．７５６ｇ、３．９５ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（ＤＭＡＰ、０．１９３ｇ、１．５７８ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、水（３０ｍＬ）で反応停止させた。この反応混合物を酢酸エチルで抽出した（３×６０ｍＬ）。有機層を混ぜ合わせ、水、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、真空内で濃縮した。粗残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２５ｇ、ヘキサン中０〜５０％の酢酸エチルで溶出）により精製して、白色の固体として、（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ａ）（６７０ｍｇ、収率４２．１％）と、それに加え、白色の泡として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ａ）および（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｂ）の混合物（６１０ｍｇ、４７．９％）；MS (ES-) 831.5 (M-1)；
を得た。
工程５：（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ｂ）の調製
エタノール（２５ｍＬ）中の（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ａ）（９６４ｍｇ、０．９３４ミリモル）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１０％）（１５０ｍｇ）を加え、５０ｐｓｉ（約３５０ｋＰａ）で一晩水素化した。この触媒を、Ｃｅｌｉｔｅのパッドに通す濾過により除去し、濾液を真空内において濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４ｇ、ヘキサン中（酢酸エチル／メタノール、９：１）により溶出、０〜１００％）により精製して、白色の固体として（２Ｓ，２’Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−３，４−ジイルビス（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノエート）（３８ｂ）（７６５ｍｇ、収率８１％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6, 370K) δ 10.61 (s, 1H, N-H), 7.86 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.37 - 7.17 (m, 16H), 6.38 (m, 2H, N-H), 6.30 (s, 2H, N-H), 6.16 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 5.87 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 5.06 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 4.12 - 4.00 (m, 2H), 3.98 - 3.86 (m, 1H), 3.78 (dd, J = 9.7, 6.9 Hz, 1H), 3.20 (m, 1H), 2.05 (m, 2H), 1.40 (s, 9H), 1.31 (s, 9H), 1.23 (d, J = 2.0 Hz, 9H), 0.90-0.80 (m, 12H); 分析値: C55H71N7O11.H2Oについて計算: C, 64.50; H, 7.18; N, 9.57; 実測値: C, 64.36; H, 7.11; N, 9.38。
実施例６：（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３５ｅ）および（Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３４ｆ）の調製
方法１：
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｄ）および（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｅ）から
アセトン（１５ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｄ）および（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｅ）の溶液に、９Ｍの硫酸（０．５１２ｍＬ、４．６１ミリモル）を加え、室温で一晩撹拌した。溶媒をデカンテーションし、白色の固体をアセトンで洗浄し、再びデカンテーションする前に、３０分間に亘り撹拌した。同じ手法を３〜４回繰り返し、得られた固体を濾過により収集し、アセトンで洗浄し、３５℃で真空内において乾燥させ、白色の固体の硫酸塩（５００ｍｇ、１．０８１ミリモル、収率９７％）として、（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３５ｅ）および（Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３４ｆ）の混合物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（２３３ｍｇのサンプル混合物ＣＭＡ−８０中０〜１００％のＣＭＡ−５０によるシリカゲル溶出）を使用した精製により、白色の固体として、（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３５ｅ）および（Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３４ｆ）の混合物（７４ｍｇ、４８％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ [8.08 (s, 0.65H), 8.07 (s, 0.35H) 1H], [7.49 (s, 0.35H), 7.48 (s, 0.65H) 1H], [5.09 (t, J = 6.4 Hz, 0.35H), 5.01 (dd, J = 5.7, 3.7 Hz, 0.65H) 1H], [4.35 (d, J = 6.7 Hz, 0.35H), 4.21 (d, J = 5.6 Hz, 0.35H), 4.18 (d, J = 5.7 Hz, 0.65H), 4.14 - 4.09 (m, 1.65H) 3H], [3.63 - 3.48 (m, 1H) 1H], [3.25 (d, J = 5.1 Hz, 0.7H), 3.20 - 3.10 (m, 1.3H) 2H], [2.05 - 1.82 (m, 1H)], [0.93 (d, J = 6.8 Hz, 1.95H), 0.88 (d, J = 6.8 Hz, 1.95H), 0.81 (d, J = 6.9 Hz, 1.05H), 0.77 (d, J = 6.8 Hz, 1.05H) 6H]; MS (ES+) 365.0 (M+1)。
