JP6427329B2 - Wheat-derived promoter - Google Patents
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Description
本発明は、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化するコムギ由来のプロモーターに関する。さらに本発明は、本発明のプロモーターを用いた、ベクター、微生物又はウイルス、形質転換体、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物の製造方法、並びに乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を植物に付与する方法に関する。 The present invention relates to a wheat-derived promoter that is activated under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions. Furthermore, the present invention provides a method of producing a plant having tolerance to vector, microorganism or virus, transformant, drought stress, salt stress and low temperature stress, and drought stress, salt stress and low temperature stress using the promoter of the present invention. It relates to a method of conferring resistance on plants.
植物は、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレスなど様々な環境ストレスに対応するための耐性機構を有している。近年、このようなストレスに対する耐性を有する植物が作製されている。例えば、特許文献１には、渇水、高塩分または極端な温度から農産物を保護することを目的としたトレハロース産生トランスジェニック植物が記載されている。また、特許文献２には、高等植物の光合成関連タンパク質の生産を促進することを特徴とする植物の環境ストレスに耐性を高める方法が記載されている。さらに特許文献３には、少なくとも１種のポリアミン合成酵素酵素遺伝子を植物中で機能し得る誘導性プロモーターの制御下で安定に保持し、且つ該外因性のポリアミン合成酵素酵素遺伝子を有していない比較対照植物に比べて少なくとも1種のストレス耐性が改良された植物及びその子孫が記載されている。
Plants have tolerance mechanisms to cope with various environmental stresses such as drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress. In recent years, plants having resistance to such stress have been produced. For example, Patent Document 1 describes a trehalose-producing transgenic plant for the purpose of protecting agricultural products from drought, high salinity or extreme temperatures. In addition,
また、ストレス誘導性プロモーターを用いて環境ストレス耐性を植物に付与することも報告されている。例えば、特許文献４及び５には、所定の塩基配列を有するイネ由来のストレス誘導性プロモーターが記載されている。また、特許文献６には、耐塩植物として知られているシロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ Ｌ．）におけるコリンモノオキシゲナーゼ遺伝子の上流に位置する環境ストレス応答性プロモーターが記載されている。さらに特許文献７及び８には、シロイヌナズナ由来の環境ストレス応答性プロモーターが記載されている。
Also, it has been reported to impart environmental stress tolerance to plants using a stress inducible promoter. For example,
上記の通り、イネ、シロザおよびシロイヌナズナに由来する環境ストレス応答性プロモーターについての報告はあるが、コムギについての環境ストレス応答性プロモーターの報告はほとんどない。また、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーターについての報告もない。本発明は、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化する能力を有する新規なプロモーターを提供すること解決すべき課題とした。 As described above, there have been reports of environmental stress responsive promoters derived from rice, shiroza and Arabidopsis thaliana, but there are few reports of environmental stress responsive promoters for wheat. In addition, there is no report on a promoter having the ability to be activated under any of drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes. An object of the present invention is to provide a novel promoter having an ability to activate under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化する能力を有する、コムギに由来する新規プロモーターをクローニングすることに成功し、本発明を完成するに到った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have developed a novel wheat-derived promoter having the ability to activate under any of drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions. It succeeded in cloning and came to complete this invention.
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１） 乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するコムギ由来のプロモーター。
（２） Triticum monococcum由来である、（１）に記載のプロモーター。
（３） 乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと比較して１〜１５０倍である、（１）又は（２）に記載のプロモーター。
（４）乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において０．７倍以上であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．２倍以上であり、根において２０倍以上であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において１０倍以上である、（１）から（３）の何れかに記載のプロモーター。
（５）乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４．０〜６３．１倍であり、根において１０．９〜４１．８倍であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．５〜３３．５倍であり、根において３０．１〜１９０．５倍以下であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．８〜４３．３倍であり、根において１４．１〜８８１．５倍以下である、（１）から（４）の何れかに記載のプロモーター。
（６） MYCATRD22（塩基配列はCACATG）、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）、ABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）からなる群から選択される少なくとも１種以上のモチーフを少なくとも１個以上有する、（１）から（５）の何れかに記載のプロモーター。
（７） 以下の（ａ）〜(ｄ）の何れかである、（１）から（６）の何れかに記載のプロモーター。
（ａ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列を含むプロモーター；
（ｂ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；
（ｃ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；又は
（ｄ）配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター。
（８） （１）から（７）の何れかに記載のプロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された遺伝子とを含むベクター。
（９） （８）に記載のベクターを含む微生物又はウイルス。
（１０） （８）に記載のベクター及び／あるいは（９）に記載の微生物又はウイルスにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
（１１） 前記宿主細胞が単子葉植物由来の細胞である、（１０）に記載の形質転換体。
（１２） 前記宿主細胞がコムギ（Triticum aestivum）由来の細胞である（１０）又は（１１）に記載の形質転換体。
（１３） （８）に記載のベクター及び／あるいは（９）に記載の微生物又はウイルスを植物細胞内に導入する工程を含む、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物の製造方法。
（１４） （８）に記載のベクター及び／あるいは（９）に記載の微生物又はウイルスを植物細胞内に導入する工程を含む、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を植物に付与する方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) A wheat-derived promoter having the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes.
(2) The promoter according to (1), which is derived from Triticum monococcum.
(3) The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions is 1 to 150 times that of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, The promoter as described in (1) or (2).
(4) The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is 3.0 times or more in leaves and 0.7 times or more in roots as compared to the start of drought stress treatment Yes,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is 1.2-fold or more in leaves and 20-fold or more in roots as compared to the beginning of salt stress treatment,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is 3.0 times or more in leaves and 10 times or more in roots as compared to the start of cold stress treatment, (1) The promoter according to any one of (3) to (3).
(5) The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is 4.0 to 63.1 times in leaves and 10.9 in roots as compared to that at the start of drought stress treatment ~ 41.8 times,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is 1.5 to 33.5-fold in leaves compared to that at the start of salt stress treatment, and in the roots from 3 to 190. 5 times or less,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is 3.8 to 43.3 times in leaves compared to that at the start of cold stress treatment and 14.1 to 881 in roots. The promoter according to any one of (1) to (4), which is 5 times or less.
(6) MYCATRD22 (base sequence is CACATG), MYCATERD1 (base sequence is CATGTG), MYBCORE (base sequence is CNGTTR), MYB2AT (base sequence is TAACTG), CBFHV (base sequence is RYCGAC), ABRELATERD1 (base sequence is ACGTG) , ABREATRD 22 (base sequence is RYACGTGGYR), GT1 GMSCAM 4 (base sequence is GAAAAA), LTRECOREATCOR15 (base sequence is CCGAC), and CCAATBOX1 (base sequence is CCAAT) at least one or more motifs selected from the group consisting of The promoter according to any one of (1) to (5), which has the above.
(7) The promoter according to any one of (1) to (6), which is any of the following (a) to (d).
(A) a promoter comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17, 18 or 21;
(B) A base sequence having a sequence identity of 90% or more with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, 18 or 21, activated under dry stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions, A promoter having the ability to increase the expression level of downstream linked genes;
(C) In the base sequence shown in SEQ ID NO: 17, 18 or 21, it contains a base sequence in which one or more bases are deleted, inserted, substituted and / or added, under dry stress conditions, salt stress conditions, And a promoter having the ability to activate under cold stress conditions to increase the expression level of the downstream linked gene; or (d) a base sequence and a string complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, 18 or 21 A promoter comprising a base sequence that hybridizes under a gen condition, and having the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes.
(8) A vector comprising the promoter according to any one of (1) to (7) and a gene linked downstream of the promoter.
(9) A microorganism or a virus comprising the vector according to (8).
(10) A transformant obtained by transforming a host cell with the vector according to (8) and / or the microorganism or virus according to (9).
(11) The transformant according to (10), wherein the host cell is a monocotyledon-derived cell.
(12) The transformant according to (10) or (11), wherein the host cell is a cell derived from wheat (Triticum aestivum).
(13) A method for producing a plant having tolerance to drought stress, salt stress and low temperature stress, comprising the step of introducing the vector of (8) and / or the microorganism or virus of (9) into a plant cell.
(14) A method for imparting tolerance to drought stress, salt stress and low temperature stress to a plant, comprising the step of introducing the vector according to (8) and / or the microorganism or virus according to (9) into a plant cell.
本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の何れにおいても活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する。本発明のプロモーターを利用することにより、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有する植物を製造することが可能である。 The promoter of the present invention has the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes. By using the promoter of the present invention, it is possible to produce plants having tolerance to drought stress, salt stress and low temperature stress.
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）プロモーター
本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有することを特徴とする。プロモーターが活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大するとは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、又は低温ストレス条件下にプロモーターを曝した場合に、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合し、プロモーターの下流に連結した遺伝子の転写を活性化して、当該遺伝子の発現量を増大することを言う。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
(1) Promoter The promoter of the present invention is characterized by having the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes. When the promoter is activated to increase the expression level of the gene linked downstream, RNA polymerase binds to the promoter when the promoter is exposed under dry stress conditions, salt stress conditions, or low temperature stress conditions, It refers to activating the transcription of a gene linked downstream of a promoter to increase the expression level of the gene.