方法２：
（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｅ）から
アセトン（１０ｍＬ）中の（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｅ）の溶液に、室温で濃硫酸（５０％水溶液、１．１６ｍＬ、１０．４４ミリモル）を加え、１８時間に亘り撹拌した。この反応混合物をアセトン（３０ｍＬ）で希釈し、撹拌した。アセトンをデカンテーションし、この操作を２回繰り返した。分離した固体を濾過により収集し、真空内において乾燥させ、白色の固体として、（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３５ｅ）および（Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート硫酸塩（３４ｆ）の混合物（０．４ｇ、６８％）を得た。この固体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル４ｇ、ＣＭＡ−８０中０〜１００％のＣＭＡ−５０による溶出）により精製して、（Ｓ）−（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３５ｅ）および（Ｓ）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３−イル２−アミノ−３−メチルブタノエート（３４ｆ）の混合物を得た；ＮＭＲ分析は、化合物３５ｅおよび３４ｆの混合物を示す；MS (ES+) 365.1 (M+1), (ES-) 362.9 (M-1)。
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｄ）および（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｅ）の調製
方法１：
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ａ）から
エタノール（５０ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ａ）（１．３１９ｇ、１．５８４ミリモル）の溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（２００ｍｇ）を加え、８時間に亘り５０ｐｓｉ（約３５０ｋＰａ）で水素化した。この触媒を、Ｃｅｌｉｔｅのパッドに通す反応混合物の濾過により除去した。その濾液を真空内において濃縮し、得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色の固体として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｄ）および（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｅ）の３：２混合物（ＮＭＲにより分析した）（９４５ｍｇ、１．１７１ミリモル、収率７４．０％）を得た；MS (ES+) 806.9 (M+1); (ES-) 805.0 (M-1), 841.2 (M+Cl)。
方法２：
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｂ）から
エタノール（２５ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｂ）（６３４ｍｇ、０．７６１ミリモル）の溶液に、１０％のＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ）を加え、８時間に亘り５０ｐｓｉ（約３５０ｋＰａ）で水素化した。この触媒を、Ｃｅｌｉｔｅのパッドに通す反応混合物の濾過により除去した。その濾液を真空内において濃縮し、得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、白色の固体として、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−４−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｄ）および（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−４−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−３−ヒドロキシ−５−（（トリチルオキシ）メチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３９ｅ）の３：２混合物（４７４ｍｇ、０．５８７ミリモル、収率７７％）を得た；ＮＭＲスペクトルは、化合物３９ａからの手法を飼養して得られた生成物と一致する；MS (ES+) 806.9 (M+1); (ES-) 805.7 (M-1)。
（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｅ）の調製
工程１：（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−ヒドロキシ−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｃ）の調製
ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（３４ｂ）（５ｇ、１２．７８ミリモル）の撹拌溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（ＤＭＡＰ、０．０７８ｇ、０．６３９ミリモル）、１Ｈ−イミダゾール（３．４８ｇ、５１．１ミリモル）および１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（４．６３ｍＬ、１４．０５ミリモル）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、水（３００ｍＬ）で希釈した。分離した固体を濾過により収集し、水で洗浄した。この固体をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中０から３５％の酢酸エチルによる溶出）により精製して、白色の固体として、（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−ヒドロキシ−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｃ）（５．０２ｇ、収率６２．０％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.26 (s, 1H, D2O 交換可能), 9.85 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 5.52 (d, J = 3.2 Hz, 1H, D2O 交換可能), 5.10 (s, 1H), 4.63 - 4.24 (m, 2H), 4.18 - 3.82 (m, 1H), 3.67 (dt, J = 8.2, 2.9 Hz, 1H), 1.37 (d, J = 45.1 Hz, 10H), 1.08 - 0.99 (m, 14H), 0.86 (m, 14H); MS (ES+) 633.9 (M+1); (ES-) 632.2 (M-1); 分析値: C28H47N7O6Si2について計算: C, 53.05; H, 7.47; N, 15.47; 実測値: C, 53.00; H, 7.55; N, 15.15。
工程２：（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｄ）の調製
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−ヒドロキシ−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｃ）（２ｇ、３．１６ミリモル）の撹拌溶液に、（Ｓ）−２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタン酸（Ｌ−Ｂｏｃバリン、１．０３ｇ、４．７３ミリモル）を加え、０℃に冷却した。０℃で、Ｎ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（ＥＤＣＩ、１．５１ｇ、７．８９ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジメチルピリジン−４−アミン（ＤＭＡＰ、０．３８５ｇ、３．１６ミリモル）を加え、室温で一晩反応させた。この反応混合物を水（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（２×１００ｍＬ）。酢酸エチル層を混ぜ合わせ、水（２×５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ、濾過し、真空内において濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル８０ｇ、ヘキサン中酢酸エチル０から３５％による溶出）により精製して、白色の固体として、（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｄ）（２．１ｇ、８０％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.40 (s, 1H, D2O 交換可能), 9.85 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.23 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.84 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 5.24 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.82 - 4.58 (m, 1H), 4.41 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 4.03 - 3.93 (m, 2H), 3.67 (s, 1H), 2.08 (dt, J = 13.5, 6.8 Hz, 1H), 1.49 - 1.33 (m, 18H), 1.15 - 0.67 (m, 35H); MS (ES+) 856.0 (M+Na), 832.4 (M-1). 分析値: C38H64N8O9Si2について計算: C, 54.77; H, 7.74; N, 13.45; 実測値: C, 54.86; H, 7.78; N, 13.13。
工程３：（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｅ）の調製
エタノール（５０ｍＬ）中の炭素上パラジウム（１０％、０．２６２ｇ）の懸濁液に、（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アジド−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｄ）（２．０５ｇ、２．４６ミリモル）を加え、１２時間に亘り６０ｐｓｉ（約４１０ｋＰａ）で水素化した。触媒を、Ｃｅｌｉｔｅのパッドに通す濾過により除去し、濾液を真空内において濃縮した。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２５ｇ、クロロホルム中の０〜１００％のＣＭＡ８０で溶出）により精製して、白色の固体として（６ａＲ，８Ｓ，９Ｓ，９ａＲ）−ｔｅｒｔ−ブチル８−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−９−（（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタノイル）オキシ）−２，２，４，４−テトライソプロピルテトラヒドロ−［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシノ［７，６−ｂ］ピロール−７（８Ｈ）−カルボキシレート（３４ｅ）（１．９ｇ、収率９６％）を得た；1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.94 (s, 1H, D2O 交換可能), 8.05 (s, 1H), 7.46 - 7.30 (m, 1H), 7.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.82 (s, 2H, D2O 交換可能), 5.86 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.16 (d, J = 25.0 Hz, 1H, D2O 交換可能), 5.00 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 12.2, 5.1 Hz, 1H), 3.98 - 3.88 (m, 1H), 3.61 (s, 1H), 2.16 - 1.92 (m, 1H), 1.41 (bs, 18H), 1.01 - 0.83 (m, 35H); MS (ES+) 806.921 (M+1), 830.1 (M+Na), (ES-) 805.289 (M-1), 842.0 (M+Cl)。
実施例７：ラットへの経口投与後の化合物３０ｆの薬物動態
健康な週齢８から１０週の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを無作為に対照グループと実験グループに割り当てた、グループ当たりＮ＝４。全ての動物は、標準様式で飼育し、給餌した。実験の日に、全ての動物を隔離し、代謝ケージ内で投薬前に約１５時間に亘り断食させた。対照薬物と実験薬物の投薬の２時間後に、餌を動物に戻した。水は不断に与えた。投与の直前に、対照化合物（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（４−アミノ−５Ｈ−ピロロ［３，２−ｄ］ピリミジン−７−イル）−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジン−３，４−ジオール二塩酸塩（１２ｉ）を水に溶かして、１ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。実験化合物３０ｆも同様に水に溶かして、当量濃度（化合物１２ｉに関して１ｍｇ／ｍＬ）を達成した。各動物の体重測定後、全ての対照動物に、０時間で、経口強制飼養により１０ｍｇ／ｋｇ体重の化合物１２ｉを投与した一方で、全ての実験動物に、０時間で経口強制飼養により１０ｍｇ／ｋｇ体重の化合物３０ｆを投与した。逐次血液サンプルを、０時間、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後に得た。全てのサンプルを微小遠心管に移し、３分間に亘り１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。各管からの血漿を取りだし、予めラベルを貼った微小遠心管に移し、分析するまで貯蔵のためにサンプルが−８０℃の冷凍庫に移されるまで、ドライアイス上に置いた。次いで、個々のサンプルを化合物１２ｉについて分析した。血漿濃度対時間のデータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアプログラムを使用した非コンパートメント手法により分析した。薬物動態パラメータのＴmax、Ｃmax、Ｔ1/2、ＡＵＣ(0-last)、ＡＵＣ(0-inf)、ＭＲＴ(0-inf)、並びに血漿および肝臓濃度対時間のプロファイルのグラフを得た。これらの結果が図１に示されている。
図１に示されるように、実験グループおよび対照グループは、薬物動態において著しい差を示した。Ｔmaxは２つグループについて同じであった（０．５時間後）が、実験グループのＣmaxは５２７ｎｇ／ｍＬであったのに対し、対照グループのＣmaxはたった１２３ｎｇ／ｍＬであり、実験グループのＡＵＣ(0-inf)は１０７６ｎｇ・ｈであったのに対し、対照グループのＡＵＣ(0-inf)はたった２１９ｎｇ・ｈであった。これらの結果に基づくと、化合物３０ｆは化合物１２ｉよりも約４倍大きいバイオアベイラビリティを有し、血漿エステラーゼは化合物１２ｉに対して化合物３０ｆを急激に加水分解する。
実施例８：アフリカミドリザル腎臓細胞中の麻疹ウイルスの複製へのウイルスＲＮＡポリメラーゼ阻害剤（化合物１２ｉ）の効果
材料および方法：Ｃｅｒｏ−７６細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州、マナッサス所在のＡＴＣＣ）から得た。これらの細胞を、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を添加した最小必須培地（０．１５％のＮａＨＣＯ3を含むＭＥＭ；米国ユタ州ローガン所在のＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に定期的に移した。化合物を評価するときに、血清を２．５％の最終濃度に希釈し、ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように試験媒質に加えた。麻疹ウイルス（ＭＶ）のシカゴ株を疾病対策センター（ジョージア州アトランタ所在）から得た。
抗ウイルス試験手法：
細胞変性効果阻害アッセイ（視覚的アッセイ）
細胞を、適切な細胞濃度で、０．２ｍＬ／ウェルで、９６ウェルの平底組織培養プレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ社）に播種し、細胞単層を得るために、３７℃で一晩インキュベーションした。その単層を作り上げたときに、成長培地をデカンテーションし、試験化合物の様々な希釈物を各ウェルに加えた（３ウェル／希釈、０．１ｍＬ／ウェル）。化合物希釈培地を細胞およびウイルス対照のウェル（０．１ｍＬ／ウェル）に加えた。試験培地中で希釈されたウイルスを、０．１ｍＬ／ウェルで、化合物試験ウェル（３ウェル／化合物の希釈）およびウイルス対照ウェル（６ウェル）に加えた。ウイルス（ウイルスＭＯＩ＝０．００１）を、化合物の約５分後に加えた。ウイルスを含まない試験培地を、０．１ｍＬ／ウェルで、全ての毒性対照ウェル（２ウェル／各試験化合物の希釈）および細胞対照ウェル（６ウェル）に加えた。ウイルス対照ウェルが適正な細胞変性効果（ＣＰＥ）測定値（８０〜１００％の細胞破壊）を有するまで、５％のＣＯ2、９５％の空気の雰囲気を含む加湿インキュベータ内において３７℃でインキュベーションした。これを、ウイルスに応じて、ウイルスの細胞への曝露後の４〜１１日間に亘り行った。次いで、細胞をＣＰＥについて顕微鏡で調査し、これを、０（正常な細胞）から４（最大、１００％、ＣＰＥ）まで採点した。毒性対照ウェルにおける細胞を、細胞毒性に寄与する形態変化について、顕微鏡で観察した。この細胞毒性（細胞破壊および／または形態変化）も、１００％細胞毒性、８０％細胞毒性、６０％細胞毒性、４０％細胞毒性、２０％細胞毒性、および０（正常な細胞）と採点した。５０％有効量（ＥＣ５０）および５０％細胞毒性量（ＩＣ５０）は、それぞれ、ウイルスＣＰＥデータおよび毒性対照データの回帰分析により計算した。試験した各化合物に関する選択指数（ＳＩ）は、式：ＳＩ＝ＣＣ５０／ＥＣ５０を使用して計算した。
ＣＰＥ阻害のニュートラルレッド取り込みアッセイ