乾燥ストレス条件とは、水分が欠乏した状態を意味し、例えば、植物体をタオルの上に置くなど水分を吸収できない状態に置くことを言う。塩ストレス条件とは、５０ｍＭ〜６００ｍＭ、好ましくは１００ｍＭ〜４００ｍＭの濃度のＮａＣｌを継続的に０．５時間〜数週間処理したときの状態を意味する。低温ストレス条件とは、生物種の生活至適温度よりも低い温度にさらされた状態を言い、例えば、コムギの場合には−２０℃〜＋１０℃、好ましくは−１５℃〜＋５℃の温度で継続的に1時間〜数週間処理することを言う。 The dry stress condition means a state of lack of water, for example, placing the plant body in a state where it can not absorb water, such as putting it on a towel. The salt stress condition means a state where NaCl at a concentration of 50 mM to 600 mM, preferably 100 mM to 400 mM, is continuously treated for 0.5 hours to several weeks. The low temperature stress condition means a condition exposed to a temperature lower than the optimum temperature for living species, for example, in the case of wheat, at a temperature of -20 ° C to + 10 ° C, preferably -15 ° C to + 5 ° C. It says to treat continuously for one hour to several weeks.
乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するか否かは、以下のような手法により確認することができる。即ち、種々のレポーター遺伝子（例えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（ＧＦＰ）等）をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入した後、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下の各々の何れにおいても活性化することを特徴とする。 Whether it has the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes can be confirmed by the following procedure. . That is, a vector is prepared by linking various reporter genes (eg, β-glucuronidase gene (GUS), luciferase gene (LUC), green fluorescent protein gene (GFP), etc.) downstream of the promoter, and the vector is It can be confirmed by measuring the expression of the reporter gene under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions after introduction into the genome of the host. The promoter of the present invention is characterized in that it is activated under drought stress conditions, salt stress conditions, and low temperature stress conditions.
本発明のプロモーターが由来する生物はコムギであり、コムギとしては、1粒系 T. aegilopoides、T. thaoudar、T. monococcum 2粒系 T. dicoccoides、T. dicoccum（2粒コムギ、エンマーコムギ）、T. pyromidale、T. orientale（コーラサンコムギ）、T. durum（デュラムコムギ、マカロニコムギ）、T. turgidum（リベットコムギ）、T. polonicum（ポーランドコムギ）、T. persicum（ペルシャコムギ）、普通系 T. aestivum（普通コムギ、パンコムギ）、T. spelta（スペルトコムギ〔ディンケルコムギ、ファッロコムギ〕）、T. compactum（クラブコムギ、密穂コムギ）T. sphaerococcum（インド矮性コムギ）、T. maha（マカコムギ）、T. vavilovii（バビロビコムギ） チモフェービ系 T. timopheevi などが挙げられるが、特に限定されない。上記の中でも特にTriticum monococcum由来のプロモーターが好ましい。 The organism from which the promoter of the present invention is derived is wheat, and as wheat, T. agilopoides, T. thaoudar, T. monococcum, 2 grains T. dicoccoides, T. dicoccum (2 grains, Emmer wheat), T Pyromidale, T. orientale (cola wheat), T. durum (durum wheat, macaroni wheat), T. turgidum (rivet wheat), T. polonicum (Polish wheat), T. persicum (Persia wheat), ordinary strain T . aestivum (normal wheat, bread wheat), T. spelta (spelled wheat (dinkel wheat, farlo wheat)), T. compactum (club wheat, thick eared wheat) T. sphaerococcum (Indian dwarf wheat), T. maha (maca wheat) , T. vavilovii (Babilovi wheat), Tymofevi strain T. timopheevi etc., but not particularly limited. Among the above-mentioned, a promoter derived from Triticum monococcum is particularly preferable.
好ましい実施態様においては、本発明のプロモーターは、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと比較して１〜１５０倍（好ましくは１．０２倍以上、１４０倍以下、より好ましくは１．０４倍以上、１３８．７倍以下）である。 In a preferred embodiment, the promoter of the present invention has the ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions compared to the cauliflower mosaic virus 35S promoter It is 1 to 150 times (preferably 1.02 to 140 times, more preferably 1.04 to 138.7 times).
好ましい実施態様においては、本発明のプロモーターは以下の（条件ｉ）〜（条件ｉｉｉ）の何れかを満たすプロモーターである。
（条件ｉ）
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上（好ましくは３．５倍以上、より好ましくは４．０倍以上）であり、根において０．７倍以上（好ましくは０．７５倍以上、より好ましくは０．８倍以上）であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．２倍以上（好ましくは１．４倍以上、より好ましくは１．５倍以上）であり、根において２０倍以上（好ましくは２５倍以上、より好ましくは３０．１倍以上）であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上（好ましくは３．５倍以上、より好ましくは３．８倍以上）であり、根において１０倍以上（好ましくは１２倍以上、より好ましくは１４．１倍以上）である。
In a preferred embodiment, the promoter of the present invention is a promoter satisfying any of the following (condition i) to (condition iii):
(Condition i)
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is 3.0 times or more (preferably 3.5 times or more, more preferably 4.) or more in leaves as compared to that at the start of drought stress treatment. 0 times or more), and 0.7 times or more (preferably 0.75 times or more, more preferably 0.8 times or more) in the root,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is at least 1.2 times (preferably 1.4 times or more, more preferably 1. times or more) in the leaves as compared to the start of salt stress treatment. 5 times or more), 20 times or more (preferably 25 times or more, more preferably 30.1 times or more) in the root,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under low temperature stress conditions is 3.0 times or more (preferably 3.5 times or more, more preferably 3. or more) in the leaves as compared to the start of low temperature stress treatment. 8 times or more) and 10 times or more (preferably 12 times or more, more preferably 14.1 times or more) in the root.
（条件ｉｉ）
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４０倍以上（好ましくは５０倍以上、より好ましくは５５．６倍以上）であり、根において３０倍以上（好ましくは３５倍以上、より好ましくは４１．８倍以上）であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において２０倍以上（好ましくは３０倍以上、より好ましくは３３．５倍以上）であり、根において１００倍以上（好ましくは１５０倍以上、より好ましくは１９０．５倍以上）であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３０倍以上（好ましくは４０倍以上、より好ましくは４１．８倍以上）であり、根において３００倍以上（好ましくは５００倍以上、より好ましくは８８１．５倍以上）である。
(Condition ii)
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is at least 40 times (preferably 50 times or more, more preferably 55.6 times or more) in the leaves as compared to the start of drought stress treatment And 30 times or more (preferably 35 times or more, more preferably 41.8 times or more) in the root,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is at least 20 times (preferably 30 times or more, more preferably 33.5 times or more) in leaves as compared to when salt stress treatment is initiated And 100 times or more (preferably 150 times or more, more preferably 190.5 times or more) in the root,
30-fold or more (preferably 40-fold or more, more preferably 41.8-fold or more) in leaves as compared with the initiation of low temperature stress treatment, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under low temperature stress conditions And 300 times or more (preferably 500 times or more, more preferably 881.5 times or more) in the root.
（条件ｉｉｉ）
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４０倍以上（好ましくは５０倍以上、より好ましくは６３．１倍以上）であり、根において５倍以上（好ましくは８倍以上、より好ましくは１０．９倍以上）であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において３倍以上（好ましくは４．０倍以上、より好ましくは５．３倍以上）であり、根において１００倍以上（好ましくは１５０倍以上、より好ましくは１８２．６倍以上）であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３０倍以上（好ましくは４０倍以上、より好ましくは４３．３倍以上）であり、根において２００倍以上（好ましくは３００倍以上、より好ましくは４４７．４倍以上）である。
(Condition iii)
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is at least 40-fold (preferably 50-fold or more, more preferably 63.1-fold or more) in leaves as compared to the start of drought stress treatment And 5 times or more (preferably 8 times or more, more preferably 10.9 times or more) in the root,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is 3 times or more (preferably 4.0 times or more, more preferably 5.3 times or more) in the leaves as compared to the beginning of salt stress treatment Or more, and 100 times or more (preferably 150 times or more, more preferably 182.6 times or more) in the root,
30-fold or more (preferably 40-fold or more, more preferably 43.3-fold or more) in leaves compared to the start of low temperature stress treatment, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under low temperature stress conditions In the root, it is 200 times or more (preferably 300 times or more, more preferably 447.4 times or more).
より好ましい実施態様においては、本発明のプロモーターは以下を満たすプロモーターである。
乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において４．０倍以上、６３．１倍以下であり、より好ましくは５５．６倍以上、６３．１倍以下であり、根において０．８倍以上、４１．８倍以下であり、より好ましくは１０．９倍以上、４１．８倍以下であり、
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．５倍以上、３３．５倍以下であり、より好ましくは５．３倍以上、３３．５倍以下であり、根において３０．１倍以上、１９０．５倍以下であり、より好ましくは、１８２．６倍以上、１９０．５倍以下であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．８倍以上、４３．３倍以下であり、より好ましくは４１．８倍以上、４３．３倍以下であり、根において１４．１倍以上、８８１．５倍以下であり、より好ましくは４４７．４倍以上、８８１．５倍以下である。
In a more preferred embodiment, the promoter of the present invention is a promoter satisfying the following.