ＮＲ取り込みは、Smee等（Virol. Methods 2002, 106: 71-79; ここに全て引用する）の発見に基づく抗ウイルス薬物を評価するための染料定量方法として選択した。このアッセイを上述したのと同じＣＰＥ阻害試験プレートに行って、目視観測によって、阻害剤活性および細胞毒性を検証した。ＮＲアッセイは、Ｂａｒｎａｒｄ等（Antiviral Chem. Chernother. 2001, 12:220-231；ここに全てを引用する）により記載されているようなＣａｖｅｎａｕｇｈ等の改良方法（Invest. New Drugs 1990, 8:347-354；ここに全てを引用する）を使用して行った。手短に言えば、ＣＰＥ阻害アッセイからＣＰＥについて採点したプレートの各ウェルから培地を取り除き、そのプレートの各ウェルに０．０３４％のＮＲを加え、このプレートを暗所において３７℃で２時間に亘りインキュベーションした。次いで、ＮＲ溶液をウェルから取り除いた。濯ぎ（時々、細胞がプレートから落ちて、ニュートラルレッドの誤った低い値を生じる）および吸引乾固後に、Ｓｏｒｅｎｓｏｎクエン酸緩衝剤で緩衝された無水エタノールを使用して、残りの染料を暗所において室温で３０分間に亘り細胞から抽出した。５４０ｎｍ／４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｏｐｓｙｓ ＭＲ（商標）、米国バージニア州シャンティリー所在のＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で読んだ。吸光度値は未処理の対照の百分率として表し、ＥＣ５０、ＣＣ５０およびＳＩは、上述したように計算した。
ウイルス収量低下アッセイ：
ウイルス収量低下アッセイは、実質的に先に記載したように、細胞培養５０％感染用量（ＣＣＩＤ５０）を使用して行った（Antimicrob. Agents Chemother. 1992, 3:1837-1842；ここに全てを引用する）。手短に言えば、各ウェルからの上清を、Ｖｅｒｏ−７６細胞を含む９６ウェルプレートの三連続のウェルに逐次希釈した。プレートを６日間に亘りインキュベーションし、次いで、ウイルス誘発ＣＰＥを調べた。ウイルス収量力価の定量は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの終端方法によるものであった（Am. J. Hyg. 1938, 27:493-498；ここに全てを引用する）。ＥＣ９０値は、ウイルス収量の９０％を阻害するまたはウイルス力価を常用対数で１減少させるのに必要な濃度を推測するために線形回帰を使用して計算した。
結果および議論：
麻疹ウイルスは、化合物１２ｉにより強く阻害された（表１）。麻疹ウイルスに対するＥＣ５０値は、それぞれ、視覚アッセイおよびＮＲアッセイにより、０．６および１．４μｇ／ｍＬであった。この化合物は、視覚またはＮＲアッセイのいずれにおいても細胞毒性を持たなかった（ＩＣ５０＞１００）。したがって、両方のアッセイによる選択指数は、化合物１２ｉが麻疹ウイルス（ＭＶ）に対して高活性であることを示唆した。ＭＶに対する強力な阻害活性をウイルス収量低下アッセイにより確認し、ＥＣ９０＝０．３６μｇ／ｍＬであり、感染細胞において生成されたウイルスが常用対数で１の低下を示した。
結論：
化合物１２ｉは、極力で選択的な阻害活性を示した。ウイルス収量低下アッセイにより、化合物１２ｉは、ＭＶの強力な阻害剤でもあった（ＥＣ９０＝０．３７μｇ／ｍＬ）。それゆえ、化合物１２ｉは、多くのＲＮＡウイルスの強力な阻害剤であることが分かり、化合物１２ｉは、選択されたＲＮＡウイルスの広域スペクトル阻害剤としてのさらなるインビトロおよびインビボの評価を保証することを示唆している。
実施例９：様々なＲＮＡウイルスの複製へのウイルスＲＮＡポリメラーゼ阻害剤（化合物１２ｉ）の効果
材料および方法：
細胞およびウイルス
アフリカミドリザル腎臓細胞（ＭＡ−１０４）をＷｈｉｔａｋｅｒ ＭＡ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社（米国メリーランド州、ウォーカーズビル所在）から得た。ベロ細胞（アフリカミドリザルの肝臓細胞）、喉頭細胞のヒト癌（Ａ−５９）、およびメイディン・ダービーイヌ腎臓細胞の全ては、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州、マナッサス所在のＡＴＣＣ）から得た。Ａ−５４９細胞は、０．１５％のＮａＨＣＯ3が添加されたダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）（米国ユタ州、ローガン所在のＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を添加した培地中で培養した。残留する細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を添加した最小必須培地（０．１５％のＮａＨＣＯ3を含むＭＥＭ；米国ユタ州ローガン所在のＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）中で定期的に移した。
化合物を評価するときに、血清を２．５％の最終濃度に希釈し、ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬの最終濃度となるように試験媒質に加えた。インフルエンザアッセイの試験培地は、無血清ＭＥＭ、０．１８％のＮａＨＣＯ3、２０μｇトリプシン／ｍＬ、２．０μｇＥＤＴＡ／ｍＬ、および５０μｇゲンタマイシン／ｍＬからなった。
活発に成長する細胞における毒性の評価について、いくつかの濃度の化合物に３日間曝露した後のＮＲ取り込みアッセイにより反映されるように、細胞の総数を決定することによって、細胞毒性を評価した。薬物の存在下または不在下での７２時間の細胞増殖を計るために、プレートに１×１０3のＭＤＣＫ細胞を播種し、４時間後（全ての細胞をプレートのウェルに接着させた）に、ＭＥＭ中の選択された濃度の薬物またはＭＥＭに曝露した。７２時間後、プレートを、ＮＲアッセイについて上述したように処理した。吸光度値は、未処理の対照のパーセントとして表し、ＣＣ５０値は、回帰分析により計算した。
デングウイルス２（ＤＶ−２）のニューギニアＣ株、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ａ２、ライノウイルス２（ＲＶ−２）、ＨＯＰ株、タカリベウイルス（ＴＣＶ）のＴＲＶＬ １１５７３株、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、および黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）の１７Ｄ株の全てを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州、マナッサス所在のＡＴＣＣ）から得た。インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）のシカゴ株、ＳＡＲＳコロナウィルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）のウルバニ株、およびウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）の９９６６２５株と称する原型ニューヨーク１９９９単離体の全ては、疾病対策センター（ジョージア州アトランタ所在）から得た。プンタトロウイルス（ＰＴＶ）のアダムス(Adames)株は、米国陸軍感染症研究所フォート・デトリック（メリーランド州、フレデリック）に所属するドクターＤｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｐｉｆａｔ氏から得た。リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）ワクチン株のＭＰ−１２、およびフニンウイルス（ＪＵＮＶ）ワクチン株のＣａｎｄｉｄ １は、ドクターＲｏｂｅｒｔ Ｔｅｓｈ氏（テキサス州所在のテキサス州大学医学部ガルベストン校、出現ウイルスおよびアルボウイルスのワールド・レファレンス・センター(World Reference Center for Emerging and Viruses and Arboviruses)）により快く提供された。ピキンデウイルス（ＰＩＣＶ）のＡｎ ４７６３株は、ドクターＤａｖｉｄ Ｇａｎｇｅｍｉ氏（サウスカロライナ州、クレムソン所在のクレムソン大学）により提供された。パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）の１４７０２／５／９５株は、Ｊａｃｑｕｅｌｉｎ Ｂｏｉｖｉｎ氏（カナダ国モントリオール所在のセント・ジャスティン病院）から得た。アデノウイルス１型（ＡＶ−１）のシカゴ／９５株は、小児患者の気管洗浄から単離されたものであり、Ｍ．Ｆ．Ｓｍａｒｏｎ氏（イリノイ州、シカゴ所在のシカゴ大学医学部）により提供された。
抗ウイルス試験手法：
細胞変性効果阻害アッセイ（視覚的アッセイ）
細胞を、適切な細胞濃度で、０．２ｍＬ／ウェルで、９６ウェルの平底組織培養プレート（ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ社）に播種し、細胞単層を得るために、３７℃で一晩インキュベーションした。その単層を作り上げたときに、成長培地をデカンテーションし、試験化合物の様々な希釈物を各ウェルに加えた（３ウェル／希釈、０．１ｍＬ／ウェル）。化合物希釈培地を細胞およびウイルス対照のウェル（０．１ｍＬ／ウェル）に加えた。試験培地中で希釈されたウイルスを、０．１ｍＬ／ウェルで、化合物試験ウェル（３ウェル／化合物の希釈）およびウイルス対照ウェル（６ウェル）に加えた。ウイルス（ウイルスＭＯＩ＝０．００１）を、化合物の約５分後に加えた。ウイルスを含まない試験培地を、０．１ｍＬ／ウェルで、全ての毒性対照ウェル（２ウェル／各試験化合物の希釈）および細胞対照ウェル（６ウェル）に加えた。ウイルス対照ウェルが適正な細胞変性効果（ＣＰＥ）測定値（８０〜１００％の細胞破壊）を有するまで、５％のＣＯ2、９５％の空気の雰囲気を含む加湿インキュベータ内において３７℃でインキュベーションした。これを、ウイルスに応じて、ウイルスの細胞への曝露後の４〜１１日間に亘り行った。次いで、細胞をＣＰＥについて顕微鏡で調査し、これを、０（正常な細胞）から４（最大、１００％、ＣＰＥ）まで採点した。毒性対照ウェルにおける細胞を、細胞毒性に寄与する形態変化について、顕微鏡で観察した。この細胞毒性（細胞破壊および／または形態変化）も、１００％細胞毒性、８０％細胞毒性、６０％細胞毒性、４０％細胞毒性、２０％細胞毒性、および０（正常な細胞）と採点した。５０％有効量（ＥＣ５０）および５０％細胞毒性量（ＩＣ５０）は、それぞれ、ウイルスＣＰＥデータおよび毒性対照データの回帰分析により計算した。試験した各化合物に関する選択指数（ＳＩ）は、式：ＳＩ＝ＣＣ５０／ＥＣ５０を使用して計算した。
ＣＰＥ阻害のニュートラルレッド取り込みアッセイ
ＮＲ取り込みは、Smee等（前出）の発見に基づく抗ウイルス薬物を評価するための染料定量方法として選択した。このアッセイを上述したのと同じＣＰＥ阻害試験プレートに行って、目視観測によって、阻害剤活性および細胞毒性を検証した。ＮＲアッセイは、Ｂａｒｎａｒｄ等（前出）により記載されているようなＣａｖｅｎａｕｇｈ等の改良方法（前出）を使用して行った。手短に言えば、ＣＰＥ阻害アッセイからＣＰＥについて採点したプレートの各ウェルから培地を取り除き、そのプレートの各ウェルに０．０３４％のＮＲを加え、このプレートを暗所において３７℃で２時間に亘りインキュベーションした。次いで、ＮＲ溶液をウェルから取り除いた。濯ぎ（時々、細胞がプレートから落ちて、ニュートラルレッドの誤った低い値を生じる）および吸引乾固後に、Ｓｏｒｅｎｓｏｎクエン酸緩衝剤で緩衝された無水エタノールを使用して、残りの染料を暗所において室温で３０分間に亘り細胞から抽出した。５４０ｎｍ／４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｏｐｓｙｓ ＭＲ（商標）、米国バージニア州シャンティリー所在のＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で読んだ。吸光度値は未処理の対照の百分率として表し、ＥＣ５０、ＣＣ５０およびＳＩは、上述したように計算した。
化合物１２ｉにより著しく阻害された（ＳＩ＞１０）と考えられる他のウイルスには、ＤＶ−２（ＥＣ５０＝１５、１３μｇ／ｍＬ）、ＪＵＮＶ（ＥＣ５０＝２９、１６μｇ／ｍＬ）、ＹＦＶ（ＥＣ５０＝８．３、８．３μｇ／ｍＬ）（表１）がある。以下のウイルスは、化合物によりわずかに阻害された（３＜ＳＩ＜１０）：ＰＩＶ−３（ＥＣ５０＝７．１、１０μｇ／ｍＬ）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ（ＥＣ５０＝１４、１６μｇ／ｍＬ）、ＰＩＣＶ（ＥＣ５０＝６１、２８μｇ／ｍＬ）、およびＲＶＦＶ（ＥＣ５０＝７５、６４μｇ／ｍＬ）。化合物１２ｉは、インフルエンザウイルス株の一部（表２）に対して試験され、多数の菌株に対して広域スペクトル抗インフルエンザ活性を示した。
結論
化合物１２ｉは、試験した全てのインフルエンザウイルスに対して強力な活性を示した。化合物１２ｉは、インフルエンザウイルス複製の強力な阻害剤であることが分かり、化合物１２ｉは、全てのインフルエンザウイルスを含む、選択されたＲＮＡウイルスの広域スペクトル阻害剤として効果的であることを示唆している。
実施例１０：化合物１２ｉのインビトロ抗ウイルス活性
化合物１２ｉの抗ウイルス活性を、いくつかのウイルスにおいてインビトロで評価した。マールブルグ（フィロウイルス科）、フニンＣａｎｄｉｄ １（アレナウイルス科）、ビキンデ（アレナウイルス科）、チクングニア１８１／２５（トガウイルス科）、およびワクシニア（ポックスウイルス科）に対するＥＣ５０値は、約１０μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬ超までに及んだ。