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is 4.0-fold or more and 63.1-fold or less, more preferably 55. 6 times or more and 63.1 times or less, and 0.8 times or more and 41.8 times or less, more preferably 10.9 times or more and 41.8 times or less in the root,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is 1.5 times or more and 33.5 times or less in the leaves as compared to the start of salt stress treatment, and more preferably 5. 3 times or more and 33.5 times or less, and 30.1 times or more and 190.5 times or less, more preferably 182.6 times or more and 190.5 times or less, in the root,
41. The ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is 3.8 times or more and 43.3 times or less in the leaves as compared to the start of cold stress treatment, more preferably 41. It is 8 times or more and 43.3 times or less, and in the root, 14.1 times or more and 881.5 times or less, more preferably 447.4 times or more and 881.5 times or less.
本発明のプロモーターの具体例としては、以下の実施例で取得された配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列を含むプロモーターを挙げることができる。
配列番号１７（RFL_Contig1515）、配列番号１８（tplb0004l11）および配列番号２１（tplb0015p04）に記載の塩基配列を含むプロモーターに存在するモチーフの種類の位置を図６に示す。本発明のプロモーターは、MYCATRD22（塩基配列はCACATG）、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）、ABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）からなる群から選択される少なくとも１種以上（好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上）のモチーフを少なくとも１個以上（好ましくは３個以上、より好ましくは５個以上、特に好ましくは８個以上）有することが好ましい。
Specific examples of the promoter of the present invention include a promoter comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17, 18 or 21 obtained in the following Examples.
The position of the type of motif present in the promoter comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 (RFL_Contig 1515), SEQ ID NO: 18 (tplb0004111) and SEQ ID NO: 21 (tplb0015p04) is shown in FIG. The promoter of the present invention is MYCATRD22 (base sequence is CACATG), MYCATERD1 (base sequence is CATGTG), MYBCORE (base sequence is CNGTTR), MYB2AT (base sequence is TAACTG), CBFHV (base sequence is RYCGAC), ABRELATERD1 (base sequence Is ACGTG, ABREATRD 22 (base sequence RYACGTGGYR), GT1GMSCAM4 (base sequence is GAAAAA), LTRECOREATCOR15 (base sequence is CCGAC), and at least one selected from the group consisting of CCAATBOX1 (base sequence is CCAAT) (preferably) At least one (preferably 3 or more, more preferably 5 or more, particularly preferably 8 or more, preferably 2 or more, more preferably 3 or more, further preferably 4 or more, more preferably 5 or more motifs. Or more) is preferable.
本発明のプロモーターの具体例としては、以下を挙げることができる。
・MYCATRD22（塩基配列はCACATG）を１個、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）を３個、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）を１個、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）又はABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）を２個、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）を１個、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）を３個有するプロモーター（例えば、配列番号１７のRFL_Contig1515）
・MYCATRD22（塩基配列はCACATG）を３個、MYCATERD1（塩基配列はCATGTG）を１個、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）を５個、MYB2AT（塩基配列はTAACTG）を１個、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）を１個、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）を１個有するプロモーター（例えば、配列番号１８のtplb0004l11）
・MYCATRD22（塩基配列はCACATG）を１個、MYBCORE（塩基配列はCNGTTR）を２個、CBFHV（塩基配列はRYCGAC）を４個、ABRELATERD1 （塩基配列はACGTG）またはABREATRD22（塩基配列はRYACGTGGYR）を１個、GT1GMSCAM4（塩基配列はGAAAAA）を１個、LTRECOREATCOR15（塩基配列は CCGAC）を３個、及びCCAATBOX1（塩基配列はCCAAT）を３個有するプロモーター（例えば、配列番号２１のtplb0015p04）
The following can be mentioned as specific examples of the promoter of the present invention.
-One MYCATRD22 (base sequence is CACATG), three MYBCORE (base sequence is CNGTTR), one MYB2AT (base sequence is TAACTG), ABRELATERD1 (base sequence is ACGTG) or ABREATRD22 (base sequence is RYACGTGGYR) A promoter having two GT1GMSCAM4 (base sequence is GAAAAA) and three CCAATBOX1 (base sequence is CCAAT) (for example, RFL_Contig 1515 of SEQ ID NO: 17)
・ 3 MYCATRD22 (base sequence is CACATG), 1 MYCATERD1 (base sequence is CATGTG), 5 MYBCORE (base sequence is CNGTTR), 1 MYB2AT (base sequence is TAACTG), 1 GT1 GMSCAM4 (base sequence is A promoter having one GAAAAA) and one CCAATBOX1 (the base sequence is CCAAT) (for example, tplb0004111 of SEQ ID NO: 18)
・ 1 MYCATRD22 (base sequence is CACATG), 2 MYBCORE (base sequence is CNGTTR), 4 CBFHV (base sequence is RYCGAC), ABRELATERD1 (base sequence is ACGTG) or ABREATRD22 (base sequence is RYACGTGGYR) One promoter, one GT1 GMS CAM4 (base sequence is GAAAAA), 3 LTRECOREATCOR15 (base sequence is CCGAC), and 3 CCAATBOX1 (base sequence is CCAAT) (for example, tplb0015p04 of SEQ ID NO: 21)
さらに、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する限りは、配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する塩基配列を含むプロモーターでもよい。 Furthermore, as long as it has the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes, the bases described in SEQ ID NO: 17, 18 or 21 The promoter may be a promoter containing a nucleotide sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more).
さらに、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する限りは、配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列において、例えば、１又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含むプロモーターでよく、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含むプロモーターも使用することができる。 Furthermore, as long as it has the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes, the bases described in SEQ ID NO: 17, 18 or 21 The sequence may be, for example, a promoter containing a nucleotide sequence in which one or more bases are deleted, inserted, substituted and / or added, and is 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 It is also possible to use a promoter comprising a nucleotide sequence in which 1 to 3, particularly preferably 1 to 3 bases have been deleted, inserted, substituted and / or added.
さらに、本発明おけるプロモーターは、当該プロモーターが有しているモチーフ以外の塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加させてもよい。
例えば以下のプロモーターを挙げることができる。なお、１〜２００ｂｐとは１〜２００番目までの塩基を意味し、上記以外の記載も同様である。
（i）配列番号１７，１８又は２１に記載の塩基配列における転写開始点（ＡＴＧ）から直近のＴＡＴＡボックスまで、及び／又は１〜２００ｂｐまでの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
（ii）配列番号１７記載の塩基配列における２０１〜３６２ｂｐ、３６９〜４７１ｂｐ、４７７〜４８７ｂｐ、４９３〜７５９ｂｐ、７６５〜８８０ｂｐ、８８７〜１０６１ｂｐ、１０６８〜１０９０ｂｐ、１０９７〜１２１１ｂｐ、１２１８〜１３７４ｂｐ、１３８０〜１４３７ｂｐ、１４４４〜１５０９ｂｐの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
（iii）配列番号１８記載の塩基配列における２０１〜２０５ｂｐ、２１３〜５８３ｂｐ、５９０〜６８９ｂｐ、７０３〜７２１ｂｐ、７２８〜１１５６ｂｐ、１１６３〜１３６５ｂｐ、１３７１〜１４０７ｂｐ、１４１４〜１５４０ｂｐ、１５４９〜１５８８ｂｐ、１５９５〜１６１９ｂｐ、１６２６〜１７５２ｂｐの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
（iv）配列番号２１記載の塩基配列における２０１〜４２７ｂｐ、４３４〜５２５ｂｐ、５３２〜５３８ｂｐ、５４４〜６１２ｂｐ、６１８〜７６３ｂｐ、７６９〜１１９０ｂｐ、１１９７〜１４６２ｂｐ、１４８１〜１５３１ｂｐ、１５３８〜１６０７ｂｐ、１６１４〜１６３４ｂｐの塩基配列において、１又は複数個の塩基を欠失、挿入、置換及び/または付加したプロモーター。
Furthermore, the promoter of the present invention may have one or more bases deleted, inserted, substituted and / or added in a base sequence other than the motif of the promoter.
For example, the following promoters can be mentioned. In addition, 1-200 bp means the 1st-200th base, and the description of those other than the above is also the same.
(I) deletion of one or more bases from the transcription start point (ATG) in the base sequence of SEQ ID NO: 17, 18 or 21 to the nearest TATA box and / or in the base sequence of 1 to 200 bp , Inserted, substituted and / or added promoters.
(Ii) 201 to 362 bp, 369 to 471 bp, 477 to 487 bp, 493 to 759 bp, 765 to 880 bp, 887 to 1061 bp, 1068 to 1090 bp, 1097 to 1211 bp, 1218 to 1374 bp, 1380 to 1437 bp in the base sequence described in SEQ ID NO: 17 , A promoter in which one or more bases are deleted, inserted, substituted and / or added in the base sequence of 1444-1509 bp.
(Iii) 201 to 205 bp, 213 to 583 bp, 590 to 689 bp, 703 to 721 bp, 1163 to 1365 bp, 1371 to 1407 bp, 1414 to 1540 bp, 1549 to 15188 bp, 1595 to 1619 bp of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 , A promoter in which one or more bases are deleted, inserted, substituted and / or added in the base sequence of 1626 to 1752 bp.