実施例１１：化合物１２ｉの相乗的抗ウイルス活性およびＭＤＣＫ細胞におけるノイラミニダーゼ阻害剤
メイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をインフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２（Ａ／ビクトリア／３／７５）ウイルスに感染させ、７２時間に亘り化合物１２ｉおよびペラミビルの様々な組合せで治療した。ニュートラルレッド染料取り込みアッセイを使用して、細胞変性効果を決定した。そのデータが表３に示されている。
実験データは、Ｍａｃ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＩＩ（商標）ソフトウェアプログラム（Prichard and Shipman, 1990；ここに全てを引用する）を使用して、三次元解析によって評価した。このソフトウェアは、個々の薬物の用量応答曲線から理論的な添加剤の相互作用を計算する。次いで、予測される添加剤の相互作用を表す、計算された添加剤表面を実験表面から引いて、予測より大きい（相乗的）または小さい（拮抗性）相互作用の領域を現す。細胞培養研究におけるペラミビルと化合物１２ｉとの組合せは、９２μＭ2単位％と等しい相乗効果の量を有する相乗抗ウイルス効果を示した。
実施例１２：ネズミインフルエンザモデルにおける化合物１２ｉの筋肉（ＩＭ）注射の有効性
週齢６〜８週のＢＡＬＢ／ｃマウスをＨ３Ｎ２ウイルス（Ａ／ビクトリア／３／７５）に順応させた。感染の１時間前から開始して５日間に亘り、筋肉（ＩＭ）注射により、一日一回、０、３０、１００、および３００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を与えた。Ｎ＝５０動物数。全ての動物を１６日間に亘り追跡した。端点は、致死率、脂肪までの平均日数、および体重減少を含んだ。
マウスインフルエンザモデルにおける化合物１２ｉのウイルス結果が表４に示されている。ＩＭにより与えられた化合物１２ｉは、インフルエンザウイルスに感染したマウスにおいて、生存率と体重減少を改善した。
実施例１３：週齢６〜８週のマウスインフルエンザモデルのＢＡＬＢ／ｃマウスにおける化合物１２ｉの経口投与の有効性
週齢６〜８週のＢＡＬＢ／ｃマウスをＨ３Ｎ２ウイルス（Ａ／ビクトリア／３／７５）に順応させた。経口により、一日一回、０、３０、１００、および３００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を与えた。Ｎ＝６０動物数。全ての動物を１６日間に亘り追跡した。端点は、致死率、脂肪までの平均日数、および体重減少を含んだ。Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃ／３／７５インフルエンザウイルスに感染したマウスにおける体重減少への経口投与された化合物１２ｉの効果が表５に示されている。経口により与えられた化合物１２ｉは、インフルエンザウイルスに感染したマウスにおいて、生存率と体重減少を改善した。
実施例１４：マウスにおける薬物動態研究
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎ＝３０）に、１００ｍｇ／ｋｇで化合物１２ｉを経口投与した。マウスは、ｔ＝０．１７、０．５、１．０、３、６、および２４時（時点当たり各５匹のマウス）で眼窩後副鼻腔を通じて採血し、遠心分離し、血漿を−８０℃で貯蔵した。血漿薬物レベルは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により測定した。
経口投与後の化合物１２ｉのマウス血漿レベルが表６に示されている。
実施例１５：エボラウイルスマウスの予防研究
週齢８〜１２週のＣ５７ＢＬ／６マウス（グループ当たりＮ＝１０、４グループ−１匹が生理食塩水治療グループおよび３匹が薬物治療グループ）に、化合物１２ｉを腹腔内、筋肉内、および経口（３００ｍｇ／ｋｇ／日、一日二回）により投与した。感染の４時間前から始めて８日間の治療。マウスに順応したエボラウイルス（ザイール）抗原投与を腹腔内により行った。死亡率および体重を感染後１４日間に亘り監視した。
エボラウイルスに感染した、生理食塩水で治療したマウスは８日目までに全て死亡した。化合物１２ｉにより腹腔内または筋肉内で治療された全てのマウスは、研究の端点（１４日目）で生存した。化合物１２ｉにより経口で治療されたマウスの８０パーセントが、研究の端点（１４日目）で生存した。
エボラウイルスに感染した、生理食塩水で治療したマウスは、８日目まで概して体重減少を示した（全ての対照マウスは８日目までに死亡した）。化合物１２ｉにより腹腔内または筋肉内で治療されたマウスは、１２日目で出発時の体重の９５％超を維持した。化合物１２ｉにより経口で治療されたマウスは、１２日目で出発時の体重の８０％超を維持した。全ての薬物治療マウスは、１２日後に体重が増え続けた。
実施例１６：エボラウイルスマウスの予防研究
週齢８〜１２週のＣ５７ＢＬ／６マウスに、化合物１２ｉを筋肉内、および経口により投与した。研究対象は６グループに分けた（グループ当たりＮ＝１０匹）。グループ１は生理食塩水対照であり；グループ２には１５０ｍｇ／ｋｇの化合物１２ｉを投薬し（経口、一日二回）；グループ３には２５０ｍｇ／ｋｇの化合物１２ｉを投薬し（経口、一日二回）；グループ４には、１５０ｍｇ／ｋｇの化合物１２ｉを投薬した（筋肉内、一日二回）。グループ５は、生理食塩水で治療した未感染のマウスであり（経口、一日二回）；グループ６は、２５０ｍｇ／ｋｇの化合物１２ｉで治療した未感染のマウスであった（経口、一日二回）。治療は、感染の４時間前から始まり、９日間であった。マウスに順応したエボラウイルス（ザイール）の抗原投与は、腹腔内により行った（１，０００ｐｆｕ）。致死率および体重を感染後の１４日間亘り監視した。
エボラウイルスに感染した、生理食塩水で治療したマウスは８日目までに全て死亡した。化合物１２ｉにより筋肉内で治療された全てのマウスは、研究の端点で生存し、化合物１２ｉの筋肉内投与は完全に保護することを示す。化合物１２ｉにより経口で治療されたマウスの８０パーセントが、研究の端点で生存した。
エボラウイルスに感染した、生理食塩水で治療したマウスは、７日目まで概して体重減少を示した（全ての対照マウスは８日目までに死亡した）。化合物１２ｉにより筋肉内で治療されたマウスは、１１日目で未感染の対照グループと同様の体重増加を示した。化合物１２ｉにより経口で治療されたマウスは、元に戻せる体重減少を示し、１１日目で出発時の体重の１００％超を維持した。