(Iv) 201-427 bp, 434-525 bp, 532-538 bp, 544-612 bp, 618-763 bp, 769-1190 bp, 1197-1462 bp, 1481-1531 bp, 1538-1607 bp, 1614-1634 bp of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 21 A promoter in which one or more bases are deleted, inserted, substituted and / or added in the base sequence of
さらに、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有する限りは、配列番号１７、１８又は２１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むプロモーターでもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃、より好ましくは50〜65℃、特に好ましくは55〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃、50℃、55℃、60℃または65℃である。 Furthermore, as long as it has the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes, the bases described in SEQ ID NO: 17, 18 or 21 It may be a promoter containing a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the sequence. Here, under stringent conditions, the sodium concentration is 25 to 500 mM, preferably 25 to 300 mM, the temperature is 42 to 68 ° C., preferably 42 to 65 ° C., more preferably 50 to 65 ° C., particularly preferably 55-65 ° C. More specifically, 5 × SSC (83 mM NaCl, 83 mM sodium citrate) at a temperature of 42 ° C., 50 ° C., 55 ° C., 60 ° C. or 65 ° C.
本発明のプロモーターは、上記した塩基配列において、これらの３'末端に翻訳効率を向上させる塩基配列を付加したものでもよいし、プロモーター活性を喪失しない限りその５'末端を欠失したものでもよい。 The promoter of the present invention may have a base sequence to improve translation efficiency added to the 3 'end of the above-mentioned base sequence, or may have the 5' end deleted as long as promoter activity is not lost. .
本発明のプロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明のプロモーターを得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明のプロモーターの変異型であって変異前のプロモーターと同等の機能を有するものを合成することもできる。 なお、部位特異的突然変異誘発法としては、変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて行うことができ、またTAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行うこともできる。 After the base sequence of the promoter of the present invention is determined, the present invention is subsequently carried out by chemical synthesis, by PCR using a cloned probe as a template, or by hybridizing a DNA fragment having the base sequence as a probe. Promoters can be obtained. Furthermore, it is possible to synthesize a mutant of the promoter of the present invention which has the same function as the promoter before mutation by site-directed mutagenesis and the like. The site-directed mutagenesis can be carried out using a kit for mutagenesis (for example, Mutant-K (manufactured by TAKARA) or Mutant-G (manufactured by TAKARA)), and LA manufactured by TAKARA. Mutation introduction can also be performed using the PCR in vitro Mutagenesis series kit.
２．ベクター
本発明のベクターは、適当なベクターに本発明のプロモーターを連結することにより製造することができる。本発明のプロモーターを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。
2. Vector The vector of the present invention can be produced by ligating the promoter of the present invention to a suitable vector. The vector for inserting the promoter of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples include plasmids, shuttle vectors, helper plasmids and the like.
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられる。ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
Examples of plasmid DNA include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YCp50, etc.) And the like. Examples of the phage DNA include λ phage (Charon 4A, Charon 21A,
ベクターに本発明のプロモーターを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。 In order to insert the promoter of the present invention into a vector, first, purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into a restriction enzyme site or multiple cloning site of an appropriate vector DNA, and ligated to the vector, etc. Will be adopted.
本発明においては、所望の遺伝子を発現させるため、上記のベクターに、さらに遺伝子を挿入することができる。遺伝子を挿入する手法は、ベクターにプロモーターを挿入する方法と同様である。遺伝子の種類は特に限定されるものではないが、例えば、植物に対して乾燥ストレス、塩ストレス及び／又は低温ストレスに対する耐性を付与できるタンパク質をコードする遺伝子などが好ましい。 In the present invention, a gene can be further inserted into the above-described vector in order to express a desired gene. The method of inserting a gene is the same as the method of inserting a promoter into a vector. Although the type of gene is not particularly limited, for example, a gene encoding a protein capable of conferring tolerance to drought stress, salt stress and / or low temperature stress to a plant is preferable.
本発明のベクターにおいて、本発明のプロモーターは、上記した所望の遺伝子の機能が発揮されるように、当該遺伝子が発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、遺伝子が導入される宿主生物においてプロモーターの制御下に遺伝子が発現されるように、遺伝子とプロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。即ち、本発明のベクターには、本発明のプロモーター及び所望の遺伝子の他に、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。 In the vector of the present invention, the promoter of the present invention needs to be incorporated into the vector such that the gene can be expressed so that the function of the desired gene described above can be exerted. The state capable of expression means that a gene and a promoter are linked and integrated into a vector such that the gene is expressed under the control of the promoter in a host organism into which the gene is introduced. That is, in addition to the promoter of the present invention and a desired gene, a terminator, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence) and the like can be ligated to the vector of the present invention . Examples of selection markers include antibiotic resistance genes such as ampicillin resistance gene and kanamycin resistance gene, and herbicide resistance genes such as bialaphos resistance gene.
さらに、本発明のプロモーターに目的の任意遺伝子をセンス又はアンチセンス方向で接続したものを作製し、これをバイナリーベクターと呼ばれるpBI101(Clonetech社)などのベクターに挿入することができる。 Furthermore, a promoter of the present invention in which an arbitrary gene of interest is connected in a sense or antisense direction can be prepared and inserted into a vector such as pBI101 (Clonetech) called a binary vector.
３．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プロモーター又は目的遺伝子、環境ストレス応答性転写因子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、植物が好ましい。宿主が植物である場合は、形質転換植物（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。
3. Transformant The transformant of the present invention can be obtained by introducing the expression vector of the present invention into a host. Here, the host is not particularly limited as long as it can express a promoter or a target gene, an environmental stress responsive transcription factor, but a plant is preferable. When the host is a plant, a transformed plant (transgenic plant) can be obtained as follows.
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、アブラナ科（例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)など）、イネ科（例えば、コムギ（Triticum）、トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativa)など）、ナス科（例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）など）、マメ科（例えば、ダイズ(Glycine max)など）に属する植物などが挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。 Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundles etc.) Or plant cultured cells. Plants used for transformation include Brassicaceae (eg, Arabidopsis thaliana etc.), Gramineae (eg, Wheat (Triticum), maize (Zea mays), rice (Oryza sativa) etc.), solanaceous plants (eg, And tobacco (Nicotiana tabacum etc.), plants belonging to the leguminous family (eg, soybean (Glycine max) etc.), etc., but it is not limited to these plants.
本発明のベクターは、通常の形質転換方法、例えばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって宿主中に導入することができる。 The vector of the present invention can be introduced into a host by a conventional transformation method such as electroporation, Agrobacterium method, particle gun method, PEG method and the like.
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入することができる。 For example, in the case of using electroporation, a gene can be introduced into a host by treatment under conditions of voltages of 500 to 1600 V, 25 to 1000 μF, and 20 to 30 msec by an electroporation apparatus provided with a pulse controller.
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。 When the particle gun method is used, a plant, a plant organ, or a plant tissue itself may be used as it is, may be used after preparing a section, or may be used after preparing a protoplast. The sample thus prepared can be processed using a gene transfer device (eg, PDS-1000 / He etc. from Bio-Rad). The treatment conditions vary depending on the plant or sample, but usually the pressure is about 1000 to 1800 psi and the distance is about 5 to 6 cm.
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。 In addition, by using a plant virus as a vector, a target gene can be introduced into a plant. Available plant viruses include, for example, cauliflower mosaic virus. That is, first, a viral genome is inserted into a vector derived from E. coli, etc. to prepare a recombinant, and then these target genes are inserted into the viral genome. The target gene can be introduced into a plant host by excising the thus modified virus genome from the recombinant with restriction enzymes and inoculating the plant host.
アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。 In the method of using the Agrobacterium Ti plasmid, when a bacterium belonging to the genus Agrobacterium infects a plant, it utilizes the property of transferring a part of the plasmid DNA it has into the plant genome. , The target gene is introduced into a plant host. Among bacteria belonging to the Agrobacterium genus, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) infects plants to form a tumor called crown gall, and Agrobacterium rhizogenes (Agrobacterium rhizogenes) infects plants. To generate hairy roots. In these, the region called T-DNA region (Transferred DNA) on the plasmid present in each bacterium called Ti plasmid or Ri plasmid during infection is transferred into the plant and integrated into the plant genome. It is due to
Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。 If DNA to be integrated into the plant genome is inserted into the T-DNA region on the Ti or Ri plasmid, the target DNA can be incorporated into the plant genome when Agrobacterium bacteria infect the plant host. It can be incorporated.
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。 Tumor tissue, shoots, hairy roots and the like obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture, and can be used at appropriate concentrations using conventionally known plant tissue culture methods. The plant body can be regenerated by administration of a plant hormone (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.)
本発明のベクターは、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、本発明のプロモーター、リボソーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 The vector of the present invention can be introduced not only into the above-mentioned plant host but also from the genus Escherichia, such as Escherichia coli, Bacillus, such as Bacillus subtilis, or Pseudomonas, such as Pseudomonas putida. (Saccharomyces cerevisiae), yeast such as Schizosaccharomyces pombe (Shizosaccharomyces pombe), animal cells such as COS cells, CHO cells, or insect cells such as Sf9, and transformants are transformed. You can also get it. When using a bacterium such as E. coli or yeast as a host, the recombinant vector of the present invention is autonomously replicable in the bacterium, and simultaneously comprises the promoter of the present invention, a ribosome binding sequence, a target gene, and a transcription termination sequence Is preferred. In addition, a gene that controls a promoter may be included.
細菌への組み換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。 The method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ion, an electroporation method and the like can be mentioned.
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。 When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, etc. are used. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method and the like.
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。 When an animal cell is used as a host, monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cell (CHO cell), mouse L cell or the like is used. Examples of methods for introducing the recombinant vector into animal cells include electroporation, calcium phosphate method, lipofection method and the like.
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。 When an insect cell is used as a host, Sf9 cells or the like are used. Examples of methods for introducing a recombinant vector into insect cells include calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like.
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行われる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。 Whether or not the gene has been incorporated into the host can be confirmed by PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method or the like. For example, DNA is prepared from transformants, DNA-specific primers are designed, and PCR is performed. The PCR is performed under the same conditions as those used to prepare the plasmid. Thereafter, the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis or the like, stained with ethidium bromide, SYBR Green solution or the like, and the amplified product is detected as a single band, Confirm that it has been transformed. Alternatively, amplification products can be detected by conducting PCR using primers previously labeled with a fluorescent dye or the like. Furthermore, a method may be employed in which the amplification product is bound to a solid phase such as a microplate and the amplification product is confirmed by fluorescence or an enzyme reaction.
４．植物の製造
本発明においては、上記した形質転換植物細胞等から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。
4. Production of Plant In the present invention, the above-mentioned transformed plant cells can be regenerated into transformed plants. As a regeneration method, a method is employed in which callus-like transformed cells are transferred to a culture medium in which the type and concentration of hormone are changed, and cultured to form somatic embryos to obtain a complete plant. As the medium to be used, LS medium, MS medium and the like are exemplified.
本発明においては、本発明のプロモーターを挿入した発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産することができる。 In the present invention, an expression vector into which the promoter of the present invention has been inserted is introduced into a host cell to obtain a transformed plant cell, and the transformed plant is regenerated from the transformed plant cell, and the transformed plant obtained. Plant seeds can be obtained, and plants can be produced from the plant seeds.
形質転換植物体から植物種子を得るには、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。このようにして育種された植物においては、特に本発明のプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を誘導することができる。 To obtain plant seeds from transformed plants, for example, transformed plants are harvested from a rooting medium, transplanted to a pot containing water-containing soil, and grown under constant temperature to form flowers. And finally form seeds. Also, in order to produce a plant from the seed, for example, when the seed formed on the transformed plant matures, it is isolated, sowed in soil containing water, and grown under constant temperature and illuminance. Produce a plant body. In plants thus bred, in particular, expression of a gene located downstream of the promoter of the present invention can be induced.
本発明のプロモーターを導入した形質転換植物体は、その下流に連結した遺伝子の発現量が増大することにより、乾燥ストレス、塩ストレス及び低温ストレスに対する耐性を有することになる。 Transformed plants into which the promoter of the present invention has been introduced have tolerance to drought stress, salt stress and low temperature stress by increasing the expression level of the gene linked downstream.
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited by the examples.
[実施例１] ストレス応答遺伝子の単離
本発明では、Wheat Oligonucleotide Microarray(Agilent Technologies社製)を用いて、環境ストレス時に特異的発現をしている遺伝子を網羅的に解析した。該マイクロアレイはRefSeq(Release 31), Unigene (Build 53), TIGR Plant Transcript Assemblies (Release 5), TIGR Gene Indices (Release 11) といった最新の公共データベースを基にしたオリゴDNAを搭載しており、43,000個以上の転写産物をカバーしている。
Example 1 Isolation of Stress-Responsive Genes In the present invention, genes that are specifically expressed at the time of environmental stress were comprehensively analyzed using Wheat Oligonucleotide Microarray (manufactured by Agilent Technologies). The microarray contains 43,000 oligo DNA based on the latest public databases such as RefSeq (Release 31), Unigene (Build 53), TIGR Plant Transcript Assemblies (Release 5), and TIGR Gene Indicators (Release 11). It covers the above transcripts.
実験に用いたサンプルは、以下のように調製した。コムギ種子（Triticum aestivam Chinese Spring）をシャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことでコムギの葉と根を生育させた。 The samples used for the experiment were prepared as follows. Wheat seeds (Triticum aestivam Chinese Spring) were absorbed on filter paper on a petri dish for 2 days at 4 ° C., and then transferred to a growth chamber under illumination at 22 ° C. for 20 hours for germination. After that, they were transferred onto glass beads and subjected to hydroponic culture for 10 days to grow wheat leaves and roots.
環境ストレスとして乾燥ストレスに応答性を示す遺伝子を解析した。乾燥ストレス処理は、水耕栽培中の植物体をキムタオルの上に置くことで乾燥ストレス状態にし、処理後1、5、10及び24時間で経時的にサンプルを採取した。各時間乾燥ストレス処理したサンプルは葉と根に切り分けその場で液体窒素によりサンプルを凍結保存した。また比較コントロールとして、水耕栽培を継続しているものからも同様に1、5、10及び24時間で経時的にサンプルを採取した。 Genes that respond to drought stress as environmental stress were analyzed. In the drying stress treatment, a plant under hydroponic culture was put on a Kim towel to bring it into a drying stress state, and samples were taken over time at 1, 5, 10 and 24 hours after treatment. The samples that had been subjected to dry stress treatment each time were cut into leaves and roots, and the samples were cryopreserved with liquid nitrogen in situ. Further, as a comparative control, samples were also taken over time at 1, 5, 10 and 24 hours from those continuing hydroponic culture.
凍結保存したサンプルからのtotal RNAの抽出にはRNeasy Plant mini kit(QIAGEN社製)を使用し、NanoDrop ND-2000分光光度計(NanoDrop Technologies社製)を使用して濃度測定を行った。回収したtotal RNAの分解度測定にはAgilent2100バイオアナライザーを使用し、分析キットとしてRNA 6000 Nano kit(Agilent Technologies社製)を用いてRNAの分解度をチェックした。 The RNeasy Plant mini kit (manufactured by QIAGEN) was used for extraction of total RNA from the cryopreserved sample, and concentration measurement was performed using a NanoDrop ND-2000 spectrophotometer (manufactured by NanoDrop Technologies). The degree of degradation of the total RNA was measured using an Agilent 2100 bioanalyzer, and the degree of degradation of RNA was checked using RNA 6000 Nano kit (manufactured by Agilent Technologies) as an analysis kit.
RNAの標識にはLow Input Quick Amp Labeling Kit(Agilent Technologies社製)を使用し、Cy3標識したcDNAを合成した。 For labeling of RNA, Low Input Quick Amp Labeling Kit (manufactured by Agilent Technologies) was used to synthesize Cy3-labeled cDNA.
このcDNAとWheat Oligonucleotide MicroarrayをGene Expression Hybridization Kit(Agilent Technologies社製)を使用してハイブリダイズさせた。その後Gene Expression Wash Pack（Wash buffer1とWash buffer2を含む）(Agilent Technologies社製)を使用して、非特異的な標識ターゲットや非特異的吸着を洗い流してマイクロアレイのスライドガラスを乾燥させた。 The cDNA was hybridized with Wheat Oligonucleotide Microarray using Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies). Thereafter, using a Gene Expression Wash Pack (containing Wash buffer 1 and Wash buffer 2) (manufactured by Agilent Technologies), non-specific labeled targets and non-specific adsorption were washed away to dry the slide glass of the microarray.
スライドガラスをDNA Microarray Scanner(Agilent Technologies社製)に読み込み、各スポットの蛍光強度を数値化した。マイクロアレイデータ解析用のソフトウェアGeneSpring(Agilent Technologies社製)を用いて、各スポットの蛍光強度（数値）、各スポットに搭載された２０mer程度のプローブの番号（ID）、元のＣＤＳ番号（contig又はtplbなど）、及びその遺伝子がコードするタンパク質、ＣＤＳと相同性のある他の植物（イネ、アラビ、オオムギなど）の情報を照合することによって解析を行った。その結果、乾燥時に特異的に発現量が増加する遺伝子を、ストレス応答遺伝子として7個選択した。 The slide glass was read into a DNA Microarray Scanner (manufactured by Agilent Technologies), and the fluorescence intensity of each spot was quantified. Using the GeneSpring (Agilent Technologies) software for microarray data analysis, the fluorescence intensity (numerical value) of each spot, the number of a 20-mer probe mounted on each spot (ID), the original CDS number (contig or tplb The analysis was carried out by collating the information of the proteins encoded by the gene, and other plants (rice, arabi, barley, etc.) having homology with CDS. As a result, seven genes were selected as stress response genes, whose expression amount specifically increases during drying.
[実施例２] プロモーター配列の単離
マイクロアレイ解析の結果選択した遺伝子（CDS）について、コムギCDSデータベース（URL: http://trifldb.psc.riken.jp/index.pl）を検索することで各ストレス応答遺伝子の配列情報を取得した。また、DDBJに登録されているコムギ配列をダウンロードし、アセンブルすることで応答遺伝子の配列情報を取得した。プロモーター配列は遺伝子の開始コドン（ATG）と推測される位置から約1〜2kbの上流付近をプロモーター領域と推定する。
[Example 2] Isolation of Promoter Sequence As a result of microarray analysis, each selected gene (CDS) is searched by searching the wheat CDS database (URL: http://trifldb.psc.riken.jp/index.pl) Sequence information of stress response gene was acquired. In addition, wheat sequences registered in DDBJ were downloaded and assembled to obtain sequence information of response genes. The promoter sequence is presumed to be about 1 to 2 kb upstream of the position assumed to be the start codon (ATG) of the gene as a promoter region.