実施例１７：黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）時間窓ゴールデンハムスター研究
黄熱病ウイルス（ヒメネス(Jimenez)株）を、ハムスター当たり２０ ＣＣＩＤ５０（〜６．２５×ＬＣ５０）で、雌のシリアンゴールデンハムスター（９９ｇ）に腹腔内注射した。グループは以下のように分けた：１）化合物１２ｉを、始まりの−４時間に投与した（Ｎ＝１５）；２）化合物１２ｉを、始まりの１ｄｐｉ（感染後の日数）に投与した（Ｎ＝１０）；３）化合物１２ｉを、始まりの２ｄｐｉに投与した（Ｎ＝１０）；４）化合物１２ｉを３ｄｐｉに投与した（Ｎ＝１０）；５）化合物１２ｉを４ｄｐｉに投与した（Ｎ＝１０）；６）リバビリンを始まりの−４時間に投与した（Ｎ＝１０）；７）生理食塩水ビヒクルを始まりの−４時間に投与した（Ｎ＝１６）；８）未感染のハムスターに化合物１２ｉを、始まりの−４時間に投与した（Ｎ＝３）；９）未感染のハムスターに生理食塩水ビヒクルを始まりの−４時間に投与した（Ｎ＝３）；および１０）未感染の未治療の正常な対照（Ｎ＝３）。治療投与量は、７日間に亘り１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、一日二回であった。研究の端点は２１日目の致死率であり、体重は、０、３、５および６日目に測定し；血清および肝臓ウイルス力価（４日目、−４時間で化合物１２ｉ、および−４時間でビヒクル）、および６日目にＡＬＴおよびＡＳＴ。
その結果は、プラセボと比較して、治療を遅らせた化合物１２ｉの向上した生存率を示した（図２）。ＹＦＶに感染し、ウイルス抗原投与後に様々な時間で始めた７日間に亘り一日二回化合物１２ｉで治療されたハムスターの生存率が示されている（プラセボと比べて、***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．１）。生存率は、感染前から始まり、３日までの感染後の遅延治療について、１００％であった。生存率は、感染後の４日目から始めた化合物１２ｉについては８０％であり、治療を遅らせたグループにおいて、プラセボより著しい改善を示す。対照的に、リバビリンは、感染前に始めて９０％の生存率を提供し、ビヒクルは、感染前に始めて１２．５％の生存率を提供した。生存した動物に、感染後の２１日目にＹＦＶを再び抗原投与する。
ＹＦＶに感染したハムスターであって、感染前から感染後４日目まで化合物１２ｉで治療したハムスターは、プラセボを投与したハムスターおよび感染前からリバビリンを投与したハムスターより体重増加を示した。
実施例１８：化合物１２ｉに関するマールブルグウイルス研究
１０００ｐｆｕのマウスに順応したＭＡＲＶ−Ｒａｖｎを抗原投与した（腹腔内）週齢１０〜１２週のＢＡＬＢ／ｃマウスに、化合物１２ｉを筋肉内投与した。この研究を１０グループに分けた（グループ当たりＮ＝１０）。投薬計画、経路、および用量が、表７に示されている。化合物１２ｉを、投与前に０．９％の生理食塩水中に溶かし、健康状態および体重を、感染後の１４日間に亘り監視した。
この研究における１０グループの生存率パーセントが表８に含まれている。ビヒクルのみ（０．９％の生理食塩水）で治療されたマウスに関する生存率は、７日目で６０％であり、８〜１２日目で３０％であった。化合物１２ｉは、全ての用量で、７日目で少なくとも９０％に、８〜１２日目で少なくとも８０％に生存率を上昇させたことを示した。
実施例１９：薬の剤形
以下は、ヒトへの治療的または予防的使用のための、本発明の化合物（「化合物Ｘ」）を含有する代表的な薬の剤形を説明するものである。
上述した製剤は、医薬業界においてよく知られた従来の手法により得られるであろう。
全ての刊行物、特許、および特許文献は、個別に引用されているかのように引用される。本発明は、様々な特別なまた好ましい実施の形態および教示を参照して記載してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲内にありながら、多くの改変および変更を行ってもよいと理解すべきである。

Claims (9)

  1. 下記の化合物、並びにその薬学的に許容される塩からなる群より選択される、化合物。
  2. 下記式により表される化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項１記載の化合物。
  3. 請求項１または２に記載の化合物を含む、ウイルスの複製を阻害するための医薬組成物。
  4. 請求項１または２に記載の化合物を含む、ウイルス感染を治療するための医薬組成物。
  5. 前記ウイルスルが、ＲＮＡウイルスからなる群より選択される、請求項３または４に記載の医薬組成物。
  6. 前記ウイルスが、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フラビウイルス科、フィロウイルス科、トガウイルス科、ピコルナウイルス科、およびコロナウイルス科からなる群より選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 前記ウイルスが、アデノウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エボラウイルス、コクサッキーウイルス、ウエストナイルウイルス、天然痘ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラ・クロスウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、クリミア・コンゴウイルス、マールブルグ・ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、プンタトロウイルス、タカリベウイルス、およびピキンデウイルスからなる群より選択される、請求項３または４に記載の医薬組成物。
  8. 前記ウイルスが、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 前記ウイルスが、アデノウイルス、デング熱ウイルス、マールブルグ・ウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、フニンウイルス、麻疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ピキンデウイルス、プンタトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、タカリベウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、および黄熱病ウイルスからなる群より選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
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