コムギゲノムの配列情報はいまだ完全には解読されていないため、各遺伝子の上流に存在するプロモーター領域の単離には定法である、5’RACE法やTAIL-PCR法などを用いることができる（島本ら 植物細胞工学シリーズ７ 新版 植物のPCR実験プロトコール 秀潤社）。また、未知領域のシーケンスに特化したDNA Walking Speedup Premix kit(Seegene社製)なども利用することができる。 Since the sequence information of the wheat genome has not been completely decoded yet, it is possible to use the 5 'RACE method, TAIL-PCR method, etc. which are conventional methods for isolation of the promoter region present upstream of each gene Plant cell engineering series 7 New version PCR experiment protocol of plant Shujunsha). In addition, DNA Walking Speedup Premix kit (manufactured by Seegene) specialized for the sequence of the unknown region can also be used.
本発明者らは、まずコムギ（Triticum aestivam Chinese Spring）からプロモーター配列の単離を試みたが、異質倍数体（AABBDD）であるため単一のプロモーター配列を単離することは困難であった。そのため、コムギの祖先種である一粒コムギ（Triticum monococcum A’A’）からプロモーター配列の単離を実施した。 The present inventors first attempted to isolate a promoter sequence from wheat (Triticum aestivam Chinese Spring), but it was difficult to isolate a single promoter sequence because it is a heteroploid (AABBDD). Therefore, isolation of a promoter sequence was performed from single grain wheat (Triticum monococcum A'A ') which is an ancestor of wheat.
一粒コムギ（Triticum monococcum DV92）の種子を実施例１記載の方法で水耕栽培し、生育した葉（第1葉〜第2葉）からCTAB法にてゲノムDNAを抽出した（島本ら 植物細胞工学シリーズ７ 新版 植物のPCR実験プロトコール 秀潤社）。これを鋳型にDNA Walking Speedup Premix kitを使用して、各ストレス応答遺伝子の上流配列の単離を行った。得られた配列はpGET vectorに組み込み、プロモーター領域を同定した。シーケンス解析はDye terminator法により実施し、Applied Biosystems社製の3130xlジェネティックアナライザを用いた。 Seeds of single grain wheat (Triticum monococcum DV 92) were hydroponically cultured according to the method described in Example 1, and genomic DNA was extracted from grown leaves (first to second leaves) by CTAB method (Shimamoto et al. Plant cells Engineering series 7 New version PCR experiment protocol of plant Shujunsha). Using this as a template, DNA Walking Speedup Premix kit was used to isolate upstream sequences of each stress response gene. The obtained sequence was incorporated into pGET vector to identify a promoter region. The sequence analysis was carried out by the dye terminator method, using an Applied Biosystems 3130xl genetic analyzer.
解読されたゲノム情報を元に、各cDNAの上流配列を増幅させるプライマーを設計し直した（表１）。forwardプライマーの5’末端側にはCACCの4塩基配列を付加しており、PCRにてDNAを増幅し、gateway用エントリーベクター pENTR/D-TOPO（invitrogen社製）へクローニングが行える。 Based on the decoded genomic information, primers for amplifying the upstream sequence of each cDNA were redesigned (Table 1). The 4-base sequence of CACC is added to the 5 'end side of the forward primer, and the DNA is amplified by PCR and can be cloned into the gateway entry vector pENTR / D-TOPO (manufactured by Invitrogen).
各cDNAのforwardプライマー及びreverseプライマーを用いて以下の条件にてゲノムPCRを行った。PCRの酵素には非常に高い正確性を有するPrimeSTAR GXLポリメラーゼ(TaKaRa BIO社製)を使用し、50μlの反応系（1X PrimeSTAR GXL バッファー, 0.2mM dNTP 液, 0.2μM PCRプライマー, テンプレート（上記Triticum monococcum DV92ゲノム） 100ng, 1.25U PrimeSTAR GXLポリメラーゼ）で行った。PCRの条件は、最初に94℃で5分反応させた後、98℃で10秒、55℃で15秒及び68℃で2分のサイクルを30サイクル、最後に68℃で5分の条件で行った。PCR産物は、1.0%アガロースゲル電気泳動により、断片のサイズと増幅効率を確認し、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TaKaRa BIO社製)を使用して精製をした。 Genomic PCR was performed using forward and reverse primers of each cDNA under the following conditions. Using PrimeSTAR GXL polymerase (TaKaRa BIO) with very high accuracy as PCR enzyme, 50 μl reaction system (1 × PrimeSTAR GXL buffer, 0.2 mM dNTP solution, 0.2 μM PCR primer, template (Triticum monococcum as described above) DV92 genome) 100 ng, 1.25 U PrimeSTAR GXL polymerase). The PCR conditions are as follows: first react at 94 ° C for 5 minutes, then 30 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 68 ° C for 2 minutes, and finally at 68 ° C for 5 minutes went. The PCR product was confirmed by 1.0% agarose gel electrophoresis to confirm the fragment size and amplification efficiency, and purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (TaKaRa BIO).
精製したPCR産物をpENTR/D-TOPOに組み込み、プロモーター領域のシーケンス解析を行い、変異がないことを確認した。それぞれのプロモーター配列を配列番号１５〜２１に示す。 The purified PCR product was incorporated into pENTR / D-TOPO, and sequence analysis of the promoter region was performed to confirm that there was no mutation. The respective promoter sequences are shown in SEQ ID NOs: 15-21.
ＣＤＳ プロモーター領域の配列
7AL.Contig16213: 配列番号１５
Scaffold2239: 配列番号１６
RFL_Contig1515: 配列番号１７
tplb0004l11: 配列番号１８
tplb0009k09: 配列番号１９
tplb0010o09: 配列番号２０
tplb0015p04: 配列番号２１
Sequence of CDS promoter region
7AL.Contig 16213: SEQ ID NO: 15
Scaffold 2239: SEQ ID NO: 16
RFL_Contig1515: SEQ ID NO: 17
tplb0004l11: SEQ ID NO: 18
tplb0009k09: SEQ ID NO: 19
tplb0010o09: SEQ ID NO: 20
tplb0015p04: SEQ ID NO: 21
[実施例３] 形質転換用アグロバクテリウムの調製
配列が確認されたプロモーターが導入されたpENTR/D-TOPOはgatewayベクターpMDC164（Curtis et. al. (2003) Plant Physiol. Oct;133(2)462-9）とLR Clonase Enzyme mix（invitrogen社製）を使用することで組み換えられ、プロモーター配列の下流にβ-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）とNosターミネーター（Tnos）を連結した発現ベクターとした。なお、pMDC164ベクターはT-DNA領域にハイグロマイシン耐性遺伝子も有している。
Example 3 Preparation of Agrobacterium for Transformation pENTR / D-TOPO into which a promoter having a confirmed sequence was introduced is a gateway vector pMDC164 (Curtis et. Al. (2003) Plant Physiol. Oct; 133 (2) It was recombined by using 462-9) and LR Clonase Enzyme mix (manufactured by invitrogen) to obtain an expression vector in which a β-glucuronidase gene (GUS) and a Nos terminator (Tnos) were linked downstream of the promoter sequence. The pMDC164 vector also contains a hygromycin resistant gene in the T-DNA region.
上記プロモーター配列を導入した発現ベクターを、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefacience EHA105） に、凍結融解法（Hofgen et. al. (1988) Nucleic Acids Res., Oct 25;16(20)9877）を参照にして導入し形質転換した。形質転換アグロバクテリウムを選抜するため、カナマイシン（50μg/L）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、28℃で2日間静置培養を行った。得られたシングルコロニーをＬＢ液体培地に植菌し、28℃で2日間振とう培養を行い、終濃度20%のグリセロールストックとして-80℃保存した。
For the expression vector into which the above promoter sequence has been introduced, freeze-thaw method (Hofgen et. Al. (1988) Nucleic Acids Res.,
[実施例４]イネ科モデル植物の形質転換
本発明では、イネ科の一年生草本植物であるミナトカモジグサ（Brachypodium distachyon）を用いてプロモーターの活性を評価する。ミナトカモジグサはコムギやオオムギと同じイチゴツナギ亜科に分類される植物で、イネ科のモロコシやイネよりも分類学上コムギに近い、ゲノムサイズが小さい、植物体が比較的小型及び形質転換が可能という点から、モデル植物に適していると考えられている。
[Example 4] Transformation of a Poaceae model plant In the present invention, promoter activity is evaluated using Brachypodium distachyon, which is an annual herbaceous plant of Poaceae. Minato-kadoshi is a plant classified in the same family as the wheat and barley, and is similar in taxonomically to wheat than sorghum and rice, and is smaller in genome size, and the plant is relatively small and transformation is possible. From the point of view, it is considered to be suitable for model plants.
ミナトカモジグサの形質転換はAlves et. al.の方法（Nature Protocol 2009;4(5):638-49）に従い、カルスへのアグロバクテリウム感染を行った。自家受粉後のミナトカモジグサ Bd21の未熟胚を取り出し、2,4-D (2.5μg/ml)を含むBDD培地で25℃暗所、約3週間培養することにより、未熟胚からカルスが形成された。 Agrobacterium infection of callus was carried out according to the method of Alves et. Al. (Nature Protocol 2009; 4 (5): 638-49) for transformation of C. versicolor. Callus was formed from immature embryos by removing immature embryos of self-pollinated Minatokamodigusa Bd21 and culturing in BDD medium containing 2,4-D (2.5 μg / ml) in the dark at 25 ° C. for about 3 weeks. .
グリセロールストックのアグロバクテリウムをカナマイシン（50μg/ml）を含むLB液体培地に植菌し、28℃で一晩振とう培養を行った。これをカナマイシン（50μg/ml）を含むBDA培地に塗布し28℃で2日間静置培養した。生育してきた菌体をかき集めてアセトシリンゴン（40μg/ml）を含むアグロバクテリウム感染液に懸濁し、OD600nm=1.0に調整したものを接種懸濁液とした。 The glycerol stock Agrobacterium was inoculated into LB liquid medium containing kanamycin (50 μg / ml), and shake culture was carried out at 28 ° C. overnight. The resultant was applied to BDA medium containing kanamycin (50 μg / ml) and statically cultured at 28 ° C. for 2 days. The grown cells were scraped, suspended in an agrobacterium infection solution containing acetosyringone (40 μg / ml), and adjusted to OD 600 nm = 1.0 to obtain an inoculation suspension.
胚カルスを接種懸濁液に5分間浸した後、ハイグロマイシンとカルベニシリンを含む培地に移し25℃暗所で約6週間静置培養した。ハイグロマイシン耐性を示して成長を続けたカルスを、カイネチンを含むシュート形成培地に移し、25℃、16時間照明下で2〜5週間培養した。シュート形成が見られた個体についてはアグリポット中のMS培地に移植し、ルート形成を促した。アグリポット内で十分発根した植物を鉢上げし、3〜4ヶ月、22℃、湿度50％、20時間照明下で生育し種子（T1）を採取した。各発現ベクター導入アグロバクテリウムを使用したミナトカモジグサの形質転換の結果、tplb0009k09のプロモーター配列を組み込んだアグロバクテリウムを感染させたカルスだけは形質転換植物が発生しなかった。 Embryo calli were immersed in the inoculum suspension for 5 minutes, transferred to a medium containing hygromycin and carbenicillin and statically cultured at 25 ° C. in the dark for about 6 weeks. The callus which showed hygromycin resistance and continued to grow was transferred to shoot formation medium containing kinetin and cultured for 2 to 5 weeks under illumination at 25 ° C. for 16 hours. Individuals in which shoot formation was observed were transferred to MS medium in agripot to promote root formation. Plants sufficiently rooted in an agripot were raised, and grown for 3 to 4 months at 22 ° C., 50% humidity, and 20 hours of light to collect seeds (T1). As a result of transformation of C. elegans using Agrobacterium expressing each of the expression vectors, transformed plants were not generated only for the callus infected with Agrobacterium in which the promoter sequence of tplb0009k09 was incorporated.
[実施例５] 環境ストレス応答の評価
１．乾燥ストレス応答実験
実施例４で採取した形質転換植物のT1種子を、シャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後、ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことで葉と根を生育させた。乾燥ストレス処理は、水耕栽培中の植物体をキムタオルの上に置くことで乾燥ストレス状態にし、5時間処理を行った。
[Example 5] Evaluation of environmental stress response Drying stress response experiment T1 seeds of the transformed plants collected in Example 4 were allowed to absorb water at 4 ° C. for 2 days on filter paper on a petri dish, and then transferred to a growth chamber under illumination at 22 ° C. for 20 hours for germination. . After that, it was transferred onto glass beads and subjected to hydroponic culture for 10 days to grow leaves and roots. In the drying stress treatment, a plant under hydroponic culture was put on a Kim towel to bring it into a drying stress state and treated for 5 hours.
乾燥処理後、葉と根を切り分け凍結乾燥した。同様に無処理（コントロール）として水耕栽培を続けた形質転換体の葉と根も採取した。各サンプルからのRNAの抽出にはRNeasy Plant mini kitを使用し、次いでPrimeScriptII1st strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa BIO社製)を使用することで cDNAを合成した。プロモーター配列の下流に繋いだGUS遺伝子の半定量RT-PCRを行うことで乾燥ストレス応答を確認した。RT-PCR条件は以下に示す。 After drying, the leaves and roots were separated and lyophilized. Similarly, the leaves and roots of transformants that continued to be subjected to hydroponic culture as no treatment (control) were also collected. RNA was extracted from each sample using RNeasy Plant mini kit and then using PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis Kit (TaKaRa BIO) to synthesize cDNA. The drought stress response was confirmed by performing semiquantitative RT-PCR of the GUS gene linked downstream of the promoter sequence. RT-PCR conditions are shown below.
ポリメラーゼはQuick Taq HS DyeMix(TOYOBO社製)を使用し、50μlの反応系（1X Premix, 0.2μM PCRプライマー, テンプレート（上記cDNA） 25ng）で行った。PCRの条件は、最初に94℃で2分反応させた後、94℃で30秒、60℃で30秒及び68℃で1分のサイクルを30サイクル、最後に68℃で2分の条件で行った。PCR産物は、1.0%アガロースゲル電気泳動により、断片のサイズと増幅効率を確認した。ここで用いたPCRプライマーを以下の表２に示す。 The polymerase used was Quick Taq HS DyeMix (manufactured by TOYOBO), and was performed in 50 μl of a reaction system (1 × Premix, 0.2 μM PCR primer, 25 ng of the template (cDNA above)). The PCR conditions are: first react at 94 ° C. for 2 minutes, then 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 1 minute, and finally at 68 ° C. for 2 minutes went. The PCR products were checked for fragment size and amplification efficiency by 1.0% agarose gel electrophoresis. The PCR primers used here are shown in Table 2 below.
PCR産物の電気泳動の結果を図１に示した。乾燥処理によって4種類のプロモーターで発現が強く応答されていた（Scaffold2239, Contig1515, tplb0004l11, tplb0015p04）。1種類（7AL.Contig16213）は微弱ながらも応答が見られた。tplb0010o09については乾燥ストレスによるGUS遺伝子の発現応答は見られなかった。 The results of electrophoresis of the PCR product are shown in FIG. Expression was strongly responded by four promoters by drying treatment (Scaffold 2239, Contig 1515, tplb0004l11, tplb0015p04). One kind (7AL.Contig 16213) showed a response even though it was weak. For tplb0010o09, no expression response of GUS gene due to drought stress was observed.
２．塩ストレス応答実験
実施例４で採取した形質転換植物のT1種子を、シャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後、ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことで葉と根を生育させた。塩ストレス処理は、水耕栽培中の植物体を200mM NaClを加えた22℃の水槽に植物体を移すことで塩ストレス状態にし、そのまま24時間処理を行った。
2. Salt Stress Response Experiment T1 seeds of the transformed plants collected in Example 4 were allowed to absorb water at 4 ° C. for 2 days on filter paper on a petri dish, and then transferred to a growth chamber under illumination at 22 ° C. for 20 hours for germination. . After that, it was transferred onto glass beads and subjected to hydroponic culture for 10 days to grow leaves and roots. In the salt stress treatment, the plants under hydroponic culture were brought into a salt stress state by transferring the plants to a water tank at 22 ° C. to which 200 mM NaCl was added, and the treatment was carried out for 24 hours.
上記手法と同様に、サンプルからRNAを抽出し、cDNAの合成及びRT-PCRを行い、GUS遺伝子の発現を電気泳動にて確認した。PCR産物の電気泳動の結果を図２に示した。塩処理によって3種類のプロモーターで発現が見られ（Contig1515, tplb0004l11, tplb0015p04）、特に葉よりも根で強い応答が見られた。一方、Scaffold2239については塩ストレス応答は見られなかった。 Similar to the above-described method, RNA was extracted from the sample, cDNA synthesis and RT-PCR were performed, and the expression of the GUS gene was confirmed by electrophoresis. The results of electrophoresis of the PCR product are shown in FIG. By salt treatment, expression was observed in the three promoters (Contig1515, tplb0004111, tplb0015p04), and a stronger response was seen particularly in roots than in leaves. On the other hand, no salt stress response was observed for Scaffold 2239.
３．低温ストレス応答実験
実施例４で採取した形質転換植物のT1種子を、シャーレ上の濾紙の上で4℃、2日間吸水させ、その後22℃、20時間照明下のグロースチャンバーに移して発芽させた。その後、ガラスビーズ上に移し、10日間水耕栽培を行うことで葉と根を生育させた。低温ストレス処理は、水耕栽培中の植物体を4℃に設定したグロースチャンバー中の4℃の水槽に植物体を移すことで低温ストレス状態にし、そのまま10時間処理を行った。
3. Low temperature stress response experiment T1 seeds of the transformed plants collected in Example 4 were allowed to absorb water at 4 ° C. for 2 days on filter paper on a petri dish, and then transferred to a growth chamber under illumination at 22 ° C. for 20 hours for germination. . After that, it was transferred onto glass beads and subjected to hydroponic culture for 10 days to grow leaves and roots. The low temperature stress treatment was carried out for 10 hours as it was in a low temperature stress state by transferring the plants under hydroponic cultivation to a 4 ° C. water tank in a growth chamber set at 4 ° C.
上記手法と同様に、サンプルからRNAを抽出し、cDNAの合成及びRT-PCRを行い、GUS遺伝子の発現を電気泳動にて確認した。PCR産物の電気泳動の結果を図３に示した。これまで乾燥及び塩ストレス応答を示した3種類のプロモーターは、低温ストレスにおいても応答することが示された。 Similar to the above-described method, RNA was extracted from the sample, cDNA synthesis and RT-PCR were performed, and the expression of the GUS gene was confirmed by electrophoresis. The results of electrophoresis of the PCR product are shown in FIG. It has been shown that the three promoters that have shown dry and salt stress responses up to now also respond to cold stress.
４．GUS染色法による導入遺伝子の発現の観察
ミナトカモジグサに導入したプロモーターの活性を観察するために、GUS染色を実施した。乾燥、塩及び低温ストレス処理を行った植物体をGUS染色用の反応液（100mM リン酸ナトリムバッファー（pH7.0）, 1mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide(X-Gluc), 0.5mM K3〔Fe(CN)6〕, 0.5mM K4〔Fe(CN)6〕,0.1% Triton-X）に浸漬し、30分間脱気をした。その後、37℃で1晩反応させ、反応液を捨て、70%エタノールで反応液を置換して反応を停止させた。何度か70%エタノールを交換して葉緑素を除去した。
4. Observation of expression of transgene by GUS staining In order to observe the activity of the promoter introduced into C. sativa L., GUS staining was performed. A reaction solution for GUS staining (100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), 1 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (D) for GUS staining of dried, salted and low temperature stress-treated plants. It was immersed in X-Gluc), 0.5 mM K 3 [Fe (CN) 6 ], 0.5 mM K 4 [Fe (CN) 6 ], 0.1% Triton-X), and degassed for 30 minutes. Then, the reaction was allowed to proceed at 37 ° C. overnight, the reaction solution was discarded, and the reaction solution was replaced with 70% ethanol to stop the reaction. The chlorophyll was removed by exchanging 70% ethanol several times.
実体顕微鏡で観察した結果を図４に示す。各ストレス処理のサンプルは葉で染色が見られ、特に若い葉で濃い染色が認められた。 The result observed with a stereomicroscope is shown in FIG. The samples of each stress treatment were stained in leaves, particularly in young leaves.
[実施例６] レポーター遺伝子（GUS）の発現量解析
乾燥、塩及び低温で応答することが確認されたプロモーターについて、発現パターンと発現強度を分析するため、各ストレス条件下で経時的（ストレス付与から０時間後、１時間後、３時間後、５時間後、１０時間後、及び２４時間語）にRNAを抽出して、定量PCRを実施した。また各時間ストレス付与後から通常の栽培条件（水耕栽培、真水、22℃）に戻し、２日間栽培した時のプロモーターの応答及び下流遺伝子の発現量変化についても確認した。定量PCRにはFast SYBR Green Mster Mix(life technologies社製)及びStepOnePlus(life technologies社製)を使用した。比較対象のコントロールとして、遺伝子組換え植物に汎用的に用いられているカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、GUS遺伝子及びNosターミネーター（Tnos）を連結したプラスミドを導入した形質転換ミナトカモジグサを使用した。内部標準遺伝子としてUBC18遺伝子を用い（Hong et. al. (2008) BMC Plant Biol., Nov 7;8:112）、プライマーの配列を以下の表３に示す。
[Example 6] Expression amount analysis of reporter gene (GUS) With respect to promoters confirmed to respond at dryness, salt and low temperature, temporally under each stress condition (stressing to analyze expression pattern and expression intensity) RNA was extracted at 0 hour, 1 hour, 3 hours, 5 hours, 10 hours, and 24 hours), and quantitative PCR was performed. After each time of stressing, the culture conditions (hydroponic culture, fresh water, 22 ° C.) were returned to normal conditions, and the response of the promoter and changes in the expression amount of downstream genes when cultivated for 2 days were also confirmed. Fast SYBR Green Mster Mix (manufactured by life technologies) and StepOnePlus (manufactured by life technologies) were used for quantitative PCR. As a control to be compared, a transformed plant was used to which a plasmid in which a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, a GUS gene and a Nos terminator (Tnos), which are widely used for genetically modified plants, were introduced was introduced. The UBC18 gene was used as an internal control gene (Hong et. Al. (2008) BMC Plant Biol., Nov 7; 8: 112), and the sequences of the primers are shown in Table 3 below.
図５はコントロールであるカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターに対する相対発現の定量PCRの結果、図６はストレス処理開始時に対する相対発現の定量PCRの結果を示す。発現パターンは、3種類とも異なっており、早い時間で応答するものや継続して応答するものが見られた。また、どのプロモーターにおいても、ストレス条件下から通常の栽培条件に戻すとプロモーターの活性は無処理と同等レベルまで低下していた。発現強度については、3種類のプロモーターのうち、1種類はコントロールである35Sプロモーターと同程度の発現強度を示し、他の2種類は10〜150倍近く発現を誘導するプロモーターであった。3種類のプロモーター配列は、植物体で汎用的なプロモーターと同等以上の発現量を有するものであることが明らかとなった。 FIG. 5 shows the results of quantitative PCR of relative expression to the control cauliflower mosaic virus 35S promoter, and FIG. 6 shows the results of quantitative PCR of relative expression to the start of stress treatment. The expression patterns were different in all three types, and there were those that responded earlier and those that continued. In addition, in any promoter, when stress conditions were returned to normal cultivation conditions, the activity of the promoter was reduced to the same level as in the case of no treatment. Regarding the expression intensity, one of the three types of promoters showed an expression intensity similar to that of the control 35S promoter, and the other two types were promoters that induced expression approximately 10 to 150 times. It has become clear that the three types of promoter sequences have an expression level equal to or higher than general-purpose promoters in plants.
tplb0004l11では、乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で４．０倍であり、根において最大で０．８倍であり、塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で１．５倍であり、根において最大で３０．１倍であり、低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で３．８倍であり、根において最大で１４．１倍である。 In tplb0004111, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is up to 4.0 times in leaves and up to 0.8 in roots compared to the beginning of drought stress treatment And the ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is at most 1.5 times in leaves and at most 30 in roots compared to when salt stress treatment is initiated. 1 times, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is at most 3.8 times in leaves and at most 14 in roots compared to the start of cold stress treatment .1 times.
Contig1515では、乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で５５．６倍であり、根において最大で４１．８倍であり、塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で３３．５倍であり、根において最大で１９０．５倍であり、低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で４１．８倍であり、根において最大で８８１．５倍である。 In Contig 1515, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is up to 55.6 times in leaves and up to 41.8 in roots compared to the beginning of drought stress treatment And the ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is at most 33.5 times in leaves and at most 190 in roots compared to when salt stress treatment is initiated. The ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is up to 41.8 times in leaves and up to 881 in roots compared to that at the start of cold stress treatment. .5 times.
tplb0015p04では、乾燥ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、乾燥ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で６３．１倍であり、根において最大で１０．９倍であり、塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で５．３倍であり、根において最大で１８２．６倍であり、低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において最大で４３．３倍であり、根において最大で４４７．４倍である。 In tplb0015p04, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is at most 63.1 times in leaves compared to the beginning of drought stress treatment and at most 10.9 in roots And the ability to increase the expression of downstream linked genes under salt stress conditions is up to 5.3 times in leaves and up to 182. 2 in roots compared to when salt stress treatment is initiated. 6 times, the ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is at most 43.3 times in leaves compared to the start of cold stress treatment, at most 447 in roots .4 times.
Claims (13)
（ａ）配列番号１７又は２１に記載の塩基配列を含むプロモーター；
（ｂ）配列番号１７又は２１に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター；
（ｃ）配列番号１７又は２１に記載の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/または付加した塩基配列を含み、乾燥ストレス条件下、塩ストレス条件下、及び低温ストレス条件下において活性化して、下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力を有するプロモーター。 A wheat-derived promoter having the ability to be activated under drought stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes, comprising the following (a) to (c) Promoter which is any of).
(A) a promoter comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 21;
(B) A base sequence having a sequence identity of 90% or more with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 21 and activated downstream under dry stress conditions, salt stress conditions and low temperature stress conditions; A promoter having the ability to increase the expression level of linked genes;
(C) The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 or 21, containing a nucleotide sequence in which one or more bases are deleted, inserted, substituted and / or added, under dry stress conditions, salt stress conditions, and low temperature A promoter that has the ability to be activated under stress conditions to increase the expression level of downstream linked genes.
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．２倍以上であり、根において２０倍以上であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．０倍以上であり、根において１０倍以上である、請求項１から３の何れか１項に記載のプロモーター。 The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is 3.0 times or more in leaves and 0.7 times or more in roots as compared to the beginning of drought stress treatment,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is 1.2-fold or more in leaves and 20-fold or more in roots as compared to the beginning of salt stress treatment,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is 3.0 times or more in leaves and 10 times or more in roots as compared to the start of cold stress treatment. The promoter according to any one of 3.
塩ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、塩ストレス処理開始時と比較して、葉において１．５〜３３．５倍であり、根において３０．１〜１９０．５倍以下であり、
低温ストレス条件下における下流に連結した遺伝子の発現量を増大する能力が、低温ストレス処理開始時と比較して、葉において３．８〜４３．３倍であり、根において１４．１〜８８１．５倍以下である、請求項１から４の何れか１項に記載のプロモーター。 The ability to increase the expression level of downstream linked genes under drought stress conditions is 4.0 to 63.1 times in leaves compared to the beginning of drought stress treatment and 10.9 to 41. in roots. 8 times,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under salt stress conditions is 1.5 to 33.5-fold in leaves compared to that at the start of salt stress treatment, and in the roots from 3 to 190. 5 times or less,
The ability to increase the expression level of downstream linked genes under cold stress conditions is 3.8 to 43.3 times in leaves compared to that at the start of cold stress treatment and 14.1 to 881 in roots. The promoter according to any one of claims 1 to 4, which is 5 times or less.
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